專利名稱：一種分子標記及其開發(fā)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因組學、生物信息學和分子生物學三個領域，特別地，涉及一種分子標記以及利用基因組測序和cDNA測序數(shù)據(jù)開發(fā)這種分子標記的方法。
背景技術：
遺傳標記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。根據(jù)生物特征所表現(xiàn)的層次，遺傳標記可分成形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記、分子標記四種類型。其中分子標記是DNA水平上遺傳變異的直接反映，具有數(shù)量豐富，信息量大，與基因表達無關，檢測不受季節(jié)、環(huán)境和個體發(fā)育階段的影響等優(yōu)點，因而是最理想的遺傳標記。分子標記廣泛應用于遺傳作圖、基因定位、基因克隆、動植物育種、遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定、遺傳病鑒定、法醫(yī)學鑒定等許多領域，因而具有重要的理論和應用價值。
自1980年首次提出分子標記的概念以來，已經(jīng)發(fā)展出十多種分子標記。但除了第一代分子標記RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)是基于DNA Southern雜交技術的之外，后來發(fā)展的分子標記皆是基于DNA擴增(PCR)技術的。PCR技術由于操作方便，因而更受歡迎。早期發(fā)展出的基于PCR的分子標記主要有RAPD(隨機擴增多態(tài)DNA)、AFLP(擴增片段長度多態(tài)性)、ISSR(簡單序列重復間區(qū))等。這些標記的特點是擴增產(chǎn)物是隨機的，且一般表現(xiàn)為顯性，因而不太理想，目前已用得較少。隨著分子標記技術的發(fā)展，人們越來越青睞特異引物的分子標記，因為它們在染色體上的位置是已知的，而且通常表現(xiàn)為共顯性。目前最受歡迎的特異引物標記是微衛(wèi)星(或稱SSR)標記，它具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、在基因組中分布均勻等優(yōu)點。SSR標記的不足是前期開發(fā)需要很高的投入，但一旦開發(fā)成功，使用起來就非常方便，使用戶受益無窮。目前，對于已完成全基因組測序的擬南芥和水稻來說，借助生物信息學手段，開發(fā)SSR標記已不太困難。目前在水稻中已開發(fā)出將近3000個SSR標記。另外，數(shù)量最為豐富的SNP(單核苷酸多態(tài)性)也正成為一種極具應用潛力的新型分子標記。SNP不僅可以通過PCR進行檢測，也可以通過DNA芯片來檢測。但目前對SNP的檢測在技術上還顯得太復雜，難度較大，因而還難以廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用已完成基因組測序及大量cDNA測序的動植物，提供一種分子標記。
該發(fā)明目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種分子標記，其特征在于，它是基因的內(nèi)含子。進一步地，所述分子標記基于基因的內(nèi)含子長度的多態(tài)性。
本發(fā)明的目的還在于提供一種分子標記的開發(fā)方法。
該發(fā)明目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種權利要求1所述的分子標記的開發(fā)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)序列下載獲得基因組序列和cDNA序列；(2)序列分析將獲得的基因組序列與cDNA序列進行聯(lián)配，得到每個基因的內(nèi)含子數(shù)量及長度，對相應的內(nèi)含子進行比較，從而得到兩基因組間有長度差異的內(nèi)含子；(3)引物設計引物設計在兩側的外顯子上或在內(nèi)含子內(nèi)部差異位點兩側的保守序列上；(4)電子PCR利用設計的引物和基因組序列進行電子PCR，選擇只有一個PCR產(chǎn)物的標記作為分子標記；(5)命名將通過電子PCR獲到的分子標記進行命名；(6)建立數(shù)據(jù)庫建立分子標記的數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括標記的序列、引物及其所在的基因組DNA克隆和cDNA的名稱以及實際PCR產(chǎn)物的電泳結果照片。
進一步地，所述步驟(3)中，所述引物長度一般在18-25堿基之間；所述步驟(5)中，所述命名方式為用RI開頭，后面跟上數(shù)字，每一個標記的名稱都是唯一的；所述步驟(6)中，所述數(shù)據(jù)庫采用MySQL作為關系數(shù)據(jù)庫，采用PHP語言來編寫Web檢索系統(tǒng)。
本發(fā)明具有以下技術效果本發(fā)明的基于內(nèi)含子長度多態(tài)性的分子標記具有共顯性、數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、在基因組中位置已知、特異性高等優(yōu)點，而且實驗操作簡單方便，結果可靠。利用本發(fā)明的技術方法對93-11，日本晴，F(xiàn)1(93-11/日本晴)，廣陸矮，協(xié)青早，IR64，越光，秀水11，Merim，Katy，Kyeema進行實驗，所有品種都有擴增產(chǎn)物，差異明顯，多態(tài)性水平高。這一內(nèi)含子長度多態(tài)性的分子標記可應用于遺傳圖譜構建、基因或QTL定位和圖位克隆、標記輔助育種、遺傳多樣性分析、基因組研究等許多方面。


圖1是本發(fā)明的開發(fā)方法的流程圖；圖2是本發(fā)明ILP的示意圖；圖3是本發(fā)明引物設計的示意圖；圖4是本發(fā)明的分子標記的PCR擴增的實例圖，泳道1-12分別為Marker，93-11，日本晴，F(xiàn)1(93-11/日本晴)，廣陸矮，協(xié)青早，IR64，越光，秀水11，Merim，Katy，Kyeema。
具體實施例方式
本發(fā)明的分子標記基于內(nèi)含子長度多態(tài)性(Intron Length Polymorphism，ILP)。內(nèi)含子是基因中的非編碼區(qū)段，具有很高的遺傳多態(tài)性，因而可以作為一種分子標記。水稻和擬南芥已經(jīng)完成全基因組測序，并且已在兩個亞種或生態(tài)型上完成測序，并已測定了大量的全長cDNA序列，有關資料可以從互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫[如TIGR(http//www.tigr.org)、RGP(http//rgp.dna.affrc.go.jp/)、BGI(http//rise.genomics.org.ac)等]獲得。借助生物信息學的方法，對DNA序列數(shù)據(jù)進行有效的分析。這為大規(guī)模檢索和開發(fā)基于內(nèi)含子多態(tài)性的分子標記提供了可能。
下面根據(jù)附圖，以水稻為例詳細說明本發(fā)明分子標記的開發(fā)方法。
如圖1所示，本發(fā)明的分子標記的開發(fā)方法包括以下步驟1、序列下載利用國際水稻測序中心發(fā)布的粳稻品種Nipponbare的基因組序列數(shù)據(jù)和華大基因中心發(fā)布的秈稻品種93-11的基因組序列數(shù)據(jù)，分別從TIGR網(wǎng)站(http//www.tigr.org)和Rise網(wǎng)站(http//rise.genomics.org.cn)下載。此外，還利用已公布的水稻全長cDNA序列數(shù)據(jù)，從日本的KOME網(wǎng)站http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)下載。
2、序列分析通過BLASTN程序(參數(shù)為e值＜10-20)，把cDNA與Nipponbare和93-11的基因組序列進行聯(lián)配，獲得匹配最好的基因組序列，然后通過SIM4程序把cDNA序列與基因組序列進行精確聯(lián)配，獲得每個基因的內(nèi)含子數(shù)量及長度，并對相應的內(nèi)含子進行比較，獲得兩亞種基因組間有長度差異的內(nèi)含子，如圖2所示。
3、引物設計對于長度較短(＜500bp)的內(nèi)含子，PCR引物設計在兩側的外顯子上，其好處是外顯子較基因組的其它序列要保守。但對于長度較長(＞500bp)的內(nèi)含子，則在內(nèi)含子內(nèi)部差異位點兩側的保守序列上設計引物。引物長度一般在18-25堿基之間，退火溫度一般在54-60℃之間。用primer3的程序進行引物設計，如圖3所示。一般在不同的位置設計出五對引物，供選擇。
4、電子PCR在進行電子PCR時，將誤配堿基數(shù)設定為0個。選擇只有一個PCR產(chǎn)物的標記作為候選標記，去除一對引物在不同克隆上擴增到多個PCR產(chǎn)物的標記。
5、命名將通過電子PCR獲到的分子標記進行命名，命名方式為用RI開頭，后面跟上數(shù)字，例如RI00008。每一個標記的名稱都是唯一的。
6、建立數(shù)據(jù)庫在前面開發(fā)工作的基礎上，建立水稻ILP標記的數(shù)據(jù)庫(基于多態(tài)性的關系數(shù)據(jù)庫)，內(nèi)容包括標記的序列、引物及其所在的秈、粳稻基因組DNA克隆和cDNA的名稱以及實際PCR產(chǎn)物的電泳結果照片。本數(shù)據(jù)庫采用MySQL作為關系數(shù)據(jù)庫，采用PHP語言來編寫Web檢索系統(tǒng)。
下面實驗驗證本發(fā)明分子標記引物的正確性和可行性，并檢驗引物的通用性和多態(tài)性水平。
圖4是本發(fā)明的分子標記的PCR擴增的實例，泳道1-12分別為Marker，93-11，日本晴，F(xiàn)1(93-11/日本晴)，廣陸矮，協(xié)青早，IR64，越光，秀水11，Merim，Katy，Kyeema為了驗證分子標記引物的正確性和可行性，合成標記的引物，以Nipponbare和93-11為材料，剪取幼嫩葉片提取基因組DNA作為模板，按常規(guī)PCR程序進行擴增。退火溫度設定在54-60℃之間，循環(huán)35次。根據(jù)預測的擴增產(chǎn)物大小的不同，在瓊脂糖凝膠或非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，用紫外線照射或銀染顯帶。擴增結果與預期吻合的，說明引物設計是正確的和可行的。
為了檢驗引物的通用性和多態(tài)性水平，選擇若干個不同亞種或生態(tài)類型的水稻品種，用上述合成的引物，按上述相同的方法進行實驗，觀察各個品種的擴增情況和差異條帶數(shù)目。在所有品種中皆有擴增產(chǎn)物的，說明通用性好；差異條帶數(shù)多的，說明多態(tài)性水平高。
上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種分子標記，其特征在于，它是基因的內(nèi)含子。
2.根據(jù)權利要求1所述的分子標記，其特征在于，所述分子標記基于基因的內(nèi)含子長度的多態(tài)性。
3.根據(jù)權利要求1所述的分子標記，其特征在于，該分子標記的PCR產(chǎn)物長度在100～1100bp以內(nèi)。
4.一種權利要求1所述的分子標記的開發(fā)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)序列下載獲得基因組序列和cDNA序列。(2)序列分析將獲得的基因組序列與cDNA序列進行聯(lián)配，得到每個基因的內(nèi)含子數(shù)量及長度，對相應的內(nèi)含子進行比較，從而得到兩基因組間有長度差異的內(nèi)含子。(3)引物設計引物設計在兩側的外顯子上或在內(nèi)含子內(nèi)部差異位點兩側的保守序列上。(4)電子PCR利用設計的引物和基因組序列進行電子PCR，選擇只有一個PCR產(chǎn)物的標記作為分子標記。(5)命名將通過電子PCR獲到的分子標記進行命名。(6)建立數(shù)據(jù)庫建立分子標記的數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括標記的序列、引物及其所在的基因組DNA克隆和cDNA的名稱以及實際PCR產(chǎn)物的電泳結果照片。
5.根據(jù)權利要求4所述的開發(fā)方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述引物長度一般在18-25堿基之間。
6.根據(jù)權利要求4所述的開發(fā)方法，其特征在于，所述步驟(5)中，所述命名方式為用RI開頭，后面跟上數(shù)字，每一個標記的名稱都是唯一的。
7.根據(jù)權利要求4所述的開發(fā)方法，其特征在于，所述步驟(6)中，所述數(shù)據(jù)庫采用MySQL作為關系數(shù)據(jù)庫，采用PHP語言來編寫Web檢索系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子標記及其開發(fā)方法，本發(fā)明依據(jù)內(nèi)含子長度的不同，在內(nèi)含子兩側外顯子上或在內(nèi)含子內(nèi)部差異位點兩側保守序列上設計引物，并通過電子PCR和實際PCR進行檢驗，從而將ILP開發(fā)成能夠用PCR進行檢測的分子標記。這種標記具有共顯性、數(shù)量豐富、實驗簡單、穩(wěn)定性好、特異性高等優(yōu)點，可應用于遺傳圖譜構建、基因或QTL定位、標記輔助育種、遺傳多樣性分析、基因組研究等許多方面。
文檔編號C12N15/11GK1632117SQ200410084499
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權日2004年11月22日
發(fā)明者吳為人, 汪旭升, 趙向前 申請人:浙江大學