專利名稱：植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物工程和植物改良基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子GaRDL1的序列及其表皮毛特異表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件。本發(fā)明還公開了GaRDL1啟動(dòng)子的用途，尤其在棉纖維和腺毛次生代謝基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物表皮毛是單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞分化、極性生長(zhǎng)和形態(tài)建成的一個(gè)模式系統(tǒng)(Hulskamp，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5，471-480)。植物表皮毛分為腺毛和非腺毛，主要的功能是保護(hù)植物，如抵御蟲害、減少蒸發(fā)、提高抗凍力和防紫外線等(Marks等，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，137-163)。其中，棉纖維和腺毛還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(Wilkins等，2000，Crit.Rev.Plant Sci.19，511-550；Wagner等，2004，Ann.Bot.(Lond)93，3-11)。
棉纖維是棉花種子的表皮毛，它是紡織工業(yè)最重要的天然纖維原料(Kim和Triplett，2001，Plant Physiol.1271361-1366)。E6啟動(dòng)子是第一個(gè)分離到的棉纖維高表達(dá)啟動(dòng)子，但是E6啟動(dòng)子除了在棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)外，在子房、花和葉中也有少量表達(dá)。E6啟動(dòng)子已用于改良棉纖維的基因工程(John和keller，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，12768-12773)。
我國(guó)是目前世界上最大的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)家，但是我國(guó)迄今尚未在棉纖維上擁有具自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的啟動(dòng)子，這阻礙了我國(guó)改良棉纖維的基因工程研究。大約三分之一的維管植物具有腺毛。植物腺毛分泌豐富的代謝產(chǎn)物，如萜類、糖、多糖、吲哚、煙堿和脂肪酸等，這些代謝產(chǎn)物可吸引昆蟲傳粉、防止動(dòng)物取食和賦予植物芳香味，以及用于醫(yī)藥等用途(McCaskill和Croteau，1999，NatBiotechnol.17，31-6；Wagner等，2004，Ann.Bot.93，3-11)。
基因表達(dá)的特異性決定于它的啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件。特異表達(dá)啟動(dòng)子是基因工程改良生物品質(zhì)性狀的基本元件。有了啟動(dòng)子，再連接上特定性狀相關(guān)的基因，可以定向改變生物的品質(zhì)性狀。但是，迄今還沒(méi)有植物表皮毛(棉纖維)特異表達(dá)的順式調(diào)控元件的報(bào)道。
綜上所述，為了改良棉纖維的品質(zhì)性狀和調(diào)控植物表皮毛次生代謝，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的更特異的植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子GaRDL1，及相關(guān)的植物表皮毛特異表達(dá)順式調(diào)控元件。
本發(fā)明的另一目的是提供產(chǎn)生GaRDL1啟動(dòng)子的方法以及其應(yīng)用，特別是在棉纖維和腺毛次生代謝基因工程中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種啟動(dòng)子元件，它包括植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子GaRDL1的核苷酸序列。
較佳地，所述的啟動(dòng)子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于在植物表皮毛中特異性表達(dá)的構(gòu)建物，它含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的上述的GaRDL1啟動(dòng)子元件。
在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因是MYB基因。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，該載體含有上述的GaRDL1啟動(dòng)子元件。較佳地，所述的載體是表達(dá)載體和質(zhì)粒。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種在植物表皮毛中特異性表達(dá)外源基因的方法(也是一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法)，它包括步驟(a)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的所述的GaRDL1啟動(dòng)子元件，(b)將步驟(a)中的構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)將步驟(b)中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成植株，從而使使外源基因在植物表皮毛中表達(dá)。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種植物表皮毛特異表達(dá)順式調(diào)控元件，選自下組(a)L1 box調(diào)控元件，序列為SEQ ID NO1中82-89位；
(b)MYB基序調(diào)控元件，序列為SEQ ID NO1中103-108位。
在本發(fā)明的第六方面，提供了所述的GaRDL1啟動(dòng)子元件或上述植物表皮毛特異表達(dá)順式調(diào)控元件的用途，它們被用于在植物表皮毛中特異性表達(dá)外源基因或用于改良棉纖維。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了GaRDL1啟動(dòng)子的序列(SEQ ID NO1)。圖中下劃線的序列TGCATTTA、CAGTTG和TATAAAT分別是調(diào)控元件L1 box、MYB motif和TATA box。其中，GaRDL1啟動(dòng)子位于GaRDL1基因翻譯起始位點(diǎn)ATG上游的-221～+81。L1 box和MYB motif的序列分別位于GaRDL1基因的-140～-133和-119～-114。
圖2顯示了GaRDL1基因在棉花中的表達(dá)特征。DPA代表開花后的天數(shù)(dayspost-anthesis)。His代表histone3基因。rRNA代表核糖體RNA。
圖3顯示了GaRDL1∷GUS在擬南芥中的表達(dá)特征。
圖4顯示了GaRDL1啟動(dòng)子對(duì)擬南芥腺毛次生代謝的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次從亞洲棉(Gossypium arboreum)(也稱為木本棉)中分離到一個(gè)植物表皮毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子，命名為GaRDL1啟動(dòng)子。Northern雜交和RT-PCR分析的試驗(yàn)結(jié)果表明，GaRDL1是一個(gè)棉纖維特異表達(dá)的基因；GaRDL1∷GUS分析表明，GaRDL1是一個(gè)擬南芥表皮毛特異表達(dá)的啟動(dòng)子；接頭掃描和點(diǎn)突變分析表明，L1 box和MYB基序元件是決定GaRDL1啟動(dòng)子在表皮毛中特異表達(dá)的順式調(diào)控元件。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“GaRDL1是Gossypium arboreum RD22-like 1的縮寫。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“GaRDL1啟動(dòng)子”、“GaRDL1啟動(dòng)子區(qū)域”可互換使用，指具有GaRDL1啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO1)或其活性片段的多聚核苷酸。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的一段序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“順式調(diào)控元件”是指對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起調(diào)節(jié)作用的保守堿基序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異表達(dá)”是指基因在特定的時(shí)間和特定的組織表達(dá)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“目的基因”是指基因工程中與特定品質(zhì)性狀相關(guān)的基因。
本發(fā)明涉及GaRDL1啟動(dòng)子及其多核苷酸變異體。這些多核苷酸變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變?cè)搯?dòng)子的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上至GaRDL1啟動(dòng)子的全長(zhǎng)。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離本發(fā)明的啟動(dòng)子的核苷酸序列。
本發(fā)明的GaRDL1啟動(dòng)子的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用棉花基因組DNA作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到本發(fā)明啟動(dòng)子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的啟動(dòng)子元件。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子元件的構(gòu)建物或載體，以及用所述構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞(尤其是植物細(xì)胞)，以及由此產(chǎn)生外源蛋白和將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成植株的方法。
適用于本發(fā)明的外源基因沒(méi)有特別限制，幾乎所有的外源基因都可用于本發(fā)明，尤其是與。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)GaRDL1基因、MYB基因、GaMYB2基因(SEQ ID NO4或6)、GFP基因等。將這些基因與本發(fā)明的GaRDL1啟動(dòng)子相連，形成含外源基因的構(gòu)建物，然后將所述構(gòu)建物用于基因治療。
一類優(yōu)選的外源基因是MYB基因。MYB基因是克隆棉纖維發(fā)育關(guān)鍵基因的焦點(diǎn)，一些自棉纖維中分離的MYB基因的表達(dá)特征和進(jìn)化關(guān)系受到重視(Cedroni等，2003，Plant Mol.Biol.51313-325)。
一種構(gòu)建物的例子就是與GaRDL1啟動(dòng)子直接相連的外源基因。通常，GaRDL1啟動(dòng)子應(yīng)位于外源基因的上游。
本發(fā)明中，含GaRDL1啟動(dòng)子元件的核苷酸序列可優(yōu)選地插入到載體，例如表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細(xì)菌)、真核(如酵母)、植物細(xì)胞中的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達(dá)載體中，除了含有含有復(fù)制起點(diǎn)、GaRDL1啟動(dòng)子元件之外，還可含有標(biāo)記基因和其他翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含GaRDL1啟動(dòng)子和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地與待表達(dá)的外源基因相連接，以指導(dǎo)所述外源基因mRNA合成。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)外源蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。
在應(yīng)用本發(fā)明的啟動(dòng)子時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得表皮毛改變的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于GaRDL1啟動(dòng)子具有極高的植物表皮毛表達(dá)的特異性，因此在棉纖維和腺毛次生代謝基因工程中具廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular cloningA laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1GaRDL1啟動(dòng)子的分離棉花DNA提取采用冷酚法。2g材料(亞洲棉(Gossypium arboreum)的棉纖維)，在液氮中磨成粉末，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入8ml提取緩沖液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，震蕩混勻，冰上放置1小時(shí)，每隔10分鐘混勻一次。4℃，13000g離心20分鐘。重復(fù)酚∶氯仿∶異戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。取上清夜，加入1/2體積的高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉，1.2M NaCl)和1/2體積異丙醇，混勻，-70℃放置1小時(shí)。4℃，13000g離心20分鐘。以下根據(jù)提取DNA和RNA而采取相應(yīng)的操作。去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室溫吹20分鐘，沉淀溶于1ml無(wú)菌水。4℃，13000g離心10分鐘。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30分鐘。
用以下引物RDL1-P-F5’-AATTAGTTATGTTTGGTAAATGAATTTG-3’(SEQ ID NO2)和RDL1-P-R5’-CTAGAACAG GAGTGACTAATTCTA-3’(SEQ ID NO3)。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃預(yù)變性30秒鐘，60℃復(fù)性30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。亞克隆后經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列是否正確。
測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO1和圖1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為302個(gè)堿基，其中下劃線的序列TGCATTTA、CAGTTG和TATAAAT分別是調(diào)控元件L1 box(L1盒)、MYB motif(MYB基序)和TATA box(TATA盒)。
用上述相同方法抽提棉花的各種組織的DNA，用相同引物進(jìn)行常規(guī)的RT-PCR。還用基于SEQ ID NO1的探針進(jìn)行Northern雜交分析。結(jié)果表明GaRDL1是一個(gè)棉纖維特異表達(dá)的基因(圖2)。
實(shí)施例2載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化根據(jù)載體多克隆區(qū)域、GaRDL1啟動(dòng)子和目的基因的限制性酶切位點(diǎn)的分布情況，確定融合片段插入載體的酶切位點(diǎn)，然后采用PCR方法將酶切位點(diǎn)引入GaRDL1啟動(dòng)子和目的基因。經(jīng)酶切和連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR法鑒定陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證。
根據(jù)外源基因GUS基因的全長(zhǎng)編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(對(duì)應(yīng)于最前20bp和最后20bp)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到GUS序列，然后與GaRDL1啟動(dòng)子直接相連(位于啟動(dòng)子下游)。然后將該DNA序列(GaRDL1∷GUS序列)克隆至中間載體pBluescript(購(gòu)自Stratagene公司)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121(購(gòu)自Clontech公司)，在保證閱讀框的前提下鑒定好的表達(dá)載體，在將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，獲得陽(yáng)性克隆，用于轉(zhuǎn)化棉花和擬南芥等植物。
根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化采用凍融法。單菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mlLB培養(yǎng)基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡拉霉素Kan或慶大霉素Gen)，28℃，220rpm，過(guò)夜培養(yǎng)。2ml菌液，50ml LB培養(yǎng)基(25μg/ml Rif和50μg/mlGen)，28℃，220rpm，培養(yǎng)到OD600＝0.5(約6小時(shí))。在冰上放置30分鐘，4℃，5000g離心5分鐘。重懸于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g離心5分鐘。重懸于1ml 20mM CaCl2，50μl/管分裝，液氮速凍，-70℃保存感受態(tài)細(xì)胞。混合含目的基因雙元載體和50μl/管感受態(tài)細(xì)胞，在冰上放置30分鐘，液氮速凍1分鐘。在37℃水浴中5分鐘使菌液融化，加1ml LB培養(yǎng)基，28℃，220rpm，培養(yǎng)2～4小時(shí)。取50～100μl涂LB培養(yǎng)基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。
實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因后代的篩選在本實(shí)施例中，以棉花和擬南芥的轉(zhuǎn)基因?yàn)槔?，其他植物的轉(zhuǎn)化可以此為參照。
a.棉花的轉(zhuǎn)基因采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化棉花。
取5日齡的無(wú)菌苗下胚軸上部切段(0.5cm)預(yù)培養(yǎng)36小時(shí)。培養(yǎng)基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L。
下胚軸切段于農(nóng)桿菌菌液(SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L)中浸泡20分鐘。
共培養(yǎng)3天。培養(yǎng)基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L。
愈傷組織起始誘導(dǎo)25～30天。培養(yǎng)基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+Km50mg/L+頭孢霉素(cef)300mg/L或MSB+2，4-D 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L+ZT0.1mg/L+Km 50mg/L+cef 300mg/L。
胚性愈傷組織誘導(dǎo)及繼代篩選，每15天增殖一次。挑選松軟、淡綠色或灰色的愈傷組織用于胚性愈傷的誘導(dǎo)；挑選新鮮、黃色、致密、顆粒狀的胚性愈傷組織繼代增殖。培養(yǎng)基SH或MSB(NH4NO3為0.3mg/L)+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。
胚狀體形成和成熟。培養(yǎng)基MSB(KNO3加倍無(wú)激素)+Km 75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體(萌發(fā))伸長(zhǎng)、生長(zhǎng)。培養(yǎng)基MSB(無(wú)激素)+活性炭250mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體真葉生長(zhǎng)。培養(yǎng)基MSB+IBA0.4mg/L+KT0.1mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。部分成正常小植株；部分采取嫁接。
b.擬南芥的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的轉(zhuǎn)化采用花芽浸泡法(floral dip)(方法按Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743進(jìn)行)。含雙元載體的單菌落GV3101(Invitrogen公司)，3ml LB培養(yǎng)基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時(shí)。2ml菌液，50ml LB培養(yǎng)基(25μg/ml Rif、50μg/mlGen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時(shí)。50ml菌液，250ml LB培養(yǎng)基(50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時(shí)。4200rpm(2900g)，15分鐘。菌體重懸于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5sec，平放于塑料盆內(nèi)，保濕，避光，16～24小時(shí)。T0代種子在4℃春化2～4d，用20％漂水處理15分鐘，無(wú)菌水清洗3～4遍。懸于0.5％的瓊脂糖(55℃)，鋪在0.6％瓊脂的LB培養(yǎng)基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，連續(xù)光照，約一周后，綠色抗性苗移栽到營(yíng)養(yǎng)土(泥炭∶蛭石∶珍珠巖1∶1∶1)中生長(zhǎng)。
結(jié)果表明，外源的GUS基因特異地在葉片和莖的表皮毛表達(dá)，使表皮毛呈現(xiàn)出藍(lán)色(圖3)。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植物的分子生物學(xué)鑒定在本實(shí)施例中，選取實(shí)施例3獲得的擬南芥T3代純合株系，采用抗生素篩選、PCR、GUS染色和Southern雜交分析等方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行驗(yàn)證。
a.PCR分析DNA提取方法和PCR反應(yīng)條件見(jiàn)實(shí)施例1。引物為SEQ ID NO2和3。
b.GUS染色分析GUS染色液浸泡植物材料，37℃，12～24小時(shí)。70％乙醇脫色，樣品在70％乙醇中保存。GUS染色液(100mM pH7.0磷酸緩沖液，50mM K3[Fe(CN)6]，50mMK4[Fe(CN)6]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％Triton X-100)。
結(jié)果表明，外源的GUS基因特異地在葉片和莖的表皮毛表達(dá)(圖3)。
c.Southern雜交分析10μg DNA，選3～5種限制酶，完全酶切(過(guò)夜)。0.7％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后切去凝膠的無(wú)用部分。在變性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分鐘，溫和搖動(dòng)。去離子水漂洗，在中和液(1.5M NaCl，1M Tris·HCl，pH7.4)中浸泡45分鐘，溫和搖動(dòng)。
采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜Hybond-XL(Amersham-PharmaciaBiotech)，轉(zhuǎn)移緩沖液為20XSSC(3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉)，轉(zhuǎn)移時(shí)間為12-18小時(shí)。用6XSSC漂洗尼龍膜，夾在濾紙中間，壓在玻璃板之間，80℃烘2小時(shí)。
25ng經(jīng)割膠醇化的PCR產(chǎn)物，采用Primer-a-Gene Labeling System(Promega)標(biāo)記探針。α-32P-dCTP，50μl反應(yīng)體系，37℃，1小時(shí)。采用QIAquick NucleotideRemoval Kit(QIAGEN)純化探針。沸水浴中10分鐘，放置冰上。
將尼龍膜放入雜交管中，加10ml預(yù)雜交液(50％甲酰胺，5XSSC，5XDenhardt，1％SDS，100μg/ml變性魚精DNA)，42℃，2～4小時(shí)。加入變性的探針，雜交16～24小時(shí)。
去雜交液，在室溫用含0.1％SDS的2XSSC洗膜2次，每次5分鐘。在室溫用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次5分鐘。在42℃用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次15分鐘。在室溫用2XSSC洗膜2次。取出尼龍膜，滴干雜交液，用保鮮膜包裹，膠帶固定，壓增感屏和X-ray膠片，-70℃，2d。膠片用D-72液顯影。
試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株中的確轉(zhuǎn)入了GaRDL1啟動(dòng)子序列，而對(duì)照的擬南芥植株則不含GaRDL1啟動(dòng)子序列。
實(shí)施例5對(duì)擬南芥表皮毛的植物基因工程改造在本實(shí)施例中，按實(shí)施例3b中相同的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。不同點(diǎn)在于用植物表皮毛調(diào)控蛋白GaMYB2(一種棉花的MYB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO5所示，基因組DNA序列如SEQ ID NO4所示，cDNA序列如SEQ ID NO5所示)的基因組序列(SEQ ID NO4)替換GUS基因序列。
結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4表明，轉(zhuǎn)入擬南芥后，GaRDL1∷GaMYB2使野生型表皮毛減少。此外，GaRDL1∷GaMYB2完全互補(bǔ)擬南芥gl1突變體，使gl1無(wú)毛突變體的體毛恢復(fù)(圖中GaRDL1簡(jiǎn)寫為GL1)。這些結(jié)果表明，GaRDL1能用于在植物表皮毛中特異性表達(dá)外源基因或用于改良植物腺毛次生代謝。
實(shí)施例5表皮毛中特異表達(dá)的順式調(diào)控元件的確定用常規(guī)方法(Molecular cloningA laboratory manual，3rd ed.，Sambrook)進(jìn)行接頭掃描和點(diǎn)突變分析，然后按實(shí)施例3b的相同方法測(cè)定突變后的GaRDL1啟動(dòng)子能夠在擬南芥的表皮毛中表達(dá)GUS蛋白。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(a)L1 box調(diào)控元件(序列為SEQ ID NO1中82-89位)和(b)MYB基序調(diào)控元件(序列為SEQ ID NO1中103-108位。)是決定GaRDL1啟動(dòng)子在表皮毛中特異表達(dá)的順式調(diào)控元件。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子<130>044447<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>302<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>1aattagttat gtttggtaaa tgaatttgaa tacatgcacc accactctca atgctcaccc60acctaagccc atgacataaa ctgcatttaa gtgaaccagt ggcagttgga gccattatgt120tggttgaaaa atattgttgg cagtgttatt cagcagtact tgttctaagg ctcctactac180atttctcatt ataaatgtgg agaaatcttg ttctactttc cattccatgc aacactaact240tttagattcc ctttccattg cactgctctt tctttctata gaattagtca ctcctgttct300ag 302<210>2<211>28<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>2aattagttat gtttggtaaa tgaatttg 28<210>3<211>24<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>3ctagaacagg agtgactaat tcta 24<210>4<211>818<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<220>
<221>CDS<222>(74)..(209)
<223>
<220>
<221>CDS<222>(288)..(745)<223>
<400>4ccttcccttg tttctcacta atcatctctg tcttcccttc tcactctttg cctcttctca 60ctgtcggcta ata atg gct cca aag aag gat gga gtg agc aaa agg gtt 109Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val1 5 10ttt aac aaa ggt tct tgg aca gct gag gaa gat aga aga ttg gct aaa157Phe Asn Lys Gly Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys15 20 25tat att gag att cat ggc gca aag aga tgg aaa aca atc gcc att aaa205Tvr Ile Glu Ile His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys30 35 40tca g gtaatttact ttctgttgaa gagaaactcc attttttgga gcattggaat 259Ser45taacgggtta ttttgttttg atgtatag gt ttg aat cga tgc ggc aag agt 310Gly Leu Asn Arg Cys Gly Lys Ser50tgc agg ttg aga tgg ttg aac tac ttg aga cct aac att aag aga ggc358Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly55 60 65aac ata tca gat gaa gaa gag gac tta att att agg ctt cat aaa ctg406Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys Leu70 75 80 85ctg ggg aac agg tgg tct ttg att gct ggg aga ctt cca ggg cga aca454Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr90 95 100gac aat gaa att aag aac tac tgg aat tcc cat ttg agc aag aaa ata502Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu Ser Lys Lys Ile105 110115ata aac cat gat gtc aga aca gaa caa act tcc tcc tcg gaa caa att550Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser Ser Ser Glu Gln Ile120 125130gtg cct cac aaa gca tgg gaa act gtc cat atg gaa gaa gaa gag gta598Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met Glu Glu Glu Glu Val135 140145gta aaa gga agt gat gaa att gaa aac tct gaa ttc agc att gat gtg646Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu Phe Ser Ile Asp Val150 155160 165gac gaa ttc ttt gac ttc aca acg gaa ggt tgc ttt act ttg gat tgg694Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys Phe Thr Leu Asp Trp170175 180gtg aat aag ttc ctt gaa ctt gat gat caa cag gat cca tta gca atg742
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1.一種啟動(dòng)子元件，其特征在于，它包括植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子GaRDL1的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件，其特征在于，它包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種用于在植物表皮毛中特異性表達(dá)的構(gòu)建物，其特征在于，它含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的啟動(dòng)子元件包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的外源基因是MYB基因。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件。
7.一種在植物表皮毛中特異性表達(dá)外源基因的方法，其特征在于，它包括步驟(a)提供一構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件，(b)將步驟(a)中的構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)將步驟(b)中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成植株，從而使使外源基因在植物表皮毛中表達(dá)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的啟動(dòng)子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
9.一種植物表皮毛特異表達(dá)順式調(diào)控元件，其特征在于，選自下組(a)L1 box調(diào)控元件，序列為SEQ ID NO1中82-89位；(b)MYB基序調(diào)控元件，序列為SEQ ID NO1中103-108位。
10.如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子元件或權(quán)利要求9所述的植物表皮毛特異表達(dá)順式調(diào)控元件的用途，其特征在于，用于在植物表皮毛中特異性表達(dá)外源基因或用于改良棉纖維。
全文摘要
本發(fā)明提供了植物表皮毛特異表達(dá)啟動(dòng)子元件－棉花GaRDL1啟動(dòng)子，含GaRDL1啟動(dòng)子元件的構(gòu)建物和載體，以及它們的用途。本發(fā)明的GaRDL1啟動(dòng)子可用于棉纖維和腺毛次生代謝基因工程。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1778925SQ200410084398
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者陳曉亞, 王水, 李春紅, 王凌健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院