專利名稱：內酯酶的制造方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶的制造方法。本發(fā)明涉及用微生物表達和分泌生產具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶。此外，本發(fā)明涉及使用該酶和使用生產該酶的系統(tǒng)制造光學活性γ-內酯及其相關化合物的方法。
背景技術：
已知D-泛解酸內酯是制造D-泛酸、D-泛醇、雙泛酰巰乙胺的中間體。上述物質作為醫(yī)學上或生理學上重要的維生素除了用于醫(yī)藥品之外，還用作食品添加劑、飼料添加劑，此外還用作化妝品原料。以前，通過光學拆分化學合成的D、L-泛解酸內酯制造D-泛解酸內酯。不過，這種方法存在需要奎尼酸、番木鱉堿等高價的拆分劑，并且存在不容易回收D-泛解酸內酯等缺點。為了解決上述問題，本發(fā)明人等在專利文獻1和專利文獻2各公報提出了用酶對D、L-泛解酸內酯的不對稱水解進行光學拆分的方法。
即，涉及制造D-泛解酸內酯的方法和用屬于下述種屬的微生物制造D-泛解酸內酯水解酶的方法，其特征是，從屬于鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、膠霉屬、散囊菌屬、從赤殼菌屬、Schizophyllum、漆斑菌屬、鏈孢霉屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、Sporothrix、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬的微生物中選取具有內酯水解能力的微生物，通過該微生物選擇性地不對稱水解D、L-泛解酸內酯中的D-構型，使之生成D-泛酸，分離該D-泛酸，轉換成D-泛解酸內酯。
可是，其中公開的多數微生物不一定具有可在工業(yè)上應用程度的水解活性，為了使相應的微生物所具有的酶活性上升到可以在工業(yè)水平應用的程度，必須對培養(yǎng)條件或活性誘導條件等花費長時間進行復雜而艱難的研究。此外，因為其中相應的微生物是真菌，所以菌體呈現多種形態(tài)的菌絲狀，和具有單一形態(tài)的細菌等相比，在制造成對工業(yè)生產有利的固定化菌體方面存在相當大的難度。而且，從菌體中純化酶的時候，存在D-泛解酸內酯水解酶回收率相當差的問題。
為了解決上述各個問題，并且通過改變D-泛解酸內酯水解酶實現使酶活性產生飛躍性上升的目的，明確了編碼天然D-泛解酸內酯水解酶例如源自尖孢鐮孢屬(Fusarium oxysporum)的天然的D-泛解酸內酯水解酶或與之本質上具有同等活性的蛋白質的基因，并且制造轉化后含有編碼該蛋白質的堿基序列的DNA的宿主細胞(專利文獻3)，不過需要使由該轉化宿主細胞得到的酶活性可以達到在工業(yè)上直接應用的更為有效的方法。
專利文獻1特開平3-65198號專利文獻2特開平4-144681號專利文獻3國際公開小冊子WO，A，97/10341發(fā)明內容以前用大腸桿菌等得到的轉化子存在所生產的酶不能添加糖鏈、比天然型(野生型)分子量小、缺乏穩(wěn)定性的問題，一直在尋求解決上述問題的辦法。
本發(fā)明利用天然的內酯酶基因，制造出有效并且生產性優(yōu)異的生產該酶的系統(tǒng)。此外，本發(fā)明還用該酶和生產該酶的系統(tǒng)，構建了有效并且生產性能更優(yōu)異的光學活性γ-內酯生產系統(tǒng)。
具有D-泛解酸內酯水解酶活性的D-泛解酸內酯水解酶(以下稱為“內酯酶”)，尤其是從尖孢鐮孢屬克隆鑒定的內酯酶，其基因的分析結果表明該酶由含有5個內含子的1453個堿基對的染色體基因所編碼，該酶在NH2末端含有20個氨基酸組成的信號肽。與由該染色體基因轉錄來的mRNA互補的cDNA所編碼的成熟酶是380個氨基酸的蛋白質。
其野生型酶添加有糖鏈。
鑒于上述問題，本發(fā)明人等為了開發(fā)能夠在重組型酶上添加糖鏈的系統(tǒng)，進行了刻苦的研究，將編碼該內酯酶的基因和信號肽的基因序列一起導入到宿主細胞中，使之表達，結果成功地大量表達了添加有天然型糖鏈的該酶，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供〔1〕產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了編碼具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶和信號肽區(qū)域的DNA；〔2〕上述〔1〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，內酯酶來自鐮孢屬；〔3〕產生內酯酶的轉化子，其特征是，導入的DNA是編碼具有序列表編號9中的第1～第380個氨基酸的氨基酸序列的內酯酶的DNA，或編碼上述序列一部分序列與信號肽區(qū)域的DNA；〔4〕上述〔3〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，信號肽區(qū)域是序列表編號9中的第-20～第-1個氨基酸所組成的氨基酸序列或上述序列的一部分序列，或是Alp信號肽區(qū)域；〔5〕具有D-泛解酸內酯水解活性的重組內酯酶的制造方法，其特征是，培養(yǎng)上述〔1〕～〔4〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子，使之產生重組內酯酶，并得到重組內酯酶；和〔6〕制造通式(II)或通式(IV)所示的光學活性的γ-內酯衍生物或其鹽的方法，其特征是，使用通式(I)所表示的化合物或其鹽接觸選自上述〔1〕～〔4〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、細胞處理物或固定化菌體、從該轉化子得到的重組內酯酶和固定化的重組內酯酶。
通式(I) (R表示羥基、氨基，R1和R2相同或不同，各自獨立表示氫或低級烷基)通式(II) (R、R1和R2分別和上述相同)通式(IV) (R、R1和R2分別和上述相同)。
在其他實施方案中，本發(fā)明提供〔7〕產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了編碼具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶和信號肽區(qū)域的DNA或導入了插有該DNA的載體；〔8〕上述〔7〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中的載體具有1個或多個絲狀菌的增強子堿基序列；〔9〕上述〔1〕～〔4〕、〔7〕和〔8〕中記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中的載體在于絲狀菌中具有功能的啟動子區(qū)域導入1個或多個絲狀菌的增強子堿基序列；〔10〕上述〔1〕～〔4〕和〔7〕～〔9〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中的載體在于絲狀菌中具有功能的啟動子區(qū)域導入了1個或多個米曲霉的α-葡糖苷酶(agdA)啟動子上的增強子序列；〔11〕上述〔9〕或〔10〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其啟動子區(qū)域為來自絲狀菌的水解酶基因或糖分解系統(tǒng)酶基因的啟動子區(qū)域；〔12〕上述〔9〕～〔11〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其啟動子區(qū)域為源于米曲霉的α-葡糖苷酶(agdA)基因的啟動子區(qū)域，或含有其部分序列的啟動子區(qū)域；〔13〕上述〔7〕～〔12〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，載體是含有適于對宿主絲狀菌的轉化子進行選擇的標記(marker)基因、含有在大腸桿菌中進行復制的DNA區(qū)域的用于在絲狀菌中表達多肽的質粒；〔14〕上述〔13〕中記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，標記基因源自絲狀菌的硝酸還原酶基因、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶基因、色氨酸合成酶基因或乙酰氨酶基因；〔15〕上述〔13〕或〔14〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，標記基因為曲霉菌屬的硝酸還原酶基因；〔16〕上述〔13〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，終止子為源于米曲霉的α-葡糖苷酶基因的終止子或含有其部分序列的終止子；〔17〕上述〔7〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，載體含有表達鐮孢屬絲狀菌所產生的堿性蛋白酶(Alp)的啟動子區(qū)域；〔18〕上述〔1〕或〔7〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，信號肽區(qū)域是分泌該Alp的信號肽序列區(qū)域或該內酯酶的信號肽序列區(qū)域；〔19〕產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了含有下述序列的DNA(a)編碼全長的具有D-泛解酸內酯水解酶活性的全長內酯酶的DNA序列和(b)編碼該內酯酶NH2末端的信號肽區(qū)域DNA序列；〔20〕上述〔19〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了含有下述序列的DNA(a)編碼全長內酯酶的cDNA序列(i)、或染色體基因DNA序列(ii)和(b)編碼該內酯酶NH2末端信號肽區(qū)域DNA序列；〔21〕產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了含有下述序列的DNA(a)編碼全長的具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶的DNA序列和(b)含有編碼鐮孢霉菌屬絲狀菌產生Alp信號區(qū)域DNA序列；〔22〕上述〔21〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了含有下述序列的DNA(a)編碼全長內酯酶的cDNA序列(i)、或染色體基因DNA序列(ii)和(b)含有編碼該Alp信號肽區(qū)域DNA序列；〔23〕產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了序列表編號8中的編碼第61～第1453個堿基序列的DNA和編碼信號肽區(qū)域DNA所組成的NDA；〔24〕上述〔23〕記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，信號肽區(qū)域是序列表編號9中的第-20～-1的氨基酸所組成的氨基酸序列或鐮孢霉菌屬絲狀菌的Alp信號肽區(qū)域；〔25〕(S)-γ-內酯衍生物或其鹽的制造方法，該方法包括用通式(I)所表示的化合物或其鹽接觸選自上述〔1〕～〔4〕和〔7〕～〔24〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、細胞處理物或固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化的重組內酯酶，從反應系統(tǒng)中分離未反應的通式(II)所示的化合物或其鹽；通式(I) (R表示羥基、氨基，R1和R2相同或不同，各自獨立表示氫或低級烷基)通式(II) (R、R1和R2分別和上述相同)；
〔26〕(R)-γ-內酯衍生物或其鹽的制造方法，該方法包括用通式(I)所表示的化合物或其鹽接觸選自上述〔1〕～〔4〕和〔7〕～〔24〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、細胞處理物或固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化的重組內酯酶，得到通式(III)所示的化合物或其鹽，將其轉變成通式(IV)所示的化合物或其鹽；通式(I) (R表示羥基、氨基，R1和R2相同或不同，各自獨立表示氫或低級烷基)通式(III) (R、R1和R2分別和上述相同)通式(IV) (R、R1和R2分別和上述相同)；〔27〕一種DNA，其特征是，含有編碼內酯酶和信號肽區(qū)域的序列；〔28〕一種DNA，其特征是，含有(a)編碼內酯酶全長的DNA序列和(b)編碼該內酯酶的NH2末端信號肽區(qū)域的DNA序列；〔29〕一種DNA，其特征是，其中含有(a)編碼全長內酯酶的cDNA序列(i)、或染色體基因DNA序列(ii)和(b)編碼該內酯酶NH2末端信號肽區(qū)域的DNA序列。
另外的實施方案中，本發(fā)明提供〔30〕上述〔1〕～〔4〕、〔7〕和〔18〕～〔24〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，導入到屬于曲霉屬、支頂孢屬、鐮孢菌屬的微生物中，以此作為宿主微生物；〔31〕上述〔1〕～〔4〕、〔7〕和〔18〕～〔24〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，導入到屬于米曲霉、頂頭孢霉、尖孢鐮孢的微生物中，以此作為宿主微生物；〔32〕一種制造方法，其特征是，在通式(II)或(IV)的光學活性γ-內酯衍生物的制造方法中，固定產生內酯酶的轉化子、其培養(yǎng)物、其細胞、其細胞處理物和由該轉化子得到的重組的內酯酶，使之可重復反應；〔33〕通式(I)中R為羥基、R1和R2都為甲基的光學活性泛解酸內酯及其鹽的制造方法；〔34〕泛酸或其鹽、泛醇或雙泛酰巰基乙胺的制造方法，其特征是，用通式(I)所示的化合物或其鹽與選自上述〔1〕～〔4〕、〔7〕～〔24〕、〔30〕和〔31〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、細胞處理物或固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化重組內酯酶相接觸，應用以此得到的D-泛解酸內酯；〔35〕一種固定菌體，其特征是，固定上述〔1〕～〔4〕、〔7〕～〔24〕、〔30〕和〔31〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子；和〔36〕一種固定化重組酶，其特征是，固定由上述〔1〕～〔4〕、〔7〕～〔24〕、〔30〕和〔31〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子得到的重組內酯酶。
此外在其他實施方案中，本發(fā)明提供〔37〕D-泛解酸內酯衍生物或其鹽的制造方法，其特征是，用上述通式(I)所示化合物或其鹽接觸選自上述〔1〕～〔4〕、〔7〕～〔24〕、〔30〕、〔31〕、〔35〕和〔36〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、細胞處理物或固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化重組內酯酶，制造上述通式(III)所示的光學活性化合物或其鹽，然后將通式(III)所示的光學活性化合物或其鹽作為出發(fā)物質，使用公知的方法或與之等價的方法或適宜的改變的方法，制造通式(IV)所示的化合物、泛酸、泛酸鈣、泛醇、泛酰巰基乙胺、輔酶A(CoA)、泛酰乙基醚、雙泛酰硫乙胺等D-泛解酸內酯衍生物或其鹽；〔38〕上述〔37〕記載的制造方法，其特征是，(a)用β-丙氨酸的鈣鹽或其酯與D-泛解酸內酯縮合，制造泛酸鈣、(b)用β-丙氨酸或其酯與D-泛解酸內酯縮合，產生D-泛酸后，使之與鈣化合物反應，制造D-泛酸鈣、(c)在仲胺或叔胺存在下，使D-泛解酸內酯和β-丙氨酸反應，向得到的反應混合物中加入氧化鈣，制造D-泛酸鈣、(d)使D-泛解酸內酯和3-氨丙醇縮合，制造D-泛醇；(e)使D-泛解酸內酯和γ-氨丙腈(aminopropionitrile)反應，制造D-泛酸腈(pantothenonitrile)，然后和半胱氨酸反應，成為2-(2-D-泛酸酰胺乙基)-2-噻唑啉后，水解，制造D-泛酰巰基乙胺，或(f)在過氧化氫存在的情況下，縮合上述(e)工序得到的D-泛酰巰基乙胺，制造雙泛酰硫乙胺；〔39〕在制造通式(III)所示的化合物、通式(IV)所示的化合物、泛酸、泛酸鈣、泛醇、泛酰巰基乙胺、輔酶A(CoA)、泛酰乙基醚、雙泛酰硫乙胺等D-泛解酸內酯衍生物或其鹽時，上述〔1〕～〔4〕、〔7〕～〔24〕、〔30〕、〔31〕、〔35〕和〔36〕中任一個記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、細胞處理物和固定菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定的重組內酯酶、或上述〔27〕～〔29〕中任一個記載的DNA的應用。
發(fā)明效果本發(fā)明提供了利用天然的內酯酶基因，制造生產有效并且生產性優(yōu)異的生產該酶的系統(tǒng)的技術，此外，本發(fā)明還用該酶和生產該酶的系統(tǒng)，構建了能夠有效并且生產性更優(yōu)異的光學活性γ-內酯生產系統(tǒng)。
通過本發(fā)明，不需要高價的拆分劑，采用簡單的操作，適合工業(yè)化生產，環(huán)境方面的問題少，并且能夠以有效的方法制造有用的醫(yī)藥品中間體或氨基酸或以泛酸為出發(fā)原料的光學活性γ-內酯衍生物。提供了簡便地并且可以工業(yè)化制造光學活性γ-內酯衍生物的制造方法。此外，可以有效并且具有經濟優(yōu)勢地制造D-泛解酸內酯和其衍生物，例如泛酸、泛酸鈣、泛醇、泛酰巰基乙胺、輔酶A(CoA)、泛酰乙基醚、雙泛酰硫乙胺或其鹽。
本領域的技術人員可以從下面的記載中理解本發(fā)明的其他的目的、特征、優(yōu)越性和其觀點。不過，包括下面的內容和具體的實施例等內容在內的本說明書的內容展示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，只是為了說明而提出的。通過下面的內容和本說明書的其他部分的內容，本領域的技術人員能夠很容易地理解在本說明書中公布的本發(fā)明的宗旨和范圍，可以進行各種變化和/或改變(或修飾)。在本說明書中引用的全部專利文獻和參考文獻是出于說明的目的引用的，它們只是本說明書的一部分，所含有的內容包含在其中，僅用于解釋。


圖1是關于在米曲霉中表達外來的內酯酶基因的調查結果的電泳照片。
A表示用考馬氏亮藍染色的電泳分離蛋白質的凝膠。泳道1是分子量標準(Daiichi Chemicals公司，東京，日本)磷酸酶b(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、醛縮酶(42kDa)和碳酸酐酶(30kDa)。泳道2是pNAN-PC轉化的米曲霉的無細胞(cell free)抽提液，泳道3是pNAN-XG轉化的米曲霉的無細胞抽提液。每個泳道采用25μg。泳道4是從尖孢鐮孢中純化的內酯酶。采用0.5μg。
B表示的是Western印記的結果，用對野生型內酯酶特異性的抗體進行免疫染色的與A相同的凝膠。泳道1是分子量標準(SDS-PAGE預染低分子量標準，Bio-Rad，Hercules，USA)磷酸酶b(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、卵清白蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(31kD)和胰蛋白抑制劑(22kDa)。
圖2用尖孢鐮孢和重組米曲霉不對稱水解外消旋泛解酸內酯的結果。A表示使用濕潤細胞的結果，B表示使用固定化細胞的結果。白色圓形表示pNAN-PC轉化的米曲霉，黑色圓形表示pNAN-XG轉化的米曲霉，白色四方形表示尖孢鐮孢。
圖3表示用于分泌表達內酯酶的質粒的結構。通過PCR進行組合構建融合基因，用SalI和XbaI切割，亞克隆到pBluescript II SK+中。
圖4表示頂頭孢霉轉化子分泌內酯酶的電泳(SDS-PAGE)照片。使用的是10％的聚丙烯酰胺凝膠。泳道1為從尖孢鐮孢中純化得到的野生型的內酯酶(0.5μg)；泳道2為用pAlpS轉化的頂頭孢霉(含有3μg蛋白質)；泳道3為pLacS轉化的頂頭孢霉(3μg蛋白質)。泳道4為分子量標記磷酸酶b(97kDa)、牛血清白蛋白(66kDa)、醛縮酶(42kDa)和碳酸酐酶(30kDa)。
圖5表示糖鏈切割處理后的內酯酶的電泳(SDS-PAGE)照片。用EndoHf處理后的野生型內酯酶(泳道2-5)和用EndoHf處理后由pAlpS轉化的頂頭孢霉純化得到的重組型內酯酶后(泳道8-11)在10％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳的結果(每個泳道各0.8μg)。泳道2和泳道8為經過1分鐘糖鏈切割處理；泳道3和泳道9為經過5分鐘糖鏈切割處理；泳道4和泳道10為經過15分鐘糖鏈切割處理；泳道5和泳道11為經過60分鐘糖鏈切割處理。泳道1和泳道7分別表示未進行糖鏈切割處理的野生型內酯酶和重組型內酯酶，泳道6為分子量標準，詳細情況和圖4相同。
圖6表示固定化酶不對稱水解外消旋泛解酸內酯的結果。用HPLC測定D-和L-泛酸的比例。黑色圓形表示D-泛酸；白色圓形表示L-泛酸；白色四方形表示DL-泛解酸內酯(外消旋泛解酸內酯)。
圖7表示編碼來自鐮孢屬絲狀菌的內酯酶的染色體DNA(基因組基因)的堿基序列。用添加陰影表示NH2末端的20個氨基酸殘基序列的信號肽區(qū)域(1～60的堿基序列)。此外，用小寫字母表示5個內含子，用菱形表示推測的N-糖基化的天冬酰胺，用星號表示相關的終止密碼子。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，提供了重組表達編碼有具有分解天然的D-泛解酸內酯能力的內酯酶，例如來自尖孢鐮孢野生型(天然型)(D-泛解酸內酯水解酶)的內酯酶的基因，或重組表達編碼與之具有本質上等同活性的蛋白質的基因的技術及其該技術的應用。還提供了制造和培養(yǎng)/增殖用含有該內酯酶的堿基序列的編碼DNA轉化的宿主細胞、用該宿主細胞制造該蛋白質、和該蛋白質和宿主細胞的應用等。此外，本發(fā)明還提供了多種有用的利用編碼上述內酯酶的基因的手段，還利用設計的表達載體等，提供了有效并且生產性能更優(yōu)異的D-泛解酸內酯生產系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及內酯酶，其特征是，該酶具有選擇性不對稱水解D、L-泛解酸內酯中的D-構型的活性；本發(fā)明涉及利用下述發(fā)現的技術使用編碼包含NH2末端信號肽區(qū)域的全長該內酯酶的基因進行轉化，得到的轉化子不僅能夠表達生產和野生型酶具有同等分子量的重組酶，而且得到的該酶的活性在穩(wěn)定性方面也令人滿意。本發(fā)明還涉及用重組技術，得到能夠保持比上述內酯酶具有更高催化能力和穩(wěn)定酶活性的轉化的細胞，應用該細胞的技術。
本發(fā)明提供用微生物表達和分泌具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶的技術，代表性的有將含有N末端信號肽區(qū)域的形式的編碼該內酯酶全長的基因導入到絲狀菌，如曲霉屬或支頂孢屬等菌中，得到的轉化子產生和野生型分子量一致的添加了糖鏈的重組酶，該酶在DL-泛解酸內酯等的γ-內酯類的水解反應中比未添加糖鏈的酶具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性，而且，當轉化菌為米曲霉時，所得到酶比尖孢鐮孢的酶的水解率更高。另外，當轉化菌為頂頭孢霉時，該菌能夠向菌體外大量分泌內酯酶，具有可在酶(粗酶、純化酶或固定化酶)水平進行DL-泛解酸內酯的水解反應等優(yōu)點。
本發(fā)明所用的基因重組技術可以采用例如Maniatis等人，“Molecular Cloning”，2nd Ed，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.T.(1989)；日本生化學會編，《續(xù)生化學實驗講座1、基因研究方法II》，東京化學同人(1986)；日本生化學會編，《新生化學實驗講座2、核酸III(重組DNA技術)》、東京化學同人(1992)；R.Wu編，“Methodsin Enzymology”，Vol.68，Academic Press，New Youk(1980)；R.Wu等人編，“Methods inEnzymology”，Vol.100 & 101，Academic Press，New York(1983)；R.Wu等人編，“Methods in Enzymology”Vol.153，154 & 155，AcademicPress，New Youk(1987)等中記載的方法或其中引用的文獻所記載的方法或本質上與之相同的方法或改變的方法等。這些方法也可以是符合本發(fā)明的目的的對公知的方法單獨加以改良的方法。
本說明書中，“聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)”又稱為“PCR”，通常指的是在美國專利4683195號的說明書等中記載的方法，例如指的是在體外用酶擴增目的核酸序列的方法。通常PCR法包括使用模板和與之能夠很好地雜交的2個寡核苷酸引物，重復引物的延長合成循環(huán)。在PCR法中應用的典型的引物為與擴增模板內部的核酸序列相對應的互補的引物，例如優(yōu)選使用可以與該擴增核酸序列的兩端相互補的或可以與該擴增核酸序列的鄰接位置相互補的作為引物。優(yōu)選的5’端的引物至少含有起始密碼子或可進行使之含有該起始密碼子的擴增，此外，優(yōu)選3’端的引物至少含有終止密碼子或可進行使之含有該終止密碼子的擴增。優(yōu)選5個以上堿基、更優(yōu)選10個以上堿基組成的寡核苷酸作為引物，更優(yōu)選18～25個堿基組成的寡核苷酸作為引物。
可以用領域內公知的方法或與之等價的方法或改變的方法進行PCR反應。例如可以按照R.Saiki等人，Science，1301350，1985；R.Saiki，等人，Science，239487，1988；H.A.Erlich編，PCRTechnology，Stockton Press，1989；D.M.Glover等人編，“DNACloning”，第二版，Vol.1(The Practical Approach Series)”，IRLPress，Oxford University Press(1995)；M.A.Innis等人編，“PCRProtocolsa guide to methods and applications”，Academic Press，New Youk(1990)；M.J.McPherson，P.Quirke and G.R.Taylor(編)，PCRa practical approach，IRL Press，Oxford(1991)；M.A.Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等中所記載的方法或對其修飾加以改變的方法等。此外，可以按照試劑盒制造者或試劑盒銷售者所闡明的流程實施PCR法使用市售的試劑盒進行PCR。
本說明書中的“寡核苷酸”是比較短的單鏈或雙鏈的多聚核苷酸，優(yōu)選多聚脫氧核糖核酸，可以按照Angew.Chen.Int.Ed.Engl.，Vol.28，p.716-734(1989)中記載的已知方法，如磷酸三酯法、磷酸二酯法、亞磷酸法、磷酸胺法、磷酸法等方法化學合成。已知在修飾的固體載體上能夠便利地進行常規(guī)的合成，例如可以采用自動合成裝置，該裝置在市場上有銷售。該寡核苷酸可以含有一個或一個以上的修飾堿基，例如含有次黃嘌呤核苷等在天然情況下通常沒有的堿基或三苯甲基化的堿基等，根據不同情況還可以含有添加有標記的堿基。
可以利用雜交技術鑒定目的核酸?？砂凑丈鲜龉嫉摹痘蛑亟M技術》的文獻記載的方法或基本與之等價的方法或者該變的方法進行該雜交。例如將含有DNA等核酸的樣本轉移到含有尼龍濾膜等的載體上，根據需要進行變性、固定、洗滌等，在雜交緩沖液中，根據需要用變性的標記探針DNA片段等和轉移到載體(例如膜等)上的核酸反應，以此實現雜交。
通常雜交處理大約35～大約80℃、更優(yōu)選大約50～大約65℃下，進行大約15分鐘～大約36小時、更優(yōu)選大約1～大約24小時，可以選擇最適宜的條件進行雜交處理。例如在大約55℃下進行18小時雜交處理?？梢詮谋绢I域內普遍使用的緩沖液中選擇用于雜交的緩沖液，例如可使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。例如使用堿變性液的方法變形轉移后的載體(例如膜等)，優(yōu)選在其處理后用中和液或緩沖液進行處理。另外，可以選擇在通常大約40～大約100℃、更優(yōu)選大約70～大約90℃、加熱大約15分鐘～大約24小時、更優(yōu)選大約1～大約4小時，選擇適當的條件進行載體(例如膜等)固定處理。例如在大約80℃，加熱大約2小時固定濾膜等載體?？梢杂帽绢I域內通常使用的洗滌液，例如用含有1MNaCl、1mM EDTA和0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)的50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0等進行洗滌，以此作為轉移后的載體(例如膜等)的洗滌處理?？梢詮谋绢I域內通常使用的載體中選擇含有尼龍濾膜等的膜的載體。
上述堿性變性液、中和液、緩沖液可以從本領域內通常所使用的各種液中加以選擇。例如可以使用含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的液體等作為堿性變性液；可以用含有1.5M NaCl的0.5M Tris-HCl緩沖液，pH8.0等作為中和液；例如可以用2×SSPE(0.36M NaCl、20mMNaH2PO4和2mM EDTA)等作為緩沖液。此外，在進行雜交處理之前，為了防止非特異性的雜交反應，根據需要，優(yōu)選對轉移的載體(例如膜等)進行雜交預處理。該雜交預處理可以如下進行，例如浸泡到雜交預處理溶液(50％甲酰胺、5×Denhart溶液(0.2％牛血清白蛋白，0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、5×SSPE、0.1％SDS、100μg/ml熱變性鮭精DNA)等中，在大約35～大約50℃、優(yōu)選大約42℃、反應大約4～大約24小時，優(yōu)選大約6～大約8小時。本領域的技術人員可以重復適當的實驗，以此選擇更優(yōu)選的條件作為該條件。例如可以在大約70～大約100℃、優(yōu)選大約100℃，加熱大約1～大約60分鐘，優(yōu)選大約5分鐘等變性用于雜交的標記探針DNA片段。并且，可以按照本身公知的方法或以之為基準的方法進行雜交。本說明書中的雜交條件，例如鈉的濃度，大約為15～大約50mM，優(yōu)選大約19～大約40mM，更優(yōu)選大約19～大約20mM，溫度大約為35～85℃，優(yōu)選大約50～大約70℃、更優(yōu)選大約60～大約65℃的條件。
雜交結束后，充分洗滌濾膜等載體，去除已經特異性雜交反應的標記探針DNA片段以外的標記探針等，然后進行檢測。可以用本領域內通常使用的溶液洗滌濾膜等載體，例如用含0.1％SDS的0.5×SSC(0.15M NaCl、15mM檸檬酸)溶液等實施洗滌。
可以用具有代表性的自放射顯影檢測雜交的核酸，也可以適當選擇本領域所用的方法，進行檢測。將檢測信號相對應的核酸條帶重懸到適宜的緩沖液，例如SM溶液(含有100mM NaCl和10mM MgSO4的50mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5)中，然后，將該懸濁液適當稀釋，分離、純化目的核酸，并且可以再擴增。
可以用雜交處理從含有核酸樣品的基因庫或cDNA庫等中重復篩選目的核酸。
可以從屬于下述各屬的微生物中獲得本發(fā)明所用的該內酯酶，例如鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、軸刺座霉屬、膠霉屬、散囊菌屬、從赤殼菌屬、漆斑菌屬、鏈孢霉屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、Sporothrix、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬等。具有代表性的有例如尖孢鐮孢IFO 5942、半裸鐮孢IFO 30200、Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561、稻惡苗赤霉IFO 6349、米曲霉ATCC 91002、米曲霉IFO 5240、泡盛曲霉IFO 4033、產黃青霉IFO 4626、米根霉IFO 4706、Volutella buxi IFO 6003、鏈孢膠霉IFO 6121、Eurotium chevalieri IFO 4334、Nectria elegans IFO 7187、群交裂褶菌IFO 4928、露濕漆斑菌IFO 9531、粗糙鏈孢菌IFO 6067、Acremonium fusidioides IFO 6813、柄銹生座孢IFO 6464、李克氏梨頭霉IFO 4009、Sporothrix schenckii IFO 5983、VerticilliumMalthousei IFO 6624、鉤骨節(jié)皮病IFO 7865等。
可以基于WO，A，97/10341；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，12787-92，1998，利用基因重組技術得到本發(fā)明中使用的編碼內酯酶的基因。例如破碎培養(yǎng)的尖孢鐮孢菌體，用常規(guī)方法離心分離染色體DNA后，分解去除RNA，進行去除蛋白質的操作，純化DNA成分?？梢詤⒖肌爸参锷飳嶒炛改限r村文化社，252頁”進行上述操作。同樣，從破碎的菌體中，按照AGPC法提取總RNA，然后用適當的方法，例如用寡聚dT纖維素柱純化mRNA，之后以得到的mRNA為模板，用逆轉錄酶等合成cDNA。此外，使用已經構建好的基因庫，采用適當的引物，通過PCR法，或逆轉錄PCR(polymerase chain reactioncoupled reverse transcription；RT-PCR)法得到目的基因?？梢詫⒁呀洬@得的內酯酶基因作為探針使用?？梢允褂檬惺鄣臉擞浽噭┖校珉S機DNA標記試劑盒(Boehringer Mannheim公司)等對探針等進行同位素等的標記。例如可以使用random-priming試劑盒(Pharmacia LKB公司，Uppsala)等，向探針DNA上標記[α-32P]dCTP(Amersham公司)等，得到具有放射活性的探針。
可以用本領域內常規(guī)使用的方法分別純化分離含有目的核酸的噬菌粒、重組質粒、重組載體等。例如可以用甘油梯度超速離心法(Molecular Cloning，a laboratory manual，ed.T.Maniatis.ColdSpring Harbor Laboratory，2nd ed，78，1989)、電泳法等進行純化?？梢杂帽绢I域常規(guī)使用的方法從噬菌粒中純化分離DNA，例如將得到的噬菌粒等重懸到TM(含10mM MgSO4的50mM Tris-HCI緩沖液，pH7.8)等溶液中，用DNaseI和RNase A等處理后，加入20mM EDTA，50μg/ml的Proteinase K和0.5％SDS混合液，在大約65℃，保溫大約1小時，將其酚抽提和二乙基醚抽提后，通過乙醇沉淀使DNA沉淀，然后用70％的乙醇洗滌得到的DNA后，干燥，用TE溶液(含10mMEDTA的10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.8)溶解得到目的核酸等。通過亞克隆等可以得到大量的目的DNA。例如可以用質粒載體等以大腸桿菌為宿主進行亞克隆。可以采用和上述同樣的離心、酚抽提、乙醇沉淀等方法純化分離所得到的亞克隆的DNA?？梢杂秒p脫氧法、例如M13雙脫氧法等、Maxam-Gilbert法等測定堿基序列，也可以用市售的測序試劑盒，例如Taq dyeprimer循環(huán)測序試劑盒等、自動堿基序列測定裝置，例如熒光DNA測序裝置等測序。
在本說明書中，核酸(或多聚核酸)是單鏈DNA、雙鏈DNA、RNA、DNARNA雜合體、合成DNA等。此外，也可以是基因組DNA(染色體基因DNA)、基因組DNA文庫、cDNA、合成DNA中的任何一種。核酸的堿基序列可以進行修飾(例如添加、去除、置換等)，也可以包括經過上述修飾后的序列。核酸可以是編碼本發(fā)明中記載的肽或編碼其一部分的核酸，優(yōu)選DNA。也可以通過化學合成的方法得到核酸。在化學合成片段時，也可以通過酶使之連接。
在本說明書中，所得到PCR產物等的核酸(包括DNA在內)，通常經過1％～2％的瓊脂糖凝膠電泳，切取特異的條帶后，用市售的試劑盒，例如gene clean kit(Bio 101)等抽提。用適當的限制性內切酶切割抽提的DNA，根據需要進行純化處理，然后再根據需要用T4多聚核苷酸激酶等將其5’末端磷酸化后，連接到pUC18等pUC系列載體等適當的質粒載體上，轉化到適當的感受態(tài)細胞中。測定并分析克隆化后的PCR產物的堿基序列?？梢允褂美鏿-Direct(Clontech公司)、pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司)、pAmpTM(Gibco-BRL公司)等銷售的質粒載體進行PCR產物的克隆。向宿主細胞轉化時，可以使用例如噬菌粒載體、鈣法、銣/鈣法、鈣/錳法、TFB高效率法、FSB冷凍感受態(tài)細胞法、快速克隆法、電穿孔法等領域內公知的方法或與之等價的方法(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，166557，1983等)。
可以向該質粒的序列內導入例如適合所選擇宿主細胞表達的密碼子或設置限制性酶切位點。此外，可以含有調控序列、增強子序列等使目的基因容易表達的序列，和其他對目的基因連接有利的連接鏈(linker)、接頭(adaptor)等，還可以含有控制抗生素耐受性等、控制代謝、對篩選等有用的序列等。
以大腸桿菌為宿主的質粒可以列舉pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene)等。適合在大腸桿菌中表達的質粒載體可列舉pAS、pKK223(Pharmacia)、pMC1403、pMC931、pKC30等。
宿主細胞為大腸桿菌時，例如來自大腸桿菌K12菌株的大腸桿菌，可列舉NM533 XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109等。在本發(fā)明的基因工程操作中，可以使用本領域內已知的或廣泛使用的限制性酶、逆轉錄酶、可以為了使DNA片段適合克隆化，使用對其構造進行修飾或改變的DNA修飾酶、分解酶、DNA聚合酶、末端核苷轉移酶、DNA連接酶等。
根據本發(fā)明，也可以將該內酯酶以融合蛋白的形式表達，在生物體內或生物體外，進行轉變、加工，使之具有與野生型基本等同的生物學活性。此外，可以用基因工程中常用的融合表達方法，利用該融合蛋白的融合部分，可以用親和層析等進行純化?？梢杂妙I域內公知的方法，通過例如利用合成寡核苷酸等向指定位置導入突變的方法(部位特異性突變導入法)或使用PCR等對蛋白質的結構進行修飾、改變等。
在本發(fā)明中，為了制造表達該內酯酶的轉化子，構建編碼該內酯酶和信號肽的DNA，適當加以利用。優(yōu)選來自鐮孢屬絲狀菌的編碼該內酯酶的基因，例如在本發(fā)明中所使用的用于表達重組內酯酶的堿基序列為含有編碼內酯酶全長的DNA序列和編碼該內酯酶NH2末端信號肽區(qū)域的DNA序列。此外，該用于表達的重組內酯酶的堿基序列可以含有(a)來自鐮孢菌屬絲狀菌的內酯酶全長cDNA序列或染色體基因DNA序列和編碼該內酯酶的NH2末端信號肽區(qū)域的DNA序列。
優(yōu)選的例子可以將含有編碼該來自鐮孢菌屬絲狀菌的內酯酶和信號肽區(qū)域序列的序列重組到適當的表達載體內。該表達載體可以含有一個或多個絲狀菌的增強子堿基序列、含有在鐮孢菌屬絲狀菌表達堿性磷酸酶(Alp)所用的啟動子區(qū)域、將一個或多個絲狀菌的增強子堿基序列導入到在絲狀菌中具有啟動子功能的區(qū)域、由在Alp分泌中的信號肽序列區(qū)域或內酯酶的信號肽序列區(qū)域所組成的信號肽區(qū)域。
例如含有米曲霉α-糖苷酶基因(agdA)啟動子上的增強子序列和啟動子區(qū)域的表達用載體適于在絲狀菌中表達。對于導入了該增強子的啟動子序列，只要能在絲狀菌中發(fā)揮功能即可，沒有特殊的限制。具體可以列舉編碼α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、細胞生物水解酶和乙酰氨酶等水解酶的基因的啟動子，和編碼在糖酵解途徑中的3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、醇脫氫酶和烯醇酶等糖酵解酶基因的啟動子。
可以從曲霉菌屬的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶的基因中分離得到適合的啟動子。更優(yōu)選米曲霉的α-糖苷酶基因的啟動子。該啟動子也可以是部分序列，只要含有在絲狀菌中的發(fā)揮啟動子功能即可。而且，適于在本發(fā)明中使用的表達質粒中含有能在上述的改良的絲狀菌中發(fā)揮功能的啟動子、終止子、適合進行宿主轉化子篩選的標記基因、可以在大腸桿菌中進行復制的的DNA區(qū)域。對于啟動子上導入該增強子的部位，只要是在啟動子區(qū)域即可，沒有特別的限制。終止子只要在絲狀菌中能發(fā)揮功能即可，沒有特別的限制。例如更優(yōu)選米曲霉的α-糖苷酶基因的終止子，或含有其部分序列的終止子。優(yōu)選的選擇性標記可列舉硝酸還原酶(niaD)、鳥氨酸氨基甲酰轉移酶(argB)、色氨酸合成酶基因(trpC)或乙酰氨酶的基因。更優(yōu)選的選擇性標記基因是硝酸還原酶基因(niaD)。利用在啟動子和終止子間設置的限制性內切酶識別位點，向這些質粒中插入編碼表達本發(fā)明的目的蛋白質的DNA片段作為適合表達用的載體可以使用例如特開平09-9968號公報、特開平5-268972號公報等公布的載體，或者采用公知的技術由上述載體衍生的載體。例如優(yōu)選使用pNLH2、pNAN8142等質粒。連接基因時，可以使用合成DNA作為基因間的接頭DNA。該合成DNA只要和兩個基因的側翼一致，并且不會導致目的基因失去活性即可。例如用AP酶基因啟動子和翻譯起始位置和/或者分泌信號肽表達目的基因時，可以使來自該AP酶基因的部位和目的基因的側翼一致，以此制造融合基因，連接到對應于和AP酶分泌信號肽翻譯起始密碼子的下游的側翼上，進行目的物質在菌體外的分泌表達。只要不喪失啟動子的功能，缺失一部分DNA片段也沒有關系。此外，可以相應的適當加以改變，使啟動子和翻譯起始部位的功能發(fā)生變化，例如改變包含啟動子和翻譯起始部位的DNA堿基序列，也可以改變與啟動子和翻譯起始部位無關區(qū)域的DNA堿基序列使之增加表達能力。
可以使用任何一種生物作為導入如上所述構建的目的基因的宿主，只要是能夠使上述基因復制、表達的生物即可。代表性的宿主，可以從酵母、絲狀菌、植物等真核生物中適當選擇?？闪信e屬于鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、軸刺座霉屬、膠霉屬、散囊菌屬、從赤殼菌屬、、漆斑菌屬、鏈孢霉屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、Sporothrix、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬等。具有代表性的有例如尖孢鐮孢IFO 5942、半裸鐮孢IFO 30200、Cylindrocarpon tonkinense IFO 30561、稻惡苗赤霉IFO 6349、米曲霉ATCC 91002、米曲霉IFO 5240、泡盛曲霉IFO 4033、產黃青霉IFO 4626、米根霉IFO 4706、Volutella buxi IFO 6003、鏈孢膠霉IFO 6121、Eurotium chevalieri IFO 4334、Nectria elegans IFO 7187、群交裂褶菌IFO 4928、露濕漆斑菌IFO 9531、粗糙鏈孢菌IFO 6067、Acremonium fusidioides IFO 6813、柄銹生座孢IFO 6464、李克氏梨頭霉IFO 4009、Sporothrix schenckii IFO 5983、VerticilliumMalthousei IFO 6624、鉤骨節(jié)皮病IFO 7865等屬的生物。
而且，作為導入含有目的內酯酶基因的載體的宿主只要是能使該基因復制、表達的即可，其中所述載體上具有AP酶基因的啟動子，并且在編碼翻譯起始部位和/或者分泌信號肽區(qū)域的下游連接有目的內酯酶基因。優(yōu)選從酵母、絲狀菌等真核生物中適當加以選擇。具體而言，酵母菌可列舉釀酒酵母菌屬、裂殖酵母菌屬、畢赤氏屬菌等。更具體而言，可列舉Saccharomyes cerevisiae、Schiizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris等。此外，絲狀菌可列舉支頂孢霉屬、曲霉菌屬、鐮孢霉屬、青霉菌屬、毛霉菌屬、脈孢菌屬、Trichoderma屬菌等。更具體可以列舉頂頭孢霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、尖孢鐮孢、半裸鐮孢、產黃青霉、Mucorjavanicus、粗糙鏈孢霉、Trichoderma viridae等。其中特別優(yōu)選頂頭孢霉。更具體可以列舉Saccaromyces cerevisiaw AH22R-、頂頭孢霉ATCC 11550株、ATCC14533株、米曲霉IFO5240、泡盛曲霉IFO4033、尖孢鐮孢IFO 5942、半裸鐮孢IFO30200、Mucor javanicusIFO4570、Trichoderma viride IFO31137等。其中最優(yōu)選頂頭孢霉ATCC 11550。
可以用原生質體細胞轉化法等作為向上述宿主中導入基因的轉化方法。例如在氯化鈣、聚乙二醇等存在的條件下，將經過用適當的細胞壁溶解酶制造的原生質化的細胞與DNA接觸等方法進行轉化。此外，轉化方法可列舉電穿孔法(例如E.Neumann等人，“EMBO J”，Vol.1，pp.841(1982)等)、顯微注射法、基因槍打入法等。
為了有效地分離轉化的細胞，向含有在宿主內具有功能的適當選擇標記基因的質粒上插入該融合基因，將該質粒轉化到宿主中。只要能選擇性地分離轉化的細胞，可以使用任何基因作為該選擇性標記基因。代表性的基因可列舉潮霉素B耐藥基因等。通常必需選用沒有選擇性功能標記基因的細胞株作為宿主。
培養(yǎng)本發(fā)明所得到的轉化細胞的各種條件根據所使用的菌株等細胞的種類而有所不同，通常關于培養(yǎng)基，可以使用含有可以讓該轉化細胞同化吸收的碳源或者氮源等的培養(yǎng)基?？梢允褂萌魏慰杀辉撧D化細胞同化吸收的物質作為碳源，可列舉葡萄糖、蔗糖、淀粉、可溶性淀粉、糊精等糖類；石蠟類等，此外，可列舉醋酸、檸檬酸、丁酸、延胡索酸、苯甲酸等有機酸類；甲醇、乙醇、丁醇、甘油等醇類；油酸、硬脂酸等脂肪酸或者其酯類；大豆油、菜籽油、豬油等油脂類等，可以單獨使用或者混合使用上述物質。只要能被吸收的物質就可以用作氮源?？闪信e硫酸銨、硝酸銨等銨類；硝酸鈉、硝酸鉀等硝酸鹽類；尿素、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米漿、玉米蛋白粉、麩皮、酵母提取物、干酵母、大豆粉、棉子粉、肉粉、其它的有機或者無機的含氮物質，可以單獨或者混合使用上述物質?？梢赃m當地向培養(yǎng)基中加入任何無機鹽類、礦物質、維生素、微量金屬鹽等營養(yǎng)素。作為無機鹽可列舉硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀等磷酸鹽類、錳鹽類等，作為其它營養(yǎng)素，可列舉麥芽提取物等。此外，可以適當選擇使用本領域內通常使用的物質。
在好氧條件下進行深部培養(yǎng)通常有利于培養(yǎng)，好氧性培養(yǎng)時，通常培養(yǎng)1～20天左右，優(yōu)選3～14天左右，更優(yōu)選3～10天左右，培養(yǎng)基的pH3～9，在培養(yǎng)溫度10～50℃下進行培養(yǎng)。
可以按照公知的方法從各種原料如包括細胞培養(yǎng)液、細胞培養(yǎng)破碎物等在內的轉化細胞等的產生酶的材料中得到本發(fā)明的轉化細胞產生的酶。例如當積累到培養(yǎng)基中時，通過離心分離或過濾得到含有目的物質的上清液。另一方面，目的物質積累在菌體等細胞中時，用培養(yǎng)后、離心分離或過濾等公知的方法收集菌體，適當采用將菌體重懸到含有鹽酸胍等的蛋白質變性劑的緩沖液中，冷卻攪拌，通過離心得到含有目的物質的蛋白質上清液，在緩沖液中重懸菌體，用磁珠進行粉碎，經過壓釜、超聲波處理或酶處理等破碎細胞，通過離心分離等得到上清液等的方法。
為了從上述上清液中分離、純化目的蛋白質，可以適當組合本身公知的分離、純化方法，例如使用硫酸銨沉淀法等鹽析、乙醇等的溶媒沉淀法、SephadexTM等凝膠過濾法，例如采用具有二乙基氨基乙基或羧甲基等的堿性基團或酸性基團的載體等的離子交換層析法，例如使用丁基、辛基、苯基等疏水性基團的載體的疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透析、超濾法、親和層析法、高效液相法等進行純化。此外，得到包涵體時，可以進行溶解處理，例如使用鹽酸胍、尿素這樣的變性劑，或根據需要在2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等還原劑存在的情況下進行處理得到活性型的酶。
可以直接用酶產生細胞作為酶使用。用本領域內公知的方法固定酶或酶產生細胞等以此作為固定化酶，可列舉用共價結合法或吸附法這類載體結合法、交聯(lián)法、包埋法等進行固定。此外，也可以將微生物菌體固定到海藻酸凝膠上。例如根據需要使用戊二醛、環(huán)己烷二異氰酸酯、環(huán)己烷二異硫氰酸酯等縮合劑進行固定。此外，用通過單體聚合反應進行凝膠化的單體法、聚合成比通常單體大的分子的預聚物(prepolymer)法、將共聚物凝膠化的共聚法等。例如用聚丙烯酰胺固定；用褐藻酸、膠原、明膠、瓊脂和к-角叉菜聚糖等天然高分子固定等；用光固化樹脂、氨基甲酸乙酯聚合物等合成高分子固定。酶或微生物菌體的固定化技術及其應用可以參照如Ichiro CHIBATA編《固定化酶》，p75，講談社科學(1975年)；Ichiro CHIBATA編《固定化生物催化劑》，p67，講談社科學(1986年)；鈴木智雄監(jiān)修《微生物工程技術手冊》、朝倉書店(1990年5月)；今中忠行編《Maruzen Advanced Technology[生物工程學編]微生物工程學》，p180～194，丸善株式會社(1993年9月30日)；日本生化學會編《新生化學實驗講座13生物工程版》，p50～54，東京化學同人(ISBN4-8079-1079-5)等中記載的方法或其中引用的文獻中記載的方法或與之等價的方法或其改進方法。也可以使用和本發(fā)明目的一致的加以單獨地改變改良的公知方法。可以按照特開平3-65198號和特開平4-144681號中記載的方法培養(yǎng)微生物、進行包括用酶對D-泛解酸內酯水解在內的利用內酯水解酶的酶不對稱水解進行內酯類化合物的光學拆分反應和生成物處理。
例如收集用液體培養(yǎng)基振搖培養(yǎng)的轉化菌，向得到的菌體中加入D，L-泛解酸內酯水溶液(2～60％濃度)，調整到pH6～8，同時在10～40℃下反應數小時以至1天。反應結束后，分離菌體，用有機溶劑(優(yōu)選如乙酸乙酯的酯類、如苯的芳香族烴類、如氯仿的鹵代烴類等)提取分離未反應的L-泛解酸內酯。在鹽酸酸性環(huán)境下，通過加熱等，將水層中殘留的D-泛解酸內酯進行內酯化，用上述有機溶劑抽提得到生成的D-泛解酸內酯。
并且，在本發(fā)明中提供了下述方法，用通式(I)的化合物或其鹽與導入有編碼來自鐮孢屬絲狀菌的內酯酶和信號肽區(qū)域的DNA或導入插入了上述DNA的載體的內酯酶轉化子的培養(yǎng)物、其細胞、或細胞處理物和由該轉化子得到的重組的內酯酶等接觸，從反應體系中分離通式(II)所示的S構型的未水解物或其鹽，然后將通式(III)所示的水解物或其鹽進行內酯化，轉換成通式(IV)或其鹽，有效地制造了具有光學活性的γ-內酯衍生物或其鹽。
在本發(fā)明中，優(yōu)選使用對通式(I)的化合物R構型選擇性地不對稱水解的如上所述得到的轉化子、特別是轉化微生物，此外，經過通式(II)的化合物或通式(III)的化合物工業(yè)化地制造通式(IV)化合物，例如可以用下面的反應式表示 (*表示光學活性碳原子，R表示羥基、氨基，R1和R2相同或不同，各自獨立表示氫或低級烷基)。
R1和R2作為低級烷基，可列舉碳原子數1～5個的直鏈狀或分支狀的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基等。代表性的分子是R為羥基、R1和R2同為甲基，這種情況下，可以用通式(I)的外消旋泛解酸內酯或其鹽制造光學活性的泛解酸內酯或其鹽，例如制造通式(IV)的D-泛解酸內酯或其鹽，或通式(II)的L-泛解酸內酯或其鹽。
在本制造方法中使用的轉化子，特別是轉化微生物可以采用在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株得到的培養(yǎng)物、從培養(yǎng)液中分離的菌體、或處理菌體或培養(yǎng)物得到的干燥菌體或固定化菌體等中的任何一種。此外，還可以采用從該轉化子分離的酶或其粗制品、純化品或固定化物等任何一種。
可以采用全批次、半批次或連續(xù)式中的任何一種操作。所用的γ-內酯的濃度通常為10～500g/L。反應溫度通常為10～50℃，更優(yōu)選20～30℃。反應時間在全批次生產時，通常為數小時至1天。反應體系的pH通常為3～9左右，更優(yōu)選6～8。
用轉化微生物對通式(I)的選擇性不對稱水解，其結果生成通式(III)的化合物，隨著反應液pH的降低，反應速度也降低。為了提高反應速度，優(yōu)選將反應液的pH保持在各種微生物的內酯水解酶的最適pH。此時，除了可以用堿金屬或堿土金屬的氫氧化物或碳酸鹽外，還可以用氨水等作為維持pH的無機鹽。
反應結束后，通過有機溶劑抽提等操作分離反應液中未水解的通式(II)的化合物?？梢允褂名u代烴類如氯乙烯、氯仿、三氯乙烷；芳香族烴類，如苯、甲苯；醚類，如二乙基醚、叔丁基甲基醚；和醋酸乙酯等，更優(yōu)選醋酸乙酯作為有機溶劑。
抽提之外的分離方法，還可以列舉柱層析等，可以使用反相柱，用水、甲醇或乙醇等醇類或它們的混合物作為洗脫溶液，以此分離通式(II)和通式(III)的化合物。
可以將反應液中殘存的通式(III)的化合物直接通過酸化轉變成通式(IV)的化合物?？梢杂名}酸、硫酸等作為使用的酸，更優(yōu)選硫酸。用pH或反應溫度、反應時間只要能使通式(III)的化合物開環(huán)，轉化成通式(IV)的化合物的條件即可，更優(yōu)選pH1以上的強酸性、反應溫度80～130℃、反應時間1～6小時。
可以用有機溶劑提取回收所生成的通式(IV)的化合物。這里所用的有機溶劑和前面提取通式(II)的化合物所用的溶劑一樣，除了使用如氯乙烯、氯仿和三氯乙烷的鹵代烴類、如苯、甲苯的芳香族烴類、如二乙基醚、叔丁基甲基醚的醚類以外，還可以使用醋酸乙酯等，更優(yōu)選醋酸乙酯。此外，可以用柱層析進行回收。
另一方面，用堿金屬的氫氧化物或碳酸鹽等處理反應液中殘存的通式(III)的化合物后，減壓蒸餾反應液，用溶劑重結晶干燥固形物，分離碳酸的堿金屬鹽。所用的堿金屬的氫氧化物或碳酸鹽為氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀等，優(yōu)選氫氧化鈉。此外，可以用甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿等作為重結晶溶劑，優(yōu)選甲醇。
特別是，本發(fā)明能夠高收率地得到高光學純度的D-泛解酸內酯?？梢园凑障率龇椒ㄟM行制造在醇類溶劑中，D-泛解酸內酯和β-丙氨酸的鈣鹽或其酯縮合，得到D-泛酸鈣，例如在醇等的有機溶劑中，將D-泛解酸內酯和β-丙氨酸或其酯縮合，得到D-泛酸后，使之與碳酸鈣等鈣化合物反應的方法(E.Stiller等人，J.Am.Chem.Soc.，62，1785(1940))。仲胺或叔胺存在的條件下，煮沸D-泛解酸內酯和β-丙氨酸，向該反應液中加入氧化鈣，制造D-泛酸鈣的方法(E.H.Wilson等人，J.Am.Chem.Soc.76，5177(1954))等。此外，在醇類溶劑中，和3-氨丙醇縮合，得到D-泛醇(USP No.2413077；Brit.Patent No.568355)。此外，在醇等有機溶劑中，使D-泛解酸內酯和γ-氨丙腈反應，得到D-泛酰腈(D-pantothenonitrile)，然后和半胱氨酸反應，得到2-(2-D-泛酸酰氨乙基)-2-噻唑啉、即2-(2-D-pantoamidoethyl)-2-thiazoline后，水解，得到D-泛酰巰基乙胺，在過氧化氫存在的條件下，使之縮合，制造雙泛酰巰基乙胺(M.Shimizu等人，Chem.Pharm.Bull.，13，180(1965))。使用本發(fā)明中得到的D-泛解酸內酯，可以有效地得到D-泛酸和其鹽，或D-泛醇。
本發(fā)明提供了簡便、有效地制造醫(yī)藥品中間體或氨基酸衍生物的有用的光學活性的γ-內酯衍生物的方法。
在說明書和附圖中的用語是以IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature或本領域中慣用的用語的含意為基準的。代表性的用語的含意如下所示A丙氨酸(Ala)M甲硫氨酸(Met)C半胱氨酸(Cys) N天冬酰氨(Asn)D天冬氨酸(Asp) P脯氨酸(Pro)E谷氨酸(Glu)Q谷胺酰胺(Gln)F苯丙氨酸(Phe) R精氨酸(Arg)
G甘氨酸(Gly) S絲氨酸(Ser)H組氨酸(His) T蘇氨酸(Thr)I異亮氨酸(Ile)V纈氨酸(Val)K賴氨酸(Lys) W色氨酸(Trp)L亮氨酸(Leu) Y酪氨酸(Tyr)關于核苷酸序列A腺嘌呤 G鳥嘌呤C胞嘧啶 T胸腺嘧啶(1)后述實施例1中記載的pNAN-XG轉化的米曲霉A.oryzae/pNAN-XG是2003年2月4日寄存到茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566 Japan，舊地址為茨城縣筑波市東1丁目1番3號)(郵政編碼305-8566)的獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物寄存中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，International PatentOrganism DepositaryIPOD)(舊名稱經濟產業(yè)省產業(yè)技術綜合研究所生命工程工業(yè)技術研究所(NIBH))保管(委托號為FERM P-19199)。根據布達佩斯條約，依據在2004年2月2日提出的原保藏的保藏轉移申請，其委托號FERM BP-08608，保存在IPOD。此外，在后述實施例2中記載的pAlpS轉化的頂頭孢霉Ac.chrysogenum/pAlpS在2003年2月4日保存在IPOD(委托號FERM P-19200)、2004年2月2日根據布達佩斯條約提出原保藏的保藏轉移申請，其委托號為FERMBP-08609，保存在IPOD。
(2)此外，后述的實施例1中使用的帶有導入的內酯酶基因的載體(pFLC40E)的大腸桿菌JM109(EJM-ESE-1)在1995年8月30日(原始保藏日)保藏在IPOD(委托號FERM P-15141)，根據布達佩斯條約，在1996年8月28日提出保藏轉移申請，保藏號為FERM BP-5638，保存在IPOD。
下面，通過實施例具體說明本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，為了參考而提供了具體的實施方案。這些例子是為了說明本發(fā)明的特定的具體實施方案，不限定本申請所公開的發(fā)明范圍或不具有限定性。在本發(fā)明中，根據本說明書的思想能夠理解為多種可行的實施方案。
在整個實施例中，除了特別詳細記載的之外，實施的或能用標準的技術實施的均采用本領域的技術人員公知的慣用的方式方法。作為在下面的實施例中通常慣用的分子生物學技術，可以按照標準的實驗操作例如J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis(ed.)“MolecularClonigA Laboratory Manual(2nd edition)”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Glover等，(ed)，“DNA Cloning”，2nd ed.，Vol.1-4(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；H.A.Erlich(ed.)PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover等人，(ed)，“DNA Cloning”，2nd ed.，Vol.1，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford Universtiy Press(1995)；M.A.Innis等人，(ed.)，“PCR Protocolsa guide to methodsand applications”，Academic Press，New Youk(1990)；M.J.McPherson，P.Quirke and G.R.Taylor(ed.)，PCRa practicalapproach，IRL Press，Oxford(1991)等中記載的方法進行，或在用市售試劑或試劑盒時，使用其中添加的說明書或添加的藥品等。
實施例1〔源自鐮孢尖孢的內酯酶在米曲霉中的表達〕(1)質粒的構建用限制性酶EcoRI、XbaI處理重組有鐮孢尖孢的成熟內酯酶的cDNA(不含N末端的信號肽和內含子)的pFLC40E質粒，分離含有內酯酶片段的cDNA。將其blunting處理后，插入到表達用質粒pNAN8142(特開平09-9968號公報，Biosci.Biotechnol.Biochem.，60383-389，1996)的p-No8142啟動子下游的PmaCI位點，得到pNAN-PC。
導入內酯酶基因的cDNA和信號肽序列的pNAN-XC是按照下面的方法構建的。
用AGPC法(使用酸-硫氰酸胍-苯酚的方法)從尖孢鐮孢中提取總RNA(試劑盒名ISOGEN，Nippon Gene)，以總RNA為模板，用(AccessRT-PCR Syestem，Promega公司制造)根據RT-PCR(用PCR從RNA擴增DNA的方法)法，擴增1.3kb的DNA片段。用FusLac1(下劃線部分含有XhoI酶切序列)和FusLac2(下劃線部分含有XbaI酶切序列)著2個寡核苷酸作為引物。
FusLac15’-AACTCGAGATGCCTTCTTCCATTTCTGTA-3’(序列號1)FusLac25’-AATCTAGACTAATCATAGAGCTTGGGAC-3’(序列號2)PCR擴增條件以上述試劑盒的說明為基準。用低融點瓊脂糖凝膠純化PCR產物，用XhoI和XbaI切割后，插入到pNAN8142的進行同樣切割的部位。
用FusLac1和FusLac2作為引物，從尖孢鐮孢的總DNA中經過PCR擴增基因組全長內酯酶基因。擴增的DNA片段用限制性酶XhoI和XbaI切割后，插入到質粒pANA8142的經過同樣切割的位點，得到pANA-XG。
(2)內酯酶基因在米曲霉中的表達將上述質粒分別轉化到用Unkles SE等(Mol.Gen.Genet.218.99-104，1989)的方法從米曲霉(ATCC91002)制造得到的米曲霉niaD突變體(AON-2)中，測定內酯酶的活性。內酯酶活性測定方法如下所述將50mg濕菌體在2mL含有0.5M Tris鹽酸緩沖液(pH7.4)和0.61mM(80mg)的D-泛解酸內酯的反應液中于30℃下，300轉/分鐘振搖15分鐘。通過離心去除菌體，用HPLC分析上清中的泛解酸內酯和泛酸。1U酶表示在1分鐘催化1μmol的D-泛解酸內酯水解的酶量。
pANA-XG轉化子表現出最高的內酯酶活性(大約是尖孢鐮孢的7.4倍)，pNAN-XC也表現出同等活性，pNAN-PC轉化子的活性為pNAN-XG的四分之一(表1)。
表1

(3)重組酶的比較將pNAN-XG和pNAN-XC的轉化子的粗提取液提供給SDS-PAGE時，在與尖孢鐮孢生成的內酯酶的分子量相當的60kDa的位置上發(fā)現表達的蛋白質(圖1A)。另一方面，在pNAN-PC時，在51kDa發(fā)現表達的蛋白質。用內酯酶抗血清進行Western印記時，在pNAN-XG的60kDa、pNAN-PC的51kDa檢測到陽性條帶(圖1B)。同樣在pNAN-XC的60kDa處檢測到陽性條帶。
分析來自pNAN-XG和pNAN-PC的各重組酶的N末端，二者都表現出和天然型相同的的氨基酸序列(Ala-Lys-Leu-Pro-Ser)，確定均經過了正確的加工過程。所以，認為重組酶間的分子量差異是由是否添加糖鏈造成的。
只有未添加信號肽區(qū)域的pNAN-PC的轉化子產生脫糖鏈型的酶，認為因為信號肽是在翻譯后將多肽輸送到糖鏈添加位置，即，內質網所必須的。
(4)外消旋內酯的不對稱水解將鐮孢尖孢和米曲霉轉化子(pNAN-PC和pNAN-XG)和35％的DL-泛解酸內酯溶液的pH控制為6.8～7.5，進行反應。
pNAN-PC轉化子的反應初速度高，但酶的穩(wěn)定性差，2小時后幾乎不再進行反應。24小時后，DL-泛解酸內酯的水解率為8.52％，和鐮孢尖孢的14.6％相比，較低(圖2A)。pNAN-XG轉化子的酶比pNAN-PC轉化子的酶穩(wěn)定性好，水解率為19.8％。
為了使水解率達到50％，提高酶的穩(wěn)定性，將5g濕菌體懸浮在115mL的1％藻酸鈉鹽中，滴入2％的氯化鈣，固定轉化子。用固定化菌體進行反應時，pNAN-XG和pNAN-PC的轉化子的酶的穩(wěn)定性更好，并且對DL-泛解酸內酯的水解率顯著提高。pNAN-XG和pNAN-PC反應24小時后的水解率分別達到49.1％和21％(圖2B)。光學純度達到95％e.e.以上。
實施例2〔用頂頭孢霉分泌生產鐮孢尖孢的內酯酶〕(1)用Combined PCR構建鐮孢屬堿性蛋白酶(Alp)啟動子、其信號肽序列、內酯酶基因的融合基因(圖3)。
使用下述引物，以質粒pNLH2(特開平5-268972號公報)為模板用PCR擴增Alp啟動子及其與之相連的Alp信號肽、前導肽(propeptide)。
有義鏈引物AlpPS(下劃線部分表示合成的SalI切斷序列)反義鏈引物AlpPA(下劃線部分表示能和LacS引物的一部分退火反應的部分)。
AlpPS5’-TTGTCGACGGATCCGAAAGATGAGACCGCT-3’(序列號3)AlpPA5’-GAAGCTTAGCCATGTTGATGCTGATGATGGCATCC-3’(序列號4)LacS5’-CATCAGCATCAACATGGCTAAGCTAAGCTTCCTTCTACGGCTC-3’(序列號5)用正義鏈引物LacS(下劃線部分為能和AlpPA引物的一部分退火的部分)和反義鏈引物FusLac2(序列號2)以pNAN-XG為模板，擴增無N末端信號肽的內酯酶基因。將各自的PCR產物混合，用AlpPS和FusLac2為引物進行二次PCR。用SalI、XbaI切割得到PCR片段(2.3kb)，導入到pBluescript中，構建得到pAlpS。
另外的一個表達質粒pLacS是將內酯酶本身的信號肽置于Alp啟動子的控制下的質粒，還是采用Combined PCR構建的。用AlpPS和AlpPA2(下劃線部分為能和LacS2引物的一部分退火的部分)通過PCR擴增Alp啟動子，用引物LacS2(下劃線部分能和AlpPA2引物的一部分退火)和引物FusLac2通過PCR擴增含有內酯酶自身信號肽的全長基因。
AlpPA25’-TGGAAGAAGGCATCTTGTCAGGGAGTATGAAGGTTG-3’(序列號6)LacS25’-TACTCCCTGACAAGATGCCTTCTTCCTTTCTGTA-3’(序列號7)混合兩種PCR產物，用引物AlpPS和引物FusLac2進行二次PCR，用SalI、XbaI切割擴增產物，亞克隆到pBluescript中。用HindIII切割Morita，S等人開發(fā)的pNLH2(J.Biotechenol.42，1-8，1995)釋放出含有頂頭孢霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GDPH)啟動子和潮霉素B脫磷酸酶的3.0kb的片段，將該HindIII切割片段導入到pBluescript中，得到pHmR。
(2)內酯酶基因在頂頭孢霉中的表達將上述質粒分別轉化到頂頭孢霉(ATCC 11550)中，為了檢測內酯酶基因是否插入到轉化子的染色體DNA中，以轉化子基因組DNA為模板，內酯酶基因3’和5’末端的寡核苷酸為引物，進行PCR分析。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳時，在檢驗的80個轉化子中檢測出大約89％具有和內酯酶基因相當的1.2kb的條帶。
將各種轉化子在每升中含有30g蔗糖、5g DL-甲硫氨酸、32g大豆粉、1.5g碳酸鈣(pH6.8)的培養(yǎng)基中于28℃下，培養(yǎng)3天，然后再在500mL的培養(yǎng)基中，于28℃，120轉/分鐘下培養(yǎng)5天。測定該培養(yǎng)上清的內酯酶活性。
用0.5mL含有0.5M Tirs鹽酸緩沖液(pH7.4)、0.61mM(80mg)D-泛解酸內酯和適量酶的反應液在30℃下反應15分鐘后，用HPLC分析反應液中的泛解酸內酯和泛酸，以此測定內酯酶的活性。結果發(fā)現在pAlpS和pLacS的轉化子的培養(yǎng)上清中具有大量的內酯酶(表2)。
表2

(3)分泌的酶的性質將pAlpS和pLacS的轉化子的培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE時，在60kDa的位置上檢測到主要條帶(圖4)。該分子量和天然酶相當。將該條帶轉移到PVDF膜上，分析N末端的氨基酸序列，結果顯示二者都具有和天然氨基酸相同的序列(Ala-Lys-Leu-Pro-Ser-Thr-Ala-)。
為了分析酶上是否添加了糖鏈，用只酶切糖蛋白質上N-糖苷鍵的高甘露糖類型和幾種混合的低聚糖的內切糖苷酶與從鐮孢尖孢和pAlpS轉化子中分別純化的酶反應1、5、15、60分鐘，進行SDS-PAGE。檢測到60、56、51kDa三種不同分子量的條帶(圖5)，因此表明至少含有2個N-糖苷鍵。
(2)固定化酶的制造將500mL pAlpS轉化子的培養(yǎng)液在20mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.4)中透析，用Amicon YM-10膜濃縮到100mL，得到酶溶液。一方面，用0.1M NaOH洗滌Deolite A-568載體，用純化水洗滌至pH為8.2。向100mL酶溶液中加入干重為15g的洗滌后的Deolite A-568。在4℃攪拌24小時。在酶吸附后，用純化水洗滌，用100mL含有2％的戊二醛的20mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.4)在4℃下交聯(lián)24小時。
大約有13.6％蛋白質殘留在培養(yǎng)液中，沒有被固定。測定固定化的酶的D-泛解酸內酯酶活性為60.4U/g濕樹脂。活性收率為14.8％(表3)。
表3

(5)固定化酶對外消旋泛解酸內酯的不對稱水解將固定了酶的濕重量為15g的樹脂和75mL的35％(w/v)DL-泛解酸內酯在30℃下，保持pH為6.8～7.5，平穩(wěn)地攪拌使之反應。結果有效地促進了不對稱水解的進行，沒有檢測到副產物L-泛酸(圖6)。反應9小時后，水解率為40％，即，D構型的水解率達到80％，到24小時后達到45％。
產業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供了下述生產技術，即，利用天然的內酯酶基因，可以制造有效地并且生產性優(yōu)異生產該酶的系統(tǒng)，此外，用該酶和生產該酶的系統(tǒng)，可以構建有效地并且生產性更優(yōu)異地光學活性γ-內酯生產系統(tǒng)。而且，可以構建可制造在醫(yī)學上或生理學上重要的維生素，如D-泛酸、D-泛醇，泛酰巰基乙胺等優(yōu)異的系統(tǒng)，除了應用于醫(yī)藥品之外，還應用于食品添加劑、飼料添加劑、化妝品的生產。
本發(fā)明，除了在上述說明書和實施例中特別說明的之外，還包括其他可以實行的方案。鑒于上述解釋，本發(fā)明的多種改變和變形形式也包括在本發(fā)明的權利要求的保護范圍內。
(序列表內容)SEQ ID NO1，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；SEQ ID NO2，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；SEQ ID NO3，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；SEQ ID NO4，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；SEQ ID NO5，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；
SEQ ID NO6，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；SEQ ID NO7，人工序列描述作為PCR引物的寡核苷酸；
序列表<110>DAIICHI FINE CHEMICAL公司<120>內酯酶的制造方法及其應用<130>FC-101PCT<150>JP 2003-55233<151>2003-03-03<150>JP 2003-371750<151>2003-10-31<160>9<170>Microsoft Windows XP Notepad<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>1aactcgagat gccttcttcc atttctgta29<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>2aatctagact aatcatagag cttgggac 28<210>3<211>30
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>3ttgtcgacgg atccgaaaga tgagaccgct 30<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>4gaagcttagc catgttgatg ctgatgatgg catcc 35<210>5<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>5catcagcatc aacatggcta agctaagctt ccttctacgg ctc43<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>6tggaagaagg catcttgtca gggagtatga aggttg36
<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列表述用于作為PCR引物的寡核苷酸<400>7tactccctga caagatgcct tcttcctttc tgta 34<210>8<211>1453<212>DNA<213>尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)<220>
<221>生物來源<222>1..1453<223>/生物＝″尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)″<220>
<221>mRNA<222>join(1..153，203..545，597..704，757..966，1015..1191，1242..1453)<223>
<220>
<221>CDS<222>join(1..153，203..545，597..704，757..966，1015..1191，1242..1453)<223>
<220>
<221>信號肽編碼序列<222>(1)..(60)<223>
<220>
<221>成熟肽或蛋白質編碼序列<222>join(61..153，203..545，597..704，757..966，1015..1191，1242..1450)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(1)..(153)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(203)..(545)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(597)..(704)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(757)..(966)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(1015)..(1191)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(1242)..(1453)<223>
<220>
<221>內含子<222>(154)..(202)<223>
<220>
<221>內含子<222>(546)..(596)<223>
<220>
<221>內含子<222>(705)..(756)<223>
<220>
<221>內含子<222>(967)..(1014)<223>
<220>
<221>內含子<222>(1192)..(1241)<223>
<400>8atg cct tct tcc att tct gta ctt gcg ggg gtt ctc gtg cct gtt ttg 48Met Pro Ser Ser Ile Ser Val Leu Ala Gly Val Leu Val Pro Val Leu-20 -15 -10 -5ggc gcg gtg gct gct aag ctt cct tct acg gct cag att att gat cag 96Gly Ala Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln-1 1 5 10aag tcg ttc aat gtc ttg aag gat gtg cca cct cct gca gtg gcc aat144Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn15 20 25gac tct ctg gtatgtcact gcagcctcgt tgctgattgt tactaataat tatgagtag 202Asp Ser Leu30gtg ttc act tgg cct ggt gta act gag gag tct ctt gtt gag aag cct250Val Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val Glu Lys Pro35 40 45ttc cat gtc tac gat gaa gag ttt tac gat gta att gga aaa gac ccc298Phe His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly Lys Asp Pro50 55 60tct ttg acc ctc atc gca aca tcg gac acc gac cca atc ttc cat gag346Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile Phe His Glu65 70 75gct gtc gta tgg tat cct cct act gaa gag gtg ttc ttt gtg cag aat394Ala Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe Val Gln Asn80 85 90 95
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<210>9<211>400<212>PRT<213>尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)<400>9Met Pro Ser Ser Ile Ser Val Leu Ala Gly Val Leu Val Pro Val Leu-20 -15 -10 -5Gly Ala Val Ala Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln-1 1 5 10Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn15 20 25Asp Ser Leu Val Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val30 35 40Glu Lys Pro Phe His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly45 50 55 60Lys Asp Pro Ser Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile65 70 75Phe His Glu Ala Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe80 85 90Val Gln Asn Ala Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser95 100 105Ser Ile Ile Gln Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys110 115 120
Gly Lys Gln Asp Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln125 130 135 140Val Ile Asn Pro Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe145 150 155Ala Gly Glu Gly Gln Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met160 165 170Asn Pro Leu Pro Pro Tyr Asn Thr Thr Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Phe175 180 185Gly Arg Gln Phe Asn Ser Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn190 195 200Gly Asp Leu Tyr Phe Thr Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe205 210 215 220Arg Pro Val Pro Gly Leu Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp225 230 235Thr Gly Ala Val Thr Val Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn Gly240 245 250Ile Gly Phe Gly Pro Asp Gly Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly255 260 265Ile Ala Leu Gly Phe Tyr Gly Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val270 275 280Tyr Ser Phe Asp Val Asn Gln Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr285 290 295 300
Phe Ala Tyr Val Ala Ser Phe Ile Pro Asp Gly Val His Thr Asp Ser305 310 315Lys Gly Arg Val Tyr Ala Gly Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn320 325 330Pro Ser Gly Lys Leu Ile Gly Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala335 340 345Asn Phe Gln Phe Ala Gly Lys Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr350 355 360Lys Leu Phe Tyr Val Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp365 370 375 380
權利要求
1.產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入了編碼具有D-泛解酸內酯水解酶活性的內酯酶和信號肽區(qū)域的DNA。
2.權利要求1中記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，內酯酶來自屬于鐮孢屬的微生物。
3.產生內酯酶的轉化子，其特征是，其中導入的DNA是編碼具有序列表編號9中的第1～第380個氨基酸的氨基酸序列的內酯酶的DNA和信號肽區(qū)域的DNA。
4.權利要求3記載的產生內酯酶的轉化子，其特征是，信號肽區(qū)域是序列表編號9中的第-20～第-1個氨基酸所組成的氨基酸序列，或Alp信號肽區(qū)域。
5.具有D-泛解酸內酯水解活性的重組內酯酶的制造方法，其特征是，培養(yǎng)權利要求1～4中任一項記載的產生內酯酶的轉化子，使之產生并得到重組內酯酶。
6.通式(II)或通式(IV)所示的光學活性的γ-內酯衍生物或其鹽的制造方法，其特征是，使用通式(I)所示的化合物或其鹽與選自權利要求1～4中任一項記載的內酯酶轉化子的培養(yǎng)物、細胞、細胞處理物或固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化重組內酯酶相接觸，以產生光學活性的γ-內酯衍生物(II)或(IV)，或其鹽，其中通式(I) (R表示羥基或氨基，R1和R2相同或不同，各自獨立表示氫或低級烷基)通式(II) (R、R1和R2分別和上述相同)式(IV) (R、R1和R2分別和上述相同)。
7.D-泛解酸內酯衍生物或其鹽的制造方法，其特征是，用上述通式(I)所示化合物或其鹽接觸選自權利要求1～4中任一項記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、細胞、細胞處理物或固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化重組內酯酶，制造上述通式(IV)所示的光學活性化合物或其鹽，然后采用公知的方法或與之等價的方法或其改變的方法，使用通式(IV)所示的光學活性化合物或其鹽制造選自包括泛酸、泛酸鈣、泛醇、泛酰巰基乙胺、泛酰乙基醚、雙泛酰硫乙胺等的D-泛解酸內酯衍生物或其鹽。
8.DNA的應用，其特征是，該DNA選自下述DNA，在制造通式(IV)所示的化合物、包括泛酸、泛酸鈣、泛醇、泛酰巰基乙胺、雙泛酰硫乙胺等的D-泛解酸內酯衍生物或其鹽時，從權利要求1～4中任一項記載的產生內酯酶的轉化子的培養(yǎng)物、細胞、細胞處理物和固定化菌體、由該轉化子得到的重組內酯酶和固定化的重組內酯酶中的DNA、或(1)以含有編碼內酯酶信號肽區(qū)域序列為特征的DNA；(2)(a)編碼全長內酯酶的DNA序列和(b)以含有編碼該內酯酶和該內酯酶的NH2末端信號肽區(qū)域DNA為特征的DNA；和(3)以含有(a)編碼全長內酯酶的cDNA序列(i)、或染色體基因DNA序列(ii)和(b)編碼該內酯酶的NH2末端信號肽區(qū)域的DNA序列的DNA。
全文摘要
作為醫(yī)藥品等有用物質的合成中間體，需要大量并且低價地生產光學活性的泛解酸內酯等γ－內酯衍生物。為了這個目的，利用可進行不對稱水解的酶－內酯酶的技術很有優(yōu)勢，不過該酶的制造或該酶產生微生物的利用還存在尚未解決的問題。當使用重組技術時也很難以取得到充分并且穩(wěn)定的酶活性。用重組技術將成熟內酯酶DNA和信號肽區(qū)域DNA均導入到宿主中生產能夠選擇性地不對稱水解外消旋泛解酸內酯等的γ－內酯衍生物的內酯酶，能夠得到天然內酯酶所欠缺的穩(wěn)定的活性，還能夠得到保持高的酶活性并且穩(wěn)定地保持該活性的轉化子，可以有效并且具有工業(yè)化優(yōu)勢地不對稱合成γ－內酯衍生物。
文檔編號C12P17/04GK1761742SQ20048000757
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月3日 優(yōu)先權日2003年3月3日
發(fā)明者清水昌, 片岡道彥, 坂本惠司 申請人:第一精密化學株式會社