專利名稱：末端磷酸根標記的核苷酸和使用方法
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發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用標記的底物或底物類似物測定靶的改進方法。其改進包括在酶-催化反應(yīng)中使底物或底物類似物進行反應(yīng)，僅當(dāng)所述底物或底物類似物反應(yīng)時，所述反應(yīng)產(chǎn)生帶有獨立可測定信號的標記的部分。本發(fā)明特別涉及測定樣品中多核苷酸的方法，所述方法基于使用末端-磷酸根標記的核苷酸，后者包括三個或多個磷酸根作為核酸聚合酶的底物。使用的標記是染料，染料經(jīng)過化學(xué)變化，并且僅僅在聚合酶的作用下變?yōu)楫a(chǎn)生熒光或顏色的試劑。
發(fā)明的背景在具有高度特異性和靈敏度的樣品中測定特定核酸或類似物的方法是公知的，所述方法通常要求首先根據(jù)存在的特定靶序列或分析物擴增核酸序列，擴增以后測定擴增的序列，并且進行定量。核酸的通常測定體系包括熒光標記測定、與熒光酶相連的測定體系、抗體-介導(dǎo)的標記測定和放射性標記的測定。
廣泛使用的測定方法的一個缺點是需要從最終的標記產(chǎn)品或副產(chǎn)品中分離被標記的起始物，所述分離一般需要凝膠電泳或?qū)行蛄泄潭ㄔ谟糜跍y定的膜上，但是測定經(jīng)常需要很多試劑和/或溫育步驟。
已知DNA和RNA聚合酶能夠識別和使用在三磷酸根部分的γ位具有修飾或替換的核苷。還已知各種聚合酶識別和使用γ-修飾的核苷酸三磷酸酯(NTP′s)的能力看來隨連接γ-磷酸酯的部分而變化。一般來說RNA聚合酶比DNA聚合酶更雜亂。
監(jiān)測在γ-磷酸根修飾的核苷酸存在下從RNA聚合酶合成RNA的比色試驗已經(jīng)被報道過。在該在先報道中，RNA聚合酶反應(yīng)在γ-修飾的堿性磷酸酯酶抗性核苷三磷酸存在下進行，后者在其γ-磷酸根處被二硝基苯基基團修飾。當(dāng)RNA聚合酶反應(yīng)在這樣的γ-修飾的NTP作為單核苷三磷酸酯和均聚模板存在下進行時，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶能夠識別和使用修飾的NTP。但是當(dāng)聚合酶反應(yīng)在堿性磷酸酯酶存在下進行時，它消化磷?；D(zhuǎn)移的焦磷酸對-硝基苯基酯羥醛產(chǎn)品(aldo-product)，形成生色的對-硝基苯基酯，并且報道了吸收的提高。該測定方法的缺點是在堿性磷酸酯酶存在下實時(real-time)的比色試驗僅僅能夠使用均聚模板進行。
因此提供在雜聚模板存在下測定RNA的方法是有利的，該方法不限于使用單一末端-磷酸根修飾的核苷酸作為唯一的核苷酸(后者基本上對于磷酸酯酶沒有活性)，該方法允許使用雜聚模板對于RNA合成的實時監(jiān)測來進行單管試驗。
通常試驗中的熒光染料通過在標記實體中處于緊臨近它們的分子被猝滅，并且當(dāng)結(jié)構(gòu)變化，并且猝滅劑被移去或者從染料移開，或者成為沒有活性的時產(chǎn)生可測定的信號。在這種情況下產(chǎn)生信號。但是因為猝滅不是絕對的，這種試驗的動態(tài)范圍受到限制。
更有利的是該方法能夠提供對于RNA的類似試驗，其中在末端-磷酸根上的標記的身份是不同的，允許通過RNA聚合酶更好地識別和使用。另外理想的是末端-磷酸根上的標記可以不同，這樣可以進行化學(xué)發(fā)光和熒光測定，或進行還原電位測定，以及進行改進的生色測定，其中測定僅需要簡單和常規(guī)的儀器，并且增大動態(tài)范圍。
由于本領(lǐng)域公知在識別和使用末端修飾的核苷酸時DNA聚合酶比RNA聚合酶較少雜亂，其中末端位置上的部分特性能夠極大地影響DNA聚合酶對于核苷酸的特性，提供通過監(jiān)測DNA聚合酶活性來測定DNA的非放射性方法是更理想的，而且DNA的合成和序列測定能夠在單管試驗中完成實時監(jiān)測，以及在核苷酸底物的末端-磷酸根上的標記可以包括化學(xué)發(fā)光、熒光和生色測定，以及通過質(zhì)量和還原電位進行分析。
發(fā)明的概述本發(fā)明涉及使用標記的底物或底物類似物測定靶的改進方法，所述方法包括在酶-催化反應(yīng)中使底物或底物類似物進行反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜锘虻孜镱愃莆锓磻?yīng)時，所述反應(yīng)產(chǎn)生僅僅帶有獨立的可測定信號的標記部分。本發(fā)明還提供測定核酸序列存在的方法，包括以下步驟a)進行核酸聚合酶反應(yīng)，其中反應(yīng)包括末端-磷酸根-標記的核苷酸的反應(yīng)，所述反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的物種；和c)測定存在的可測定的物種。
本發(fā)明中的磷酸酯酶的定義包括能夠斷裂磷酸單酯、多磷酸和核苷酸，并且釋放出無機磷酸鹽的任何酶。在本發(fā)明的上下文中，這種酶不斷裂末端標記的核苷磷酸酯(即末端-磷酸根-標記的核苷酸對磷酸酯酶基本上不反應(yīng))。本文中的磷酸酯酶定義特別包括，但是不限于堿性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)、酸性磷酸酯酶(EC 3.1.3.2)。本文中的核苷酸定義包括天然或修飾的核苷磷酸酯。
本發(fā)明還提供測定存在的DNA序列的方法，包括以下步驟a)在末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行DNA聚合酶反應(yīng)，該反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的物種；和c)測定存在的可測定的物種。
本發(fā)明還提供測定存在的核酸序列的方法，包括以下步驟(a)在至少一種在多磷酸酯鏈上有四個或多個磷酸根基團的末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行核酸聚合酶反應(yīng)，該反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；和(b)測定標記的多磷酸酯。
另外本發(fā)明涉及測定核酸序列存在的方法，包括以下步驟(a)在至少一種在多磷酸酯鏈上有四個或多個磷酸根基團的末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行核酸聚合酶反應(yīng)，該反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的物種；和(c)測定存在的可測定的物種。
本發(fā)明的另一方面涉及定量核酸的方法，包括以下步驟(a)進行核酸聚合酶反應(yīng)，其中的反應(yīng)包括末端-磷酸根-標記的核苷酸的反應(yīng)，該反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的附產(chǎn)品物種，其數(shù)量基本上和核酸的數(shù)量成比例；(c)測定可測定的物種；和(d)使用已知的標準比較測定結(jié)果，確定核酸的數(shù)量。
本發(fā)明還涉及定量DNA序列的方法，包括以下步驟(a)在末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行DNA聚合酶反應(yīng)，該反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可標記的附產(chǎn)品物種，其數(shù)量基本上和DNA序列的數(shù)量成比例；(c)測定可測定的物種；和(d)使用已知標準比較測定結(jié)果，確定DNA的數(shù)量。
本發(fā)明另一方面涉及測定核酸序列中單一核苷酸性質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟(a)在至少一種末端磷酸根-標記的核苷酸存在下進行核酸聚合酶反應(yīng)，所述反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的物種；(c)測定存在的可測定的物種；和(d)確定摻入的核苷。
本發(fā)明還提供確定核酸序列中單一核苷酸身份的方法，所述方法包括以下步驟(a)在至少一種多磷酸酯鏈上有四個或多個磷酸根的末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行核酸聚合反應(yīng)，所述反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的物種；(c)測定存在的所述可測定的物種；和(d)確定摻入的核苷。
本發(fā)明還包括核酸測定藥盒，其中所述藥盒包括(a)至少一種或多種如下式的末端-磷酸根-標記的核苷酸 其中P＝磷酸根(PO3)及其衍生物，n是2或更大；Y氧或硫原子；B是含氮的雜環(huán)堿基；S是非環(huán)部分、碳環(huán)部分或糖部分；L是酶-活化的標記，其中含有適合于在天然或修飾的核苷酸的末端磷酸根上形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯鍵的羥基、巰基或氨基；P-L是磷?；臉擞洠?dāng)除去磷酸根時，它優(yōu)選是獨立地可測定的。
(b)至少一種DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶；和(c)磷酸酯酶。
本發(fā)明還提供使用磷酸根標記的核苷酸的試驗方法，其中在堿基被摻入到核苷酸中釋放標記的焦磷酸根以前，該標記是不可測定的，然后通過適當(dāng)酶如磷酸酯酶的作用進行測定。因為除非堿基被摻入標記，否則是不可測定的，實驗?zāi)軌蛞跃嘈问竭M行，或者在單一容器中進行，不要求多次添加試劑。另外，不需要分離未反應(yīng)的試劑，這是因為在未反應(yīng)的核苷酸中的標記不產(chǎn)生信號。而且因為假如堿基被摻入僅產(chǎn)生信號，系統(tǒng)將有大的動態(tài)范圍，并且假如使用一個或多個，優(yōu)選四個不同的標記的核苷酸，試驗可以是多重的。
本發(fā)明提供新的包括下式的染料多磷酸酯的組合物染料-(P)n-P其中當(dāng)n是2-5時，染料選自熒光的、有色的、發(fā)熒光的、生色的、發(fā)光的染料或電化學(xué)標記；當(dāng)n是1-5時，染料是發(fā)熒光的或發(fā)光的部分或電化學(xué)標記。
附圖的建議說明

圖1顯示在模板-定向的方法中，于磷酸酯酶存在下通過利用γ-磷酸根-標記的ddGTP中的聚合酶得到的熒光。
圖2表示在模板-定向方法中，于磷酸酯酶存在下通過利用γ-磷酸根-標記的ddATP中的聚合酶得到的熒光。
發(fā)明的詳細說明本文定義的術(shù)語″核苷″是包括嘌呤、去氮雜嘌呤、嘧啶或在1′位或等價位置上連接到糖或糖替代物上的修飾的堿基，如碳環(huán)或非碳環(huán)的部分，包括2′-脫氧和2′-羥基以及2′，3′-二脫氧形式以及其它的取代。
本文定義的術(shù)語″核苷酸″是指核苷的磷酸酯，其中的酯化位點通常是連接到戊糖的C-5位的羥基。
本文定義的術(shù)語“寡核苷酸″包括核苷酸或其衍生物的線型低聚體、脫氧核糖核苷、核糖核苷等。在全部說明書中，寡核苷酸是用字母的序列表示的，核苷酸是從左到右的5′-3′的順序，除非另有說明，其中A是脫氧腺苷，C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，T是胸苷。
術(shù)語″引物″是指線型寡核苷酸，它以特定的方式退火為單一的核酸序列，并且可以擴增該序列。
術(shù)語″靶核酸序列″等是指其序列特性或核苷的順序或位置由一種或幾種本發(fā)明的方法確定的核酸。
術(shù)語多磷酸根是指兩個或多個磷酸根。
術(shù)語發(fā)光的部分是指僅當(dāng)活化時產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的化學(xué)部分。
本發(fā)明涉及測定樣品中多核苷酸的方法，其中使用常規(guī)的試驗通過核酸聚合酶活性監(jiān)測RNA或DNA的合成。RNA和DNA聚合酶合成寡核苷酸，通過從核苷三磷酸酯(NTP)或脫氧核苷三磷酸(dNTP)將核苷單磷酸酯轉(zhuǎn)移到增長的核苷酸鏈的3′羥基上來進成，該反應(yīng)的驅(qū)動力是酸酐鍵的斷裂和同時的無機焦磷酸鹽的形成。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)核苷酸的末端-磷酸根的結(jié)構(gòu)修飾沒有消除其在聚合酶反應(yīng)中的功能，寡核苷酸的合成反應(yīng)包括僅僅在核苷酸的α-和β-磷?；系闹苯幼兓?，使得在末端磷酸根位置有修飾的核苷酸作為核酸聚合酶反應(yīng)的底物是有價值的。
在某些實施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，如DNA聚合酶I、II、或III或DNA聚合酶α-、β-、γ或末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或末端轉(zhuǎn)移酶。在另一實施方案中，合適的聚合酶包括但是不限于依賴于DNA的RNA聚合酶、引發(fā)酶或依賴于RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)。
本發(fā)明提供的方法使用核苷多磷酸酯，如脫氧核苷多磷酸酯、二脫氧核苷多磷酸酯、碳環(huán)核苷多磷酸酯或非環(huán)核苷多磷酸酯類似物，并且?guī)в羞B接到末端-磷酸根的電化學(xué)標記、質(zhì)量標記或生色染料、化學(xué)發(fā)光標記或熒光標記。當(dāng)核酸聚合酶使用這種類似物作為底物時，酶-可活化的標記將存在于磷?；D(zhuǎn)移的無機多磷酸酯副產(chǎn)品中。磷?；D(zhuǎn)移的多磷酸酯產(chǎn)品通過磷酸酯酶的斷裂導(dǎo)致在其上連接的標記中的可測定的變化。應(yīng)該注意RNA和DNA聚合酶能夠識別帶有修飾的末端磷?；暮塑账幔景l(fā)明人確信這種原料不是磷酸酯酶的模板。以下的結(jié)構(gòu)式表示本發(fā)明中的最相關(guān)的分子；即末端-磷酸根-標記的核苷酸，標記的多磷酸酯副產(chǎn)品和酶-活化的標記。
上式中n是1或更大，R1和R2獨立地是H、OH、SH、SR、OR、F、Br、Cl、I、N3、NHR或NH2；B是核苷堿基或修飾的雜環(huán)堿基；X是O、S或NH；Y是O、S或BH3；L是磷酸酯酶可活化的標記，它可以是生色的、發(fā)熒光的、或是化學(xué)發(fā)光的分子、質(zhì)量標記或電化學(xué)標記。質(zhì)量標記是適合于質(zhì)譜儀的小分子量部分，由于質(zhì)量不同而很容易區(qū)別于其它組分。電化學(xué)標記是容易氧化或還原的物種。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)n是2或更大時，與當(dāng)n是1時比較，核苷酸是聚合酶的顯著更好的底物。因此在優(yōu)選的實施方案中，n是2、3或4，R1和R2獨立地是H或OH；X和Y是O；B是核苷酸堿基和L是可以生色的、發(fā)熒光的或化學(xué)發(fā)光的分子的標記。
在本文提供的測定核酸序列存在的方法的一個實施方案中，其步驟包括(a)進行核酸聚合酶反應(yīng)，其中反應(yīng)包括末端-磷酸根-標記的核苷酸，其中的聚合酶反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和適合于水解磷酸酯的磷酸酯酶反應(yīng)，產(chǎn)生可測定的物種；和c)通過適當(dāng)?shù)姆绞綔y定可測定物種的存在。在所述實施方案中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板可以是雜聚的或均聚的模板。在全部說明書中，通過末端-磷酸根-標記的核苷酸，在將核苷單磷酸酯摻入到增長的核苷酸鏈中后同時釋放的標記的多磷酸酯，可以和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的物種。包括在實質(zhì)上對磷酸酯酶不反應(yīng)的反應(yīng)中的其它核苷酸可以例如在末端-磷酸根處被不導(dǎo)致產(chǎn)生可測定物種的部分阻斷。在該特定的實施方案中，用于測定的核酸可以包括RNA、天然或合成的寡核苷酸、線粒體或染色體DNA。
本發(fā)明進一步提供測定DNA序列存在的方法，其步驟包括(a)在末端-磷酸根標記的核苷酸存在下進行DNA聚合酶反應(yīng)，其中反應(yīng)包括末端-磷酸根-標記的核苷酸，該反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)，產(chǎn)生可測定的物種；和c)測定所述可測定物種的存在。用于測定的DNA序列可以包括從細胞游離出來的DNA、化學(xué)處理的DNA例如二硫化物(bisulfite)處理的甲基化DNA或按照本領(lǐng)域公知方法化學(xué)或酶促合成的DNA。所述方法包括PCR，并且記載于DNA結(jié)構(gòu)部分ADNA的合成和物理分析(Lilley，D.M.J.和Dahlberg，J.E.(Eds.)，Methods Enzymol.，211，Academic Press，Inc.，New York(1992))，將其作為本文的參考。DNA序列還包括染色體DNA和天然或合成的寡核苷酸，DNA可以是雙-或單-鏈的。
本發(fā)明的方法還包括在聚合酶反應(yīng)中含有一個或多個附加的測定試劑的步驟。附加的測定試劑可以是能夠應(yīng)答的，在測定時區(qū)別于可測定的物種，例如附加的測定試劑可以是抗體。
在聚合酶反應(yīng)中作為底物加入的合適的核苷酸包括核苷多磷酸酯，例如包括但是不限于脫氧核糖核苷多磷酸酯、核糖核苷多磷酸酯、二脫氧核苷多磷酸酯、碳環(huán)核苷多磷酸酯和非環(huán)核苷多磷酸酯及其類似物。特別理想的是在多磷酸酯鏈上含有3、4、5或6個磷酸根基團的核苷酸，其中末端磷酸酯是被標記的。
應(yīng)該注意，在包括多磷酸酯鏈上有四個或多個磷酸根的末端-磷酸根-標記的核苷酸的實施方案中，磷?；D(zhuǎn)移的標記的多磷酸酯副產(chǎn)品可以不使用磷酸酯酶處理進行測定，其屬于本發(fā)明期望的范圍。例如天然或修飾的核苷堿基，特別是鳥嘌呤能夠引起熒光標記的猝滅，因此在末端-磷酸根-標記的核苷酸中，標記可以部分地被堿基猝滅。由于加入核苷單磷酸酯，標記的多磷酸酯副產(chǎn)品由于其提高的熒光度而可以被測定。另外在通過熒光、顏色、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)測定鑒定以前，通過色譜分離方法機械地分離標記的多磷酸酯產(chǎn)品是可能的，此外質(zhì)譜方法通過質(zhì)量差別能夠用于測定產(chǎn)品。
本發(fā)明方法包括在至少一種DNA或RNA聚合酶存在下進行聚合酶反應(yīng)，合適的核酸聚合酶包括引發(fā)霉、端粒酶、末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。需要核酸模板用于進行聚合酶反應(yīng)，并且可以加入到聚合酶反應(yīng)溶液中。可以預(yù)期在本發(fā)明測定方法中的所有的步驟(a)、(b)和(c)能夠使用單一的均相的反應(yīng)混合物同時進行，以及按順序進行。
在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)，核酸聚合酶反應(yīng)可以包括使用聚合酶的擴增方法。這種方法的實例包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)和核酸序列堿基擴增(NASBA)。例如其中靶分子是核酸聚合物如DNA時，它可以通過PCR將γ-磷酸根標記的核苷酸堿基例如腺嘌呤、胸腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或其它氮雜環(huán)堿基摻入到DNA分子中而被測定。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法記載于ScienceVol.239，P.487，1988，(Saiki等)，U.S.Patent 4，683，195(Mullis等)和MolecularCloning，(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY(1980)(Sambrook J.等(Eds.))，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NY(1999)(Ausubel，F(xiàn).M.等(Eds.))和Recombinant DNAMethodology II，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.，NY，(1995)(Wu，R.(Ed.))。使用PCR通過將用于測定的靶核酸如DNA直接放入含有PCR試劑和適當(dāng)引物的反應(yīng)器中來對它進行擴增。通常選擇在序列上至少和靶核酸的部分是互補的引物。
應(yīng)該注意，適合于進行本發(fā)明方法的步驟(a)的核酸聚合酶反應(yīng)還包括擴增核酸序列的各種RCA方法，例如公開于U.S.專利5,854,033(Lizardi，Paul M.)的方法可以作為本文的參考。聚合酶反應(yīng)還包括基于核酸序列的擴增(NASBA)，其中該體系包括RNA而不是DNA的擴增，并且擴增是等溫的，發(fā)生在同一溫度(41℃)。通過NASBA的靶RNA的擴增包括三種酶的協(xié)同活性逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶，與寡核苷酸引物一起定向到樣品靶RNA上，這些酶在四個步驟中催化靶單鏈RNA的指數(shù)式擴增四個步驟是擴展、降解、DNA合成和環(huán)狀RNA擴增。
室溫-PCR、RCA和NASBA的方法通常需要間接通過定量擴增產(chǎn)品來測定靶核酸的起始數(shù)量。一般首先從起始物通過在瓊脂凝膠上的電泳分離擴增產(chǎn)品，以便確定成功的擴增，然后使用任何方便的核酸測定體系，如測定熒光標記、酶-聯(lián)合測定體系、抗體-介導(dǎo)的標記測定和放射性標記測定進行定量。相比之下，本發(fā)明的方法在能夠測定這些產(chǎn)品以前不需要從原料中分離聚合酶反應(yīng)產(chǎn)品。例如在本發(fā)明中報道分子(熒光，化學(xué)發(fā)光或生色)或其它有用分子以如下的方式連接核苷酸，使得當(dāng)被磷酸根結(jié)合掩蔽時在某些條件下它是不能測定的。但是隨著將核苷酸摻入增長的寡核苷酸鏈和用磷酸酯酶處理反應(yīng)，在所述條件下標記又是可以測定的。例如假如1，3-二氯-9，9-二甲基-吖啶-2-酮(DDAO)的三環(huán)結(jié)構(gòu)一側(cè)上的羥基連接到核苷酸的末端-磷酸根位置，DDAO在659nm處將不發(fā)熒光。一旦核苷單磷酸酯摻入到DNA中，另一產(chǎn)品DDAO多磷酸酯(它在659nm也不發(fā)熒光)即是磷酸酯酶的底物，一旦去-磷酰基化形成DDAO，染料部分將變得在659nm處發(fā)出熒光，因此是可以測定的。多磷酸酯產(chǎn)品的特定分析能夠在聚合酶反應(yīng)溶液中進行，不需要從原料中分離反應(yīng)產(chǎn)品，所述方式允許測定，并且能夠任選地在聚合反應(yīng)期間使用常規(guī)儀器如光譜儀來定量形成的核酸。
在上述方法中，聚合酶反應(yīng)步驟可以進一步包括在磷酸酯酶存在下進行聚合酶反應(yīng)，該反應(yīng)將多磷酸酯副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為可測定的標記。這樣就可以設(shè)計方便的試驗以測定存在的核酸序列，允許連續(xù)監(jiān)測可測定物種的形成。這表示均相試驗方式能夠在單一試管中進行。
上述試驗方法的一個方式包括，但是不限于在單一類型的、能夠傳送可測定物種的末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行聚合酶反應(yīng)，例如末端-磷酸根-修飾的ATP，其中所有其它核苷酸實質(zhì)上對磷酸酯酶是沒有活性的，但是能夠產(chǎn)生非-可測定物種。
在另一試驗方式中，聚合酶反應(yīng)可以在多于一種類型的末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行，每種類型能夠產(chǎn)生單一的可測定物種。例如試驗包括第一核苷酸(即腺苷多磷酸酯)，它和第一標記結(jié)合，當(dāng)從磷?；D(zhuǎn)移的無機多磷酸酯副產(chǎn)品中酶促游離出來時，所述標記在第一波長處發(fā)光；并且第二核苷酸(即鳥苷多磷酸酯)結(jié)合第二標記，后者在第二波長處發(fā)光。理想的是第一和第二波長發(fā)射基本上較少重疊或不重疊。在本發(fā)明預(yù)期的范圍內(nèi)還包括基于核苷酸序列信息的多個同時試驗可以在其后基于從多磷酸酯釋放的特定標記而衍生得到。
在上述測定核酸序列存在的方法的另一方面中，末端-磷酸根-標記的核苷酸可以用下式(式I)表示 其中P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；n是2或更大；Y是氧或硫原子；B是含氮雜環(huán)堿基；S是非環(huán)部分，碳環(huán)部分或糖部分；L是酶-活化的標記，它在天然或修飾的核苷酸中的末端磷酸根上含有適合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯鍵的羥基、巰基或氨基；P-L是磷?；瘶擞?，當(dāng)磷酸酯被除去以后它變?yōu)榭瑟毩⒌販y定的。
除了磷酸酯水解，很多其它類型的反應(yīng)是能夠生色的、發(fā)熒光的或結(jié)果產(chǎn)生獨立地可測定的標記。例如糖苷酶能夠作用于生色糖苷，如作用在X-gal(溴氯吲哚基糖苷)上的β-半乳糖苷酶。蛋白酶和肽酶能夠作用于酯和酰胺如N-?；_丹明。本發(fā)明的其它方面是使用于作為靶的報道分子的那些其它類型的反應(yīng)。在靶存在下使用底物類似物(它們能夠轉(zhuǎn)化為這些酶的報道底物)是本發(fā)明公開的方法中的另一個實例。
對于本發(fā)明方法的目的，有用的碳環(huán)部分記載于Ferraro，M.和Gotor，V.的Chem Rev.2000，volume 100，4319-48；合適的糖部分記載于Joeng，L.S.等人的J Med.Chem.1993，vol.356，2627-38；Kim H.O.等人的J Med.Chem.193，vol.36，30-7；和EschenmosserA.的Science 1999，vol.284，2118-2124。另外有用的非環(huán)部分記載于Martinez，C.I.等人的Nucleic Acid Research 1999，vol.27，1271-1274；Martinez，C.I.等人的Bioorganic & MedicinalChemistry Letters 1997，vol.7，3013-3016；和U.S.Patent5,558,91(Trainer，G.L.)。這些部分的結(jié)構(gòu)表示如下，其中對于所有的部分R可以是H、OH、NHR、F、N3、SH、SR、OR、低級烷基或芳基；對于糖的部分X和Y獨立地是O、S或NH；對于?；糠諼＝O、S、NH、NR。
碳環(huán)部分 糖部分 非環(huán)部分在某些實施方案中，式I中的糖部分可以選自核糖基、2′-脫氧核糖基、3′-脫氧核糖基、2′，3′二脫氫二脫氧核糖基、2′，3′-二脫氧核糖基、2′-或3′-烷氧基核糖基、2′-或3′氨基核糖基、2′-或3′-氟核糖基、2′-或3′-巰基核糖基、2′或3′烷硫基核糖基、非環(huán)、碳環(huán)和其它修飾的糖。
而且式I中的堿基可以包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、次黃嘌呤、7-脫氮次黃嘌呤、腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤或其類似物。
而且末端磷酸根標記的核苷酸能夠用于標記，它將不發(fā)射信號，除非并且直到堿基被摻入到核苷酸中，因此釋放多磷酸酯，然后能夠被酶如磷酸酯酶作用，產(chǎn)生可測定的信號。在這種系統(tǒng)中，當(dāng)堿基被摻入時，標記將經(jīng)受化學(xué)變化從沒有活性(非-可測定的)形式變?yōu)?可測定的)形式，因此提供了關(guān)于摻入的堿基的性質(zhì)的情報。因為顏色僅僅依賴于反應(yīng)而產(chǎn)生，產(chǎn)生的信號基本上沒有本底，這樣就提供了擴大的試驗動態(tài)范圍。假如需要，兩種或多種不同的標記的核苷酸可以被一次性加入，使得試驗是多重的。
如下所述標記是生色的或者是發(fā)熒光的，但是不必須包括任何猝滅劑。而且當(dāng)優(yōu)選用于如本文所述的核苷酸測列或表征試驗時，應(yīng)該理解這些末端磷酸根標記的核苷酸能夠和其它的結(jié)合分子如抗體或半抗原軛合，允許這種類型的均相親和試驗以多重方式進行。
在一般的試驗中，一個或多個末端標記的核苷酸處在反應(yīng)混合物中，假如存在的話，互補的堿基通過核酸聚合酶被摻入到序列中；這導(dǎo)致釋放染料標記的多磷酸酯，然后它能夠通過另一酶的作用被測定，優(yōu)選磷酸酯酶，更優(yōu)選河蝦堿性磷酸酯酶、牛小腸堿性磷酸酯酶、大腸桿菌堿性磷酸酯酶或海洋紅嗜熱鹽菌堿性磷酸酯酶。標記然后能夠通過合適的比色或熒光比色方法被測定。
在末端-磷酸根-標記的核苷酸中，連接于末端-磷酸根位置的標記可以選自1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光化合物、熒光染料、生色染料、質(zhì)量標記和電化學(xué)標記。它們允許可測定的物種通過存在的任何一個顏色、熒光發(fā)射、化學(xué)發(fā)光、質(zhì)量變化、電化學(xué)測定或其組合被測定。
式I中的磷?；臉擞浭前l(fā)熒光的部分，它理想地選自以下(全部以磷酸單酯表示)2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮，商品名為ELF 97的固體(Molecular Probes，Inc.)、熒光素二磷酸酯(四銨鹽)、熒光素3′(6′)-O-烷基-6′(3′)-磷酸酯、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(二銨鹽)、4-甲基傘形?；姿狨?游離酸)、試鹵靈磷酸酯、4-三氟甲基傘形?；姿狨?、傘形酰基磷酸酯、3-氰基傘形?；姿狨?、9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯、6，8-二氟-4-甲基傘形酰基磷酸酯及其衍生物。所述染料的結(jié)構(gòu)表示如下 2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮 熒光素二磷酸酯熒光素3′(6′)-O-烷基-6′(3′)-磷酸酯 9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(二銨鹽)
4-甲基傘形酰基磷酸酯 6，8-二氟-4-甲基傘形酰基磷酸酯 4-三氟甲基傘形?；姿狨?傘形?；姿狨?br> 3-氰基傘形酰基磷酸酯 試鹵靈磷酸酯 9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯其中上述式I中的磷酰基標記部分是生色部分，它可以選自以下5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、3-吲哚氧基磷酸酯、對-硝基苯基磷酸酯及其衍生物。這些生色染料的結(jié)構(gòu)作為磷酸單酯表示如下 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(二鈉鹽)
3-吲哚基磷酸酯(二鈉鹽) 對-硝基苯基磷酸酯在末端-磷酸根位置的部分還可以是化學(xué)發(fā)光化合物，其中它是磷酸酯酶-活化的1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物是理想的。1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物可以包括，但是不限于2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5-氯-)三環(huán)[3，3，1-13，7]-癸-1-基)-1-苯基磷酸酯二鈉鹽，CDP-Star(商品名)(Tropix，Inc.，Bedford，MA)、氯金剛烷-2′-亞基甲氧基苯氧基磷?；蹼s環(huán)丁烷，CSPD(商品名)(Tropix)，和3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷，AMPPD(商品名)(Tropix)。這些市場上可以買到的二氧雜環(huán)丁烷化合物分別記載于US專利5,582,980、5,112,960和4,978,614，并且作為本文的參考。
上述方法還包括定量核酸序列的步驟。在一個相關(guān)的方面中，可測定的物種能夠以實質(zhì)上和擴增的核酸序列數(shù)量成比例的數(shù)量產(chǎn)生。定量核酸序列的步驟通過將測定物種得到的光譜和已知光譜進行比較來完成是理想的。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供定量核酸的方法，包括以下步驟(a)進行核酸聚合酶反應(yīng)，聚合酶反應(yīng)包括核苷酸的反應(yīng)，它基本上對磷酸酯酶是沒有活性的，除了對至少一個末端-磷酸根-標記的核苷酸以外，其中反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的副產(chǎn)品物種，其數(shù)量基本上和被定量的核酸的數(shù)量成比例；(c)測量可測定的物種；和(d)使用公知的標準比較測定結(jié)果，以確定核酸的數(shù)量。在定量核酸方法的該實施方案中，被定量的核酸可以是RNA。核酸也可以是天然或合成的寡核苷酸、染色體DNA或DNA。
本發(fā)明還提供定量DNA序列的方法，包括以下步驟(a)在末端-磷酸根-標記的核苷酸存在下進行DNA聚合酶反應(yīng)，其中反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生可測定的副產(chǎn)品物種，其數(shù)量基本上和被定量的DNA序列的數(shù)量成比例；(c)測量可測定的物種；和(d)使用公知標準比較測量結(jié)果以便確定DNA的數(shù)量。在該實施方案中，被定量的DNA序列可以包括天然的或合成的寡核苷酸，或從細胞中分離的DNA，包括染色體DNA。
在一個上述定量核酸序列的方法中，聚合酶反應(yīng)步驟進一步包括在磷酸酯酶存在下進行聚合酶反應(yīng)，如以上說明書中所述，這將允許核酸聚合酶活性的實時監(jiān)測，因此允許定量的靶核酸序列的實時測定。
本文提供的用于定量核酸序列方法的末端-磷酸根-標記的核苷酸用上述式I表示。酶-活化的標記通過磷酸酯酶的活性變得可測定，所述磷酸酯酶改變了在標記和天然或修飾的核苷酸的末端-磷酸酯之間的磷酸酯鍵，其方式是產(chǎn)生可測定的物種。可測定的物種可以通過任何一個顏色、熒光發(fā)射、化學(xué)發(fā)光、質(zhì)量差別或電化學(xué)潛能或其組合的存在而被測定。如上所述酶活化的標記可以是1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光化合物、熒光染料、生色染料、質(zhì)量標記或電化學(xué)標記或其組合。合適的標記是和上述那些相同的。
如在實施例部分將進一步詳細描述的，本發(fā)明提供測定在靶核酸序列中的單一核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟(a)在至少一種末端磷酸根標記的核苷酸存在下進行核酸聚合酶反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生標記的多磷酸酯；(b)使標記的多磷酸酯和磷酸酯酶反應(yīng)產(chǎn)生標記的物種；(c)測定存在的標記的物種；和(d)確定被摻入的核苷。在所述實施方案中末端磷酸根-標記的核苷酸在多磷酸酯鏈中包括四個或多個磷酸酯。
本發(fā)明另一方面涉及核酸測定藥盒，包括a)至少一種或幾種下式的末端-磷酸根-標記的核苷酸
其中P＝磷酸根(PO3)及其衍生物；n是2或更大；Y是氧或硫原子；B是含氮雜環(huán)堿基；S是非環(huán)部分、碳環(huán)部分或糖部分；其中L是酶-活化的標記，它在天然或修飾的核苷酸中的末端磷酸根上含有適合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯鍵的羥基、巰基或氨基；P-L是磷?；瘶擞?，當(dāng)磷酸根被除去以后它變?yōu)榭瑟毩⒌販y定；b)至少一種DNA聚合酶，RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶；c)磷酸酯酶。
在上述藥盒中末端-磷酸根-標記的核苷酸中的糖的部分包括，但是不限于核糖基、2′-脫氧核糖基、3′-脫氧核糖基、2′，3′-二脫氧核糖基、2′，3′-二脫氫二脫氧核糖基、2′-或3′-烷氧基核糖基，2′-或3′-氨基核糖基、2′-或3′-氟核糖基、2′-或3′-巰基核糖基，2′-或3′-烷硫基核糖基、非環(huán)、碳環(huán)和其它修飾的糖。
堿基可以是，但是不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、次黃嘌呤、7-脫氮次黃嘌呤、腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤或其類似物。
而且如上所述，酶-活化的標記可以是1，2-二氧雜環(huán)丁烷化學(xué)發(fā)光化合物、熒光染料、生色染料、質(zhì)量標記、電化學(xué)標記或其結(jié)合。在核苷酸的末端-磷酸根位置偶聯(lián)的合適的化合物和上述的那些相同。
實施例實施例1制備γ-(4-三氟甲基香豆素基)ddGTP(γCF3香豆素-ddGTP)將ddGTP(200μl，46.4mM溶液，純度＞96％)和無水二甲基甲酰胺(DMF，2×0.5ml)一起共同蒸發(fā)，往其中加入二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC，9.6mg，5當(dāng)量)，再將混合物和無水DMF(0.5ml)共同蒸發(fā)，然后在無水DMF(0.5ml)中處理殘留物，將混合物攪拌過夜。還剩余約20％未環(huán)化的三磷酸酯(可能是來自環(huán)狀三甲基磷酸酯在柱上的水解)。向混合物中加入另外2當(dāng)量DCC，攪拌2小時以后，加入7-羥基-4-三氟甲基香豆素(4-三氟甲基傘形酮，42.7mg，20當(dāng)量)和三乙胺(26μI，20當(dāng)量)，將混合物在室溫下攪拌，2天以后，HPLC(在0.1M三乙基銨乙酸鹽(TEAA)中的0-30％乙腈/15分鐘，30-50％乙腈/5分鐘和50-100％乙腈/10分鐘，C18 3.9×150mm柱，流速1ml/分鐘)顯示在9.7分鐘有新的產(chǎn)品和起始的環(huán)狀三磷酸酯(在254nm下比例為77∶5)。再攪拌混合物1天，P-31 NMR顯示γ-標記的核苷-三磷酸酯作為反應(yīng)混合物的主要成分。
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮反應(yīng)混合物，用水(5×1ml)萃取殘留物，HPLC顯示純度在254nm處為82％和在335nm處為81％。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮混合的水溶液，并且溶解在水(1ml)中，在1英寸×300cm C18柱上，使用在0.1M三乙基銨碳酸氫鹽中的0-30％乙腈(TEAB，pH8.3)/30min和30-50％乙腈/10min、15ml/min流速提純，將產(chǎn)品峰收集在3個餾分中，除了通過鼓入CO2將TEAB緩沖液的pH降低到6.7以外，使用如上述相同的制備HPLC方法再提純餾分1。將產(chǎn)品峰濃縮，使用MeOH(2倍)和水(1倍)共同蒸發(fā)。將樣品溶解在1ml水中，HPLC顯示在254處和在335nm處的純度＞99％。UV顯示濃度為2.2mM，假設(shè)消光系數(shù)在322nm處是11,000(報道的對于7-羥基-4-三氟甲基香豆素的β半乳糖苷衍生物，分子探針目錄)，MSM-＝702.18(計算值702.31)，UVλA＝253，276 & 322nm。連接到ddGTP的γ-磷酸根上的三氟香豆素染料以322nm的最大激發(fā)和約415nm的最大發(fā)射發(fā)熒光，磷酸酯水解后釋放香豆素染料，光譜發(fā)生變化，最大激發(fā)約為385nm和最大發(fā)射約為502nm，這種變化很容易通過樣品的熒光測定或顏色變化來測定。γ核苷酸的合成被Arzumanov一般性地描述(A.et al.in J Biol Chem(1996)Oct 4；271(40)24389-94)。

γ-(4-三氟甲基香豆素基)二脫氧鳥苷-5′-三磷酸酯(γCF3香豆素-ddGTP)實施例2制備γ-(3-氰基香豆素基)ddATP(γ-CN香豆素-ddATP)將ddATP(100μl，89mM溶液，＞96％)和無水DMF(2×1ml)共同蒸發(fā)，往其中加入DCC(9.2mg，5當(dāng)量)，攪拌混合物，再和無水DMF(1ml)共同蒸發(fā)，用無水DMF(O.5ml)處理殘留物，于室溫攪拌反應(yīng)過夜以后加入7-羥基-3-氰基香豆素(33.3mg，20當(dāng)量)和TEA(25p.1，20當(dāng)量)。將混合物于室溫下攪拌1天以后在8.1分鐘時觀察到主要產(chǎn)品(55％，在254nm處)和在10分鐘(大約10％)觀察到另一次要產(chǎn)品，一天以后沒有觀察到大的變化。
將反應(yīng)混合物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，用3×2ml水萃取殘留物并且過慮，濃縮水溶液，在C-18上提純，使用0.1M TEAB中的0-30％乙腈(pH6.7)/30min，30-50％乙腈/10min，流速15ml/min。將主峰收集在3個餾分中，主峰的HPLC(fr.2)顯示純度在254nm處為95.6％，在335nm處為98.1％。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(室溫)濃縮，將MeOH(2x)及水(1x)共同蒸發(fā)，將殘留物溶解在0.5ml水中，把5μl樣品稀釋到1ml進行UV分析，346nm＝0.784，假設(shè)消光系數(shù)為20,000(報道的對于7-乙氧基-3-氰基香豆素的，分子探針目錄)，濃度＝7.84mM，產(chǎn)量＝3.92μmol，44％。使用上述同樣的方法在C-18柱上再提純樣品。將樣品峰收集在3個餾分中，將純度＞98％(254nm)和純度＞99.5％(340nm)的餾分2和3混合，濃縮以后將殘留物和MeOH(2x)及水(1x)共同蒸發(fā)。將樣品溶解在水(1ml)中得到2.77mM的溶液。MSM-＝642.98au(計算值643.00au)，UVSA＝263 & 346nm，連接到ddATP的γ-磷酸根上的氰基香豆素染料以346nm的最大激發(fā)和約411nm的最大發(fā)射發(fā)熒光。由于磷酸酯水解釋放香豆素染料，光譜發(fā)生變化，最大激發(fā)約為408nm和最大發(fā)射約為450nm，這種變化很容易通過測量樣品的熒光和顏色變化來測定。γ-核苷酸的合成被Arzumanov，A等人一般性地描述(J Biol Chem.(1996)Oct4；271(40)24389-94)
γ-(3-氰基香豆素基)二脫氧腺苷-5′-三磷酸酯(γ-CN香豆素-ddATP)實施例3制備8-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脫氧胸苷-5′-四磷酸酯(ddT4P-DDAO)將ddTTP(100gel，80mM溶液)和無水二甲基甲酰胺(DMF，2×1ml)共同蒸發(fā)，往其中加入二環(huán)己基碳化二亞胺(8.3mg.5當(dāng)量)，將混合物再和無水DMF(1ml)共同蒸發(fā)，用無水DMF(1ml)處理殘留物，將反應(yīng)物于室溫攪拌過夜，HPLC顯示出大部分環(huán)化的三磷酸酯(-82％)。濃縮反應(yīng)混合物，用無水乙醚洗滌殘留物三次，再溶解于無水DMF中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮致干，用DDAO-單磷酸酯、銨鹽(5mg，1.5當(dāng)量)在200μl無水DMF中浸取殘留物，于40℃攪拌一周，HPLC顯示形成了新的產(chǎn)品，具有理想的在11.96分鐘處的UV特征。(HPLC方法在0.1M三乙基銨乙酸鹽中的0.30％乙腈(pH7)/15min，30-50％乙腈/5min，Novapak C-18 3.9×150mm柱，1ml/min)。LCMS(ES-)也顯示M-1峰的主峰834。濃縮反應(yīng)混合物，在DeltapakC18，19×300mm柱上提純，使用0.1M TEAB(pH6.7)和乙腈。用HPLC再提純產(chǎn)品的餾分，按照上述相同的方法。濃縮純的產(chǎn)品餾分，和MeOH(2x)及水(1x)共同蒸發(fā)，將殘留物溶解在水(1.2ml)中，得到1.23mM的溶液。HPCL純度＞97.5％(在254nm處)，＞96％(在455nm處)；UVBA＝267nm和455nm；MSM-1＝834.04(計算值8.33.95)。
以同樣的方式合成并提供了δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脫氧胞苷-5′-四磷酸酯(ddC4P-DDAO)、δ-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮二脫氧腺苷-5′-四磷酸酯(ddA4P-DDAO)和δ-9H(1，3-二氯-9，9二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脫氧鳥苷-5′-四磷酸酯(ddG4P-DDAO)。分析這些提純的化合物得到以下數(shù)據(jù)ddC4P-DDAOUVλA＝268nm和454nm；MSM-1＝819.32(計算值818.96)；ddA4P-DDAOUVλA＝263nm和457nm；MSM-1＝843.30(計算值842.97)；ddG4P-DDAOUVA＝257nm和457nm；MSM-1＝859.40(計算值858.97)。
ddT4P-DDAO ddC4P-DDAO ddA4P-DDAO
ddG4P-DDAO實施例4制備ε-9H(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脫氧胸苷-5′-五磷酸酯DDAO-ddT-五磷酸酯(ddT5P-DDAO)A.DDAO焦磷酸酯的制備將DDAO-磷酸酯二銨鹽(11.8μmol)和無水DMF(3×0.25ml)共同蒸發(fā)，溶解在DMF(0.5ml)中，往其中加入羰基二咪唑(CDI，9.6mg，5當(dāng)量)，將混合物于室溫下攪拌過夜，通過加入MeOH(5F1)除去過量的CDI，攪拌30分鐘，往該混合物中加入磷酸二氫三丁基銨(10當(dāng)量，236ml(0.5M溶液，DMF中)，于室溫攪拌混合物4天，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮反應(yīng)混合物，在HiPrep 16.10 Q XL柱上提純殘留物，使用0-100％B，使用0.1MTEAB/乙腈(3∶1)作為緩沖液A和使用1M TEAB/乙腈(3∶1)作為緩沖液B。收集主峰(HPLC純度98％)，濃縮并且和甲醇(2x)共同蒸發(fā)，將殘留物溶解在1ml水中得到5.9mM的溶液，UV/VISλmax＝456nm。
B.ddT5P-DDAO的制備將ddTTP(100μl的47.5mM溶液，水中)和無水DMF(2×1ml)共同蒸發(fā)，往其中加入DCC(5當(dāng)量，4.9mg)，將混合物和DMF(1×1ml)共同蒸發(fā)，使用無水DMF(0.5ml)處理殘留物，于室溫攪拌3小時，往其中加入1.03含水的DDAO焦磷酸酯(DMF溶液)，和無水DMF(2×1ml)共同蒸發(fā)，將混合物濃縮致干，使用200μl無水DMF處理，將混合物于38℃加熱2天，濃縮反應(yīng)混合物，用水稀釋，過慮并且在HiTrap 5ml離子交換柱上提純，使用0-100％A-B，使用2步驟梯度，溶劑A＝0.1M TEAB/乙腈(3∶1)，溶劑B＝1M TEAB/乙腈(3∶1)，合并餾分12×13(含有大量產(chǎn)品)，濃縮并且和甲醇(2x)共同蒸發(fā)，在Xterra RP C-18 30-100mm柱上提純殘留物，使用5柱體積的0.1M TEAB中的0.30％乙腈，和2柱體積的0.1M TEAB中的30-50％乙腈，流速為10ml/min，濃縮含有純產(chǎn)品的餾分，并且和甲醇(2x)及水(1x)共同蒸發(fā)，HPLC純度(455nm)＞99％，UV/VIS＝268nm和455nm.MSM-1＝914.03(計算值913.93)。
連接到這些多磷酸酯的γ-磷酸根上的DDAO染料以455nm的最大激發(fā)和約608nm的最大發(fā)射發(fā)熒光，由于磷酸酯水解釋放游離染料，光譜發(fā)生變化，最大激發(fā)約為645nm和最大發(fā)射約為659nm，這種變化很容易通過測定樣品的熒光和顏色變化來測定。
ddT5P-DDAO應(yīng)該注意帶有染料或連接于末端磷酸根的其他可測定部分的類似的核苷酸組分也能夠使用類似于上述實施例1-4所述的方法制備。它們包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷-四磷酸酯、帶有任何天然堿基的核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、次黃嘌呤和尿嘧啶)以及修飾的堿基或修飾的糖。
實施例5制備乙基-熒光素三磷酸酯將乙基-熒光素(100mg)和無水乙腈(2倍)共同蒸發(fā)，并且再懸浮于無水乙腈(5ml)中，往其中加入磷酰氯(78μl)。于0℃攪拌30分鐘以后，加入三當(dāng)量的吡啶，將混合物溫?zé)岬绞覝兀谑覝財嚢?小時。往反應(yīng)混合物中加入在DMF中的焦磷酸三丁基銨(0.5M，10當(dāng)量)和三丁基胺(15當(dāng)量)，攪拌5分鐘以后，用15ml 1M三乙基銨碳酸氫鹽淬滅。濃縮反應(yīng)混合物，和甲醇(2倍)共同蒸發(fā)，用離子交換色譜法提純殘留物，使用HiPrep16×10 Q XL柱，然后使用反相色譜提純，使用Xterra C-18 30×100mm柱，得到37.2umol純的產(chǎn)品，在274nm處有最大入值，M-1＝598.99(計算值599)質(zhì)子和磷NMR光譜對應(yīng)于結(jié)構(gòu)式如下的乙基-熒光素磷酸酯。
以下的實施例6和7說明在測定核酸的模板-定向方法中，具有連接于末端磷酸根的染料衍生物的二脫氧核苷酸可以通過核酸聚合酶作為底物有效地摻入到增長中的核酸鏈中。
實施例6核酸序列的測定，使用摻入γ-磷酸根-標記的ddGTP的聚合酶在室溫下裝配(23℃)反應(yīng)，使用實施例的(1)二脫氧核苷酸。反應(yīng)含有引物模板組合，該組合含有單一寡核苷酸引物(以SEQ ID NO1表示)，該單一寡核苷酸引物被退火到含有鄰近引物的3′末端作為下一個模板的核苷酸的dC或dT的兩個不同寡核苷酸模板之一上，這兩個模板分別相應(yīng)于SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
參考圖1，對于本實施例中的模板1(SEQ ID NO2)，期望DNA聚合酶利用標記的ddGTP來延長引物。同樣對于圖1中的模板2(SEQ IDNO3)，期望DNA聚合酶利用ddATP來延長引物，但是不利用標記的ddGTP。
反應(yīng)條件70μl含有25mM Tris，pH8.0、5％甘油5mMMgCl2、0.5mM β-乙硫醇、0.01％吐溫-20，0.25單位河蝦堿性磷酸酯酶、退火到模板(下一個模板核苷酸是dCMP或dTMP)上的100nM引物和2μM ddGTP-CF3-香豆素的反應(yīng)物，被裝配在以時間驅(qū)動模式工作的LS-55熒光光譜儀的(Perkin Elmer)石英熒光超-微容器中。
激發(fā)和發(fā)射波長分別是390nm和500nm，激發(fā)狹縫的寬度是5nm，發(fā)射狹縫的寬度是15nm，通過加入0.35μl(11單位)基因工程化的用來消除3′-5′外切核酸酶活性和5′-3′外切核酸酶活性并且辨別二脫氧核苷酸的克隆的DNA聚合酶I和0.25mM MnCl2來啟動反應(yīng)。
如圖1中所示，對于含有γ標記的ddGTP的反應(yīng)，僅僅對于引物模板1測得了染料發(fā)射，其中在模板中的下一個核苷酸是dC。通過河蝦堿性磷酸酯酶切割磷?；D(zhuǎn)移的焦磷酸酯產(chǎn)品導(dǎo)致CF3-香豆素標記的可測定的變化，這樣就可以測定核酸。使用引物模板2沒有獲得可測定的染料發(fā)射。
實施例7利用聚合酶摻入γ磷酸根-標記的ddATP進行核酸序列的測定在室溫下裝配(23℃)反應(yīng)，使用實施例的(2)二脫氧核苷酸，反應(yīng)含有引物模板組合，該組合具有單一的寡核苷酸引物(SEQ IDNO1)，該單一的寡核苷酸引物被退火到含有臨近引物的3′末端作為模板核苷酸的dC或dT的兩個不同寡核苷酸模板之一上，這兩個模板分別對應(yīng)于SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
參考本實施例中的圖2，對于本實施例中的模板2(SEQ ID NO3)，期望DNA聚合酶利用標記的ddATP來延長引物。同樣對于圖2中的模板1(SEQ ID NO3)，期望DNA聚合酶利用ddGTP來延長引物，但是不利用標記的ddATP。
反應(yīng)條件70μl含有25mM Tris，pH8.0、5％甘油5mMMgCl2、0.5mM β-乙硫醇、0.01％吐溫-20、0.25單位河蝦堿性磷酸酯酶、100nM退火到模板上的引物和2μM ddATP-CN-香豆素的反應(yīng)物，被裝配在LS-熒光光譜儀(Perkin Elmer)以時間驅(qū)動模式工作的中的石英熒光超-微容器中。
激發(fā)和發(fā)射波長分別是410nm和450nm，激發(fā)狹縫的寬度是5nm，發(fā)射狹縫寬度是15nm，通過加入0.35μl(11單位)基因工程化的用來消除3′-5′外切核酸酶活性和5′-3′外切核酸酶活性并且辨別二脫氧核苷酸的克隆的DNA聚合酶I和0.25mMMnCl2來啟動反應(yīng)。
如圖2中所示，對于含有γ標記的ddATP的反應(yīng)，僅僅對于引物模板2測到了染料發(fā)射，其中在模板中的下一個核苷酸是dT。通過河蝦堿性磷酸酯酶切割磷?；D(zhuǎn)移的焦磷酸酯產(chǎn)品導(dǎo)致CN-香豆素標記中的可測定的變化，這樣就允許測定核酸。使用引物模板1沒有得到可測定的染料發(fā)射。
序列表<110>AMERSHAM B[OSCIENCES CORPFULLER，CarlKUMAR，ShivSOOD，AnupNELSON，John<120>末端磷酸根標記的核苷酸和使用方法<130>PB0156-1-CIP<140>PCT/US2004/將要被轉(zhuǎn)讓<141>2004-01-30<150>US 10/358,818<151>2003-02-05<150>US 10/113,030<151>2002-04-01<150>US 60/315,798<151>2001-08-29<160>3<170>Patent In version 3.2<210>1<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA合成的引物<400>1atccg 5<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>DNA模板<400>2taggccgctg 10<210>3<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA模板<400>3taggctgctg 10
權(quán)利要求
1.使用標記的底物或底物類似物測定靶的方法，包括在酶-催化的反應(yīng)中使所述底物或底物類似物進行反應(yīng)，產(chǎn)生標記的多磷酸酯，僅當(dāng)?shù)孜锘虻孜镱愃莆锓磻?yīng)時該標記的多磷酸酯具有獨立地可測定的信號，并且其中當(dāng)靶是核酸時，該標記的多磷酸酯具有三個或多個磷酸根。
2.權(quán)利要求1的方法，其中標記的多磷酸酯還經(jīng)受化學(xué)變化，產(chǎn)生可測定的信號。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的化學(xué)變化被一種或多種酶催化，產(chǎn)生可測定的信號。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶是核酸靶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的靶是蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中標記的底物類似物是末端-磷酸根標記的核苷多磷酸酯。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的酶-催化反應(yīng)是核酸聚合反應(yīng)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中酶-催化反應(yīng)被磷酸二酯酶催化。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的酶-催化反應(yīng)被二核苷酸磷酸化酶催化。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的酶-催化反應(yīng)被連接酶催化。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述的多磷酸酯含有兩個或多個磷酸根基團。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述標記的多磷酸酯以下式表示Label-x-(p)n-p其中Label是可測定的部分，x是O、S、NH或連接基團，n是1-5和p是磷酸根或磷酸根衍生物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中在所述標記的多磷酸酯中的標記是比色的、發(fā)熒光的、生色的、產(chǎn)生熒光的或化學(xué)發(fā)光的化合物或電化學(xué)標記。
14.權(quán)利要求2的方法，其中所述標記選自由化學(xué)發(fā)光的化合物、熒光染料、生色染料、電化學(xué)標記或其結(jié)合組成的組。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述可測定的物種是可通過選自由顏色、熒光發(fā)射、化學(xué)發(fā)光、質(zhì)量變化、還原/氧化潛能及其組合組成的組中的性質(zhì)測定的。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述的比色標記選自由花青、merro花青、吩_嗪、吖啶酮或硝基苯酚組成的組。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述熒光標記選自熒光素、若丹明、花青或merro花青。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述標記中產(chǎn)生熒光的部分選自2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮、熒光素二磷酸酯、熒光素3′(6′)-O-烷基-6′(3′)-磷酸酯、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯、4-甲基傘形?；姿狨?、試鹵靈磷酸酯、4-三氟甲基傘形酰基磷酸酯、傘形?；姿狨?、3-氰基傘形?；姿狨?、9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯、6，8-二氟-4-甲基傘形?；姿狨ゼ捌溲苌铩?br> 19.權(quán)利要求14的方法，其中所述標記是選自由5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、3-吲哚氧基磷酸酯、對-硝基苯基磷酸酯及其衍生物組成的組的生色部分。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光化合物是磷酸酯酶-活化的1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述1，2-二氧雜環(huán)丁烷化合物選自由2-氯-5-(4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-(5-氯-)三環(huán)[3，3，1-13，7]-癸烷]-1-基)-1-苯基磷酸酯、氯金剛烷基-2′-亞基甲氧基苯氧基磷?；蹼s環(huán)丁烷，3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷及其衍生物組成的組。
22.權(quán)利要求3的方法，其中所述酶選自磷酸酯酶、糖苷酶、多磷酸轉(zhuǎn)移酶、肽酶、氧化酶、過氧化物酶、硫酸酯酶、酯酶及其組合。
23.權(quán)利要求2的方法，其中所述的化學(xué)變化是由化學(xué)水解引起的。
24.權(quán)利要求2的方法，其中所述化學(xué)變化是由化學(xué)水解和酶促作用引起的。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的化學(xué)水解是自發(fā)的。
26.使用標記的核苷酸類似物測定靶核酸序列的方法，包括通過核酸聚合酶將所述的類似物摻入到與靶序列互補的多核苷酸中，產(chǎn)生既不是焦磷酸酯，也不是單-取代的焦磷酸酯的物種，再經(jīng)受化學(xué)變化產(chǎn)生可測定的信號。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述化學(xué)變化被一種或多種酶所催化。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述物種是帶有三個或多個磷酸根基團的標記的多磷酸酯。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述物種用下式表示Label-x-p-(p)n-p其中Label是可測定的部分，x是O、S、NH或連接基團，n＝1-4和p是磷酸根或磷酸根衍生物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中連接基團是酶-可移動的連接基團。
31.權(quán)利要求29的方法，其中連接基團在除去磷酸根以后自動被除去。
32.含有標記的磷酸的化合物，它包括下式Label-(P)n-P其中l(wèi)abel是可測定的部分，選自由熒光的、有顏色的、產(chǎn)生熒光的、發(fā)色的、發(fā)光的部分或化學(xué)發(fā)光標記組成的組，以及n是2-5。
33.含有標記的磷酸根的化合物，它包括下式Label-(P)n-P其中l(wèi)abel是可測定的部分，選自由產(chǎn)生熒光的、發(fā)光的部分或電化學(xué)標記組成的組，以及n是1-5。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用標記的底物或底物類似物測定靶的改進方法，所述方法包括在酶－催化的反應(yīng)中使所述底物或底物類似物進行反應(yīng)，僅當(dāng)?shù)孜锘虻孜镱愃莆锓磻?yīng)時，產(chǎn)生帶有獨立地可測定信號的標記部分。本發(fā)明特別公開了測定樣品中核酸的方法，所述方法基于使用末端－磷酸根－標記的核苷酸作為核酸聚合酶的底物。本發(fā)明方法使用核苷多磷酸酯、二脫氧核苷多磷酸酯或脫氧核苷多磷酸酯類似物，它們具有連接于末端磷酸根上的生色染料、化學(xué)發(fā)光或熒光部分、質(zhì)量標記或電化學(xué)標記。當(dāng)核酸聚合酶使用這些類似物作為底物時，酶－活化的標記將存在于磷酰基轉(zhuǎn)移的無機多磷酸酯副產(chǎn)品中，磷?；D(zhuǎn)移的多磷酸酯產(chǎn)品通過磷酸酯酶的斷裂導(dǎo)致其上連接的標記中的可測定變化，當(dāng)聚合酶試驗在磷酸酯酶存在下進行時，提供了實時監(jiān)測RNA或DNA合成和測定靶核酸的方便的方法。
文檔編號C12Q1/42GK1973048SQ200480003557
公開日2007年5月30日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月5日
發(fā)明者C·福勒, S·庫馬, A·索德, J·納爾遜 申請人:通用電氣醫(yī)療集團生物科學(xué)公司