專利名稱：一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法及其應(yīng)用，更具體地說是利用熒光強(qiáng)度定量分析技術(shù)定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，并將該方法用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡誘因的篩查和抗凋亡化合物的篩選，屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞死亡的主要方式，也是大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中期制約活細(xì)胞密度和細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品生產(chǎn)效率、影響細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品質(zhì)量重要因素。預(yù)防并控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞凋亡是提高動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品生產(chǎn)效率和質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)手段。
細(xì)胞凋亡的定量檢測(cè)是控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞凋亡的重要前提。目前，細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法大致可歸為三類形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法、生化和分子生物學(xué)檢測(cè)方法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法、生化和分子生物學(xué)檢測(cè)方法難于檢測(cè)出處于凋亡早期階段的凋亡細(xì)胞，一般主要用于檢測(cè)處于凋亡中、晚期階段的凋亡細(xì)胞。其中，形態(tài)學(xué)方法雖然直觀可靠，但主觀性較強(qiáng)、定量不夠準(zhǔn)確，檢測(cè)效率低、不能完成對(duì)大批量細(xì)胞樣品的檢測(cè)；生化和分子生物學(xué)方法(如瓊脂糖凝膠電泳法、TUNEL法、Caspases活性檢測(cè)法)的樣品需要量較大、操作繁瑣耗時(shí)，一般只能對(duì)檢測(cè)樣品的細(xì)胞凋亡作相對(duì)定量分析。目前，最常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法是基于FITC-AnnexinV/PI(異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶)染色的流式細(xì)胞儀方法。該方法能夠檢測(cè)出部分處于早期的細(xì)胞凋亡，結(jié)果較為準(zhǔn)確，但其缺點(diǎn)是不能用于原位檢測(cè)貼壁依賴生長(zhǎng)細(xì)胞的凋亡，熒光染料的價(jià)格較高、流式細(xì)胞儀的價(jià)格昂貴，不利于其推廣應(yīng)用。此外，由于流式細(xì)胞儀檢測(cè)法不能區(qū)分早期階段的細(xì)胞壞死(稱為脹亡，oncosis)和凋亡，在一定程度上影響了流式細(xì)胞儀檢測(cè)法的特異性和準(zhǔn)確性。
體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞受不斷變化的環(huán)境條件的影響，任何能影響細(xì)胞正常代謝和/或生長(zhǎng)的環(huán)境因素即細(xì)胞環(huán)境壓力均有可能誘發(fā)細(xì)胞的凋亡和壞死。盡管動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞環(huán)境壓力一般不足于招致細(xì)胞的原發(fā)性壞死，而是啟動(dòng)細(xì)胞按自身預(yù)定的精確步序發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞自殺過程(即細(xì)胞凋亡)，但往往也同時(shí)伴隨著一定程度的原發(fā)性細(xì)胞壞死。此外，在持續(xù)存在或加劇的細(xì)胞環(huán)境壓力作用下，處于凋亡早、中期階段的凋亡細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為繼發(fā)性的細(xì)胞壞死。因而，在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)物中往往可同時(shí)觀察到不同程度的細(xì)胞壞死。在定量測(cè)定動(dòng)物細(xì)胞凋亡的同時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞壞死，能更全面地反映體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，更全面地分析細(xì)胞環(huán)境壓力對(duì)細(xì)胞存活的影響。
YO-PRO-1(簡(jiǎn)稱YP)是一種喹啉化合物，其化學(xué)文摘索引號(hào)和化學(xué)名稱(CASNumber/Name)為152068-09-2/Quinolinium，4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-，diiodide)。它能夠在細(xì)胞膜通透性發(fā)生輕微變化的細(xì)胞凋亡早期透過細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。碘化丙啶(PI)也是一種核酸染料，它只能透過通透性很強(qiáng)的壞死細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。這兩種染料的聯(lián)合應(yīng)用，能夠?qū)⒒罴?xì)胞(YP-/PI-)、凋亡細(xì)胞(YP+/PI-)和壞死細(xì)胞(YP-/PI+和極少量YP+/PI+)區(qū)分開來。2002年，Wronski等用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)YP/PI聯(lián)合染色細(xì)胞樣品，根據(jù)YP和PI的熒光強(qiáng)度比值定性分析細(xì)胞樣品中凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞的相對(duì)比值。對(duì)于利用熒光強(qiáng)度定量分析技術(shù)定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，迄今尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜對(duì)核酸熒光染料的不同選擇通透性，利用熒光強(qiáng)度定量分析技術(shù)定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，并將該方法用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡誘因的篩查和抗凋亡化合物的篩選。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，以YO-PRO-1(YP)和碘化丙啶(PI)為細(xì)胞凋亡檢測(cè)的熒光染料，用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)量具有不同稀釋度的細(xì)胞樣品的YP和PI熒光強(qiáng)度，用熒光顯微鏡判定各具有不同稀釋度的細(xì)胞樣品中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)；對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析，分別得到依據(jù)YP熒光強(qiáng)度值和PI熒光強(qiáng)度值求得凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程；用熒光分光光度計(jì)測(cè)量待測(cè)樣品的YP和PI值，分別代入上述直線相關(guān)方程，得到待測(cè)樣品中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。
本發(fā)明具有廣泛的適用性，所述動(dòng)物細(xì)胞包括貼壁依賴性生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和非貼壁依賴性生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，至少包括但并不局限于CHO、Vero、BHK、HEK、C127細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。
所述細(xì)胞樣品是指用于建立直線相關(guān)方程的動(dòng)物細(xì)胞，可以直接采用批次培養(yǎng)至第2～5天的待測(cè)動(dòng)物細(xì)胞，也可以依照下述方法制備在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入濃度為800nM的星形孢菌素，37℃、5％CO2條件下作用8～12小時(shí)，使部分細(xì)胞凋亡和死亡。
本發(fā)明可以但并不局限于用下述方式實(shí)施在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入濃度為800nM的星形孢菌素(staurosporine，STS)，37℃、5％CO2條件下作用8～12小時(shí)，STS通過抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶C而使部分細(xì)胞凋亡和死亡，以此作為用于建立定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法的細(xì)胞樣品；或直接以批次培養(yǎng)第2～5天的動(dòng)物細(xì)胞作為用于建立定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法的細(xì)胞樣品。用細(xì)胞密度和活力自動(dòng)分析系統(tǒng)(Cedex A20，Innovatis)確定的細(xì)胞樣品中的細(xì)胞密度。
根據(jù)細(xì)胞樣品的細(xì)胞密度先用用含1～5％(v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞樣品作5～20倍稀釋，再分別作2～10倍稀釋，用微量加樣器按100μl/孔移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每一稀釋度樣品分別加于2塊細(xì)胞培養(yǎng)板中，每塊細(xì)胞培養(yǎng)板中的加入孔數(shù)為3，同時(shí)在其中的1塊細(xì)胞培養(yǎng)板中設(shè)置添加100μl稀釋液的對(duì)照孔1個(gè)。
于設(shè)置有對(duì)照孔的細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中加入100μl YP濃度為5μM、PI濃度為5μg/ml、血清濃度為1～5％(v/v)DMEM培養(yǎng)基，37℃作用5～10分鐘后，用熒光分光光度計(jì)分別讀取各樣品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP熒光強(qiáng)度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI熒光強(qiáng)度值。
在對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析的同時(shí)，用Nikon Eclipse TE300倒置熒光顯微鏡的10×或20×相差熒光物鏡查看細(xì)胞的熒光著色，顯現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞判定為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)橙色熒光的細(xì)胞判定為壞死細(xì)胞。分別計(jì)數(shù)各孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。
以YP熒光強(qiáng)度值為橫坐標(biāo)、倒置熒光顯微鏡判定的不同稀釋度孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在直角坐標(biāo)系中確定細(xì)胞樣品不同稀釋度孔的YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)的關(guān)系；以PI熒光強(qiáng)度值為橫坐標(biāo)、倒置熒光顯微鏡判定的不同稀釋度孔中的壞死細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在直角坐標(biāo)系中確定細(xì)胞樣品不同稀釋度孔的PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)的關(guān)系。對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析，分別得到依據(jù)YP熒光強(qiáng)度值和PI熒光強(qiáng)度值求得凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)①可同時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞樣品的細(xì)胞凋亡和壞死。②按照本發(fā)明的定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡方法能夠檢測(cè)出樣品中少至100個(gè)的凋亡細(xì)胞，靈敏度高、特異性強(qiáng)。③所需儀器和試劑的價(jià)格相對(duì)便宜、檢測(cè)成本低。④操作簡(jiǎn)便、快捷，可在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)大批量細(xì)胞樣品的凋亡檢測(cè)。
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的限制。


圖1為實(shí)施例1中倒置熒光顯微鏡下觀察的經(jīng)YP和PI染色處理的雜交瘤細(xì)胞。顯現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)橙色熒光的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。
圖2為實(shí)施例1中YP熒光強(qiáng)度值與凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)在直角坐標(biāo)系中的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
圖3為實(shí)施例1中PI熒光強(qiáng)度值與壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)在直角坐標(biāo)系中的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、定量檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞凋亡方法的建立(1)細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的分泌抗人單鏈尿激酶原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所采用雜交瘤技術(shù)構(gòu)建)培養(yǎng)物中加入濃度為800nM STS，37℃、5％CO2條件下作用12小時(shí)后，用細(xì)胞密度和活力自動(dòng)分析系統(tǒng)(Cedex A20，Innovatis)確定的細(xì)胞樣品中的細(xì)胞密度，以此作為用于建立定量檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞凋亡方法的細(xì)胞樣品。
(2)雜交瘤細(xì)胞樣品中凋亡細(xì)胞數(shù)的定量用含2％(v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞樣品作10倍稀釋后，再分別作2～10倍稀釋，用微量加樣器按100μl/孔移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每一稀釋度樣品各加3個(gè)培養(yǎng)孔。在裝備有落射熒光光源的Nikon Eclipse TE300倒置顯微鏡下用10×或20×相差熒光物鏡查看雜交瘤細(xì)胞的熒光著色，顯現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞判定為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)橙色熒光的細(xì)胞判定為壞死細(xì)胞(圖1)。分別計(jì)數(shù)適宜稀釋度孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。
(3)雜交瘤細(xì)胞樣品的YP和PI熒光強(qiáng)度測(cè)定將上述經(jīng)不同倍數(shù)稀釋的雜交瘤細(xì)胞樣品加入另一塊細(xì)胞培養(yǎng)板中，每一稀釋度樣品各加3個(gè)培養(yǎng)孔，同時(shí)在其中塊設(shè)置添加100μl稀釋液的對(duì)照孔1個(gè)。于各孔中加入100μl YP濃度為5μM、PI濃度為5μg/ml、血清濃度為2％(v/v)的DMEM培養(yǎng)基，37℃作用5～10分鐘后，用熒光分光光度計(jì)分別讀取各樣品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP熒光強(qiáng)度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI熒光強(qiáng)度值。
(4)YP熒光強(qiáng)度與雜交瘤細(xì)胞凋亡數(shù)的直線回歸分析以YP熒光強(qiáng)度值為橫坐標(biāo)、倒置熒光顯微鏡判定的不同稀釋度孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在直角坐標(biāo)系中確定細(xì)胞樣品不同稀釋度孔的YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)的關(guān)系(圖2)；以PI熒光強(qiáng)度值為橫坐標(biāo)、倒置熒光顯微鏡判定的不同稀釋度孔中的壞死細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在直角坐標(biāo)系中確定細(xì)胞樣品不同稀釋度孔的PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)的關(guān)系(圖3)。對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析，分別得到依據(jù)YP熒光強(qiáng)度值和PI熒光強(qiáng)度值求得凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)和壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程。YP熒光強(qiáng)度值與凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)系數(shù)分別為0.995和0.984。
凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)＝4.69×YP熒光強(qiáng)度值+0.059壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)＝13.49×PI熒光強(qiáng)度值-0.062實(shí)施例2、定量檢測(cè)CHO工程細(xì)胞凋亡方法的建立表達(dá)人重組尿激酶原的CHO工程細(xì)胞(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所采用基因重組技術(shù)構(gòu)建，簡(jiǎn)稱CHO工程細(xì)胞)用小牛血清濃度為1％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)于100ml組織培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)的第5天，經(jīng)0.25％(w/v)的胰蛋白酶消化處理后，用小牛血清濃度為1％(v/v)的DMEM/F12培養(yǎng)基分散、懸浮。以此作為用于建立定量檢測(cè)CHO工程細(xì)胞凋亡方法的細(xì)胞樣品，并用細(xì)胞密度和活力自動(dòng)分析系統(tǒng)確定的細(xì)胞樣品中的細(xì)胞密度。
用含2％(v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)CHO工程細(xì)胞樣品作20倍稀釋后，再分別作2～10倍稀釋后，按實(shí)施例1中步驟2所述的方法在Nikon Eclipse TE300熒光倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)適宜稀釋度孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。
將上述經(jīng)不同倍數(shù)稀釋的CHO工程細(xì)胞樣品加入另一塊細(xì)胞培養(yǎng)板中，按實(shí)施例1中步驟3所述的方法處理細(xì)胞樣品并用熒光分光光度計(jì)分別讀取各樣品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP熒光強(qiáng)度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI熒光強(qiáng)度值。
按實(shí)施例l中步驟4所述的方法對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析，分別得到依據(jù)YP熒光強(qiáng)度值和PI熒光強(qiáng)度值求得凋亡CHO工程細(xì)胞數(shù)和壞死CHO工程細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程。YP熒光強(qiáng)度值與凋亡CHO工程細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死CHO工程細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)系數(shù)分別為0.981和0.958。
凋亡CHO工程細(xì)胞數(shù)＝12.5×YP熒光強(qiáng)度值-0.023壞死CHO工程細(xì)胞數(shù)＝11.92×PI熒光強(qiáng)度值+0.055實(shí)施例3、培養(yǎng)基中氨基酸和葡萄糖缺乏對(duì)體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞凋亡的影響將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的分泌抗人單鏈尿激酶原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞用含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺和5.6mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基懸浮、調(diào)整細(xì)胞濃度為1.4×104cells/ml，按200μl/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每塊細(xì)胞培養(yǎng)板中同時(shí)設(shè)置2個(gè)只加DMEM培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
先用移液器自各培養(yǎng)孔中吸去160μl培養(yǎng)基，除其中的4個(gè)培養(yǎng)孔按170μl/孔更換含5％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺和5.6mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)孔按170μl/孔分別更換為如下氨基酸或葡萄糖缺失的DMEM培養(yǎng)基無谷氨酰胺DMEM、無甲硫氨酸DMEM、無丙酮酸鈉DMEM、無賴氨酸DMEM、無異亮氨酸DMEM、無胱氨酸DMEM和無葡萄糖DMEM，每種處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。
37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2天后，先用移液器自各培養(yǎng)孔中吸去100μl培養(yǎng)基，再于各孔中加入100μl YP濃度為5μM、PI濃度為5μg/ml、血清濃度為2％(v/v)的DMEM培養(yǎng)基，37℃作用5～10分鐘后，用熒光分光光度計(jì)分別讀取各樣品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP熒光強(qiáng)度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI熒光強(qiáng)度值。
求出相同處理的YP熒光強(qiáng)度平均值，代入實(shí)施例1所求得的YP熒光強(qiáng)度值和凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程，得到各處理的的凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)；求出相同處理的PI熒光強(qiáng)度平均值，代入實(shí)施例1所求得的PI熒光強(qiáng)度值和壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程，得到各處理的壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)。以各處理的凋亡雜交瘤細(xì)胞數(shù)為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合各處理的壞死雜交瘤細(xì)胞數(shù)評(píng)定培養(yǎng)基中氨基酸和葡萄糖缺乏誘導(dǎo)體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞凋亡的作用。表1所列為氨基酸和葡萄糖缺乏對(duì)雜交瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
表1氨基酸和葡萄糖缺乏對(duì)雜交瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

實(shí)施例4、抗細(xì)胞凋亡化合物的篩選將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的表達(dá)人重組尿激酶原的CHO工程細(xì)胞用含1％(v/v)小牛血清、4mM谷氨酰胺和5.6mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基懸浮、調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×104cells/ml，按200μl/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每塊細(xì)胞培養(yǎng)板中同時(shí)設(shè)置2個(gè)只加DMEM培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
用移液器自各培養(yǎng)孔中吸去160μl培養(yǎng)基，按170μl/孔更換含1％(v/v)小牛血清、5.6mM葡萄糖的無谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基。除其中3個(gè)設(shè)置為實(shí)驗(yàn)對(duì)照的培養(yǎng)孔外，分別將不同的抗細(xì)胞凋亡化合物按2～10μl/孔加入其余培養(yǎng)孔。不同抗細(xì)胞凋亡化合物的作用濃度如下2μM、10μM Z-VAD-FMK，2mM、5mM GSH(還原型谷胱甘肽)，1mM、3mM Vc(維生素C)，2mM、10mM NAC(N-乙酰半胱氨酸)，20μM、100μM ATA(金精三羧酸)。每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。
37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)3天后，先用移液器自各培養(yǎng)孔中吸去100μl培養(yǎng)基，再于各孔中加入100μl YP濃度為5μM、PI濃度為5μg/ml、血清濃度為2％(v/v)的DMEM培養(yǎng)基，37℃作用5～10分鐘后，用熒光分光光度計(jì)分別讀取各樣品孔在Ex/Em(nm)＝485/510的YP熒光強(qiáng)度值和Ex/Em(nm)＝485/538的PI熒光強(qiáng)度值。
求出相同處理的YP熒光強(qiáng)度平均值，代入實(shí)施例2所求得的YP熒光強(qiáng)度值和凋亡CHO工程細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程，得到各處理的凋亡CHO工程細(xì)胞數(shù)；求出相同處理的PI熒光強(qiáng)度平均值，代入實(shí)施例2所求得的PI熒光強(qiáng)度值和壞死CHO工程細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程，得到各處理的壞死CHO工程細(xì)胞數(shù)。以各處理的凋亡CHO工程細(xì)胞數(shù)為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合各處理的壞死CHO工程細(xì)胞數(shù)評(píng)定不同抗細(xì)胞凋亡化合物對(duì)抗谷氨酰胺誘導(dǎo)CHO工程細(xì)胞凋亡的效果。表2所列為不同抗細(xì)胞凋亡化合物對(duì)抗谷氨酰胺誘導(dǎo)CHO工程細(xì)胞凋亡的效果。
表2不同抗細(xì)胞凋亡化合物對(duì)抗谷氨酰胺誘導(dǎo)CHO工程細(xì)胞凋亡的效果


本發(fā)明的特定實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做了詳盡的說明。對(duì)本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)它所做的任何顯而易見的改動(dòng)，特別是對(duì)若干步驟和/或參數(shù)的等同替換，都構(gòu)成對(duì)本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，其特征在于以YO-PRO-1(YP)和碘化丙啶(PI)為細(xì)胞凋亡檢測(cè)的熒光染料，用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)量具有不同稀釋度的細(xì)胞樣品的YP和PI熒光強(qiáng)度，用熒光顯微鏡判定各具有不同稀釋度的細(xì)胞樣品中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)；對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析，分別得到依據(jù)YP熒光強(qiáng)度值和PI熒光強(qiáng)度值求得凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)的直線相關(guān)方程；用熒光分光光度計(jì)測(cè)量待測(cè)樣品的YP和PI值，分別代入上述直線相關(guān)方程，得到待測(cè)樣品中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，其特征在于所述動(dòng)物細(xì)胞包括貼壁依賴性生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和非貼壁依賴性生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞至少包括CHO、Vero、BHK、HEK、C127細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法，其特征在于所述細(xì)胞樣品為批次培養(yǎng)至第2～5天的待測(cè)動(dòng)物細(xì)胞，或?yàn)橐勒障率龇椒ㄖ苽涞膭?dòng)物細(xì)胞在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入濃度為800nM的星形孢菌素，37℃、5％CO2條件下作用8～12小時(shí)，使部分細(xì)胞凋亡和死亡。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于所述凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)的判定方法是在對(duì)細(xì)胞樣品行熒光強(qiáng)度定量分析的同時(shí)，用熒光顯微鏡查看細(xì)胞的熒光著色，顯現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞判定為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)橙色熒光的細(xì)胞判定為壞死細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)各孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于所述對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析是指以YP熒光強(qiáng)度值為橫坐標(biāo)、熒光顯微鏡判定的不同稀釋度孔中的凋亡細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在直角坐標(biāo)系中確定細(xì)胞樣品不同稀釋度孔的YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)的關(guān)系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡的方法，其特征在于所述對(duì)YI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析是指以YI熒光強(qiáng)度值為橫坐標(biāo)、熒光顯微鏡判定的不同稀釋度孔中的壞死細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在直角坐標(biāo)系中確定細(xì)胞樣品不同稀釋度孔的YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)的關(guān)系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死方法的應(yīng)用，其特征在于所述方法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中存在于培養(yǎng)基的細(xì)胞凋亡誘因的篩查。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死方法的應(yīng)用，其特征在于所述方法用于具有抑制細(xì)胞凋亡作用的抗細(xì)胞凋亡化合物的篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和壞死的方法及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。以YP和PI為檢測(cè)用熒光染料，測(cè)量不同稀釋度的細(xì)胞樣品的YP和PI熒光強(qiáng)度及各細(xì)胞樣品的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)；對(duì)YP熒光強(qiáng)度值與凋亡細(xì)胞數(shù)、PI熒光強(qiáng)度值與壞死細(xì)胞數(shù)作直線回歸分析得到直線相關(guān)方程；測(cè)量待測(cè)樣品的YP和PI值，代入直線相關(guān)方程，得到待測(cè)樣品的凋亡細(xì)胞數(shù)和壞死細(xì)胞數(shù)。本發(fā)明可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡誘因的篩查和抗凋亡化合物的篩選。優(yōu)點(diǎn)為①同時(shí)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死，②能檢測(cè)出樣品中少至100個(gè)的凋亡細(xì)胞，靈敏度高、特異性強(qiáng)，③儀器和試劑價(jià)格相對(duì)便宜、檢測(cè)成本低，④操作簡(jiǎn)便、快捷，可在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)大批量細(xì)胞樣品的凋亡檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1779440SQ20041009177
公開日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者陳昭烈, 葉玲玲, 劉紅, 吳本傳, 劉興茂, 熊福銀, 黃培堂, 李世崇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所