專利名稱：一種100bp梯度核糖核酸分子量標(biāo)志物及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，制備100bp梯度的DNA分子量標(biāo)志物，屬于分子生物學(xué)試劑制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在DNA合成及各種方式的基因操作過程中，需要對合成的或進(jìn)行操作的DNA分子大小變化進(jìn)行監(jiān)測，常用的方法是通過將待測DNA分子與一種已知分子量的DNA混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同時進(jìn)行電泳，通過比較待測DNA分子與DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在電泳過程中的遷移程度來判斷待測DNA分子的大小。因此，需要制備一些已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA。制備標(biāo)準(zhǔn)DNA的方法有多種化學(xué)合成法通過化學(xué)反應(yīng)的方法將4種不同的脫氧核糖核苷酸腺嘌呤(dATP)，鳥嘌呤(dGTP)，胞嘧啶(dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)結(jié)合在一起，合成目標(biāo)大小的DNA片段，該方法操作十分繁瑣，效率極低，合成的DNA長度受到嚴(yán)重的限制，一般可合成DNA的長度不超過400bp，大分子量的DNA片段無法直接用化學(xué)合成法來合成。
片段連接法先用化學(xué)合成法合成一些小分子量的DNA分子，再用酶促連接反應(yīng)將小分子DNA一個一個逐步連接起來，形成不同大小的DNA分子。理論上講可以制備各種大小的DNA分子，但操作卻十分繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備。
酶解法用一種或兩種限制性內(nèi)切酶對噬菌體DNA(如φχ174)，質(zhì)粒DNA(PBR322)進(jìn)行切割，產(chǎn)生不同大小的DNA片段，作為分子量標(biāo)志，該方法的缺點(diǎn)是酶切產(chǎn)生的DNA片段大小受到所用的限制性酶種類的限制，DNA分子的制備和純化過程比較復(fù)雜，成本高且產(chǎn)率低。
聚合酶鏈反應(yīng)法DNA聚合酶鏈反應(yīng)已廣泛用于基因克隆和DNA片段的制備。經(jīng)查閱國內(nèi)專利文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)有以質(zhì)粒PBR322為模板，設(shè)計11對特異性引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)，制備由11條DNA帶組成的100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于聚合酶鏈反應(yīng)的原理提供一種DNA分子量標(biāo)志物及其快速制備的方法。本發(fā)明制備的產(chǎn)物作為分子量參照物，用于分子生物學(xué)實(shí)驗中對DNA分子大小的變化進(jìn)行監(jiān)測。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物是由100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp，共11條DNA條帶組成的混合物，溶于三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉組成的緩沖液(TE溶液)中，每條DNA帶的終濃度為4ng/μl。在進(jìn)行DNA電泳時，取3-5μl分子量標(biāo)志物與待檢測樣本同時進(jìn)行電泳，電泳一段時間后，分子量標(biāo)志物會在瓊脂糖凝膠上產(chǎn)生11條清晰的、分子量大小不同的DNA條帶。該分子量標(biāo)志物的制備是通過如下技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，包括模板DNA(質(zhì)粒PBR322)，11對特異性引物，Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶緩沖液，4種脫氧核糖核苷酸(dTTP，dATP，dCTP，dGTP)，無離子水，PCR儀，瓊脂糖凝膠，溴化乙啶，溴酚蘭，0.25ml離心管，凝膠電泳槽及電泳電源，紫外光燈，紫外分光光度計。取11個無菌的0.25ml的離心管，在每一個離心管中將模板DNA與相應(yīng)DNA條帶的一對特異性引物混合，在有Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶緩沖液、4種脫氧核糖核酸存在的條件下，在PCR儀上，在同一個PCR擴(kuò)增條件下，對11條DNA片段同時進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，30個循環(huán)后，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。從每個反應(yīng)管中取少量的樣品在含有溴化乙啶的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，在紫外線燈上觀察合成的DNA片段的大小及純度。在確定擴(kuò)增產(chǎn)物符合目標(biāo)大小，并且具有高度的特異性后，用酚∶氯仿為1∶1的混合溶劑抽提，去除其中的蛋白質(zhì)成份；用乙醇沉淀法沉淀DNA分子，干燥沉淀物。用一定體積的TE溶液溶解沉淀的DNA，用紫外分光光度計測定DNA溶液的濃度。將11條DNA條帶按每條的終濃度為4ng/μl的比例混合，即可制成100bp梯度的DNA分子量標(biāo)志物。
聚合酶鏈反應(yīng)原理在微量離心管中，加入適量的緩沖液，微量的模板DNA，4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)溶液，TaqDNA聚合酶，和一對特異性引物，將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下(如95℃)變性，雙鏈解鏈成單鏈；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下(如37℃)與模板DNA互補(bǔ)退火，形成部分的雙鏈；溶液溫度再升至中溫(如72℃)，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，以結(jié)合在單鏈模板DNA上的引物為合成起點(diǎn)，按模板DNA鏈堿基的配對要求，合成其互補(bǔ)鏈，這樣一條雙鏈分子便變成兩條雙鏈分子。如此反復(fù)按順序改變反應(yīng)溫度，即高溫變性，低溫退火和中溫延伸合成，這樣三次溫度改變?yōu)橐粋€循環(huán)，每經(jīng)過一次循環(huán)使反應(yīng)管中的特異區(qū)段的DNA數(shù)目增加1倍。一般樣品經(jīng)過30次左右的循環(huán)擴(kuò)增，最終使原始的模板DNA數(shù)量增加到數(shù)百萬倍。可以在短時間內(nèi)大量生產(chǎn)某種DNA分子。
一、材料1質(zhì)粒PBR322為通用質(zhì)粒，為閉環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)DNA，全長為4361bp，其核苷酸序列如下所示，該質(zhì)粒保存在大腸桿菌Ecoli JM109中，購自美國PROMEGA公司。
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa60ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 420aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 480cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 540actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 600caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 660gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 720cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 780ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 840tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 900acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt 960cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc 1020cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca 1080tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc 1140gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat 1200tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg 1260ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga 1320attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac 1380
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重蒸酚，氯仿，70％冷乙醇，無水乙醇，蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，瓊脂粉，無離子水。
3設(shè)備微量移液器，PCR儀，紫外熒光燈，紫外分光光度計，低溫高速離心機(jī)，電泳儀，溫箱，恒溫?fù)u床，振蕩混勻器。
二、試劑配制LB肉湯蛋白胨1.0gNaCl 1.0g酵母抽提物0.5g調(diào)PH值至7.2-7.4，加無離子水至100ml。高壓滅菌。
LB平板蛋白胨1.0gNaCl 1.0g酵母抽提物0.5g瓊脂粉1.2g調(diào)PH值至7.2-7.4，加無離子水至100ml。高壓滅菌，冷卻到55℃鋪平皿。
TE緩沖液Tris10mM(PH 8.0)EDTA-Na21mM
TBE緩沖液Tris-硼酸 0.045M(PH8.0)EDTA-Na20.001M凝膠載樣緩沖液溴酚蘭 0.25％蔗糖 40％(w/v)1％瓊脂糖凝膠在一個250ml的錐形瓶中，加入100ml TBE緩沖液，1.0g瓊脂糖，混勻后在微波爐或電爐上加熱溶解，待瓊脂糖完全融化后冷卻到60℃，加入溴化乙啶至終濃度為0.5μg/ml，然后在插有梳子的凝膠槽中灌制凝膠，冷卻后即可使用。
三、引物設(shè)計與合成11條DNA帶的PCR擴(kuò)增用引物均為本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)質(zhì)粒PBR322的DNA序列，用引物設(shè)計軟件primer express進(jìn)行設(shè)計。分別如下100bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGATGCAGATCCGGAACA-3′ 1678-1661200bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GTATGGATGCGGCGGGACCA-3′ 1778-1759300bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GGTAATGATACCGATGAAACGA-3′ 1878-1857400bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GCGTTAATGTCTGGCTT-3′1978-1962500bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGCGCGAGGCAGCT-3′ 2078-2065600bp 正向引物5′-CTCCCTCGTG CGCTCTCCTGTTCC-3′2642-2665反向引物5′-TTAATTTAAAAGGATCTAGGTG-3′ 3239-3218700bp 正向引物5′-CCGTGTATGAAATCTAACAAT-3′80-100反向引物5′-GCTGCCGGCACCTGTCCTACG-3′777-757800bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGAGTCAGTGAGCGAGGA-3′ 2378-2361900bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-ACATGTTCTTTCCTGCGTT-3′ 2478-24601000bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGTCGATTTTTGTGATGCT-3′ 2578-25601200bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598
反向引物5′-GCTTGGAGCGAACGACCTAC-3′ 2778-2759引物合成由上海博亞生物制品有限公司合成，合成后的干粉樣引物用無離子水溶解成濃度為12.5μM的溶液。


圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果1.100bp，2.200bp，3.300bp，4.400bp，5.500bp，6.600bp，7.700bp，8.800bp，9.900bp，10.1000bp，11.1200bp。
圖2 100bp梯度DNA標(biāo)志物實(shí)物的電泳圖譜。
圖3實(shí)施例2的圖示1.菌落1的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2.菌落2的PCR擴(kuò)增結(jié)果，3，DNA分子量標(biāo)志。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的制備方法，具體包括如下步驟。
1質(zhì)粒PBR322DNA的制備將含有質(zhì)粒PBR322的細(xì)菌接種到3ml LB肉湯培養(yǎng)基中(含有氨芐青霉素100μg/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。以12000g離心收集細(xì)菌，再用質(zhì)粒DNA純化試劑盒純化PBR322質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA提取的過程按試劑盒的說明書進(jìn)行。
2.DNA條帶的制備-聚合酶鏈反應(yīng)取11個0.25ml的PCR用薄壁離心管，分別標(biāo)上100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp的標(biāo)志，按以下方案，在每個管中加入聚合酶鏈反應(yīng)用的各種試劑10×Taq DNA聚合酶緩沖液10μl4×dNTP8μl正向引物 2μl反向引物 2μlPBR322 DNA 1μl(50ng)無離子水 75μl蓋好蓋子后，混勻，在100℃水浴中煮沸變性10min，冷卻后短暫離心，收集管壁上的冷凝水，并置于冰上，加入2μl的Taq DNA聚合酶(3U)，最終的反應(yīng)體積為100μl。將反應(yīng)管插入PCR儀(PE2400)的孔槽中進(jìn)行DNA擴(kuò)增，按如下溫度設(shè)置擴(kuò)增條件變性94℃ 10sec退火50℃ 20sec
延伸72℃50sec循環(huán)次數(shù)為30，最后72℃保溫7min，終止反應(yīng)。
3聚合酶反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(TBE)，使凝膠浸于液面下約3-5mm。將每個擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl與2μl凝膠載樣緩沖液混合，加入凝膠孔中。以1-5V/cm的電壓進(jìn)行電泳，使樣本向陰極移動，當(dāng)溴酚藍(lán)移到凝膠的三分之二處時停止電泳。將凝膠放在紫外燈上，觀察擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果如圖1。
4.DNA純化與濃度測定將每個含有單一DNA條帶的樣品轉(zhuǎn)移到一個干凈無菌的1.5ml的離心管中，加入1倍體積的重蒸酚，1倍體積的氯仿，在振蕩混勻器上混勻30sec，再以12000g的速度離心10min，小心將上層含有DNA的水相液體轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，再分別加入等體積的重蒸酚，氯仿，振蕩混勻后，以同樣的速度離心，將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的離心管中，再加入2倍體積的氯仿，相同的方法再抽提一次，最后將上清液轉(zhuǎn)移到一新的干凈離心管中，加入2倍體積的冷乙醇(-30℃)，顛倒混勻，置于-80℃冰箱中沉淀15min，或-30℃冰箱中沉淀2h，再以12000g的速度在4℃離心15min，倒掉上清液，用70％的冷乙醇輕輕洗滌沉淀和管壁，小心倒掉乙醇，將有DNA沉淀的離心管放在室溫下干燥10-20min，至DNA沉淀物開始變白為止，用10-50μl TE溶液溶解沉淀。
取DNA溶液2μl與98μl TE溶液混合，作50倍稀釋。在紫外分光光度計上，測定溶液在波長280nm和260nm處的吸光度A值。計算溶液中DNA的實(shí)際濃度。
DNA濃度＝A值×50mg/ml×50(稀釋倍數(shù))，[1AOD280＝50mg/ml]DNA的純度A260/A280＝1.8-2.05.100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的構(gòu)建設(shè)定每只100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的總量為100μl，每個DNA片段的終濃度是4ng/ul，每次的用量為5μl，其中100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bpDNA帶的量均為20ng。根據(jù)每種DNA片段溶液的啟始濃度，按照以上設(shè)定要求，將11條片段混合到一起，組成100bp梯度的DNA分子量標(biāo)志物，如圖2。
實(shí)施例2用于鑒定陽性克隆菌落用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)化平板上菌落1和菌落2，分別懸浮于無離子水中，煮沸裂解。以此裂解為模板，使用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5μl本發(fā)明的分子量標(biāo)志物和菌落1、菌落2的擴(kuò)增產(chǎn)物各10μl，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束，在紫外光下觀察結(jié)果。結(jié)果表明，菌落1的擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生分子量在700-800bp的單一DNA條帶，與被克隆的目標(biāo)基因大小相似，初步證明該菌落為陽性克隆菌落，而菌落2的擴(kuò)增產(chǎn)物沒有任何的DNA條帶出現(xiàn)，證明該菌落為陰性克隆菌落。如圖3。
權(quán)利要求
1.一種100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物，其特征是由11條DNA帶組成的混合物，每條DNA帶的終濃度為4ng/μl，11條DNA帶是以質(zhì)粒PBR322為模板DNA，用11對特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，所得DNA帶的長度分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp。
2.如權(quán)利要求1所述100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的制備方法，其特征是以質(zhì)粒PBR322為模板DNA，用11對特異性引物，在有Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸dTTP、dATP、dCTP、dGTP存在的條件下，在PCR儀上，在同一個PCR擴(kuò)增條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，同時合成11條DNA片段，所得DNA帶的長度分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp，再經(jīng)純化、混合而成；(1)模板DNA采用質(zhì)粒PBR322的DNA；(2)11條DNA帶的引物DNA序列100bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGATGCAGATCCGGAACA-3′ 1678-1661200bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GTATGGATGCGGCGGGACCA-3′1778-1759300bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GGTAATGATACCGATGAAACGA-3′ 1878-1857400bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GCGTTAATGTCTGGCTT-3′ 1978-1962500bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGCGCGAGGCAGCT-3′ 2078-2065600bp正向引物5′-CTCCCTCGTG CGCTCTCCTGTTCC-3′ 2642-2665反向引物5′-TTAATTTAAAAGGATCTAGGTG-3′ 3239-3218700bp正向引物5′-CCGTGTATGAAATCTAACAAT-3′ 80-100反向引物5′-GCTGCCGGCACCTGTCCTACG-3′ 777-757800bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGAGTCAGTGAGCGAGGA-3′2378-2361900bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′1581-1598反向引物5′-ACATGTTCTTTCCTGCGTT-3′ 2478-24601000bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′1581-1598反向引物5′-CGTCGATTTTTGTGATGCT-3′ 2578-25601200bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′1581-1598反向引物5′-GCTTGGAGCGAACGACCTAC-3′ 2778-2759每條引物溶液的濃度為12.5μM；(3)DNA條帶的制備-聚合酶鏈反應(yīng)取11個0.25ml的PCR用薄壁離心管，分別標(biāo)上100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp的標(biāo)志，按以下方案，在每個管中加入聚合酶鏈反應(yīng)用的試劑10×TaqDNA聚合酶緩沖液 10μl4×dNTP 8μl正向引物 2μl反向引物 2μlPBR322 DNA 1μl，為50ng，無離子水 75μl蓋好蓋子后，混勻，在100℃水浴中煮沸變性10min，冷卻后短暫離心，收集管壁上的冷凝水，并置于冰上，加入2μl的3U Taq DNA聚合酶，最終體積為100μl，將反應(yīng)管插入PCR儀的孔槽中進(jìn)行DNA擴(kuò)增，按如下溫度設(shè)置擴(kuò)增條件變性 94℃ 10sec退火 50℃ 20sec延伸 72℃ 50sec循環(huán)次數(shù)為30，最后72℃保溫7min，終止反應(yīng)；(4)聚合酶反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使凝膠浸于液面下約3-5mm，將每個擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl與2μl凝膠載樣緩沖液混合，加入凝膠孔中，以1-5V/cm的電壓進(jìn)行電泳，使樣本向陰極移動，當(dāng)溴酚蘭移到凝膠的三分之二處時停止電泳，在紫外燈上觀察PCR產(chǎn)物的純度及產(chǎn)量；(5)DNA純化與濃度測定用酚∶氯仿為1∶1的混合溶劑抽提，去除其中的蛋白質(zhì)成份，用乙醇沉淀法沉淀DNA分子，干燥沉淀物，用一定體積的三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二鈉組成的緩沖液溶液溶解沉淀的DNA，用紫外分光光度計測定DNA溶液的濃度。(6)100bp梯度DNA分子量標(biāo)志物的構(gòu)建將100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp共11條DNA混合，使各條帶的終濃度為4ng/μl。
全文摘要
一種100bp梯度核糖核酸(DNA)分子量標(biāo)志物及其制備，屬于分子生物學(xué)試劑制備技術(shù)領(lǐng)域。該分子量標(biāo)志物是由11條DNA條帶組成的混合物，11條DNA帶的長度分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp，每條DNA帶的濃度為4ng/μl。其制備方法為以質(zhì)粒PBR322為模板DNA，用11對特異性引物，在有Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶緩沖液、4種脫氧核榶核苷酸(dTTP、dATP、dCTP、dGTP)存在的條件下，在PCR儀上，在同一個擴(kuò)增條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，同時合成11條DNA片段，再經(jīng)純化、混合而成。本發(fā)明的特點(diǎn)是能按預(yù)定目標(biāo)快速、精確、大量地制備用于DNA分子量標(biāo)志物的不同長度的DNA分子。
文檔編號C12N15/11GK1654650SQ20041010320
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者余傳信, 殷旭仁 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所