專利名稱：反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸體外合成方法，具體地涉及到核糖核酸的體外反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的方法，更具體地涉及在同一體系中進(jìn)行RNA體外反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒是一種世界范圍內(nèi)的非腸道傳染的病毒。據(jù)估計(jì)超過(guò)1％的世界人口感染有HCV。在衛(wèi)生保健體系較落后的國(guó)家和地區(qū)，其比例更高，已成為嚴(yán)重危害人類健康的一種傳染病。
來(lái)自全世界的對(duì)HCV編碼序列的分析結(jié)果已經(jīng)揭示出在各個(gè)病毒分離物中的相當(dāng)可觀的序列變化形式。此外，對(duì)來(lái)自各個(gè)患者的HCV序列分析結(jié)果已經(jīng)證實(shí)這些病毒已所謂的“亞種”的形式傳播，他們含有相關(guān)但不相同的序列。HCV遺傳變異性的程度對(duì)預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。
目前我國(guó)普遍使用的免疫學(xué)方法受制于其間接檢測(cè)原理的局限，不能解決HBV預(yù)防診斷治療中的許多問(wèn)題，HCV RNA檢測(cè)方法的出現(xiàn)從根本上突破了免疫學(xué)方法的間接檢測(cè)的局限性，通過(guò)直接檢測(cè)病毒的核酸水平真實(shí)地反映病毒的情況從而對(duì)于HCV的準(zhǔn)確診斷、有效治療、精確預(yù)后及新藥研制等各個(gè)方面具有重大意義。
HCV核酸檢測(cè)一般應(yīng)用AMV酶或MMLV酶合成cDNA第一鏈。第二鏈合成和后面的PCR擴(kuò)增用Taq DNA聚合酶，反應(yīng)在不同體系進(jìn)行，效率低下，更主要的是核酸檢測(cè)的高靈敏性要求低污染，反轉(zhuǎn)錄后的擴(kuò)增操作容易導(dǎo)致污染。
目前有很多一步法RT-PCR試劑盒，但是，大部分RT-PCR方法建議合成cDNA第一鏈后隨之對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行抑制并且對(duì)合成第一鏈cDNA的反應(yīng)體系進(jìn)行稀釋以消除反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)Taq DNA酶的抑制作用。因此在第一次反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后要添加一些必須成分到反應(yīng)體系中去，還是會(huì)增加反應(yīng)時(shí)間和導(dǎo)致污染。
除了檢測(cè)HCV的RNA之外，在其他一些場(chǎng)合也需要檢測(cè)RNA，尤其是檢測(cè)其他一些RNA病毒的RNA。
綜上所述，本領(lǐng)域目前的RT-PCR在減少反應(yīng)時(shí)間和污染可能性方面還存在缺陷，因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)污染更低、反應(yīng)時(shí)間更短的RNA檢測(cè)方法，尤其是檢測(cè)HCV RNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種污染更低、反應(yīng)時(shí)間更短的RNA檢測(cè)方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的緩沖液，它含有以下組分(a)0.005-0.05U/微升的反轉(zhuǎn)錄酶；(b)0.001-0.1U/微升的高溫DNA聚合酶；(c)1-10mM的鎂離子；(d)dNTPs，各0.2±0.1mmol/L；且所述緩沖液不含錳離子。
在另一優(yōu)選例中，所述緩沖液的體積為10-100微升，且還含有以下組分(e)0.1-5ug的RNA模板。
在另一優(yōu)選例中，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV且RNA模板為0.1-1微克時(shí)，鎂離子濃度為3±0.5mM；當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV且RNA模板為1-5微克時(shí)，鎂離子濃度為5±1mM；當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶是AMV時(shí)，鎂離子濃度為8±2mM。
在另一優(yōu)選例中，所示緩沖液還含有以下組分(f)引物對(duì)，各0.3±0.1μmol/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖液還含有以下組分(g)探針，2.0±0.5mmol/L。
在另一優(yōu)選例中，所述的反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV、AMV或SUPERSCRIPT II。
在另一優(yōu)選例中，所述緩沖液含有以下組分(a)0.01U/μl的反轉(zhuǎn)錄酶SUPERSCRIPT II；(b)0.03U/μl的DNA聚合酶Taq酶；(c)2.0mmol/L鎂離子；(d)dNTPs，0.2mmol/L；(e)0.1-5ug的RNA模板；
(f)引物對(duì)，各0.3±0.1μmol/L；(g)探針，2.0±0.5mmol/L；(h)5*PB緩沖液，其成分是Tris-HCl pH8.3，250mmol/L，KCL，360mmol/L，并且所述的緩沖液體積為20-50微升。
在另一優(yōu)選例中，所述的RNA模板為HCV的RNA提取物，并且所述的引物對(duì)和探針選自下列各組A組上游引物1 TGCGGAACCGGTGAGTACA (SEQ ID NO1)下游引物1 GGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO2)探針1 FAM-GCGGGTAGATCCAAGAAAGGA-TAMRA (SEQ ID NO3)B組上游引物2 TGCGGAACCGGTGAGTACA (SEQ ID NO4)下游引物2 CGGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO5)探針2 FAM-TTGAGCGGGTAGATCCAAGAA-TAMRA (SEQ ID NO6)C組上游引物3 CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT (SEQ ID NO7)下游引物3 TCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG (SEQ ID NO8)探針3 FAM-AGGCTGCACGACACTCATACTAAC-TAMRA(SEQ ID NO9)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明上述緩沖液的用途，它被用于制備同時(shí)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增的反應(yīng)體系或試劑盒。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種進(jìn)行檢測(cè)RNA的方法，它包括步驟(a)用反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成cDNA；(b)用高溫DNA聚合酶對(duì)步驟(a)中形成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，形成DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)檢測(cè)DNA產(chǎn)物；步驟(a)和(b)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，并且在步驟(a)和(b)之間不向反應(yīng)體系中添加物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)和(b)之間包括降解反轉(zhuǎn)錄酶的步驟在90-97℃保溫1-5分鐘。
更佳地，步驟(a)和(b)在本發(fā)明上述的緩沖液中進(jìn)行。


圖1顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的測(cè)量結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)對(duì)反轉(zhuǎn)錄體系和擴(kuò)增體系的廣泛而深入的研究，通過(guò)優(yōu)化，得到一個(gè)既能反轉(zhuǎn)錄RNA，又能擴(kuò)增DNA的反應(yīng)體系。這樣省略了在合成cDNA第一鏈后對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行抑制的步驟，還省略了對(duì)合成第一鏈cDNA的反應(yīng)體系進(jìn)行稀釋以消除反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)Taq DNA酶的抑制作用的步驟。因此本發(fā)明方法污染可能性更低、反應(yīng)時(shí)間更短。
反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶催化RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，第一個(gè)被使用的反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV和AMV。
反轉(zhuǎn)錄酶常用RNASE H-以提高反轉(zhuǎn)錄效率，在隨后的擴(kuò)增時(shí)形成的RNADNA復(fù)合體會(huì)阻礙擴(kuò)增引物與cDNA結(jié)合，所以一般在擴(kuò)增前加入RNASE H酶以降解RNADNA復(fù)合體中的RNA。但這樣勢(shì)必要求反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增分開(kāi)，導(dǎo)致操作繁鎖。
因此在本發(fā)明方法中優(yōu)選無(wú)RNASE H活性的反轉(zhuǎn)錄酶?，F(xiàn)在，有很多可供選擇的RNASE H-的反轉(zhuǎn)錄酶出現(xiàn)。例如，SUPERSCRIPT II就是一種RNASE H-的反轉(zhuǎn)錄酶，可購(gòu)自Life Technologies公司。
此外，如果采用有RNASE H活性的反轉(zhuǎn)錄酶，可以在擴(kuò)增前加一個(gè)95℃以上程序，使RNA水解。這一程序還可以對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行滅活，防止反轉(zhuǎn)錄酶阻礙Taq酶與cDNA模板結(jié)合，又不會(huì)對(duì)耐熱性的Taq酶活性有影響。這一加熱滅活反轉(zhuǎn)錄酶的步驟也可用于無(wú)RNASE H活性的反轉(zhuǎn)錄酶。
DNA聚合酶用于本發(fā)明的DNA聚合酶沒(méi)有特別限制，可以本領(lǐng)域常用的耐熱的DNA聚合酶，即在95℃保溫1-5分鐘仍可保持至少70％活力的DNA聚合酶。這些耐熱DNA聚合酶可在市場(chǎng)上購(gòu)得，例如Taq酶等。
引物和探針提高專一性(或特異性)是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的必須要求，專一性與選用引物直接相關(guān)，常見(jiàn)有三種反轉(zhuǎn)錄引物基因?qū)Ｒ恍砸?，隨機(jī)引物和Oligo(dT)引物。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的是專一性引物。專一性引物是與靶RNA上特定序列互補(bǔ)的寡核苷酸。專一性引物可以被設(shè)計(jì)成較高的退火溫度，這樣能夠降低非特異性雜交提高轉(zhuǎn)錄效率和產(chǎn)量。更為重要的是，專一性反轉(zhuǎn)錄引物可以和擴(kuò)增引物序列相同，這樣可以用一對(duì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，減少過(guò)多引物造成的競(jìng)爭(zhēng)和引物二聚體，提高效率和產(chǎn)量。
專一性反轉(zhuǎn)錄引物和高溫反轉(zhuǎn)錄酶的使用使得反轉(zhuǎn)錄在較高溫度下反轉(zhuǎn)錄，比如55℃或更高(如55-65℃)，在低溫下反轉(zhuǎn)錄往往會(huì)使模板RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得引物的結(jié)合或延伸遇到阻礙降低效率和產(chǎn)量。
為了減低假陽(yáng)性，還可使用專一性探針，如熒光探針。
專一性引物和任選的探針可根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的序列用常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成。
鎂離子和錳離子反轉(zhuǎn)錄酶通常需要錳離子的存在，而Taq DNA聚合酶反應(yīng)需要鎂離子的存在。第一個(gè)商業(yè)化的試劑盒是在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后加入EGTA已除去錳離子，再加入鎂離子。改進(jìn)的試劑盒使用含錳離子的N-二甘氨酸緩沖液，這種緩沖液能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，但是，錳離子的存在會(huì)使擴(kuò)增的忠實(shí)度大大下降，從而限制了它的應(yīng)用。
因此，在本發(fā)明的緩沖液中宜不含有錳離子，而僅含有鎂離子。而且反轉(zhuǎn)錄酶在僅含鎂的情況下的轉(zhuǎn)錄效率也足夠高了。
鎂離子反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增體系中是一個(gè)至關(guān)重要的因子。通常，鎂離子濃度為1-10mM。如果反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV，反應(yīng)體系的中總RNA含量在1微克以內(nèi)的鎂離子含量為3mM，總RNA在1-5微克之間的鎂離子含量應(yīng)為5mM。如果反轉(zhuǎn)錄酶是AMV，最佳的鎂離子濃度為8mM。
額外成分為了使反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增更有效地進(jìn)行，需要在體系中添加一些輔助劑。在正常合成需要的dNTPs濃度基礎(chǔ)上增加dNTPs的濃度會(huì)提高反轉(zhuǎn)錄的效率，這可能是高濃度的dNTPs可以增加RNA-引物的穩(wěn)定性的結(jié)果。
此外，實(shí)驗(yàn)證明用一定濃度的乙?；腂SA也可以起到增加低拷貝RNA檢測(cè)靈敏度的作用。
糖原一般在RNA分離時(shí)作為一種RNA載體加入，可以提高小量樣本提取時(shí)RNA的得率。糖原是水溶性的物質(zhì)，在RNA分離處理時(shí)和RNA一起留在水相中，有助于后面的RNA沉淀。當(dāng)樣本小于50毫克組織或小于106拷貝數(shù)時(shí)，提取RNA時(shí)有必要加入糖原，同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增體系中加入BSA。
象甘油和DMSO這樣的添加物能夠起到穩(wěn)定核酸雙鏈復(fù)合體和消除RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用，20％以下的甘油(如5-20％)和10％以下的DMSO(如2-10％)用于反轉(zhuǎn)錄體系中不會(huì)對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶活性有所抑制。10％以下的甘油(如1-10％)和5％以下的DMSO(如0.5-5％)在后面的擴(kuò)增中不會(huì)對(duì)Taq酶活性有所影響。
在遇到不能有效地對(duì)某些RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，最可能的原因是模板RNA有二級(jí)結(jié)構(gòu)，解決這個(gè)問(wèn)題一般采取高溫溫育的方法，同時(shí)高溫溫育還可以提高引物與模板結(jié)合的專一性，減少非特異性結(jié)合，提高反轉(zhuǎn)錄效率和目的cDNA產(chǎn)量。
反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)會(huì)對(duì)反應(yīng)有抑制作用，必須避免，比如甲酰胺，EDTA，糖原和SDS以及提取RNA時(shí)一些鹽都會(huì)成為抑制反應(yīng)的因素，所以反應(yīng)體系要求提取少含雜質(zhì)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的緩沖液可以使反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增都能正常進(jìn)行，中間不需添加任何試劑，避免了污染和節(jié)省了時(shí)間。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1配制緩沖液配制成分如下的緩沖液(a)0.01U/微升的反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII；(b)0.03U/微升的高溫DNA聚合酶Taq酶；(c)2mM的鎂離子；
(d)dNTPs，各0.2±0.1mmol/L；余量為水，供1000微升。
實(shí)施例2反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增HCV的RNA首先，配制成分如下的HCV PCR緩沖液

5*PB(熒光)的成分Tris-HCl pH8.3，250mmol/L，KCL，360mmol/L。
針對(duì)3對(duì)引物，分別配制3種單獨(dú)的HCV PCR緩沖液1、2和3。同時(shí)配制一種同時(shí)含3對(duì)引物的HCV PCR緩沖液ALL。
然后，配制成分如下的PCR反應(yīng)體系

對(duì)應(yīng)于3對(duì)引物和相應(yīng)的3個(gè)探針，分別配制3種單獨(dú)的PCR反應(yīng)體系1、2和3。同時(shí)配制一種同時(shí)含3對(duì)引物的PCR反應(yīng)體系A(chǔ)LL。
在本實(shí)施例中，采用的GSP引物和探針的序列如下A組上游引物1TGCGGAACCGGTGAGTACA(SEQ ID NO1)下游引物1GGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO2)探針1FAM-GCGGGTAGATCCAAGAAAGGA-TAMRA(SEQ ID NO3)
B組上游引物2TGCGGAACCGGTGAGTACA (SEQ ID NO4)下游引物2CGGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO5)探針2FAM-TTGAGCGGGTAGATCCAAGAA-TAMRA (SEQ ID NO6)C組上游引物3CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT (SEQ ID NO7)下游引物3TCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG (SEQ ID NO8)探針3FAM-AGGCTGCACGACACTCATACTAAC-TAMRA(SEQ ID NO9)。
反應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)PCR儀器，采用以下反應(yīng)程序

結(jié)果如圖1所示，表明陽(yáng)性樣本出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，而陰性樣本熒光值一直保持平直。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司<120>反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增RNA的方法<130>042147<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>1tgcggaaccg gtgagtaca 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>2ggaattgcca ggacgaccgg 20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸
<400>3gcgggtagat ccaagaaagg a21<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>4tgcggaaccg gtgagtaca 19<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>5cggaattgcc aggacgaccg g21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>6ttgagcgggt agatccaaga a21<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>7cactcccctg tgaggaacta ctgt 24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>8tcacgcagaa agcgtctagc catgg25<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>9aggctgcacg acactcatac taac 2權(quán)利要求
1.一種用于反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的緩沖液，其特征在于，它含有以下組分(a)0.005-0.05U/微升的反轉(zhuǎn)錄酶；(b)0.001-0.1U/微升的高溫DNA聚合酶；(c)1-10mM的鎂離子；(d)dNTPs，各0.2±0.1mmol/L；且所述緩沖液不含錳離子。
2.如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液的體積為10-100微升，且還含有以下組分(e)0.1-5ug的RNA模板。
3.如權(quán)利要求2所述的緩沖液，其特征在于，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV且RNA模板為0.1-1微克時(shí)，鎂離子濃度為3±0.5mM；當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV且RNA模板為1-5微克時(shí)，鎂離子濃度為5±1mM；當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶是AMV時(shí)，鎂離子濃度為8±2mM。
4.如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其特征在于，它還含有以下組分(f)引物對(duì)，各0.3±0.1μmol/L。
5.如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其特征在于，它還含有以下組分(g)探針，2.0±0.5mmol/L。
6.如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其特征在于，所述的反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV、AMV或SUPERSCRIPT II。
7.如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其特征在于，它含有以下組分(a)0.01U/μl的反轉(zhuǎn)錄酶SUPERSCRIPT II；(b)0.03U/μl的DNA聚合酶Taq酶；(c)2.0mmol/L鎂離子；(d)dNTPs，0.2mmol/L；(e)0.1-5ug的RNA模板；(f)引物對(duì)，各0.3±0.1μmol/L；(g)探針，2.0±0.5mmol/L；(h)5*PB緩沖液，其成分是Tris-HCl pH 8.3，250mmol/L，KCL，360mmol/L，并且所述的緩沖液體積為20-50微升。
8.如權(quán)利要求7所述的緩沖液，其特征在于，所述的RNA模板為HCV的RNA提取物，并且所述的引物對(duì)和探針選自下列各組A組上游引物1 TGCGGAACCGGTGAGTACA(SEQ ID NO1)下游引物1 GGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO2)探針1 FAM-GCGGGTAGATCCAAGAAAGGA-TAMRA(SEQ ID NO3)B組上游引物2 TGCGGAACCGGTGAGTACA(SEQ ID NO4)下游引物2 CGGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO5)探針2 FAM-TTGAGCGGGTAGATCCAAGAA-TAMRA(SEQ ID NO6)C組上游引物3 CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT (SEQ ID NO7)下游引物3 TCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG (SEQ ID NO8)探針3 FAM-AGGCTGCACGACACTCATACTAAC-TAMRA (SEQ ID NO9)。
9.如權(quán)利要求1所述的緩沖液的用途，其特征在于，用于制備同時(shí)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增的反應(yīng)體系或試劑盒。
10.一種進(jìn)行檢測(cè)RNA的方法，它包括步驟(a)用反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成cDNA；(b)用高溫DNA聚合酶對(duì)步驟(a)中形成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，形成DNA擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)檢測(cè)DNA產(chǎn)物；其特征在于，步驟(a)和(b)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，并且在步驟(a)和(b)之間不向反應(yīng)體系中添加物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種核糖核酸的體外反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的方法，更具體地涉及在同一體系中進(jìn)行RNA體外反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的方法。本發(fā)明的緩沖液可以使反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增都能正常進(jìn)行，因而在反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增之間不需添加任何試劑，避免了污染和節(jié)省了時(shí)間。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1786181SQ20041008936
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者夏懿, 周煜, 徐曉青 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司