專利名稱：B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽及其篩選、制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小肽及其篩選、制備方法，本發(fā)明尤其涉及一種B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)抑制性小肽及其篩選、制備方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)及干燥綜合征(Sjgren′s syndrom，SS)是三種患病率較高的、嚴(yán)重威脅人類健康的自身免疫性疾病(以我國為例，SLE患病率為0.07％，女性約為0.1％；RA患病率為0.32％～0.36％；SS患病率為0.3％～0.7％，但在老年人群中患病率可高達(dá)3％～4％)。迄今為止，關(guān)于三種疾病的治療措施主要是使用抗炎藥物及免疫抑制劑，同時結(jié)合對癥處理的一般性治療。對于RA還可視情況采取滑膜切除或關(guān)節(jié)置換等外科手術(shù)治療。但總體來講，目前尚無特效療法。因此，為幾種疾病尋找特效治療方法一直是有關(guān)這些疾病研究中的一個熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。BLyS的發(fā)現(xiàn)及其作用的研究為上述熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題的解決帶來了新的希望。
BLyS又稱為BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family，TNF家族的B細(xì)胞活化因子)、TALL-1(TNF-and apoptosis ligand-related leukocyte expressedligand 1，TNF和凋亡配體相關(guān)的白細(xì)胞表達(dá)配體1)、THANK(TNF homologue thatactivates apoptosis，NF-κB and JNK，誘導(dǎo)凋亡并活化NF-κB和JNK的TNF同源物)、zTNF4等。該分子于1999年被發(fā)現(xiàn)和克隆，它是TNF超家族的一個新成員，其屬II型跨膜蛋白，N端在胞內(nèi)，C端在胞外。BLyS有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式，二者的生物學(xué)活性基本一致。人BLyS全長為285個氨基酸，其中47-73氨基酸為跨膜區(qū)，74-285氨基酸為胞外區(qū)，133-285氨基酸為其發(fā)揮功能的主要區(qū)域。BLyS可以以胞外區(qū)可溶片段形式存在，其生物學(xué)活性與全長膜結(jié)合蛋白基本一致。
BLyS主要表達(dá)于髓樣單核細(xì)胞系，其不僅廣泛參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育和分化以及抗體的產(chǎn)生，而且最近發(fā)現(xiàn)其還廣泛參與T細(xì)胞的活化和應(yīng)答過程。另外，人的BLyS不僅可活化人B細(xì)胞，而且可使小鼠的B細(xì)胞活化。
BLyS單體是一含9個保守β-片層的結(jié)構(gòu)，和其它許多TNF超家族成員一樣，寡聚化形成同源三聚體形式表現(xiàn)活性。BLyS作為一種配體蛋白，通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用。目前已發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于B細(xì)胞膜上的BLyS受體至少有三個，它們是TACI(transmembrane activator and cyclophilin ligand interactor，跨膜激活劑和環(huán)孢素配體相互作用物)、BCMA(B cell maturation antigen，B細(xì)胞成熟抗原)及BR3(BLyS receptor3，BLyS受體3)。而關(guān)于表達(dá)于T細(xì)胞膜上的BLyS受體，目前僅發(fā)現(xiàn)了TACI，是否還有其它受體的存在，尚不完全清楚。
近年諸多研究表明，BLyS過表達(dá)在某些自身免疫性疾病的發(fā)病中起著獨(dú)特的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的證據(jù)主要有1.在SLE病人，血清中sBLyS水平明顯升高，其與抗-雙鏈DNA抗體的滴度呈正相關(guān)，血清中的BLyS能在體外刺激B細(xì)胞活化。BLyS轉(zhuǎn)基因鼠可出現(xiàn)嚴(yán)重的B細(xì)胞增多癥和典型的SLE樣改變。
2.在RA病人，血清中sBLyS水平明顯升高，且與病人RA因子滴度呈正相關(guān)。同時RA病人關(guān)節(jié)滑膜液中的sBLyS水平也升高，其與關(guān)節(jié)局部的病理損傷有關(guān)。
3.在SS(該綜合征以重癥唾液腺炎、唾液分泌減少、頜下腺破壞為特征)病人，血清中sBLyS水平明顯升高，而且在發(fā)炎的唾液腺中，BLyS的表達(dá)水平明顯上調(diào)。在BLyS轉(zhuǎn)基因鼠，可出現(xiàn)SS樣改變。
4.體外和動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BLyS的可溶性受體(通常與抗體的Fc段融合)既可抑制人B細(xì)胞NF-κB的激活和免疫球蛋白的產(chǎn)生，也可阻斷T細(xì)胞活化。在SLE模型鼠，給予BLyS的可溶性受體后，可使動物蛋白尿程度明顯減輕，同時能延長動物的存活時間。在RA模型鼠，給予BLyS的可溶性受體后能使炎癥大大減輕，同時能明顯抑制骨和軟骨的破壞以及疾病的發(fā)展。
5.抗-BLyS抗體可通過中和sBLyS或封閉(或空間位阻)膜結(jié)合型BLyS的功能位點(diǎn)而抑制B細(xì)胞活化和多種抗體的產(chǎn)生。
由于SLE、RA和SS等是同時涉及B、T淋巴細(xì)胞過度活化的自身免疫性疾病，而BLyS又同時參與了B、T淋巴細(xì)胞的過度激活，因而設(shè)法阻斷BLyS的生物學(xué)活性，則可使兩種淋巴細(xì)胞的活化受抑，從而有可能為上述多種自身免疫性疾病的治療和復(fù)發(fā)預(yù)防提供新的(乃至特效的)方法和藥物。
如前所述，經(jīng)體外或動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類策略是行之有效的。目前阻斷BLyS生物學(xué)作用的制劑主要有兩類，即BLyS的可溶性受體(通常與抗體的Fc段融合)和抗-BLyS抗體。另外，只能結(jié)合BLyS受體而不能活化淋巴細(xì)胞的BLyS突變體也有可能被用作BLyS的競爭抑制劑(只是目前尚缺乏有力實(shí)驗(yàn)證據(jù))。在人類，抗-BLyS抗體已于2001年進(jìn)入臨床前試驗(yàn)，用以治療BLyS功能亢進(jìn)相關(guān)的自身免疫性疾病，目前已進(jìn)入二期臨床。然而以上這三類可能的BLyS抑制分子較大，制備和純化相對不便，甚至在應(yīng)用時有可能出現(xiàn)副作用，如與抗體Fc段融合的可溶性受體，由于Fc段的存在，有可能引起不必要的生物學(xué)效應(yīng)，從而使制劑的作用效率降低。對于抗-BLyS抗體，在用于人體時，需使用人源化抗體，否則將會導(dǎo)致人抗異源性抗體反應(yīng)，甚至過敏反應(yīng)。然而，相應(yīng)人源化抗體的制備費(fèi)用高、難度大。因此，如果能將BLyS抑制劑的分子小型化，同時使其制備和純化更加方便，則將使相應(yīng)制劑在醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐中的實(shí)用性大大提高。
噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)于1985年首先由Smith發(fā)明，在1988年由Parmley和Smith提出構(gòu)建噬菌體隨機(jī)肽庫的設(shè)想，而在1990年則由三個研究小組構(gòu)建并成功篩選了噬菌體肽庫，從而標(biāo)志著噬菌體肽庫技術(shù)的誕生。噬菌體肽庫的基本原理是將隨機(jī)肽段的DNA序列插人到噬菌體衣殼蛋白的基因組，插入的DNA經(jīng)噬菌體表達(dá)以后，以線性肽展示在噬菌體衣殼蛋白上，肽段與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白而呈現(xiàn)于噬菌體表面，并利用噬菌體能大量復(fù)制的特點(diǎn)，得到不同重組噬菌體的多個拷貝，而不影響噬菌體的侵染與擴(kuò)增能力。這一技術(shù)使基因型與表型得以巧妙地結(jié)合，從而為不同的研究提供了有利工具。
生物大分子之間的相互作用，實(shí)質(zhì)上是功能位點(diǎn)間的相互作用，并不需要整個分子的完全接觸，BLyS與其受體間的相互作用以及BLyS與抗-BLyS抗體間的相互作用也都不例外。因此，只要能找到受體分子或封閉性抗體分子上與BLyS結(jié)合的肽序列(或模擬肽序列，即功能相同或相似，但氨基酸組成不同的肽序列)，就可利用相應(yīng)肽(或模擬肽)來競爭性或封閉性抑制BLyS與淋巴細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，進(jìn)而達(dá)到抑制BLyS活化B、T淋巴細(xì)胞的目的。
在噬菌體隨機(jī)肽庫中恰恰包含了極大量的、在氨基酸組成或序列上相互有差異的小肽，這些小肽呈現(xiàn)于噬菌體表面，它們可以在序列上充當(dāng)或模擬生物大分子間相互作用的功能位點(diǎn)。噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)的優(yōu)勢在于其篩選通量大，操作簡便，從庫中既可篩選到代表蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)的真實(shí)肽序列或模擬肽序列，也可篩選到模擬非蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)的肽序列。
目前已經(jīng)商品化的噬菌體隨機(jī)肽庫最常用的是由美國New England Biolabs公司(簡稱NEB)在M13噬菌體基礎(chǔ)上開發(fā)的噬菌體文庫，M13噬菌體是一種溶源性噬菌體，它只感染而不裂解宿主菌，最終以分泌蛋白的形式排出，宿主菌保持其原有的活性，并不斷分泌擴(kuò)增的噬菌體。M13噬菌體電鏡下呈長絲狀結(jié)構(gòu)，長約1μm，直徑600-700nm，其基因組為一單鏈環(huán)狀DNA，由6407個核苷酸組成，共編碼10種蛋白，其中5種為病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白。NEB公司通過分子生物學(xué)的手段在M13噬菌體的次要衣殼蛋白p3的基因中插入外源片段以表達(dá)外源蛋白，插入的外源基因表達(dá)后呈現(xiàn)于噬菌體P3蛋白的N端。NEB公司的產(chǎn)品包括7肽庫，12肽庫，環(huán)7肽庫三種文庫，其中前面兩種屬于非構(gòu)象型肽庫，第三種是一個構(gòu)象型肽庫。兩類肽庫的區(qū)別主要在于構(gòu)象型肽庫是將兩個半胱氨酸的核苷酸序列加于隨機(jī)肽DNA序列的兩端，二硫鍵能夠相結(jié)合成環(huán)從而使呈現(xiàn)的肽段形成具有功能活性的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而模擬天然分子的相互作用；而非構(gòu)象約束型肽庫所呈現(xiàn)的肽段則為線形，則不使所呈現(xiàn)的隨機(jī)肽形成二硫鍵。基于肽庫篩選的基本原則，我們的研究選用構(gòu)象型肽庫，這將更加有利于篩選出與靶分子具有高親和力的小肽。
研究顯示，噬菌體呈現(xiàn)型小肽作用的發(fā)揮，有時涉及到了目的序列臨近的噬菌體衣殼蛋白中的氨基酸殘基。因此，噬菌體呈現(xiàn)型小肽與人工合成的相應(yīng)游離小肽有時在功能上并不能完全吻合，所以必須對人工合成的游離小肽再次進(jìn)行功能鑒定。另外，噬菌體呈現(xiàn)型小肽因有噬菌體成分的存在，不能用于在體研究，也就是說，只有對所篩選到的噬菌體呈現(xiàn)型小肽進(jìn)行人工合成后才具有真正的開發(fā)和應(yīng)用價值。
基于以上現(xiàn)有情況，為了克服目前BLyS的抑制劑的不足之處，如果能借助噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)、人工合成肽技術(shù)以及免疫學(xué)功能試驗(yàn)以BLyS來篩選構(gòu)象型肽庫，篩選、鑒定并合成前述具有抑制人BLyS功能的小肽，將為進(jìn)一步研發(fā)針對BLyS的新型抑制劑奠定基礎(chǔ)，從而對B淋巴細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病的治療有相當(dāng)?shù)膸椭?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有以下氨基酸序列的小肽分子P-M-K-M-R-T-M，脯氨酸-甲硫氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甲硫氨酸；或Y-E-P-K-I-R-G，酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-精氨酸-甘氨酸。
本發(fā)明所提供的一種小肽分子與BlyS的結(jié)合具有高親和力，能夠與BLyS特異結(jié)合并抑制其活性，同時也能夠拮抗重組BLyS肽段刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種本發(fā)明的小肽分子的制備方法，采用Fmoc固相合成法合成本發(fā)明所述的小肽分子。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，提供一種本發(fā)明小肽分子的制備方法，包括以下步驟①用Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團(tuán)對氨基酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，通過一個支臂將其連結(jié)到一個不溶性高分子樹脂支持物載體上，隨后用哌啶堿基將α-氨基脫保護(hù)，去除Fmoc的保護(hù)性，洗滌氨基酸—支臂—樹脂；②將預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的氨基酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接到氨基酸—支臂—樹脂，然后重復(fù)進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌、耦聯(lián)，直到得到目的肽；③最后將肽—支臂—樹脂裂解，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化。
本發(fā)明具P-M-K-M-R-T-M序列的小肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①用9-芴甲氧羰基基團(tuán)對脯氨酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，通過一個支臂將其連結(jié)到一個不溶性高分子樹脂支持物載體上，隨后用哌啶堿基將α-氨基脫保護(hù)，去除Fmoc的保護(hù)性，用二氯甲烷溶液洗滌氨基酸—支臂—樹脂；②將預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的甲硫氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接到氨基酸—支臂—樹脂，然后進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌；③重復(fù)②，對預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的賴氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、蘇氨酸、和甲硫氨酸依次進(jìn)行耦聯(lián)，直到得到具P-M-K-M-R-T-M序列的小肽；最后將肽—支臂—樹脂裂解，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化。本發(fā)明的小肽也可以用其他的合成方法制備得到。
本發(fā)明具Y-E-P-K-I-R-G序列的小肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①用9-芴甲氧羰基基團(tuán)對酪氨酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，通過一個支臂將其連結(jié)到一個不溶性高分子樹脂支持物載體上，隨后用哌啶堿基將α-氨基脫保護(hù)，去除Fmoc的保護(hù)性，用二氯甲烷溶液洗滌氨基酸—支臂—樹脂；②將預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的谷氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接到氨基酸—支臂—樹脂，然后進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌；③重復(fù)②，對預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的脯氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、精氨酸、和甘氨酸依次進(jìn)行耦聯(lián)，直到得到具Y-E-P-K-I-R-G序列的小肽；最后將肽—支臂—樹脂裂解，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化。
人工合成本發(fā)明所述的小肽后對其進(jìn)行抑制淋巴細(xì)胞增殖的檢測顯示，它們與BlyS的結(jié)合具有高親和力，并且能夠拮抗重組BLyS肽段(rhBLyS112-285)刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。
本發(fā)明同時提供一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，包括以下步驟①將B淋巴細(xì)胞刺激因子，即BLyS，與噬菌體肽庫孵育，然后洗脫特異結(jié)合噬菌體并擴(kuò)增；②重復(fù)上述操作進(jìn)行2-5次親和篩選，得到與BLyS親和力較高的一個噬菌體集合；③確定特異結(jié)合噬菌體的DNA序列即得該抑制肽。
優(yōu)選的，用重組的人可溶性BLyS胞外區(qū)112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，篩選人噬菌體構(gòu)象型7肽庫。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法包括以下步驟①將重組的人可溶性BLyS胞外區(qū)112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，加到培養(yǎng)皿或其他容器中培養(yǎng)，經(jīng)洗滌后加入人噬菌體構(gòu)象型7肽庫孵育；②經(jīng)TBS/Tween20洗滌、HCl-Gly和牛血清白蛋白緩沖液解離洗脫和Tris-HCl中和緩沖液中和后，從培養(yǎng)皿或其他容器中收集特異結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選，用同樣方法共進(jìn)行2-5輪親和篩選；③對篩選得到的單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，通過DNA測序結(jié)果推導(dǎo)出BLyS的結(jié)合肽序列，并對其抑制淋巴細(xì)胞增殖的情況進(jìn)行檢測后，即可確定該抑制肽。
其中，在洗滌時，用1-5mL/L的TBS/Tween20洗滌6-10次，在第二輪及其后的篩選中Tween20的濃度為5mL/L。
其中，洗脫時用pH值為2.2的0.2mol/L的HCl-Gly洗脫緩沖液在室溫下解離5-10min；用140-160μL pH值為8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液進(jìn)行中和。
更優(yōu)選的，本發(fā)明的制備方法包括以下步驟①將100-200mg/L的rhBLyS112-285加到培養(yǎng)皿或其他容器中培養(yǎng)，經(jīng)1-5mL/L的TBS/Tween20洗滌7-8次后，加入8-12μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫，于室溫輕搖吸附30-60min；
②洗脫特異結(jié)合噬菌體，經(jīng)1-5mL/L的TBS/Tween20洗滌6-10次后，加入1mL pH值為2.2的0.2mol/L HCl-Gly洗脫緩沖液和1g/L的牛血清白蛋白，室溫解離5-10min，再加入140-160μL pH值為8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集，重復(fù)進(jìn)行3輪親和篩選；③對篩選得到的單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，通過DNA測序結(jié)果推導(dǎo)出BLyS的結(jié)合肽序列，并對其抑制淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測后，即可確定該抑制肽。
最優(yōu)選的，本發(fā)明的制備方法包括以下步驟①將1.5ml 100-200mg/L的rhBLyS112-285加到全塑培養(yǎng)皿或其他聚苯乙烯容器中，4℃過夜，棄蛋白液，加入5g/L牛血清白蛋白室溫封閉1-2h。
經(jīng)1-5mL/L的TBS/Tween20洗滌6-10次后，加入8-12μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫，其中含2×1011噬菌體病毒顆粒，于室溫輕搖吸附30-60min。
②洗脫特異結(jié)合噬菌體，經(jīng)1-5mL/L的TBS/Tween20洗滌6-10次后，加入1mL pH值為2.2的0.2mol/L HCl-Gly洗脫緩沖液和1g/L的BSA，室溫解離5-10min，再加入140-160μL pH值為8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集，重復(fù)進(jìn)行3輪親和篩選。
③從所得到的噬菌體集合中分離出單個的噬菌體單克隆，并對其與BlyS的結(jié)合活性進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)、競爭抑制實(shí)驗(yàn)鑒定，觀察陽性噬菌體克隆抑制BLyS與淋巴細(xì)胞結(jié)合的情況，對能夠抑制BlyS促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖活性的陽性噬菌體進(jìn)行DNA測序，并分析對比序列。
本發(fā)明的小肽在聯(lián)合作用時的抑制效應(yīng)強(qiáng)于各自單獨(dú)作用，這可能是由于BLyS結(jié)合和活化B、T細(xì)胞涉及其多個功能位點(diǎn)，聯(lián)合應(yīng)用多個不同的功能位點(diǎn)結(jié)合小肽或功能位點(diǎn)封閉小肽，能夠增強(qiáng)小肽抑制BLyS的功能。
這種拮抗肽的獲得為小肽型BLyS抑制劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，通過動物實(shí)驗(yàn)、體外活性試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明，該小肽可作為BLyS的抑制肽用于制備治療BLyS相關(guān)疾病的藥物，從而可以用來治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)及干燥綜合征(Sjgren′s syndrom，SS)等BLyS相關(guān)的疾病，可以作為防治BlyS相關(guān)疾病的新型候選分子。
本發(fā)明所述的BLyS抑制性小肽具備以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的小肽能夠阻斷BLyS的生物學(xué)活性，因而可使兩種淋巴細(xì)胞的活化受抑，應(yīng)用于臨床將能夠競爭性(或封閉性)地抑制BLyS與淋巴細(xì)胞上受體的結(jié)合，達(dá)到抑制BLyS活化B、T淋巴細(xì)胞的目的，從而為進(jìn)一步研發(fā)針對BLyS的小肽型抑制劑創(chuàng)造了條件。
由于SLE、RA和SS等是同時涉及B、T淋巴細(xì)胞過度活化的自身免疫性疾病，而BLyS又同時參與了B、T淋巴細(xì)胞的過度激活，從而本發(fā)明的小肽為發(fā)展防治BLyS功能亢進(jìn)相關(guān)的SLE、RA和SS等多種自身免疫性疾病的新型制劑提供候選對象，可為上述多種自身免疫性疾病的治療和復(fù)發(fā)預(yù)防提供新的(乃至特效的)方法和藥物。
2.本發(fā)明的小肽與現(xiàn)有的阻斷BLyS生物學(xué)作用的三類可能制劑(BLyS的可溶性受體、抗-BLyS抗體以及只結(jié)合BLyS受體而不活化淋巴細(xì)胞的BLyS突變體)相比通過篩選噬菌體構(gòu)象型肽庫獲得的BLyS結(jié)合小肽的人工合成和純化簡便，容易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，同時在合成時可加入非天然氨基酸改進(jìn)和提高小肽的某些特性。因?yàn)橛糜诋a(chǎn)生前三類制劑的原核與真核細(xì)胞都只能使用20種天然氨基酸，所以這是前三類制劑無法做到的。
3.本發(fā)明的小肽分子小，滲透能力強(qiáng)，容易到達(dá)全身各組織和器官；同時小肽在腎臟的蓄積少，不易引起毒副作用，使用相對較為安全。所得到的游離小肽的免疫原性極低，一般不會引起抗小肽的免疫應(yīng)答。
圖1為YG-克隆60-DNA測序2為PM-克隆67-DNA測序3為陽性噬菌體克隆與BLyS結(jié)合活性的ELISA鑒定圖4為陽性噬菌體克隆的競爭抑制ELISA鑒定圖5為陽性噬菌體對BLyS增殖淋巴細(xì)胞功能的抑制作用圖6為合成的小肽對BLyS增殖淋巴細(xì)胞功能的抑制作用具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一.以BLyS為靶分子篩選噬菌體構(gòu)象型肽庫1、噬菌體肽庫的親和篩選
①將1.5ml 100mg/L的rhBLyS112-285加到全塑培養(yǎng)皿中，4℃過夜。棄蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室溫封閉1h。
②經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌8次后，加入10μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫(含2×1011病毒顆粒)，人噬菌體構(gòu)象型7肽庫包括宿主菌ER2738，購自NewEngland Biolabs公司，于室溫輕搖吸附55min。
其中TBS緩沖液的配方為Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌7次后，加入1mLpH值為2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脫緩沖液和1g/L的BSA，室溫解離7min，再加入150μLpH值為9.1的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集。
其中的Tris為tris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷。
④收集噬菌體測定滴度，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。
2、單克隆噬菌體的擴(kuò)增①以第3輪篩選所獲噬菌體按不同稀釋度鋪板(LB/IPTG/X-Gal瓊脂平板)，從克隆數(shù)小于100的平板上挑取藍(lán)斑加入到對數(shù)期的ER2738細(xì)菌(本次篩選所選用的噬菌體文庫的特異宿主菌)中，以200-300r/min振搖培養(yǎng)4-5h。
②離心取上清，加入PEG8000/NaCl沉淀過夜，離心棄上清再沉淀，溶于PBS(Phosphate-buffered saline，一種磷酸鹽緩沖液，每1000ml PBS中含有NaCl 8g，KCl0.2g，Na2HPO4·7H2O0.5g，KH2PO40.2g，pH7.4)中，測定各單克隆噬菌體的滴度。
③為了得到與rhBLyS112-285具有高親和力結(jié)合的噬菌體，以rhBLyS112-285為目標(biāo)分子，在噬菌體環(huán)7肽庫中進(jìn)行親和篩選，共進(jìn)行3輪親和篩選。在第二輪篩選中將Tween20的濃度由1mL/L加大為3mL/L，洗滌次數(shù)增加至10次。經(jīng)篩選后，回收率(指在每一輪親和篩選中，洗脫下來的噬菌體克隆與投入篩選的噬菌體克隆數(shù)之比)從8.5×10-4增加到2.1×10-2，說明噬菌體得到有效的富集(表1)。
表1BLyS高親和力結(jié)合噬菌體的富集
二.鑒定BLyS的結(jié)合肽親和篩選中回收的噬菌體均是與篩選配基牢固結(jié)合且能耐受漂洗過程的克隆。因此具有一定的特異性和親和力。親和篩選中，即使經(jīng)過多輪篩選，也不能排除非特異性結(jié)合噬菌體克隆的存在，因而進(jìn)一步挑取單個克隆，確定它與篩選靶分子的特異性吸附是實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟。ELISA(enzyme linked immunosorbent assay酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))能夠半定量測定篩選靶分子與噬菌體克隆間的結(jié)合常數(shù)，是較為常用的方法。采用牛血清白蛋白作為對照，避免了由于噬菌體用量過大和洗滌強(qiáng)度不夠所可能造成的假陽性。
1.陽性克隆的ELISA鑒定將rhBLyS112-285(20mg/L)加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔200μL，在濕盒中于4℃過夜。次日棄蛋白液，每孔加入200μL20g/L脫脂奶粉室溫封閉1h。
將擴(kuò)增的單克隆噬菌體上清(約含1×1012病毒顆粒)分別與等體積的20g/L脫脂奶粉混勻，室溫孵育30min后，加至酶標(biāo)板的各孔中(每孔100μL)，于室溫輕搖吸附1h。
經(jīng)PBST洗5次后，加HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的抗M13抗體(抗M13噬菌體的抗體，HRP酶標(biāo)小鼠抗M13單抗，購自Pharmacia公司)(100μL/孔)室溫孵育1h，用PBST洗6次后，加鄰苯二胺(OPD)(100μL/孔)顯色，以酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司Sunrise酶標(biāo)儀)讀取A492nm值(吸光度為492nm時的數(shù)值)。每個單克隆噬菌體均以PBS包被對照孔，同時設(shè)第一次親和篩選未與rhBLyS112-285結(jié)合的噬菌體作為陰性噬菌體對照，其余操作相同。
從第3輪篩選噬菌體的平板中，挑取80個噬菌體克隆，擴(kuò)增后鋪板測定其滴度。用ELISA鑒定各噬菌體單克隆與rhBLyS112-285的結(jié)合活性，每個單克隆噬菌體以不含蛋白的包被液包被對照孔，陰性對照噬菌體(negative control phage，NP)為第一次篩選的未結(jié)合的陰性噬菌體。結(jié)果表明，15個克隆可與rhBLyS112-285產(chǎn)生高親和力結(jié)合，而與不含蛋白的包被液無結(jié)合反應(yīng)(A492nm值P/N≥2，見圖3)。
2.噬菌體克隆的競爭ELISA鑒定包被rhBLyS112-285并封閉(方法同上)。
將rhBLyS112-28550mg/L與已鑒定的各陽性噬菌體(約含1×1012病毒顆粒)等體積混合，37℃孵育1h，加入96孔酶標(biāo)板各孔中(每孔100μL)，于室溫輕搖吸附1h。
經(jīng)PBST洗5次后，加HRP標(biāo)記的抗M13抗體(100μL/孔)，室溫孵育1-2h。
加OPD(100μL/孔)顯色，以酶標(biāo)儀讀取A492nm值。對照孔加入未與rhBLyS112-285孵育的相同數(shù)量的噬菌體顆粒，其余操作均相同。
以rhBLyS112-285競爭抑制噬菌體與包被rhBLyS112-285的結(jié)合，來判斷噬菌體與rhBLyS112-285結(jié)合的特異性，對照孔加入未與rhBLyS112-285預(yù)先結(jié)合的噬菌體。結(jié)果表明，15個ELISA鑒定陽性的克隆中，與rhBLyS112-285的預(yù)先結(jié)合能夠阻斷12個克隆與包被rhBLyS112-285的結(jié)合(以A492nm值P/N≥2為陽性噬菌體，見圖4)。
3.陽性噬菌體的測序?qū)U(kuò)增篩選所得陽性噬菌體克隆用PEG8000/NaCl沉淀，提取噬菌體單鏈DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送交上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。對篩選得到的12個陽性噬菌體克隆進(jìn)行序列分析后，發(fā)現(xiàn)3組序列，其中一組有7個相同的克隆，另一組有3個相同的克隆，最后一組有2個相同的克隆。在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索BLyS的3個受體均未發(fā)現(xiàn)與上述3組同源的序列。
對篩選得到的噬菌體克隆提取單鏈DNA，M13噬菌體單鏈DNA抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。進(jìn)行DNA測序使用的是雙脫氧測序法，是由上海生物工程公司所完成。
三.噬菌體克隆抑制淋巴細(xì)胞增殖的檢測用淋巴細(xì)胞分離液分離正常人外周血淋巴細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液(用于體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的一種液體，購于GIBCO公司)將淋巴細(xì)胞配成105/L的懸液，按每孔200μL細(xì)胞懸液加入96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、50mL/L CO2條件下培養(yǎng)。
將5μg/μL rhBLyS112-285與三個噬菌體克隆不同數(shù)目(分別為0、1010、1011、1012及1013個病毒顆粒)的噬菌體混合后，37℃孵育1-2h，加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)兩個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)14h。
然后按20μL/孔加入MTT(噻唑藍(lán)，MTT可作用于活細(xì)胞，生成的黑藍(lán)色產(chǎn)物與細(xì)胞的代謝程度成正比，用于分析細(xì)胞增生水平)溶液(5g/L)，8h后離心棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO(二甲基亞楓)振蕩15-20min，用酶標(biāo)儀于波長570nm測定光吸收(A)值。對照組為經(jīng)ELISA檢測證實(shí)不與rhBLyS112-285結(jié)合的陰性噬菌體，同時設(shè)單加噬菌體或細(xì)胞組，以RP MI1640培養(yǎng)液作為空白對照。
加入的rhBLyS112-285在未與噬菌體克隆預(yù)先結(jié)合時，均有刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果表明，對照的無關(guān)噬菌體對rhBLyS112-285刺激細(xì)胞增殖的活性無明顯影響。在3個克隆中，克隆1對rhBLyS112-285刺激細(xì)胞增殖的活性無明顯影響；克隆2、克隆3隨著加入噬菌體顆粒數(shù)目的增多，對rhBLyS112-285刺激細(xì)胞增殖的活性的抑制作用增強(qiáng)(見圖5)。單獨(dú)加入噬菌體顆粒組則與細(xì)胞獨(dú)立生長組無明顯差異(結(jié)果略)，說明噬菌體顆粒能夠抑制rhBLyS112-285刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。
其中能夠抑制BlyS促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的克隆2序列為P-M-K-M-R-T-M，克隆3序列為Y-E-P-K-I-R-G，參考圖1.YG-克隆60-DNA測序圖和圖2.PM-克隆67-DNA測序圖。
四.人工合成小肽及對其抑制淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測1、人工合成小肽將具有抑制作用的兩條噬菌體呈現(xiàn)型小肽的氨基酸序列交由上海博亞生物技術(shù)公司，采用Fmoc固相合成法，在肽合成儀上合成相應(yīng)游離小肽，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化，然后測定其濃度。
2、人工合成小肽對抑制淋巴細(xì)胞增殖的檢測用淋巴細(xì)胞分離液分離正常人外周血淋巴細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞配成105/L的懸液，按每孔200μL細(xì)胞懸液加入96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、50mL/L CO2條件下培養(yǎng)。
將5μg/μL rhBLyS112-285與小肽不同濃度混合后，37℃孵育1h，加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)三個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)14h。
然后按20μL/孔加入MTT溶液(5g/L)，8h后離心棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO振蕩15min，用酶標(biāo)儀于波長570nm測定光吸收(A)值。以未溶解小肽的溶液為對照，同時設(shè)單加小肽細(xì)胞組，以RPMI1640培養(yǎng)液作為空白對照。
合成的兩個小肽均為HPLC95％以上純度，命名為P-A和P-B。加入的rhBLyS112-285在未與小肽預(yù)先結(jié)合時，均有刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果表明，P-A隨著加入濃度的增高，對rhBLyS112-285刺激細(xì)胞增殖的活性的抑制作用增強(qiáng)；P-B對rhBLyS112-285刺激細(xì)胞增殖的活性抑制作用相對較弱；當(dāng)P-A和P-B同時加入時對rhBLyS112-285刺激細(xì)胞增殖的活性抑制作用高于P-A和P-B單獨(dú)加入(見圖6)。單獨(dú)加小肽組則與細(xì)胞獨(dú)立生長組無明顯差異，說明小肽是在與BlyS片段先相互作用的前提下發(fā)揮作用的，如果不與BlyS預(yù)先作用對淋巴細(xì)胞未見明顯影響(結(jié)果略)，說明小肽與rhBLyS112-285的預(yù)先結(jié)合抑制了rhBLyS112-285刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。
實(shí)施例2一.以BLyS為靶分子篩選噬菌體構(gòu)象型肽庫1、噬菌體肽庫的親和篩選①將120mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃過夜。棄蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室溫封閉1h。
②經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌9次后，加入10μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫(含2×1011病毒顆粒)，人噬菌體構(gòu)象型7肽庫包括宿主菌ER2738，購自NewEngland Biolabs公司，于室溫輕搖吸附60min。
其中TBS緩沖液的配方為Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌6次后，加入1mLpH值為2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脫緩沖液和1g/L的BSA，室溫解離8min，再加入150μLpH值為9.1的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集。
其中的Tris為tris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷。
④收集噬菌體測定滴度，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。
重復(fù)以上步驟共進(jìn)行5輪親和篩選，在后4輪篩選中將Tween20的濃度由1mL/L加大為3mL/L。洗滌次數(shù)增加至10次。
其余的操作同實(shí)施例1。
實(shí)施例3一.以BLyS為靶分子篩選噬菌體構(gòu)象型肽庫1、噬菌體肽庫的親和篩選①將150mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃過夜。棄蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室溫封閉1h。
②經(jīng)1mL/L的TBS/Tween 20洗滌10次后，加入10μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫(含2×1011病毒顆粒)，人噬菌體構(gòu)象型7肽庫包括宿主菌ER2738，購自NewEngland Biolabs公司，于室溫輕搖吸附50min。
其中TBS緩沖液的配方為Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③經(jīng)1mL/L的TBS/Tween 20洗滌9次后，加入1mLpH值為2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脫緩沖液和1g/L的BSA，室溫解離6min，再加入150μLpH值為9.1的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集。
其中的Tris為tris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷。
④收集噬菌體測定滴度，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。
重復(fù)以上步驟共進(jìn)行3輪親和篩選，在后兩輪篩選中將Tween20的濃度由1mL/L加大為4mL/L。洗滌次數(shù)增加至10次。
其余的操作同實(shí)施例1。
實(shí)施例4一.以BLyS為靶分子篩選噬菌體構(gòu)象型肽庫1、噬菌體肽庫的親和篩選①將200mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃過夜。棄蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室溫封閉2h。
②經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌7次后，加入10μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫(含2×1011病毒顆粒)，人噬菌體構(gòu)象型7肽庫包括宿主菌ER2738，購自NewEngland Biolabs公司，于室溫輕搖吸附30min。
其中TBS緩沖液的配方為Tris-HCl 50mmol/L，NaCl150mM/L。
③經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌10次后，加入1mL pH值為2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脫緩沖液和1g/L的BSA，室溫解離5min，再加入150μL pH值為9.1的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集。
其中的Tris為tris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷。
④收集噬菌體測定滴度，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。
重復(fù)以上步驟共進(jìn)行4輪親和篩選，在后3輪篩選中將Tween20的濃度由1mL/L加大為5mL/L。洗滌次數(shù)增加至10次。
其余的操作同實(shí)施例1。
實(shí)施例5一.以BLyS為靶分子篩選噬菌體構(gòu)象型肽庫l、噬菌體肽庫的親和篩選①將180mg/L的rhBLyS112-285加到聚苯乙烯容器中，4℃過夜。棄蛋白液，加入5g/LBSA(牛血清白蛋白)室溫封閉2h。
②經(jīng)1mL/L的TBS/Tween 20洗滌6次后，加入10μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫(含2×1011病毒顆粒)，人噬菌體構(gòu)象型7肽庫包括宿主菌ER2738，購自NewEngland Biolabs公司，于室溫輕搖吸附40min。
其中TBS緩沖液的配方為Tris-HCl 50mmol/L，NaCl 150mM/L。
③經(jīng)1mL/L的TBS/Tween20洗滌8次后，加入1mLpH值為2.2的0.2mol/LHCl-Gly(甘氨酸)洗脫緩沖液和1g/L的BSA，室溫解離10min，再加入150μLpH值為9.1的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集。
其中的Tris為tris(hydroxymethyl)aminomethane三羥甲基氨基甲烷。
④收集噬菌體測定滴度，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。
重復(fù)以上步驟共進(jìn)行5輪親和篩選，在后4輪篩選中將Tween 20的濃度由1mL/L加大為5mL/L。洗滌次數(shù)增加至10次。
其余的操作同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種小肽分子，其特征在于，具有如下氨基酸序列P-M-K-M-R-T-M或Y-E-P-K-I-R-G。
2.權(quán)利要求1所述的一種小肽分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①用9-芴甲氧羰基基團(tuán)對氨基酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，通過一個支臂將其連接到一個不溶性高分子樹脂支持物載體上，隨后用哌啶堿基將α-氨基脫保護(hù)，去除Fmoc的保護(hù)性，洗滌氨基酸—支臂—樹脂；②將預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的氨基酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接到氨基酸—支臂—樹脂，然后重復(fù)進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌、耦聯(lián)，直到得到目的肽；最后將肽—支臂—樹脂裂解，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種小肽分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①用9-芴甲氧羰基基團(tuán)對脯氨酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，通過一個支臂將其連結(jié)到一個不溶性高分子樹脂支持物載體上，隨后用哌啶堿基將α-氨基脫保護(hù)，去除Fmoc的保護(hù)性，用二氯甲烷溶液洗滌氨基酸—支臂—樹脂；②將預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的甲硫氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接到氨基酸—支臂—樹脂，然后進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌；③重復(fù)②，對預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的賴氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、蘇氨酸、和甲硫氨酸依次進(jìn)行耦聯(lián)，直到得到具P-M-K-M-R-T-M序列的小肽；最后將肽—支臂—樹脂裂解，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種小肽分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟①用9-芴甲氧羰基基團(tuán)對酪氨酸的α-氨基進(jìn)行保護(hù)，通過一個支臂將其連結(jié)到一個不溶性高分子樹脂支持物載體上，隨后用哌啶堿基將α-氨基脫保護(hù)，去除Fmoc的保護(hù)性，用二氯甲烷溶液洗滌氨基酸—支臂—樹脂；②將預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的谷氨酸通過耦聯(lián)反應(yīng)連接到氨基酸—支臂—樹脂，然后進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌；③重復(fù)②，對預(yù)先活化的α-氨基保護(hù)的脯氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、精氨酸、和甘氨酸依次進(jìn)行耦聯(lián)，直到得到具Y-E-P-K-I-R-G序列的小肽；最后將肽—支臂—樹脂裂解，經(jīng)樹脂切割和脫保護(hù)后，對合成小肽進(jìn)行純化。
5.一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟①將B淋巴細(xì)胞刺激因子，即BLyS，與噬菌體肽庫孵育，然后洗脫特異結(jié)合噬菌體并擴(kuò)增；②重復(fù)上述操作進(jìn)行2-5次親和篩選，得到與BLyS親和力較高的一個噬菌體集合；③確定特異結(jié)合噬菌體的DNA序列即得該抑制肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，其特征在于，用重組的人可溶性BLyS胞外區(qū)112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，篩選人噬菌體構(gòu)象型7肽庫。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟①將重組的人可溶性BLyS胞外區(qū)112到285氨基酸片段，即rhBLyS112-285，加到培養(yǎng)皿或其他容器中培養(yǎng)，經(jīng)洗滌后加入人噬菌體構(gòu)象型7肽庫孵育；②經(jīng)TBS/Tween 20洗滌、HCl-Gly和牛血清白蛋白緩沖液洗脫解離和Tris-HCl中和緩沖液中和后，從培養(yǎng)皿或其他容器中收集特異結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后用于下一輪的篩選，用同樣方法共進(jìn)行2-5輪親和篩選；③對篩選得到的單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，通過DNA測序結(jié)果推導(dǎo)出BLyS的結(jié)合肽序列，并對其抑制淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測后，即可確定該抑制肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，其特征在于，在洗滌時，用1-5mL/L的TBS/Tween20洗滌6-10次，在第二輪及其后的篩選中Tween 20的濃度為5mL/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，其特征在于，洗脫時用pH值為2.2的0.2mol/L的HCl-Gly洗脫緩沖液在室溫下解離5-10min；用140-160μL pH值為8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液進(jìn)行中和。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9的任意一種所述的一種B淋巴細(xì)胞刺激因子抑制肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟①將100-200mg/L的rhBLyS112-285加到培養(yǎng)皿或其他容器中培養(yǎng)，經(jīng)1-5mL/L的TBS/Tween 20洗滌7-8次后，加入8-12μL人噬菌體構(gòu)象型7肽庫，于室溫輕搖吸附30-60min；②洗脫特異結(jié)合噬菌體，經(jīng)1-5mL/L的TBS/Tween 20洗滌6-10次后，加入1mL pH值為2.2的0.2mol/L HCl-Gly洗脫緩沖液和1g/L的牛血清白蛋白，室溫解離5-10min，再加入140-160μL pH值為8.9-9.3的1mol/L Tris-HCl中和緩沖液，中和并收集，重復(fù)進(jìn)行3輪親和篩選；③對篩選得到的單克隆噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，通過DNA測序結(jié)果推導(dǎo)出BLyS的結(jié)合肽序列，并對其抑制淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測后，即可確定該抑制肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小肽分子，具有如下氨基酸序列P－M－K－M－R－T－M或Y－E－P－K－I－R－G。同時還公開了其制備方法，該方法以B淋巴細(xì)胞刺激因子為靶分子篩選噬菌體肽庫，得到與B淋巴細(xì)胞刺激因子特異結(jié)合小肽并確定其序列，然后人工合成相應(yīng)小肽。該小肽可用于制備治療B淋巴細(xì)胞刺激因子相關(guān)疾病的藥物。
文檔編號C12Q1/68GK1781936SQ20041009663
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日
發(fā)明者何鳳田, 吉清, 鄭英如 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)