專利名稱：?jiǎn)?dòng)子與其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是有關(guān)于啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在亞洲國(guó)家，紅曲霉(Monascus)長(zhǎng)期被用作為食品添加物。經(jīng)紅曲霉發(fā)酵的谷物呈現(xiàn)鮮紅至紫色，且保有稻米原來(lái)形狀。此外，紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物也被認(rèn)為具有促進(jìn)健康的功效。將紅曲霉應(yīng)用于米酒制造是由于其具有高量的α-淀粉酶，可促使淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖。目前研究已確認(rèn)紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物如Monacolin K等的醫(yī)療效果。且紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物所具有的保存效果也經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明。
本領(lǐng)域的主要研究焦點(diǎn)為紅曲霉的基因產(chǎn)物或培養(yǎng)、生產(chǎn)的方法，然而，對(duì)于紅曲霉序列標(biāo)簽(EST)基因庫(kù)的研究正方興未艾，紅曲霉的序列標(biāo)簽可能提供重組DNA技術(shù)更多的信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等對(duì)于由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的紅曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因庫(kù)進(jìn)行搜尋研究，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)高表達(dá)量的基因，經(jīng)比對(duì)為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF基因)以及熱休克蛋白基因(heat shock protein gene，簡(jiǎn)稱Hsp基因)，并檢測(cè)與確認(rèn)此二基因上游區(qū)域的啟動(dòng)子區(qū)域。由此而完成本發(fā)明。
(I)acuF啟動(dòng)子因此，本發(fā)明的一型態(tài)為一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動(dòng)子活性。上述具有啟動(dòng)子活性的DNA分子亦可包括序列識(shí)別號(hào)1中第117至1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)1中約第117至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，較佳地為序列識(shí)別號(hào)1中第367至1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)1中約第367至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，更佳地為序列識(shí)別號(hào)1中第517至1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)1中約第517至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列；或于嚴(yán)苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。此外，上述DNA分子可由細(xì)菌或真菌取得，特別是由紅曲霉屬(Monascus sp.)，更特別是由紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可經(jīng)基因工程方式， 由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF)的起始子上游序列克隆而得。上述基因工程包含基因庫(kù)建構(gòu)、菌落雜交(colony hybridization)、引物步行(primer walking)、或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。此外，熟悉此技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA序列，經(jīng)由已知的PCR、雜交反應(yīng)、或人工合成等獲得本發(fā)明所述序列。上述嚴(yán)苛雜交條件可參考?xì)W洲專利EP 1325959 A1 P7 節(jié)。
本發(fā)明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動(dòng)子區(qū)域與一編碼區(qū)域。上述啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列雜交的序列。特別是，上述啟動(dòng)子區(qū)域可包括序列識(shí)別號(hào)1中第117至1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)1中約第117至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，較佳地為序列識(shí)別號(hào)1中第367至1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)1中約第367至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，更佳地為序列識(shí)別號(hào)1中第517至1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，序列識(shí)別號(hào)1中約第517至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列；或于嚴(yán)苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。且上述啟動(dòng)子區(qū)域可由紅曲霉屬(Monascus sp.)取得，特別是由紅曲霉屬M(fèi)onascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可經(jīng)基因工程方式，由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的BCRC38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF)的起始子上游序列克隆而得。而上述編碼區(qū)域包括編碼一所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。所需蛋白質(zhì)包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉(zhuǎn)錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的另一型態(tài)是提供一種表達(dá)載體，其包括一啟動(dòng)子，上述啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列雜交的序列。上述啟動(dòng)子是如以上重組DNA的啟動(dòng)子區(qū)域所定義。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，例如質(zhì)粒，噬菌體，或病毒。上述表達(dá)載體可任擇地包括編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。上述所需蛋白質(zhì)包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉(zhuǎn)錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的另一型態(tài)是有關(guān)于一種表達(dá)系統(tǒng)，包括上述定義的表達(dá)載體，以及一適于表達(dá)所需蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。上述載體是經(jīng)由一轉(zhuǎn)化方法被轉(zhuǎn)化入上述宿主細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞意指任何可用于表達(dá)所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、或絲狀真菌。上述絲狀真菌可為紅曲霉屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉屬M(fèi)onascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC38072。轉(zhuǎn)化方法可采用目前已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)于屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌施予一轉(zhuǎn)化步驟?？蓞⒖?xì)W洲專利EP 1325959 A1 P5 節(jié)所述的方法。
本發(fā)明亦有關(guān)于一種轉(zhuǎn)化株，包括a)序列識(shí)別號(hào)1，或b)序列識(shí)別號(hào)1的第117至第1116個(gè)連續(xù)核苷酸，或序列識(shí)別號(hào)1的約第117至約第1116個(gè)連續(xù)核苷酸，或c)序列識(shí)別號(hào)1的第367至第1116個(gè)連續(xù)核苷酸，或序列識(shí)別號(hào)1的約第367至約第1116個(gè)連續(xù)核苷酸，或d)序列識(shí)別號(hào)1的第517至第1116個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)1的約第517至約第1116個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或在嚴(yán)苛條件下可與上述任一序列雜交的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化株更包括一編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
本發(fā)明亦有關(guān)于一種表達(dá)一蛋白質(zhì)的方法。上述方法包括于一培養(yǎng)基培養(yǎng)上述含有編碼所欲蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化株，由轉(zhuǎn)化株所在的培養(yǎng)基生產(chǎn)與累積所需蛋白質(zhì)，以及由培養(yǎng)基收集所需蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的一型態(tài)是提供一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)18的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)18的核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動(dòng)子活性。
本發(fā)明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動(dòng)子區(qū)域與一編碼區(qū)域。上述啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)18的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列，而上述編碼區(qū)域包括編碼一所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一型態(tài)是提供一種表達(dá)載體，其包括一啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)18的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列。
本發(fā)明的又一型態(tài)提供一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)24的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動(dòng)子活性。
(II)Hsp啟動(dòng)子本發(fā)明的一型態(tài)提供一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列雜交的序列。上述DNA分子具有啟動(dòng)子活性。上述具有啟動(dòng)子活性的DNA分子亦可包括序列識(shí)別號(hào)2中第443至1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2中約第443至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，較佳地為序列識(shí)別號(hào)2中第759至1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2中約第759至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，更佳地為序列識(shí)別號(hào)2中第982至1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2中約第982至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列；或于嚴(yán)苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。此外，上述DNA分子可由細(xì)菌或真菌取得，特別是由紅曲霉屬(Monascus sp.)，更特別是由紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可經(jīng)基因工程方式，由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的BCRC 38072中熱休克蛋白(heat shock protein，簡(jiǎn)稱Hsp)的起始子上游序列克隆而得。上述基因工程包含基因庫(kù)建構(gòu)、菌落雜交(colony hybridization)、引物步行(primer walking)、或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。此外，熟悉此技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA序列，經(jīng)由已知的PCR、雜交反應(yīng)、或人工合成等獲得本發(fā)明所請(qǐng)序列。上述嚴(yán)苛雜交條件可參考?xì)W洲專利EP 1325959 A1 P7 節(jié)。
本發(fā)明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動(dòng)子區(qū)域與一編碼區(qū)域。上述啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列雜交的序列。特別是，上述啟動(dòng)子區(qū)域可包括序列識(shí)別號(hào)2中第443至1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2中約第443至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，較佳地為序列識(shí)別號(hào)2中第759至1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2中約第759至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，更佳地為序列識(shí)別號(hào)2中第982至1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2中約第982至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列；或于嚴(yán)苛條件下可與上述序列雜交的核苷酸序列。且上述啟動(dòng)子區(qū)域可由細(xì)菌或真菌取得，例如由紅曲霉屬(Monascus sp.)取得，特別是由紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可經(jīng)基因工程方式，由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的BCRC 38072中熱休克蛋白(heat shockprotein，簡(jiǎn)稱Hsp)的起始子上游序列克隆而得。而上述編碼區(qū)域包括編碼一所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。所需蛋白質(zhì)包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉(zhuǎn)錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的另一型態(tài)是提供一種表達(dá)載體，其包括一啟動(dòng)子，上述啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列雜交的序列。上述啟動(dòng)子是如以上重組DNA的啟動(dòng)子區(qū)域所定義。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，例如質(zhì)粒，噬菌體，或病毒。上述表達(dá)載體可任擇地包括編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。上述所需蛋白質(zhì)包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；轉(zhuǎn)錄因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷爾蒙，如胰島素或生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的另一型態(tài)是有關(guān)于一種表達(dá)系統(tǒng)，包括上述定義的表達(dá)載體，以及一適于表達(dá)所需蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。上述載體是經(jīng)由一轉(zhuǎn)化方法被轉(zhuǎn)化入上述宿主細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞意指任何可用于表達(dá)所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、或絲狀真菌。上述絲狀真菌可為紅曲霉屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉屬M(fèi)onascuspilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC38072。轉(zhuǎn)化方法可采用目前已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)于屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌施予一轉(zhuǎn)化步驟?？蓞⒖?xì)W洲專利EP 1325959 A1 P5 節(jié)所述的方法。
本發(fā)明亦有關(guān)于一種轉(zhuǎn)化株，包括a)序列識(shí)別號(hào)2，或b)序列識(shí)別號(hào)2的第443至第1478個(gè)連續(xù)核苷酸，或序列識(shí)別號(hào)2的約第443至約第1478個(gè)連續(xù)核苷酸，或c)序列識(shí)別號(hào)2的第759至第1478個(gè)連續(xù)核苷酸，或序列識(shí)別號(hào)2的約第759至約第1478個(gè)連續(xù)核苷酸，或d)序列識(shí)別號(hào)2的第982至第1478個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或序列識(shí)別號(hào)2的約第982至約第1478個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或在嚴(yán)苛條件下可與上述任一序列雜交的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化株更包括一編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
本發(fā)明亦有關(guān)于一種表達(dá)一蛋白質(zhì)的方法。上述方法包括于一培養(yǎng)基培養(yǎng)上述含有編碼所欲蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化株，由轉(zhuǎn)化株所在的培養(yǎng)基生產(chǎn)與累積所需蛋白質(zhì)，以及由培養(yǎng)基收集所需蛋白質(zhì)。
本發(fā)明亦提供一種重組DNA，其包括一啟動(dòng)子區(qū)域與一編碼區(qū)域。上述啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)24的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該序列識(shí)別號(hào)24的核苷酸序列雜交的序列，而上述編碼區(qū)域包括編碼一所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
此外，本發(fā)明亦提供一種表達(dá)載體，其包括一啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)24的核苷酸序列或在嚴(yán)苛條件下可與該核苷酸序列雜交的序列。
含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體的實(shí)施例可經(jīng)由PCR方式增殖本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，并于其下游接上具有標(biāo)示功能的基因而得。所得表達(dá)載體可建構(gòu)為篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志(marker)，例如，用于評(píng)估基因克隆的效率。此外，本發(fā)明的載體亦可作為紅曲酶基因敲除(knockout)的工具，進(jìn)行菌種改良，產(chǎn)生更安全及更具產(chǎn)業(yè)利用性的紅曲霉種。
本發(fā)明的啟動(dòng)子序列尚可在其下游接上具有標(biāo)示功能的基因及欲偵測(cè)的目標(biāo)蛋白質(zhì)基因，用于活體內(nèi)(in vivo)或原位(in situ)偵測(cè)蛋白質(zhì)間的交互作用及目標(biāo)蛋白質(zhì)的作用位置。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化株及表達(dá)蛋白質(zhì)方法的應(yīng)用，可通過(guò)在啟動(dòng)子序列下游接上要表達(dá)的酶基因，采用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，可縮短酶生產(chǎn)時(shí)間，亦可大為增加產(chǎn)量。例如，增加紅曲霉蛋白酶的產(chǎn)量，可增進(jìn)紅曲霉以大豆粉作為培養(yǎng)基質(zhì)的效率，降低生產(chǎn)成本，另增加紅曲霉淀粉酶的產(chǎn)量，則可以增進(jìn)紅曲在釀酒時(shí)的糖化力，藉以改變制酒的制程及產(chǎn)生新風(fēng)味。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化株及表達(dá)蛋白質(zhì)的方法的應(yīng)用，亦可以在啟動(dòng)子的下游接上二次代謝產(chǎn)物基因，此表達(dá)系統(tǒng)可提前二次代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間，增加產(chǎn)量，而大量減低生產(chǎn)成本。
此外，本發(fā)明的表達(dá)載體亦可以在啟動(dòng)子下游接上轉(zhuǎn)錄活化子(transcriptional activator)基因，通過(guò)大量表達(dá)此活化子，同時(shí)也活化其所調(diào)控的基因，而大為增加產(chǎn)量。


圖1顯示本發(fā)明實(shí)施例中的acuF啟動(dòng)子區(qū)域的克隆流程。
圖2顯示本發(fā)明實(shí)施例中的acuF啟動(dòng)子區(qū)域的重組載體。本發(fā)明的acuF啟動(dòng)子區(qū)域經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入載體pHygEGFP后形成重組載體pMS-acuF。
圖3A與3B顯示pMS-acuF轉(zhuǎn)化后的綠色熒光蛋白表達(dá)情形。圖3A為明視野下；圖3B為熒光濾鏡下。
圖4顯示本發(fā)明實(shí)施例中的Hsp啟動(dòng)子區(qū)域的克隆流程。
圖5顯示本發(fā)明實(shí)施例中的Hsp啟動(dòng)子區(qū)域的重組載體。本發(fā)明的Hsp啟動(dòng)子區(qū)域經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入載體pHygEGFP后形成重組載體pMS-hsp。
圖6A與6B顯示pMS-hsp轉(zhuǎn)行后的綠色熒光蛋白表達(dá)情形。圖6A為明視野；圖6B為熒光濾鏡之下。
圖7顯示PCR產(chǎn)物的電泳圖。第1欄為1kb標(biāo)記(Bio-1kbTM DNA ladder)；第2-5欄為編號(hào)1-4的轉(zhuǎn)化株；第6欄為BCRC 38072野生型，(-)對(duì)照組；以及第7欄為pHygEGFP，(+)對(duì)照組。
大腸桿菌EP1300pMPF 001、大腸桿菌EP1300pMPF 002、大腸桿菌DH5αpMS-acuF、大腸桿菌DH5αpMS-Hsp已于公元2003年12月5日被寄存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110-2209，USA)，寄存編號(hào)分別為PTA-5685、PTA-5686、PTA-5687、PTA-5688。
具體實(shí)施例方式
由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的紅曲霉BCRC38072的EST基因庫(kù)中搜尋得到高表達(dá)量的基因，經(jīng)比對(duì)為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinasegene，簡(jiǎn)稱acuF基因)以及熱休克蛋白基因(heat shock proteingene，簡(jiǎn)稱Hsp基因)，推測(cè)此二基因的上游應(yīng)分別由一強(qiáng)大的啟動(dòng)子所調(diào)控，其可用于大量表達(dá)蛋白質(zhì)。
將紅曲霉BCRC 38072依照Hawksworth & Pitt(1983)的分類系統(tǒng)進(jìn)行觀察及鑒定，其型態(tài)特征如下宏觀特征
CYA，25℃，7天。菌落直徑25-26mm，菌絲體開(kāi)始為白色，漸漸變成淡紅橘色，復(fù)轉(zhuǎn)為深紅橘色。
MEA，25℃，7天。菌落直徑48mm，亮紅橘色，復(fù)轉(zhuǎn)為鮮紅橘色。
G25N，25℃，7天。菌落直徑28-29mm，深紅橘色，中央為深黃橘色。
微觀特征分生粉孢子(aleuriocondia)通常為單生或成短鏈，為倒梨狀(obpyriform)至球狀(globose)，大小為10-13×8-10μm。其有性世代閉囊殼(Cleistothecia)為球狀(globose)，直徑37-72μm。子囊孢子(ascospore)為透明，橢圓形，大小為4.6-6.3(-6.6)×3.3-4.2μm。
根據(jù)以上觀察，BCRC 38072的特征分析如下形態(tài)特征BCRC 38072介于M.pilosus與M.ruber之間。
1.依據(jù)菌落顏色與生長(zhǎng)速度以及分生粉孢子的著生方式，BCRC 38072與M.pilosus較接近。
2.依據(jù)子囊孢子形態(tài)大小，BCRC 38072與M.ruber較接近。
序列分析BCRC 38072、M.pilosus與M.ruber的rDNAITS片段及β-微管蛋白(6-tubulin)基因部分序列100％相同。
綜合形態(tài)特征與序列分析B CRC 380 72的學(xué)名暫定為Monascus pilosus K.Sato ex D Hawksw.& Pitt。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF)是在動(dòng)物淀粉新生(gluconeogenesis)中重要的淀粉，此酶在細(xì)胞中能持續(xù)且強(qiáng)烈的表達(dá)。
在動(dòng)物淀粉新生的過(guò)程中，丙酮酸(pyruvate)經(jīng)由丙酮酸羧基酶(pyruvate carboxylase)生成草酰乙酸(oxaloacetate)，再通過(guò)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)生成磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)。其反應(yīng)如下所示。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶熱休克蛋白(heat shock protein，簡(jiǎn)稱Hsp)是一類高度保守的蛋白質(zhì)，屬于一蛋白質(zhì)家族(protein family)，廣泛存在于原核生物與真核生物中，依其分子量分為四大類Hsp 90(83-90KDa)，Hsp 70(66-78 KDa)，Hsp 60，以及小Hsp家族。在生物體受到環(huán)境刺激時(shí)，此類蛋白質(zhì)會(huì)大量表達(dá)。
將acuF與Hsp的啟動(dòng)子以BLAST方式比對(duì)目前公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)并無(wú)與本發(fā)明紅曲霉的acuF與Hsp啟動(dòng)子序列相似的序列。于是將acuF與Hsp啟動(dòng)子序列重組到一pHygEGFP載體上，其具有HPH(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin Bphosphotransferase))與增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，簡(jiǎn)稱EGFP)的融合蛋白。通過(guò)觀察熒光蛋白的表達(dá)，證實(shí)上述兩個(gè)啟動(dòng)子的確具有開(kāi)啟下游基因的活性。
以下將以實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1acuF啟動(dòng)子1.材料(1)宿主紅曲霉Monascus BCRC 38072、Monascus pilosus，BCRC 31527、Neurospora crassa BCRC 32685(財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所)。
(2)感受態(tài)細(xì)胞ECOSTME.coli competent cells DH5α(益生生技公司)。
(3)質(zhì)粒pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T EasyVector(PROMEGA)。
(4)培養(yǎng)基a.大腸桿菌的培養(yǎng)基LB肉汁(USB)，瓊脂(USB)。
b.紅曲霉及粉紅面包霉(Neurospora crassa)的培養(yǎng)基PDA(DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培養(yǎng)基(參見(jiàn)*)，以及topagar。
(5)抗生素青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B)(SIGMA)。
*Vogel氏培養(yǎng)基1.微量元素溶液將5g檸檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1gFe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mgMnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml的滅菌去離子水。最終總量100ml。
2.生物素溶液5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。
3.50X Vogel氏鹽濃縮液150g檸檬酸鈉·5H2O、250gKH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事先緩緩溶于20ml的水中)于750ml的滅菌去離子水，加入5ml微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最終總量1升。過(guò)濾、滅菌后，將溶液保存于室溫。
4.修飾過(guò)的Vogel氏培養(yǎng)基將1％葡萄糖溶于1X的Vogel氏鹽液。
2.流程acuF啟動(dòng)子的制備流程是如圖1所示。由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的紅曲霉Monascus B CRC 38072的EST基因庫(kù)尋找到cDNA表達(dá)量最高的基因Contig IDMPTC00008457，經(jīng)比對(duì)為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF)，推測(cè)該基因由一強(qiáng)大啟動(dòng)子所調(diào)控。于是利用acuF基因5’端基因序列設(shè)計(jì)一段465bp的探針，以PCR方式由紅曲霉染色體放大該段探針。之后，將PCR產(chǎn)物接到pGEM-T Easy Vector上，再以DIG(Digoxigenin)標(biāo)示制成探針。利用此探針對(duì)紅曲BCRC 38072的原生質(zhì)體數(shù)據(jù)庫(kù)(fosmid library)進(jìn)行菌落雜交，找到含有acuF基因的原生質(zhì)體，編號(hào)為mpf01014A4。利用引物步行方式對(duì)編號(hào)為mpf01014A4的原生質(zhì)體進(jìn)行定序，找出acuF基因前端的啟動(dòng)子序列。成功定序出1116bp的預(yù)定啟動(dòng)子序列，并將之以BLAST進(jìn)行比對(duì)，并無(wú)比對(duì)相似序列。將此1116bp的acuF啟動(dòng)子序列以限制酶BglII與KpnI切位接到載體pHygEGFP上，并命名為pMS-acuF(又標(biāo)記為pMS-a1)，如圖2所示(右方的圖譜)。將pMA-acuF轉(zhuǎn)化至紅曲霉中，成功觀察到熒光蛋白的表達(dá)，如圖3A與3B所示。圖3A為明視野下，圖3B為熒光濾鏡下。此結(jié)果證明所推測(cè)的acuF啟動(dòng)子序列具有啟動(dòng)子活性。詳細(xì)步驟說(shuō)明如下。
A.acuF的探針基因片段的取得利用PCR克隆出BCRC 38072的acuF探針序列。
由紅曲霉EST基因庫(kù)設(shè)計(jì)引子如下正向引物5`-TGTTAATAGGACCGCCCTGC-3`(序列識(shí)別號(hào)3)反向引物5`-AGTATGCGGTCAGAGCACC-3`(序列識(shí)別號(hào)4)反應(yīng)條件如下100μl的PCR反應(yīng)中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，53℃30秒，72℃30秒，30次循環(huán)，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應(yīng)結(jié)束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續(xù)以70％酒精洗滌，經(jīng)離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
B.重組質(zhì)粒TA-acuF將PCR產(chǎn)物acuF探針片段純化回收，將回收的DNA與pGEM-T Easy Vector以濃度3∶1的比例混勻，加入1μl的T4DNA接合與10×接合緩沖液，以滅菌去離子水調(diào)制總體積10μl，于室溫進(jìn)行接合1小時(shí)。待接合完成后，取出5μl接合反應(yīng)產(chǎn)物加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用，所得轉(zhuǎn)化株已于93年12月7日寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號(hào)BCRC 940474。篩選出3483bp的質(zhì)粒，并以PCR確認(rèn)，得到重組質(zhì)粒TA-acuF。
C.acuF啟動(dòng)子片段的取得利用PCR克隆出原生質(zhì)體mpf01014A4的acuF啟動(dòng)子序列。
所采用的引子與反應(yīng)條件如下正向引物5`-GAAGATCTCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3`(序列識(shí)別號(hào)6)反向引物5`-ATGGTAC CTGTTTCTGAGTGAGGTC GAGTG-3`(序列識(shí)別號(hào)7)100μl的PCR反應(yīng)中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，59℃30秒，72℃1分鐘，30次循環(huán)，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應(yīng)結(jié)束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續(xù)以70％酒精洗滌，經(jīng)離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
D.重組質(zhì)粒pMS-acuF的制備以限制酶BglII與KpnI分別和PCR產(chǎn)物acuF啟動(dòng)子片段與克隆載體pHygEGFP進(jìn)行剪切作用4小時(shí)，再以DNA電泳鑒定分離，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。將回收的載體與acuF啟動(dòng)子片段以1∶3比列混勻，并以滅菌去離子水調(diào)制總體積10μl。于16℃進(jìn)行接合反應(yīng)4小時(shí)。待接合反應(yīng)完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用。經(jīng)大腸桿菌質(zhì)粒篩選出6.1kb的質(zhì)粒，并以PCR確認(rèn)，即得到重組質(zhì)粒pMS-acuF。
E.Monascus原生質(zhì)體(protoplast)的制備將Monascus孢子液接在PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)5-7天。用無(wú)菌水刮下孢子，以兩層滅菌的miracloth濾膜過(guò)濾孢子液，除去菌絲及瓊脂塊。于光學(xué)顯微鏡下，以血球計(jì)數(shù)盤(pán)計(jì)算濾液中的孢子數(shù)。接種孢子107個(gè)/ml至50ml的修飾過(guò)的Vogel氏培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)。以兩層滅菌的miracloth濾膜過(guò)濾萌芽的紅曲孢子，以無(wú)菌水清洗后，接著以酶消化緩沖液潤(rùn)濕菌絲。
以10ml酶消化緩沖液洗下miracloth濾膜上的菌絲，加入5ml酶混合液，置于震蕩器上，于室溫快速搖晃反應(yīng)半小時(shí)，每隔十分鐘，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞壁分解情形，直到約90％菌絲均釋出原生質(zhì)體。用兩層miracloth濾膜過(guò)濾，濾液于4℃，1500rpm離心15分鐘，收集原生質(zhì)體。倒去上清液，以酶消化緩沖液清洗沉淀物兩次，再以STC清洗兩次。加入1.5ml的STC、20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于顯微鏡下計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)目，分裝107個(gè)/管，并置于-80℃保存。
F.轉(zhuǎn)化作用采用STC清洗原生質(zhì)體兩次，于4℃、1500rpm離心15分鐘。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生質(zhì)體沉淀。加入1-10μg的質(zhì)粒DNA，于200Ohms，25μF，0.7KV的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。加入1ml的再生緩沖液(regeneration buffer)，于30℃下靜置隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B)的top agar培養(yǎng)基，鋪于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培養(yǎng)基上，于30℃靜置培養(yǎng)，約3-5天可觀察到轉(zhuǎn)化株。
G.轉(zhuǎn)化株的篩選與確認(rèn)(1)用尖頭鑷子挑取少許轉(zhuǎn)化株上的菌絲與孢子置于載玻片上，滴一滴無(wú)菌水后蓋上蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。在觀察綠色熒光蛋白所使用的濾鏡下(Ex.430-510nm；Em.475-575nm)可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。
(2)將轉(zhuǎn)化株接到PDB(potato dextrose broth)培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)5-10天。之后將菌體磨碎，抽取染色體DNA，以HPH-EGFP專一性引子進(jìn)行PCR，可得到1740bp的產(chǎn)物。
H.確認(rèn)具有啟動(dòng)子活性的最小片段為更進(jìn)一步確認(rèn)acuF啟動(dòng)子片段(1116bp)中具有功能活性的最小片段，利用PCR方式分別得到包含活性序列片段的1000bp，750bp，600bp，及500bp的PCR產(chǎn)物。所采用的模板為pMS-a1。獲得上述PCR產(chǎn)物所使用的引子列示如下。
1000bp正向引物acuF-B2 gaagatctTGTCGATGCAATCGGGCAATCC(序列識(shí)別號(hào)13)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識(shí)別號(hào)14)750bp正向引物acuF-B3 gaagatctTGATGATTGGGATCGGACTCGG(序列識(shí)別號(hào)15)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識(shí)別號(hào)14)600bp正向引物acuF-B4 gaagatctTGCGGATCCGAGGATAAAAC(序列識(shí)別號(hào)16)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識(shí)別號(hào)14)500bp正向引物acuF-B5 gaagatctCCCGGTATTGTCCGAGGCTC(序列識(shí)別號(hào)17)反向引物acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序列識(shí)別號(hào)14)將1000bp，750bp，600bp，及500bp的acuF啟動(dòng)子序列接到pMS載體，并命名為pMS-a2，pMS-a3，pMS-a4，及pMS-a5。將載體轉(zhuǎn)化至Monascus BCRC 38072，并以含有Hygr30ug/ml的PDA培養(yǎng)基做篩選。結(jié)果如下所示。

1R抗性；N.R.無(wú)抗性。
2+陽(yáng)性；-陰性。
N.D.未偵測(cè)。
具有功能活性的最小片段為600bp。且含有600bp片段的轉(zhuǎn)化株亦可偵測(cè)到熒光反應(yīng)。
將這些質(zhì)粒亦轉(zhuǎn)化到Monascus pilosus BCRC 31527，以含有Hygr 50ug/ml的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。結(jié)果如下表。

1R抗性；N.R.無(wú)抗性。
2+陽(yáng)性；-陰性。
N.D.未偵測(cè)。
具有功能活性的最小片段亦為600bp。且含有600bp片段的轉(zhuǎn)化株亦可偵測(cè)到熒光反應(yīng)。
將這些質(zhì)粒亦轉(zhuǎn)化到Neurospora crassa BCRC 32685，并以含Hygr 50ug/ml的PDA培養(yǎng)基篩選之。結(jié)果如下表。

1R抗性；N.R.無(wú)抗性。
N.D.未偵測(cè)。
具有功能活性的最小片段亦為600bp。
由上述結(jié)果證明，acuF啟動(dòng)子序列中具有功能活性的最小片段為600bp(序列識(shí)別號(hào)18)，且其可表達(dá)于Monascus BCRC38072，Monascus pilosus BCRC 31527，以及Neurosporacrassa BCRC 32685。
實(shí)施例2Hsp啟動(dòng)子1.材料(1)宿主紅曲霉Monascus BCRC 38072，Monascus pilosusBCRC 31527，以及Neurospora crassa BCRC 32685(財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所)。
(2)感受態(tài)細(xì)胞ECOSTME.coli competent cells DH5α(益生生技公司)。
(3)質(zhì)粒pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T EasyVector(PROMEGA)。
(4)培養(yǎng)基a.大腸桿菌的培養(yǎng)基LB肉汁(USB)，瓊脂(USB)。
b.紅曲霉及粉紅面包霉(Neurospora crassa)的培養(yǎng)基PDA(DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培養(yǎng)基(參見(jiàn)*)，以及topagar。
(5)抗生素青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B)(SIGMA)。
*Vogel氏培養(yǎng)基①.微量元素溶液將5g檸檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mgMnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml的滅菌去離子水。最終總量100ml。
②.生物素溶液5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。
③.50X Vogel氏鹽濃縮液150g檸檬酸鈉·5H2O、250gKH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事先緩緩溶于20ml的水中)于750ml的滅菌去離子水，加入5ml微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最終總量1升。過(guò)濾、滅菌后，將溶液保存于室溫。
④.修飾過(guò)的Vogel氏培養(yǎng)基將1％葡萄糖溶于1X的Vogel氏鹽液。
2.流程Hsp啟動(dòng)子的制備流程是如圖4所示。由財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所所收集的紅曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因庫(kù)尋找到25℃ 培養(yǎng)三天時(shí)表達(dá)量最高的基因，經(jīng)比對(duì)為熱休克蛋白(Heat shock protein，簡(jiǎn)稱Hsp)，推測(cè)該基因由一強(qiáng)大啟動(dòng)子所調(diào)控。于是利用其5’端基因序列設(shè)計(jì)一段探針，以PCR方式由紅曲霉染色體放大該段探針。之后，將PCR產(chǎn)物接到pGEM-TEasy Vector上，命名為T(mén)A-Hsp，再以DIG(Digoxigenin)標(biāo)示制成探針。利用此探針對(duì)紅曲BCRC 38072的fosmid基因庫(kù)進(jìn)行菌落雜交，找到含有Hsp基因的原生質(zhì)體。利用基因槍(shotgun)的方式對(duì)此克隆株進(jìn)行定序，找出Hsp基因序列及其5’端的啟動(dòng)子區(qū)域。針對(duì)Hsp基因5’啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)引子，利用PCR方法，自紅曲染色體放大一段1478bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子區(qū)域。將此1478bp的Hsp啟動(dòng)子序列以限制酶BglII與XhoI切位接到載體pHygEGFP上，并命名為pMS-Hsp，如圖5所示(右方的圖譜)。將pMS-Hsp轉(zhuǎn)化至紅曲霉中，以潮霉素進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化株在熒光顯微鏡下可成功觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，如圖6A與6B所示。圖6A為明視野下，圖6B為熒光濾鏡下。此結(jié)果證明此段啟動(dòng)子區(qū)域具有活性。再以QIAGEN DNasePlant kit抽取紅曲霉BCRC38072熒光轉(zhuǎn)化株的染色體DNA，以HPH-EGFP專一性引子進(jìn)行PCR反應(yīng)，轉(zhuǎn)化株得到1740的產(chǎn)物，如圖7所示。第1欄代表1kb標(biāo)記(Bio-1KbTM DNA Ladder)，第2-5欄為標(biāo)號(hào)1-4的轉(zhuǎn)化株，第6欄為BCRC 38072野生型，(-)對(duì)照組，以及第7欄為pMS-Hsp，(+)對(duì)照組。詳細(xì)步驟說(shuō)明如下。
A.Hsp的探針基因片段的取得利用PCR克隆出BCRC 38072的Hsp探針序列。
由紅曲霉EST基因庫(kù)設(shè)計(jì)引子如下正向引物mptc3161-A5`-GCTTATCTCCAATGCCTCCG-3`(序列識(shí)別號(hào)8)反向引物mptc3161-B5`-CAAGGTCTCGCTCGTTAC-3`(序列識(shí)別號(hào)9)反應(yīng)條件如下所示。
100μl的PCR反應(yīng)中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，55℃30秒，72℃30秒，30次循環(huán)，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應(yīng)結(jié)束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續(xù)以70％酒精洗滌，經(jīng)離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
B.重組質(zhì)粒TA-Hsp將PCR產(chǎn)物Hsp探針片段純化回收，將回收的DNA與pGEM-T Easy Vector以濃度3∶1的比例混勻，加入1μl的T4DNA接合 與10×接合緩沖液，以滅菌去離子水調(diào)制總體積10μl，于室溫進(jìn)行接合1小時(shí)。待接合完成后，取出5μl接合反應(yīng)產(chǎn)物加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用。篩選出3482bp的質(zhì)粒，并以PCR確認(rèn)，得到重組質(zhì)粒TA-Hsp。
C.Hsp啟動(dòng)子片段的取得由Monascus EST基因庫(kù)設(shè)計(jì)出Hsp啟動(dòng)子的引子，利用PCR克隆出Hsp啟動(dòng)子序列。
所采用的引子與反應(yīng)條件如下正向引物Mps17-9259-F5`-AGTGGCAGCCAACCCTCACC-3`(序列識(shí)別號(hào)11)反向引物Mps17-7782-R5`-CGGGCTGATAGAGCAGATAGATAGATG-3`(序列識(shí)別號(hào)12)100μl的PCR反應(yīng)中含有DNA模板20ng，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM)8μl，10×緩沖液10μl。
第一回合94℃7分鐘，第二回合94℃1分鐘，60℃30秒，72℃1分鐘，30次循環(huán)，第三回合72℃15分鐘，4℃保存。
反應(yīng)結(jié)束后，以同樣體積的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10體積的3M醋酸鈉溶液及兩倍體積的100％酒精沉淀DNA。續(xù)以70％酒精洗滌，經(jīng)離心干燥后，溶于滅菌去離子水，保存于-20℃冰箱。
D.重組pMS-hsp的制備以限制酶BglII與XhoI分別和PCR產(chǎn)物Hsp啟動(dòng)子片段與克隆載體pHygEGFP進(jìn)行剪切作用16小時(shí)，再以DNA電泳鑒定分離，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。將回收的載體與Hsp啟動(dòng)子片段以1∶3比列混勻，并以滅菌去離子水調(diào)制總體積10μl。于16℃進(jìn)行接合反應(yīng)16小時(shí)。待接合反應(yīng)完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用，所得轉(zhuǎn)化株已于93年12月7日寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，寄存編號(hào)BCRC 940473。經(jīng)大腸桿菌質(zhì)粒篩選出6215bp的質(zhì)粒，并以PCR確認(rèn)，即得到重組質(zhì)粒pMS-hsp。
E.Monascus原生質(zhì)體(protoplast)的制備將Monascus孢子液接在PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)5-7天。用無(wú)菌水刮下孢子，以兩層滅菌的miracloth濾膜過(guò)濾孢子液，除去菌絲及瓊脂塊。于光學(xué)顯微鏡下，以血球計(jì)數(shù)盤(pán)計(jì)算濾液中的孢子數(shù)。接種孢子107個(gè)/ml至50ml的修飾過(guò)的Vogel氏培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)。以兩層滅菌的miracloth濾膜過(guò)濾萌芽的紅曲孢子，以無(wú)菌水清洗后，接著以酶消化緩沖液潤(rùn)濕菌絲。
以10ml酶消化緩沖液洗下miracloth濾膜上的菌絲，加入5ml酶混合液，置于震蕩器上，于室溫快速搖晃反應(yīng)半小時(shí)，每隔十分鐘，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞壁分解情形，直到約90％菌絲均釋出原生質(zhì)體。用兩層miracloth濾膜過(guò)濾，濾液于4℃，1500rpm離心15分鐘，收集原生質(zhì)體。倒去上清液，以酶消化緩沖液清洗沉淀物兩次，再以STC清洗兩次。加入1.5ml的STC、20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于顯微鏡下計(jì)算原生質(zhì)體數(shù)目，分裝107個(gè)/管，并置于-80℃保存。
F.轉(zhuǎn)化作用采用STC清洗原生質(zhì)體兩次，于4℃、1500rpm離心15分鐘。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生質(zhì)體沉淀。加入1-10μg的質(zhì)粒DNA，于200 Ohms，25μF，0.7KV的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。加入1ml的再生緩沖液(regeneration buffer)，于30℃下靜置隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B)的top agar培養(yǎng)基，鋪于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培養(yǎng)基上，于30℃靜置培養(yǎng)，約3-5天可觀察到轉(zhuǎn)化株。
G.轉(zhuǎn)化株的篩選與確認(rèn)(1)用尖頭鑷子挑取少許轉(zhuǎn)化株上的菌絲與孢子置于載玻片上，滴一滴無(wú)菌水后蓋上蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。在觀察綠色熒光蛋白所使用的濾鏡下(Ex.430-510nm；Em.475-575nm)可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。
(2)將轉(zhuǎn)化株接到PDB(potato dextrose broth)培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm震蕩培養(yǎng)5-10天。之后將菌體磨碎，抽取染色體DNA，以HPH-EGFP專一性引子進(jìn)行PCR，可得到1740bp的產(chǎn)物。
H.確認(rèn)具有啟動(dòng)子活性的最小片段為更進(jìn)一步確認(rèn)Hsp啟動(dòng)子片段(1478bp)中具有功能活性的最小片段，利用PCR方式分別得到包含活性序列片段的1036bp，720bp，及497bp的PCR產(chǎn)物。所采用的模板為pMS-hsp。獲得上述PCR產(chǎn)物所使用的引子列示如下。
497bp
正向引物CCGAGAGCGCGTATATGTAACG(序列識(shí)別號(hào)19)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識(shí)別號(hào)20)720bp正向引物TGAATTGTGTGGGTGCGTGG(序列識(shí)別號(hào)21)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識(shí)別號(hào)20)1036bp正向引物CAGTGCATCTTAGCGGTTGG(序列識(shí)別號(hào)22)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識(shí)別號(hào)20)1478bp正向引物AGTGGCAGCCAACCCTCACC(序列識(shí)別號(hào)23)反向引物CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列識(shí)別號(hào)20)將1478bp，1036bp，720bp，及497bp的Hsp啟動(dòng)子序列接到表達(dá)載體，并將載體轉(zhuǎn)化至Monascus BCRC 38072，以含有Hygr 30ug/ml的PDA培養(yǎng)基做篩選。結(jié)果如下所示。

1R抗性；N.R.無(wú)抗性。
2+陽(yáng)性；-陰性。
具有功能活性的最小片段為497bp。且含有497bp片段的轉(zhuǎn)化株亦可偵測(cè)到熒光反應(yīng)。
將這些質(zhì)粒亦轉(zhuǎn)化到Monascus pilosus BCRC 31527與Neurospora crassa BCRC 32685，以含有Hygr 50ug/ml或200ug/ml的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。結(jié)果如下表。

1R抗性；N.R.無(wú)抗性。
2+陽(yáng)性；-陰性。
具有功能活性的最小片段為497bp(序列識(shí)別號(hào)24)。且證實(shí)可于Monascus BCRC 38072，Monascus pilosus BCRC 31527與Neurospora crassa BCRC 32685表達(dá)。
其它實(shí)施型態(tài)含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的表達(dá)載體的實(shí)施例可經(jīng)由P CR方式增殖本發(fā)明的啟動(dòng)子序列，并于其下游接上具有標(biāo)示功能的基因而得。具有標(biāo)示功能的基因?yàn)?，例如，潮霉素抗性基因或Hyg-GFP基因。所得表達(dá)載體可建構(gòu)為篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志(marker)，例如，用于評(píng)估基因克隆的效率。此外，本發(fā)明的載體亦可作為紅曲基因敲除(knockout)的工具，進(jìn)行菌種改良，如破壞橘霉素(citrinin)的生合成基因、抑制子(repressor)基因等有害基因，產(chǎn)生更安全及更具產(chǎn)業(yè)利用性的紅曲霉種。
本發(fā)明的啟動(dòng)子序列尚可在其下游接上具有標(biāo)示功能的基因及欲偵測(cè)的目標(biāo)蛋白質(zhì)基因，用于活體內(nèi)(in vivo)或原位(in situ)偵測(cè)蛋白質(zhì)間的交互作用及目標(biāo)蛋白質(zhì)的作用位置。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化株及表達(dá)蛋白質(zhì)方法的應(yīng)用，可通過(guò)在啟動(dòng)子序列下游接上要表達(dá)的酶基因，例如蛋白酶，淀粉酶(amylase)，幾丁質(zhì)酶(chitinase)，植酸酶(phytase)，葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)。采用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，可縮短酶生產(chǎn)時(shí)間，亦可大為增加產(chǎn)量。例如，增加紅曲霉蛋白酶的產(chǎn)量，可增進(jìn)紅曲霉以大豆粉作為培養(yǎng)基質(zhì)的效率，降低生產(chǎn)成本，另增加紅曲霉淀粉酶的產(chǎn)量，則可以增進(jìn)紅曲在釀酒時(shí)的糖化力，藉以改變制酒的制程及產(chǎn)生新風(fēng)味。
本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化株及表達(dá)蛋白質(zhì)的方法的應(yīng)用，亦可以在啟動(dòng)子的下游接上二次代謝產(chǎn)物基因，例如，聚縮酮類合成酶(polyketide synthase)，或非核糖體羧氨酸合成酶(nonribosomal peptide synthase)基因。此表達(dá)系統(tǒng)可提前二次代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間，增加產(chǎn)量，而大量減低生產(chǎn)成本。
此外，本發(fā)明的表達(dá)載體亦可以在啟動(dòng)子下游接上轉(zhuǎn)錄活化子(transcriptional activator)基因，通過(guò)大量表達(dá)此活化子，同時(shí)也活化其所調(diào)控的基因，而大為增加產(chǎn)量。
雖然本發(fā)明已以一較佳實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更動(dòng)與潤(rùn)飾，故本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的權(quán)利要求書(shū)所界定的范圍為準(zhǔn)。
序列表<110>財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所<120>啟動(dòng)子與其應(yīng)用<140>
<141>
<160>24<210>1<211>1116<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動(dòng)子<222>
<223>acuF啟動(dòng)子<400>1ACTATTAGCG AAAGACCGGC AAGTAGATGG AAGAGCCGGA ATTATTCTTG50TTCTTCGATA GTATTCCGTC CATGCCTAGG CACAGATAGT AAGATACACA100TCGTAATAGG ACCGCCTGTC GATGCAATCG GGCAATCCAG GAACCCACGC150AGCCCAAACA CGAGGCTAGA CTCGCGTCTG CTGCACATGG AAGCTGATGG200ATACATATAC CCCCAGCAGC ATGCGGTTCC CCCTGCAGAG ACCAGAGGCT250AGAAGTCTCT GGGCGCATGT ATGTATCTAT TATTACCTAT CAATCGGTTT300CGGGTACTCC TTGCCGGAGT CGCTGAAGCG CAGACGTGCC GACCCGGAAC350ATTTAGGAAG AAACCGTGAT GATTGGGATC GGACTCGGGC ACACATGGCA400CCGAATTGCC AAAAAATGGC GCATTCTGGG GAATCAAGCA TGCAGCACAT450CTTACTAGAT TCAATAGATT AAGGCACAGG CCATGTAGAG GGCAGTGGCA500ATACAATATG GGGCCGTGCG GATCCGAGGA TAAAACTTGC CCGTTAGTCC550GGCTGGGGGT TACGGCAGTC ATAACCATCT ACAGCCACGG CCGGGCCAGG600TGGTGCACAC GGCCGTCCCG GTATTGTCCG AGGCTCAGCC GAGAAGCCCT650AACCCCTAGC CGACCAGGGC TCCGCGTCTC CCCGCAAACT CGTTTTAAAC700TTGCAGCTTC CCGTGCTCCG TCGTGCCCTA GCCCGCGCTG ATTCGCCGCT750CGGGCGAATT CGGGCGTGTT TATGCCTCGT CCTGCTCTGA CTTCATCGTC800CGGAGCCCAA TTCCTGGCCG TCAATCGCTC TCCTTCGCTG CCCTGACGCA850AACCGCGCTG TCCACAGCGC TCCCCATCTC GCAACGACCC CGACATCTCC900CGTTATACGG TGGAGACGGA CGAGAAATCT TCTGCGGATG GGAGGCATAT950TCGACACTTT ACGACTTATC GTCGCCCTCA TGGTTTCCCC CGCTGCAAAC1000ATTCCATATA CCCCCCCTTC GGCCCTGCTT CTCCTGCTCC TGCAAACTCG1050
GATTTTGTTC GACAGCAAGT CGCGAGACAG CAGAAGAACG ACTACCACTC1100GACCTCACTC AGAAAC 1116<210>2<211>1478<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動(dòng)子<222>
<223>Hsp啟動(dòng)子<400>2AGTGGCAGCC AACCCTCACC AAATCGGAAC TGAACAGATT TACGTTGAAG50AACGCCGTAC TCGTACCAAT ACCTACGGTG GAAATGCCAA CTTTGGAGCT100GGCAGGGGTG GCGCTGGCCG TGGTCGTGCT GGACAAGGCC GGGGCGGCTT150CCAACGAGAT GGCGGCCGTG GAGGGTTTGC TCCCCGTGGC CGTGGCGGAA200ACGTCACGCC CAAGGGCCGC AACCAGCCTC AAACTGCATA AAGTAAGGAT250GCCAATGAGA ATTCGAATGC GTGATGCTTT CTTTGTTTCT CCGGCTGACG300ATACCTCTTT TTCTTTTTTT CTACCAATCC CGCTGGTTGG TGCAGCGCTG350ATCTTTGTTA TATTGCTTAC GGAATTTCCA GGTTATGTAT TACTTTCCCA400TTTACCCATA ATGATATGTG TTATGTGGCT CTCATTTTGT CACAGTGCAT450CTTAGCGGTT GGAAAAAAGT TTTCATTTTT CCCAGCTCAG CACTTTTATT500TTCCATGGCC TCTTTGGTTT GTGTTTTATG AGCTCGTTTC TTTTGTTACT550TTCTGCCTTT GTATTGTCCG CATCCGTGTG ATCCTAGCAT AGCGCGCAGA600AAGCCTATAT TCTTCTCCCC TATTATTCCA CATATCCTTT TCTTTCTCCT650TGATGCTGTG TTTCAGATCT CAACCTAACA ACACTTAGTG TTCTCTTCTT700TCTATTTCTT ATTTTTATTT TTATTTATTT ATATTTTTTC ACATTGGTAT750TGGCACCCTG AATTGTGTGG GTGCGTGGAA TACTGTACAA TCAATCCACT800CAGGCGCAGT GAATTGGTTT GCAGGAAGGG AACAGTATAT GGATATCTGC850AAATATGCTA GAATACACTT TTAGCTAATG TAAAACAATC AGTGAATTCT900GAAGCTTCTC AGGGTTGCTG CGCCAACAGG GCTGGCGGAG AGCAAGGGCG950GAGGGCGGAC AGGCTTGTAC GATGACTGGC CCCGAGAGCG CGTATATGTA1000ACGGTACTGT AATGTAGTCA CCCGCGGCAG CGATATTGCA GTTAAGATAC1050TGTAATGCTC TGTAACGGCA GCCGGCCGAA CAATGGAATG GGTGGAGCGG1100AACGTTCTAG ATTGTTCAAG ACCTCAGGTA GCAATTGCCT CACCCCTCCA1150GTTTCCTCGA AGGCAGACTA GAAAAATGCA GAAGGAAAGA GAGGCTTCCA1200ACGGATTCGA TGGCTATATC CTGTGATTGG AAAAACACGA ATTTCCAGTG1250
TGTCCGGATC CACGGAAAGC ACTGGAACCA AGTGAAAGTG CAGAGTTCAA1300AGCTGGTTGA GCCCCCAAAG TGGTTTAGGG CACGGCGGAG CGCGTGGAAG1350TTGCTGGACG GCCGTAGAAT CGCAGATTCC TGCTCTCTTC CCTCGCAACT1400ATTTTATCCT CGCTTCCTCC GCTTCTCTCT CTCTCTTTCT TCCGCTTCAT1450CTATTCATCT ATCTATCTGC TCTATCAG1478<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-F<400>3TGTTAATAGG ACCGCCCTGC 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-R<400>4AGTATGCGGT CAGAGCACC 19<210>5<211>465<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>
<223>acuF probe<400>5
TGTTAATAGG ACCGCCCTGC ACCCTGGTGG TGTTCNTTAC GTCTTCCTTT50CCTGCCTTGT TGCTGCTGCT TCCGTTGCAT ACTACATCTA TCGCACCAAG100GACAACAACA GGTCTTGCTG TTCTCTTTTC TTATTGCTTT TTCTCTTTTT150TCTCCGTTCT ACTCTCCATC GTTCCTTCCC CATGACTCAA CCTCGCTAAC200ATCTGCTTTC TTTTCTGCTC TTTCTAGGCC GGGCAAAGGA CACACGGAGC250TTGAGGAGGA GCTCCATGAG ACAGCGCACA TTGACTATGA CCGAGTGGCA300ATCGTAAGAT CCCAGTCATC CTCTTGATGT TTTCCTCCTT GACAAGGACA350TGGCTAACGA ACGACTCTAG ATTGCGAATC CTTCCGTTGC TGCCCTCTAC400GAAGATGCCC TTGTCTATGA AACGGGAACC GCCATCACAT CCAGCGGTGC450TCTGACCGCA TACTC 465<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>6GAAGATCTCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGC 34<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>7ATGGTACCTG TTTCTGAGTG AGGTCGAGTG 30<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mptc3161-A<400>8GCTTATCTCC AATGCCTCCG 20<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mptc3161-B<400>9CAAGGTCTCG CTCGTTAC 18<210>10<211>269<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>
<223>Hsp probe<400>10GCTTATCTCC AATGCCTCCG ATGCCCTCGA CAAGATCCGC TATGAGTCCT50TGTCGGACCC TTCCAAGCTC GATTCGTGCA AGGACCTCCG TATCGACATC100ATCCCGGATA AGGAGTCTAA GACTCTCACC ATCCGCGATA CCGGTATTGG150TATGACCAAG GCTGATCTAA TCAACAACCT TGGTACCATT GCTCGCTCTG200GAACATAACC ATACTGGTTC CGACTAGATT AGTTGTTGGA ACCATGGTAA250CGAGCGAGAC CTTG 269<210>11<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>Mps 17-9259-F<400>11AGTGGCAGCC AACCCTCACC 20<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>Mps17-7782-R<400>12CGGGCTGATA GAGCAGATAG ATAGATG 27<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-B2<400>13GAAGATCTTG TCGATGCAAT CGGGCAATCC 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-KpnI<400>14ATGGTACCTG TTTCTGAGTG AGGTCGAGTG30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-B3<400>15GAAGATCTTG ATGATTGGGA TCGGACTCGG 30<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-B4<400>16GAAGATCTTG CGGATCCGAG GATAAAAC 28<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>acuF-B5<400>17GAAGATCTCC CGGTATTGTC CGAGGCTC 28
<210>18<211>600<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動(dòng)子<222>
<223>
<400>18TGCGGATCCG AGGATAAAAC TTGCCCGTTA GTCCGGCTGG GGGTTACGGC50AGTCATAACC ATCTACAGCC ACGGCCGGGC CAGGTGGTGC ACACGGCCGT100CCCGGTATTG TCCGAGGCTC AGCCGAGAAG CCCTAACCCC TAGCCGACCA150GGGCTCCGCG TCTCCCCGCA AACTCGTTTT AAACTTGCAG CTTCCCGTGC200TCCGTCGTGC CCTAGCCCGC GCTGATTCGC CGCTCGGGCG AATTCGGGCG250TGTTTATGCC TCGTCCTGCT CTGACTTCAT CGTCCGGAGC CCAATTCCTG300GCCGTCAATC GCTCTCCTTC GCTGCCCTGA CGCAAACCGC GCTGTCCACA350GCGCTCCCCA TCTCGCAACG ACCCCGACAT CTCCCGTTAT ACGGTGGAGA400CGGACGAGAA ATCTTCTGCG GATGGGAGGC ATATTCGACA CTTTACGACT450TATCGTCGCC CTCATGGTTT CCCCCGCTGC AAACATTCCA TATACCCCCC500CTTCGGCCCT GCTTCTCCTG CTCCTGCAAA CTCGGATTTT GTTCGACAGC550AAGTCGCGAG ACAGCAGAAG AACGACTACC ACTCGACCTC ACTCAGAAAC600<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>19CCGAGAGCGC GTATATGTAA CG 22<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>20CTGATAGAGC AGATAGATAG ATG 23<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>21TGAATTGTGT GGGTGCGTGG 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>22CAGTGCATCT TAGCGGTTGG 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>
<400>23AGTGGCAGCC AACCCTCACC20<210>24<211>497<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>啟動(dòng)子<222>
<223>
<400>24CCGAGAGCGC GTATATGTAA CGGTACTGTA ATGTAGTCAC CCGCGGCAGC50GATATTGCAG TTAAGATACT GTAATGCTCT GTAACGGCAG CCGGCCGAAC100AATGGAATGG GTGGAGCGGA ACGTTCTAGA TTGTTCAAGA CCTCAGGTAG150CAATTGCCTC ACCCCTCCAG TTTCCTCGAA GGCAGACTAG AAAAATGCAG200AAGGAAAGAG AGGCTTCCAA CGGATTCGAT GGCTATATCC TGTGATTGGA250AAAACACGAA TTTCCAGTGT GTCCGGATCC ACGGAAAGCA CTGGAACCAA300GTGAAAGTGC AGAGTTCAAA GCTGGTTGAG CCCCCAAAGT GGTTTAGGGC350ACGGCGGAGC GCGTGGAAGT TGCTGGACGG CCGTAGAATC GCAGATTCCT400GCTCTCTTCC CTCGCAACTA TTTTATCCTC GCTTCCTCCG CTTCTCTCTC450TCTCTTTCTT CCGCTTCATC TATTCATCTA TCTATCTGCT CTATCAG 49權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)1中約517至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)18)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列，其中該DNA序列具有啟動(dòng)子活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)1中約367至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)1中約117至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)1的序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自細(xì)菌或真菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus sp。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
8.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF基因)的上游序列。
10.一種重組DNA，其包括一啟動(dòng)子區(qū)域，包括序列識(shí)別號(hào)1中約517至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)18)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列；以及一編碼區(qū)域，包括一編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA，其啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)1中約367至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA，其啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)1中約117至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組DNA，其啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)1的序列雜交的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求10～13任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自細(xì)菌或真菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求10～13任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus sp。
16.根據(jù)權(quán)利要求10～13任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
17.根據(jù)權(quán)利要求10～13任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF基因)的上游序列。
19.一種表達(dá)載體，其包括一啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)1中約517至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)18)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)1中約367至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)1中約117至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)1的序列雜交的核苷酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求19～22任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自細(xì)菌或真菌。
24.根據(jù)權(quán)利要求19～22任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus sp。
25.根據(jù)權(quán)利要求19～22任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
26.根據(jù)權(quán)利要求19～22任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，簡(jiǎn)稱acuF基因)的上游序列。
28.一種DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)2中約982至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)24)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列，其中該DNA序列具有啟動(dòng)子活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)2中約759至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)2中約443至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)2的序列雜交的核苷酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求28～31任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自細(xì)菌或真菌。
33.根據(jù)權(quán)利要求28～31任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus sp。
34.根據(jù)權(quán)利要求28～31任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
35.根據(jù)權(quán)利要求28～31任一項(xiàng)所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的DNA分子，其中該DNA分子是源自紅曲霉BCRC 38072中熱休克蛋白基因(heat shockprotein gene，簡(jiǎn)稱hsp基因)的上游序列。
37.一種重組DNA，其包括一啟動(dòng)子區(qū)域，包括序列識(shí)別號(hào)2中約982至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)24)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列；以及一編碼區(qū)域，包括一編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的重組DNA，其啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)2中約759至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的重組DNA，其啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)2中約443至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的重組DNA，其啟動(dòng)子區(qū)域包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)2的序列雜交的核苷酸序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求37～40任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自細(xì)菌或真菌。
42.根據(jù)權(quán)利要求37～40任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus sp。
43.根據(jù)權(quán)利要求37～40任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascusrubber，或Monascus purpureus。
44.根據(jù)權(quán)利要求37～40任一項(xiàng)所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的重組DNA，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉BCRC 38072中熱休克蛋白基因(heat shockprotein gene，簡(jiǎn)稱hsp基因)的上游序列。
46.一種表達(dá)載體，其包括一啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)2中約982至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)24)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)2中約759至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)2中約443至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的表達(dá)載體，其啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)2的序列雜交的核苷酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求46～49任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自細(xì)菌或真菌。
51.根據(jù)權(quán)利要求46～49任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus sp。
52.根據(jù)權(quán)利要求46～49任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自紅曲霉屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus。
53.根據(jù)權(quán)利要求46～49任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子是源自寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所的紅曲霉BCRC 38072。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的表達(dá)載體，其中該啟動(dòng)子區(qū)域是源自紅曲霉BCRC 38072中熱休克蛋白基因(heat shockprotein gene，簡(jiǎn)稱hsp基因)的上游序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及啟動(dòng)子及其應(yīng)用。acuF啟動(dòng)子包括序列識(shí)別號(hào)1中約517至約1116個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)18)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。Hsp啟動(dòng)子，包括序列識(shí)別號(hào)2中約982至約1478個(gè)連續(xù)核苷酸序列(即序列識(shí)別號(hào)24)的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與上述連續(xù)序列雜交的核苷酸序列。含有上述兩個(gè)啟動(dòng)子的相應(yīng)的DNA分子、重組DNA、表達(dá)載體。含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的應(yīng)用如表達(dá)載體可建構(gòu)為篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，用于評(píng)估基因克隆的效率。作為紅曲酶基因敲除的工具，進(jìn)行菌種改良，產(chǎn)生更安全及更具產(chǎn)業(yè)利用性的紅曲霉種。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1644689SQ200410097179
公開(kāi)日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者陳怡靜, 郭恩惠, 劉意如, 黃英娥, 吳文蓉, 李鐘財(cái), 陳智偉, 彭筱琦, 廖麗玲, 袁國(guó)芳 申請(qǐng)人:食品工業(yè)發(fā)展研究所