專利名稱：分離核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的純化。特別地，本發(fā)明涉及將存在于含水吸附液中的核酸吸附到固體基材上的方法。
背景技術(shù)：
許多生物物質(zhì)，特別是核酸，目前特有的問題是將它們與它們所在的自然環(huán)境相分離。一方面，它們通常以非常小的濃度存在，另一方面，通常發(fā)現(xiàn)它們存在于許多其它固體和溶解物質(zhì)中，如存在于胞溶之后的物質(zhì)中。這使它們難以分離或測量，特別是在檢測特定核酸或檢測核酸的特定性質(zhì)的生物特異性試驗中。這種生物特異性試驗在診斷學(xué)和生物分析領(lǐng)域的研發(fā)中起重要作用。生物特異性試驗的例子為雜交試驗、免疫試驗、和受體-配體試驗。雜交試驗使用特定的堿基對用于核酸分析物如RNA和DNA的分子檢測。因此，長度為18到20個核苷酸的寡聚核苷酸探針能夠特異性識別所選擇的如人類基因組中的互補序列。另一個需要兩種寡聚核苷酸引物選擇性結(jié)合的試驗是US4,683,195中描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。該方法通過在若干循環(huán)中在脫氧核苷酸三磷酸的存在下，通過熱穩(wěn)定的聚合酶將特定的核酸區(qū)域選擇性擴增到可檢測的水平。
如上所述，核酸在上述試驗之一中進行分析或用于其它方法之前，需要將它們從包含不同組分如蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組分的復(fù)合混合物的生物樣品中分離或純化。通常，對于第一步，使用使在研組分即核酸富集的方法。經(jīng)常地，這些組分包含于細菌細胞、真菌細胞、病毒粒子、或更復(fù)雜生物體的細胞如人血細胞或植物細胞中。核酸作為在研組分也可以稱為“靶組分”。
為釋放所述細胞或粒子的內(nèi)容物，它們可用酶或化學(xué)品處理，使這些生物體的細胞壁和細胞膜溶解、降解或變性。該方法通常稱為胞溶。得到的包含這種胞溶物質(zhì)的溶液稱為胞溶產(chǎn)物。在胞溶過程中經(jīng)常遇到的問題是降解靶組分的其它酶如脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在胞溶過程中與靶組分接觸。這些降解酶也可在胞溶之前存在于細胞外部或在不同的細胞隔室內(nèi)在空間上被分開，而現(xiàn)在接觸到靶組分。該方法期間釋放的其它組分可為如屬于脂多糖類的內(nèi)毒素，其對細胞有毒性并能夠使人類或動物治療用產(chǎn)品出現(xiàn)問題。
在樣品制備的胞溶步驟之后的下一步中，進一步使核酸富集。通常在用于基于探針的試驗之前將核酸從復(fù)雜的胞溶混合物中提取出來。核酸的提取有幾種方法。序列依賴性或生物特異性的方法包括例如親和色譜法或與固定探針的雜交。序列非依賴性或物化方法包括例如使用苯酚-氯仿的液-液提取法、用純乙醇或異丙醇沉淀、用濾紙?zhí)崛?、用膠束形成試劑如十六烷基三甲基溴化銨提取、與固定的嵌入染料如吖啶衍生物結(jié)合、吸附于基材如硅膠或硅藻土上、在離液序列高的條件下吸附于可磁吸引的玻璃粒子(MGP)或有機硅烷粒子。優(yōu)選核酸與具有二氧化硅表面的基材直接結(jié)合，原因之一為核酸無需修飾，并且甚至天然的核酸也可以結(jié)合。
雖然可使用其它的表面，但用于提取目的的特別興趣在于將核酸吸附到玻璃表面上。
近年來已經(jīng)提出通過使用核酸與基材如玻璃表面的結(jié)合行為將核酸與它們的自然環(huán)境分離的許多過程。當(dāng)想要使核酸游離時，經(jīng)常使用離液劑如硫氰酸胍或陰離子的、陽離子的、兩性離子的或非離子的洗滌劑。還可以有利地使用迅速降解這些酶或多余蛋白質(zhì)的蛋白酶類。在例如細胞胞溶和/或細胞器如線粒體、質(zhì)體、細胞核或其它含核酸的細胞器胞溶之后游離的核酸，可通過如下方式純化核酸使其結(jié)合于基材如無機物載體，洗滌結(jié)合有核酸的所述無機物載體，并使所述核酸從所述無機物載體釋放，即解吸。對于洗滌步驟的條件，由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進行選擇，在所選的洗滌條件下，使核酸保持吸附于無機物載體上。優(yōu)選地，大于40％，更優(yōu)選大于50％，更優(yōu)選大于70％，更優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％，更優(yōu)選大于99％的核酸保持吸附于無機物載體上。對于解吸步驟條件，由本領(lǐng)域的技術(shù)人員進行選擇，在所選條件下，使核酸從無機物載體釋放。優(yōu)選地，大于40％，更優(yōu)選大于50％，更優(yōu)選大于70％，更優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于90％，更優(yōu)選大于95％，更優(yōu)選大于99％的核酸被從無機物載體釋放。
在離液鹽的存在下將核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子在本領(lǐng)域是已知的(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)第615-619頁)并且為核酸的色譜純化和分離過程奠定了基礎(chǔ)。本領(lǐng)域還已知使用高濃度的離液鹽如碘化鈉、高氯酸鈉、和硫氰酸胍從胞溶產(chǎn)物中分離和純化RNA和DNA的方法(Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503；Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209)。得自細菌的質(zhì)粒DNA在高氯酸鈉的存在下在玻璃粉上的純化在Marko，M.A.等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387中有所描述。在DE 3724442中，描述了通過用乙酸使噬菌體粒子沉淀并用高氯酸鹽使噬菌體粒子胞溶而分離單鏈的M13噬菌體DNA。洗滌與玻璃纖維過濾器結(jié)合的核酸，然后用含甲醇的Tris/EDTA緩沖溶液洗脫。從λ噬菌體純化DNA的類似過程在Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201中有所描述。該過程要求核酸在離液鹽溶液中選擇性地與玻璃表面結(jié)合，并從污染物如瓊脂糖、蛋白質(zhì)或細胞殘余物中分離核酸。為從污染物中分離玻璃粒子，可通過離心分離粒子或吸引液體使其通過玻璃纖維過濾器。然而，這是一個限制性步驟，防止使用該過程來處理大量的樣品。
在通過加入鹽和乙醇沉淀之后，使用磁性粒子固定核酸是更有利的，其在例如Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169和WO 91/00212中有所描述。在這個過程中，核酸與磁性粒子一起粘合。通過施加磁場使粘合物從原溶劑中分離并進行洗滌步驟。一次洗滌步驟之后，將核酸溶解于Tris緩沖溶液中。然而，這個過程有一個缺點，在于沉淀對于核酸不是選擇性的。而是還粘合有多種固體和溶解物質(zhì)。結(jié)果是，這個過程不能用于除去可能存在的顯著量的特定酶促反應(yīng)的任何抑制劑。磁性的多孔玻璃也是有市售的，其在多孔的特別是玻璃基質(zhì)中包含磁性粒子，并由包含鏈親和素的層覆蓋。如果生物材料在復(fù)雜的制備步驟中經(jīng)過修飾使得它們與生物素共價結(jié)合，則上述產(chǎn)物可用于分離這些生物材料，如蛋白質(zhì)或核酸?？纱呕奶囟ㄎ絼┍蛔C明是非常有效的，并適用于自動樣品制備。亞鐵磁的和鐵磁的以及超順磁性顏料被用于這一目的。最優(yōu)選的MGP為在WO01/37291中描述的那些。
通過在高濃度鹽的存在下將核酸吸附于基材上如無機物基材來純化核酸也適用于其它的復(fù)雜混合物。其例子是分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，包括例如在核酸的體外合成如PCR、限制性內(nèi)切酶消化、連接反應(yīng)等之后得到的反應(yīng)混合物。例如在Vogelstein，B.和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619中，提出了使瓊脂糖凝膠中的核酸在碘化鈉的存在下結(jié)合于研磨的燧石玻璃的過程。通過在高濃度鹽的存在下將核酸吸附于基材上如無機物基材來純化核酸的另一個應(yīng)用是除去可能已經(jīng)與核酸共同純化的熱原(pyrogenic)污染物。
還不完全清楚核酸在離液劑的存在下與無機物載體結(jié)合的機理。據(jù)假設(shè)，核酸和溶劑之間的相互作用受到影響而使核酸吸附于無機物載體并變性。在高濃度離液劑的存在下，反應(yīng)幾乎是定量的。被吸附的核酸可通過對無機物載體施用低離子強度的緩沖溶液洗脫。
EP 0 658 164描述了色譜純化核酸的方法。核酸從具有高的鹽濃度的、優(yōu)選包含離液劑的含水吸附液中吸附于基材即無機物載體上。所述含水吸附液包括鏈長度為1％-50％的C1-C5脂族醇和/或聚乙二醇和/或疏水的無機聚合物和/或有機聚合物和/或有機酸如三氯乙酸。
本領(lǐng)域中目前的分離/純化核酸的方法有某些缺點。這種缺點涉及如純度、選擇性、回收率、實驗室安全性和方便性，以及涉及分離/純化方法的速度。
例如，在使用苯酚/氯仿提取的方案中，殘余的苯酚對于某些后分離過程，特別對于酶促反應(yīng)如用限制性內(nèi)切酶消化、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、或連接酶介導(dǎo)的反應(yīng)通常是一個問題。通常，純化/分離方法的殘余試劑的濃度升高可帶來問題。因此，希望在純化的核酸中保持盡可能低的在純化過程中所用試劑的殘余量。與純度有關(guān)的另一個潛在問題是某些物質(zhì)從吸附基質(zhì)中共萃取(浸出)。因此，希望在純化的核酸中保持盡可能低的在純化過程中由浸出釋放出的化合物的殘余量。
本領(lǐng)域目前的在吸附液中使用乙醇或異丙醇的方案的另一個缺點為這種醇的高揮發(fā)性和易燃性。一方面，這些易燃的醇在實驗室實踐中是潛在危險。同時，根據(jù)國家法規(guī)的規(guī)定，易燃的醇可造成與可允許的儲存和運輸有關(guān)的后勤問題。另外，揮發(fā)性醇由于它們的蒸氣壓難以精確定量。因此，希望由危險較小或/和較少造成后勤問題的物質(zhì)代替易燃醇。
用于制備核酸樣品的市售示例性試劑盒為“High Pure”產(chǎn)品線(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)。將吸附液轉(zhuǎn)移到“High Pure”柱并通過包含玻璃纖維材料的羊毛狀物(fleece)。在這個方法過程中，核酸吸附于玻璃物質(zhì)上。當(dāng)使用Roche的“HighPure”試劑盒和在吸附液中使用乙醇從血清分離/純化核酸的方案時，人們注意到血清中高的甘油三酯濃度導(dǎo)致吸附液通過玻璃纖維羊毛狀物所需的時間延長(也參見實施例6)。因此，考慮到從具有高的甘油三酯濃度的血清制備樣品時，希望找到乙醇的代替物，以減少吸附液通過玻璃纖維羊毛狀物所需的時間。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的問題是提供可供選擇的純化核酸的方法，該方法在含水吸附液中使用可供選擇的物質(zhì)，以促進核酸與基材如無機物載體的結(jié)合。
令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果高離子強度的吸附液包括含有式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物時，核酸可與基材結(jié)合， (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子。
因此，在本發(fā)明的第一個實施方案中提供純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將核酸從組合物吸附于基材上，所述組合物含有(i)緩沖水溶液、(ii)高濃度鹽、和(iii)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物、和(iv)核酸， (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材，然后，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉淀并分離沉淀的核酸，從而進一步純化核酸。
本發(fā)明的另一個實施方案是將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供核酸的水溶液，所述水溶液包含高濃度的鹽和與水混溶的非酸性有機化合物，該有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；然后(b)將步驟(a)的水溶液加入到基材上。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；然后(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物中，形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為含有粉狀材料形式的基材的懸浮液，所述基材分散在與水混溶的非酸性有機化合物中，該有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為與水混溶的非酸性有機化合物在實施本文所述的本發(fā)明的方法中的應(yīng)用，所述與水混溶的非酸性有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。另外，本發(fā)明的另一個實施方案為使用與水混溶的非酸性有機化合物用于制備懸浮液，通過將基材分散在所述與水混溶的非酸性有機化合物中形成所述基材的懸浮液，所述與水混溶的非酸性有機化合物包含式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。另外，本發(fā)明的另一個實施方案為本發(fā)明的懸浮液在實施本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它實施方案為各組件的試劑盒(kit of parts)，包含與水混溶的非酸性有機化合物，該有機化合物包括式I的官能團，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
還發(fā)現(xiàn)如果高離子強度的吸附液包含與水混溶的環(huán)狀二醚時，核酸可與基材結(jié)合。
因此，本發(fā)明的另一個實施方案為純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將核酸從組合物吸附于基材上，所述組合物包含(i)緩沖水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)與水混溶的環(huán)狀二醚、和(iv)核酸；b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然后，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉淀并分離沉淀的核酸，從而進一步純化核酸。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽和與水混溶的環(huán)狀二醚的核酸水溶液；和(b)將步驟(a)的水溶液加到基材上。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供與水混溶的環(huán)狀二醚；(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的環(huán)狀二醚中形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，所述基材分散在與水混溶的環(huán)狀二醚中。
另外，本發(fā)明的另一個實施方案為與水混溶的環(huán)狀二醚在實施本文所述的本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明的另一個實施方案為使用與水混溶的環(huán)狀二醚，通過將所述基材分散在所述與水混溶的非酸性有機化合物中制備懸浮液，從而形成所述基材的懸浮液。另外，本發(fā)明的另一個實施方案為本發(fā)明的懸浮液在實施本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它實施方案為包含與水混溶的環(huán)狀二醚的各組件的試劑盒。
本發(fā)明的另一個實施方案為測定生物樣品中核酸存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物含有(i)步驟(a)的胞溶生物樣品、(ii)緩沖水溶液、(iii)高濃度鹽、(iv)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)
其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附于基材上；(d)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然后，(e)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(f)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。優(yōu)選地，通過核酸的擴增測定核酸，通過使用特異引物、特異性檢測探針、和擴增混合物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方式進行擴增，從而實時監(jiān)測擴增。
本發(fā)明的另一個實施方案為測定生物樣品中核酸的存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物含有(i)步驟(a)的胞溶生物樣品、(ii)緩沖水溶液、(iii)高濃度鹽、(iv)與水混溶的環(huán)狀二醚，其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附于基材上；(d)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然后，(e)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(f)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。
在本文中，可以理解，術(shù)語“核酸”表示至少一種核酸。另外，術(shù)語“核酸”還可能表示核酸的混合物。術(shù)語“核酸”包括RNA、DNA、或兩者都包括。術(shù)語“基材”表示在水溶液中基本上不溶的物質(zhì)，并且當(dāng)加入高離子強度的核酸水溶液時，所述基材上可吸附核酸。因此，基材的例子為多孔或無孔無機物粒子，如二氧化硅、玻璃、石英、沸石、或其混合物。同時，術(shù)語“基材”包括涂有二氧化硅、玻璃、石英、或沸石的可被磁吸引的粒子。另外，可以理解，“粉末”或“粉狀”材料形式的基材指精細粉碎的材料，當(dāng)分散在液相如液體有機化合物或水溶液中時，其生成懸浮液。術(shù)語“粉末”或“粉狀”材料包括其中粉狀材料已經(jīng)聚集的片，但是當(dāng)與液體有機化合物或水溶液混和時，仍然得到懸浮液。另外，可以理解，術(shù)語“高離子強度”和“高濃度”指溶解的鹽的濃度等于或大于約1M所生成的水溶液的離子強度或濃度。優(yōu)選水溶液中存在的鹽的濃度為1-10M。更優(yōu)選離液鹽的濃度為1到8M。另外，術(shù)語“與水混溶的”是指在室溫和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力下非含水有機化合物可以以等于或大于1％(體積百分數(shù))的比例溶解于水中，形成均相液相。術(shù)語“非酸性的”有機化合物表示沒有羧基官能團的有機化合物。
詳細而言，將(至少一種)核酸(也稱為靶核酸)結(jié)合于基材如玻璃粒子上的過程可描述如下。優(yōu)選在濃度為1到8mol/l，優(yōu)選在2到6mol/l的離液鹽的存在下進行，該離液鹽可為碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍。也可使用其它物質(zhì)如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
純化效果得自在這些條件下，即在一定濃度的離液劑以及優(yōu)選的與水混溶的非酸性有機化合物的存在下，將DNA或RNA結(jié)合于具有玻璃表面的材料上。為使樣品與基材即與核酸有親和力的材料接觸，將樣品與材料混和并培養(yǎng)一段足以發(fā)生結(jié)合的時間。技術(shù)人員通常熟知進行非磁性粒子處理過程的培養(yǎng)持續(xù)時間。這個步驟可通過在不同的時間點測定固定在表面上的生物材料的量而進行優(yōu)化。對于核酸，適合的培養(yǎng)時間為10秒到30分鐘。培養(yǎng)之后，結(jié)合的(至少一種)靶組分即核酸與液體分離。這通?？赏ㄟ^重力來實現(xiàn)、或在核酸結(jié)合于磁性玻璃粒子上的情況中通過施加磁場使與磁性粒子結(jié)合的材料分離而實現(xiàn)。例如，磁性粒子可被拉到其中進行培養(yǎng)的容器的壁上。從而除去包含未與磁性粒子結(jié)合的樣品的液體。使用的除去過程取決于其中進行培養(yǎng)的容器的種類。適當(dāng)?shù)牟襟E包括通過移液或抽取除去液體。
另一個例子是將吸附液中的核酸結(jié)合于玻璃羊毛狀物上。市售的試劑盒經(jīng)常在柱的底部提供這種羊毛狀物。包含核酸的吸附液被轉(zhuǎn)移到柱上，并通過施加力使吸附液通過羊毛狀物。術(shù)語“力”包括重力，和優(yōu)選的離心力。非常優(yōu)選的是“自旋柱”過程，其中由于通過離心施加的力使吸附液通過過濾器。使吸附液通過羊毛狀物的其它方法包括施用壓力或吸力。
然后，結(jié)合有DNA或RNA的材料可至少洗滌一次。優(yōu)選地，洗滌液包含高于1和低于100體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。同樣優(yōu)選地，洗滌液包含1到100體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，洗滌液為1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。另一個非常優(yōu)選的洗滌液為40到80體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。另一個非常優(yōu)選的洗滌液為50到99體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。更優(yōu)選的洗滌液是約70體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物與水的混合物。同樣優(yōu)選的洗滌液為與水混溶的非酸性有機化合物，也就是說得自供應(yīng)商的純液體化合物也理解是被包括在術(shù)語“洗滌液”中。
使用的洗滌液不會引起所述(至少一種)靶核酸從材料表面釋放，但盡可能徹底地洗掉不需要的污染物。這一洗滌步驟優(yōu)選通過將結(jié)合有靶核酸的材料與洗滌液培養(yǎng)進行。在這一步驟中，材料優(yōu)選是懸浮的。同樣優(yōu)選地，在材料為玻璃羊毛狀物或柱中的填塞物的情況中，洗滌步驟通過用洗滌液淋洗柱子而進行。優(yōu)選地，通過施加壓力、吸力、離心力或重力使洗滌液通過柱。當(dāng)與水混溶的非酸性有機化合物以純的形式使用時，以上所述同樣適用。
被污染的洗滌液優(yōu)選正如在上述將核酸與基材材料結(jié)合的步驟中那樣被除去。最后的洗滌步驟之后，材料可在真空中簡單地干燥，或使液體蒸發(fā)。也可實施使用丙酮的預(yù)處理步驟。
然后，條件可能逆轉(zhuǎn)，例如，離液劑或與水混溶的非酸性有機化合物的濃度可被降低，以洗脫與材料結(jié)合的DNA或RNA。優(yōu)選地，使基材如磁性玻璃粒子與其余樣品分離的方法通過使固定的生物材料粒化，例如通過重力或在磁性玻璃粒子的情況中使用磁鐵，并除去上清液進行。然后，將固定有生物材料的磁性玻璃粒子再懸浮在沒有或只有少量離液劑和/或與水混溶的非酸性有機化合物的水溶液中。或者，可使用沒有或只有少量離液劑和/或與水混溶的非酸性有機化合物的溶液稀釋該懸浮液。具有這一性質(zhì)的緩沖溶液在DE 372442和Jakobi，R.，等人的Anal.Biochem.，175(1988)196-201中已知。低含鹽量的洗脫緩沖溶液特別為含量低于0.2mol/l的緩沖溶液。優(yōu)選地，洗脫緩沖溶液包含緩沖用的物質(zhì)Tris。同樣優(yōu)選地，洗脫緩沖溶液為軟化水。目前包含純化DNA或RNA的溶液可用于其它反應(yīng)。任選地，可使用例如乙醇或異丙醇使核酸從溶液中沉淀。沉淀物還可以進行另外的洗滌步驟。這類的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并在Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press，2001中有所描述。
對于本發(fā)明方法中的吸附和洗滌步驟，優(yōu)選使用適合于分子生物學(xué)方法特別是脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)純化方法中的液體，所述方法利用了這些物質(zhì)在一定條件下與玻璃粒子的結(jié)合。優(yōu)選的液體包括含有式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。優(yōu)選地，官能團選自氧代基團、硫氧代(sulfoxo)基團、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶?。更優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。本發(fā)明同樣包括包含作為與水混溶的非酸性有機化合物的環(huán)狀二醚的液體。優(yōu)選地，環(huán)狀二醚為二氧雜環(huán)己烷。
本發(fā)明中使用的磁性玻璃粒子可以以不同制劑提供。可能以片劑的形式提供、作為粉末或作為懸浮液提供。非常優(yōu)選地，磁性玻璃粒子懸浮在與水混溶的非酸性有機化合物中。優(yōu)選地，這些懸浮液包含5到60mg/ml的磁性玻璃粒子(MGP)。同樣優(yōu)選地，將含二氧化硅的材料懸浮在緩沖水溶液中，所述緩沖水溶液任選地包含濃度為2到8mol/l，優(yōu)選4到6mol/l的離液劑。離液鹽為碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它化合物。本發(fā)明的離液劑為干擾液態(tài)水有序結(jié)構(gòu)的任何化學(xué)物質(zhì)，并且如果這些試劑存在于包含DNA或RNA的溶液中，其具有使DNA或RNA與磁性玻璃粒子結(jié)合的效果。生產(chǎn)適當(dāng)?shù)木彌_水溶液對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。適用于分子生物學(xué)目的的緩沖系統(tǒng)可在例如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第三版，CSHL Press，2001中發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選的緩沖材料為三(羥甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸鹽、N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)及其鹽或其它適當(dāng)?shù)牟牧?。另外，可存在那些改進溶液的離子強度的物質(zhì)如NaCl、KCl、或CaCl2；或金屬陽離子絡(luò)合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽。也可存在本領(lǐng)域已知的其它生物材料。
本發(fā)明的方法適合于從包含核酸的其它生物材料的復(fù)雜混合物純化核酸，即RNA或DNA。因此可以純化多種核酸的混合物，甚至是包含低豐度在研核酸的混合物。因此，本發(fā)明還包括純化其中靶核酸在濃度上可能是微量組分(或可能以低豐度存在)的特定核酸的混合物。
本文所述的過程可用于分離天然或修飾的核酸。天然核酸被認為是如下核酸，其結(jié)構(gòu)與天然存在的核酸相比不是不可逆改變的。然而，這不意味著樣品的其它組分不能被修飾。修飾的核酸包括非天然存在的核酸，如通過將其連接于反應(yīng)性的、可檢測的、或能夠固定的基團上而修飾的核酸。其例子為生物素化的核酸。
在上述步驟之后，現(xiàn)在可根據(jù)需要進一步使用通過本發(fā)明的方法分離的核酸。例如它們可用作多種酶促反應(yīng)的基材。當(dāng)涉及核酸時，它們可用于測序、放射性或非放射性標(biāo)記、它們所含的一個或多個序列的擴增、轉(zhuǎn)錄、與標(biāo)記探針核酸雜交、翻譯或連接。因此，本發(fā)明也包括如下方法該方法包含使結(jié)合的靶核酸從與其有親合力的材料中釋放的步驟。如果期望，如此純化的靶核酸可與如上所述的材料分離。
因此，本發(fā)明的第一個實施方案是純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將包含(i)緩沖水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物、和(iv)核酸的組合物中的核酸吸附于基材上 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然后，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉淀并分離沉淀的核酸，從而進一步純化核酸。優(yōu)選官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶８鼉?yōu)選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了步驟(a)的組合物在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應(yīng)用。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經(jīng)常具有包含溶液如儲備溶液的開口容器。在這個方面，溶液的液相包含在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力和室溫下具有低蒸發(fā)傾向的溶劑是有利的。因此，非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞砜。還非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
優(yōu)選地，步驟(a)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優(yōu)選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優(yōu)選地，步驟(a)的組合物中鹽的濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優(yōu)選地，洗滌液包含與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，洗滌液包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，洗滌液包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，洗滌液包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，洗滌液包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，洗滌液包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，洗滌液包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選粒度為0.1μm到1,000μm的無機物基材。同樣優(yōu)選當(dāng)使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優(yōu)選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏松填充的形式。更優(yōu)選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含硅膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優(yōu)選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。靶核酸可進行檢測和測定。優(yōu)選上述純化方法，然后進行測定或檢測步驟或純化方法，然后進行擴增和測定或檢測步驟。靶核酸或在研核酸可包含在非靶核酸的基質(zhì)中，甚至可在特定核酸的所述混合物中為微量組分。適當(dāng)?shù)腄NA檢測方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并在標(biāo)準(zhǔn)教科書如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第三版，CSHL Press，2001；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987中有所描述。在DNA檢測步驟之前同樣可能進行另外的純化步驟如沉淀步驟。檢測方法可包括但不限于特定染料如溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的結(jié)合或嵌入，所述染料嵌入雙鏈DNA并由此改變其熒光。純化的DNA同樣可通過電泳法分離，任選地在限制性內(nèi)切酶酶切消化之后進行所述分離，然后顯象。還有基于探針的試驗，其采用將寡聚核苷酸雜交到特異序列上并隨后進行雜交檢測。同樣在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另外的步驟之后對DNA測序。其它方法將多種DNA序列施加到結(jié)合有特異探針的硅片上，并當(dāng)結(jié)合有互補序列時產(chǎn)生信號。
本發(fā)明同樣涉及包含核酸的非蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組分的混合物，其中核酸包括DNA或RNA或兩者。
本發(fā)明同樣涉及從其中純化核酸的生物樣品，其包括病毒或細菌細胞以及多細胞機體的分離細胞如人和動物細胞如白細胞，和免疫活性的低和高分子化合物如半抗原、抗原、抗體和核酸、血漿、腦液、唾液、糞便、活檢標(biāo)本、骨髓、漱口液、血清、組織、尿或其混合物。本發(fā)明同樣涉及生物樣品如得自人或動物體的液體；優(yōu)選生物樣品為血液、血漿、血清或尿。血漿優(yōu)選為EDTA、肝素或檸檬酸鹽血漿。在本發(fā)明的一個實施方案中，生物樣品包括細菌細胞、真核細胞、病毒或其混合物。以上所述的生物樣品，優(yōu)選為經(jīng)過處理的形式如胞溶產(chǎn)物，可為(靶)核酸由其吸附到基材上的組合物的部分。
同樣優(yōu)選核酸和蛋白質(zhì)材料的混合物包括脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或兩者，優(yōu)選DNA或RNA或兩者源自于病毒或(至少一種)微生物。病毒可為甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)或細小病毒B19。
同樣優(yōu)選靶核酸組分和其它核酸的純化基本上如上所述。然后對靶核酸組分進行另外的操作并檢測，即，通過特異性擴增靶序列到可檢測的量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行擴增。其它可能的擴增反應(yīng)為連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR，Wu，D.Y.和Wallace R.B.，Genomics 4(1989)560-569；和Barany，F(xiàn).，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，F(xiàn).，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO 90/01069)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(EP 0 439 182A2)，3SR(Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08800)，和NASBA(US 5,130,238)。另外，有鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增(TMA)、和Q-β-擴增(綜述參見例如Whelen，A.C.和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47)。
特別優(yōu)選的是在WO 92/02638和相應(yīng)的美國專利US 5,210,015；US 5,804,375；US 5,487,972中公開的TaqMan檢測方法。該方法采用聚合酶的核酸外切酶活性生成信號。詳細而言，檢測靶核酸組分的方法包括使樣品與含有與靶核酸組分區(qū)域序列互補的寡聚核苷酸和含有與相同靶核酸組分序列鏈的第二區(qū)域序列互補但不包括第一寡聚核苷酸定義的核酸序列的標(biāo)記寡聚核苷酸接觸，以在雜交條件期間生成雙鏈體混合物，其中雙鏈體包括退火為第一寡聚核苷酸和標(biāo)記寡聚核苷酸的靶核酸，使得第一寡聚核苷酸的3′-末端連接于標(biāo)記寡聚核苷酸的5′-末端。然后，用具有5′到3′核酸酶活性的模板依賴性核酸聚合酶在足夠使得聚合酶的5′到3′核酸酶活性能使退火的標(biāo)記寡聚核苷酸裂開并釋放標(biāo)記片段的條件下處理混合物。檢測和/或測量標(biāo)記寡聚核苷酸水解生成的信號。TaqMan技術(shù)消除了對形成固相結(jié)合反應(yīng)復(fù)合物的需要，并使其可檢測。更概括地，公開了純化靶核酸組分然后進行檢測步驟的過程，其中擴增和/或檢測反應(yīng)為均相溶液相。
本發(fā)明的另一個實施方案是將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供核酸的水溶液，該水溶液包含高濃度的鹽和具有式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；和(b)將步驟(a)的水溶液加到基材上。優(yōu)選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶?。更優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。同樣考慮了在自動化方法中使用步驟(a)的水溶液來純化(至少一種)核酸。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經(jīng)常具有包含溶液如儲備溶液的開口容器。在這個方面，溶液/或懸浮液的液相包含在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力和室溫下具有低蒸發(fā)傾向的溶劑是有利的。因此，非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞砜。還非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液中的鹽為濃度為1到8M的離液鹽。更優(yōu)選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液中的鹽的濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選粒度為0.1μm到1,000μm的多孔無機物基材。同樣優(yōu)選當(dāng)使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優(yōu)選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏松填充的形式。更優(yōu)選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含硅膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優(yōu)選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案中提供將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物中，以形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。優(yōu)選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶?。更優(yōu)選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了步驟(d)的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應(yīng)用。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經(jīng)常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如步驟(d)的懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力和室溫下具有低蒸發(fā)傾向的溶劑是有利的。因此，非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞砜。還非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。更優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。非常優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
優(yōu)選地，步驟(e)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優(yōu)選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優(yōu)選地，步驟(e)的組合物中鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，該基材分散在包括式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物中 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子。優(yōu)選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶８鼉?yōu)選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了本發(fā)明的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應(yīng)用。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經(jīng)常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如上述懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力和室溫下具有低蒸發(fā)傾向的溶劑是有利的。因此，非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞砜。還非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為使用包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物用于實施本文所述的方法 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
優(yōu)選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不屬于羧基官能的羰基。更優(yōu)選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了本發(fā)明的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應(yīng)用。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經(jīng)常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如上述懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力和室溫下具有低蒸發(fā)傾向的溶劑是有利的。因此，非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞砜。還非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
本發(fā)明的另一個實施方案為使用包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物用于制備懸浮液，其通過將基材分散于所述與水混溶的非酸性有機化合物中制備 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子。
優(yōu)選地，官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不屬于羧基官能的羰基。更優(yōu)選與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。還考慮了本發(fā)明的懸浮液在純化(至少一種)核酸的自動化方法中的應(yīng)用。能夠?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的自動化處理裝置，如具有移液裝置的自動機，經(jīng)常具有包含溶液如儲備溶液和懸浮液如上述懸浮液的開口容器。在這個方面，溶液和/或懸浮液的液相包含在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力和室溫下具有低蒸發(fā)傾向的溶劑是有利的。因此，非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為二甲亞砜。還非常優(yōu)選地，與水混溶的非酸性有機化合物為N-甲基-2-吡咯烷酮。
優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為使用本發(fā)明懸浮液用于實施本文所述的本發(fā)明的方法。
本發(fā)明同樣考慮了試劑盒。這種試劑盒在本領(lǐng)域中已知，其另外包括能夠在樣品制備過程中使用的塑料制品，如由德國漢堡的Eppendorf生產(chǎn)的96或384孔格式的微量滴定板或僅僅是普通的反應(yīng)管、和所有其它的用于實施本發(fā)明方法的試劑。因此，試劑盒可另外包含與核酸(和(至少一種)靶核酸組分)有親合力的材料，與核酸(和(至少一種)靶核酸組分)有親合力的材料優(yōu)選包括具有二氧化硅表面的材料。優(yōu)選地，具有二氧化硅表面的材料為玻璃。最優(yōu)選地，與核酸有親合力的材料包括磁性玻璃粒子，即涂有玻璃的可被磁吸引的粒子的組合物。另一個優(yōu)選的與核酸有親合力的材料為陰離子交換劑。試劑盒可進一步或另外包括胞溶緩沖溶液，其包含例如離液劑、洗滌劑、或其混合物，其能夠使細胞溶解。本發(fā)明的試劑盒的這些組分可分別在試管中或儲存容器中提供。根據(jù)組分的性質(zhì)，這些甚至可在一個試管或儲存容器中提供。試劑盒可進一步或另外包括適合于磁性玻璃粒子在結(jié)合有DNA或RNA時的洗滌步驟的洗滌液。這些洗滌液可包含本發(fā)明的與水混溶的非酸性有機化合物和/或在一種或多種不含本發(fā)明與水混溶的非酸性有機化合物的酸性pH的緩沖溶液中的離液劑；和/或如上所述的離液劑。通常洗滌液或其它溶液作為儲備溶液提供，其在使用之前必需經(jīng)過稀釋。試劑盒可進一步或另外包括洗脫劑或洗脫緩沖溶液，即溶液或緩沖溶液(如10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)或純水，以洗脫結(jié)合于磁性玻璃粒子上的DNA或RNA。另外，可存在有其它的試劑或緩沖溶液，用于核酸即DNA或RNA的純化方法。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩沖鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；(c)緩沖溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩沖鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物
(式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；(c)緩沖溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩沖鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)如上所述的本發(fā)明的懸浮液；(c)緩沖溶液。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩沖鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)如上所述的本發(fā)明的懸浮液；(c)緩沖溶液。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案為本發(fā)明的方法或試劑盒在如WO 99/16781中描述的可自動化的方法中的應(yīng)用。可自動化的方法是指該方法的步驟適合于使用在很少或沒有通過人類外部控制或影響下能夠進行操作的裝置或機器進行。自動化方法是指可自動化的方法的步驟使用在很少或沒有通過人類外部控制或影響下能夠進行操作的裝置或機器進行。只有方法的準(zhǔn)備步驟需要手工完成，如儲存容器必需被填充并放在位置上，樣品的選擇必需由人類完成，其它步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如控制計算機的操作。裝置或機器可例如自動添加液體、混合樣品、或在特定溫度下進行培養(yǎng)步驟。典型地，這種機器或裝置通過執(zhí)行其中規(guī)定了單個步驟和命令的程序的計算機進行自動控制。優(yōu)選的自動化方法為在高通量格式中實施的那些方法，所述高通量格式是指方法和所用機器或裝置被優(yōu)化用于在短時間內(nèi)處理高通量樣品。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的方法或試劑盒用于半自動化方法中，其是指某些反應(yīng)步驟必需通過手動完成。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，包含本發(fā)明的MGP(磁性玻璃粒子)的懸浮液被從儲存容器中取出并將部分加入到不同的反應(yīng)容器中。反應(yīng)容器可能是由塑料制成最終為包含96或384孔或更多孔的微量滴定板格式的反應(yīng)管，在孔中可進行反應(yīng)。然而，這些容器可由其它材料制成，例如鋼。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地是，本發(fā)明考慮的某些有機化合物能夠溶解某些塑料材料。因此，當(dāng)確定適當(dāng)?shù)膬Υ嫒萜骰蚍磻?yīng)容器的性質(zhì)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在有限的顯而易見的試驗中確定最適合進行本發(fā)明的方法或生產(chǎn)本發(fā)明的試劑盒的材料。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的試劑盒被用于在研核酸的純化、生物分析或診斷。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的試劑盒或本發(fā)明的方法被用于高通量格式中，即，用于允許在非常短的時間分析大量不同樣品的自動化方法中。
本發(fā)明的另一個實施方案為測定生物樣品中的核酸存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物包含(i)步驟(a)胞溶生物樣品、(ii)緩沖水溶液、(iii)高濃度鹽、(iv)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附于基材上；(d)任選地用洗滌液洗具有吸附的核酸的基材；然后，(e)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和(f)將從基材解吸的核酸與溶液分離；和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。優(yōu)選地，通過核酸的擴增測定核酸，其通過使用特異引物、特異性檢測探針、和擴增混合物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方式擴增，從而實時監(jiān)測擴增。同樣優(yōu)選的是通過使核酸雜交于雜交探針并檢測和/或?qū)﹄s交體定量化而測定核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道不僅核酸可作為雜交探針，而且可以使用包含一種或多種核苷類似物的核酸。另外，本領(lǐng)域已知核酸類似物如PNA能夠與核酸形成可檢測的雜交體?？梢岳斫?，要被檢測的核酸為DNA或RNA。非常優(yōu)選的是上述方法，其中核酸為RNA以及步驟(g)包括(i)使RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，(ii)隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方式擴增cDNA，(iii)檢測cDNA的存在，從而測定核酸的存在。
本發(fā)明的發(fā)明人同樣發(fā)現(xiàn)，與水混溶的環(huán)狀二醚是適合于實施本發(fā)明的方法的非酸性有機化合物。
因此，本發(fā)明的另一個實施方案為純化核酸的方法，其包括以下步驟a)將核酸從組合物吸附于基材上，所述組合物包含(i)緩沖水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)與水混溶的環(huán)狀二醚、和(iv)核酸；b)任選地用洗滌液洗具有吸附的核酸的基材；然后，c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和d)將從基材解吸的核酸與溶液分離，從而純化核酸；和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉淀并分離沉淀的核酸，從而進一步純化核酸。優(yōu)選地，與水混溶的環(huán)狀二醚是二氧雜環(huán)己烷。
優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(a)的組合物包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。
優(yōu)選地，步驟(a)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優(yōu)選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優(yōu)選地，步驟(a)的組合物中鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優(yōu)選地，洗滌液包含與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，洗滌液包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，洗滌液包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，洗滌液包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，洗滌液包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，洗滌液包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，洗滌液包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。
優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選粒度為0.1μm到1,000μm的無機物基材。同樣優(yōu)選當(dāng)使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優(yōu)選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏松填充的形式。更優(yōu)選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含硅膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優(yōu)選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟a)提供包含高濃度鹽和與水混溶的環(huán)狀二醚的核酸水溶液；和b)將步驟(a)的水溶液加入基材。優(yōu)選地，與水混溶的環(huán)狀二醚是二氧雜環(huán)己烷。
優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。
優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優(yōu)選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優(yōu)選地，步驟(a)的水溶液中的鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選粒度為0.1μm到1,000μm的無機物基材。同樣優(yōu)選當(dāng)使用時，多孔的無機物載體材料的孔徑大小為2到1,000nm。更優(yōu)選地，多孔或無孔載體材料，特別是沸石，為疏松填充的形式。更優(yōu)選地，無機物基材由玻璃形式的濾板、石英或陶瓷濾板、和/或包含硅膠的膜、和/或無機物載體的粒子或纖維和石英或玻璃棉的織物組成。同樣優(yōu)選地，基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供與水混溶的環(huán)狀二醚；(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的環(huán)狀二醚中形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。優(yōu)選地，與水混溶的環(huán)狀二醚為二氧雜環(huán)己烷。
優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含2到35體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。更優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含約4體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含約15體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。非常優(yōu)選地，步驟(e)的組合物包含約25體積百分數(shù)的與水混溶的環(huán)狀二醚。
優(yōu)選地，步驟(e)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M。更優(yōu)選地，所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
同樣優(yōu)選地，步驟(e)的組合物中鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，該基材分散在與水混溶的環(huán)狀二醚中。優(yōu)選地，與水混溶的環(huán)狀二醚為二氧雜環(huán)己烷。
優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為與水混溶的環(huán)狀二醚在實施本文所述的本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。優(yōu)選地，環(huán)狀二醚為二氧雜環(huán)己烷。
本發(fā)明的另一個實施方案為使用與水混溶的環(huán)狀二醚用于制備懸浮液，其通過將基材分散在所述與水混溶的環(huán)狀二醚中形成所述基材的懸浮液。優(yōu)選地，環(huán)狀二醚為二氧雜環(huán)己烷。
優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自硅膠、玻璃、石英、和沸石。同樣優(yōu)選地，基材包括粉狀多孔或無孔無機物基材，其選自金屬氧化物，和/或金屬混合的氧化物、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯、和主要由玻璃組成的材料。同樣優(yōu)選基材包括可被磁吸引的粒子。更優(yōu)選地，可被磁吸引的粒子涂有選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的無機物基材。更優(yōu)選地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本發(fā)明的另一個實施方案為使用上述本發(fā)明的懸浮液用于實施本文所述的本發(fā)明的方法。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包含(a)緩沖鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)二氧雜環(huán)己烷；(c)緩沖溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)二氧雜環(huán)己烷；(c)緩沖溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)上述本發(fā)明的在二氧雜環(huán)己烷中的懸浮液；(c)緩沖溶液。
本發(fā)明的另一個實施方案為各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)上述本發(fā)明的在二氧雜環(huán)己烷中的懸浮液；(c)緩沖溶液。
提供以下實施例、參考文獻、和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正保護范圍在附加的權(quán)利要求書中闡述?？梢岳斫饪蓪λ鲞^程中進行修飾，而不脫離本發(fā)明的精神實質(zhì)。


圖1a使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的各方案和試劑盒從8倍復(fù)制的106海拉細胞分離RNA。對于這些分離，將MGP(磁性玻璃粒子)再懸浮于水中或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。然后在瓊脂糖凝膠上分析具有純化RNA的洗脫液。道次1-8，即使用再懸浮于水中的MGP的RNA制劑，其帶非常弱，并幾乎不能重現(xiàn)。M表示尺寸標(biāo)記。道次9-16表示使用再懸浮于NMP中的MGP的制劑得到的RNA帶。
圖1b使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim；目錄號碼3186229)的各方案和試劑盒從4倍復(fù)制的106海拉細胞分離RNA。對于這些分離，將MGP(磁性玻璃粒子)再懸浮于異丙醇中或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。然后在瓊脂糖凝膠上分析具有純化RNA的洗脫液。
圖2使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim；目錄號碼3186229)的各方案和試劑盒從8倍復(fù)制的1ml血液中分離DNA。對于這些分離，將MGP(磁性玻璃粒子)再懸浮于異丙醇中或N-甲基-2-吡咯烷酮或水中。然后在瓊脂糖凝膠上分析具有純化DNA的洗脫液。
圖3a、3bTaqMan PCR過程中的熒光信號。X軸表示PCR周期的數(shù)目，Y軸為檢測器測得的以[mV]為單位的熒光信號?！癛300”曲線反映了由凈化水中10,000拷貝陽性對照靶RNA得到的信號。“R30”曲線反映了由凈化水中1,000拷貝陽性對照靶RNA得到的信號。另外的曲線為“NMP”(1-甲基-2-吡咯烷酮)、“PC”(異丙二醇碳酸酯)、“yBL”(γ-丁內(nèi)酯)、和“noBC”(沒有加入結(jié)合調(diào)節(jié)劑)的曲線。
具體實施例方式
實施例1使用玻璃纖維分離DNA用100μl的蛋白酶K溶液(Roche Id.No.745723，90mg溶解于4.5毫升水中)和1,200μl離液結(jié)合緩沖溶液(6M鹽酸胍，10mMTrisHCl，20％ Triton X 100 pH4.4)在70℃培養(yǎng)得自健康供體的1,000μl全血10分鐘。
加入500μl的(a)異丙醇、(b)乙腈、(c)二甲亞砜或(d)甲基乙基酮之后，將胞溶產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維濾管(濾管取自Macherey undNagel Cat.No.740 954.20的試劑盒)中。以1,900xg離心3分鐘之后，棄去流通液(flowthrough)并將濾管放在接收管上。將2,000μl高離子抑制劑清除緩沖溶液(5M鹽酸胍，20mMTris，60％乙醇，pH6.6)移液于玻璃纖維過濾器上并以3,000xg離心1分鐘。然后用2,000μl洗滌緩沖溶液(20mMNaCl，2mMTrisHCl，80％乙醇，pH 7.5)的兩個洗滌步驟并以3,000xg離心5分鐘。棄去流通液。使用新的接收管。DNA的洗脫使用300μl 70℃的熱Tris緩沖溶液(10mM，pH8.5)完成。培養(yǎng)5分鐘之后，試管以3,000xg離心5分鐘。
分離的DNA的分析由使用標(biāo)準(zhǔn)光度計從OD260nm測量結(jié)果計算DNA收率。通過計算OD260/280nm的比例評價純度。結(jié)果(n＝2)如表1中所示。
表1從1,000μl全血分離DNA

實施例2在MagNA Pure LC儀器上分離RNA將106海拉細胞(體積200μl)直接轉(zhuǎn)移到MagNA Pure LC儀器(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim)的樣品筒。從軟件選擇各個方案，將必要的塑料一次用品和試劑盒試劑安裝在工作站上，并開始自動化的RNA分離。然后MagNA Pure LC儀器自動地進行所有的分離和純化步驟，如用特定的胞溶/結(jié)合緩沖溶液使細胞胞溶、用蛋白酶K的酶促蛋白質(zhì)消化、用脫氧核糖核酸酶I的酶促DNA消化、RNA與磁性玻璃粒子(MGP)的結(jié)合、幾個洗滌步驟以除去未結(jié)合物質(zhì)和雜質(zhì)、純RNA在特定洗脫緩沖溶液中的洗脫和最后將洗脫液轉(zhuǎn)移到冷卻的儲存筒中。
當(dāng)分析非酸性有機化合物如N-甲基-2-吡咯烷酮在核酸分離過程中的性能時，將干燥的MGP懸浮在適當(dāng)體積的各個非酸性有機化合物中，并將懸浮液與MagNA Pure試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的所有其它試劑一起用于MagNA Pure LC儀器。
與水相比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用N-甲基-2-吡咯烷酮制備磁性玻璃粒子的懸浮液時，RNA收率更高。與異丙醇相比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用N-甲基-2-吡咯烷酮制備磁性玻璃粒子的懸浮液時，RNA收率相等或更高。
表2從106海拉細胞分離RNA(也參見圖1a、圖1b)

結(jié)果也在圖1a(i、ii)和1b(iii、iv)表示。
實施例3在MagNA Pure LC儀器上分離DNA將人血(1ml)直接轉(zhuǎn)移到MagNA Pure LC儀器(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)的樣品筒。從軟件選擇各個方案，將必要的塑料一次用品和試劑盒試劑安裝在工作站上，并開始DNA的自動化分離。然后MagNA Pure LC儀器自動地進行所有的分離和純化步驟，如用特定的胞溶/結(jié)合緩沖溶液使細胞胞溶、用蛋白酶K的酶促蛋白質(zhì)消化、DNA與磁性玻璃粒子(MGP)的結(jié)合、幾個洗滌步驟以除去未結(jié)合的物質(zhì)和雜質(zhì)、純DNA在特定洗脫緩沖溶液中的洗脫和最后將洗脫液轉(zhuǎn)移到冷卻的儲存筒中。
當(dāng)分析非酸性有機化合物如N-甲基-2-吡咯烷酮在核酸分離過程中的性能時，將干燥的MGP懸浮在適當(dāng)體積的各個非酸性有機化合物中，并將懸浮液與MagNA Pure試劑盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的所有其它試劑一起用于MagNA Pure LC儀器。
對分離的DNA的分析在1％瓊脂糖凝膠上檢查分離的DNA的完整性，用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓與分子量標(biāo)記物III(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)一起染色。使用標(biāo)準(zhǔn)光度計從OD260hm的測量結(jié)果計算DNA收率。通過計算OD260/280nm的比例評價純度。為保證使用MagNA Pure方案和N-甲基-2-吡咯烷酮或其它非酸性有機化合物分離的DNA可被擴增，使用如LightCycler Factor V Mutation DetectionKit或LightCycler Her2neu DNA Quantification Kit(都來自RocheDiagnostics GmbH，Mannheim)對所有樣品在LightCycler儀器上進行PCR。在所有情況中擴增都獲得成功。
表3從1,000μl全血分離DNA(也參見圖2)

使用N-甲基-2-吡咯烷酮得到的DNA收率與異丙醇相同，使用水得到的收率低得多。圖2說明了這些結(jié)果。
實施例4
從血清樣品分離RNA胞溶和調(diào)節(jié)得自健康患者的200μl體積的血清與20μl的蛋白酶K溶液(酶活性6,000 U/ml，沒有脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶活性)混和并在37℃培養(yǎng)5分鐘。隨后，將600μl的胞溶緩沖溶液與經(jīng)過蛋白酶K處理的樣品混和，得到胞溶溶液。胞溶緩沖溶液包含溶解于水中的以下化合物表4

隨后，向胞溶溶液加入380μl結(jié)合調(diào)節(jié)劑，并混和，得到吸附液。使用100％的γ-丁內(nèi)酯(CAS 96-48-0)、100％的異丙二醇碳酸酯(CAS108-32-7)或100％的1-甲基-2-吡咯烷酮(CAS 872-50-4)作為結(jié)合調(diào)節(jié)劑。
吸附于固相將第一個600μl試樣量的經(jīng)過調(diào)節(jié)的胞溶溶液轉(zhuǎn)移到具有玻璃羊毛狀物作為固相的市售自旋柱中。優(yōu)選地，使用得自High Pure PCRTemplate Preparation Kit(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目錄編號1796828)的High Pure Spin Filter管作為自旋柱。具有第一個600μl試樣量的自旋柱以4,300xg離心1分鐘。然后將第二個試樣量轉(zhuǎn)移到相同的自旋柱并在相同條件下重復(fù)離心步驟。
洗滌洗滌柱三次，每次使用150μl的洗滌緩沖溶液。洗滌緩沖溶液包含溶解于水中的以下化合物
表5

對于前兩個洗滌步驟，將洗滌緩沖溶液轉(zhuǎn)移到自旋柱并以4,300xg離心1分鐘。第三個洗滌步驟有所改變，柱以13,200xg離心3分鐘。
代替通過離心(第三個洗滌步驟，參見上面)的方式除去洗滌緩沖溶液，固相可選地在65℃下干燥10分鐘。
洗脫對于這個步驟，使用包含溶解于水中的以下化合物的洗脫緩沖溶液表6

將150μl的洗脫緩沖溶液轉(zhuǎn)移到自旋柱，并以4,300xg自旋柱1分鐘。收集洗脫液用于進一步分析。
實施例5RNA分析如實施例4所述處理攙入10,000拷貝的陽性對照靶RNA(純化的丙型肝炎病毒RNA)的血清樣品。洗脫液中靶RNA的含量通過TaqManPCR使用Roche HCV檢測試劑盒測定。
對于回收率(＝處理之后的量/處理之前的量)的計算，使用標(biāo)準(zhǔn)樣品運行檢測過程。圖3a和3b表示相當(dāng)于10,000拷貝的“R300”曲線(即300％回收率)，和相當(dāng)于1,000拷貝的“R30”曲線(即30％回收率)。
圖3a和3b表示典型實驗的結(jié)果。而沒有結(jié)合調(diào)節(jié)劑(“noBC”)的對照實驗得到非常低的回收率(沒有發(fā)現(xiàn)靶)，加入結(jié)合調(diào)節(jié)劑(“NMP”N-甲基-2-吡咯烷酮、“PC”異丙二醇碳酸酯、或“gBL”γ-丁內(nèi)酯)得到針對對照RNA高于50％的回收率。
將雜質(zhì)留在洗脫液中的樣品制備過程可損害TaqMan PCR方法過程中形成的信號。因此，監(jiān)測信號形成以評價RNA制備的質(zhì)量/純度。上個PCR周期之后的熒光信號值作為測量值。作為參考，使用潔凈陽性對照RNA(與攙入血清的RNA相同)在純水中的已知量。圖3a和3b說明典型實驗的結(jié)果。而在沒有結(jié)合調(diào)節(jié)劑(主要由于沒有回收)的制備中熒光信號的形成是可忽略不計的，加入結(jié)合調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致信號形成的改善，其可與用純靶發(fā)現(xiàn)的信號形成相當(dāng)。
實施例6樣品處理時間來自醫(yī)院并且其中樣品具有升高的甘油三酯值的樣品根據(jù)以下方案處理750μl體積的血清與75μl蛋白酶K溶液(酶活性6,000U/ml，沒有脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶活性)在37℃培養(yǎng)5分鐘。然后，加入1,405μl體積的胞溶緩沖溶液(根據(jù)表4)并混合。隨后，加入880μlγ-丁內(nèi)酯或880μl96％乙醇并混合，得到兩種不同類型吸附液。
在+1巴的恒壓下使每個吸附液通過包含直徑為5mm和厚度為1mm的玻璃纖維羊毛狀物(得自Roche“High Pure”試劑盒)的柱裝置處理。測量全部體積通過裝置所需的時間(也稱為“結(jié)合時間”)。結(jié)果總結(jié)在表7中。
表7

*認為是正常的，**升高的甘油三酯值參考文獻Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987Barany，F(xiàn).，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16Barany，F(xiàn).，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503DE 3724442EP 0439182A2EP 0658164Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86(1989)1173-1177Marko，M.A等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第3版，CSHLPress，2001US 4,683,195US 5,130,238US 5,210,015US 5,487,972US 5,804,375Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996WO 01/37291WO 90/01069WO 91/00212WO 92/02638WO 92/08800WO 99/16781Wu，D.Y.，和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209
權(quán)利要求
1.純化核酸的方法，其包括以下步驟(a)將核酸從組合物吸附于基材上，所述組合物含有(i)緩沖水溶液，(ii)高濃度鹽，(iii)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物 (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子，和(iv)核酸；(b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材，然后，(c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度，和(d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸，和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉淀并分離沉淀的核酸，從而進一步純化核酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不屬于羧基官能的羰基。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
4.權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其特征在于步驟(a)的組合物包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于步驟(a)的組合物包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
6.權(quán)利要求1到5中任一項的方法，其特征在于步驟(a)的組合物中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M，并且所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
7.權(quán)利要求1到5中任一項的方法，其特征在于步驟(a)的組合物中鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
8.權(quán)利要求1到7中任一項的方法，其特征在于步驟(b)的洗滌液包含與水混溶的非酸性有機化合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于步驟(b)的洗滌液包含1到100體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
10.權(quán)利要求1到9中任一項的方法，其特征在于基材包括選自硅膠、玻璃纖維、石英纖維和沸石的多孔或無孔無機物基材。
11.權(quán)利要求1到9中任一項的方法，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
12.將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供核酸的水溶液，該水溶液包含高濃度的鹽和與水混溶的非酸性有機化合物，該有機化合物包含式I官能團 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶?，和與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；然后(b)將步驟(a)的水溶液加到基材上。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于步驟(a)的水溶液包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其特征在于步驟(a)的水溶液包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
15.權(quán)利要求12到14中任一項的方法，其特征在于步驟(a)的水溶液中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M，并且所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
16.權(quán)利要求12到14中任一項的方法，其特征在于步驟(a)的水溶液中的鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
17.權(quán)利要求12到16中任一項的方法，其特征在于基材包括選自硅膠、玻璃纖維、石英纖維、和沸石的多孔或無孔無機物基材。
18.權(quán)利要求12到16中任一項的方法，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
19.將核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步驟(a)提供包含高濃度鹽的核酸水溶液；(b)提供粉狀材料形式的基材；(c)提供包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物， (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物的所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶筒襟E(c)的與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；然后(d)將步驟(b)的基材分散在步驟(c)的與水混溶的非酸性有機化合物中形成所述基材的懸浮液；和(e)將步驟(a)的水溶液與步驟(d)的懸浮液混合。
20.權(quán)利要求19的方法，其特征在于步驟(e)的組合物包含1到50體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其特征在于步驟(e)的組合物包含3到30體積百分數(shù)的與水混溶的非酸性有機化合物。
22.權(quán)利要求19到21中任一項的方法，其特征在于步驟(a)的水溶液中的鹽為離液鹽，其濃度為1到8M，并且所述離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉。
23.權(quán)利要求19到21中任一項的方法，其特征在于步驟(e)的組合物中的鹽濃度為1到10M，并且所述鹽選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物。
24.權(quán)利要求19到23中任一項的方法，其特征在于基材包括選自硅膠、玻璃、石英、和沸石的粉狀多孔或無孔無機物基材。
25.權(quán)利要求19到24中任一項的方法，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
26.包含粉狀材料形式的基材的懸浮液，所述基材分散在包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物中 (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶?，和與水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
27.權(quán)利要求26的懸浮液，其特征在于基材包括選自硅膠、玻璃、石英和沸石的粉狀多孔或無孔無機物基材。
28.權(quán)利要求26到27中任一項的懸浮液，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
29.包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物在實施權(quán)利要求1到25中任一項的方法中的應(yīng)用， (式I)其中W為碳原子或硫原子，Z為氧原子或氮原子，和所述官能團選自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲?；倌芑蝓０分械牡粚儆隰然倌艿聂驶团c水混溶的非酸性有機化合物選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
30.權(quán)利要求26到28中任一項的懸浮液在實施權(quán)利要求19到25中任一項的方法中的應(yīng)用。
31.各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮的與水混溶的非酸性有機化合物；(c)緩沖溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
32.各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)選自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亞砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、異丁基甲基酮、γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、異丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮的與水混溶的非酸性有機化合物；(c)緩沖溶液；和(d)色譜材料和過濾材料。
33.各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和離液鹽的濃儲備液，離液鹽選自高氯酸鈉、鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、和碘化鈉；(b)權(quán)利要求26到28中任一項的懸浮液；(c)緩沖溶液。
34.各組件的試劑盒，其包括(a)緩沖鹽和選自氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、脲、及其混合物的鹽的濃儲備液；(b)權(quán)利要求26到28中任一項的懸浮液；(c)緩沖溶液。
35.測定生物樣品中核酸的存在的方法，其包括以下步驟(a)使生物樣品胞溶；(b)形成組合物，該組合物包含(i)步驟(a)的胞溶生物樣品，(ii)緩沖水溶液，(iii)高濃度鹽，(iv)包含式I官能團的與水混溶的非酸性有機化合物， (式I)其中W為碳原子或硫原子，和Z為氧原子或氮原子；(c)將步驟(b)的組合物與基材接觸，從而將核酸吸附于基材上；(d)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然后(e)將吸附有核酸的基材與舍有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和(f)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，和(g)檢測步驟(f)的溶液中核酸的存在，從而測定核酸的存在。
36.權(quán)利要求35的方法，其特征在于核酸為RNA或DNA。
37.權(quán)利要求35和36中任一項的方法，其特征在于核酸為RNA，步驟(g)包括(i)使RNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，(ii)隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增cDNA，(iii)檢測cDNA的存在，從而測定核酸的存在。
全文摘要
本發(fā)明要解決的問題是提供可供選擇的使用在含水吸附液中的可供選擇的物質(zhì)用于核酸的色譜純化的方法，目的在于促進核酸與基材如無機物載體結(jié)合。本發(fā)明提供了純化核酸的方法，其包括以下步驟(a)將核酸從組合物吸附于基材上，所述組合物包含(i)緩沖水溶液、(ii)高濃度鹽、(iii)與水混溶的非酸性有機化合物、和(iv)核酸；(b)任選地用洗滌液洗滌吸附有核酸的基材；然后，(c)將吸附有核酸的基材與含有鹽的溶液接觸，從而使核酸從基材解吸，該含有鹽的溶液中鹽的濃度低于步驟(a)的組合物中鹽的濃度；和(d)將含有解吸核酸的溶液與基材分離，從而純化核酸；和任選地(e)使解吸核酸從步驟(d)的溶液中沉淀并分離沉淀的核酸，從而進一步純化核酸。
文檔編號C12Q1/68GK1616477SQ20041008358
公開日2005年5月18日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月13日
發(fā)明者F·貝格曼, M·柯西格澤, T·瓦爾特, K·魏因德爾, R·齊倫斯基, E·薩洛芬 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司