專利名稱：快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的臨床檢測技術(shù)，具體涉及一種快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變的方法。利用該基因檢測方法不僅能夠快速檢測肺癌病人腫瘤組織DNA某些區(qū)域中的點突變，更重要的是可以預(yù)測治療非小細胞性肺癌新藥——吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]對病人是否有療效，指導(dǎo)臨床用藥，真正做到對癥下藥。
背景技術(shù)：
肺癌在中國是發(fā)病率最高的腫瘤，致病因素主要是吸煙。據(jù)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計有85％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸煙造成的。而其它可造成肺癌發(fā)病的因素還包括一些與工業(yè)致癌物的接觸，如石棉、砷、鈾、鎳、鉻酸鹽等以及室內(nèi)空氣被氡氣及福爾馬林(甲醛)污染等。
肺癌在組織學(xué)上分為4種類型鱗癌、腺癌、大細胞肺癌以及小細胞肺癌。這4種肺癌在臨床上也可簡單地歸納為非小細胞肺癌(前3種)和小細胞肺癌兩種。從目前的醫(yī)療水平看，純西醫(yī)治療效果總的來說，大約只有13％的肺癌病人(男性12％，女性16％)診斷后治療存活5年及5年以上，而非小細胞肺癌病人的5年生存率大約為15％。據(jù)統(tǒng)計在肺癌病人中，大約有75％是非小細胞肺癌。
根據(jù)現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究成果，表皮生長因子受體(EGFR)是一種受體酪氨酸激酶，表皮生長因子(EGF)與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合導(dǎo)致受體自身磷酸化并激活其激酶活性，通過一系列由磷酸化傳導(dǎo)的信號傳遞，形成激活細胞生存和分化的機制。在多種癌癥包括非小細胞肺癌中，表皮生長因子受體(EGFR)及其它一些蛋白激酶異?；罨蜻^高表達是這種機制的典型特征。
藥物化療法是目前治療非小細胞肺癌的有效方法，但也只能延長病人的壽命，并不能根治，而且伴隨著嚴(yán)重的副反應(yīng)。吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]是美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的治療對其它化療不敏感非小細胞肺癌病人的新藥。它是一種小分子化合物，其作用是特異性地結(jié)合在表皮生長因子受體(EGFR)的ATP結(jié)合區(qū)，并阻斷表皮生長因子受體(EFGR)的激酶活性。不過在臨床治療中，大多數(shù)非小細胞肺癌患者對吉非替林(Gefitinib)并不敏感。為此，哈佛醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的兩個研究小組通過研究，最近同時發(fā)現(xiàn)在幾乎所有對吉非替林治療有反應(yīng)的病人的腫瘤組織中，表皮生長因子受體(EGFR)基因含有特定的基因突變。這些突變都發(fā)生在表皮生長因子受體(EGFR)的第18，19，21外顯子里(第18外顯子點突變；第19外顯子一段堿基缺失性刪除突變；第21外顯子點突變L858R；第21外顯子點突變L861Q)，對應(yīng)于蛋白的激酶活性區(qū)，特別是ATP結(jié)合部位，病人一般含有一個或多個突變。而在其他沒有反應(yīng)的病人腫瘤組織中該基因里則沒有這些突變。研究表明這些突變在腺癌組織中的發(fā)生率有21％，其它形式的非小細胞肺癌只有2％。而在日本，26％的非小細胞性肺癌病人中有此類突變，比美國病人突變率高。更為顯著的是，日本女性腺癌病人中有50％具以上表皮生長因子受體(EGFR)突變?？梢酝茰y中國非小細胞肺癌病人中的突變率將與日本人相似。
上述新發(fā)現(xiàn)可以改變吉非替林(Gefitinib)的使用方法，使該藥品的使用更加科學(xué)有效，即檢測該基因突變情況可以預(yù)測病人是否對肺癌新藥吉非替林(Gefitinib)有反應(yīng)。具體是利用基因檢測的方法檢測病人腫瘤組織DNA中這些區(qū)域中的突變可以預(yù)測吉非替林(Gefitinib)是否對病人有療效，真正做到對癥下藥。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種廣泛使用于基因檢測的方法。利用PCR擴增上述表皮生長因子受體(EGFR)基因突變所在區(qū)片斷，然后用測序可檢查病人該基因是否有突變。但測序要分別測定表皮生長因子受體(EGFR)的第18，19，21三個外顯子片段，這種測定需要進行三次，不僅費時，而且成本較高；另外，測序需要測序儀，這種儀器非常昂貴，一般單位無力配備。因此，這種方法在臨床上難以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對第18，21兩個外顯子片段，提供一種簡便、快速的檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變的方法，以指導(dǎo)醫(yī)生對非小細胞性肺癌病人的臨床用藥。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，包括下列步驟(1)、準(zhǔn)備DNA①、從人體肺部采集病變組織；②、從病變組織中獲取DNA；(2)、對DNA進行擴增利用PCR擴增方法，采用下列三組對應(yīng)外顯子DNA片段的至少一組四引物進行擴增第18外顯子點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；內(nèi)源反義 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有義 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反義 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外顯子L858R點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；內(nèi)源反義 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外顯子L861Q點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；內(nèi)源反義 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具體步驟為①、將上述每組四引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨的反應(yīng)體系；②、分別對各反應(yīng)體系重復(fù)進行PCR循環(huán)，將DNA量擴增至凝膠電泳可觀察即可；(3)、凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對上述DNA擴增后的體系做凝膠電泳；(4)、觀測結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來判斷對應(yīng)外顯子位置是否發(fā)生點突變以及突變類型，具體判斷方法如下①、如果觀察到某外顯子泳帶中出現(xiàn)三條DNA條帶時，則判定有雜合子突變；②、如果觀察到某外顯子泳帶中僅出現(xiàn)兩條DNA條帶時，則用較小條帶的大小與下列對應(yīng)組中特異性產(chǎn)物的理論值對比，根據(jù)接近程度來判斷是純合子突變或是正常特異性，三組特異性產(chǎn)物的理論值如下A、第18外顯子點突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為
正常特異性產(chǎn)物大小198個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小270個堿基；非特異性產(chǎn)物大小420個堿基；B、第21外顯子L858R點突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小118個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小178個堿基；非特異性產(chǎn)物大小248個堿基；C、第21外顯子L861Q點突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小100個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小192個堿基；非特異性產(chǎn)物大小248個堿基。
上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下1、關(guān)于特異性DNA片段的PCR擴增PCR(polymerase chain reaction)擴增是一種體外擴增DNA片段的方法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。采用這種方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中只要有一個拷貝待擴增的DNA片段，在短時間內(nèi)就能擴增出大量拷貝數(shù)的特異性DNA片段。該方法廣泛應(yīng)用于基因檢測。
PCR擴增的基本原理是模仿細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程，以DNA互補鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過靶DNA變性、引物與模板DNA(待擴增DNA)一側(cè)的互補序列復(fù)性雜交、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴增的特異性DNA片段。一般反應(yīng)過程是1、將反應(yīng)體系加熱至90～95℃，模板雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA，作為互補鏈聚合反應(yīng)的模板；2、降溫至37～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈的3’一側(cè)的互補序列雜交(復(fù)性)；3、升溫至70～75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA鏈的互補鏈。重復(fù)以上過程，就可以出現(xiàn)待擴增的特異性DNA片段。由于上一次循環(huán)合成的兩條互補鏈均可作為下一次循環(huán)的模板DNA鏈，所以每循環(huán)一次，底物DNA的拷貝數(shù)增加一倍，因此PCR經(jīng)過n次循環(huán)后，待擴增的特異性DNA片段基本上達到2n個拷貝數(shù)。
2、上述方案中，為了獲得更好的PCR擴增效果，其PCR循環(huán)按以下條件進行


以上PCR循環(huán)次數(shù)較好的范圍為25～45次。
3、上述方案中，凝膠電泳采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2％瓊脂糖凝膠電泳。
4、上述方案中，“L858R”表示第21外顯子中所發(fā)生的一個突變，其中，L為突變前的亮氨酸；858為氨基酸在蛋白鏈中的位置，即突變所發(fā)生的位置；R為突變后的精氨酸?！癓861Q”表示第21外顯子中所發(fā)生的另一個突變，其中，L為突變前的亮氨酸；861為氨基酸在蛋白鏈中的位置，即突變所發(fā)生的位置；Q為突變后的谷氨酸胺。
本發(fā)明原理是三組四引物是設(shè)計用來檢測第18外顯子、第21外顯子(L858R)和第21外顯子(L861Q)中的已知位點的DNA點突變的一種簡便方法。其中，內(nèi)源有義引物是正?；蛱禺愋缘?；內(nèi)源反義引物是突變體特異性的。而外源有義引物和外源反義引物，則位于突變位點的上下游距離不等的地方。當(dāng)基因含有突變時，內(nèi)源反義引物與外源有義引物之間的片段被擴增出來。對正?；騺碚f，則內(nèi)源有義引物與外源反義引物之間的片段被擴增出來。這兩種不同的片斷的大小不一樣。而外源有義和外源反義引物之間的DNA總是要被擴增的，但不影響檢測判斷。此方法不需測序，只需要瓊脂糖水平電泳儀就足夠。不過，為了提高分辨率，建議使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。因為人有22對常染色體，表皮生長因子受體(EGFR)基因位有常染色體上，因此表皮生長因子受體(EGFR)基因有兩個拷貝(一個是父—染色體；一個是母—染色體)。以下結(jié)合


其工作原理和各種結(jié)果。
圖1表示的是純合子突變情況，即父—染色體和母—染色體這兩個拷貝的EGFR基因都有突變。產(chǎn)物1是以上兩個拷貝的外源有義與外源反義引物之間被擴增出來的DNA片段(是以上兩個拷貝同時被擴增的重合)，該片段是非特異性產(chǎn)物，它們總是要被擴增出來的，但不影響檢測判斷。產(chǎn)物2是以上兩個拷貝的外源有義與內(nèi)源反義引物之間被擴增出來的DNA片段(是以上兩個拷貝同時被擴增的重合)，是突變特異性產(chǎn)物，說明父—染色體和母—染色體這兩個拷貝的EGFR基因都有突變，而以上兩個拷貝的內(nèi)源有義與外源反義引物之間沒有被擴增出來，即沒有正常特異性產(chǎn)物，因此屬于純合子突變。
圖2表示的是雜合子突變情況，即父—染色體和母—染色體的兩個拷貝中有一個拷貝的EGFR基因有突變，而另一個正常。產(chǎn)物1與圖1中表示的完全相同，不重復(fù)描述。產(chǎn)物2是母—染色體拷貝中，外源有義與內(nèi)源反義引物之間被擴增出來的DNA片段，是突變特異性產(chǎn)物，說明母—染色體拷貝的EGFR基因有突變。產(chǎn)物3是父—染色體拷貝中，內(nèi)源有義與外源反義引物之間被擴增出來的DNA片段，是正常特異性產(chǎn)物，因此屬于雜合子突變。這里值得注意的是產(chǎn)物2與產(chǎn)物3的大小是不一樣的，這對將來判斷純合子突變和正常特異性具有意義(見發(fā)明內(nèi)容中的純合子突變或正常特異性判斷原則)。
圖3表示的是正常特異性，即父—染色體和母—染色體的兩個拷貝中的EGFR基因都沒有突變發(fā)生。產(chǎn)物1與圖1中表示的完全相同，不重復(fù)描述。產(chǎn)物2沒有，表示以上兩個拷貝的EGFR基因都沒有發(fā)生突變。產(chǎn)物3是以上兩個拷貝的內(nèi)源有義與外源反義引物之間被擴增出來的DNA片段(是以上兩個拷貝同時被擴增的重合)，是正常特異性產(chǎn)物，因此屬于正常特異性。
由以上原理可知，針對每個點突變本發(fā)明運用一組特殊設(shè)計的四種引物，利用PCR擴增后，通過凝膠電泳可直接觀察到產(chǎn)物的三種情況之一，這三種情況分別對應(yīng)純合子突變、雜合子突變和正常特異性，因此可以通過產(chǎn)物的數(shù)量和大小來判斷EGRF基因是否有點突變發(fā)生和突變的類型。對于每種情況，除了外源有義與外源反義引物之間的DNA總是要被擴增而外，每個拷貝只可能出現(xiàn)兩種可能，一種是外源有義與內(nèi)源反義引物之間的片段被擴增出來，表示對應(yīng)的拷貝中含有突變，另一種是內(nèi)源有義與外源反義引物之間的片段被擴增出來，表示對應(yīng)的拷貝屬于正?；?。上述三種情況是由父—染色體和母—染色體兩個拷貝在四引物作用下組合產(chǎn)生的，當(dāng)通過凝膠電泳觀察到三條DNA條帶時，根據(jù)圖2所示，可以判定有雜合子突變；當(dāng)觀察到兩條DNA條帶時，則要根據(jù)較小條帶的大小來判斷是純合子突變或是正常特異性。
已知肺癌EGFR基因突變包括外顯子18中的點突變，外顯子19中的在同一狹小區(qū)域的7種刪除突變(deletion)(從9bp到24bp)，外顯子21中的兩種點突變。應(yīng)用以上PCR四引物突變檢測方法可以檢測出外顯子18，21中是否有已知的點突變。由于有以上點突變和刪除突變的非小細胞性肺癌病人對吉非替林(Gefitinib)藥物均有反應(yīng)，因此本發(fā)明的應(yīng)用可以預(yù)測治療非小細胞性肺癌新藥——吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]對病人是否有療效，指導(dǎo)臨床用藥，所以具有積極意義。
由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點和效果1、本發(fā)明應(yīng)用特殊設(shè)計的引物，利用該基因檢測方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可直接觀察產(chǎn)物的數(shù)量和大小來判斷病人有無與吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]療效有關(guān)的EGRF基因點突變，及時指導(dǎo)臨床用藥，真正做到對癥下藥。
2、本發(fā)明簡單，不需測序。
3、本發(fā)明便宜，一般分子生物學(xué)實驗室或檢驗室就可操作。
4、本發(fā)明靈敏度高，可以檢測到測序漏診的病例。

附圖1為純合子突變示意圖；附圖2為雜合子突變示意圖；附圖3為正常特異性示意圖；附圖4為外顯子21(L858R)突變檢查測序圖譜，其中，上半部為病人DNA測序圖譜，下半部為正常DNA測序?qū)φ請D譜；附圖5本發(fā)明實施例凝膠電泳圖片；附圖6為外顯子21(L861Q)突變檢查測序圖譜，其中，上半部為病人DNA測序圖譜，下半部為正常DNA測序?qū)φ請D譜。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例一種快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，包括下列步驟第一步、腫瘤組織基因組DNA樣品準(zhǔn)備第一種新鮮組織或福爾馬林處理后組織試劑準(zhǔn)備緩沖溶液50mM Tris-HCl，pH8.020mM NaCl1mM EDTA1％ SDS10mg/ml蛋白酶K(Proteinase K)10mg Proteinase K溶于1mlddH2O。分裝，-20℃保存。使用時，在4℃融化。(最好是現(xiàn)配現(xiàn)用)。
(1)、取微量組織(≤米粒的1/4)，加入20uL上述溶液中(可冷凍保存)，在加入1uL 10mg/ml蛋白酶K。
(2)、在55℃溫育15分鐘，Vortex，再溫育15分鐘。(可用PCR管在PCR機器上完成)。加雙蒸水至200uL。
(3)、加熱至95℃，保持10分鐘，使蛋白酶K失活，降溫至4℃或室溫。
(4)、取1uL作為DNA模板。用于以下PCR反應(yīng)。
第二種組織切片組織切片中含有石蠟。與方法1相比，只多了除蠟這一步，具體如下取40um大小的切片加入100ul0.5％Tween-20，加熱至90度并保持10分鐘，冷卻至55度。
第二步、對DNA進行擴增利用PCR擴增方法，采用下列三組對應(yīng)外顯子DNA片段的后兩組四引物進行擴增第18外顯子點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；內(nèi)源反義 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有義 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反義 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外顯子L858R點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；內(nèi)源反義 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外顯子L861Q點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；內(nèi)源反義 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具體步驟為1、將上述每組四引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨的反應(yīng)體系，具體見下表


2、分別對各反應(yīng)體系重復(fù)進行PCR循環(huán)，將DNA量擴增至凝膠電泳可觀察即可。PCR循環(huán)條件見下表

第三步、凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對上述DNA擴增后的體系做凝膠電泳，可采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2％瓊脂糖凝膠電泳。
第四步、觀測結(jié)果圖5為2％瓊脂糖電泳圖片，如采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，分辨率會更高。圖5中，M泳帶為標(biāo)準(zhǔn)DNA大小值對照，第5泳帶為外顯子21(L858R)的結(jié)果，第6泳帶為外顯子21(L861Q)結(jié)果，注意所有泳帶中，條帶的大小，自上而下，由大變小。
而理論上，外顯子21(L858R)的大小分別為正常特異性產(chǎn)物大小為118個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小為178個堿基；非特異性產(chǎn)物大小為248個堿基。
外顯子21(L861Q)的大小分別為正常特異性產(chǎn)物大小100個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小192個堿基；非特異性產(chǎn)物大小248個堿基。
從圖片中可以看出，在第5泳帶中，自上而下可以很清楚地看到非特異性產(chǎn)物、突變特異性產(chǎn)物和正常特異性產(chǎn)物三條DNA條帶，則判定外顯子21(L858R)泳帶所對應(yīng)EGFR基因的DNA片段有雜合子突變。而在第6泳帶中，自上而下可以很清楚地看到兩條DNA條帶，其中，除了上方的非特異性產(chǎn)物條帶外，下方的較小條帶大小值與正常特異性產(chǎn)物的理論大小接近，由此可以判定外顯子21(L861Q)泳帶所對應(yīng)EGFR基因的DNA片段屬于正常特異性產(chǎn)物，沒有發(fā)生突變。
比較例參見圖4和圖6，通過測序檢查，此病人含有外顯子21(L858R)突變，但沒有L861Q突變。以上結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，結(jié)果表明此病人是雜合子突變。
值得說明的是，在圖4中的突變圖譜并不明顯，通常情況下，突變峰(黑)與正常峰(紅)應(yīng)該相同高度。這種情況是由于腫瘤標(biāo)本中混入了正常組織。經(jīng)克隆方法證實此病人確有該突變。在這種情況下，四引物法可以很清楚地檢測出突變。這也說明采用本發(fā)明方法進行檢測的正確性。
應(yīng)用檢測EGFR基因中的已知點突變方法，與檢測刪除突變的PCR方法相結(jié)合，可以同時檢測已知刪除突變和點突變。因為這些突變的有無，可以預(yù)測抗非小細胞肺癌新藥，吉非替林或易瑞沙，對病人的療效，所以此方法可以發(fā)展為試劑盒應(yīng)用于臨床檢測，造福病人。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，其特征在于包括下列步驟(1)、準(zhǔn)備DNA①、從人體肺部采集病變組織；②、從病變組織中獲取DNA；(2)、對DNA進行擴增利用PCR擴增方法，采用下列三組對應(yīng)外顯子DNA片段的至少一組四引物進行擴增第18外顯子點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；內(nèi)源反義GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有義GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反義CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外顯子L858R點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；內(nèi)源反義CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有義CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外顯子L861Q點突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；內(nèi)源反義TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有義CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具體步驟為①、將上述每組四引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨的反應(yīng)體系；②、分別對各反應(yīng)體系重復(fù)進行PCR循環(huán)，將DNA量擴增至凝膠電泳可觀察即可；(3)、凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對上述DNA擴增后的體系做凝膠電泳；(4)、觀測結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來判斷對應(yīng)外顯子位置是否發(fā)生點突變以及突變類型，具體判斷方法如下①、如果觀察到某外顯子泳帶中出現(xiàn)三條DNA條帶時，則判定有雜合子突變；②、如果觀察到某外顯子泳帶中僅出現(xiàn)兩條DNA條帶時，則用較小條帶的大小與下列對應(yīng)組中特異性產(chǎn)物的理論值對比，根據(jù)接近程度來判斷是純合子突變或是正常特異性，三組特異性產(chǎn)物的理論值如下A、第18外顯子點突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小198個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小270個堿基；B、第21外顯子L858R點突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小118個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小178個堿基；C、第21外顯子L861Q點突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小100個堿基；突變特異性產(chǎn)物大小192個堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，其特征在于上述PCR循環(huán)為
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，其特征在于所述循環(huán)次數(shù)為35次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，其特征在于上述凝膠電泳采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2％瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
一種快速檢測非小細胞性肺癌表皮生長因子受體基因點突變方法，其特征在于包括下列步驟(1)準(zhǔn)備DNA；(2)利用PCR方法采用三組特殊設(shè)計的四引物對DNA進行擴增；(3)凝膠電泳；(4)觀測結(jié)果。本發(fā)明應(yīng)用特殊設(shè)計的引物，利用該基因檢測方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可直接觀察產(chǎn)物的數(shù)量和大小來判斷病人有無與吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]療效有關(guān)的EGRF基因點突變，及時指導(dǎo)臨床用藥，真正做到對癥下藥。本發(fā)明的特點是1.簡單，不需測序；便宜，一般分子生物學(xué)實驗室或檢驗室就可操作；3.靈敏度高，可以檢測到測序漏診的病例。
文檔編號C12Q1/68GK1661107SQ20041010322
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者王進, 朱輝, 秦正紅 申請人:王進, 朱輝, 秦正紅