專利名稱：細(xì)胞外電位測量用傳感元件、測量器件、裝置及測量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種把在細(xì)胞等活體試樣發(fā)生的電化學(xué)變化作為指標(biāo)來簡單高速地進(jìn)行生物試樣的電生理學(xué)評價(jià)的細(xì)胞外電位測量用傳感元件和細(xì)胞外電位測量器件。而且，本發(fā)明還涉及細(xì)胞外電位測量裝置和使用該裝置的細(xì)胞外電位測量方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，將細(xì)胞電活動作為指標(biāo)來篩選藥品是通過膜片鉗(patchcramp)法、使用熒光色素或者發(fā)光指示劑的方法進(jìn)行的。
膜片鉗法是使用附在微移液管頂端部分的細(xì)胞膜的微小部分(下面稱為片)，通過微小電極探針來電記錄介由單個(gè)通道蛋白質(zhì)分子之離子輸送的方法。膜片鉗法是能夠?qū)崟r(shí)研究一個(gè)蛋白質(zhì)分子之功能的數(shù)目不多的方法之一。
另外，還有通過使用根據(jù)特定離子濃度變化而發(fā)光的熒光色素或者發(fā)光指示劑來監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)離子移動以測量細(xì)胞電活動的方法(下面稱為熒光測量法)。
但是，膜片鉗法在微移液管的制作和操作上必須有特殊的技術(shù)。于是，膜片鉗法在一個(gè)試樣的測量上需要很多的時(shí)間。由于這些，膜片鉗法不適合用于高速篩選大量候補(bǔ)藥品化合物。
另外，盡管熒光測量法在高速篩選大量候補(bǔ)藥品化合物方面是可能的，但必須有細(xì)胞染色工序。而且，熒光測量法在測量時(shí)由于色素的影響而使背景濃度增高，由于隨著時(shí)間過去而脫色，使得測量的S/N比變差。
作為代替這些方法的方法，已有在國際公開第02/055653號公報(bào)(下面稱為專利文獻(xiàn)1)上公開的測量細(xì)胞外電位的方法(下面稱為細(xì)胞外電位測量法)。細(xì)胞外電位測量法可以得到與用膜片鉗法獲得的數(shù)據(jù)相等的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。而且，細(xì)胞外電位測量法能夠如熒光測量法那樣簡單高速地測量大量試樣。
專利文獻(xiàn)1公開了一種細(xì)胞外電位測量器件(下面稱為器件)，其測量細(xì)胞外電位或者細(xì)胞發(fā)生的物理化學(xué)變化。器件具有至少一個(gè)具有設(shè)置在基板上的細(xì)胞保持機(jī)構(gòu)的坑井(well)。而且，坑井具有用于檢測電信號的傳感機(jī)構(gòu)。
圖40是表示現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞外電位測量器件之結(jié)構(gòu)的模式圖。培養(yǎng)液110注入到坑井103內(nèi)。被檢體細(xì)胞(下面稱為細(xì)胞)105通過基板102上設(shè)置的細(xì)胞保持部113被捕捉或保持。細(xì)胞保持部113具有在基板102上形成的凹下部104、開口部106和貫通孔107。貫通孔107通過開口部106被連接到凹下部104。而且，在貫通孔107中配置有作為傳感機(jī)構(gòu)的檢測電極109。然后，檢測電極109經(jīng)過布線108被連接到信號檢測部(未圖示)。
測量時(shí)，通過吸泵(未圖示)等從貫通孔107側(cè)吸引細(xì)胞105并使其貼緊保持在凹下部104部分上。同時(shí)，培養(yǎng)液111流到貫通孔107一側(cè)并接觸檢測電極109。這樣，由細(xì)胞105的活動產(chǎn)生的電信號就不會傳到坑井103的培養(yǎng)液110，而通過貫通孔107一側(cè)設(shè)置的檢測電極109檢出。
但是，由于使細(xì)胞105和藥劑(未圖示)發(fā)生反應(yīng)，使用以往的細(xì)胞外電位測量器件的測量方法必須將藥劑注入到培養(yǎng)液110內(nèi)。向培養(yǎng)液110內(nèi)注入藥劑使得在細(xì)胞105周圍的培養(yǎng)液110發(fā)生流動。當(dāng)細(xì)胞105周圍培養(yǎng)液110的流動變化較大時(shí)，與檢測電極109接觸的培養(yǎng)液111出現(xiàn)起伏波動。培養(yǎng)液111的起伏波動對于檢測電極109來說就成為噪聲。
當(dāng)測量細(xì)胞外電位時(shí)，相對檢測電極109的噪聲就成為使檢測電極109檢測信號之S/N變壞的原因。由于培養(yǎng)液111的起伏波動而產(chǎn)生的噪聲一般來說是100Hz以下的低頻。另一方面，細(xì)胞外電位的變化是以DC成分到5kHz左右的周期變化的信號。即，兩個(gè)信號的頻帶重疊。
另外，盡管試圖用電濾波器等來降低噪聲成分，但DC成分附近的低頻區(qū)域的信號也被切掉了。而且，根據(jù)濾波器特性，高于100Hz的區(qū)域的信號有時(shí)也被切掉了。結(jié)果，正確捕捉細(xì)胞105產(chǎn)生的細(xì)胞外電位信號變得困難了。
發(fā)明公開本發(fā)明的細(xì)胞外電位測量用傳感元件具有基板、在基板上設(shè)置的坑井、在坑井的壁面上設(shè)置的引導(dǎo)部以及在基板的下面設(shè)置的檢測電極。引導(dǎo)部引導(dǎo)藥劑。在坑井的底面設(shè)置有凹下部和用于貫通凹下部和基板下面的第一貫通孔?？泳贡粰z體細(xì)胞、培養(yǎng)液和藥劑相混合。


圖1是實(shí)施方式1中的細(xì)胞外電位測量器件的部分切除分解斜視圖。
圖2是圖1所示器件中使用的傳感元件的部分切除分解斜視圖。
圖3是圖2所示傳感元件主要部分的部分切除放大斜視圖。
圖4是表示圖1所示器件之使用方法的剖面圖。
圖5是圖1所示器件的放大剖面圖。
圖6是圖1所示器件的放大剖面圖。
圖7是圖1所示器件的剖面圖。
圖8是圖1所示器件的剖面圖。
圖9是表示圖1所示器件上使用的傳感元件的斜視圖。
圖10是表示圖1所示器件上使用的傳感元件的斜視圖。
圖11是表示圖1所示器件中的細(xì)胞外電位之測量方法的流程圖。
圖12是表示圖1所示器件中的細(xì)胞外電位測量方法之測量數(shù)據(jù)的特性圖。
圖13是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖14是表示圖1所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖15是表示圖1所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖16是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖17是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖18是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖19是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖20是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖21是表示圖1所示器件之制造方法的剖面圖。
圖22是實(shí)施方式2中的細(xì)胞外電位測量器件的部分切除分解斜視圖。
圖23是圖22所示器件的部分切除分解斜視圖。
圖24是圖22所示器件中使用的傳感元件的部分切除分解斜視圖。
圖25是圖24所示傳感元件主要部分的部分切除放大斜視圖。
圖26是本發(fā)明的細(xì)胞外電位測量器件的部分切除斜視圖。
圖27是本發(fā)明的細(xì)胞外電位測量器件的部分切除斜視圖。
圖28是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖29是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖30是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖31是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖32是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖33是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖34是表示圖22所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖35是表示圖22所示器件之制造方法的剖面圖。
圖36是實(shí)施方式3中的細(xì)胞外電位測量器件的部分?jǐn)U大剖面圖。
圖37是表示圖36所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖38是表示圖36所示器件之制造方法的部分放大剖面圖。
圖39是實(shí)施方式3中的細(xì)胞外電位測量器件的部分放大剖面圖。
圖40是現(xiàn)有技術(shù)細(xì)胞外電位測量器件的模式剖面圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施方式1圖1是實(shí)施方式1中的細(xì)胞外電位測量器件的部分切除分解斜視圖。圖1是用剖面圖來表示容器的一部分，以可見容器內(nèi)部。圖2是細(xì)胞外電位測量用傳感元件(下面稱為傳感元件)的部分切除斜視圖。另外，圖3是圖2所示的傳感元件主要部分的部分切除放大斜視圖。
細(xì)胞外電位測量器件(下面稱為器件)51是細(xì)胞外電位測量用傳感元件1連接在容器2上的結(jié)構(gòu)。傳感元件1是由硅和二氧化硅的層疊體構(gòu)成。另外，容器2由作為電絕緣體的樹脂構(gòu)成，容器2上設(shè)置有用于測量容器2中電位的參考電極7。
在傳感元件1內(nèi)設(shè)置有具有從傳感元件1上面開口的坑井9。在坑井9的底面設(shè)置有第一微小貫通孔(下面稱為貫通孔)3和凹下部4。具有小于凹下部4的孔徑的貫通孔3貫通凹下部4底面和傳感元件1下面。另外，如圖3所示，在貫通孔3下部的傳感元件1下面設(shè)置有測量用檢測電極8。
在容器2的底部設(shè)置有第二貫通孔(下面稱為貫通孔)5。貫通孔5的尺寸大于坑井9開口的尺寸。而且，坑井9的壁10的形狀變成研缽狀?？泳?承擔(dān)了儲藏培養(yǎng)液和藥劑的任務(wù)。
另外，在容器2的側(cè)面設(shè)置有第三貫通孔(下面稱為貫通孔)6。管11被插入到貫通孔6中。管11的頂端通過以貫通孔6作為引導(dǎo)被更精確地定位在形成貫通孔3和凹下部4的位置上。
圖5和圖6是表示用氧化膜46覆蓋凹下部4和貫通孔3的情況。氧化膜46在必要時(shí)可根據(jù)測量對象細(xì)胞的種類、大小等而形成。氧化膜46是多種多樣的，可以類似熱氧化膜厚度為10000埃或其以上，也可以類似自然氧化膜為500?；蚱湟韵?。氧化膜46的厚度不是構(gòu)成本發(fā)明的必要條件。
下面，說明器件51的使用方法。
圖4是表示器件51使用方法的剖面圖。圖5和圖6是貫通孔3和凹下部4的部分放大剖面圖。
當(dāng)培養(yǎng)液22和被檢體細(xì)胞(下面稱為細(xì)胞)21被注入到容器2時(shí)，細(xì)胞21在培養(yǎng)液22中浮游。在培養(yǎng)液22不只充滿容器2內(nèi)部，還充滿凹下部4、貫通孔3之后，在檢測電極8一側(cè)溢出。
如圖5和圖6所示，在培養(yǎng)液22中浮游的細(xì)胞21根據(jù)容器2內(nèi)的壓力，被引入到凹下部4。當(dāng)對細(xì)胞21的引入壓力不足時(shí)，通過使用吸泵(未圖示)等從檢測電極8一側(cè)吸引培養(yǎng)液22。于是，浮游在培養(yǎng)液22中的細(xì)胞21被確實(shí)可靠地吸引到凹下部4。設(shè)計(jì)貫通孔3的尺寸小于細(xì)胞21。因此，細(xì)胞21被保持在凹下部4的內(nèi)部。
另一方面，為了確實(shí)可靠地將藥劑(未圖示)投放到細(xì)胞21的周圍，用于投放藥劑的管11的頂端應(yīng)該盡可能設(shè)置在距離保持有細(xì)胞21的凹下部4較近的位置。通常，管11使用直徑為1mm或其以下的極細(xì)的管子。因此，如圖7和圖8所示，當(dāng)從充滿了培養(yǎng)液22的容器2的上部放入管11時(shí)，管11因受到培養(yǎng)液22表面張力的作用而變彎。所以，難以將管11的頂端高精度地定位到規(guī)定位置。
因此，貫通孔6以從形成貫通孔3和凹下部4的位置成為放射狀的方式而被設(shè)置在容器2的側(cè)面上。然后，管11插入到貫通孔6中。因此，管11的頂端位置可以被高精度地設(shè)定在貫通孔3和凹下部4的極近處。
因此，即使容器2中充滿培養(yǎng)液22，管11的頂端也不會受到培養(yǎng)液22的表面張力的作用，并能容易地定位到規(guī)定位置。即，貫通孔6的壁面完成了引導(dǎo)管11的引導(dǎo)任務(wù)。由此，常?？梢允顾巹┑耐斗欧€(wěn)定進(jìn)行。
另外，通過將坑井9的壁10做成研缽形狀，藥劑容易浸透到坑井9的內(nèi)部。因此，即使當(dāng)從管11的藥劑投藥壓力低時(shí)，也能夠完成向被保持在凹下部4之細(xì)胞21附近的可靠藥劑投藥。由此，細(xì)胞21不會被隨意地施加壓力，可以防止細(xì)胞21被施加壓力而引起的振動。壁10由于被做成研缽形狀，因此是作為將藥劑引導(dǎo)到坑井9內(nèi)的引導(dǎo)部而發(fā)揮作用。
其中，貫通孔5比坑井9的開口大，因此不會遮蔽坑井9的研缽形形狀。由此，藥劑容易浸透到坑井9的底部。
而且，管11的材料優(yōu)選樹脂、玻璃或者二氧化硅的任何一種。這些材料是電絕緣體，即使插入到容器2中也不會隨意地?cái)_亂培養(yǎng)液22的電位。
另外，如圖9所示，坑井9A的壁10A的形狀也可以是螺旋形狀。通過使壁10A成為螺旋形狀，即使藥劑的投藥壓力設(shè)定得較低且藥劑的流入速度也較低，所投放的藥劑也能夠均勻地混合到坑井9A內(nèi)的培養(yǎng)液22中。具有螺旋形狀壁10A的傳感元件1A可以進(jìn)行誤差少的高精度測量，所以是有效果的。
而且，如圖10所示，坑井9B的壁10B的形狀也能夠做成朝向中心的放射狀。通過使壁10B成為放射形狀，即使藥劑的投藥壓力設(shè)定得較低且藥劑的流入速度也較低，所投放的藥劑也能夠均勻地混合到坑井9B內(nèi)的培養(yǎng)液22中。具有放射形狀壁10B的傳感元件1B可以獲得與螺旋形狀時(shí)相同的效果。螺旋形狀或者放射形狀的壁10A，10B與研缽形狀的壁10相同，都作為將藥劑引導(dǎo)至坑井9A，9B內(nèi)的引導(dǎo)部而發(fā)揮作用。
其中，凹下部4的尺寸依賴于作為測量對象的細(xì)胞21而變化，可以為將細(xì)胞21保持在凹下部4內(nèi)的尺寸。典型地，凹下部4的直徑為10-500微米，深度為1-500微米。優(yōu)選凹下部4的直徑為10-100微米，深度為2-100微米。進(jìn)一步優(yōu)選凹下部4的直徑為20微米，深度為10微米或者20微米。
另外，與凹下部4相同，貫通孔3的尺寸也依賴于測量對象的細(xì)胞21而變化，可以為將細(xì)胞21保持在凹下部4內(nèi)的尺寸。典型地，貫通孔3的直徑為5-100微米，深度為10納米-100微米。優(yōu)選貫通孔3的直徑為5微米，深度為1.5微米。
接著，說明利用了器件51的細(xì)胞外電位的測量方法。
首先，通過管11將藥劑投放到容器2內(nèi)的培養(yǎng)液22中。藥劑浸透到培養(yǎng)液22內(nèi)部，然后浸透到保持在凹下部4中的細(xì)胞21的周圍。
如圖6所示，在細(xì)胞21通過藥劑而被活化之后，細(xì)胞21通過細(xì)胞膜內(nèi)的離子通道(未圖示)攝取或反過來釋放Na+，K+，Ca+等離子的離子交換頻率增加。離子交換是在藥劑作用下反應(yīng)的細(xì)胞所發(fā)生的電化學(xué)變化。
離子交換頻率的增加使細(xì)胞21周圍或者貫通孔3內(nèi)部的培養(yǎng)液22中的離子濃度發(fā)生變化，進(jìn)而引起電位變化。另一方面，貫通孔3內(nèi)部的培養(yǎng)液22的電阻通常維持在5兆歐以上以與容器2內(nèi)部的培養(yǎng)液22分開。因此，能夠?qū)⒇炌?內(nèi)部的離子濃度或者電位變化作為電信號而從檢測電極8中取出。
這里，細(xì)胞21與培養(yǎng)液22之間的離子交換頻率根據(jù)細(xì)胞21的種類而多種多樣。但是，一般地，離子交換現(xiàn)象不是以特定周期而同步進(jìn)行的，而是在各離子通道上隨機(jī)進(jìn)行的。即，檢測的電信號不是只在特定的頻率下觀測的，而是寬幅檢測從DC到5kHz左右的頻率信號。
圖11是表示細(xì)胞外電位測量方法的流程圖。首先，用作為傳感部的檢測電極8所檢測的電壓或者電流的電信號62由放大器63放大。被放大的電信號64通過高速傅立葉變換器(下面稱為FFT)65在規(guī)定時(shí)間內(nèi)積累以進(jìn)行頻域變換。接著，頻域上的信號強(qiáng)度66在每個(gè)規(guī)定時(shí)間上由計(jì)算機(jī)67描繪。這樣，用檢測電極8測量的電信號62在頻率變換之后被計(jì)算機(jī)所描繪。
從外部混入的噪聲具有周期性的頻率成分。因此，通過分析頻域上的信號強(qiáng)度66，細(xì)胞21產(chǎn)生的電信號與噪聲可在視覺上被區(qū)分開。所以，即使在產(chǎn)生有來自外部的電源噪聲的情況下，也能夠容易地將細(xì)胞21產(chǎn)生的電信號與噪聲區(qū)分開。本發(fā)明的細(xì)胞外電位測量方法能夠正確地捕捉到藥劑所引起的細(xì)胞21的反應(yīng)變化。
圖12是通過細(xì)胞外電位測量方法獲得的測量數(shù)據(jù)的特性圖。在圖12中，橫坐標(biāo)以秒為單位表示測量時(shí)間?？v坐標(biāo)是頻率，其以濃度繪出在橫坐標(biāo)的測量時(shí)間中的頻率的信號強(qiáng)度(稱為等高線(contour)圖)。在圖12中，在信號72和信號73可以看到橫線。即，信號72和信號73具有周期性頻率成分，因此是從外部電源等混入的噪聲。信號71和信號74不具有周期性頻率成分，其是通過改變細(xì)胞21附近的離子濃度而被觀測到的電信號。
接著，說明本實(shí)施方式1的細(xì)胞外電位測量器件51的制造方法。圖13和圖16-圖20是表示細(xì)胞外電位測量器件51之制造方法的傳感元件1的剖面圖。圖14和圖15是表示細(xì)胞外電位測量器件51之制造方法的傳感元件1的部分放大剖面圖。圖21是表示細(xì)胞外電位測量器件51制造方法的剖面圖。
如圖13所示，基板40是將基底41、中間層42和薄板43層疊而成的。然后，基底41和薄板43由硅構(gòu)成，中間層42由二氧化硅構(gòu)成。在基板40的薄板43的一面上形成有規(guī)定圖案的抗蝕劑掩膜44被形成。其中，基板40的原材料一般被稱為SOI基板，在制作半導(dǎo)體器件時(shí)經(jīng)常使用。因此獲得比較容易，所以省略對基板40制造方法的說明。
首先，如圖14所示，通過干式蝕刻形成貫通孔3，并達(dá)到薄板43的規(guī)定深度。形成貫通孔3的方法最好為采用干式蝕刻的方法。干式蝕刻使用了促進(jìn)蝕刻的氣體(下面稱為促進(jìn)氣體)(未圖示)和抑制蝕刻的氣體(下面稱為抑制氣體)(未圖示)。促進(jìn)氣體是XeF2，CF4，SF6等。另外，抑制氣體是CHF3，C4F8等?；旌洗龠M(jìn)氣體和抑制氣體來進(jìn)行蝕刻，由蝕刻所形成的孔的壁面被作為CF2聚合物的保護(hù)膜所覆蓋。當(dāng)孔的壁面被保護(hù)膜覆蓋時(shí)，抑制向壁面的蝕刻。結(jié)果，通過干式蝕刻的貫通孔3的形成是在只在抗蝕劑掩膜44的下方具有各向異性的情況下而進(jìn)行的。
這里，再稍微詳細(xì)地說明通過只在下方具有各向異性來進(jìn)行蝕刻的結(jié)構(gòu)。
首先，在蝕刻工序中，通過促進(jìn)氣體而僅稍微進(jìn)行蝕刻。此后，在保護(hù)膜形成工序中，通過抑制氣體而僅稍微形成保護(hù)膜。通過蝕刻工序和保護(hù)膜形成工序的相互重復(fù)進(jìn)行，在大致垂直方向上進(jìn)行由蝕刻實(shí)現(xiàn)的開孔加工和孔壁面的保護(hù)膜形成。
在蝕刻工序中，在通過外部線圈的感應(yīng)耦合所生成的等離子體中，對基板40施加高頻電壓。于是，在基板40上產(chǎn)生負(fù)偏壓，等離子體中作為正離子的SF5+或者CF3+朝著基板40碰撞。由此，干式蝕刻向垂直下方的方向進(jìn)行。于是形成了貫通孔3。
另一方面，在保護(hù)膜形成工序中，不對基板40施加高頻電壓。于是，在基板40上完全不產(chǎn)生偏壓，所以等離子體中的正離子沒有受到偏轉(zhuǎn)，干式蝕刻被抑制。然后，成為保護(hù)膜材料的CF+在蝕刻工序中出現(xiàn)的新面上發(fā)揮作用。其結(jié)果，相對于由干式蝕刻形成的貫通孔3的壁面而形成均勻的保護(hù)膜75。實(shí)驗(yàn)中，通過使用了作為促進(jìn)氣體的SF6和作為抑制氣體的C4F8的干式蝕刻，確認(rèn)了貫通孔3和保護(hù)膜75的形成。
如上所述，當(dāng)通過使用了促進(jìn)氣體和抑制氣體的干式蝕刻來進(jìn)行貫通孔3的形成時(shí)，貫通孔3是向著抗蝕劑掩膜44下方的深度方向進(jìn)行而形成的。然后，通過使用抑制氣體，在貫通孔3的壁面上形成保護(hù)膜75。
接著，如圖15所示，例如，只使用XeF2等促進(jìn)氣體來進(jìn)行干式蝕刻。促進(jìn)氣體不蝕刻形成在貫通孔3的壁面上的保護(hù)膜75。然后，只在貫通孔3底面的硅上面進(jìn)行蝕刻。而且，由于促進(jìn)氣體不蝕刻二氧化硅，也就不蝕刻中間層42。其結(jié)果是形成了比貫通孔3大的凹下部4。
接著，如圖16所示，進(jìn)行在基底41面上形成抗蝕劑掩膜45的蝕刻。于是，如圖17所示，形成了坑井9。關(guān)于坑井9形成時(shí)的蝕刻方法，例如是只使用XeF2或者SF6等促進(jìn)氣體的干式蝕刻。由此，坑井9側(cè)面的壁10成為研缽形狀。
另外，為了使坑井9形成螺旋形狀或者放射形狀，可以適宜地進(jìn)行使用了適當(dāng)?shù)奈g刻掩膜的蝕刻。在這種情況下，蝕刻所使用的氣體不只使用促進(jìn)氣體，也使用了抑制氣體。
接著，如圖18所示，用濕式蝕刻或者干式蝕刻等一般方法對中間層42進(jìn)行蝕刻。
接著，除去抗蝕劑掩膜45。而且，如圖19所示，通過一般的熱氧化工序在硅表面上形成熱氧化膜46。其中，熱氧化工序被用于希望盡量增加硅表面電阻的場合。當(dāng)硅的表面不需要高表面電阻時(shí)，只需在硅表面上自然地形成自然氧化膜就可以了。
接著，如圖20所示，通過使用了例如Au、Al、Ti、Cr等金屬的濺射或者真空蒸鍍等通常的薄膜形成機(jī)構(gòu)，在薄板43的面上形成檢測電極8。
如上所述，通過在基板40上實(shí)施各種加工而制成傳感元件1。通過將由硅和二氧化硅的層疊體所構(gòu)成的SOI基板用作基板40的材料，能夠極其簡便地進(jìn)行高精度的加工。由此有效地制造傳感元件1。
最后，如圖21所示，通過使用粘結(jié)劑50等使傳感元件1粘結(jié)到容器2上。而且，由于容器2是用樹脂成型加工等一般方法制成的，因此省略對其的說明。另外，容器2的材質(zhì)優(yōu)選電絕緣材料，以使容器2內(nèi)的培養(yǎng)液22的電位不會隨意地變化，并且不對測量造成不良影響。
而且，在測量時(shí)插入?yún)⒖茧姌O7和管11。
其中，在使用作為硅和二氧化硅的層疊體的基板40的情況下對傳感元件1進(jìn)行說明。但是，中間層42的材質(zhì)不局限于二氧化硅。與硅制基底41和薄板43相比，中間層42很難被蝕刻而能夠使用電絕緣性高的材料。中間層42的材質(zhì)也能夠使用例如包含二氧化硅的玻璃材料。
實(shí)施方式2使用圖22到圖27來說明實(shí)施方式2。對于和實(shí)施方式1相同構(gòu)成的部分，給出相同的符號來說明。圖22是實(shí)施方式2中的細(xì)胞外電位測量器件的部分切除分解斜視圖。圖23是圖22中容器的部分切除分解斜視圖。圖24是傳感元件的部分切除斜視圖。圖25是圖24所示傳感元件的部分切除放大斜視圖。
在圖22中，細(xì)胞外電位測量器件(下面稱為器件)81是由傳感元件12連接到容器13的下部而構(gòu)成。容器13由電絕緣樹脂構(gòu)成，在容器13內(nèi)部安裝用于測量容器13內(nèi)部電位的參考電極7。
另外，傳感元件12由硅和二氧化硅的層疊體構(gòu)成。然后，在傳感元件12的下部設(shè)有開口部20。檢測電極19被設(shè)置于通過開口部20在傳感元件12下部形成的傳感元件12的下面。凹下部4設(shè)置在傳感元件12的上部。而且，設(shè)置有貫通凹下部4的底面和設(shè)置了檢測電極19的傳感元件12的下面的第一微小貫通孔(下面稱為貫通孔)3。
第二貫通孔(下面稱為貫通孔)14形成在容器13的底部。貫通孔14的壁15的形狀是研缽形狀。然后，由連接在容器13下部的傳感元件12的上面16、貫通孔14和壁15形成了坑井17。本實(shí)施方式2與實(shí)施方式1之間的差別在于坑井17的結(jié)構(gòu)不同。
而且，第三貫通孔6設(shè)置在容器13的側(cè)面上。假定傳感元件12連接到容器13下部，貫通孔6是以從貫通孔3和凹下部4附近的規(guī)定位置呈放射形狀貫通的方式而形成的。
這里，器件81的使用方法和利用器件81的細(xì)胞外電位測量方法幾乎與實(shí)施方式1的相同。
通過使壁15成為研缽形狀，當(dāng)測量細(xì)胞外電位時(shí)，即使藥劑投放的流入速度放慢，藥劑也能可靠地浸透到凹下部4所保持的被檢體細(xì)胞21的周圍。然后，與實(shí)施方式1相同，在細(xì)胞21周圍的培養(yǎng)液22不會發(fā)生流動變化。因此，進(jìn)行穩(wěn)定測量是可能的。而且，壁15成為研缽形狀，并作為把藥劑引導(dǎo)至坑井17內(nèi)的引導(dǎo)部而發(fā)揮作用。
其中，如圖26所示，當(dāng)形成向著容器13A底部貫通孔14A中心的螺旋形狀的壁23A時(shí)，即使藥劑的流入速度進(jìn)一步降低，也能夠使所投放藥劑均勻地混合在培養(yǎng)液22中。因此，壁23A可以進(jìn)行誤差少的高精度測量，所以是有效果的。
另外，如圖27所示，當(dāng)壁23B的形狀做成向著容器13B底部貫通孔14B的中心呈放射狀時(shí)，同樣也能進(jìn)行高精度測量，所以也是有效果的。螺旋形狀的壁23A或者放射形狀的壁23B與研缽形狀的壁15相同，都是作為將藥劑引導(dǎo)到坑井17內(nèi)的引導(dǎo)部而發(fā)揮作用的。
另外，開口部20不一定是必要的。在本實(shí)施例中，為了在用于獲得傳感元件12之機(jī)械強(qiáng)度的傳感元件12厚度和貫通孔3深度之間得到平衡而設(shè)置了開口部20。因此，如果即使傳感元件12較薄也能得到充分的強(qiáng)度，則開口部20不一定是必要的。
接著，說明本實(shí)施方式2細(xì)胞外電位測量器件81的制造方法。圖28-圖34是表示細(xì)胞外電位測量器件81制造方法的傳感元件12的剖面圖。圖35是表示細(xì)胞外電位測量器件81制造方法的剖面圖。
如圖28所示，基板25由基底26、中間層27和薄板28構(gòu)成?；?6和薄板28的材質(zhì)都是硅，中間層27的材質(zhì)是二氧化硅?？刮g劑掩膜29形成在基板25的基底26的面上。其中，基板25被稱為SOI基板，在制作半導(dǎo)體器件時(shí)被經(jīng)常使用。由于SOI基板容易獲得，所以省略對SOI基板的制造方法的說明。
接著，如圖29所示，通過使用干式蝕刻、濕式蝕刻等常規(guī)的蝕刻方法來蝕刻基底26以形成開口部20。
接著，如圖30所示，在基板25的薄板28面上以規(guī)定圖案形成抗蝕劑掩膜30。
接著，如圖31所示，通過干式蝕刻，從基板25的薄板28面開始進(jìn)行蝕刻。蝕刻所使用的蝕刻氣體只是促進(jìn)氣體。促進(jìn)氣體是例如SF6、CF4或者XeF2等。使用促進(jìn)氣體的硅的蝕刻不只對深度方向上的蝕刻有促進(jìn)作用，對寬度方向上的蝕刻也有促進(jìn)作用。用使用XeF2的蝕刻來確認(rèn)實(shí)驗(yàn)效果。然后，如圖31所示，蝕刻形狀成為以抗蝕劑掩膜30的開口部為中心的半球形，并形成凹下部4。另外，由于抗蝕劑掩膜30幾乎不被XeF2蝕刻，因此保持了最初的形狀。
接著，如圖32所示，再次從薄板28面開始進(jìn)行干式蝕刻。蝕刻氣體使用促進(jìn)氣體和抑制氣體的混合氣體。由此，由于蝕刻是只在垂直下方具有各向異性而進(jìn)行的，于是從凹下部4的下部連接并形成了貫通孔3。
接著，如圖33所示，通過干式蝕刻、濕式蝕刻等通常的蝕刻方法，從基底26面開始蝕刻由二氧化硅構(gòu)成的中間層27。而且還除去了抗蝕劑掩膜30。
接著，如圖34所示，通過通常的薄膜形成技術(shù)，從基板25的基底26面開始形成Au作為主體的檢測電極19。通過經(jīng)過上述制造工序，得到了傳感元件12。而且，如果需要，還可以在形成檢測電極19的工序之前進(jìn)行熱氧化處理，形成覆蓋硅表面的熱氧化膜46。
接著，如圖35所示，以薄板28的面作為上面，用粘結(jié)劑50等將傳感元件12粘貼到另外制作的樹脂制容器13的底面。其中，容器13由模壓成型、光成型、切削加工等常規(guī)方法制造。如果使用這些方法，容器13底面的貫通孔14和容器13側(cè)面的貫通孔6可以形成為規(guī)定形狀。由于貫通孔6和貫通孔4的形成不是特別困難，說明省略。
由此，制作了本實(shí)施方式2所示的細(xì)胞外電位測量器件81。
另外，在使用作為硅和二氧化硅的層疊體的基板25的情況下對傳感元件1進(jìn)行說明。但是，中間層27的材質(zhì)不局限于二氧化硅。與硅制基底26和薄板28相比，中間層27難以被蝕刻而能夠使用電絕緣性高的材料。中間層27的材質(zhì)也能夠使用例如包含二氧化硅的玻璃材料。
實(shí)施方式3使用圖36到圖38說明實(shí)施方式3。其中，對于與實(shí)施方式1相同結(jié)構(gòu)的部分，給出相同的符號來說明。
圖36是表示本實(shí)施方式3中的細(xì)胞外電位測量器件的結(jié)構(gòu)的剖面圖。
本實(shí)施方式3中公開的內(nèi)容也是在實(shí)施方式1或者2所示的細(xì)胞外電位測量器件中能夠適用的內(nèi)容。因此可獲得同樣的效果。
如圖36和圖38所示，本實(shí)施方式3與實(shí)施方式1的不同點(diǎn)是在傳感元件38上所形成的檢測電極8的一部分被絕緣層31覆蓋。因此，只在貫通孔3的開口部37附近露出檢測電極8。而且，由玻璃構(gòu)成的絕緣基板39是介由與檢測電極8之間的規(guī)定空隙而覆蓋該檢測電極8。
那么，檢測細(xì)胞外電位的步驟與實(shí)施方式1相同。因此，說明省略。在這里，說明將絕緣層31設(shè)置在檢測電極8的表面上的效果和設(shè)置絕緣基板39的效果。
如前面在實(shí)施方式1用圖4和圖5所示的那樣，在測量時(shí)，培養(yǎng)液22也流出到檢測電極8一側(cè)。于是，所流出的培養(yǎng)液22與檢測電極8的露出面接觸。
另一方面，由于細(xì)胞21的離子交換而發(fā)生離子濃度變化或者電位變化的區(qū)域被限制在細(xì)胞21的最近旁。但是，檢測電極8不只檢測貫通孔3附近培養(yǎng)液22的電位變化。例如，假設(shè)在遠(yuǎn)離貫通孔3的區(qū)域(例如圖4的圓所包圍的區(qū)域C)中產(chǎn)生了由和細(xì)胞21活動無關(guān)的噪聲導(dǎo)致的電位變化。于是，檢測電極8也檢測出這些噪聲所造成的電位變化。然后，檢測電極8檢測的電信號就成為將細(xì)胞21的離子交換導(dǎo)致的電位變化和噪聲導(dǎo)致的電位變化進(jìn)行平均的電位變化。作為結(jié)果，正確檢測出因細(xì)胞21的離子交換導(dǎo)致的電位變化就困難了。
因此，如圖36所示，檢測電極8做成用絕緣層31覆蓋檢測電極8的一部分并且只露出在貫通孔3的開口部37最近旁的結(jié)構(gòu)。通過這，不會檢測出因噪聲引起的電位變化(例如在圖36的圓所包區(qū)域D部發(fā)生的變化)。因此，不受來自外部的外擾的影響而能夠進(jìn)行穩(wěn)定的測量。
檢測電極8的露出面積越小，噪聲造成的不良影響就越小，就能夠進(jìn)行穩(wěn)定的測量。而且，為了穩(wěn)定測量，優(yōu)選通過絕緣層31覆蓋的檢測電極8的面積比檢測電極8的露出面積大。
另外，絕緣基板39抑制檢測電極8面上培養(yǎng)液22的起伏波動而降低因培養(yǎng)液22的起伏波動引起的噪聲。即，在圖4所示的器件51中，檢測電極8面上的培養(yǎng)液22露出到大氣中。測量時(shí)，在發(fā)生外部振動或者大氣壓力變動的情況下，有時(shí)在培養(yǎng)液22的表面會產(chǎn)生起伏波動的情況。當(dāng)在培養(yǎng)液22的表面上出現(xiàn)起伏波動時(shí)，在培養(yǎng)液22中就發(fā)生流動。于是，在貫通孔3附近的培養(yǎng)液22上也發(fā)生流動，這成為噪聲的原因。因此，檢測電極8就不能夠正確地測量因細(xì)胞21的離子交換所發(fā)生的離子濃度或者電位的變化。
而且，有時(shí)貫通孔3附近的壓力發(fā)生變化，用于保持細(xì)胞21的壓力也發(fā)生變化。當(dāng)細(xì)胞21受到變化壓力時(shí)，用于隔開貫通孔3和容器2的電絕緣電阻發(fā)生變化。同時(shí)，細(xì)胞21因外部壓力刺激，其電活動狀態(tài)改變。由于絕緣電阻的變化或者細(xì)胞21電活動狀態(tài)的變化，檢測電極8檢測的電信號就變化。因此不能夠正確地測量因細(xì)胞21與藥劑反應(yīng)而發(fā)生的離子交換所引起的電位變化。
因此，如圖36所示，絕緣基板39通過一定空隙與檢測電極8的面連接。在檢測電極8一側(cè)流出的培養(yǎng)液22由于被封閉在傳感元件38和絕緣基板39之間而不與大氣直接接觸。由此，受到來自外部的力的情況是極少的。然后，在測量中，即使產(chǎn)生外部振動或者大氣壓力變動，培養(yǎng)液22的表面也不會起伏波動。
結(jié)果，可穩(wěn)定檢測細(xì)胞外電位的器件91得到實(shí)現(xiàn)。而且，用于封閉培養(yǎng)液22的絕緣基板39優(yōu)選為電絕緣體，以便培養(yǎng)液22的電位不會隨意地不穩(wěn)定。
下面，說明用于制造實(shí)施方式3中器件91的方法。在實(shí)施方式3中，由于能夠使用前面在實(shí)施方式1中說明的制造方法的基板40，省略在實(shí)施方式1中說明的工序(圖13-圖20)。
首先，準(zhǔn)備在圖20中所示的形成檢測電極8的基板40。然后，如圖36所示，通過電絕緣材料的濺射、真空蒸鍍、旋涂等方法使絕緣層31形成在基板40的形成了檢測電極8的面上。電絕緣材料是聚酰亞胺、氟樹脂，二氧化硅等。
接著，如圖38所示，絕緣層31不需要的部分通過使用了抗蝕劑掩膜的蝕刻等去掉，從而形成具有規(guī)定圖案的絕緣層31。由此獲得只在貫通孔3開口部37最近旁露出檢測電極8的傳感元件38。
接著，通過使用粘結(jié)劑50等，使檢測電極8的面向下，把傳感元件38粘結(jié)到容器2的底面。然后，如圖36所示，將絕緣基板39粘結(jié)到傳感元件38的檢測電極8的面上，使得與傳感元件38之間具有規(guī)定的間隙。為了正確的測量，絕緣基板39的粘結(jié)優(yōu)選使用絕緣性的樹脂粘結(jié)劑(未圖示)。
其中，上述本實(shí)施方式3也可適用于根據(jù)上述實(shí)施方式2的器件81。圖39是表示將實(shí)施方式3適用于根據(jù)實(shí)施方式2的器件81的細(xì)胞外電位測量器件的部分放大剖面圖。
如圖39所示，與實(shí)施方式2的不同點(diǎn)是在傳感元件58上所形成的檢測電極19的一部分被絕緣層31覆蓋。因此，只露出在貫通孔3開口部37附近的檢測電極19。而且，由玻璃構(gòu)成的絕緣基板39介由和檢測電極19的規(guī)定空隙而覆蓋該檢測電極8。因此，可以獲得與上述相同的運(yùn)行和效果。
另外，用于制造細(xì)胞外電位測量器件92的方法能夠使用與用于制造上述器件91之方法相同的方法。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞外電位測量用傳感元件，其特征在于，包括基板，在所述基板內(nèi)設(shè)置的、具有底面和壁面、用于將被檢體細(xì)胞、培養(yǎng)液和藥劑混合的坑井，在所述壁面上設(shè)置的用于引導(dǎo)所述藥劑的引導(dǎo)部，以及在所述基板的下面設(shè)置的檢測電極；且在所述底面上設(shè)置有凹下部和用于貫通所述凹下部和所述基板的下面的第一貫通孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞外電位測量用傳感元件，其特征在于，所述引導(dǎo)部是研缽形狀、螺旋形狀和放射形狀中之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞外電位測量用傳感元件，其特征在于，還包括覆蓋所述檢測電極一部分的絕緣層。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞外電位測量用傳感元件，其特征在于，所述檢測電極由所述絕緣層覆蓋的覆蓋面積比所述檢測電極的露出面積大。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞外電位測量用傳感元件，其特征在于，所述基板是硅和在二氧化硅與包含二氧化硅的玻璃材料之中任何一種的層疊體。
6.一種細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，包括傳感元件，其具有基板，在所述基板內(nèi)設(shè)置的、具有底面和壁面、用于將被檢體細(xì)胞、培養(yǎng)液和藥劑混合的坑井，在所述壁面上設(shè)置的用于引導(dǎo)所述藥劑的引導(dǎo)部，在所述基板的下面設(shè)置的檢測電極，并且在所述底面上設(shè)置有凹下部和用于貫通所述凹下部和所述基板的下面的第一貫通孔；和容器，其由絕緣體構(gòu)成，與所述傳感元件的上部連接，并且在底部設(shè)置了比所述坑井更大的第二貫通孔。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述引導(dǎo)部是研缽形狀、螺旋形狀和放射形狀中之一。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述容器設(shè)置了從所述凹下部附近的規(guī)定位置以放射形狀貫通所述容器的第三貫通孔，還包括插入到所述第三貫通孔、用于將培養(yǎng)液或者藥劑之任何一個(gè)投放到所述容器內(nèi)的管。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述管為樹脂、玻璃和二氧化硅之中的一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，還包括覆蓋所述檢測電極的一部分的絕緣層。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述檢測電極由所述絕緣層覆蓋的覆蓋面積比所述檢測電極的露出面積大。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，還包括介由空隙而和所述檢測電極對向設(shè)置的絕緣體基板。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述基板是硅和在二氧化硅與包含二氧化硅的玻璃材料之中任何一種的層疊體。
14.一種細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，包括傳感元件，其包括具有上面和下面的基板、在所述下面設(shè)置的檢測電極，并且在所述基板上設(shè)置了凹下部和貫通所述凹下部和所述下面的第一貫通孔；容器，其由絕緣體構(gòu)成，與所述傳感元件的上部連接，并且在底部設(shè)置了第二貫通孔；引導(dǎo)部，其設(shè)置在所述第二貫通孔的壁面上，用于引導(dǎo)藥劑；坑井，其由所述上面和所述引導(dǎo)部形成，并用于將所述藥劑、被檢體細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行混合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述引導(dǎo)部是研缽形狀、螺旋形狀和放射形狀中之一。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述容器設(shè)置了從所述凹下部附近的規(guī)定位置以放射形狀貫通所述容器的第三貫通孔，還包括插入到所述第三貫通孔、用于將培養(yǎng)液或者藥劑之任何一種投放到所述容器內(nèi)的管。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述管為樹脂、玻璃和二氧化硅之中的一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，還包括覆蓋所述檢測電極的一部分的絕緣層。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述檢測電極由所述絕緣層覆蓋的覆蓋面積比所述檢測電極的露出面積大。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，還包括介由空隙而和所述檢測電極對向設(shè)置的絕緣體基板。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞外電位測量器件，其特征在于，所述基板是硅和在二氧化硅與包含二氧化硅的玻璃材料之中任何一種的層疊體。
22.一種細(xì)胞外電位測量裝置，其特征在于，包括傳感元件，其具有基板，在所述基板內(nèi)設(shè)置的、具有底面和壁面、用于將被檢體細(xì)胞、培養(yǎng)液和藥劑混合的坑井，在所述壁面上設(shè)置的用于引導(dǎo)所述藥劑的引導(dǎo)部，在所述基板的下面設(shè)置的檢測電極，并且在所述底面上設(shè)置了凹下部和用于貫通所述凹下部和所述基板下面的第一貫通孔；容器，其由絕緣體構(gòu)成，與所述傳感元件的上部連接，并且在底部設(shè)置了比所述坑井更大的第二貫通孔；放大器，其用于放大由所述檢測電極檢測的電信號；頻率變換器，其用于取得并頻率變換由所述放大器放大的電信號；和計(jì)算機(jī)，其用于在每個(gè)規(guī)定的時(shí)間上描繪從所述頻率變換器輸出的被頻率變換的信號。
23.一種細(xì)胞外電位測量裝置，其特征在于，包括傳感元件，其包括具有上面和下面的基板、在所述下面設(shè)置的檢測電極，并且在所述基板上設(shè)置了凹下部和貫通所述凹下部和所述下面的第一貫通孔；容器，其由絕緣體構(gòu)成，與所述傳感元件的上部連接，并且在底部設(shè)置了第二貫通孔；引導(dǎo)部，其設(shè)置在所述第二貫通孔的壁面上，用于引導(dǎo)藥劑；坑井，其由所述上面和所述引導(dǎo)部形成，并用于將所述藥劑、被檢體細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行混合；放大器，其用于放大由所述檢測電極檢測的電信號；頻率變換器，其用于取得并頻率變換由所述放大器放大的電信號；和計(jì)算機(jī)，其用于在每個(gè)規(guī)定的時(shí)間上描繪從所述頻率變換器輸出的被頻率變換的信號。
24.一種細(xì)胞外電位測量方法，其特征在于，包括將被檢體細(xì)胞產(chǎn)生的電位變化檢測作為電信號的檢測步驟；放大由所述檢測步驟檢測的電信號的放大步驟；頻率變換由所述放大步驟放大的電信號的頻率變換步驟；在每個(gè)規(guī)定時(shí)間上描繪由所述頻率變換步驟進(jìn)行頻率變換的信號的描繪步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細(xì)胞外電位測量用傳感元件，該傳感元件具有在基板上設(shè)置的坑井、在坑井底面上設(shè)置的凹下部、在基板的底面上設(shè)置的檢測電極。然后，凹下部通過微小貫通孔貫通到基板的底面。藥劑引導(dǎo)部設(shè)置在坑井的壁面上，可在坑井內(nèi)對藥劑、被檢體細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行混合。通過這個(gè)結(jié)構(gòu)，能夠正確測量被檢體細(xì)胞所發(fā)生的變化。
文檔編號C12M1/34GK1619302SQ20041009521
公開日2005年5月25日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者中谷將也, 尾崎亙彥, 岡弘章 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社