專利名稱:一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的dreb類轉(zhuǎn)錄因子的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因及其應(yīng)用,更具體地說(shuō)是具有調(diào)控楊柳科樹(shù)種中的寧1號(hào)雜交楊(Populua alba L.×P.bolleanaLauche.)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的編碼核酸及其用于轉(zhuǎn)基因育種的應(yīng)用,屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
目前已知轉(zhuǎn)錄因子在生物的生命活動(dòng)中起著非常重要的作用,它不僅參與了生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育,同時(shí)也調(diào)控著生物體對(duì)外界逆境如干旱、高鹽、低溫、病原物侵染等的應(yīng)答反應(yīng)。植物中調(diào)控對(duì)外界干旱、高鹽、低溫等逆境的應(yīng)答反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子DREB(drought-responsive element binding factor)自1998年(Liu等Plant Cell,1998,10(8)1391-1406)從擬南芥中被分離出來(lái)以來(lái),DREB已受到廣泛的關(guān)注和得到深入的研究,如目前除擬南芥外,已從小麥、大麥、油菜、番茄、菠菜、棉花、大豆等多種植物中分離到類似DREB的基因,這些基因也具有類似的功能。但是在楊樹(shù)領(lǐng)域,還鮮有這方面的報(bào)道。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展,分離新的基因和將新的基因?qū)胫参镏衼?lái)改良植物的遺傳性狀已成為可能。植物的抗鹽、旱和低溫應(yīng)答涉及到許多基因的上調(diào)表達(dá),在這些上調(diào)表達(dá)的基因中有許多受到轉(zhuǎn)錄因子DREB的調(diào)控。
楊樹(shù)分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、是重要的造林樹(shù)種,具有相當(dāng)高的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益;還在水土保持和維護(hù)生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用,是防風(fēng)固沙、退耕還林、城市綠化、美化環(huán)境可大力發(fā)展的環(huán)保型樹(shù)種。但是楊樹(shù)的種植受到越來(lái)越嚴(yán)重的水資源缺乏、土地鹽漬化的影響,給栽種范圍和栽種后的管理帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。因此開(kāi)展楊樹(shù)的抗非生物逆境(干旱、鹽漬化、低溫等)育種是楊樹(shù)育種的一個(gè)重要方面。在楊樹(shù)上,DREB類基因的克隆還沒(méi)有見(jiàn)到報(bào)道,利用DREB基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)楊樹(shù)品種進(jìn)行遺傳改良是一個(gè)很有前景的楊樹(shù)育種方向。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼這種轉(zhuǎn)錄因子的基因的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因(PaDREB),其具有序列表No.1所示的堿基序列。
序列表No.1所示的堿基序列所編碼的具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子。
本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入研究,分離并得到了寧1號(hào)雜交楊的DREB cDNA,并確定了其堿基序列。并將該cDNA的編碼區(qū)構(gòu)建到特定的載體中,把重組的特定載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞中激活了特定報(bào)告基因的表達(dá),從而鑒定出該cDNA編碼的DREB轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活功能。
編碼具有調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因用于轉(zhuǎn)基因植物育種的應(yīng)用。植物抗鹽、旱、寒性屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀,是多種耐逆機(jī)制共同作用的結(jié)果。PaDREB轉(zhuǎn)錄激活因子是一個(gè)受高鹽、干旱和低溫誘導(dǎo)的反式作用因子,能與基因的啟動(dòng)子區(qū)的DRE調(diào)控元件特異結(jié)合,促進(jìn)啟動(dòng)子中含有這一元件的多個(gè)高鹽或干旱、低溫誘導(dǎo)的基因表達(dá),從而激活植物體內(nèi)的多種抗逆機(jī)制。
所述的轉(zhuǎn)基因植物為楊柳科楊屬的楊樹(shù)樹(shù)種。PaDREB轉(zhuǎn)錄激活因子在楊樹(shù)的高鹽、干旱和冷誘導(dǎo)處理中表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)特征。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是PaDREB轉(zhuǎn)錄激活因子能夠激活植物體內(nèi)的多種抗鹽、抗旱、耐低溫機(jī)制,涉及多種啟動(dòng)子區(qū)具有DRE調(diào)控元件的基因表達(dá)。因此,PaDREB轉(zhuǎn)錄激活因子為基因工程改良植物抗逆性提供了一種全新的技術(shù)途徑,在造林樹(shù)種楊樹(shù)的抗鹽、抗旱、耐寒性的綜合改良過(guò)過(guò)程中具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明,凡依照以下內(nèi)容所作的任何本領(lǐng)域的等同替換均屬于對(duì)本發(fā)明專利權(quán)的侵犯。
圖1為鹽脅迫下PaDREB基因的表達(dá)模式圖,上方為real time RT-PCR結(jié)果,下方為內(nèi)參actin RT-PCR結(jié)果圖2為干旱脅迫下PaDREB基因的表達(dá)模式圖,上方為real time RT-PCR結(jié)果,下方為內(nèi)參actin RT-PCR結(jié)果圖3為冷脅迫下PaDREB基因的表達(dá)模式圖,上方為real time RT-PCR結(jié)果,下方為內(nèi)參actinRT-PCR結(jié)果圖4為PaDREB轉(zhuǎn)錄激活載體的構(gòu)建方法5-1至圖5-3為PaDREB蛋白轉(zhuǎn)錄激活功能的檢測(cè)結(jié)果圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)操作,詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版),本申請(qǐng)發(fā)明人克隆到了寧1號(hào)雜交楊的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的cDNA,并確定了其堿基序列(命名為PaDREB)。
實(shí)施例1、PaDREB cDNA的分離1、植物材料準(zhǔn)備、脅迫處理、總RNA的分離采用由寧夏農(nóng)科院提供的寧1號(hào)雜交楊(Populua alba L.×P.bolleana Lauche.)的試管苗,將繼代的叢生芽轉(zhuǎn)接到MS生根培養(yǎng)基上,在25℃恒溫與16小時(shí)光照周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)20天左右,植株生長(zhǎng)健壯,根系長(zhǎng)約7-8cm時(shí),準(zhǔn)備用于干旱、高鹽、低溫等脅迫處理。
將生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)的試管苗從培養(yǎng)基中取出,用清水沖洗干凈須根上的培養(yǎng)基,盡可能的減少對(duì)根系的損傷,然后對(duì)植株分別進(jìn)行干旱、高鹽和低溫等脅迫處理。干旱脅迫處理是在22℃溫度下,把植株放置在干凈的足夠厚度的濾紙上使其脫水;高鹽脅迫處理是在22℃溫度下,把植株的根系浸泡在250mM NaCl水溶液中;低溫脅迫處理是在22℃溫度下,把植株的根系浸泡在4℃預(yù)冷的純水中。各處理經(jīng)過(guò)5小時(shí)后分別取樣,立即在液氮中冷凍,保存于-80℃的超低溫冰箱中,待用于RNA的提取。
用Invitrogen公司的TRIzol reagent進(jìn)行各種處理材料的總RNA提取,整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照TRIzol試劑的RNA提取流程說(shuō)明,在無(wú)RNA酶條件下進(jìn)行,并分裝成小份凍存在-80℃下備用。
2、PaDREB AP2保守區(qū)序列的獲得利用反轉(zhuǎn)錄PCR法得到PaDREB的AP2保守區(qū),所用合成引物的序列如下正向引物5’T(T/A)C,AG(A/C),GGG,ATA,(A/C)GG,ATG,(A/C)G 3’反向引物5’TC(A/G),G(G/C)G,AAG,TTG,AG(G/C),C(A/T)G,GC 3’反應(yīng)體系及參數(shù)10×PCR buffer 5μldNTP(10mM) 5μlMgCl2(20mM) 10μlRNase Inhibitor1μlM-MLV(200U/μl)1μl
Taq酶(2.5U/μl) 1μl (TaKaRa公司)正向引物(10μM) 2μl反向引物(10μM) 2μl模板DNA(1~10ng/μl)2μlH2O(滅菌超純水)21μl反應(yīng)條件50℃ 40分鐘94℃ 3分鐘94℃ 30秒/51.7℃30秒/72℃30秒(33次循環(huán))72℃ 10分鐘使用377DNA Sequencer(Applied Biosystems公司測(cè)定,AP2保守區(qū)的堿基序列如下TACAGAGGAGTGAGACAGAGGACATGGGGGAAGTGGGTTGCTGAGATTCGGGAACCAAACAAAGGCCCTAGGCTATGGCTTGGTACTTTTCCTACTGCCTACGAAGCTGCTCTTGCCTATGATGAAGCTGCACGAGCTATGTATGGCTCGTATGCTCGTTTAAATGTTCCTGA3、同源的EST搜索分析依據(jù)上述PaDREB的AP2保守區(qū)序列,通過(guò)NCBI的BLAST搜索得到一個(gè)序列號(hào)為gi|24103730|gb|BU892665.1|BU892665的EST片段,該片段經(jīng)DNAman軟件分析后具有DREB類基因的保守序列和完整的5`端編碼區(qū)。
4、保守區(qū)的3`RACE擴(kuò)增依據(jù)上述PaDREB的AP2保守區(qū)序列進(jìn)行3`RACE的引物設(shè)計(jì),采用TAKARA的RACE試劑盒進(jìn)行RACE擴(kuò)增,所得條帶用377DNA Sequencer確定其堿基序列,得到了PaDREB的3`端全序列。
所合成的3`RACE引物序列如下PRIMER1 5`CAGAGGAGTGAGACAGAGGAC3`PRIMER2 5`TCGGGAACCAAACAAAGG 3`5、PaDREB全長(zhǎng)的獲得將3`RACE所得的序列和EST序列經(jīng)DNAman軟件分析拼接,合成一組引物,通過(guò)RT-PCR進(jìn)行PaDREB全長(zhǎng)的擴(kuò)增,所得條帶用377DNA Sequencer確定其堿基序列。所確定的PaDREB堿基序列如序列表No.1所示所合成的PaDREB全長(zhǎng)擴(kuò)增引物序列如下PRIMER1 5`TGTAGTTTGGCTGTACTGGG3`PRIMER2 5`TCCCTTCTAAACCATGCG3`實(shí)施例2、干旱、高鹽及低溫脅迫下PaDREB基因的表達(dá)模式將上述方法(實(shí)施例1)培養(yǎng)的寧1號(hào)雜交楊幼苗分別用干旱、高鹽和低溫條件處理將寧1楊無(wú)菌苗從培養(yǎng)瓶中取出,去除根上帶有的培養(yǎng)基(盡量不要傷根),然后分別進(jìn)行干旱和鹽處理。干旱處理是將上述材料放在鋪有足夠厚的吸水紙的培養(yǎng)瓶中,鹽處理是將上述材料的根浸在250mMNaCl溶液中,低溫處理是將生長(zhǎng)在培養(yǎng)瓶中的材料直接放在冰上,分別于1、3、5、8、12、24和48小時(shí)取材料,準(zhǔn)確稱量0.1克,并立即用液氮速凍,置于-80℃冰箱中用于總RNA的分離。
采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒提取總RNA,提取方法完全按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。提取的RNA凍存在-80℃下備用。
用TAKARA公司的real time one step RT-PCR kit,對(duì)PaDREB基因在干旱、高鹽及低溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,PaDREB基因是受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的。在干旱處理誘導(dǎo)下,1h就有明顯的表達(dá),隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量升高,高峰出現(xiàn)在24h,在48h時(shí)表達(dá)已經(jīng)明顯減弱。在高鹽處理誘導(dǎo)下,該基因的表達(dá)情況與干旱處理誘導(dǎo)下的表達(dá)情況一致。在冷處理誘導(dǎo)下,1h時(shí)就有明顯表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量升高,高峰出現(xiàn)在8h,以后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量急劇降低(如圖1、2、3所示)。
實(shí)施例3、PaDREB轉(zhuǎn)錄激活載體的構(gòu)建和PaDREB蛋白轉(zhuǎn)錄激活功能的檢測(cè)將插入到PGEM-T easy載體(購(gòu)自Promega公司)上的PaDREB基因,用限制性內(nèi)切酶Not I從重組PGEM-T easy載體上切下全長(zhǎng)PaDREB基因,插入到Y(jié)EpGAP112的相應(yīng)位置,經(jīng)檢測(cè)無(wú)誤后,轉(zhuǎn)化入含雙報(bào)道子的酵母菌株4271(Clontech公司)中(如圖4所示)。用含3-AT的SD-Agar三缺培養(yǎng)基(即His-、Trp-、Ura-培養(yǎng)基,Clontech公司)檢測(cè)其生長(zhǎng)情況,結(jié)果在含野生型DRE元件的酵母菌株中,PaDREB與對(duì)照DREB1A(Liu等Plant Cell,1998,10(8)1391-1406)同樣可以在3-AT-SD-Agar三缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(如圖5所示)。而含轉(zhuǎn)錄因子的DRE元件突變酵母菌及不含轉(zhuǎn)錄因子的DRE元件正常酵母菌,不能正常生長(zhǎng)。說(shuō)明PaDREB蛋白可以特異結(jié)合DRE元件,激活DRE元件下游目的基因表達(dá),具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
序列表<110>北京揚(yáng)華生物科技股份有限公司<120>一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因及其應(yīng)用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1181<212>mRNA<213>楊柳科楊屬(Populua alba L.×P.bolleana Lauche)<400>1tgtagtttgg ctgtactggg atcaaaattg ttgggttctg agattgagaa aatgggtact 60cttgatcaag attctaaagc tacttctatg cctatggatt ctactaagaa gaggaaaagg120gtaagcagta aatctgtagc cgagaccctt aaaaagtgga aggagtataa tgagtatctt180gattctcaag gtgatggagg taataaacca gttcgtaaag ttcctgccaa gggctcaaag240aaagggtgta tgaaaggtaa aggaggacca gagaattcag tctgcaatta cagaggagtg300agacagagga catgggggaa gtgggttgct gagattcggg aaccaaacaa aggccctagg360ctatggcttg gtacttttcc tactgcctac gaagctgctc ttgcctatga tgaagctgca420cgagctatgt atggctcgta tgctcgttta aatgttcctg atgtgctgaa ttcaacaagc480tcatcgaagg acaacttctc ctcagcgaca ccgtcttgct attctccagc agcgagttct540gcggactccg ctactacatc aacccactcc gaggtctgcg tgtatgagga tcctaagcag600aatgtatcca gccaagctga ggttcttgcg catcatatat caagccaaca acatattgag660gatggttcgc agggagttga aaatagcacg ctgagggacg agcagcagag tcaatcagaa720aatcctttgt ggactccatc agaaaattcc ttgtggaccg atgactggca cagctacccg780atggatgaaa tatttagctt tgatgagttg ctagggggtg ttgatgaggg gatgatgggg840gcagaagggt acttcaactt gggattttga tagctctgga gcgctttctt gaggaagcta900ttgcttgtgc tttgtgctgg ttgaagggtt tataaatttt aatgtaaaac tggtttcttg960
gtcccttgct ttgcattttg caaactagaa gtccaatttg aaaagaaatt gtcaattatt1020aactgatgtt aggaaacaaa ctagagttat tgatctttta ctgtttactt ggtgggcatt1080gcgaagtttt cgcatggttt agaagggatt catttgtgta gggctaatta aaatttgcaa1140tttgcaaatt gcaatttgca gtgtttgtta aaaaaaaaaa a118權(quán)利要求
1.一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因,其具有序列表No.1所示的堿基序列。
2.序列表No.1所示的堿基序列所編碼的具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控楊樹(shù)抗旱、寒、鹽性的轉(zhuǎn)錄因子。
3.編碼具有調(diào)控楊樹(shù)抗旱、寒、鹽性的轉(zhuǎn)錄因子的基因用于轉(zhuǎn)基因植物育種的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)編碼調(diào)控楊樹(shù)抗鹽、旱、寒性的DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基因,其具有序列表No.1所示的堿基序列,屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是PaDREB轉(zhuǎn)錄激活因子能夠激活植物體內(nèi)的多種抗鹽、抗旱、耐低溫機(jī)制,涉及多種啟動(dòng)子區(qū)具有DRE調(diào)控元件的基因表達(dá)。因此,PaDREB轉(zhuǎn)錄激活因子為基因工程改良植物抗逆性提供了一種全新的技術(shù)途徑,在造林樹(shù)種楊樹(shù)的抗鹽、抗旱、耐寒性的綜合改良過(guò)過(guò)程中具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1796560SQ200410101518
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者劉敬梅, 賈志平, 張海超, 秦紅霞 申請(qǐng)人:北京揚(yáng)華生物科技有限公司