專利名稱：生產(chǎn)能產(chǎn)生或修飾代謝途徑的進(jìn)化微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備可以產(chǎn)生或修飾代謝途徑的進(jìn)化微生物的方法，和根據(jù)本法所產(chǎn)生的進(jìn)化微生物及編碼其進(jìn)化蛋白的基因，以及所述的進(jìn)化微生物，基因或蛋白質(zhì)在生物轉(zhuǎn)化過程上的應(yīng)用。
制備修飾其性質(zhì)的微生物是很常見的方法。其目的在使微生物在具有選擇壓力的生長培養(yǎng)基中生長，從而選擇那些能夠抵抗壓力的微生物，或者用基因工程技術(shù)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)異種基因，從而使此微生物產(chǎn)生與所述異種基因表達(dá)有關(guān)的表現(xiàn)型特征。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，此類進(jìn)化可通過使用突變劑輕易達(dá)成。
通過除去培養(yǎng)基中某種成分轉(zhuǎn)化所必需的基因以在選擇壓力下生長，和利用突變劑生長進(jìn)化微生物的方法已于FR 2 823 219和WO 03/004656中有所敘述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種制備能產(chǎn)生或修飾代謝途徑的進(jìn)化微生物的方法，其特征在于其包括以下幾個(gè)步驟a)修飾原始微生物的細(xì)胞使其在某種特定的培養(yǎng)基中生長時(shí)抑制代謝物的生成或消耗，從而對微生物的生長造成負(fù)面的影響。如細(xì)胞未經(jīng)修飾，微生物則能產(chǎn)生或消耗此代謝物，并能夠在相同的特定培養(yǎng)基中正常生長。
b)使前項(xiàng)所得的經(jīng)修飾的微生物在所述特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其發(fā)生進(jìn)化，其中特定的培養(yǎng)基中可能包括進(jìn)化所需的某種共同底物。
c)篩選能夠在此適當(dāng)?shù)睾餐孜锏奶囟ǖ呐囵B(yǎng)基中生長的修飾微生物。
此進(jìn)化微生物優(yōu)選至少含有一個(gè)編碼進(jìn)化蛋白的進(jìn)化基因。此進(jìn)化過程可使受抑制的代謝途徑被一個(gè)新的代謝途徑所取代。
本發(fā)明還涉及一個(gè)包括在使修飾微生物生長的步驟b)前另加的一個(gè)步驟a1)的方法，在所述步驟a1)中，將至少一個(gè)編碼異種蛋白的異種基因?qū)?，其中此異種基因可預(yù)期產(chǎn)生進(jìn)化而演化出一條新的代謝途徑。
本發(fā)明還涉及一種包括將編碼進(jìn)化蛋白的基因分離的步驟d)的方法。本發(fā)明還涉及一種方法，其為將根據(jù)本發(fā)明得到的進(jìn)化基因以某種適合的形式導(dǎo)入某種用于生產(chǎn)的微生物中，進(jìn)而生產(chǎn)此進(jìn)化蛋白。
本發(fā)明還涉及一種由本發(fā)明上述或下列方法所獲得的進(jìn)化微生物。
本發(fā)明還涉及一種制備進(jìn)化蛋白的方法，其特征為使根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化微生物在一種合適的培養(yǎng)基中生長從而生產(chǎn)進(jìn)化蛋白并在有必要時(shí)將此蛋白純化。
本發(fā)明還涉及一種由本發(fā)明上述或下列方法所獲得的編碼進(jìn)化蛋白的進(jìn)化基因。
本發(fā)明還涉及一種由本發(fā)明上述或下列方法所獲得的進(jìn)化蛋白。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明上述或下列方法所產(chǎn)生的進(jìn)化微生物或進(jìn)化蛋白質(zhì)在生物轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用。
定義本發(fā)明將‘進(jìn)化微生物’定義為由修飾微生物經(jīng)篩選而獲得的微生物。進(jìn)化微生物與修飾微生物至少有一點(diǎn)不同。此不同可以為，例如其酶學(xué)特性有所改善或能產(chǎn)生一條新的代謝途徑。
本發(fā)明將‘代謝途徑’定義為經(jīng)一個(gè)或多個(gè)酶促反應(yīng)產(chǎn)生了一種分子(產(chǎn)品)而這分子與反應(yīng)前存在的分子(底物)有所不同。
根據(jù)本發(fā)明‘修飾’定義為一種改變，特別是指至少一種編碼酶的基因和/或此基因的啟動子的缺失。根據(jù)本發(fā)明‘代謝物’定義為由微生物合成和/或轉(zhuǎn)化的分子。
根據(jù)本發(fā)明‘特定的培養(yǎng)基’定義為一種分子組成已知且適合微生物生長的培養(yǎng)基。特定的培養(yǎng)基實(shí)質(zhì)上不含任何代謝物，其產(chǎn)物通過修飾而被抑制。
根據(jù)本發(fā)明‘共同底物’定義為一種與底物不同的有機(jī)或無機(jī)分子，此分子參與反應(yīng)并將其一個(gè)或多個(gè)原子供給底物從而產(chǎn)生一個(gè)新的產(chǎn)品。共同底物并不具所認(rèn)知的突變特性。
根據(jù)本發(fā)明‘篩選’定義為一種用來篩選已進(jìn)化的微生物的培養(yǎng)方法，其中該微生物的生長已不受修飾所影響。一種優(yōu)選的用途是連續(xù)培養(yǎng)的方法，其用稀釋率不斷增高的方法進(jìn)行，從而僅有那些生長率等于或高于所定稀釋率的微生物存留在培養(yǎng)基中。
根據(jù)本發(fā)明‘進(jìn)化基因’定義為一段由A，T，G或C組成的由終止密碼子(TAA，TAG，TGA)所限制的核苷酸序列。在篩選后，至少一個(gè)核酸與原序列不同，如此經(jīng)此進(jìn)化基因編碼所得的蛋白與經(jīng)原有基因編碼所得的蛋白至少有一個(gè)氨基酸的差異。
根據(jù)本發(fā)明‘異種基因’為由起始密碼子(ATG或GTG)和終止密碼子(TA，TAG，TGA)所包圍的一核苷酸序列。這序列又稱為編碼序列，其來源于與進(jìn)化和/或生產(chǎn)所用微生物不同的生物體。
根據(jù)本發(fā)明‘進(jìn)化蛋白’定義為一氨基酸序列(蛋白序列)，其在篩選后，至少一個(gè)氨基酸與與原蛋白序列不同。
根據(jù)本發(fā)明‘異種蛋白’定義為經(jīng)異種基因翻譯所得的蛋白。
基因與蛋白可由其主要序列確認(rèn)，還可經(jīng)序列或序列對比同源性確定同組蛋白。
PFAM(對比性與隱馬爾科夫模型蛋白家族數(shù)據(jù)庫；http://www.saneer.ac.uk/Software/Pfam/)存有大量蛋白序列對比性的訊息。每個(gè)PFAM能顯示多重對比性，展示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，評估在微生物中的分布，取得進(jìn)入其他數(shù)據(jù)庫的條件及觀察已知的蛋白結(jié)構(gòu)。
COGs(具同源件的蛋白質(zhì)簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是由與代表30個(gè)主要?jiǎng)又参锵档?3個(gè)全長基因組序列來源的蛋白序列比較而得。每個(gè)COG至少由3個(gè)系確認(rèn)以便鑒定其固有的保守結(jié)構(gòu)域。
本領(lǐng)域技術(shù)人員對鑒定同源系列及其同源性百分比的方法十分熟悉，其中包括可由網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)入的BLAST程序，其默認(rèn)參數(shù)值均登載在網(wǎng)址上。所得的序列尚可利用CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)等程序作進(jìn)一步的探索(對比)。其默認(rèn)參數(shù)值均登錄在網(wǎng)站上。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，利用基因庫(GenBank)所提供的基因資料可確定在其他生物體，細(xì)菌株，酵母，真菌，哺乳動物，植物等中存在的對等基因。這項(xiàng)常規(guī)工作有利地是將從其它微生物中獲得的基因進(jìn)行對比得道共有序列，然后再設(shè)計(jì)退化探針在另一生物體內(nèi)克隆相應(yīng)的基因。這些分子生物學(xué)的常規(guī)方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是非常熟悉的，而且這些方法亦在例如薩姆布魯克等所著的書內(nèi)有所描述(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，1989，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)。
根據(jù)本發(fā)明在進(jìn)化株上被缺失或過度表達(dá)的基因主要是應(yīng)用大腸桿菌基因命名定義的。但根據(jù)本發(fā)明，此種應(yīng)用更是常規(guī)的方法，其包括了在其他微生物中的相應(yīng)基因。利用基因庫所提供的大腸桿菌基因信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)定在其他細(xì)菌體內(nèi)的相應(yīng)基因。
根據(jù)本發(fā)明，‘新代謝途徑’是指一組一個(gè)或多個(gè)酶促反應(yīng)，反應(yīng)后產(chǎn)生一種化學(xué)產(chǎn)物。在篩選進(jìn)化微生物后其酶活性在同一代謝途徑中與未經(jīng)進(jìn)化的微生物有所不同。此種不同可為催化反應(yīng)的類型不同或具有不同的動力學(xué)特性(Km，Vmax，Ki，等)。一個(gè)新的酶學(xué)途徑能從一個(gè)與最初底物相同或不同的底物中產(chǎn)生一個(gè)與最初化學(xué)產(chǎn)物不同或相同的化學(xué)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，‘適當(dāng)形態(tài)’是指一個(gè)由起始密碼子(ATG或GTG)和終止密碼子(TAA，TAG，TGA)所包圍的核苷酸序列。這序列稱為編碼序列或?yàn)榫幋a序列的一部分。在所需要的調(diào)控子控制下使異種基因在微生物中表達(dá)。這些調(diào)控子，包括啟動調(diào)控子或啟動子，特別是在微生物中稱為強(qiáng)構(gòu)建啟動子的啟動子，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是非常熟悉的。構(gòu)成啟動子優(yōu)選地選自pTAC-O，pLAC-O，pTRC-O或使lac操縱子缺失而構(gòu)建的強(qiáng)啟動子，pTHLA。
根據(jù)本發(fā)明，‘原始微生物’是指一株從未經(jīng)過修飾，突變或進(jìn)化的微生物。
根據(jù)本發(fā)明，‘生產(chǎn)用微生物’是指經(jīng)進(jìn)化微生物導(dǎo)入一個(gè)新代謝途徑的進(jìn)化微生物或優(yōu)化微生物。
根據(jù)本發(fā)明，‘修飾微生物’是指一株經(jīng)可控性修飾而非經(jīng)進(jìn)化過程而獲得的微生物。例如基因的定向突變或缺失，或啟動子的定向修飾。
根據(jù)本發(fā)明，‘適合生產(chǎn)進(jìn)化蛋白的培養(yǎng)基’是指一個(gè)有確定成分的培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基，或部分成分確定培養(yǎng)基。復(fù)合培養(yǎng)基來源于植物，微生物或動物性水解產(chǎn)物。其組成可由分析確定。但這類培養(yǎng)基的徹底分析通常很難做到。部分成分確定的培養(yǎng)基是指在特定的的培養(yǎng)基中加入一些復(fù)合培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明，‘生物轉(zhuǎn)化過程’是指一個(gè)利用一個(gè)或數(shù)個(gè)酶將分子A轉(zhuǎn)化成分子B的過程。這些酶或許存在或許不存在在一株或數(shù)株微生物中。生物轉(zhuǎn)化過程可分成三類生物轉(zhuǎn)換，發(fā)酵和生物催化。在生物轉(zhuǎn)換中一種或多種酶由在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長的微生物所產(chǎn)生，將底物A，如有必要時(shí)將一種或多種共同底物轉(zhuǎn)換成底物B。在發(fā)酵時(shí)，一種或多種酶由在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長的一種或多種微生物所產(chǎn)生，從而由這些微生物合成底物A。這種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中含有共同底物。在生物催化反應(yīng)中，酶并不存在細(xì)胞內(nèi)而是在一個(gè)供應(yīng)底物A和其他生物轉(zhuǎn)化必備的共同底物的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基內(nèi)。
基因分離方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是非常熟悉的。同時(shí)這些方法亦在薩姆布魯克等著(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，1989，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)，奧蘇貝爾等著(現(xiàn)代分子生物協(xié)議，1987，約翰威利父子出版社，紐約)及馬尼阿提斯等著(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，1982，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)中均有介紹。這些方法使基因定位，拷貝，提取，然后再將此基因轉(zhuǎn)入一個(gè)新的生物體內(nèi)成為可能。在最后一步前，可在將基因?qū)肷矬w前加入一個(gè)將基因與一個(gè)多核苷酸結(jié)合的步驟。
蛋白純化方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是非常熟悉的。同時(shí)這些方法亦在科立根等著(現(xiàn)代蛋白科學(xué)協(xié)議，1997，約翰威利父子出版社，紐約)中均有介紹。這些方法能使在斷片或非斷片蛋白質(zhì)提取物中提取感興趣蛋白質(zhì)成為可能。然后純化蛋白質(zhì)，如果此蛋白質(zhì)為酶，則可通過純化增強(qiáng)它的活性。這些方法也可使在必要時(shí)將蛋白質(zhì)固定在支承體上(樹脂)成為可能。
根據(jù)本發(fā)明，‘缺失’是指抑制‘缺失’的基因的活性。此種抑制可通過某種適當(dāng)?shù)氖侄危瑢⑺P(guān)注的基因鞭表達(dá)產(chǎn)物失活而實(shí)現(xiàn)，或通過抑制所關(guān)注基因的表達(dá)，或通過使至少部分基因缺失從而使基因表達(dá)產(chǎn)生障礙(如使表達(dá)所需的啟動子全部或部分缺失)，或通過使表達(dá)產(chǎn)物失去功能(如使所關(guān)注基因的編碼部分缺失)等來實(shí)現(xiàn)。基因缺失優(yōu)選地包括除去大部分基因。如有必要，可用一段標(biāo)記基因來取代以便確認(rèn)，分離與純化根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化株。
根據(jù)本發(fā)明，‘底物’是能被酶轉(zhuǎn)化的代謝物。如有必要以共同底物存在。
發(fā)明的詳細(xì)描述A.被修飾的微生物根據(jù)本發(fā)明，被修飾的微生物可為真核或原核生物。
根據(jù)本發(fā)明，一株微生物是指一組同種的微生物，其包括至少一種此株的微生物。因此所描述的此株微生物的特性與也是此株內(nèi)任何一種微生物的特性。同理，描述的任何一株微生物的特性也可代表此株內(nèi)所有微生物的特性。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)化細(xì)菌選自細(xì)菌，酵母或真菌。具體而言，曲霉菌屬(Aspergillus sp.)，桿狀菌屬(Bacillus sp.)，短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)，梭狀桿菌屬(Clostridium sp.)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)，埃希氏菌屬(Escherichia sp.)，葡糖酸桿菌屬(Gluconobacter sp.)，假單胞菌署(Pseudomonas sp.)，紅球菌屬(Rhodococcus sp.)，酵母菌(Saccharomyces sp.)，鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)，黃單胞菌屬(Xanthomonas sp.)及假絲酵母(Candida sp.)。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，菌屬為埃希氏菌屬，具體為大腸桿菌。在另一個(gè)實(shí)施例中，菌屬為棒狀桿菌屬，具體為谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，酵母是酵母菌屬，具體為塞里維辛酵母菌(S.cerevisiae)。
為了制備修飾微生物，有利地是將與欲修飾的代謝途徑有關(guān)或無關(guān)的其他基因減弱或缺失，以利于微生物的進(jìn)化。
為制備修飾微生物，還可使與欲修飾的代謝途徑有關(guān)或無關(guān)的異種基因或非異種基因過度表達(dá)，以利于微生物的進(jìn)化。
基因過度表達(dá)可通過將啟動子原位更換為強(qiáng)啟動子或可誘導(dǎo)的啟動子而實(shí)現(xiàn)?；蚩蓪⒁粋€(gè)或數(shù)個(gè)復(fù)制的質(zhì)?？截悓?dǎo)入細(xì)胞中，在所述質(zhì)粒上，將被過度表達(dá)的基因由適當(dāng)?shù)膯幼诱{(diào)控。
所使用的修飾方法當(dāng)根據(jù)選擇的被修飾的代謝途徑而定。在下列所述的代謝途徑中，所使用的方法將逐一描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知修飾微生物基因特性所用的方法。
優(yōu)選地用同源重組法使基因失活。(達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR產(chǎn)物將大腸桿菌K-12染色體基因一步失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645)。現(xiàn)將此方法原理略述于下將在體外獲得的一個(gè)直鏈基因片段導(dǎo)入細(xì)胞中；此片段由跨越基因的兩側(cè)兩個(gè)區(qū)域和至少一個(gè)被選中的位于此二區(qū)域之間的基因(通常是個(gè)耐抗生素基因)構(gòu)成。此基因片段代表一個(gè)失活基因。經(jīng)歷重組并有基因片段融入的細(xì)胞通過將其涂抹在一個(gè)選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。經(jīng)二次重組后的固有基因已被失活基因取代的細(xì)胞隨即被篩選出來?？捎藐幮曰蜿栃院Y選系統(tǒng)增加二次重組的檢測率來改善本方法。
塞里維辛酵母菌(S.cerevisiae)中基因的失活可優(yōu)選地利用同源重組來實(shí)現(xiàn)。(鮑丁等，核酸研究，21，3329-3330，1993；臥旭等，酵母雜志，10，1793-1808，1994；布拉格門等，酵母雜志，14115-32，1998)。
B.生產(chǎn)用微生物生產(chǎn)用微生物選自以上所列的細(xì)菌，酵母及真菌。它可是根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化過程所獲得的進(jìn)化微生物，或?yàn)樯a(chǎn)所欲得的代謝物而優(yōu)化的微生物，在此微生物內(nèi)至少導(dǎo)入一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)化基因。
C.微生物的培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明，‘培養(yǎng)’和‘發(fā)酵’互相通用，是指在一合適的含有簡單碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。
根據(jù)本發(fā)明，簡單碳源是指碳的來源，本領(lǐng)域技術(shù)人員可其獲得正常生長的微生物，特別是細(xì)菌。具體而言，其可為可吸收的糖類，如葡萄糖，半乳糖，蔗糖，乳糖，或糖蜜或其他糖的副產(chǎn)品。葡萄糖是一個(gè)特別優(yōu)選的簡單碳源。蔗糖是另一個(gè)優(yōu)選的簡單碳源。
根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定微生物的培養(yǎng)條件。具體而言，細(xì)菌可在20℃與55℃的間發(fā)酵，優(yōu)選為25℃與40℃。對谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)而言，30℃左右最佳，對大腸桿菌(E.coli)而言，37℃左右最佳。
發(fā)酵通常在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，罐內(nèi)裝有適合細(xì)菌生長的已知的特定的無機(jī)培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基內(nèi)至少有一種簡單碳源，如有必要亦可加入生成代謝物所需的共同底物。
具體而言，大腸桿菌的無機(jī)培養(yǎng)基與M9培養(yǎng)基(安德生，1946，美國國家科學(xué)院院刊，32120-128)，M63培養(yǎng)基(米勒，1992；細(xì)菌基因?qū)W速成大腸桿菌及有關(guān)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)，或與由西華等人發(fā)展出的培養(yǎng)基(1999，生物化學(xué)年鑒，27088-96)成分類似或相同。
類似地，用于谷氨酸棒狀桿菌(C.glutamicum)的無機(jī)培養(yǎng)基與BMCG培養(yǎng)基(賴伯等1989，微生物技術(shù)應(yīng)用32205-210)或與由萊德等人發(fā)展出的培養(yǎng)基(2001，分子微生物技術(shù)雜志，3573-583)成分類似或相同。
D.代謝途徑欲進(jìn)化的代謝途徑常選自氨基酸合成途徑、核酸合成途徑、脂質(zhì)合成途徑、或糖類代謝途徑中挑選。
在本發(fā)明第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，進(jìn)化的代謝途徑是氨基酸的生物合成途徑，具體而言選自蛋氨酸(methionine)、半胱氨酸(cysteine)、蘇氨酸(threonine)、賴氨酸(lysine)或異亮氨酸(isoleucine)的氨基酸生物合成途徑。
在本發(fā)明第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，修飾的代謝途徑是由NADPH再生NADP的代謝途徑。半胱氨酸、羥基丙酸鹽與木糖醇的生物合成途徑將被用到。
D.I.蛋氨酸生物合成途徑例如，本發(fā)明可應(yīng)用在蛋氨酸生物合成途徑上(圖1)用來生產(chǎn)某種微生物株，特別是細(xì)菌，如大腸桿菌或棒狀桿菌。此種細(xì)菌能產(chǎn)生2-氨基-4-(烷巰基)丁酸。具體如通過一個(gè)簡單的碳源和硫源，例如甲硫醇(CH3SH)，硫化氫(H2S)或其生理上能被接受的鹽，生成L-蛋氨酸2-氨基-4-(甲巰基)丁酸。硫源H2S亦可以硫酸鹽形式加入培養(yǎng)基內(nèi)。本發(fā)明還涉及此株微生物與其改進(jìn)的酶及其編碼序列。本發(fā)明最后涉及利用培養(yǎng)所述微生物株來生產(chǎn)蛋氨酸。DN-蛋氨酸在工業(yè)上是由化學(xué)合成的。甲硫醇與丙烯醛作用而產(chǎn)生β-硫丙醛，再與氰化氫作用產(chǎn)生α-羥基-γ-硫代丁腈。經(jīng)氨水處理及水解后得到蛋氨酸。
所有工業(yè)生產(chǎn)DL-蛋氨酸均應(yīng)用相同的原料丙烯醛，甲硫醇，氰化氫，氨水貨碳酸氨。外消旋的蛋氨酸的合成可以以批量或連續(xù)的程序進(jìn)行。
工業(yè)生產(chǎn)程序包括在化學(xué)合成內(nèi)另加了一個(gè)用由米曲霉菌(Aspergillus oryzas)產(chǎn)生的氨?；D(zhuǎn)移酶將DL-蛋氨酸轉(zhuǎn)化為純L-蛋氨酸的生物催化過程。
第6,379,934號美國專利及第1 055 730號歐洲專利描述了用某株棒狀菌經(jīng)擴(kuò)增accBC基因來生產(chǎn)氨基酸的方法。其中提到了蛋氨酸。但僅例舉了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
但是利用微生物培養(yǎng)合成含硫氨基酸在可行的工業(yè)尺度上而言還是十分困難的。其主要是由于生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。
蛋氨酸代謝在某層次上是被嚴(yán)密調(diào)控的(魏士巴克等，1991，分子微生物學(xué)，5，1593-1597)●由三磷酸甘油酸鹽合成L-絲氨酸及由天冬氨酸和乙酰輔酶A合成L-高絲氨酸的經(jīng)碳代謝。
●由培養(yǎng)基中存在的乙酰輔酶A與硫酸鹽及L-絲氨酸合成L-半胱氨酸的經(jīng)硫代謝。
●由L-高絲氨酸，半胱氨酸與乙酰輔酶A或琥珀酰輔酶A合成蛋氨酸。(圖1)世界專利申請書WO 93/17112描述了在不同生物體內(nèi)由L-天冬氨酸生物合成蛋氨酸所涉及的各種酶。此專利申請也描述了在用甲硫醇和硫化氫供應(yīng)硫時(shí)，將一些可指導(dǎo)蛋氨酸合成的異種基因?qū)胛⑸锏姆椒ā?br> 此發(fā)明涉及一些微生物株，具體而言如細(xì)菌，特別是能產(chǎn)生通式(I)的2-氨基-4-(烷巰基)丁酸的大腸桿菌與棒狀桿菌。
R-S-(CH2)2-CHNH2-COOH(I)其中，R是含有1到18碳原子的直鏈或支鏈烷基。其可能含有一個(gè)或多個(gè)羥基取代物，或在其異芳環(huán)內(nèi)含有一至數(shù)個(gè)氮原子或硫原子的芳基或異芳基。其可能是苯基，吡啶基(pyrolyl)，吡咯基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，或噻吩基。
通過由通式(II)代表的化合物組成的簡單碳源與硫源的代謝R’-SH(II)其中，R′是氫原子或是如上所述的R及其生理上能被接受的鹽，其微生物中至少有一個(gè)編碼具有‘蛋氨酸合成酶’的活性的酶的基因。
根據(jù)本發(fā)明，具修飾的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶能將如通式(III)所描述的底物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化而合成如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巰基)丁酸。
R”-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)其中，R”是酰基，優(yōu)選是琥珀?；蛞阴；?。
或直接將底物生物轉(zhuǎn)化成如通式(I)所示的酸。
或?qū)⒌孜锷镛D(zhuǎn)化成如通式(IV)所示的高半胱氨酸。
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)高半胱氨酸再經(jīng)合適的酶轉(zhuǎn)化成如通式(I)所示的酸。
與天然酶相比，這些具有‘蛋氨酸合成酶’活性的酶是經(jīng)過經(jīng)修飾而得的，因此它們能將如通式(III)所示的底物優(yōu)選地生物轉(zhuǎn)化成如通式(I)所示的酸，或轉(zhuǎn)化成如通式(IV)所示的高半胱氨酸，以此取代了其他天然酶催化的反應(yīng)。這種修飾也稱突變，主要導(dǎo)致了修飾過的酶對如通式(II)所示的含硫化合物產(chǎn)生比其天然共同底物更大的親和力。
根據(jù)本發(fā)明，簡單碳源是本領(lǐng)域技術(shù)人員為了使微生物，特別是細(xì)菌正常生長而選用的任何可應(yīng)用的碳源。此定義包括任何可吸收的糖類，如葡萄糖，半乳糖，蔗糖，或糖蜜或這些糖的其他副產(chǎn)品。葡萄糖是一個(gè)特別優(yōu)選的簡單碳源。蔗糖是另一個(gè)優(yōu)選的簡單碳源。
根據(jù)本發(fā)明，生理上能接受的鹽是不影響微生物代謝或生長的通式(I)的任何鹽。它可能是一個(gè)堿金屬鹽，如鈉鹽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，R是具有1到4碳原子的直鏈或支鏈烷基，具體而言如甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基及叔丁基，但優(yōu)選的是甲基。
所得的如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巰基)丁酸優(yōu)選地是L-蛋氨酸。用如通式(II)所示的簡單碳源和硫源經(jīng)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生如通式(I)所示的丁酸有以下數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)-只須一或二個(gè)步驟即可由O-?；?L-高絲氨酸合成如通式(I)所示的酸或蛋氨酸，同時(shí)與高半胱氨酸合成及四氫葉酸循環(huán)無關(guān)。
-通式(II)所示的含硫化合物，如甲硫醇，通常是有毒性的石油化學(xué)品，現(xiàn)可將其用作生物合成生產(chǎn)有用氨基酸的原料，以增加其利用價(jià)值。
本發(fā)明是基于在甲硫醇存在下直接修飾胱硫醚-γ-合成酶(EC4.2.99.9；GenBank AAN83320，或AAA24167)的‘蛋氨酸合成酶’活性。此在蛋氨酸生物合成途徑中的酶是受大腸桿菌(圖2)和谷氨酸棒桿菌的metB基因所編碼。它對許多底物均有活性。(傅雷文與斯勞特，1967，直接由O-琥珀酰-高絲氨酸酶促合成高絲氨酸或蛋氨酸，生物化學(xué)與生物物理，132400-405)。
本發(fā)明也是基于在甲硫醇存在下直接修飾O-乙?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶(或O-乙?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶，C4.2.99.9)的‘蛋氨酸合成酶’活性。此在蛋氨酸生物合成途徑中的酶是受谷氨酸棒桿菌的metB基因(GenBank AF220150)所編碼。它對許多底物均有活性。(斯密斯與湯沐森，1969，在無蛋氨酸的脈孢菌變種及其向蛋氨酸轉(zhuǎn)化途徑中S-半胱氨酸甲酯與甲硫醇的應(yīng)用，生物化學(xué)與生物物理，184(1)130-8)。
本發(fā)明還涉及制備根據(jù)本發(fā)明的菌株方法，以及此方法在菌株使用在制備通式(I)的2-氨基-4-(烷巰基)丁酸、優(yōu)選L-蛋氨酸中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，制備菌株的方法包括從原始菌株得到經(jīng)修飾的菌株。該菌株內(nèi)至少一處對編碼具有‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因進(jìn)行的修飾。該修飾過程包括將原始菌株暴露于通式(II)所示的化合物存在的選擇壓力中。其目的是將該菌種中編碼具‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因進(jìn)化為相對原始菌種其編碼具‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因被修飾。
在相同培養(yǎng)條件下(在含有適當(dāng)量如通式(II)所示的含硫化合物的培養(yǎng)基內(nèi))，當(dāng)菌株(A)比原始菌株(I)能產(chǎn)生更多蛋氨酸時(shí)，則其‘蛋氨酸合成酶’的活性有所改進(jìn)。優(yōu)選用合成的蛋氨酸的數(shù)量來評估改善的程度。在一些情況下，可在一無蛋氨酸存在的基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)用菌株(A)相對于菌株(B)的生長率增加程度來觀察改善的程度。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的方法篩選出的‘蛋氨酸合成酶’活性改善的菌株，以及至少一個(gè)編碼由上述和下述內(nèi)容定義的具有經(jīng)修飾的蛋氨酸合成酶’活性的酶的基因。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施例中，具改善‘蛋氨酸合成酶’活性的酶可直接將如通式(III)所示的底物轉(zhuǎn)化成如通式(I)所示的酸。在此例中硫源是如通式(II)所示的化合物，其中R′是如上定義的R基。
具改善的蛋氨酸合成酶活性的酶可選自胱硫醚-γ-合成酶或乙?；呓z氨酸硫化氫解酶。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施例中，具改善‘蛋氨酸合成酶’活性的酶可將如通式(III)所示的底物轉(zhuǎn)化成如通式(IV)所示的高半胱氨酸。
HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)然后高半胱氨酸再經(jīng)合適的酶轉(zhuǎn)化成如通式(I)所示的酸。在此情況下，硫源是如通式(II)所示的化合物，其中，R′是氫原子，優(yōu)選是硫化氫。硫源H2S可直接加入培養(yǎng)基中，或由細(xì)菌從簡單硫源，如硫酸鹽產(chǎn)生。
具改善的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶優(yōu)選地選自胱硫醚-γ-合成酶或乙?；呓z氨酸硫化氫解酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何依據(jù)它們的進(jìn)化能力來選擇其他的具有修飾的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶，以便進(jìn)行上述的修飾的酶促‘蛋氨酸合成酶反應(yīng)’。具體例子包括由細(xì)菌cysK和cysM基因編碼的半胱氨酸合成酶A和B。
對本文中所定義的修飾的胱硫醚-γ-合成酶而言，底物有利的是O-乙酰基-L-高絲氨酸或O-琥珀酰-L-高絲氨酸，優(yōu)選O-琥珀酰-L-高絲氨酸。
對本文中所定義的修飾的乙?；呓z氨酸硫化氫解酶而言，底物有利地是O-乙?；?L-高絲氨酸或O-琥珀酰-L-高絲氨酸，優(yōu)選為O-乙?；?L-高絲氨酸。
對此兩種酶而言，所謂修飾就是突變。突變后可使如通式(III)所示的底物優(yōu)選地與如通式(II)所示的化合物，而不與L-半胱氨酸反應(yīng)發(fā)生轉(zhuǎn)化。
酶突變可通過實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明所示的在含有通式(II)所示的化合物的培養(yǎng)基中采用選擇壓力培養(yǎng)制備具有改善‘蛋氨酸合成酶’活性的菌株的方法來獲得。
此時(shí)，具有胱硫醚-γ-合成酶或乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶編碼序列的基因可能是●在原始株(I)基因組內(nèi)能表達(dá)并翻譯相應(yīng)的酶的野生型基因?；颉癜琢蛎?γ-合成酶或乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶的編碼序列的異種基因可在調(diào)控因子控制下可在被導(dǎo)入的原始株(I)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)與翻譯。
●使存在于原始株(I)內(nèi)的野生型基因直接突變，具體地如通過同源重組突變而得到的基因。
●現(xiàn)將胱硫醚-γ-合成酶或乙?；呓z氨酸硫化氫解酶編碼序列用常規(guī)手段直接突變，然后再將其導(dǎo)入原始株(I)，并在調(diào)控因子控制下能在原始株(I)中具有表達(dá)和翻譯能力的基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員對這些調(diào)控因子十分熟悉。其包括了啟動子調(diào)節(jié)序列或啟動子。具體地如強(qiáng)構(gòu)建啟動子。強(qiáng)構(gòu)建啟動子優(yōu)選地為pTAC-O(SEQ ID No.1)，pLAC-O(SEQ ID No.2)，pTRC-O(SEQ ID No.3)，或pTHLA(SEQ ID No.4)。所有這些都是由lac操縱子缺失而構(gòu)成的強(qiáng)啟動子。
‘原始’或未修飾‘蛋氨酸合成酶’活性的胱硫醚-γ-合成酶有利地選自PFAM，參考號PF01053或COG參考號CPG0626的胱硫醚-γ-合成酶。
胱硫醚-γ-合成酶優(yōu)選是從大腸桿菌K12的胱硫醚-γ-合成酶。其代號為SEQ ID No.6。與此序列同源的序列具有胱硫醚-γ-合成酶活性。相對SEQ ID No.6氨基酸序列的同源性至少有80％，優(yōu)選為90％，更優(yōu)選為95％。
本領(lǐng)域技術(shù)人員對鑒定同源序列及同源性百分比都十分熟悉。特別可利用是BLAST程序。例如BLASTP程序可登錄其網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用。所有默認(rèn)參數(shù)亦可在此網(wǎng)站上查到。
在本發(fā)明的一個(gè)較優(yōu)選的實(shí)施例中，原始胱硫醚-γ-合成酶在修飾前在其氨基酸序列C-末端(保守區(qū)域1)有以下序列X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1代表A，G，S，優(yōu)選為AX2代表E，V，P，T，優(yōu)選為EX3代表S，T，N，優(yōu)選為SX4代表G，D，A，H，T，優(yōu)選為GX5代表V，A，T，H，N，優(yōu)選為VX6代表E，R，K，F(xiàn)，優(yōu)選為EX7代表S，T，優(yōu)選為SX8代表L，I，V，A，優(yōu)選為LX9代表I，V，A，T，優(yōu)選為I在根據(jù)本發(fā)明，具有‘蛋氨酸合成酶’活性的修飾胱硫醚-γ-合成酶，在其C-末端(保守區(qū)域1)有以下一段氨基酸序列A-E-S-L-G-G-V-E-S原始胱硫醚-γ-合成酶在修飾前在其N-末端(保守區(qū)域2)含有以下一段氨基酸序列X10-X11-Y-X12-R-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X10代表H，Y，F(xiàn)，L，K，優(yōu)選為AX11代表E，D，K，R，V，I，優(yōu)選為YX12代表S，A，T，P，G，優(yōu)選為SX13代表I，S，T，R，E，F(xiàn)，W，D，優(yōu)選為SX14代表S，G，A，I，E，N，K，P，優(yōu)選為GX15代表N，H，Q，S，優(yōu)選為NX16代表P，D，L，優(yōu)選為PX17代表T，M，N，G，S，優(yōu)選為T
X18代表R，L，V，S，W，E，優(yōu)選為R氨基酸X1 to X9對應(yīng)SEQ ID No.6所示的大腸桿菌K12的胱硫醚-γ-合成酶的324-334殘基。
氨基酸X10 to X18對應(yīng)SEQ ID No.6所示的大腸桿菌K12的胱硫醚-γ-合成酶的44-54殘基。
在全文中所用的氨基酸位置是參照大腸桿菌K12的胱硫醚-γ-合成酶的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員如何利用序列對比工具在其他胱硫醚-γ-合成酶序列中找到所對應(yīng)的氨基酸。這些工具包括BLAST程序?？傻卿浧渚W(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/使用。所有默認(rèn)參數(shù)亦可在此網(wǎng)站上查到。序列對比可在蛋白質(zhì)(SEQ ID No.6)和其編碼序列上完成，例如SEQ ID No.5所代表的編碼序列。
BlastP的進(jìn)一步搜索功能可用(PHI-BLAST)主旨來簡化搜索。主旨[AGS]-[EVPT]-[STN]-L-G-[GDAHT]-[VATHN]-[ERKF]-[ST]-[LIVA]-[IVAT]可用于保守區(qū)域1，主旨x(2)-Y-[SATPG]-R-x(2)-[NHQS]-[PDL]-[TMNGS]-[RLVSWE]可用于保守區(qū)域2。其中粗體字母代表在那位置上最常出現(xiàn)的氨基酸，x代表任何氨基酸，而在括號內(nèi)的數(shù)字2表示那里有兩個(gè)未定的氨基酸。
至于序列對比，則可用CLUSTALW程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN程序(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cei-bin/multalin.pl)。其默認(rèn)參數(shù)均在網(wǎng)站上可尋。
圖7顯示對不同胱硫醚-γ-合成酶的序列對比。
它們優(yōu)選地選自以下的胱硫醚-γ-合成酶(CGS)Q9ZMW7 O-琥珀酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，幽門螺旋桿菌P46807 O-琥珀酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，麻風(fēng)分枝桿菌AAO29646 苛養(yǎng)木桿菌Temeculal株(Xylella fastidiosaTemeculal)
NP_638204 野生黃單胞菌野生株.ATCC 33913NP_358970 肺炎鏈球菌R6NP_126586 O-琥珀酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，阿比西火球菌NP_373671 金黃色葡萄球菌金黃色亞種N315NP_418374 大腸桿菌K12NP_601979 谷氨酸棒桿菌ATCC 13032NP_343729 O-琥珀酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，硫磺礦硫化葉菌NP_786043 O-琥珀酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳桿菌WCFS1NP_719586 金屬離子還原菌MR-1(Shewanellaoneidensis MR-1)CAD30944 天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)NP_696324 雙叉桿菌NCC2705NP_457953 沙門氏傷寒桿菌NP_539021 羊布魯氏桿菌(Brucella melitensis)EAA30199 O-琥珀酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，真菌脈胞菌BAC61028 副溶血弧菌如上所述的修飾胱硫醚-γ-合成酶優(yōu)選地表示至少應(yīng)當(dāng)在其C末端有一個(gè)突變和(或)在其N末端也至少有一個(gè)突變。
根據(jù)本發(fā)明，所謂突變是指在野生型序列中的某個(gè)氨基酸被一個(gè)不同的氨基酸所取代。
突變優(yōu)選地包括用一個(gè)非極性氨基酸替換與未修飾的酶的半胱氨酸共同底物作用的酸性氨基酸。此非極性氨基酸可能是甘氨酸，丙胺酸，亮胺酸，異亮胺酸，纈胺酸，苯丙胺酸或蛋氨酸殘基。
這些氨基酸可由科羅森等所描述的大腸桿菌胱硫醚-γ-合成酶的晶體結(jié)構(gòu)確認(rèn)。(EMBOJ，Vol.17，No.23，pp 6827-6838，1998)。
在C-末端的突變最好能發(fā)生在‘保守區(qū)域1’內(nèi)的酸性氨基酸上。如在殘基X2上則更佳。
根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾后具有‘蛋氨酸合成酶’特性的胱硫醚-γ-合成酶有利地在其C-末端有以下的序列為佳X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1，X3，X4，X5，X6，X7，X8和X9如前所述。
X2代表G，A，L，I，V，F(xiàn)，或M，優(yōu)選地為A。
在N-末端的突變最好能發(fā)生在如上所述的‘保守區(qū)域2’內(nèi)的氨基酸上。如在殘基X11和(或)R和(或)X13上為優(yōu)選。
根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾后具有‘蛋氨酸合成酶’特性的胱硫醚-γ-合成酶最好在其C-末端有以下的序列A-A-S-L-G-G-V-E-S根據(jù)本發(fā)明經(jīng)修飾后具有‘蛋氨酸合成酶’特性的胱硫醚-γ-合成酶在其N-末端有以下的序列為佳X10-X11-Y-X12-X19-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X7，X9，X12，X14，X15，X16，X17和X18如前所述，X11如前所述或是一個(gè)非極性氨基酸，X13如前所述或是一個(gè)非極性氨基酸，X19如前所述或是一個(gè)非極性氨基酸，同時(shí)至少一個(gè)X11，X13和X19的氨基酸是如上所述的非極性氨基酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，依此方法修飾而具有‘蛋氨酸合成酶’活性的胱硫醚-γ-合成酶就是一個(gè)上述的胱硫醚-γ-合成酶。其利用甲硫醇(如通式(II)所示的化合物，其中R是個(gè)甲基)將O-琥珀酰L-高絲氨酸直接轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，具有‘蛋氨酸合成酶’活性的胱硫醚-γ-合成酶含有如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。編碼此修飾酶的DNA序列如SEQ ID No.7所示。
本法明亦涉及如上所述的修飾胱硫醚-γ-合成酶及其編碼核苷酸序列。特別是其DNA序列。特別是分離的序列，更特別是其由SEQ ID No.7所代表的序列，含有在宿主生物內(nèi)在修飾的胱硫醚-γ-合成酶表達(dá)及轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)控因子控制下的這些核苷酸序列的克隆和(或)表達(dá)載體，及接受這些載體轉(zhuǎn)化的宿主生物。
‘原始’或未修飾的的‘蛋氨酸合成酶’活性?；呓z氨酸硫化氫解酶最好從對應(yīng)于PFAM PF01053和COG CPG02873的?；呓z氨酸硫化氫解酶中挑選。
以從以下所列的乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶中挑選為優(yōu)選NP_785969 O-乙?；呓z氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳桿菌WCFS1AAN68137 O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶，惡臭假單胞菌KT2440NP_599886 O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶，谷氨酸棒桿菌ATCC 13032NP_712243 乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶，鉤端螺旋體黃膽出血型賴株56601BAC46370 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，慢性型大豆根瘤菌USDA110AAO57279 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，假單胞桿菌丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000NP_284520 O-琥珀酰高絲氨酸 硫化氫解酶[腦膜炎奈瑟菌Z2491AAA83435 O-琥珀酰高絲氨酸 硫化氫解酶(銅假綠單胞菌)在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，為了修飾蛋氨酸的生物合成途徑必須先用基因工程來修飾細(xì)菌。此修飾包括必須減弱至少一個(gè)基因和可能須要克隆至少一個(gè)異種基因。減弱基因使細(xì)菌為了生長而修復(fù)一條相當(dāng)?shù)耐緩?。這個(gè)經(jīng)基因工程修飾過的細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)與篩選，其生長率可在外源性共同底物的存在或不存在時(shí)而加快。
根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建菌株的方法包括獲得原始菌株，將該菌株修飾使其在編碼具有“蛋氨酸合成酶”活性的酶(如大腸桿菌MetE)或具有“高半胱氨酸合成酶”活性的酶(如大腸桿菌MetC)的基因上具有至少一處修飾。在構(gòu)造新的菌株過程中，將所述原始菌株在前述含硫培養(yǎng)基中承受選擇壓力至少使其中一個(gè)基因產(chǎn)生突變(如大腸桿菌MetE)而使進(jìn)化株恢復(fù)蛋氨酸合成酶或高半胱氨酸合成酶活性。這活性的恢復(fù)與修飾的倒轉(zhuǎn)無關(guān)。
本發(fā)明又涉及了一株具有改進(jìn)“蛋氨酸合成酶”活性的菌種，其中至少有一個(gè)涉及傳統(tǒng)蛋氨酸生物合成途徑的內(nèi)源基因被失活。
在優(yōu)選實(shí)施例中，該菌株至少有一個(gè)失活的內(nèi)源基因。內(nèi)源基因可從下列基因中選擇metB，metJ，metC，metE，或metH。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述修飾菌株是株具有改進(jìn)“蛋氨酸合成酶”活性的菌種，例如大腸桿菌。先將大腸桿菌野生株的蛋氨酸合成酶活性(受metE基因編碼)失活，在將此菌株在一個(gè)不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸及胱硫醚，但含甲硫醇(外源性共同底物)或其某種鹽化合物的中培養(yǎng)。同時(shí)篩選一株進(jìn)化微生物。其胱硫醚-γ-合成酶在甲硫醇存在下具有很強(qiáng)的蛋氨酸合成酶活性。強(qiáng)到能將失活的活性恢復(fù)。在這一個(gè)實(shí)施例中，有必要指出用來篩選進(jìn)化微生物的培養(yǎng)基與用來生長原始微生物(未經(jīng)修飾的微生物)的培養(yǎng)基完全相同。只是增加了一個(gè)共同底物(烷基硫醇)。在某特定的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的被進(jìn)化的微生物是一株大腸桿菌，更優(yōu)選是大腸桿菌K183株。此株曾在2003年4月2日依布達(dá)佩斯公約在CNCM取得注冊號碼I-3005。(地址為25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，F(xiàn)rance)此株含有表達(dá)修飾過的胱硫醚-γ-合成酶的基因，藏有突變E325A的酶及失活的metE基因。
在本發(fā)明的某應(yīng)用特例中，亦可采用有更多缺失基因的菌種，如metC和/或metH和/或metJ缺失，來獲取具有改善“蛋氨酸合成酶”性能的菌株。
在第二個(gè)相當(dāng)?shù)膬?yōu)選實(shí)施例中，所述原始菌株，特別是大腸桿菌的修飾包括先將胱硫醚-γ-合成酶活性(由大腸桿菌的metC基因編碼)失活，再將所述進(jìn)化菌株在一個(gè)不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸及胱硫醚的特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在內(nèi)源硫化氫存在情況下選擇具有很高的胱硫醚-γ-合成酶的高半胱氨酸合成酶活性的進(jìn)化微生物。其活性高到能取代失活前的程度。在這一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，有必要指出用來篩選進(jìn)化微生物的培養(yǎng)基與用來生長原始微生物(未經(jīng)修飾的微生物)的培養(yǎng)基完全相同。在此例中某一特例下，可將NaSH加入培養(yǎng)基內(nèi)。在另一個(gè)特別應(yīng)用下，可采用另外在metH和/或metJ中具有至少一處突變的菌株。
在本發(fā)明的第三個(gè)相當(dāng)?shù)膶?shí)施例中，所述原始株，特別大腸桿菌的失活包括將野生型琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶活性(由metB基因編碼)和蛋氨酸合成酶活性(受大腸桿菌的metE基因編碼)失活。然后將乙?；呓z氨酸硫化氫解酶(由谷氨酸棒狀桿菌的metY基因編碼)轉(zhuǎn)入此菌株內(nèi)。再將得到的所述修飾菌株在一個(gè)不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸及胱硫醚，但含甲基硫醇鈉的特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其目的在篩選出一株在甲基硫醇鈉存在下其乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶(MetY)具有很高的蛋氨酸合成酶活性的進(jìn)化株。其活性高到能取代失活前的蛋氨酸合成酶活性。在本發(fā)明的這一個(gè)實(shí)施例中，有必要指出用來篩選進(jìn)化微生物的培養(yǎng)基與用來生長原始微生物(未經(jīng)修飾的微生物)的培養(yǎng)基完全相同。僅加了一個(gè)共同底物(甲基硫醇)。在此例中某一特例中，可采用另外至少在metH和/或metJ和/或metC基因中具有缺失的菌株。
在JP 2000157267-A/3中建議將metJ突變來產(chǎn)生更多的蛋氨酸(參見GenBank E35587)。此基因編碼的蛋白質(zhì)能抑制如metB，E，L，J和R基因(在鼠傷寒沙門氏菌中)。這類失活及修飾步驟能減少所受蛋氨酸負(fù)反饋的影響。
基因metC(GenBank M12858)編碼胱硫醚-β-裂解酶(EC 4.4.1.8)?；騧etE(GenBank AE000458)和基因metH(GenBank J04975)編碼蛋氨酸合成酶(EC 2.1.1.13)。蛋氨酸是細(xì)胞存活所需的重要的氨基酸。失活一個(gè)或多個(gè)這些基因則會使蛋氨酸生物合成途徑受到抑制。
參考GenBank所中提供的這些基因資料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在大腸桿菌外的其他菌種中找到與這些基因相當(dāng)?shù)幕?。這類常規(guī)工作可有利地利用保守序列而輕易地完成。保守序列可從為他種微生物而合成的基因決定。通過設(shè)計(jì)簡并探針在其它生物體中克隆相應(yīng)的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)分子生物化學(xué)技術(shù)。同時(shí)這類技術(shù)在如薩姆布魯克等著(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，1989，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)的書內(nèi)均有描述。
根據(jù)本發(fā)明的具有一個(gè)改進(jìn)過的‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的上述修飾菌株優(yōu)選地至少有一處下列的基因失活metE和(或)metH，和(或)metC，和(或)metB。
當(dāng)用以上所述的具有改進(jìn)性‘蛋氨酸合成酶’活性的酶來將如通式(III)所示的底物直接經(jīng)由生物轉(zhuǎn)化而變成如通式(I)所示的酸類時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的菌株至少在下列基因中有一處失活metE和(或)metH和(或)metB。優(yōu)選地在metE基因中有一處失活。
當(dāng)用以上所述的具有改進(jìn)性‘蛋氨酸合成酶’活性的酶來將如通式(III)所示的底物直接經(jīng)由生物轉(zhuǎn)化而變成如通式(IV)所示的高半胱氨酸，HS-(CH2)2-CHNH2-COOH(IV)而此產(chǎn)物又能利用一個(gè)適當(dāng)?shù)拿付D(zhuǎn)化成如通式(I)所示的酸類時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的菌株至少在下列基因中的一處失活metC和(或)metB。同時(shí)也可能失活metE與(或)內(nèi)源性metH基因。此時(shí)，與metE和(或)metH基因相關(guān)的甲基化酶活性可利用導(dǎo)入編碼一個(gè)具有相同活性的酶基因而恢復(fù)。這酶可選自和(或)修飾以增加如通式(I)所示的氨基酸合成產(chǎn)量。
在一實(shí)施例中，此菌株另可具有由metA基因所控制的高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的修飾，使其具有高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性(EC2.3.1.46)或高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(EC 2.3.1.11)。
在某特別實(shí)施例中，可將編碼高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性的大腸桿菌的metA基因(Genbank AAN83396)替換或修飾。使其獲得高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道此活性是由谷氨酸棒狀桿菌的metA基因(Genbank AF052652)所編碼的。用來將大腸桿菌的metA基因替換成谷氨酸棒狀桿菌的metA基因的方法，或?qū)⒋竽c桿菌的metA基因修飾而將高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性轉(zhuǎn)換成高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的技術(shù)亦為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
同理亦可替換或修飾用來編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的谷氨酸棒狀桿菌的metA基因，以取得高絲氨酸O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性。
所有以上所述的菌株修飾方式均可根據(jù)本發(fā)明所將菌株暴露于選擇壓力下達(dá)成?；蛘呖刹捎酶鶕?jù)本發(fā)明的方法篩選一株略受修飾的菌株。在如通式(II)所示的化合物存在下，特別是在甲硫醇存在下，選出一株具有‘蛋氨酸合成酶’活性的菌株。然后再進(jìn)行其他所述的修飾以增強(qiáng)規(guī)避正常蛋氨酸合成途徑的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員深知如何修飾微生物的遺傳特性。將某基因的啟動子原位替換成一個(gè)強(qiáng)表現(xiàn)或誘導(dǎo)啟動子可使此基因過度表達(dá)?；蚩蓪⒁粋€(gè)復(fù)制質(zhì)粒(單拷貝或多拷貝)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。在此細(xì)胞內(nèi)被過度表示的基因受到一個(gè)適當(dāng)啟動子控制。
基因失活優(yōu)選采用同源重組法。其原理可大致描述如下將一個(gè)直鏈片段導(dǎo)入細(xì)胞中。此片段在體外獲得，由跨越某基因的兩側(cè)的兩個(gè)區(qū)域和位于此二區(qū)域間的至少一個(gè)被選中的基因(通常是個(gè)耐抗生素基因)構(gòu)成。這直鏈片段代表一個(gè)失活基因。經(jīng)過重組并整合了導(dǎo)入片段的細(xì)胞在一選擇性培養(yǎng)基上篩選。經(jīng)過兩次重組的細(xì)胞被篩選出來。其中的野生型基因被失活基因所取代。這方法可用正負(fù)雙向選擇法加速其檢測雙重重組的能力。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，所用的菌株是大腸桿菌。
在另一實(shí)施例中，所用的菌株是一株棒狀桿菌，特別是谷氨酸棒狀桿菌。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所用的菌株是于2003年4月2日向CNCM(法國IDA)注冊的大腸桿菌K183(注冊號碼I-3005)。此菌株含有一個(gè)能表達(dá)修飾的胱硫醚-γ-合成酶的基因，其具前述的E325A突變及失活的metE基因。
根據(jù)本發(fā)明的微生物包含胱硫醚-γ-合成酶和(或)酰化高絲氨酸硫化氫解酶。優(yōu)選由篩選與進(jìn)化來挑選和改善此類微生物。這也是本發(fā)明的目的的一。根據(jù)本發(fā)明的菌株也可經(jīng)基因工程修飾(也就是說至少一個(gè)內(nèi)源性基因可被失活，突變和(或)過度激活)。這類修飾可在篩選前或篩選后進(jìn)行。
在如通式(II)所示的化合物存在下，特別是甲硫醇存在下，為了要加快生產(chǎn)蛋氨酸的菌株的篩選及進(jìn)化，采取了下述的步驟。此方法適用于甲硫醇。但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何將它改用在任何如通式(II)所示的化合物上，特別是硫化氫。
a.將感興趣的底物的生物合成與微生物生長結(jié)合而使底物生產(chǎn)變成微生物生長的必要條件。
一種做法是擾亂編碼可將高半胱氨酸轉(zhuǎn)化成蛋氨酸的蛋氨酸合成酶的metE基因。此株則成為蛋氨酸營養(yǎng)缺陷型的株。
為了在一個(gè)含有簡單碳源和甲硫醇或甲基硫醇鈉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生存，微生物優(yōu)選由O-?；鵏-高絲氨酸及甲硫醇或甲基硫醇鈉合成L-蛋氨酸的途徑。計(jì)算機(jī)模擬顯示在此情況下有可能理論上將蛋氨酸產(chǎn)量加倍(表1)。

表1在固定生物質(zhì)產(chǎn)量下(連續(xù)培養(yǎng))，用大腸桿菌在(a)葡萄糖中和在(b)葡萄糖與甲硫醇中發(fā)酵生產(chǎn)蛋氨酸的最大理論產(chǎn)量(蛋氨酸質(zhì)量/葡萄糖質(zhì)量)可是，除L-蛋氨酸外，當(dāng)欲生產(chǎn)其他2-氨基-4-(烷巰基)丁酸時(shí)，培養(yǎng)基須加入蛋氨酸才能使微生物生長。
b.增強(qiáng)主要生物合成途徑的抑制調(diào)控，特別是酶與基因的復(fù)反饋，編碼抑制基因的metJ基因可被抑制。同時(shí)，由metA基因編碼的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶受到蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸向下調(diào)控(泰勒等，1966，生物化學(xué)雜志，2413641-3642)。當(dāng)然最好將此酶由一個(gè)對負(fù)反饋不敏感的酶所取代。(查德等，1970，遺傳微生物學(xué)雜志.63121-131)。
本發(fā)明的另一目的是找尋一個(gè)供篩選和確認(rèn)用的測試方法來尋獲一株能利用烷基硫醇或H2S，特別是甲硫醇的代謝作用而產(chǎn)生2-氨基-4-(烷巰基)丁酸，特別是L-蛋氨酸的微生物。
本發(fā)明能鑒定某菌株的基因組曾經(jīng)突變而具有攝取如通式(II)所示的化合物的能力從而產(chǎn)生如通式(I)所示的酸類。這樣的修飾誘導(dǎo)了‘蛋氨酸合成酶’活性的增強(qiáng)。從簡單碳源和如通式(II)所示的化合物中，可加速這種能生產(chǎn)蛋氨酸的菌株的生長。
本發(fā)明的另一目的是篩選一株原始細(xì)菌株的方法，其可經(jīng)基因工程修飾具有編碼胱硫醚-γ-合成酶或?；呓z氨酸硫化氫解酶的基因。此菌種可將的修飾成一株能生產(chǎn)如通式(I)所示的氨基酸的菌種，特別是生產(chǎn)L-蛋氨酸的菌種。同時(shí)在如通式(II)的含硫化合物存在下，修飾能誘導(dǎo)‘蛋氨酸合成酶’活性的酶的編碼基因，此修飾是通過將此菌株在如通式(II)所示的化合物存在下暴露于選擇壓力而使菌株向胱硫醚-γ-合成酶編碼基因或酰基高絲氨酸硫化氫解酶進(jìn)化。此進(jìn)化包括了一個(gè)突變，此突變能使此菌株能夠優(yōu)選地直接將如通式(III)所示的底物轉(zhuǎn)化成如通式(I)所示的氨基酸或如通式(IV)所示的高半胱氨酸。
此原始菌株可存在某種缺失和(或)過度激活，特別是將強(qiáng)表現(xiàn)的構(gòu)成的啟動子導(dǎo)入至少一個(gè)內(nèi)源基因內(nèi)。
本發(fā)明另涉及一個(gè)修飾菌株。其胱硫醚-γ-合成酶和(或)?；呓z氨酸硫化氫解酶的編碼基因經(jīng)基因工程修飾而使此酶的‘蛋氨酸合成酶’活性在如通式(II)所示的化合物存在下有所增強(qiáng)，特別是在甲硫醇的存在下。如上所述，此類菌種可能經(jīng)過至少另一種基因修飾(例如失活，突變或過度表達(dá)其內(nèi)源基因)。
此種菌株能優(yōu)選地由本發(fā)明所示的方法取得。特別是確實(shí)能用本發(fā)明所示的方法取得。
本發(fā)明另涉及一種制備如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巰基)丁酸的方法。其通過將一株具有改進(jìn)‘蛋氨酸合成酶’活性的微生物在一個(gè)含如通式(II)所示含硫化合物的簡單碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如通式(I)所示的氨基酸以蛋氨酸為優(yōu)選，更優(yōu)選為L-蛋氨酸。如通式(II)所示的含硫化合物是甲硫醇或H2S。
根據(jù)本發(fā)明，‘培養(yǎng)’與‘發(fā)酵’乃通用詞。是指在一個(gè)適合的含簡單碳源的培養(yǎng)基中使菌種生長。
本發(fā)明所涉及的微生物培養(yǎng)(發(fā)酵)條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)定。特別是細(xì)菌可在20℃至55℃的間培養(yǎng)，但以在25℃至40℃為優(yōu)選。對谷氨酸棒狀桿菌而言30℃更佳，對大腸桿菌而言37℃為最佳。
發(fā)酵在發(fā)酵罐內(nèi)經(jīng)進(jìn)行。利用一個(gè)適合細(xì)菌的礦物質(zhì)培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基至少含有一種簡單碳源及如通式(II)所示的含硫化合物。
特別是大腸桿菌用的礦物質(zhì)培養(yǎng)基成分可與M9培養(yǎng)基(安德生，1946，美國國家科學(xué)院院刊，32120-128)或M63培養(yǎng)基(米勒，1992；細(xì)菌基因?qū)W速成大腸桿菌及有關(guān)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)，或由西華等人研發(fā)出的培養(yǎng)基(1999，生物化學(xué)年鑒，27088-96)成分類似或相同。
同理，谷氨酸棒狀桿菌用的礦物質(zhì)培養(yǎng)基可與BMCG培養(yǎng)基(賴伯等1989，微生物技術(shù)應(yīng)用32205-210)或與由萊德等人研發(fā)出的培養(yǎng)基(2001，分子微生物技術(shù)雜志，3573-583)的成分類似或相同。
培養(yǎng)基可適量填補(bǔ)任何營養(yǎng)缺陷成分。培養(yǎng)基含適當(dāng)濃度的簡單碳源以供微生物培養(yǎng)及生產(chǎn)所需。另含適當(dāng)濃度的如通式(II)所示的硫化物使菌株進(jìn)化及選擇的生產(chǎn)方式。
發(fā)酵后，利用傳統(tǒng)方法將如通式(I)所示的氨基酸收回。如有必要，則進(jìn)行純化。
將如通式(I)所示的氨基酸從培養(yǎng)基中回收及純化的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是非常熟悉的。
本發(fā)明另涉及一種制備如通式(I)所示的2-氨基-4-(烷巰基)丁酸的方法。在此方法中將如通式(III)所示的底物R”-O-(CH2)2-CHNH2-COOH(III)其中R”代表一個(gè)?；?，以琥珀?；蛞阴；鶠閮?yōu)選，與一個(gè)具有改進(jìn)‘蛋氨酸合成酶’活性的酶在一個(gè)適當(dāng)?shù)暮缤ㄊ?II)所示的含硫反應(yīng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生反應(yīng)。
此適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的普通的酶反應(yīng)培養(yǎng)基。特別是一個(gè)水基培養(yǎng)基，其中酶與底物均溶解或懸浮在培養(yǎng)基中。反應(yīng)所須的條件亦是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。特別要注意防止任何酶的實(shí)質(zhì)的變性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，這具有改進(jìn)‘蛋氨酸合成酶’活性的酶存在于一個(gè)失活的細(xì)菌中，或在細(xì)胞提取物中。、在另一個(gè)某優(yōu)選實(shí)施例中，這具有改進(jìn)‘蛋氨酸合成酶’活性的酶是個(gè)純化過的酶。
D.II.半胱氨酶生物合成途徑本發(fā)明亦涉及由發(fā)酵微生物來從事生物轉(zhuǎn)化及生產(chǎn)氨基酸的領(lǐng)域。它涉及一個(gè)篩選和直接進(jìn)化微生物的方法，可用來鑒定經(jīng)基因工程修飾使其所具有的“修飾的半胱氨酸合成酶”活性的酶，具體如一種修飾的O-?；?高絲氨酸硫化氫解酶的菌株。這種菌株能產(chǎn)生L-半胱氨酸或與簡單碳源代謝而產(chǎn)生其他氨基酸衍生物。本發(fā)明亦涉及此類微生物菌株及利用培養(yǎng)這類微生物菌株來生產(chǎn)L-半胱氨酸，或氨基酸衍生物的方法。
半胱氨酸可由不同方法及不同原料生產(chǎn)。向陽化工公司(Sun-Orient Chemical Co.，Ltd)在HCl存在下從水解的毛發(fā)中提取L-半胱氨酸。然后由電解法將L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化成氫氧化半胱氨酸。
DL-氫氧化半胱氨酸可由Strecker法生產(chǎn)(在氨水，HCN和巰基醛中合L-半胱氨酸)。
在Bucherer-Berg反應(yīng)中，將乙縮氯醛，HCN，碳酸銨和硫化鈉混合亦可產(chǎn)生L-半胱氨酸。這種L-半胱氨酸是以鹽酸鹽結(jié)晶方式存在于鹽酸中。
用酶促反應(yīng)或用色氨酸合成酶來催化置于β位置的丙氨酸與硫化物的反應(yīng)來生產(chǎn)半胱氨酸的方法，已在GB2 174 390與EP0 272 365中有所描述。相似地，用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)半胱氨酸的方法，包括優(yōu)化微生物分泌合成的半胱氨酸的方法，將cysB基因過度表達(dá)來優(yōu)化H2S產(chǎn)量的方法，及利用對半胱氨酸反饋抑制不敏感的絲胺酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的方法，分別在在專利申請EP 0 885 962與WO01/27 307及WO97/15 673中描述。
例如，本發(fā)明亦可應(yīng)用在供應(yīng)進(jìn)化微生物的半胱氨酸生物途徑(圖4)使用。特別是提供能產(chǎn)生如通式(V)所示的2-氨基-4-(烷巰基)丙酸的細(xì)菌，例如大腸桿菌與棒狀桿菌。
R-S-CH2-CHNH2-COOH(V)其中R是如上定義的通式(I)的半族。
經(jīng)含如通式(II)所示的硫化物的簡單碳源培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝R’-SH(II)
此菌種至少含有一個(gè)具有‘進(jìn)化半胱氨酸合成酶’活性的突變酶的編碼基因。
根據(jù)本發(fā)明，通式(I)表示的‘生理上能接受的鹽’是一個(gè)不影響代謝或微生物生長的化合物。特別是一個(gè)堿金屬鹽，如鈉鹽。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，R是具有1到4碳原子的直鏈或支鏈烷基，具體地選自甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基及叔丁基，優(yōu)選為甲基。
在如通式(V)所示的2-氨基-4-(烷巰基)丙酸中以L-半胱氨酸為優(yōu)選。
根據(jù)本發(fā)明，具有進(jìn)化的‘半胱氨酸合成酶’活性的酶可以是任何參與如通式(V)所示的氨基酸，特別是L-半胱氨酸，的生物合成的突變酶。其基本活性是能直接將乙酰絲氨酸，優(yōu)選是O-乙酰-L-絲氨酸，在如通式(II)所示的硫化物中轉(zhuǎn)化產(chǎn)成如通式(V)所示的氨基酸。其在未經(jīng)突變前，‘半胱氨酸合成酶’活性并非其基本活性。參與半胱氨酸生物轉(zhuǎn)化的天然酶，如cysK與cysM所編碼的半胱氨酸合成酶A與B，雖能直接將O-乙酰-L-絲氨酸(乙酰絲氨酸)在硫化氫存在下轉(zhuǎn)化成L-半胱氨酸，但依此定義將被排除在外。
‘原始’未突變酶優(yōu)選為在H2S存在下催化硫化氫解反應(yīng)者，優(yōu)選具有O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶活性者。
具有O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶活性的‘原始’酶最好從列于PFAM PF01053和COG COG2873的中的O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶中挑選。
優(yōu)選從下列具有?；呓z氨酸中挑選NP_785969 O-乙酰高絲氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳桿菌WCFS1AAN68137 O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶，惡臭假單胞菌KT2440NP_599886 O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶，谷氨酸棒桿菌ATCC 13032NP_712243 乙酰高絲氨酸硫化氫解酶，鉤端螺旋體黃膽出血型賴株56601
BAC46370 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，慢性型大豆根瘤菌USDA110AAO57279 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，假單胞桿菌丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000NP_284520 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，[腦膜炎奈瑟菌Z2491AAA83435 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，(銅假綠單胞菌)更優(yōu)選地，O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶選自由棒狀桿菌metY基因，特別是谷氨酸棒桿菌metY基因(Genbank AF220150)，編碼的O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶，選自具有相同的O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶活性的同源的酶，至少與被谷氨酸棒桿菌metY基因(Genbank AF220150)編碼的O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶有80％序列同源性，優(yōu)選至少85％同源性，更優(yōu)選至少90％同源性。
本發(fā)明是基于以下的事實(shí)，在可控情況下修飾?；呓z氨酸硫化氫解酶對底物的特異性，使其能優(yōu)先使用乙酰絲氨酸。本發(fā)明還是基于在可控情況下能修飾一個(gè)底物對一個(gè)未經(jīng)修飾的酶特異性而使其叢具有?；呓z氨酸硫化氫解酶活性進(jìn)化到具有半胱氨酸合成酶活性。
在一實(shí)施例中，未經(jīng)修飾的微生物不具有天然O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶活性，或不具有編碼此酶的metY基因同源的基因。
根據(jù)本發(fā)明，菌株可用基因工程法通過失活，突變和(或)過度表達(dá)來修飾至少一個(gè)內(nèi)源基因。由此而允許其向新的代謝途徑進(jìn)化。特別是根據(jù)本發(fā)明用基因工程將微生物的cysK和(或)cysM基因抑制。此二基因所編碼的蛋白質(zhì)分別具備半胱氨酸合成酶A及半胱氨酸合成酶B活性。以抑制cysK與cysM基因?yàn)閮?yōu)選。
基因cysK(圖4)編碼半胱氨酸合成酶A(GenBank NP_416909)，基因cysM編碼半胱氨酸合成酶B(GenBank NP_416916)。將此二基因失活會造成半胱氨酸生物合途徑的關(guān)閉。而造成該菌株半胱氨酸的營養(yǎng)缺陷。
在此修飾后的細(xì)菌內(nèi)導(dǎo)入一個(gè)酶的編碼基因。此酶能在H2S存在下催化如以上所述的硫化氫解反應(yīng)。不同于其它酶，其主要活性是半胱氨酸合成酶活性(又稱為O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶)。特別是一個(gè)編碼O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶的基因，例如棒狀桿菌的基因，更特別是谷氨酸棒桿菌的metY基因(Genbank AF220150)。
一個(gè)用來編碼在H2S存在下能催化硫化氫解反應(yīng)的酶的基因可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的直接導(dǎo)入法或復(fù)制質(zhì)粒法轉(zhuǎn)入細(xì)菌中。
經(jīng)修飾后的菌株優(yōu)選以篩選與進(jìn)化的方法來篩選與改進(jìn)。這也是本發(fā)明的目的之一。該方法能使?；呓z氨酸硫化氫解酶活性進(jìn)化成半胱氨酸合成酶活性，從而恢復(fù)生產(chǎn)半胱氨酸的能力。
當(dāng)經(jīng)過基因工程修飾與進(jìn)化后的菌株(E)在含作為簡單碳源的葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的生長率與一株僅經(jīng)修飾的菌株(M)在此培養(yǎng)基中的生長率相當(dāng)時(shí)，則可認(rèn)已完成將?；呓z氨酸硫化氫解酶活性轉(zhuǎn)化為‘進(jìn)化的半胱氨酸合成酶’活性的轉(zhuǎn)換。在一特別實(shí)施例中，當(dāng)被修飾的O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶蛋白所具有的半胱氨酸合成酶活性比其原有的活性增加10％時(shí)，則認(rèn)為將?；呓z氨酸硫化氫解酶活性轉(zhuǎn)化為‘進(jìn)化的半胱氨酸合成酶’活性的轉(zhuǎn)換已告完成。在某些例子中，可看到菌株E的生長率比菌株M的生長率高。最后，在最初不含任何半胱氨酸及相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)情況下，當(dāng)菌株E所生產(chǎn)的半胱氨酸不少于菌株M所生產(chǎn)的半胱氨酸時(shí)，則可認(rèn)為將?；呓z氨酸硫化氫解酶活性轉(zhuǎn)化為‘進(jìn)化的半胱氨酸合成酶’活性的轉(zhuǎn)換已告完成。
這類菌種可用基因工程法修飾。將至少一個(gè)內(nèi)源基因失活，突變和(或)過度表達(dá)。這修飾過程可在修飾基因進(jìn)化前或后進(jìn)行。特別是可根據(jù)本發(fā)明可經(jīng)基因工程手段修飾微生物來抑制其半胱氨酸合成酶A，半胱氨酸合成酶B，及胱硫醚-γ-合成酶的活性。以將基因cysK與cysM抑制為優(yōu)選?；騝ysK編碼半胱氨酸合成酶A(GenBankNP_416909)，基因cysM編碼半胱氨酸合成酶B(GenbankNP_416916)。將此二基因失活可抑制半胱氨酸生物合成途徑，進(jìn)而使此菌株發(fā)生半胱氨酸的營養(yǎng)缺陷。如此可篩選將酰基高絲氨酸硫化氫解酶活性修飾成半胱氨酸合成酶活性而恢復(fù)半胱氨酸合成的菌種。
如有必要，可缺失用來編碼胱硫醚-γ-合成酶活性的基因。
在一實(shí)施例中，可將菌株中編碼絲氨酸-O?；D(zhuǎn)移酶的基因cysE(圖4)修飾，使其對半胱氨酸的反饋抑制不敏感。
在另一實(shí)施例中，可將菌株中的cysB基因過度表達(dá)，進(jìn)而解除對H2S硫同化途徑的調(diào)控。
在生產(chǎn)如通式(V)所示的氨基酸時(shí)，優(yōu)選是L-半胱氨酸時(shí)，最好能過度表達(dá)編碼乙酰-CoA合成酶的基因，例如同時(shí)過度表達(dá)acs基因(EC6.2.1.1，入藏號碼AF000480)與如前所定義用來編碼‘改進(jìn)的半胱氨酸合成酶’活性的酶的基因(圖4)。
同時(shí)可將編碼乙酸激酶和(或)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的基因減弱或缺失。特別是分別用來編碼乙酸激酶(EC 2.7.2.1)與磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(EC 2.3.1.8)的ack和pta基因(入藏號碼AE000318andAE000319)。這類基因減弱/缺失優(yōu)選與過度表達(dá)編碼乙酰-CoA合成酶的基因同時(shí)進(jìn)行。
所有前述的對修飾株所作的改進(jìn)措施可在開始metY基因進(jìn)化的前實(shí)施。亦可在metY基因進(jìn)化后實(shí)施。但缺失cysK和(或)cysM基因除外。此項(xiàng)工作必須在修飾菌株生長及進(jìn)化前實(shí)施。
本發(fā)明又涉及一個(gè)制備具有如上所定義的‘進(jìn)化半胱氨酸合成酶活性’的菌株的方法。此菌株這方法包括在一個(gè)適當(dāng)?shù)暮唵翁荚磁囵B(yǎng)基中生長一株菌種。這株細(xì)菌在H2S存在下具有能催化硫化氫解作用的能力。但依定義其本性活性并非‘半胱氨酸合成酶’活性。其目的是在使其酶編碼的基因向著能編碼‘進(jìn)化半胱氨酸合成酶活性’的基因進(jìn)化。
為加速在H2S存在下能催化硫化氫解反應(yīng)的酶的編碼基因的篩選與直接進(jìn)化，可采取下列措施a.將半胱氨酸的生物合成與微生物生長結(jié)合使產(chǎn)生半胱氨酸成為優(yōu)良生長微生物的必要條件。
為抑制所有天然半胱氨酸合成途徑，基因cysK與cysM，加上基因metB與胱硫醚-γ-合成酶的編碼(如枯草桿菌的yrhB基因)可能被缺失。如此，這類菌種變成半胱氨酸的營養(yǎng)缺陷株。
為能在一個(gè)含簡單碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生存，此微生物必須優(yōu)化其O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶的半胱氨酸合成酶的活性。從而重新建立一個(gè)由乙酰絲氨酸與H2S起始的半胱氨酸合成途徑。當(dāng)metB基因缺失時(shí)，必須在培養(yǎng)基中補(bǔ)充蛋氨酸。
b.抑制調(diào)控機(jī)制，特別是酶與基因水平上的反饋抑制，以增強(qiáng)主要生物合成途徑。
可過度表達(dá)編碼同化硫途徑的激活蛋白的基因cysB gene來優(yōu)化H2S的產(chǎn)量(WO01/27307)。另外由cysE基因編碼的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)化酶的被證明受半胱氨酸反饋所抑制。因此最好將此酶替換成一個(gè)對反饋抑制不敏感的酶(WO97/15673；WO 02/061106)，或可將其過度表達(dá)(WO 02/29029)。
本發(fā)明亦涉及一個(gè)生產(chǎn)半胱氨酸的方法。此法將一株如上文中所定義的具有‘進(jìn)化半胱氨酸合成酶’活性的微生物在一個(gè)如上所定義的合適的含簡單碳源的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。
發(fā)酵條件屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范疇。發(fā)酵是在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。包括一種適合所要培養(yǎng)的細(xì)菌的無機(jī)培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基含一個(gè)碳源。
培養(yǎng)基可彌補(bǔ)因缺失cysK和(或)cysM基因而引起的營養(yǎng)缺陷。培養(yǎng)基含一種簡單碳源。其濃度由生長方式與生產(chǎn)方式而定。并含有如通式(II)所示的硫化物。其濃由菌株即進(jìn)化程度與生產(chǎn)方式調(diào)節(jié)。
發(fā)酵后，以傳統(tǒng)方法收回半胱氨酸。如有必要可將其純化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員對在培養(yǎng)基中的半胱氨酸的回收及純化的方法非常熟悉。
本發(fā)明又涉及一種生產(chǎn)如通式(V)所示的氨基酸的方法。其特點(diǎn)是將乙酰絲氨酸與前文所定義的具有‘進(jìn)化半胱氨酸合成酶’活性的酶在一個(gè)合適的并含有如通式(II)所示的硫化物的反應(yīng)培養(yǎng)基中反應(yīng)。
這一個(gè)合適的反應(yīng)培養(yǎng)基是個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的普通酶培養(yǎng)基。特別是一個(gè)水基培養(yǎng)基，其中底物與酶均溶解或懸浮在內(nèi)。此反應(yīng)條件亦為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。特別要注意避免讓酶發(fā)生變性。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，這具有‘進(jìn)化半胱氨酸合成酶’活性的酶存在于失活的細(xì)菌中，或在細(xì)胞提取物的內(nèi)。
D.III.NADPH-依賴性途徑的進(jìn)化.
在另一優(yōu)選實(shí)施例中，一個(gè)具NADPH依賴性的途徑可被進(jìn)化。為達(dá)到此目的，必須修飾原始菌株使NADPH生產(chǎn)率大于將NADPH氧化成NADP+(或可寫為NADA)的速率。在某種選定的特定的培養(yǎng)基中，此種菌株不會生長。
本發(fā)明涉及修飾菌種使NADPH能在其進(jìn)化的代謝途徑中被消耗。根據(jù)本發(fā)明的這類菌種可用在消耗NADPH的生物轉(zhuǎn)化程序中。
本發(fā)明更涉及在合適的培養(yǎng)基中通過與生長有關(guān)的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)化工產(chǎn)品的方法。同時(shí)這類菌種具有生產(chǎn)以上所述的化工產(chǎn)品的基因特性。
生物轉(zhuǎn)化過程的研發(fā)使我們能低價(jià)生產(chǎn)化工產(chǎn)品品。同時(shí)亦可將工業(yè)或農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品善加利用。
利用體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)感性趣的化工產(chǎn)品可依以下兩種方式進(jìn)行-第一，發(fā)酵，發(fā)酵可由一個(gè)簡單碳源生產(chǎn)化工產(chǎn)品(例如依WO0102547所描述可在葡萄糖中利用谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)賴氨酸)。
-第二，利用微生物將一個(gè)非簡單碳源底物生物轉(zhuǎn)化而生產(chǎn)化合物。此底物僅僅用來產(chǎn)生所需的生物質(zhì)量的感興趣的化工產(chǎn)品(例如WO0012745所描述的R-哌啶衍生物生產(chǎn)法與WO0068397描述的塔格糖生產(chǎn)法)。
一個(gè)生物轉(zhuǎn)化程序的改善牽涉許多因素，例如溫度，氧飽和度，培養(yǎng)基的成分，回收方式等等。也可以將微生物修飾使化工產(chǎn)品的產(chǎn)量或分泌量增加。
對發(fā)酵而言，或許可將生物合成途徑優(yōu)化。例如將基因調(diào)控機(jī)制修飾，或利用基因修飾而改善酶的特性，或優(yōu)化共同底物的再生。
對生物轉(zhuǎn)化而言，或許可經(jīng)改善酶動力學(xué)特性來減低副產(chǎn)品的生成及優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化步驟中共同底物的再生。
在所有生物轉(zhuǎn)化程涉及的共同底物中，NADPH是非常重要的。特別在生產(chǎn)氨基酸(如精氨酸，脯胺酸，異亮氨酸，蛋氨酸，或賴氨酸)，維生素(例如泛酸鹽，維生素K1，或維生素E)，芳香族化合物(例如WO9401564)，)，或其他高增值的化工產(chǎn)品。
本發(fā)明涉及產(chǎn)生消耗NADPA的酶進(jìn)化和代謝途徑的修飾微生物。
為了創(chuàng)造此類微生物，本發(fā)明人選擇采用了能使其NADPH生產(chǎn)率增加和NADPH氧化成NADP+速率減低的修飾。這類經(jīng)修飾后的微生物可用來產(chǎn)生消耗NADPH的進(jìn)化酶或代謝途徑。這類細(xì)菌則可被恰如其分地用在生物轉(zhuǎn)化過程中以生產(chǎn)來源于NADPH-依賴性的合成途徑的化工商品。
用大腸桿菌優(yōu)化NADPH的過程敘述如下。同樣原理也適用于對其他在厭氧狀況下培養(yǎng)的微生物。
根據(jù)本發(fā)明修飾后菌株缺失udhA和/或qor基因。在一優(yōu)選實(shí)施例中，udhA與qor基因同時(shí)缺失。
在某一特別的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明修飾后菌株還缺失了pgi或pfkA和/或pfkB基因。
以上列出的基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是非常熟悉的。同時(shí)在科學(xué)文獻(xiàn)中亦有描述。特別是在大腸桿菌中的基因大腸桿菌基因及參考文獻(xiàn)udhAX66026可溶性吡啶轉(zhuǎn)氫酶；qorL02312醌氧化還原酶；pgiX15196磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9)；pfkAX02519磷酸果糖激酶-1；pfkBK02500磷酸果糖激酶-2。
本發(fā)明另一個(gè)目的是一株用本文所述方法修飾過而能產(chǎn)生NADPH的進(jìn)化微生物。此株具有一個(gè)或多個(gè)編碼具NADPH-依賴性酶的基因。這些酶參與和生產(chǎn)感興趣的化工產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化過程。同時(shí)這類酶與一個(gè)或數(shù)個(gè)篩選標(biāo)記基因會引起進(jìn)化。
根據(jù)本發(fā)明，對修飾株而言，這類基因可能是天然的?；蚩山?jīng)一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體而轉(zhuǎn)入優(yōu)化的菌株內(nèi)。可將此類基因直接整合到微生物的基因組中，或利用一個(gè)復(fù)制載體。此載體具有一或多個(gè)參與和生產(chǎn)所述化工產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化過程的酶的編碼基因，或所述的篩選標(biāo)記基因。
這些基因包含了一個(gè)編碼參與和生產(chǎn)感興趣的化工產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化過程的酶的核酸序列，和/或一個(gè)篩選標(biāo)記的核酸序列。此編碼序列被連接到一個(gè)被選來參與生物轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞的高效率啟動子序列。此載體(或質(zhì)粒)可在大腸桿菌與另一株微生物間穿梭。
本發(fā)明另涉及如本文所述的一種生產(chǎn)修飾微生物的方法。其中可將udhA和/或qor基因缺失。如令有必要，可再將pgi或pfkA和/或pfkB基因缺失。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，制備菌株的方法還包括利用至少一個(gè)合適的載體轉(zhuǎn)化到修飾過的菌株中。此載體具有一或數(shù)個(gè)編碼一個(gè)或數(shù)個(gè)參與和生產(chǎn)感興趣的化工產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化過程同時(shí)能消耗NADPH的酶的基因，和一或數(shù)個(gè)篩選標(biāo)記基因。這個(gè)載體能使這些具備基因具備復(fù)制能力，或能將這些基因整合到修飾菌株的染色體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，通過載體的轉(zhuǎn)化可在修飾過的菌株內(nèi)，也可在修飾前進(jìn)行。
能生產(chǎn)NADPH的菌株可經(jīng)分子生物學(xué)法修飾取得。
本發(fā)明的另一方面涉及利用這類修飾株將具NADPH-依賴性的酶進(jìn)化來改善其動力學(xué)特性，或擴(kuò)展或縮小其底物特異性。其最終目的是產(chǎn)生一個(gè)新的代謝途徑和/或改善生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)出率。本發(fā)明另涉及在消耗NADPH的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用這類修飾株或進(jìn)化株。而使生物轉(zhuǎn)化率高于使用未修飾株和/或未進(jìn)化株的產(chǎn)出率。
本發(fā)明又涉及利用一個(gè)消耗NADPH的過程來生產(chǎn)感興趣的化工產(chǎn)品的方法，其特征是此方法具有以下幾個(gè)步驟a)根據(jù)本發(fā)明的方法在一適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)化株。此培養(yǎng)基有助于此菌株的生長，并具有除了NADPH以外的發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)所需要的底物。
b)由培養(yǎng)基抽取感興趣的化工產(chǎn)品，如有必要并將產(chǎn)品純化。
優(yōu)選的化工產(chǎn)品選自半胱氨酸，蛋氨酸，3-羥基丙酸，氫化可的松，木糖醇和甘油。
為進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，此方法包括在合適的培養(yǎng)基中添加被轉(zhuǎn)化的底物。
在步驟b)中所述的培養(yǎng)基至少包括一種可攝取的碳水化合物。此碳水化合物可從下列可直接攝取的糖類中挑選如葡萄糖，半乳糖，蔗糖，乳糖，糖蜜或這些糖的副產(chǎn)品。在一優(yōu)選實(shí)施例中，簡單碳源是葡萄糖。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，簡單碳源是蔗糖。此培養(yǎng)基中可含一或數(shù)種有利于生產(chǎn)感興趣的化工產(chǎn)品的底物(例如氨基酸，維生素，礦物鹽等)。
本發(fā)明可由下列案例闡明。但其適用范疇不受這些案例所約束。
E.


圖1在細(xì)菌內(nèi)由高絲氨酸合成蛋氨酸圖2根據(jù)本發(fā)明利用大腸桿菌合成蛋氨酸的圖解；同理，此方法可移轉(zhuǎn)到其他微生物上，包括谷氨酸棒狀桿菌。利用metB*或metY**的模式必須使用開始時(shí)至少是Δ(metE)的菌種。利用metB**或metY*的模式必須使用開始時(shí)至少是Δ(metC)的菌種。
圖注MetA高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶；可被一個(gè)不受蛋氨酸反饋抑制的異構(gòu)體所取代，或被一個(gè)不受蛋氨酸反饋抑制的高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶異構(gòu)體所取代。MetB胱硫醚-γ-合成酶MetB*胱硫醚-γ-合成酶進(jìn)化成‘蛋氨酸合成酶’MetB**胱硫醚-γ-合成酶進(jìn)化成高半胱氨酸合成酶MetY*O-乙酰-高絲氨酸(谷氨酸棒狀桿菌)進(jìn)化成高半胱氨酸合成酶MetY**O-乙酰-高絲氨酸(谷氨酸棒狀桿菌)進(jìn)化成‘蛋氨酸合成酶’中間的途徑代表大腸桿菌的天然蛋氨酸合成途徑。其他途徑對應(yīng)于本發(fā)明所示的方法。
圖3表示根據(jù)本發(fā)明，用來篩選菌株的連續(xù)發(fā)酵機(jī)制。例如我們采用了DASGIP公司的“Fedbatch-Pro”技術(shù)。由一個(gè)計(jì)算機(jī)控制的模塊系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行微生物發(fā)酵和補(bǔ)充培養(yǎng)基的pH與pO2的監(jiān)控。
圖4在細(xì)菌內(nèi)由絲氨酸合成半胱氨酸圖5由O-乙酰-L-絲氨酸合成半胱氨酸的策略。用紅色箭頭為根據(jù)本發(fā)明所得到的metY進(jìn)化基因(metY*)所編碼的具絲氨酸合成酶活性的酶所采用的途徑。
圖6用異核相關(guān)譜法(HAQC)比較蛋氨酸中第五個(gè)5碳原子的13C-核磁共振譜，(a)野生型的水解物(上圖)與Kla-F優(yōu)化株(下圖)?？捎^察到Kla-F株的第五個(gè)碳原子未被碳13所標(biāo)定。如此可確認(rèn)該碳原子來自甲基硫醇鈉。
圖7利用MULTIALIN法取得的胱硫醚-γ-合成酶未經(jīng)修飾的序列對比。(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)圖8利用MULTIALIN法取得的?；呓z氨酸硫化氫解酶未經(jīng)修飾的序列對比。
圖9大腸桿菌原始株Δ(metE)在批式培養(yǎng)中的直接篩選中生長率進(jìn)化情況。橫軸傳代次數(shù)；箭頭族群K144；μ推導(dǎo)值從OD 2-3推導(dǎo)所得，μ計(jì)算值從大于4倍DO中獲得。
圖10在首次種植后(培養(yǎng)1)及在第十次再植后(再植次數(shù)10)的大腸桿菌Δ(metE)株生長動力學(xué)圖。
圖11利用引子DmetJBF與MetJR對大腸桿菌ΔmetE∷Cm株進(jìn)行PCR。引子DmetJBF的5’端可與位于metL基因3’端的序列雜化。
圖-12利用PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行同源重組后所得的菌株(見圖11)；可進(jìn)行兩個(gè)不同的同源重組，每個(gè)重組的可能性相同。在第一個(gè)情況下，大腸桿菌ΔmetE∷Cm株參與反應(yīng)。在第二個(gè)情況下，可將位于metL的前的metBLF操縱元的啟動子更換，產(chǎn)生大腸桿菌[ΔmetJ，ΔmetJ∷Cm]株。
圖13大腸桿菌[Δ(metBJ，metC)pTrc-metY]株在含有作為簡單碳源的葡萄糖的特定的培養(yǎng)基(MML8)中的生長率隨時(shí)間進(jìn)化的情況F.實(shí)施例F.I.蛋氨酸生物合成途徑本發(fā)明第一個(gè)應(yīng)用(實(shí)施例F.I.1.)是在生產(chǎn)蛋氨酸的生物合成途徑的代謝工程上。它包括以下幾個(gè)步驟a)將metE基因從大腸桿菌原始株中缺失；所得的修飾株是蛋氨酸缺陷株。原始株可在一不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高絲氨酸或胱硫醚的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)中存活。但此修飾株則失去此能力。
b)在同一基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)內(nèi)加入甲基硫醇鈉(共同底物)后，培養(yǎng)修飾株使其的內(nèi)源酶活性進(jìn)化成蛋氨酸合成酶活性來彌補(bǔ)所缺失的酶活性(MetE)。
c)在甲基硫醇鈉存在下，篩選具有新的蛋氨酸合成酶活性的進(jìn)化株，并將此株定性。
d)將編碼具有進(jìn)化酶活性的蛋白的基因分離。在此案例中，是具有改進(jìn)蛋氨酸合成酶活性的胱硫醚-γ-合成酶。
本發(fā)明第二個(gè)應(yīng)用(實(shí)施例F.I.2.)是在生產(chǎn)蛋氨酸的生物合成途徑的代謝工程上。它包括以下幾個(gè)步驟a)將metC基因從大腸桿菌原始株中缺失；所得的修飾株是蛋氨酸缺陷株。原始株可在一不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高絲氨酸或胱硫醚的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)中存活。但此修飾株則失去此能力。
b)在不存在任何共同底物的同一基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)內(nèi)培養(yǎng)修飾株，使其內(nèi)源酶活性進(jìn)化成高絲氨酸合成酶活性來彌補(bǔ)所缺失的酶活性(MetC)。
本發(fā)明第三個(gè)應(yīng)用(實(shí)施例F.I.3.)是在生產(chǎn)蛋氨酸的生物合成途徑的進(jìn)化上。它包括以下幾個(gè)步驟a)將metC，metB，和metJ基因從大腸桿菌原始株中缺失；所得的修飾株是蛋氨酸缺陷株。原始株可在一不含蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高絲氨酸或胱硫醚的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)中存活。但此修飾株則失去此能力。
a1)導(dǎo)入一個(gè)從谷氨酸棒狀桿菌分離出的異種基因，metY基因。此基因可將乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性進(jìn)化成蛋氨酸合成酶活性。
b)在同一基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)內(nèi)加入甲基硫醇鈉(共同底物)后，培養(yǎng)大腸桿菌修飾株[metYΔ(metB，metC，metJ)]使其的內(nèi)源酶活性進(jìn)化成蛋氨酸合成酶活性來彌補(bǔ)所缺失的酶活性(MetB與MetC)。
c)在甲基硫醇鈉存在下，篩選具有新的蛋氨酸合成酶活性的進(jìn)化株。
案例F.I.1在甲基硫醇鈉存在下制備一株具有蛋氨酸合成酶活件的進(jìn)化株
a)構(gòu)建大腸桿菌修飾株Δ(metE)metE基因的失活可經(jīng)導(dǎo)入一個(gè)氯霉素抗性基因框架及缺失大部分有關(guān)基因而達(dá)成。此法曾在下列文獻(xiàn)中報(bào)告達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645。
此策略的執(zhí)行用到兩個(gè)寡核苷酸-含100個(gè)堿基的DmetER(SEQ ID NO 1)tacccccgacgcaagttctgcgccgcctgcaccatgttcgccagtgccgcgcgggtttctggccagccgcgcgttttcagCATATGAATATCCTCCTTAG其-一個(gè)區(qū)域(小寫)與metE基因(4010643至4012904序列，為網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/所登錄的參考序列)的序列(4012903至4012824)同源；-另一區(qū)域(大寫)是用來擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3中的氯霉素抗性基因框架。(達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645)。
-含100個(gè)堿基的DmetEF(SEQ ID NO 2)tgacaatattgaatcacaccctcggtttccctcgcgttggcctgcgtcgcgagctgaaaaaagcgcaagaaagttattggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其-一個(gè)區(qū)域(小寫)與metE基因的序列(4010644至4010723)同源；-另一區(qū)域(大寫)是用來擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3中的氯霉素抗性基因框架。
寡核苷酸DmetER與DmetEF是用來擴(kuò)增質(zhì)粒pKD3中的氯霉素抗性基因框架。所得的PCR產(chǎn)物用電穿孔法轉(zhuǎn)入MG1655(pKD46)株。在此株內(nèi)表達(dá)的紅色重組酶使同源重組順利進(jìn)行。然后將氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子篩選。同時(shí)用寡核苷酸metE和metEF加入利用PCR分析證實(shí)此抗性框架的導(dǎo)入。
MetER(SEQ ID NO 3)ggtttaagcagtatggtgggaagaagtcgc(與4012978至4012949的序列同源)。
MetEF(SEQ ID NO 4)cccggggatgaataaacttgccgccttccc(與4010567至4010596的序列同源)。
然后可將此氯霉素抗性基因框架剔除。將具有可作用在氯霉素抗性基因框架的FRT位置上的FLP重組酶質(zhì)粒pCP20用電穿孔技術(shù)導(dǎo)入到重組株中。經(jīng)過在42℃一連串的培養(yǎng)，氯霉素抗性基因框架的丟失可用加入同樣的寡核苷酸后用PCR分析證實(shí)。
b)在利用甲基硫醇鈉做共同底物的情況下培養(yǎng)與進(jìn)化Δ(metE)修飾株為優(yōu)化利用大腸桿菌從甲硫醇生產(chǎn)蛋氨酸的能力，可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行控制性的篩選。
如上所述，將metE基因失活而產(chǎn)生的蛋氨酸缺陷的大腸桿菌，除非能從甲硫醇中產(chǎn)生蛋氨酸，否則不能生長。
利用此法篩選一株在甲硫醇存在下其胱硫醚-γ-合成酶(EC 4.2.99.9)已具備‘但蛋氨酸合成酶’活性的大腸桿菌修飾株。
這種控制下所作的篩選是在一個(gè)密封的玻璃瓶中進(jìn)行。瓶中有50毫升無機(jī)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中有33mM葡萄糖及25mg/l氯霉素。(西華等，1999，生物化學(xué)年鑒，27088-96。)將某確定OD600nm值的大腸桿菌K12ΔmetE株種植于此培養(yǎng)基。須種植足夠的菌以使其中存在若干偶發(fā)的metB基因突變，使其能攝取甲硫醇。這些菌種是通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入蛋氨酸培養(yǎng)蛋氨酸缺陷株而獲得的。
在三個(gè)瓶中加入100μl的400mg/l甲硫醇溶液。第四個(gè)瓶中不加任何甲硫醇。在37℃搖動培養(yǎng)6天。然后測量OD600nm。其結(jié)果報(bào)告在表2。

表2.在有甲基硫醇鈉時(shí)(培養(yǎng)瓶1-3)或在無甲基硫醇鈉時(shí)(對照培養(yǎng)瓶)的大腸桿菌培養(yǎng)基的光密度(OD)這些結(jié)果顯示在培養(yǎng)瓶2與3中生長的菌種可利用甲硫醇來產(chǎn)生供其生長所用的蛋氨酸(光密度增大)。
所觀察到的改進(jìn)“蛋氨酸合成酶”活性是因在培養(yǎng)瓶2與3的大腸桿菌K12ΔmetE株的胱硫醚-γ-合成酶編碼基因已被修飾。
在培養(yǎng)瓶2中的大腸桿菌可被用來進(jìn)一步改善在甲硫醇存在下的“蛋氨酸合成酶”活性?？刹捎玫姆椒òêY選與經(jīng)多次發(fā)酵而尋求改進(jìn)，或重復(fù)上以上所述的培養(yǎng)瓶試驗(yàn)。
c)篩選與經(jīng)多次發(fā)酵而尋求改進(jìn)為優(yōu)化大腸桿菌基于甲硫醇的蛋氨酸生產(chǎn)過程而進(jìn)行篩選。
此方法可用來篩選在甲硫醇存在下其胱硫醚-γ-合成酶(EC 4.2.99.9)已發(fā)展成改進(jìn)的“蛋氨酸合成酶”活性的大腸桿菌的株?；蛘?，可使用如同在實(shí)施例2中獲得的菌株。
這種直接篩選可在一個(gè)連續(xù)多階系統(tǒng)中進(jìn)行(Figure 3)。
在第一個(gè)發(fā)酵罐中以近于最大生長率的速度培養(yǎng)細(xì)菌。所生長的細(xì)菌被不斷地由第一個(gè)發(fā)酵罐中移到第二個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)。第二個(gè)發(fā)酵罐的特色是具選擇性篩選的低稀釋度(甲硫醇)。
在第二個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)菌所承受的選擇壓力是由其甲硫醇濃度所決定。接二連三的篩選程序使我們能將甲硫醇濃度慢慢增加以逐漸加強(qiáng)篩選壓力。
在每個(gè)濃度下，在第二個(gè)發(fā)酵罐中的篩選株不斷地進(jìn)化。結(jié)果將所有的甲硫醇都代謝完畢(發(fā)酵罐中無殘余甲硫醇)。
在此情況下，將第二個(gè)發(fā)酵罐當(dāng)生長發(fā)酵罐，把第一個(gè)發(fā)酵罐當(dāng)篩選罐再重新篩選。在此時(shí)加入比上次用的更濃的甲硫醇。
經(jīng)過不同的篩選循環(huán)來獲取一株能迅速發(fā)酵甲硫醇的菌株。并將此菌株分析以確定其胱硫醚-γ-合成酶編碼基因的突變。
d)在甲基硫醇鈉存在下篩選進(jìn)化株將培養(yǎng)瓶2中的大腸桿菌Δ(metE)菌相連續(xù)種植，可得菌相Kla-F。
所獲的新菌相Kla-F在下述的一個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的中培養(yǎng)。(西福等，1999，生物化學(xué)年鑒，27088-96)此培養(yǎng)基含2.5g.l-1被碳-13均勻標(biāo)識的葡萄糖和未被碳-13標(biāo)識的甲基硫醇鈉(200ppm)。此菌相在無甲基硫醇鈉存在時(shí)是蛋氨酸缺陷株。
在培養(yǎng)完成后，細(xì)胞經(jīng)回收及洗滌，最后在107℃ 6N HCl中水解24小時(shí)。產(chǎn)品用二維核磁共振(NMR)法分析(異核相關(guān)譜HSQC)。分析結(jié)果可分辨蛋氨酸的5-碳是從由培養(yǎng)液中葡萄糖而產(chǎn)生的L-半胱氨酸而來(傳統(tǒng)途徑)，或是經(jīng)本發(fā)明所創(chuàng)造的新代謝途徑從甲基硫醇鈉而來。
在甲基硫醇鈉不存在的狀況下，大腸桿菌野生株K12(能從葡萄糖產(chǎn)生蛋氨酸)被用來做相同的實(shí)驗(yàn)。
圖6顯示兩個(gè)從兩次取樣而得到的一維核磁共振譜。然后將此兩譜重疊以增加清晰度。這些一維譜是從二維核磁共振的異核相關(guān)譜(質(zhì)子與碳13原子的相關(guān)性)中抽取的。此二維核磁共振譜是在一個(gè)細(xì)菌的酸性水解物中測得。
此樣本是個(gè)完全水解物。根據(jù)核磁共振的靈敏度及使用的采樣時(shí)間，所測到的是氨基酸，糖類，堿類與甘油。每個(gè)酸的碳原子(與一質(zhì)子偶合)都有個(gè)核磁共振的信號。
在這兩株中，蛋氨酸的5-碳(在甲基端)均產(chǎn)生了一個(gè)14.7ppm的化學(xué)位移。
但可見到在上面那個(gè)譜中5-碳信號比較強(qiáng)。表示著這個(gè)5-碳是由碳-13標(biāo)識的。所以這個(gè)5-碳是從培養(yǎng)基中經(jīng)過標(biāo)識的葡萄糖底物中取得的。
相反的，下面的譜中5-碳信號非常弱(Kla-F株)。這結(jié)果顯示這個(gè)5-碳基本上未被標(biāo)識。但是在此分子中的其他碳原子均被很強(qiáng)的標(biāo)識(結(jié)果未示)。這未經(jīng)標(biāo)識的5-碳不是來自葡萄糖，而是來自甲硫醇。
所以可以歸結(jié)到下列的結(jié)論Kla-F株所產(chǎn)的蛋氨酸是由琥珀酰-L-高絲氨酸和甲基硫醇鈉得到的。
Kla-F菌相在培養(yǎng)瓶中接連種植了14次。所得的是菌相K144(如圖9所示)。然后將此菌種涂抹在基礎(chǔ)培養(yǎng)培養(yǎng)板上。板上唯一的碳源是葡萄糖。將接種過的培養(yǎng)皿在有氧情況下放置在一個(gè)有氧的瓶子內(nèi)。另將一個(gè)裝有甲基硫醇鈉水溶液的試管也放入瓶中。將瓶子放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。因甲硫醇的沸點(diǎn)僅在5℃，甲硫醇在在瓶內(nèi)空氣中富集。4天后，克隆開始在培養(yǎng)皿中出現(xiàn)。這些是能在甲硫醇存在下產(chǎn)生蛋氨酸的細(xì)菌。包括克隆K176在內(nèi)，共有10個(gè)菌落被分離?？寺176是在液體培養(yǎng)基中生長的。將其制備成甘油標(biāo)準(zhǔn)液，編號為K183。
測定克隆K183及大腸桿菌原始株K12Δ(metE)的metJ與metB(SEQ ID No.5)基因的序列。經(jīng)進(jìn)化后的metB基因，被改稱為metB*基因(SEQ ID No.7)，其序列顯示第325個(gè)氨基酸為一個(gè)丙氨酸(SEQ IDNo.8)，而不是一個(gè)谷氨酸(SEQ ID No.6)。metJ基因未見任何突變。本菌株已于2003年4月2日向CNCM注冊取得注冊號碼I-3005。
●克隆K183的性能分析克隆K183是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)成的。此培養(yǎng)基中僅有的碳源是葡萄糖與甲基硫醇鈉。同時(shí)在相同情況下平行培養(yǎng)大腸桿菌野生株K12.。其每單位生物質(zhì)量的葡萄糖消耗量是另一株大腸桿菌野生株(MBM01)的兩倍。這種過度消耗或許是由于產(chǎn)生醋酸鹽所致。

表3.比較大腸桿菌野生株與進(jìn)化克隆K183的生物質(zhì)量生產(chǎn)率生物質(zhì)量生產(chǎn)率以生物質(zhì)量/葡萄糖質(zhì)量表示醋酸鹽生產(chǎn)率以醋酸鹽質(zhì)量/葡萄糖質(zhì)量表示將此二培養(yǎng)物中的胞內(nèi)與胞外代謝物分析后發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)丙氨酸，丙酮酸鹽，丁酮酸鹽，與2-酮異己酸鹽濃度上升，但色胺酸，正纈氨酸，正亮氨酸，亮氨酸與蛋氨酸的濃度降低。
在細(xì)胞外，谷氨酸，異亮氨酸，蘇氨酸，纈氨酸與2-酮異己酸鹽有所堆積，但丙酮酸鹽，正亮氨酸及色胺酸有所減少。
●在甲硫醇存在下描述MBM01與K183株的‘蛋氨酸合成酶’特異活性為闡明K183株相對野生株(MBM01)具有較高的蛋氨酸合成酶活性，在細(xì)胞萃取液內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)。細(xì)胞萃取液是在不含無甲硫醇從大腸桿菌K183株與MBM01株的豐富培養(yǎng)基(BH1，經(jīng)由DIFCO銷售，含葡萄糖2.5g/L)中取得。蛋白萃取物用PD10脫鹽后存放在冰上。
反應(yīng)條件與樣本處理-將甲基硫醇鈉溶液稀釋10倍(100μl 3M水溶液加900μlMilliQ水)后存放在冰上。
-將反應(yīng)混合物20μL 500mM pH 6.5磷酸鹽緩沖液，10μL2.5mM磷酸吡哆醛，16μL 25mM O-琥珀酰高絲氨酸，10μL0.3M甲基硫醇鈉，和24μL MilliQ水制備后存放在冰上。
-將試管放置在37℃(在無菌工作臺使用恒溫混勻器)，并加入蛋白萃取物(20μl)開始反應(yīng)。
-要終止反應(yīng)時(shí)(0至30分鐘)，將試管放置在冰上，并加入在-20℃的丙酮400μl。
-將試管留置在-20℃ 30分鐘。
-無菌工作臺內(nèi)將試管打開，放置10分鐘讓甲硫醇與丙酮蒸發(fā)散去(在冰上)。
-將混合物在10,000g下離心5分鐘。把上清(～100μl)倒進(jìn)一個(gè)Eppendorf管內(nèi)。將其稀釋至1ml。
測量由琥珀酰高絲氨酸所釋放的琥珀酸鹽以決定蛋氨酸合成酶活性將10μl上述樣本在Dionex DX-500離子色譜儀上分析。此色譜具有一個(gè)2mmAG-11預(yù)柱，一個(gè)2mmAS-11主柱，一個(gè)ASRS超級離子抑制器，與一個(gè)10μl樣本注入回路。采用下列的梯度0-7分鐘0.5mM KOH；7分鐘注入；7-9.5分鐘0.5mM KOH；9.5-13分鐘0.5-5mM KOH；13-25分鐘5-38.3mM KOH。
測量在甲硫醇存在下蛋氨酸合成量以決定蛋氨酸合成酶活性采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(GC-MS)來分析蛋氨酸。但在注入樣本前必須將樣本硅基化。為此，每個(gè)樣本內(nèi)均加入一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(絲氨酸13C)以使硅基化質(zhì)量得到保證。所有樣本凍干過夜。
衍生物依以下所述的方法制備用一個(gè)1ml自動加樣器加入400μl羥胺溶液(將0.250g+/-0.002g溶解在10ml吡啶中)，并確保試管被緊緊地蓋住。用旋渦混合器將此混合物攪拌兩次，每次10秒鐘。然后將此混合物離心集中在試管底部(最多在5000g離心1分鐘)。然后將試管放置在30℃讓反應(yīng)進(jìn)行1_小時(shí)。將試管打開用一個(gè)1ml自動加樣器加入1000μlBSTFA溶液。再加入100μl吡啶(用一個(gè)200μl自動加樣器)。將試管蓋緊后，用旋渦混合器將混合物攪拌10秒鐘。制備TBDMS衍生物時(shí)，將此混合物在60℃培養(yǎng)60分鐘。制備BSTFA衍生物時(shí)，將混合物在70℃培養(yǎng)30分鐘。如有必要，可用一個(gè)一次性0.22μm PTFE膜過濾器將樣本過濾，或?qū)颖驹?000g下離心5分鐘。樣本然后被轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5ml玻璃瓶內(nèi)。封妥后注入色譜儀中。
在一個(gè)具有一個(gè)非極性色譜柱(HP-5MS，Bios Analytique)的Agilent Technologies GC6890/MSD5973氣相色譜/質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析。攜帶氣體是氦氣。流量是1ml.min-1。以非分流方式，流量為50ml.min-1時(shí)間為0.85min注入1μl樣本。其溫度分布如下起始溫度90℃保持2分鐘，以10℃.min-1梯度加溫至320℃。在此溫度保持6分鐘。用質(zhì)譜儀測量。以電子沖擊離子化樣本。在m/z＝40至550amu范圍內(nèi)用掃描式法進(jìn)行分析。溶劑通過時(shí)間為3.10分鐘。
在此條件下，在甲硫醇內(nèi)培養(yǎng)的樣本的‘蛋氨酸合成酶’活性可用離子色譜法定量分析琥珀酸鹽再用GC-MS分析蛋氨酸來檢測。
分析結(jié)果如表四所示。

表4在甲硫醇存在下菌株MBM01及K183萃取物的蛋氨酸合成酶活性如此證明了在甲硫醇存在下這株進(jìn)化株的蛋氨酸合成酶活性比原始株強(qiáng)。同時(shí)證明了這突變胱硫醚-γ-合成酶(E325A)具有修飾過的蛋氨酸合成酶活性。
e)進(jìn)化基因的分離與具進(jìn)化蛋氨酸合成酶活性的METB*酶的動力學(xué)特性為測量在METB與METB*中與蛋氨酸合成酶與胱硫醚-γ-合成酶活性有關(guān)的動力學(xué)參數(shù)，采用下述的策略將metB和metB*基因克隆到過度表達(dá)載體pTopo(Invitrogene)中-將metB或metB*基因用寡核苷酸metJ/metLR與抗熱性聚合酶Pwo擴(kuò)增。
-將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pTOPO 4-PCR平端連接。將所構(gòu)成的質(zhì)粒pTopo.metB或pTopo.metB*轉(zhuǎn)換至DH5α并篩選Apr克隆。
-萃取質(zhì)粒pTopo.metB或pTopo.metB*后用酶切法證實(shí)其結(jié)構(gòu)。
-結(jié)構(gòu)證實(shí)后，將質(zhì)粒pTopo.metB轉(zhuǎn)化至MG1655(ΔmetBJ，ΔmetE)株中。再用上述的酶切法證實(shí)所構(gòu)建的質(zhì)粒。再用PCR及寡核苷酸metJR/metLR證實(shí)metJ基因在MG1655(ΔmetBJ，ΔmetE)株中缺失。并用寡核苷酸metER/metEF證實(shí)metE基因在MINS33株中缺失。
在豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)后，萃取蛋白質(zhì)。蛋氨酸合成酶活性與胱硫醚-γ-合成酶活性分別用甲基硫醇鈉及半胱氨酸為共同底物而決定的。
蛋氨酸合成酶活性的動力學(xué)特性如表5所示。胱硫醚-γ-合成酶活性的動力學(xué)特性如表6所示。

表5.METB與METB*蛋氨酸合成酶活性的明顯動力學(xué)特性.
突變A325E的作用是在甲硫醇中將此酶的Km減低45倍，但Vmax只被減低一半。

表6.METB與METB*胱硫醚-γ-合成酶活性的明顯動力學(xué)特性。
突變A325E的作用是將半胱氨酸的胱硫醚-γ-合成酶活性減低13倍，同時(shí)降低其Km值。
實(shí)施例F.I.2.由胱硫醚-γ-合成酶中進(jìn)化出高半胱氨酸合成酶活性
●MG1655(ΔmetC∷Cm)與MG1655(ΔmetC)株的構(gòu)建為失活基因metC，采用了達(dá)森科與華納(2000)所述的同源重組策略。此策略允許導(dǎo)入一個(gè)氯霉素抗性基因框架及缺失大部分有關(guān)基因。為達(dá)到此目的，采用了兩個(gè)寡核苷酸為失活基因metC-含100個(gè)堿基的DmetCR(SEQ ID NO 13)ccggcgtccagatcggcaatcagatcgtcgacatcttccagaccaatatgcaggcgaatcaaggtcccgctaaaatcgatCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與metC基因(如網(wǎng)址http://genolist.pasteur.fr/Colibri/所登錄的參考序列的3150251至3151438序列)的序列(3151419至3151359)同源。
-另一區(qū)域(大寫)是用來擴(kuò)增氯霉素抗性框架(參考序列刊載在達(dá)森科K.A.與華納，B.L.，2000，PNAS，976640-6645)。
-內(nèi)含100個(gè)堿基的DmetCF(SEQ ID NO 14)cggacaaaaagcttgatactcaactggtgaatgcaggacgcagcaaaaaatacactctcggcgcggtaaatagcgtgattTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與metC基因的序列(3150255至3150334)同源。
-另一個(gè)區(qū)域(大寫)是用來擴(kuò)增氯霉素抗性框架。
寡核苷酸DmetCR與DmetCF是用來從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性框架的。用電穿孔法將所得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至MG1655(pKD46)株中。在此株中表達(dá)的紅重組酶使同源重組得以進(jìn)行。具有氯霉素抗性的菌株經(jīng)篩選后，利用PCR及寡核苷酸metCR與metC證實(shí)菌株已導(dǎo)入此氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子。所得的菌株被稱為MG1655(ΔmetC∷Cm)株。
MetCR(SEQ ID NO 11)cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(與3151522至3151493的序列同源)。
MetCF(SEQ ID NO 12)gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(與3150118至3150149的序列同源)。
可將此氯霉素抗性框架剔除。將質(zhì)粒pCP20用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組株中。此質(zhì)粒具有作用在此氯霉素抗性框架FRT位點(diǎn)的FLP重組酶。經(jīng)連續(xù)在42℃培養(yǎng)后，用PCR及同樣的寡核苷酸證實(shí)氯霉素抗性框架遺失。這株菌被命名為MG1655(ΔmetC)株。
菌株Δ(metC)的構(gòu)建如實(shí)施例F.I.2.所述。在一優(yōu)選實(shí)施例中，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)大腸桿菌Δ(metC)株(見實(shí)施例F.I.1)。瓶中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基僅含葡萄糖為其唯一的碳源。此培養(yǎng)基不含甲硫醇或H2S。經(jīng)過每次種植后，重新測量生長率。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，Δ(metC)A株的生長率大有增進(jìn)。表示其胱硫醚-γ-合成酶的高半胱氨酸合成酶活性在內(nèi)源性H2S的影響下大有進(jìn)步(見圖10)。

實(shí)施例F.I.3.由乙酰高絲氨酸硫化氫解酶進(jìn)化而得的蛋氨酸合成酶活性MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)株的創(chuàng)建為缺失基因metB及metJ，并保留操縱子metBL的啟動子，將一個(gè)氯霉素抗性框架導(dǎo)入。同時(shí)將大部分有關(guān)的基因缺失并保留metBL啟動子。為達(dá)到此目的，采用了一下兩種寡核苷酸。
對基因metBJ-內(nèi)含30個(gè)堿基的MetJR(SEQ ID NO 9)ggtacagaaaccagcaggctgaggatcagc與在基因metJ(4125975至4125581的序列，參考序列登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)下游的序列(4125431至4125460)同源。
-內(nèi)含100個(gè)堿基的DmetJBF(SEQ ID NO 10)tatgcagctgacgacctttcgcccctgcctgcgcaatcacactcatttttaccccttgtttgcagcccggaagccattttcaggcaccagagtaaacatt其中有
-一個(gè)部分(大寫)與位于基因metJ與metB(4126252至4127412的序列)的間內(nèi)含操縱子metBLF啟動區(qū)域的序列(4126217至4126197)同源。
-另一部分(小寫)則與對應(yīng)于metL基因(4127415至4129847的序列)開始處與metB基因結(jié)尾處的序列(4127460至4127380)同源。
這兩個(gè)寡核苷酸是用來擴(kuò)增與MG1655Δ(metJ∷Cm)株染色體DNA有關(guān)的區(qū)域；見圖11。
所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化至MG1655(pKD46)株中。在此株中表達(dá)的紅重組酶使同源重組順利進(jìn)行。具氯霉素抗性的菌株經(jīng)篩選后，用寡核苷酸MetJR與MetLR通過PCR法證實(shí)經(jīng)同源重組后metB基因已自氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子中缺失。
所要得到的菌株是MG1655(ΔmetB-ΔmetJ∷Cm)株。在此株中，基因metJ與metB被剔除了。同時(shí)操縱子metBLF的啟動子也被換位到metL的前(見圖12)。
如此，這個(gè)氯霉素抗性框架可被剔除。質(zhì)粒pCP20可用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組株中。此質(zhì)粒所含的FLP重組酶作用在氯霉素抗性框架的FRT位點(diǎn)上。經(jīng)過在42℃一連串的培養(yǎng)后，可用寡核苷酸MetLR與MetJR通過PCR法證實(shí)確實(shí)以剔除了氯霉素抗性框架。
菌株MG1655Δ(metC∷Cm，metJB)與MG1655Δ(metC，metJB)的構(gòu)建為缺失菌株MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)的metC基因(對應(yīng)于登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/參考序列3150251至3151438的序列)，采用了噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)法。此方法涉及兩個(gè)步驟。第一步是制備菌株MG1655Δ(metC∷Cm)的噬菌體裂解物。第二步是將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至菌株MG 1655Δ(metB-ΔmetJ)中。
菌株Δ(metC∷Cm)的構(gòu)建已在實(shí)施例F.I.2.中有所敘述。
噬菌體P1裂液的制備過程-用100μl經(jīng)過夜培養(yǎng)的菌株MG1655(ΔmetC∷Cm)在10mlLB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM種植。
-在37℃及振蕩下孵育30分鐘。
-加入100μl由野生株MG1655所得的噬菌體裂解液(大約1.109噬菌體/ml)。
-在37℃振蕩3小時(shí)直到所有細(xì)胞菌已裂解為止。
-加入200μl氯仿并用旋渦混合器混合。
-在4500g下離心10分鐘以除去所有細(xì)胞碎片。
-將上清移入一無菌的試管中，并添加200μl氯仿。
-將裂解液儲存在4℃。
轉(zhuǎn)導(dǎo)過程-將5ml在LB培養(yǎng)基內(nèi)過夜培養(yǎng)的MG1655(ΔmetB-ΔmetJ)菌株在1500g下離心10分鐘。
-將細(xì)胞沉積物懸浮在2.5ml的10mM MgSO4及5mMCaCl2溶液內(nèi)。
--對照試管100μl細(xì)胞100μl菌株MG1655(ΔmetC∷Cm)的噬菌體P1-試驗(yàn)試管100μl細(xì)胞+菌株MG1655(ΔmetC∷Cm)的噬菌體P1-在30℃無振蕩情況下孵育30分鐘。
-在每個(gè)試管中添加100μl 1M檸檬酸鈉，并用旋渦混合器將混合物混勻。
-添加1ml LB培養(yǎng)基。
-在37℃與振蕩下培養(yǎng)1小時(shí)。
-在7000rp離心3分鐘。將收集物涂抹在LB+Cm 30μg/ml培養(yǎng)皿上。
-在37℃過夜培養(yǎng)。
菌株的驗(yàn)證篩選此氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子。含(metC∷Cm)區(qū)域的導(dǎo)入可用寡核苷酸MetCR與MetCF通過PCR法證實(shí)。同時(shí)可用寡核苷酸MetJR與MetLR證實(shí)此株含有基因metB與metJ。這菌株被命名為MG1655Δ(metC∷Cm，metJB)。
MetCR(SEQ ID NO 11)cgtccgggacgccttgatcccggacgcaac(與3151522至3151493的序列同源)。
MetCF(SEQ ID NO 12)gcgtttacgcagtaaaaaagtcaccagcacgc(與3150118至3150149間的序列同源)。
如前所述，可將此氯霉素抗性框架剔除。將質(zhì)粒pCP20用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組位點(diǎn)中。此質(zhì)粒具有作用在此氯霉素抗性框架FRT位點(diǎn)的FLP重組酶。經(jīng)連續(xù)在42℃培養(yǎng)后，用同樣的寡核苷酸通過PCR法(MetCR和MetCF，與MetJR和Met LR)證實(shí)氯霉素抗性框架遺失。這株菌被命名為MG1655Δ(metC，metJB)。
質(zhì)粒pTrc99A-metY的轉(zhuǎn)入及菌株的進(jìn)化在一優(yōu)選實(shí)施例中，構(gòu)建了一能表達(dá)谷氨酸棒狀桿菌metY基因的質(zhì)粒。此基因是從谷氨酸棒狀桿菌的染色體DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增而得。然后再將此基因?qū)胭|(zhì)體pTrc99A中。metY基因和其野生型啟動子可經(jīng)PCR擴(kuò)增。在一優(yōu)選實(shí)施例中，metY基因可在某種啟動子控制下被克隆并在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。所用的載體為pTrC99A(Pharmacia)。也可用從pUC，pBluescript，pCR-Script，pTopo，等載體中挑選出的載體。
將前面所得的大腸桿菌Δ(metC，metJB)株用谷氨酸棒狀桿菌質(zhì)粒pTrc-metY經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化。
用所得的菌株接種于一個(gè)錐狀瓶中(OD600nm～0.4-0.5)。瓶中含有大約其10％左右的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基中葡萄糖是唯一的碳源。最初因MetY酶的琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶活性較低，此菌相在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MML8)內(nèi)的生長率因受蛋氨酸合成量的限制而偏低(μ～0.06h-1)。當(dāng)OD600nm達(dá)到2時(shí)將菌株種植。總共篩選了22個(gè)培養(yǎng)循環(huán)。在此進(jìn)化-篩選過程中生長率發(fā)生了顯而易見的進(jìn)步(見圖13)?；谝郧暗慕?jīng)驗(yàn)，這樣的改善可歸于metY基因的進(jìn)化。其將O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶活性改變?yōu)镺-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶活性，從而允許由細(xì)菌所生的O-琥珀酰高絲氨酸和H2S生產(chǎn)高半胱氨酸。為優(yōu)化metY基因的進(jìn)化過程，可用相似方法利用其他大腸桿菌突變株進(jìn)行，例如突變株Δ(metC，metB)。
實(shí)施例F.I.4.用補(bǔ)充培養(yǎng)基培養(yǎng)法生產(chǎn)及純化蛋氨酸預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)是在一個(gè)裝有50ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500ml培養(yǎng)瓶中過夜進(jìn)行的。此培養(yǎng)基為一修正的M9培養(yǎng)基，內(nèi)含葡萄糖2.5g/l。細(xì)胞經(jīng)離心回收并存放在5ml修正的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)在一個(gè)可用容積為300ml的Fedbatch-pro DASGIP型發(fā)酵罐中以補(bǔ)充培養(yǎng)基培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。
發(fā)酵罐內(nèi)裝有145ml修正的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基。并利用5ml預(yù)培養(yǎng)液接種。接種OD600nm在0.5到1.2的間。
培養(yǎng)溫度控制在30到37℃的間。其pH用一種CH3SNa溶液連續(xù)調(diào)解控制在6.5到8之間。如有必要，可加入適量的2N氫氧化鈉來完成pH調(diào)節(jié)。在批式操作時(shí)，保持振蕩率在200到400rpm之間。在半連續(xù)灌流培養(yǎng)過程快結(jié)束時(shí)，將振蕩率增快到1000rpm。用一個(gè)氣體流量控制器保持溶解氧濃度在30％至40％飽和度之間。當(dāng)OD600nm達(dá)到2.5至3時(shí)，開始半連續(xù)灌流培養(yǎng)。最初將補(bǔ)充培養(yǎng)基以0.3到0.5ml/h的速率加入。并逐漸將此速率加快至2.5到3.5ml/h之間。在此后24h到32h之間，培養(yǎng)基補(bǔ)充率保持固定。補(bǔ)充培養(yǎng)基與修正的M9培養(yǎng)基基本相同。僅增加了300至500g/l的葡萄糖。同時(shí)在此培養(yǎng)基中另添加一些CH3SNa溶液(1至5M)來促使細(xì)菌生長并用來調(diào)節(jié)pH。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到20到50g/l時(shí)，立刻將補(bǔ)充培養(yǎng)基換成僅含少量磷的修正的形M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基。不用甲硫醇溶液，而將CH3SH氣體直接注射進(jìn)發(fā)酵罐中。氣體流量依與補(bǔ)充培養(yǎng)基的流量對碳底物的摩爾比而定，大約在1到3之間。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50到80g/l之間，將發(fā)酵反應(yīng)停止。此時(shí)將發(fā)酵液用NaOH溶液將其pH調(diào)整到7.5至9之間。同時(shí)將此發(fā)酵液加熱到60至80℃之間。將此發(fā)酵液在超過濾裝置上過濾。將此發(fā)酵液溫度保持在60至80℃之間。再用炭將發(fā)酵液脫色前(使用一個(gè)脫色柱或批式操作)，先將其濃縮。脫完色的發(fā)酵液再經(jīng)一次過濾出去其中的粒子。然后與濃HCl作用使其pH降到2.28以下(蛋氨酸的pK1值)。析出的蛋氨酸鹽酸鹽結(jié)晶經(jīng)過濾回收。蒸發(fā)后除去HCl取得純L-蛋氨酸。
生物材料的注冊菌株K183已于2003年4月2日依布達(dá)佩斯公約條款向法國國家微生物收集中心(CNCM，地址25 rue du Docteur-Roux，75724 ParisCedex 15，F(xiàn)rance)注冊，取得注冊號碼I-3005。
F.II.半胱氨酸生物合成途徑的進(jìn)化本發(fā)明應(yīng)用在半胱氨酸生物途徑的代謝工程技術(shù)的例子(實(shí)施例F.II.1.)包括以下數(shù)個(gè)步驟a)將大腸桿菌原始株的cysK與cysM缺失而使修飾株變成有半胱氨酸營養(yǎng)缺陷株。原始株可在無蛋氨酸，S-腺苷甲硫氨酸，高半胱氨酸，胱硫醚，或半胱氨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)中生長。但此修飾株則失去了這種能力。
a1)導(dǎo)入一個(gè)從谷氨酸棒狀桿菌分離的異種基因，基因metY。此基因從乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性向半胱氨酸合成酶活性進(jìn)化。
b)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)內(nèi)，在無共同底物存在的情況下，培養(yǎng)大腸桿菌修飾株[metY(cysK，cysM)]使基因MetY進(jìn)化而產(chǎn)生半胱氨酸合成酶活性來彌補(bǔ)由于缺失基因CysK與CysM而散散喪失的酶活性。
c)篩選在內(nèi)源H2S存在下具有半胱氨酸合成酶的進(jìn)化株。同時(shí)檢驗(yàn)所創(chuàng)造的新合成途徑。
實(shí)施例F.II.1將乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性進(jìn)化成半胱氨酸合成酶活性a)大腸桿菌Δ(cysK，cysM)株的構(gòu)建利用導(dǎo)入抗生素抗性框架基因(氯霉素與卡那霉素)與缺失大部分有關(guān)的基因分別將cysK與cysM失活。這方法在達(dá)森科K.A.；華納，B.L.(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645，中有所描述。構(gòu)建一種基因需要合成一對寡核苷酸對cysK而言DcysKR內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 15)TgttgcaattctttctcagtgaagagatcggcaaacaatgcggtgcttaaataacgctcacccgatgatggtagaataacCATATGAATATCCTCCTTAG其中有
-一個(gè)區(qū)域(小寫)與基因cysK(其參考序列登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上)的一個(gè)序列(2531396至2531317)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增氯霉素抗性框架。(參考序列報(bào)告在達(dá)森科K.A.；華納，B.L.，2000，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中)。
-DcysKF內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 16)agtaagatttttgaagataactcgctgactatcggtcacacgccgctggttcgcctgaatcgcatcggtaacggacgcatTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與基因cysK的一個(gè)序列(2530432至2530511)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增氯霉素抗性框架。
Pour cysMDcysMR內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 17)cccgccccctggctaaaatgctcttccccaaacaccccggtagaaaggtagcgatcgccacgatcgcagatgatcgccacCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與基因cysM(其參考序列登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上)的一個(gè)序列(2536699至2536778)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增卡那霉素抗性框架。
DcysMF內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 18)AgtacattagaacaaacaataggcaatacgcctctggtgaagttgcagcgaatggggccggataacggcagtgaagtgtgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與基因cysM的一個(gè)序列(2537600至2537521)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增氯霉素抗性框架。
寡核苷酸DcysKR和DcysKF，與DcysMR和DcysMF是分別用來從質(zhì)粒pKD3與pKD4中擴(kuò)增氯霉素與卡那霉素抗性框架所用的。用電穿孔法將所得的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至MG1655(pKD46)株中。在此株中表達(dá)的紅重組酶使同源重組得以順利進(jìn)行。將每種抗生素抗性轉(zhuǎn)化子分別篩選。利用PCR及寡核苷酸cysKR與cysKF和cysMR與cysMF分別證實(shí)菌株已導(dǎo)入此二抗生素抗性轉(zhuǎn)化子。
cyKR(SEQ ID NO 19)tttttaacagacgcgacgcacgaagagcgc(與2531698至2531669的序列同源)。
cysKF(SEQ ID NO 20)ggcgcgacggcgatgtgggtcgattgctat與2530188至2530217的序列同源)。
cysMR(SEQ ID NO 21)ggggtgacggtcaggactcaccaatacttc(與2536430至2536459的序列同源)。
cysMF(SEQ ID NO 22)gcgcgcatcgctggccgctgggctacacac(與2538071至2538042的序列同源)。
如前所述，可將此氯霉素抗性框架及卡那霉素抗性框架剔除。將質(zhì)粒pCP20用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組位點(diǎn)中。此質(zhì)粒具有作用在此氯霉素抗性框架或卡那霉素抗性框架FRT位點(diǎn)的FLP重組酶。經(jīng)連續(xù)在42℃培養(yǎng)后，用PCR及同樣的寡核苷酸證實(shí)抗生素抗性框架已失落。
a1)將基因metY轉(zhuǎn)入先前菌株中將基因metY導(dǎo)入PCR4TOPO載體(Zero Blunt TOPO PCR cloningkit，Invitrogen)構(gòu)建質(zhì)粒pTopometY。為達(dá)到此目的，將由谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032株的染色體DNA所分離的metY基因用聚合酶Pwo及以下所列的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增MetYR(SEQ ID NO 23)ttagagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaaaactcttaaggacctccaaatgccTRC型啟動子(pTRC-O)是用粗體羅馬字體表示。metY基因的是用粗體羅馬加底線字體表示。而metY基因的起始密碼子是用粗斜體表示。
MetYF(SEQ ID NO 24)gctctgtctagtctagtttgcattctcacg在轉(zhuǎn)錄終止子下游的序列。
質(zhì)粒pTopometY是將PCR產(chǎn)物直接導(dǎo)入載體Topo中所構(gòu)建。載體Topo攜帶了大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)及一具青氨芐霉素抗性基因與一卡那霉素抗性基因。
然后將質(zhì)粒pTopometY轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α株中。質(zhì)粒pTopometY中的metY基因序列與通用寡核苷酸M13正向引物和M13負(fù)向引物可用來檢驗(yàn)所構(gòu)建成的質(zhì)粒。
用點(diǎn)穿孔法將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Δ(cysK，cysM)株。
c)培養(yǎng)編碼乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶活性的metY基因使其向半胱氨酸合成酶活性進(jìn)化先前所提的含metY基因的菌株可在園瓶內(nèi)或錐狀瓶中作控制性的篩選。使用此法可篩選到一株大腸桿菌，其乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶活性已進(jìn)化成‘半胱氨酸合成酶’活性。此控制性篩選是在錐狀瓶內(nèi)進(jìn)行的。瓶內(nèi)裝有50ml的無機(jī)培養(yǎng)基(西華等，1999，生物化學(xué)年鑒，27088-96)。培養(yǎng)基內(nèi)另含33mM葡萄糖，與最終濃度為25mg/l的氯霉素及25mg/l的卡那霉素。
以大腸桿菌K12[Δ(cysK，cysM)pTopometY]株在一定的OD600nm值下接種此培養(yǎng)基。采用了一個(gè)足夠大的菌相來種植以確保某些細(xì)菌的metY基因已存在一些相關(guān)的突變使其已能攝取O-乙酰絲氨酸。這菌相是由在一個(gè)含半胱氨酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一株有半胱氨酸營養(yǎng)缺陷的菌株得來的。用大腸桿菌K12(ΔcysK，cysM)株種植一個(gè)對照培養(yǎng)。
在37℃振蕩下培養(yǎng)6天。隨后測量OD600nm值。對照培養(yǎng)幾乎顯示OD值不變。其他培養(yǎng)的OD值則有明顯的變化。所以在這些錐狀瓶中可能已顯現(xiàn)了‘進(jìn)化的半胱氨酸合成酶活性?！@種突變最可能發(fā)生在metY基因上。因?yàn)檫@是這些菌株與對照株唯一不同的處。
可重復(fù)使用前述的瓶內(nèi)培養(yǎng)法將在陽性培養(yǎng)物中的菌相的半胱氨酸合成酶活性繼續(xù)改進(jìn)。
c)克隆的篩選將進(jìn)化后的菌相涂抹在一個(gè)凝膠化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上。其中唯一的碳源是葡萄糖。在有氧條件下，將接種皿放置在37℃。36小時(shí)后，克隆在皿上出現(xiàn)。這些克隆對應(yīng)于能在葡萄糖為唯一碳源的情況下產(chǎn)生半胱氨酸的菌種。分離了三株克隆。
●合成途徑的控制將大腸桿菌進(jìn)化株K12[Δ(cysK，cysM)pTopometY]在一個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(西華等，1999，生物化學(xué)年鑒，27088-96)中培養(yǎng)。此培養(yǎng)中含2.5g.l-1用碳13均勻標(biāo)識的葡萄糖。培養(yǎng)后，將細(xì)胞收回，洗滌。再將細(xì)胞在107℃利用6N HCl水解24小時(shí)。采用2D NMR(HSQC)分析產(chǎn)物來決定葡萄糖中碳13的去出。由此可證實(shí)半胱氨酸是由絲氨酸和乙酰-絲氨酸合成的。此現(xiàn)象表示由metY基因所編碼的酶已進(jìn)化而具有半胱氨酸合成酶活性。
F.III.具NADPH依賴性酶的進(jìn)化本發(fā)明可將具NADPH依賴性的生物轉(zhuǎn)化途徑經(jīng)代謝工程法更改。在某一實(shí)施例中(實(shí)施例F.III.1.)，包括以下數(shù)個(gè)步驟a1)將基因udhA與pgi從大腸桿菌原始株中缺失；a2)將基因pfkA，pfkB與udhA在大腸桿菌原始株中失活；優(yōu)化所得的修飾株還原NADP的能力。原始株可在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)中生長，但修飾株在此培養(yǎng)基中生長的能力大大地減弱了。
b)轉(zhuǎn)入一個(gè)含有為蠟狀芽孢桿菌芐基還原酶編碼的yueD基因的質(zhì)粒。
c)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)中培養(yǎng)前述的修飾柱。并在培養(yǎng)基中加入對硝基苯甲醛(共同底物)使其在這代謝不良的底物上能進(jìn)化出芐基還原酶活性。
d)定性分析進(jìn)化株YueD。
實(shí)施例F.III.1大腸桿菌菌株Δ(udhA，pgi)與A(pfkA，pfkB，udhA)的構(gòu)建和蠟狀芽孢桿菌芐基還原酶動力學(xué)特性的修飾a1)大腸桿菌修飾株Δ(udhA，pgi)的構(gòu)建導(dǎo)入一個(gè)卡那霉素抗性框架及缺失大部分有關(guān)基因可將基因udhA失活。此方法已在達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中有所描述。
為此合成了兩個(gè)寡核苷酸-DudhAR內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 25)cccagaatctcttttgtttcccgatggaacaaaattttcagcgtgcccacgttcatgccgacgatttgtgcgcgtgccagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有
-一個(gè)區(qū)域(小寫)與udhA基因(其參考基因?yàn)樾蛄?158303至4156969，已登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一個(gè)序列(4157144至4157223)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)卡那霉素抗性框架(其參考序列已報(bào)告在達(dá)森科與華納(2000)，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中)。
DudhAF內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 26)ggtgcgcgcgtcgcagttatcgagcgttatcaaaatgttggcggcggttgcacccactggggcaccatcccgtcgaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與udhA基因)的一個(gè)序列(4158285至4158206)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)卡那霉素抗性框架)。
寡核苷酸DudhAR與DudhAF是用來從質(zhì)粒pKD4中擴(kuò)增這個(gè)卡那霉素抗性框架用的。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)由電穿孔法轉(zhuǎn)入菌株MG1655(pKD46)中。在此株內(nèi)表達(dá)的紅重組酶讓同源重組得以順利進(jìn)行。此卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子被篩選。并用寡核苷酸UdhAR與UdhAF證實(shí)此抗性框架確實(shí)已被導(dǎo)入。
UdhAR(SEQ ID NO 27)gcgggatcactttactgccagcgctggctg(與4156772至4156801的序列同源)。
UdhAF(SEQ ID NO 28)ggccgctcaggatatagccagataaatgac(與4158475至4158446的序列同源)。
導(dǎo)入一個(gè)氯霉素抗性框架及缺失大部分有關(guān)基因可將基因pgi失活。此方法已在達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中有所描述。
為此合成了兩個(gè)寡核苷酸-DpgiR內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 29)gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATGAATATCCTCCTTAG其中有
-一個(gè)區(qū)域(小寫)與pgi基因(其參考基因?yàn)樾蛄?232980至4232901，已登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一個(gè)序列(4231337至4232986)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)氯霉素抗性框架(其參考序列已報(bào)告在達(dá)森科與華納(2000)，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中)。
-DpgiF內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 30)ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與pgi基因的一個(gè)序列(4231352至4231432)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)氯霉素抗性框架。寡核苷酸DpgiR與DpgiF是用來從質(zhì)粒pKD3中擴(kuò)增這個(gè)卡那霉素抗性框架用的。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)由電穿孔法轉(zhuǎn)入菌株MG1655udhA(pKD46)中。在此株內(nèi)表達(dá)的紅重組酶讓同源重組得以順利進(jìn)行。此氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子被篩選。并用寡核苷酸PgiR與PgiF證實(shí)此抗性框架確實(shí)已被導(dǎo)入。
PgiR(SEQ ID NO 31)cggtatgatttccgttaaattacagacaag(與4233220至4233191的序列同源)。
PgiF(SEQ ID NO 32)gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc(與4231138至4231167的序列同源)。
可將此氯霉素抗性框架及卡那霉素抗性框架剔除。將質(zhì)粒pCP20用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組株中。此質(zhì)粒具有作用在此氯霉素抗性框架與卡那霉素抗性框架FRT位點(diǎn)的FLP重組酶。經(jīng)連續(xù)在42℃培養(yǎng)后，用PCR及同樣的寡核苷酸證實(shí)其抗生素抗性框架已失落。
a2)大腸桿菌修飾株Δ(pfkA，pfkB，udhA)的構(gòu)建導(dǎo)入一個(gè)卡那霉素抗性框架及缺失大部分有關(guān)基因可將基因pfkA失活。此方法已在達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中有所描述。
為此合成了兩個(gè)寡核苷酸-DpfkAR內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 33)ttcgcgcagtccagccagtcacctttgaacggacgcttcatgttttcgatagcgtcgatgatgtcgtggtgaaccagctgCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與pfkA基因(其參考基因?yàn)樾蛄?105132至4106094，已登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一個(gè)序列(4106081至4106002)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)氯霉素抗性框架(其參考序列已報(bào)告在達(dá)森科與華納(2000)，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中)。
-DpfkAF內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 34)ggtgtgttgacaagcggcggtgatgcgccaggcatgaacgccgcaattcgcggggttgttcgttctgcgctgacagaa ggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與pfkA基因的一個(gè)序列(4105147至4105227)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)卡那霉素抗性框架。
寡核苷酸DpfkAR與DpfkAF是用來從質(zhì)粒pKD3中擴(kuò)增這個(gè)氯霉素抗性框架用的。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)由電穿孔法轉(zhuǎn)入菌株MG1655(pKD46)中。在此株內(nèi)表達(dá)的紅重組酶讓同源重組得以順利進(jìn)行。此氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子被篩選。并用寡核苷酸PfkAR與PfkAF和PCR分析法證實(shí)此抗性框架確實(shí)已被導(dǎo)入。
PfkAR(SEQ ID NO 35)ccctacgccccacttgttcatcgcccg(與4106434至4106408的序列同源)。
PfkAF(SEQ ID NO 36)cgcacgcggcagtcagggccgacccgc(與4104751至4104777的序列同源)。
基因udhA的失活已在實(shí)施例F.III.1a1)中有所描述。可用同法進(jìn)行。
可將此二抗生素抗性框架剔除。將質(zhì)粒pCP20用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組中。此質(zhì)粒具有作用在此氯霉素抗性框架或卡那霉素抗性框架FRT位點(diǎn)的FLP重組酶。經(jīng)連續(xù)在42℃培養(yǎng)后，用PCR及同樣的寡核苷酸證實(shí)抗生素抗性框架已失落。
導(dǎo)入一個(gè)氯霉素抗性框架及缺失大部分有關(guān)基因可將基因pfkB失活。此方法已在達(dá)森科與華納(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中有所描述。
為此合成了兩個(gè)寡核苷酸-DpfkBR內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 37)gcgggaaaggtaagcgtaaattttttgcgtatcgtcatgggagcacagacgtgttccctgattgagtgtggctgcactccCATATGAATATCCTCCTTAG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與pfkB基因(其參考基因?yàn)樾蛄?804394至1805323，已登錄在http://genolist.pasteur.fr/Colibri/)的一個(gè)序列(1805320至1805241)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)氯霉素抗性框架(其參考序列已報(bào)告在達(dá)森科與華納(2000)，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645中)。
-DpfkBF內(nèi)含100個(gè)堿基(SEQ ID NO 38)gcgccctctctcgatagcgcaacaattaccccgcaaatttatcccgaaggaaaactgcgctgtaccgcaccggtgttcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其中有-一個(gè)區(qū)域(小寫)與pfkB基因的一個(gè)序列(1804421至1804499)同源。
-一個(gè)區(qū)域(大寫)用來擴(kuò)增一個(gè)氯霉素抗性框架。寡核苷酸DpfkBR與DpfkBF是用來從質(zhì)粒pKD3中擴(kuò)增這個(gè)氯霉素抗性框架用的。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)由電穿孔法轉(zhuǎn)入菌株MG1655A(pfkA，udhA)(pKD46)中。在此株內(nèi)表達(dá)的紅重組酶讓同源重組得以順利進(jìn)行。此氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子被篩選。并用寡核苷酸PfkBR與PfkBF證實(shí)此抗性框架確實(shí)已被導(dǎo)入。
PfkBR(SEQ ID NO 39)gccggttgcactttgggtaagccccg(與1805657至1805632的序列同源)。
PfkBF(SEQ ID NO 40)tggcaggatcatccatgacagtaaaaacgg(與1803996至1804025的序列同源)。
如前所述，可將此氯霉素抗性框架框架剔除。將質(zhì)粒pCP20用電穿孔法轉(zhuǎn)入重組株中。此質(zhì)粒具有作用在此氯霉素抗性框架的FRT位點(diǎn)的FLP重組酶。經(jīng)連續(xù)在42°C培養(yǎng)后，用PCR及同樣的寡核苷酸證實(shí)氯霉素抗性框架已失落。所得的菌株被命名為MG1655Δ(pfkA，pfkB，udhA)株。
b)將蠟狀芽孢桿菌芐基還原酶編碼基因yueD導(dǎo)入菌株A(pgi，udhA)或Δ(pfkA，pfkB，udhA)中將基因yueD導(dǎo)入載體pTrc99A(Amersham-Pharmacia)中。用寡核苷酸YueDR與YueDF來擴(kuò)增由蠟狀芽孢桿菌染色體所分離的基因。
YueDR(SEQ ID NO 41)CGTGAATTC(此處為國際公布時(shí)丟失處，申請人已要求國際局更正)將1-苯基-1，2-丙二酮(共同底物)加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)基中修飾株可以略遜于原始株(未經(jīng)修飾)的速率生長。此刻決定在一化學(xué)恒定器，(OD 5)，種植在一個(gè)含有對硝基苯甲醛(共同底物)與修飾株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在此種情況下，修飾株以與其在無共同底物存在的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相似的生長率生長。將化學(xué)恒定器維持1到5星期，但逐漸增加其稀釋率。稀釋率可分步或連續(xù)增大。常規(guī)性地制備在化學(xué)恒定器中菌相的甘油標(biāo)準(zhǔn)保存液。
d)進(jìn)化酶YueD的定性分析當(dāng)菌相不能再適應(yīng)所施加的稀釋率時(shí)，篩選工作既告完成。從所得的最后進(jìn)化菌相中分離單一菌落。(如有必要可用上一個(gè)甘油標(biāo)準(zhǔn)存儲液。)審查此進(jìn)化的芐基還原酶的動力學(xué)特性。將其與原始芐基還原酶動力學(xué)特性在1-苯基-1，2-丙二酮與對硝基苯甲醛中比較。在對硝基苯甲醛中，此進(jìn)化的芐基還原酶的kcat值大有改善。但在1-苯基-1，2-丙二酮中，其kcat值大被壓低了許多。進(jìn)化克隆的序列中發(fā)現(xiàn)許多點(diǎn)突變。這可解釋為何這些酶有不同的底物特異度。
參考資料安德生，E.H.；(1946)，生長大腸桿菌″B″株病毒抗性變種的條件，美國國家科學(xué)院院刊，32120-128。
A鮑丁，O歐瑟-卡洛戈洛布洛斯，A丹瑙，F(xiàn)拉克特與C克倫；(1993)，在釀酒酵母中一種簡單與有效的直接基因缺失法，核酸研究，21，3329-3330，1993。
布拉格門CB，戴維斯A，考斯特GJ，卡布圖E，李J，海特P，與布克JD，(1998)由釀酒酵母S288C株經(jīng)設(shè)計(jì)衍生的缺失株一組在PCR-介導(dǎo)的基因破壞反應(yīng)中及其他應(yīng)用上有用的基因與質(zhì)粒，酵母雜志，14115-32。
達(dá)森科，K.A.；華納，B.L.(2000)，利用PCR將大腸桿菌K-12一步染色體基因失活，美國國家科學(xué)院院刊，976640-6645。
米勒，1992；細(xì)菌基因?qū)W速成大腸桿菌及有關(guān)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約薩姆布魯克等(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，1989，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約西華，U.，布斯，W.，塔克斯，R.，與魏斯特-鮑茲，D.(1999)，監(jiān)測胞內(nèi)代謝物動態(tài)的自動取樣機(jī)，生物化學(xué)年鑒，27088-96。
臥旭，A.，布拉查，A.，珀門，R.，與菲利普生，P.(1994)，在釀酒酵母中用在傳統(tǒng)或PCR基因破壞作用上的新外源模塊，酵母雜志，10，1793-1808。
REFERENCESAnderson，E.H.(1946)，Growth requirements of virus-resistantmutants of Escherichia coli strain″B″Proc.Natl.Acad.Sci.USA32120-128.
A Baudin，O Ozier-Kalogeropoulos，A Denouel，F(xiàn) Lacroute，and CCullin(1993)，A simple and efficient method for direct gene deletion inSaccharomyces cerevisiae，Nucl.Acids Res.，213329-3330，1993.
Brachmann CB，Davies A，Cost GJ，Caputo E，Li J，Hieter P.BoekeJD.(1998)，Designer deletion strains derived from Saccharomycescerevisiae S288Ca useful set of strains and plasmids for PCR-mediatedgene disruption and other applications.Yeast.14115-32.
Datsenko，K.A.；Wanner，B.L.(2000)，One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-6645.
Miller，1992.A Short Course in Bacterial GeneticsA LaboratoryManual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.
Sambrook et al.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual.2ndEd.Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York.
Schaefer，U.，Boos，W.，Takors，R.，Weuster-Botz，D.(1999)，Automated sampling device for monitoring intracellular metabolitedynamics，Anal.Biochem.27088-96.
Wach，A.，Brachat，A.，Pohlmann，R.，and Philippsen，P.(1994)Newheterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions inSaccharomyces cerevisiae.Yeast，10，1793-1808.
序列表<110>代謝開發(fā)公司<120>生產(chǎn)能產(chǎn)生或修飾代謝途徑的進(jìn)化微生物的方法<130>D20701/345773<150>FR 0301924<151>2003-02-18<150>FR 0305768<151>2003-05-14<150>FR 0305769<151>2003-05-14<150>FR 0313054<151>2003-11-06<160>42<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetER<400>1tacccccgac gcaagttctg cgccgcctgc accatgttcg ccagtgccgc gcgggtttct 60ggccagccgc gcgttttcag catatgaata tcctccttag 100<210>2<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetEF<400>2tgacaatatt gaatcacacc ctcggtttcc ctcgcgttgg cctgcgtcgc gagctgaaaa 60aagcgcaaga aagttattgg tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetER<400>3ggtttaagca gtatggtggg aagaagtcgc 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetEF<400>4cccggggatg aataaacttg ccgccttccc 30<210>5<211>1161<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5atgacgcgta aacaggccac catcgcagtg cgtagcgggt taaatgacga cgaacagtat 60ggttgcgttg tcccaccgat ccatctttcc agcacctata actttaccgg atttaatgaa 120ccgcgcgcgc atgattactc gcgtcgcggc aacccaacgc gcgatgtggt tcagcgtgcg 180
ctggcagaac tggaaggtgg tgctggtgca gtacttacta ataccggcat gtccgcgatt240cacctggtaa cgaccgtctt tttgaaacct ggcgatctgc tggttgcgcc gcacgactgc300tacggcggta gctatcgcct gttcgacagt ctggcgaaac gcggttgcta tcgcgtgttg360tttgttgatc aaggcgatga acaggcatta cgggcagcgc tggcagaaaa acccaaactg420gtactggtag aaagcccaag taatccattg ttacgcgtcg tggatattgc gaaaatctgc480catctggcaa gggaagtcgg ggcggtgagc gtggtggata acaccttctt aagcccggca540ttacaaaatc cgctggcatt aggtgccgat ctggtgttgc attcatgcac gaaatatctg600aacggtcact cagacgtagt ggccggcgtg gtgattgcta aagacccgga cgttgtcact660gaactggcct ggtgggcaaa caatattggc gtgacgggcg gcgcgtttga cagctatctg720ctgctacgtg ggttgcgaac gctggtgccg cgtatggagc tggcgcagcg caacgcgcag780gcgattgtga aatacctgca aacccagccg ttggtgaaaa aactgtatca cccgtcgttg840ccggaaaatc aggggcatga aattgccgcg cgccagcaaa aaggctttgg cgcaatgttg900agttttgaac tggatggcga tgagcagacg ctgcgtcgtt tcctgggcgg gctgtcgttg960tttacgctgg cggaatcatt agggggagtg gaaagtttaa tctctcacgc cgcaaccatg 1020acacatgcag gcatggcacc agaagcgcgt gctgccgccg ggatctccga gacgctgctg 1080cgtatctcca ccggtattga agatggcgaa gatttaattg ccgacctgga aaatggcttc 1140cgggctgcaa acaaggggta a 1161<210>6<211>10<212>PRT<213>大腸桿菌<400>6Met Glu Thr Thr His Arg Ala Arg Gly Leu1 5 10
<210>7<211>1161<212>DNA<213>大腸桿菌<400>7atgacgcgta aacaggccac catcgcagtg cgtagcgggt taaatgacga cgaacagtat 60ggttgcgttg tcccaccgat ccatctttcc agcacctata actttaccgg atttaatgaa120ccgcgcgcgc atgattactc gcgtcgcggc aacccaacgc gcgatgtggt tcagcgtgcg180ctggcagaac tggaaggtgg tgctggtgca gtacttacta ataccggcat gtccgcgatt240cacctggtaa cgaccgtctt tttgaaacct ggcgatctgc tggttgcgcc gcacgactgc300tacggcggta gctatcgcct gttcgacagt ctggcgaaac gcggttgcta tcgcgtgttg360tttgttgatc aaggcgatga acaggcatta cgggcagcgc tggcagaaaa acccaaactg420gtactggtag aaagcccaag taatccattg ttacgcgtcg tggatattgc gaaaatctgc480catctggcaa gggaagtcgg ggcggtgagc gtggtggata acaccttctt aagcccggca540ttacaaaatc cgctggcatt aggtgccgat ctggtgttgc attcatgcac gaaatatctg600aacggtcact cagacgtagt ggccggcgtg gtgattgcta aagacccgga cgttgtcact660gaactggcct ggtgggcaaa caatattggc gtgacgggcg gcgcgtttga cagctatctg720ctgctacgtg ggttgcgaac gctggtgccg cgtatggagc tggcgcagcg caacgcgcag780gcgattgtga aatacctgca aacccagccg ttggtgaaaa aactgtatca cccgtcgttg840ccggaaaatc aggggcatga aattgccgcg cgccagcaaa aaggctttgg cgcaatgttg900agttttgaac tggatggcga tgagcagacg ctgcgtcgtt tcctgggcgg gctgtcgttg960tttacgctgg cggcatcatt agggggagtg gaaagtttaa tctctcacgc cgcaaccatg 1020acacatgcag gcatggcacc agaagcgcgt gctgccgccg ggatctccga gacgctgctg 1080
cgtatctcca ccggtattga agatggcgaa gatttaattg ccgacctgga aaatggcttc1140cgggctgcaa acaaggggta a 1161<210>8<211>5<212>PRT<213>大腸桿菌<400>8Met Glu Thr Thr His1 5<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetJR<400>9ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc 30<210>10<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetJBF<400>10tatgcagctg acgacctttc gcccctgcct gcgcaatcac actcattttt accccttgtt 60tgcagcccgg aagccatttt caggcaccag agtaaacatt 100<210>11<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetCR<400>11cgtccgggac gccttgatcc cggacgcaac 30<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetCF<400>12gcgtttacgc agtaaaaaag tcaccagcac gc32<210>13<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetCR<400>13ccggcgtcca gatcggcaat cagatcgtcg acatcttcca gaccaatatg caggcgaatc 60aaggtcccgc taaaatcgat catatgaata tcctccttag 100<210>14<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DmetCF
<400>14cggacaaaaa gcttgatact caactggtga atgcaggacg cagcaaaaaa tacactctcg 60gcgcggtaaa tagcgtgatt tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>15<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysKR<400>15tgttgcaatt ctttctcagt gaagagatcg gcaaacaatg cggtgcttaa ataacgctca 60cccgatgatg gtagaataac catatgaata tcctccttag 100<210>16<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysKF<400>16agtaagattt ttgaagataa ctcgctgact atcggtcaca cgccgctggt tcgcctgaat 60cgcatcggta acggacgcat tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>17<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysMR<400>17cccgccccct ggctaaaatg ctcttcccca aacaccccgg tagaaaggta gcgatcgcca 60
cgatcgcaga tgatcgccac catatgaata tcctccttag 100<210>18<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DcysMF<400>18agtacattag aacaaacaat aggcaatacg cctctggtga agttgcagcg aatggggccg 60gataacggca gtgaagtgtg tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysKR<400>19tttttaacag acgcgacgca cgaagagcgc 30<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysKR<400>20ggcgcgacgg cgatgtgggt cgattgctat 30<210>21<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysMR<400>21ggggtgacgg tcaggactca ccaatacttc 30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cysMF<400>22gcgcgcatcg ctggccgctg ggctacacac 30<210>23<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetYR<400>23ttagagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaataaa aactcttaag 60gacctccaaa tgcc74<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MetYF
<400>24gctctgtcta gtctagtttg cattctcacg 30<210>25<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DudhAR<400>25cccagaatct cttttgtttc ccgatggaac aaaattttca gcgtgcccac gttcatgccg 60acgatttgtg cgcgtgccag tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>26<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DudhAF<400>26ggtgcgcgcg tcgcagttat cgagcgttat caaaatgttg gcggcggttg cacccactgg 60ggcaccatcc cgtcgaaagc catatgaata tcctccttag 100<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>UdhAR<400>27gcgggatcac tttactgcca gcgctggctg 30
<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>UdhAF<400>28ggccgctcag gatatagcca gataaatgac 30<210>29<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpgiR<400>29gcgccacgct ttatagcggt taatcagacc attggtcgag ctatcgtggc tgctgatttc 60tttatcatct ttcagctctg catatgaata tcctccttag 100<210>30<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpgiF<400>30ccaacgcaga ccgctgcctg gcaggcacta cagaaacact tcgatgaaat gaaagacgtt 60acgatcgccg atctttttgc tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>31<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PgiR<400>31cggtatgatt tccgttaaat tacagacaag 30<210>32<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PgiF<400>32gcggggcggt tgtcaacgat ggggtcatgc 30<210>33<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkAR<400>33ttcgcgcagt ccagccagtc acctttgaac ggacgcttca tgttttcgat agcgtcgatg 60atgtcgtggt gaaccagctg catatgaata tcctccttag 100<210>34<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkAF<400>34ggtgtgttga caagcggcgg tgatgcgcca ggcatgaacg ccgcaattcg cggggttgtt 60
cgttctgcgc tgacagaagg tgtaggctgg agctgcttcg 100<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkAR<400>35ccctacgccc cacttgttca tcgcccg 27<210>36<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkAF<400>36cgcacgcggc agtcagggcc gacccgc 27<210>37<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkBR<400>37gcgggaaagg taagcgtaaa ttttttgcgt atcgtcatgg gagcacagac gtgttccctg 60attgagtgtg gctgcactcc catatgaata tcctccttag 100<210>38<211>99
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DpfkBF<400>38gcgccctctc tcgatagcgc aacaattacc ccgcaaattt atcccgaagg aaaactgcgc 60tgtaccgcac cggtgttcgt gtaggctgga gctgcttcg 99<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkBR<400>39gccggttgca ctttgggtaa gccccg 26<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PfkBF<400>40tggcaggatc atccatgaca gtaaaaacgg 30<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YveDR
<400>41cgtgaattct tattcatcaa ttctaataa29<210>42<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YueDF<400>42acgttcatga gatacgttat cataacagga ac3權(quán)利要求
1.一種可用來修飾代謝途徑的進(jìn)化微生物的制備方法，其特征為此方法包括以下數(shù)個(gè)步驟a)利用細(xì)胞的基因修飾從一個(gè)原始微生物制備一個(gè)修飾微生物，使此被修飾的微生物在一個(gè)特定的培養(yǎng)基生長時(shí)抑制某種代謝物的產(chǎn)生或消耗，因而使其生長能力受損；b)在前述的特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此修飾微生物使其進(jìn)化，此特定的培養(yǎng)基含可促成進(jìn)化的共同底物；a)篩選能在此特定的培養(yǎng)基(必要時(shí)含有共同底物)中生長的修飾微生物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為所述的代謝途徑選自氨基酸的生物合成途徑，核酸的合成途徑，脂質(zhì)的合成途徑或糖類的代謝途徑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征為修飾的代謝途徑是氨基酸的生物合成途徑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征為修飾的代謝途徑是選自以下的氨基酸的生物合成途徑蛋氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，賴氨酸，或異亮氨酸。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征為修飾的代謝途徑能消耗NADPH。
6.如權(quán)利要求1至4任何一項(xiàng)所述的方法，其特征為或許因?yàn)橄拗屏擞蒒ADPH氧化成NADP的反應(yīng)，在a)步驟中所作的修飾對將NADP還原成NADPH有利。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為進(jìn)化微生物至少有一個(gè)編碼進(jìn)化蛋白的進(jìn)化基因，此進(jìn)化使用一個(gè)新的代謝途徑來取代被抑制的代謝途徑。
8.如權(quán)利要求1或2任何一項(xiàng)所述的方法，其特征為其包括一個(gè)附加的步驟a1)，在此步驟中導(dǎo)入至少一個(gè)編碼異種蛋白的異種基因，此異種基因能促成新的代謝途徑的進(jìn)化，并為在步驟b)培養(yǎng)修飾微生物做好制備工作。
9.如權(quán)利要求7或8任何一項(xiàng)所述的方法，其特征為包括分離編碼進(jìn)化蛋白的進(jìn)化基因的步驟d)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征為將進(jìn)化的基因以某種合適的形態(tài)導(dǎo)入生產(chǎn)用微生物中用以生產(chǎn)進(jìn)化蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10的任何一項(xiàng)所述的方法得到的進(jìn)化微生物。
12.如權(quán)利要求11所述的進(jìn)化微生物，其特征為此微生物為具有一種修飾的“蛋氨酸合成酶”活性的大腸桿菌K183株，并已在2003年4月2日向CNCM注冊，取得注冊號碼I-3005。
13.一種制備進(jìn)化蛋白的方法，其中如權(quán)利要求11所述的進(jìn)化微生物在適合生產(chǎn)進(jìn)化蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征為所生產(chǎn)的進(jìn)化蛋白被純化。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法獲得的編碼進(jìn)化蛋白的進(jìn)化基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14任何一項(xiàng)所述的方法獲得的進(jìn)化蛋白。
17.如權(quán)利要求16的進(jìn)化蛋白，其特征為此酶具有修飾的“蛋氨酸合成酶”活性，其選自具有修飾的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶或?；呓z氨酸硫化氫解酶中挑選。
18.如權(quán)利要求17的進(jìn)化蛋白，其特征為具有未修飾的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶在進(jìn)化前選自PFAM PF01053或COGCPG0626中的胱硫醚-γ-合成酶。
19.如權(quán)利要求18的進(jìn)化蛋白，其中具有未修飾的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶在進(jìn)化前在其C端(保守區(qū)域1)具有以下的氨基酸序列X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1代表A，G，S，優(yōu)選為AX2代表E，V，P，T，優(yōu)選為EX3代表S，T，N，優(yōu)選為SX4代表G，D，A，H，T，優(yōu)選為GX5代表V，A，T，H，N，優(yōu)選為VX6代表E，R，K，F(xiàn)，優(yōu)選為EX7代表S，T，優(yōu)選為SX8代表L，I，V，A，優(yōu)選為LX9代表I，V，A，T，優(yōu)選為I其對應(yīng)大腸桿菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶序列(SEQ ID NO 6)的氨基酸殘基324-334，。
20.如權(quán)利要求18或19的進(jìn)化蛋白，其特征為具有未修飾的“蛋氨酸合成酶”活性的胱硫醚-γ-合成酶在進(jìn)化前在其N端(保守區(qū)域2)具有以下的氨基酸序列X10-X11-Y-X12-R-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X10代表A，H，Y，F(xiàn)，L，K，優(yōu)選為AX11代表Y，E，D，K，R，V，I，優(yōu)選為YX12代表S，A，T，P，G，優(yōu)選為SX13代表I，S，T，R，E，F(xiàn)，W，D，優(yōu)選為SX14代表S，G，A，I，E，N，K，P，優(yōu)選為GX15代表N，H，Q，S，優(yōu)選為NX16代表P，D，L，以為優(yōu)選PX17代表T，M，N，G，S，優(yōu)選為TX18代表R，L，V，S，W，E，優(yōu)選為R其對應(yīng)大腸桿菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶序列(SEQ ID NO 6)的氨基酸殘基44-54。
21.如權(quán)利要求18至20的任何一項(xiàng)的進(jìn)化蛋白，其特征為其包括至少一個(gè)在C端的突變，和/或至少一個(gè)在N端的突變。
22.如權(quán)利要求21的進(jìn)化蛋白，其特征為突變是將在未修飾的酶中與共同底物半胱氨酸反應(yīng)的酸性氨基酸被一個(gè)選自如下的非極性氨基酸殘基所取代甘胺酸，丙胺酸，亮胺酸，異亮胺酸，纈胺酸，苯丙胺酸或蛋氨酸。
23.如權(quán)利要求22的進(jìn)化蛋白，其特征為胱硫醚-γ-合成酶C端的突變被導(dǎo)入如權(quán)利要求14所定義的“保守區(qū)域1”的酸性氨基酸，特別是到X2殘基上。
24.如權(quán)利要求23的進(jìn)化蛋白，其特征為其C端具有如下所述的氨基酸序列X1-X2-X3-L-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9其中X1，X3，X4，X5，X6，X7，X8與X9與上文中定義相同X2代表G，A，L，I，V，F(xiàn)，M，優(yōu)選為A其對應(yīng)大腸桿菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶(SEQ ID NO 8)的氨基酸殘基324-334。
25.如權(quán)利要求24的進(jìn)化蛋白，其特征為其C端具有如下所述的氨基酸序列A-A-S-L-G-G-V-E-S其對應(yīng)大腸桿菌K12株的胱硫醚-γ-合成酶(SEQ ID NO 8)的氨基酸殘基324-332。
26.如權(quán)利要求25的進(jìn)化蛋白，其特征為具有修飾過的《蛋氨酸合成酶》活性的胱硫醚-γ-合成酶含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
27.如權(quán)利要求18至26的任何一項(xiàng)的進(jìn)化蛋白，其特征為胱硫醚-γ-合成酶N端的突變發(fā)生在被導(dǎo)入到如上定義的“保守區(qū)域2”的酸性氨基酸，特別是到X11和/或R和/或X13殘基上。
28.如權(quán)利要求27的進(jìn)化蛋白，其特征為具有修飾過的《蛋氨酸合成酶》活性的胱硫醚-γ-合成酶的N端有下列的氨基酸序列X10-X11-Y-X12-X19-X13-X14-X15-X16-X17-X18其中X7，X9，X12，X14，X15，X16，X17與X18如上文定義，X11如權(quán)利要求15所定義，或代表一個(gè)非極性氨基酸，X13如權(quán)利要求15所定義，或代表一個(gè)非極性氨基酸，X19是R或代表一個(gè)非極性氨基酸，X11，X13與X19中，至少一個(gè)代表非極性氨基酸，其中非極性氨基酸可從甘胺酸，丙胺酸，亮胺酸，異亮胺酸，纈胺酸，苯丙胺酸或蛋氨酸殘基中挑選。
29.如權(quán)利要求16的進(jìn)化蛋白，其特征為未突變的原始酶進(jìn)化前在H2S存在下能催化硫化氫解反應(yīng)。
30.如權(quán)利要求29的進(jìn)化蛋白，其特征為未突變的原始酶在進(jìn)化前具有O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶活性。
31.如權(quán)利要求30的進(jìn)化蛋白，其特征為具有O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶活性的原始酶的是從PFAM PF01053或COG COG2873對應(yīng)的O-酰基-L-高絲氨酸硫化氫解酶中選出的。
32.如權(quán)利要求31的進(jìn)化蛋白，其特征為原始酶是從以下所列的?；呓z氨酸硫化氫解酶中挑選出的NP_785969O-乙?；呓z氨酸(硫醇)-裂解酶，植物乳桿菌WCFS1AAN68137 O-乙酰基高絲氨酸硫化氫解酶，惡臭假單胞菌KT2440NP 599886 O-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶，谷氨酸棒桿菌ATCC 13032NP_712243乙?；呓z氨酸硫化氫解酶，鉤端螺旋體黃膽出血型賴株56601BAC46370 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，慢性型大豆根瘤菌USDA110AAO57279 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，假單胞桿菌丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000NP_284520 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶[腦膜炎奈瑟菌Z2491AAA83435 O-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶(銅假綠單胞菌)
33.如權(quán)利要求31的進(jìn)化蛋白，其特征為原始酶在進(jìn)化前是由谷氨酸棒狀桿菌的metY基因所編碼的O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶。
34.如權(quán)利要求33的進(jìn)化蛋白，其特征為O-?；?L-高絲氨酸硫化氫解酶是被谷氨酸棒狀桿菌metY基因(Genbank AF220150)所編碼的。
35.權(quán)利要求11所述的進(jìn)化微生物或權(quán)利要求15所述的進(jìn)化蛋白在生物轉(zhuǎn)化方法中的應(yīng)用。
36.如權(quán)利要求35所述的生物轉(zhuǎn)化方法，其中生物轉(zhuǎn)化依賴NADPH依賴性的酶。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中具NADPH依賴性的酶因進(jìn)化而具有底物特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備能修飾代謝途徑的進(jìn)化微生物的一個(gè)新的方法，其特征為其包括以下步驟a)通過對原始微生物細(xì)胞的基因修飾生產(chǎn)修飾的微生物，如在可影響微生物生長的特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物時(shí)抑制代謝物的生成和吸收，b)培養(yǎng)從前述特定的培養(yǎng)基中得到的微生物以誘導(dǎo)所述細(xì)胞發(fā)生進(jìn)化，有時(shí)有必要向特定培養(yǎng)基中加入共同底物以促進(jìn)所述的進(jìn)化，c)選擇可在特定培養(yǎng)基中進(jìn)化的修飾微生物，此特定培養(yǎng)基可任選地含有共同底物。本發(fā)明還涉及如上所述得到的進(jìn)化微生物、通過所述方法得到的編碼進(jìn)化蛋白質(zhì)的進(jìn)化基因以及所述的進(jìn)化微生物、基因或蛋白質(zhì)在生物轉(zhuǎn)化方法中的應(yīng)用。
文檔編號C12P13/06GK1751120SQ200480004474
公開日2006年3月22日 申請日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月18日
發(fā)明者M·沙托, B·岡薩雷斯, I·梅尼亞爾－薩勒, P·N·P·蘇凱勒, O·贊克 申請人:代謝開發(fā)公司