專利名稱：引起嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(sars)的新型人病毒及其應(yīng)用的制作方法
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本申請(qǐng)包含一份長(zhǎng)序列表，該序列表通過(guò)一式三份的CD-R代替印刷的紙質(zhì)文本一并提交，其通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。所述CD-R于2004年3月16日刻錄，分別標(biāo)記為“CRF”、“Copy 1”和“Copy2”，每個(gè)只含有一個(gè)相同的1.58MB文件(V9661069.APP)。
1.前言本發(fā)明涉及引起人類嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的分離的新型病毒(“hSARS病毒”)。經(jīng)鑒定，hSARS病毒在形態(tài)學(xué)上和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上與已知的冠狀病毒科(Coronaviridae)成員相類似。本發(fā)明涉及包含hSARS病毒全基因組序列的核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含hSARS病毒一部分基因組序列的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及hSARS病毒全基因組序列的推斷氨基酸序列。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及由這些序列編碼和/或衍生的核酸和肽及它們?cè)谠\斷方法和治療方法(例如用作免疫原)中的應(yīng)用。本發(fā)明更進(jìn)一步包括所述核苷酸序列編碼的嵌合病毒或重組病毒以及抗所述核苷酸序列編碼的多肽的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含hSARS病毒的疫苗制品，包括所述病毒的重組形式和嵌合形式以及所述病毒的蛋白提取物和亞單位。
2.發(fā)明背景最近，中國(guó)大陸的廣東省爆發(fā)了非典型肺炎。在2002年11月到2003年3月之間，報(bào)道了792例病例，其中31例死亡(WHO.SevereAcute Respiratory Syndrome(SARS)Weekly Epidenziol Rec.2003；7886)。為應(yīng)對(duì)此次危機(jī)，香港醫(yī)院管理局加強(qiáng)了對(duì)嚴(yán)重非典型肺炎患者的監(jiān)視。在此次調(diào)查過(guò)程中，確認(rèn)了多個(gè)衛(wèi)生保健工作者患有此病。另外，與此病感染者密切接觸的人中出現(xiàn)多個(gè)肺炎病例。盡管采用了針對(duì)已知通常與非典型肺炎有關(guān)的細(xì)菌病原體的典型抗生素治療方法，此病的嚴(yán)重程度和發(fā)展仍非同尋常。本發(fā)明的發(fā)明者是參與調(diào)查這些患者的小組之一。在這些患者中，對(duì)常見(jiàn)病毒和細(xì)菌的所有鑒定試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。此病按嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe AcuteRespiratory Syndrome)的首字母縮略詞命名(SARS)。在本發(fā)明發(fā)明者從SARS患者分離出本文所公開(kāi)的hSARS病毒之后，才了解了此病的病源因子。也就是說(shuō)，本發(fā)明公開(kāi)了從SARS患者分離和鑒定出來(lái)的新型人病毒。本發(fā)明可用于臨床和科學(xué)研究用途。
3.發(fā)明概述本發(fā)明基于本發(fā)明發(fā)明人對(duì)引起人類嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的新型病毒(“hSARS病毒”)的分離和鑒定。所述病毒是從在最近中國(guó)的嚴(yán)重非典型肺炎爆發(fā)中患上SARS的患者中分離出來(lái)的。該分離病毒是正極性有包膜單鏈RNA病毒，屬巢病毒(Nidovirales)目冠狀病毒科(Coronaviridae)。因此，本發(fā)明涉及在形態(tài)學(xué)上和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上與已知的冠狀病毒科成員相關(guān)的分離hSARS病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分離hSARS病毒是下文第7節(jié)所述的于2003年4月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物中心(CCTCC)、給予保藏號(hào)CCTCC-V200303的病毒。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hSARS病毒的全基因組序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒包含SEQ ID NO15核苷酸序列。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從病毒分離的核酸。所述病毒優(yōu)選在其基因組中包含SEQ ID NO1、11和/或13核苷酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下分離核酸分子，所述分離核酸分子包含或由SEQ ID NO1的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成，優(yōu)選SEQ ID NO1核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下分離核酸分子，所述分離核酸分子包含或由SEQ ID NO11的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成，優(yōu)選SEQ ID NO11核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下分離核酸分子，所述分離核酸分子包含或由SEQ ID NO13的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成，優(yōu)選SEQ ID NO13核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如下分離核酸分子，所述分離核酸分子包含或由SEQ ID NO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成，優(yōu)選SEQ ID NO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。此外，在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能在本文定義的嚴(yán)格條件下與具有SEQID NO1、11、13、15、16、240、737、1108、1590或1965序列或其互補(bǔ)物的核酸分子雜交的分離核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本發(fā)明核酸的編碼鏈反義的分離核酸分子。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列為SEQ IDNO1核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列為SEQ ID NO11核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列為SEQ ID NO13核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列為SEQ ID NO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供從hSARS病毒分離的蛋白質(zhì)或多肽，包括從感染病毒的細(xì)胞中分離出來(lái)、但不存在于可比較的未感染細(xì)胞中的病毒蛋白質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步提供SEQ ID NO2、12和14的蛋白質(zhì)或多肽以及圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)和圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964、1966-2470)所示的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)優(yōu)選具有SEQ ID NO1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965序列編碼的蛋白質(zhì)的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)具有如下核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)，所述核苷酸序列為SEQ ID NO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)具有圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)和圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964、1966-2470)的蛋白質(zhì)的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)。
在一方面，本發(fā)明提供在宿主細(xì)胞中增殖hSARS病毒的方法，所述方法包括用分離hSARS病毒感染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞以使病毒繁殖以及收獲所得的病毒顆粒。本發(fā)明還提供被hSARS病毒感染的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及分離hSARS病毒在診斷方法和治療方法中的應(yīng)用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物樣品中使用分離hSARS病毒或其任何蛋白質(zhì)或多肽檢測(cè)對(duì)hSARS病毒具有免疫特異性的抗體的方法。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選免疫特異性結(jié)合或中和hSARS的抗體的方法。這種抗體可用于對(duì)感染了hSARS的患者進(jìn)行被動(dòng)免疫或免疫療法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離病毒的序列信息在診斷方法和治療方法中的應(yīng)用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適合用作引物的核酸分子，該引物包含或由SEQ ID NO1、11、13或15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或至少其核苷酸序列的一部分組成。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適合與hSARS核酸進(jìn)行雜交的核酸分子，所述核酸分子包括但不限于PCR引物、逆轉(zhuǎn)錄酶引物、用于Southern分析或其它核酸雜交分析以檢測(cè)hSARS核酸的探針，例如包含或由SEQ ID NO1、11、13或15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成。本發(fā)明進(jìn)一步包括由所述核苷酸序列全部或部分編碼的嵌合病毒或重組病毒。
本發(fā)明進(jìn)一步提供抗體，所述抗體能特異性地結(jié)合由SEQ IDNO1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽、或由包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1、11或13核苷酸序列雜交的核苷酸序列的核酸編碼的本發(fā)明多肽、和/或具有本發(fā)明多肽一種或多種生物活性的任何hSARS表位。本發(fā)明進(jìn)一步提供能特異性結(jié)合由SEQ ID NO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽的抗體。這些多肽包括圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)及圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供抗體，所述抗體能特異性地結(jié)合由包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO15核苷酸序列雜交的核苷酸序列的核酸編碼的本發(fā)明多肽，和/或具有本發(fā)明多肽一種或多種生物活性的任何hSARS表位。這種抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫鍵連接的Fvs、胞內(nèi)抗體和含有能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的VL或VH結(jié)構(gòu)域或甚至互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物材料如細(xì)胞、血液、唾液、尿等中檢測(cè)本發(fā)明hSARS病毒的存在、活性或表達(dá)的方法。樣品中hSARS病毒其活性或表達(dá)相對(duì)于對(duì)照樣品的提高或降低如下確定，即將生物材料與能直接或間接檢測(cè)hSARS病毒的存在、活性或表達(dá)的試劑相接觸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是本發(fā)明抗體或核酸分子。本發(fā)明抗體也可用來(lái)治療SARS。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含hSARS病毒(包括所述病毒的重組形式和嵌合形式)或病毒的蛋白質(zhì)亞單位的疫苗制品。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗制品包含活的但減毒的hSARS病毒，有或沒(méi)有佐劑。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗制品包含滅活或死的hSARS病毒?？赏ㄟ^(guò)病毒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行一系列的傳代或通過(guò)制備病毒的重組形式或嵌合形式來(lái)制備這種減毒或滅活病毒。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供制備hSARS的重組形式或嵌合形式的方法。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗制品包含hSARS病毒(例如保藏號(hào)為CCTCC-V200303的病毒)的核酸或片段，或具有SEQ ID NO1、11、13或15序列或其片段的核酸分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含從hSARS病毒(例如保藏號(hào)為CCTCC-V200303的病毒)分離的或從其核酸生產(chǎn)的一種或多種多肽的疫苗制品。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗制品包含由SEQ ID NO1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗制品包含圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)及圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的本發(fā)明多肽或SEQ ID NO15核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明提供通過(guò)單獨(dú)或與佐劑或其它藥物可接受賦形劑聯(lián)合給予本發(fā)明疫苗制品或抗體來(lái)治療、改善、控制或預(yù)防SARS的方法。
在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗病毒藥物和藥物可接受載體的藥物組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明抗病毒藥物是免疫特異性結(jié)合hSARS病毒或任何hSARS表位的抗體。在另一具體的實(shí)施方案中，抗病毒藥物是本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)或本發(fā)明核酸分子。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明藥物組合物的試劑盒。
3.1定義本文所用術(shù)語(yǔ)“免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或抗體片段”指免疫特異性結(jié)合SEQ ID NO1、11、13或15核苷酸序列或其片段編碼的多肽、且不會(huì)非特異性地結(jié)合其它多肽的抗體或其片段。免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其片段可與其它抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。優(yōu)選免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其片段不與其它抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。免疫特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體或其片段可例如通過(guò)免疫測(cè)定或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它技術(shù)進(jìn)行鑒定。
“分離的”或“純化的”肽或蛋白質(zhì)基本不含來(lái)自所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞源或組織源的細(xì)胞材料或其它污染蛋白質(zhì)，或當(dāng)它們通過(guò)化學(xué)法合成時(shí)，基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。措詞“基本不含細(xì)胞材料”包括多肽/蛋白質(zhì)制品，其中多肽/蛋白質(zhì)從其分離或重組生產(chǎn)的細(xì)胞的細(xì)胞成分中分離出來(lái)。因此，基本不含細(xì)胞材料的多肽/蛋白質(zhì)包括含少于約30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)污染蛋白質(zhì)的多肽/蛋白質(zhì)制品。當(dāng)多肽/蛋白質(zhì)為重組生產(chǎn)時(shí)，還優(yōu)選基本不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制品的體積少于約20％，、10％或5％。當(dāng)多肽/蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)，即與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)分離。因此，這種多肽/蛋白質(zhì)制品含少于約30％、20％、10％、5％(干重)不屬于目的多肽/蛋白質(zhì)片段的化學(xué)前體或化合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽/蛋白質(zhì)是分離的或純化的。
“分離的”核酸分子是與其天然來(lái)源中存在的其它核酸分子分離的核酸分子。此外，“分離的”核酸分子如cDNA分子，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)可基本不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，當(dāng)通過(guò)化學(xué)法合成時(shí)可基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明多肽/蛋白質(zhì)的核酸分子是分離的或純化的。術(shù)語(yǔ)“分離的”核酸分子不包括屬于文庫(kù)的成員、還未與含有其它核酸分子的其它文庫(kù)克隆分離的核酸。
本文所用術(shù)語(yǔ)“部分”或“片段”指含有相關(guān)核酸分子長(zhǎng)度的至少約25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核酸，且具有相關(guān)核酸分子的至少一種功能特征(或其編碼的蛋白質(zhì)具有相關(guān)核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)的一種功能特征)的核酸分子片段；或指含有相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,100、4,200、4,300、4,350、4,360、4,370、4,380個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度，且具有相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽的至少一種功能特征的蛋白質(zhì)或多肽片段。
術(shù)語(yǔ)“具有本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性”或“具有本發(fā)明多肽的生物活性”指具有共同生物活性的多肽或蛋白質(zhì)的特性，其與SEQ IDNO1、11、13、15、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列編碼的多肽相比具有類似或相同結(jié)構(gòu)域和/或具有足夠的氨基酸一致性。本發(fā)明多肽的這種共同生物活性包括抗原性和免疫原性。
術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下”指相互之間具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的核苷酸序列保持互相雜交的雜交和洗滌條件。這種雜交條件例如但不限于在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.；Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science PublishingCo.，Inc.，N.Y.(1986)，第75-78頁(yè)和第84-87頁(yè)；及Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，第387-389頁(yè)中描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。優(yōu)選的嚴(yán)格雜交條件的非限制性實(shí)例是，在約68℃下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5％SDS中雜交，然后在室溫下2X SSC、0.5％SDS中洗滌一次或多次。優(yōu)選的嚴(yán)格雜交條件的另一個(gè)非限制性實(shí)例是，在約45℃下6X SSC中雜交，然后在約50-65℃下0.2X SSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次。
本文所用術(shù)語(yǔ)“變體”指天然產(chǎn)生的hSARS基因突變株或重組制備的hSARS突變體，與CCTCC-V200303的hSARS相比，它們各自在其基因組中含有一個(gè)或多個(gè)突變。術(shù)語(yǔ)“變體”也可指特定肽的天然產(chǎn)生的突變體或特定肽或蛋白質(zhì)的重組制備的突變體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基通過(guò)氨基酸置換、插入或缺失被修飾。
4.


圖1顯示從SARS病毒獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO1)及其推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，所述SARS病毒與已知冠狀病毒(Coronaviruses)的RNA依賴性RNA聚合酶蛋白具有57％的同源性。
圖2顯示具有類似冠狀病毒的形態(tài)學(xué)特征的新型hSARS病毒的電子顯微照片。
圖3顯示與感染新型冠狀病毒科(Coronaviridae)人呼吸道病毒的FrHK-4細(xì)胞特異性結(jié)合的IgG抗體的免疫熒光染色。
圖4顯示生長(zhǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)物中、在pH 7.0用3％磷鎢酸鉀負(fù)染色的hSARS病毒的超離心沉積物的電子顯微照片。
圖5A顯示SARS患者的肺活組織切片檢查的薄層切片電子顯微照片；圖5B顯示hSARS感染細(xì)胞的薄層切片電子顯微照片。
圖6顯示hSARS病毒(GenBank檢索號(hào)AY268070)的部分蛋白序列(215氨基酸；SEQ ID NO2)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析結(jié)果。系統(tǒng)樹(shù)是通過(guò)鄰接法構(gòu)建的。水平線距離表示兩個(gè)相比較的序列不同的位點(diǎn)的數(shù)目。自引導(dǎo)值是從500個(gè)重復(fù)中推斷得出的。
圖7A顯示在能定量檢測(cè)樣品中hSARS病毒的實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)中熒光強(qiáng)度對(duì)PCR循環(huán)的擴(kuò)增圖。指出了反應(yīng)中輸入質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。X軸表示定量PCR試驗(yàn)的循環(huán)數(shù)，Y軸表示超過(guò)背景的熒光強(qiáng)度(FI)。圖7B顯示臨床樣品的PCR產(chǎn)物的解鏈曲線分析結(jié)果。指出了得自陽(yáng)性(+ve)樣品、陰性(-ve)樣品和水對(duì)照(水)的信號(hào)。X軸表示溫度(℃)，Y軸表示超過(guò)背景的熒光強(qiáng)度(FI)。
圖8顯示另一種從SARS病毒獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO11)及其推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
圖9顯示又一種從SARS病毒獲得的部分DNA序列(SEQ ID NO13)及其推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。
圖10顯示SARS病毒的整個(gè)基因組DNA序列(SEQ ID NO15)。
圖11顯示以三種讀框(參見(jiàn)SEQ ID NO16、240和737)從SEQ IDNO15獲得的推斷氨基酸序列。星號(hào)(*)表示標(biāo)志肽的末端的終止密碼子。第一讀框氨基酸序列SEQ ID NO17-239；第二讀框氨基酸序列SEQ ID NO241-736；第三讀框氨基酸序列SEQ ID NO738-1107。
圖12顯示以三種讀框(參見(jiàn)SEQ ID NO1108、1590和1965)從SEQ ID NO15的互補(bǔ)物獲得的推斷氨基酸序列。星號(hào)(*)表示標(biāo)志肽的末端的終止密碼子。第一讀框氨基酸序列SEQ ID NO1109-1589；第二讀框氨基酸序列SEQ ID NO1591-1964；第三讀框氨基酸序列SEQ ID NO1966-2470。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在形態(tài)學(xué)上和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上與已知冠狀病毒相關(guān)的分離hSARS病毒。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分離hSARS病毒是CCTCC-V200303病毒。在另一具體的實(shí)施方案中，所述病毒包含SEQID NO1、11、13和/或15的核苷酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hSARS病毒的分離核酸分子或其互補(bǔ)物或其部分，該核酸分子包括或由SEQ ID NO1、11、13和/或15的核苷酸序列組成。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供那能在本文定義的嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO1、11、13或15序列的核酸分子、或冠狀病毒科已知成員的特定基因、或其互補(bǔ)物雜交的分離核酸分子。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含SEQ ID NO1核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含SEQ ID NO11核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含SEQ ID NO13核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。在又一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由如下核酸分子編碼的分離多肽或蛋白質(zhì)，所述核酸分子包含SEQ IDNO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。這些多肽包括圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)及圖12(SEQ IDNO1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽。本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)優(yōu)選具有以下蛋白質(zhì)的一種或多種生物活性由SEQ ID NO1、11、13、15序列編碼的蛋白質(zhì)；或含有由SEQ ID NO1、11、13或15序列編碼的氨基酸序列的天然病毒蛋白質(zhì)；或圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)及圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及在宿主細(xì)胞中增殖hSARS病毒的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離病毒的序列信息在診斷方法和治療方法中的應(yīng)用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供hSARS病毒CCTCC-V200303的整個(gè)核苷酸序列SEQ ID NO15或其片段或互補(bǔ)物。此外，本發(fā)明涉及能在嚴(yán)格條件下與hSARS病毒CCTCC-V200303的基因組SEQ ID NO15的任何部分雜交的核酸分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適合用作引物的核酸分子，該核酸分子包含或由SEQ IDNO1、11、13或15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含或由SEQ ID NO3和/或4的核苷酸序列組成的引物。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適合用作雜交探針的核酸分子，用于檢測(cè)包含或由SEQ ID NO1、11、13或15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其部分組成的、編碼本發(fā)明多肽的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步包括嵌合病毒或重組病毒或由所述核苷酸序列編碼的病毒蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供能特異性結(jié)合由SEQ ID NO1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽或任何hSARS表位的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供能特異性結(jié)合由SEQID NO15核苷酸序列或其片段編碼的本發(fā)明多肽或任何hSARS表位的抗體。這種抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫鍵連接的Fvs、胞內(nèi)抗體和含有能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的VL或VH結(jié)構(gòu)域或甚至互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生物材料如細(xì)胞、血液、唾液、尿、痰、鼻咽抽吸物等中檢測(cè)本發(fā)明hSARS病毒的存在、活性或表達(dá)的方法。可通過(guò)將生物材料與能直接或間接檢測(cè)hSARS病毒存在的試劑相接觸來(lái)確定樣品中hSARS病毒的存在。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是本發(fā)明抗體。在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)試劑是本發(fā)明核酸分子。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含hSARS病毒(包括所述病毒的重組形式和嵌合形式)或病毒亞單位的疫苗制品。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗制品包含活的但減毒的hSARS病毒，有或沒(méi)有藥物可接受賦形劑，包括佐劑。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗制品包含滅活或死的hSARS病毒，有或沒(méi)有藥物可接受賦形劑，包括佐劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供制備hSARS的重組形式或嵌合形式的方法。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗制品包含一種或多種包含或由SEQ ID NO1、11、13和/或15的序列或其片段組成的核酸分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含一種或多種本發(fā)明多肽的疫苗制品，所述多肽由包含或由SEQ ID NO1、11、13、16、240、737、1108、1590和/或1965核苷酸序列或其片段組成的核苷酸序列編碼。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含一種或多種本發(fā)明多肽的疫苗制品，所述多肽由包含或由SEQ ID NO15核苷酸序列或其片段組成的核苷酸序列編碼。此外，本發(fā)明提供通過(guò)單獨(dú)或與以下藥物聯(lián)合給予本發(fā)明疫苗制品或抗體來(lái)治療、改善、控制或預(yù)防SARS的方法抗病毒藥物[例如金剛烷胺、金剛乙胺、更昔洛韋、阿昔洛韋、利巴韋林、噴昔洛韋、奧塞米韋、膦甲酸、齊多夫定(AZT)、去羥肌苷(ddI)、拉米夫定(3TC)、扎西他濱(ddC)、司他夫定(d4T)、奈韋拉平、地位韋啶、茚地那韋、利托那韋、阿糖腺苷、奈非那韋、沙奎那韋、扎那米韋、磷酸奧塞米韋、普來(lái)可那立、干擾素等]、類固醇和皮質(zhì)類固醇(如潑尼松、可的松、氟替卡松)和糖皮質(zhì)激素、抗生素、止痛劑、支氣管擴(kuò)張藥或其它用于呼吸道和/或病毒感染的療法。
此外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗病毒藥物和藥物可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明藥物組合物的藥盒。
在另一方面，本發(fā)明提供篩選能抑制hSARS病毒或其變體的傳染性或復(fù)制的抗病毒藥物的方法。
5.1重組和嵌合hSARS病毒本發(fā)明包括由來(lái)源于hSARS病毒或其自然變體的基因組的病毒載體編碼的重主或嵌合病毒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，重組病毒來(lái)源于保藏號(hào)為CCTCC-V200303的hSARS病毒。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病毒具有SEQ ID NO15的核苷酸序列。在另一具體的實(shí)施方案中，重組病毒來(lái)源于hSARS病毒的自然變體。hSARS病毒的自然變體具有與hSARS病毒CCTCC-V200303的基因組序列(SEQ ID NO15)不同的序列，這是由于基因組序列的一種或多種自發(fā)突變，包括但不限于點(diǎn)突變、重排、插入、缺失等，所述突變會(huì)或不會(huì)導(dǎo)致發(fā)生表型改變。根據(jù)本發(fā)明，來(lái)源于hSARS病毒CCTCC-V200303的基因組的病毒載體含有編碼至少hSARS病毒一個(gè)ORF的一部分的核酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述OFR包含或由SEQ ID NO1、11或13核苷酸序列或其片段組成。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在SEQ ID NO15核苷酸序列或其互補(bǔ)序列或其片段中存在多于一個(gè)的OFR，如圖11(SEQ ID NO16、240和737)及圖12(SEQ ID NO1108、1590和1965)所示。在另一實(shí)施方案中，ORF編碼的多肽包含或由SEQ IDNO2、12或14氨基酸序列或其片段、或如圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)及圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示或其片段組成。根據(jù)本發(fā)明，這些病毒載體可包含或不包含不屬于天然病毒基因組的核酸。
在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合病毒是進(jìn)一步包含異源核苷酸序列的重組hSARS病毒。根據(jù)本發(fā)明，嵌合病毒可由核苷酸序列編碼，其中已向基因組添加了異源核苷酸序列或其中內(nèi)源或天然核苷酸序列已被異源核苷酸序列置換。
根據(jù)本發(fā)明，嵌合病毒由進(jìn)一步包含異源核苷酸序列的本發(fā)明病毒載體編碼。根據(jù)本發(fā)明，嵌合病毒由可包含或不包含不屬于天然病毒基因組的核酸的病毒載體編碼。根據(jù)本發(fā)明，嵌合病毒由病毒載體編碼，其中已添加、插入異源核苷酸序列或已用異源核苷酸序列置換天然或非天然序列。根據(jù)本發(fā)明，嵌合病毒可由來(lái)源于hSARS病毒的不同毒株或變體的核苷酸序列編碼。具體的說(shuō)，嵌合病毒由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列編碼來(lái)源于SARS病毒的不同毒株或變體的抗原多肽。
嵌合病毒對(duì)于生產(chǎn)抗兩種或多種病毒的重組疫苗是特別有用的(Tao等，J.Virol.72，2955-2961；Durbin等，2000，J.Virol.74，6821-6831；Skiadopoulos等，1998，J.Virol.72，1762-1768(1998)；Teng等，2000，J.Virol.74，9317-9321)。例如，可以設(shè)想，來(lái)源于hSARS病毒、表達(dá)hSARS病毒變體一種或多種蛋白質(zhì)(反之亦然)的病毒載體將保護(hù)接種了這種載體的對(duì)象免受天然hSARS病毒及其變體的感染。對(duì)于用活疫苗接種的目的，可像其它病毒一樣使用減毒和復(fù)制缺陷型病毒。(參見(jiàn)PCT WO 02/057302第6頁(yè)和第23頁(yè)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
根據(jù)本發(fā)明，待摻入編碼本發(fā)明重組或嵌合病毒的病毒載體的異源序列包括從hSARS的不同毒株或變體獲得或衍生的序列。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合或重組病毒由來(lái)源于病毒基因組的病毒載體編碼，其中一個(gè)或多個(gè)序列、基因間區(qū)、末端序列或ORF的整體或部分已被異源或非天然序列取代。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明嵌合病毒由來(lái)源于病毒基因組的病毒載體編碼，其中一種或多種異源序列已被插入或添加到載體中。
病毒載體的選擇可取決于待治療病毒感染或保護(hù)免受病毒感染的對(duì)象的種類。如果對(duì)象是人類，則可用減毒hSARS病毒來(lái)提供抗原序列。
根據(jù)本發(fā)明，可對(duì)病毒載體進(jìn)行人工改造，以提供對(duì)hSARS病毒及其天然變體的感染帶來(lái)保護(hù)作用的抗原序列。可對(duì)病毒載體進(jìn)行人工改造，以提供一種、兩種、三種或更多種抗原序列。根據(jù)本發(fā)明，抗原序列可來(lái)源于同一病毒、同一種類病毒的不同毒株或變體、或不同病毒。
根據(jù)本發(fā)明獲得的表達(dá)產(chǎn)物和/或重組或嵌合病毒顆粒可有利地應(yīng)用在疫苗制品中?？蓪?duì)本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物和嵌合病毒顆粒進(jìn)行人工改造，以產(chǎn)生抗多種病原體的疫苗，所述病原體包括病毒和細(xì)菌抗原、腫瘤抗原、變應(yīng)原抗原和與自身免疫病有關(guān)的自身抗原。具體的說(shuō)，可對(duì)本發(fā)明嵌合病毒顆粒進(jìn)行人工改造，以制造能保護(hù)對(duì)象免受hSARS病毒或其變體感染的疫苗。
在某些實(shí)施方案中，可對(duì)本發(fā)明表達(dá)產(chǎn)物和重組或嵌合病毒顆粒進(jìn)行人工改造，以產(chǎn)生抗多種病原體的疫苗，所述病原體包括病毒抗原、腫瘤抗原和與自身免疫病有關(guān)的自身抗原。實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的一個(gè)方法包括對(duì)現(xiàn)有的hSARS基因進(jìn)行修飾，使得在所述基因各自的外結(jié)構(gòu)域中包含外源序列。在異源序列為病原體的表位或抗原的情況下，這些嵌合病毒可用來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)衍生這些決定簇的疾病因子的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明涉及使用病毒載體和重組或嵌合病毒來(lái)制備抗多種病毒和/或抗原的疫苗。本發(fā)明還包括包含病毒載體的重組病毒，所述病毒載體來(lái)源于hSARS病毒或其變體，含有能使病毒具有更適合用于疫苗制品的表型(例如減毒表型或增強(qiáng)的抗原性)的序列。變異和修飾可出現(xiàn)在病毒的編碼區(qū)、基因間區(qū)和前導(dǎo)序列和尾隨序列。
本發(fā)明提供包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。含有hSARS病毒的聚合酶成分的質(zhì)粒載體或病毒載體在原核細(xì)胞中產(chǎn)生，以在相關(guān)的細(xì)胞類型(細(xì)菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真核細(xì)胞)中表達(dá)所述成分。含有hSARS基因組全長(zhǎng)拷貝或部分拷貝的質(zhì)?；虿《据d體在原核細(xì)胞中產(chǎn)生，以在體外或體內(nèi)表達(dá)病毒核酸。后者載體可含有其它病毒序列以產(chǎn)生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可缺少病毒基因組的某些部分以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒，并可含有突變、缺失或插入以產(chǎn)生減毒病毒。此外，本發(fā)明提供感染hSARS病毒(例如保藏號(hào)為CCTCC-V200303的hSARS病毒)的宿主細(xì)胞。
hSARS(野生型、減毒型、復(fù)制缺陷型或嵌合型)的傳染性拷貝可根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)在共表達(dá)聚合酶成分時(shí)產(chǎn)生。
此外，可使用短暫或穩(wěn)定表達(dá)一種或多種全長(zhǎng)或部分hSARS蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞。這種細(xì)胞可通過(guò)轉(zhuǎn)染(蛋白質(zhì)載體或核酸載體)、感染(病毒載體)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒載體)來(lái)制成，可用于與所述野生型、減毒型、復(fù)制缺陷型或嵌合型病毒互補(bǔ)。
本發(fā)明病毒載體和嵌合病毒可用于通過(guò)刺激體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答或通過(guò)刺激對(duì)抗原的耐受性而調(diào)節(jié)對(duì)象的免疫系統(tǒng)。本文所用的對(duì)象指人、靈長(zhǎng)目動(dòng)物、馬、牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、鳥(niǎo)類和嚙齒動(dòng)物。
5.2疫苗和抗病毒藥的配制在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明核酸編碼的蛋白質(zhì)分子或hSARS病毒特異性病毒蛋白及其功能片段。有用的蛋白質(zhì)分子例如來(lái)源于可從本發(fā)明病毒衍生的任何基因或基因組片段，包括包膜蛋白(E蛋白)、膜內(nèi)在蛋白質(zhì)(M蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、核殼蛋白(N蛋白)、血凝素酯酶(HE蛋白)和RNA依賴性RNA聚合酶。本文所提供的這種分子或其抗原片段例如可用于診斷方法或試劑盒中，以及用于藥物組合物如亞單位疫苗中。特別有用的是由SEQ ID NO1、11、13或15核苷酸序列編碼的或圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)及圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽或其抗原片段，供混入作為抗原或亞單位免疫原，但也可使用滅活的全病毒。還特別有用的是由hSARS基因組的重組核酸片段編碼的蛋白物質(zhì)，當(dāng)然優(yōu)選的是在ORF的優(yōu)選界限內(nèi)、尤其是在體內(nèi)(例如出于保護(hù)目的或治療目的，或用于提供診斷性抗體)或體外(例如通過(guò)噬菌體展示技術(shù)或其它用于產(chǎn)生合成抗體的技術(shù))都引發(fā)hSARS特異性抗體或T細(xì)胞應(yīng)答的蛋白物質(zhì)。
本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療hSARS病毒感染的疫苗制品。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明疫苗包含hSARS病毒的重組和嵌合病毒。在某些實(shí)施方案中，病毒是減毒的。
在本發(fā)明此方面的另一實(shí)施方案中，滅活疫苗制品可通過(guò)使用常規(guī)技術(shù)“殺死”嵌合病毒來(lái)制備。在其傳染性已被破壞的意義上，滅活疫苗是“死的”。理想的是，病毒的傳染性被破壞，但不影響其免疫原性。為制備滅活疫苗，可使嵌合病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中或在雞胚的尿囊中生長(zhǎng)，通過(guò)區(qū)帶超離心純化，用甲醛或β-丙醇酸內(nèi)酯滅活，收集。所得疫苗通常通過(guò)肌肉內(nèi)接種。
滅活病毒可用合適的佐劑配制，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這種佐劑可包括但不限于無(wú)機(jī)凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子；肽；油乳液；及具有潛在用途的人佐劑如BCG和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
在另一方面，本發(fā)明還提供DNA疫苗制品，其中包含hSARS病毒(例如保藏號(hào)為CCTCC-V200303的病毒)的核酸或片段或具有SEQID NO1、11、13或15序列的核酸分子或其片段。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明DNA疫苗制品包含編碼免疫特異性結(jié)合hSARS病毒的抗體的核酸或其片段。在DNA疫苗制品中，DNA疫苗包含帶有插入片段的病毒載體(例如來(lái)源于hSARS病毒)、細(xì)菌質(zhì)粒或其它表達(dá)載體，所述插入片段包含有效地與一種或多種控制元件相連的本發(fā)明核酸分子，從而使得由所述核酸分子編碼的接種蛋白質(zhì)可以在接種對(duì)象中表達(dá)。這種載體可用重組DNA技術(shù)制備成攜帶本發(fā)明核酸分子的重組或嵌合病毒載體(參見(jiàn)上文5.1節(jié))。
已描述了各種供DNA接種以抗病毒感染的異源載體。例如，以下參考文獻(xiàn)描述的載體可用來(lái)表達(dá)hSARS序列而不是所描述的病毒或其它病原體的序列；尤其描述用于以下的載體乙肝病毒(Michel，M.L.等，1995，DAN-mediated immunization to the hepatitis B surfaceantigen in miceAspects of the humoral response mimic hepatitis B viralinfection in humans，Proc.Natl.Aca Sci.USA 925307-5311；Davis，H.L.等，1993，DNA-based immunization induces continuous seretion ofhepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody，HumanMolec.Genetics 21847-1851)、HIV病毒(Wang，B.等，1993，Geneinoculation generates immune responses against human imunodeficiencyvirus type 1，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904156-4160；Lu，S.等，1996，Simian immunodeficiency virus DNA vaccine trial in macques，J.Virol.703978-3991；Letvin，N.L.等，1997，Potent，protective anti-HIV immuneresponses generated by bimodal HIV envelope DNA plus proteinvaccination，Proc Natl Acad Sci USA.94(17)9378-83)和流感病毒(Robinson，HL等，1993，Protection against a lethal influenza viruschallenge by immunization with a haemagglutinin-expressing plasmidDNA，Vaccine 11957-960；Ulmer，J.B.等，Heterologous protectionagaainst influenza by injection of DNA encoding a viral protein，Science2591745-1749)，以及細(xì)菌感染如結(jié)核病(Tascon，R.E.等，1996，Vaccination agaainst tuberculosis by DNA injection，Nature Med.2888-892；Huygen，K.等，1996，Immunogenicity and protective efficacy of atuberculosis DNA vaccine，Nature Med.，2893-898)和寄生蟲(chóng)感染如瘧疾(Sedegah，M.，1994，Protection against malaria by immunization withplasmid DNA encoding circumsporozoite protein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919866-9870；Doolan，D.L.等，1996，Circumventing geneticrestriction of protection agaainst malaria with multigene DNAimmunizationCD8+T cell-interferon δ，and nitric oxide-dependentimmunity，J.Exper.Med.，11831739-1746)。
可使用多種方法來(lái)輸入上述疫苗制品。這些方法包括但不限于口、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和鼻內(nèi)途徑。另外，優(yōu)選通過(guò)疫苗針對(duì)其設(shè)計(jì)的病原體的自然感染途徑來(lái)輸入嵌合病毒疫苗制品。本發(fā)明DNA疫苗可以鹽水溶液形式，通過(guò)用注射器和針頭注射入肌肉或皮膚內(nèi)來(lái)給予(Wolff J.A.等，1990，Direct gene transfer into mousemuscle in vivo，Science 2471465-1468；Raz，E.，1994，Intradermal geneimmunizationThe possible role of DNA uptake in the induction of cellularimmunity to viruses，Proc.Natl.Acd.Sci.USA 919519-9523)。另一種給予DNA疫苗的方式稱為“基因槍”方法，通過(guò)該法，涂有目的DNA分子的微小金珠被射入細(xì)胞中(Tang，D.等，1992，Genetic immunizationis a simple method for eliciting an immune response，Nature 356152-154)。有關(guān)DNA疫苗的方法的全面綜述參見(jiàn)Robinson，H.L.，1999，DNA vaccinesbasic mechanism and immune responses(綜述)，Int.J.Mol.Med 4(5)549-555；Barber，B.，1997，IntroductionEmerging vaccinestrategies，Seminars in Immunology 9(5)269-270；和Robinson，H.L.等，1997，DNA vaccines，Seminars in Immunology 9(5)271-283。
5.3hSARS病毒或其變體的減毒可對(duì)本發(fā)明hSARS病毒或其變體進(jìn)行基因工程改造，以顯示出減毒表型。具體的說(shuō)，本發(fā)明病毒在所述病毒作為疫苗給予的對(duì)象中顯示出減毒表型。減毒可通過(guò)普通技術(shù)人員熟知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。非為理論所囿，可例如通過(guò)使用本質(zhì)上在預(yù)定宿主物種中不能很好地復(fù)制的病毒來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明病毒的減毒表型，例如相對(duì)于病毒的野生型毒株，通過(guò)減少病毒基因組的復(fù)制，通過(guò)降低病毒感染宿主細(xì)胞的能力，或通過(guò)降低病毒蛋白質(zhì)裝配成傳染性病毒顆粒的能力。
hSARS病毒及其變體的減毒表型可通過(guò)普通技術(shù)人員熟知的任何方法來(lái)檢測(cè)。候選病毒可例如檢測(cè)其感染宿主的能力或其在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的復(fù)制速率。在某些實(shí)施方案中，用不同溫度下的生長(zhǎng)曲線來(lái)檢測(cè)病毒的減毒表型。例如，減毒病毒能在35℃下生長(zhǎng)，但不能在39℃或40℃下生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，可用不同的細(xì)胞系評(píng)價(jià)病毒的減毒表型。例如，減毒病毒可只能在猴細(xì)胞系中生長(zhǎng)，但卻不能在人細(xì)胞系中生長(zhǎng)，或者減毒病毒在不同細(xì)胞系中可達(dá)到的病毒滴度不同。在某些實(shí)施方案中，病毒在小型動(dòng)物模型(包括但不限于倉(cāng)鼠、棉鼠、小鼠、豚鼠)的呼吸道中的復(fù)制被用來(lái)評(píng)價(jià)病毒的減毒表型。在其它實(shí)施方案中，病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體滴度(例如通過(guò)蝕斑減少中和試驗(yàn)或ELISA來(lái)檢測(cè))被用來(lái)評(píng)價(jià)病毒的減毒表型。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，蝕斑減少中和試驗(yàn)或ELISA在低劑量下進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，可檢測(cè)出hSARS病毒在動(dòng)物模型中引起病理癥狀的能力。病毒在動(dòng)物模型中引起病理癥狀的能力降低是其減毒表型的指征。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，檢測(cè)候選病毒在猴模型中對(duì)鼻的感染，以黏液的產(chǎn)生為指標(biāo)。
可對(duì)本發(fā)明病毒進(jìn)行減毒，以使病毒的一種或多種功能特征受損。在某些實(shí)施方案中，減毒是通過(guò)與減毒病毒來(lái)源的病毒野生型毒株作比較來(lái)測(cè)定的。在其它實(shí)施方案中，減毒是通過(guò)比較減毒病毒在不同宿主系統(tǒng)中的生長(zhǎng)來(lái)確定的。因此，作為非限制性實(shí)例，當(dāng)在人宿主中生長(zhǎng)時(shí)，如果hSARS病毒或其變體與非減毒hSARS或其變體相比在人宿主中的生長(zhǎng)降低，則hSARS病毒或其變體被稱為減毒的。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明減毒病毒能夠感染宿主，能夠在宿主中復(fù)制，從而產(chǎn)生傳染性病毒顆粒。但是，與野生型毒株相比，減毒株生長(zhǎng)得到的滴度低，或生長(zhǎng)得更緩慢?？捎闷胀夹g(shù)人員熟知的任何方法確定減毒病毒的生長(zhǎng)曲線并將其與野生型病毒的生長(zhǎng)曲線相比較。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明減毒病毒(例如重組或嵌合hSARS病毒)在人細(xì)胞中復(fù)制得不如野生型病毒(例如野生型hSARS)好。但是，減毒病毒在缺乏干擾素功能的細(xì)胞系如Vero細(xì)胞中可復(fù)制良好。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明減毒病毒能夠感染宿主，能夠在宿主中復(fù)制，以及能夠使本發(fā)明病毒的蛋白質(zhì)嵌入到胞質(zhì)膜中，但是減毒病毒不會(huì)引起宿主產(chǎn)生新的傳染性病毒顆粒。在某些實(shí)施方案中，減毒病毒感染宿主、在宿主中復(fù)制、并且導(dǎo)致病毒蛋白質(zhì)嵌入到宿主的胞質(zhì)膜中的效率與野生型hSARS一樣。在其它實(shí)施方案中，減毒病毒相對(duì)于野生型病毒其導(dǎo)致病毒蛋白質(zhì)嵌入到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)膜中的能力降低。在某些實(shí)施方案中，減毒hSARS病毒相對(duì)于野生型病毒其在宿主中復(fù)制的能力降低?？墒褂闷胀夹g(shù)人員熟知的任何技術(shù)來(lái)確定病毒是否能夠感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，是否能夠在宿主中復(fù)制以及是否能夠?qū)е虏《镜鞍踪|(zhì)嵌入到宿主的胞質(zhì)膜中。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明減毒病毒能夠感染宿主。但與野生型hSARS相反的是，減毒hSARS病毒不能在宿主中復(fù)制。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，減毒hSARS病毒能感染宿主，能導(dǎo)致宿主將病毒蛋白質(zhì)嵌入到其胞質(zhì)膜中，但減毒病毒不能夠在宿主中復(fù)制?？墒褂闷胀夹g(shù)人員熟知的任何方法來(lái)檢測(cè)減毒hSARS病毒是否已感染宿主以及是否已導(dǎo)致宿主將病毒蛋白質(zhì)嵌入到其胞質(zhì)膜中。
在某些實(shí)施方案中，減毒病毒感染宿主的能力與野生型病毒感染相同宿主的能力相比降低了。可使用普通技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)來(lái)確定病毒是否能夠感染宿主。
在某些實(shí)施方案中，突變(例如錯(cuò)義突變)被引入到病毒的基因組中，例如被引入到SEQ ID NO1、11、13或15序列中，以產(chǎn)生具有減毒表型的病毒。突變(例如錯(cuò)義突變)可被引入到hSARS的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因中。突變可以是增添、置換、缺失或它們的組合?？珊Y選這種hSARS變體的預(yù)期功能性，如在細(xì)胞培養(yǎng)物中的傳染性、復(fù)制能力、蛋白質(zhì)合成能力、裝配能力以及致細(xì)胞病變效應(yīng)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，錯(cuò)義突變是冷敏突變。在另一實(shí)施方案中，錯(cuò)義突變是熱敏突變。在另一實(shí)施方案中，錯(cuò)義突變防止病毒蛋白質(zhì)的正常加工或剪切。
在其它實(shí)施方案中，缺失被引入到hSARS病毒的基因組中，導(dǎo)致病毒的減毒。
在某些實(shí)施方案中，病毒的減毒是通過(guò)用不同種、不同亞群或不同變體的病毒基因替換野生型病毒的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在另一方面，病毒的減毒是通過(guò)用來(lái)源于不同種病毒的相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域替換野生型病毒的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特定結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在某些其它實(shí)施方案中，病毒的減毒是通過(guò)缺失野生型病毒的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)特定結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
當(dāng)使用活減毒疫苗時(shí)，必須考慮其安全性。所述疫苗必須不會(huì)導(dǎo)致疾病。本領(lǐng)域熟知的能使疫苗安全的任何技術(shù)均可在本發(fā)明中使用。除減毒技術(shù)外，也可使用其它技術(shù)。一個(gè)非限制性實(shí)例是使用不能被摻入到病毒顆粒膜中的可溶性異源基因。例如，可使用單拷貝的缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的病毒跨膜蛋白質(zhì)可溶性形式。
可使用多種試驗(yàn)檢測(cè)疫苗的安全性。例如，可使用蔗糖梯度試驗(yàn)和中和試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)安全性。蔗糖梯度試驗(yàn)可用來(lái)確定異源蛋白質(zhì)是否被插入到病毒顆粒中。如果異源蛋白質(zhì)被插入到病毒顆粒中，則應(yīng)檢測(cè)病毒顆粒在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中導(dǎo)致癥狀的能力，因?yàn)椴《究赡芤呀?jīng)獲得新的、可能致病的性質(zhì)。
5.4佐劑和載體分子hSARS相關(guān)抗原與一種或多種佐劑一起給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，hSARS相關(guān)抗原與無(wú)機(jī)鹽佐劑或無(wú)機(jī)鹽凝膠佐劑一起給藥。這種無(wú)機(jī)鹽佐劑和無(wú)機(jī)鹽凝膠佐劑包括但不限于氫氧化鋁(ALHYDROGEL、REHYDRAGEL)、磷酸鋁凝膠、羥基磷酸鋁(ADJU-PHOS)和磷酸鈣。
在另一實(shí)施方案中，hSARS相關(guān)抗原與免疫刺激佐劑一起給藥。這類佐劑包括但不限于細(xì)胞因子(例如白介素-2、白介素-7、白介素-12、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ、白介素-1β(IL-1β)和IL-1β肽或Sclavo肽)、含細(xì)胞因子的脂質(zhì)體、三萜類糖苷或皂苷(例如QuilA和QS-21，亦在商標(biāo)STIMULON、ISCOPREP下出售)、胞壁酰二肽(MDP)衍生物如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(蘇氨酰-MDP，在商標(biāo)TERMURTIDE下出售)、GMDP、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)乙胺、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、未甲基化的CpG二核苷酸和寡核苷酸如細(xì)菌DNA及其片段、LPS、一磷酰脂質(zhì)A(3D-MLA，在商標(biāo)MPL下出售)和聚磷腈。
在另一實(shí)施方案中，所用的佐劑是特殊的佐劑，包括但不限于乳液，例如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、例如與嵌段共聚物如L-121(聚氧丙烯/聚氧乙烯，在商標(biāo)PLUROMC L-121下出售)制備的角鯊烯或角鯊?fù)樗妥魟┲苿┤鏢AF和MF59、脂質(zhì)體、病毒體、脂質(zhì)體卷(cochleates)和在商標(biāo)ISCOM下出售的免疫刺激復(fù)合物。
在另一實(shí)施方案中，使用微粒佐劑。微粒佐劑包括但不限于生物可降解和生物相容性聚酯、乳酸的均聚物(PLA)及乙醇酸的均聚物(PGA)和它們的共聚物、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)微粒、能自締合成微粒的聚合物(泊洛沙姆顆粒)、可溶性聚合物(聚磷腈)和病毒樣顆粒(VLP)如重組蛋白質(zhì)微粒，例如乙肝表面抗原(HbsAg)。
可以使用的又一類佐劑包括黏膜佐劑，包括但不限于來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)的不耐熱腸毒素(LT)、來(lái)自霍亂弧菌(Vibriocholerae)的霍亂全毒素(CT)和霍亂毒素B亞單位(CTB)、突變株毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和聚合脂質(zhì)體。
在其它實(shí)施方案中，上述任何類型的佐劑可相互組合或與其它佐劑組合使用。例如，可用來(lái)給予本發(fā)明hSARS相關(guān)抗原的組合佐劑制劑的非限制性實(shí)例包括包含免疫刺激蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、T細(xì)胞和/或B細(xì)胞肽的脂質(zhì)體；或帶有或不帶包埋IL-2的微生物或含有腸毒素的微粒。本領(lǐng)域熟知的其它佐劑也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)(參見(jiàn)VaccineDesignThe Subunit and Adjuvant Appoach，第7章，Michael F.Powell和Mark J.Newman(編輯)，Plenum Press，New York，1995，其通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中)。
佐劑的效力可通過(guò)測(cè)量誘導(dǎo)針對(duì)免疫原性多肽(含有hSARS多肽表位)的抗體來(lái)確定，所述抗體由在也包含各種佐劑的疫苗中給予這種多肽而產(chǎn)生。
所述多肽可配制成中性形式或鹽形式的疫苗。藥物可接受的鹽包括酸加成鹽(通過(guò)肽的游離氨基形成)和與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、馬來(lái)酸等)形成的鹽。通過(guò)游離羧基形成的鹽也可來(lái)源于無(wú)機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，及有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
本發(fā)明疫苗可以是多價(jià)疫苗或單價(jià)疫苗。多價(jià)疫苗由能指導(dǎo)多于一種抗原表達(dá)的重組病毒制成。
可使用多種方法來(lái)引入本發(fā)明疫苗制品；這些方法包括但不限于口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)途徑和通過(guò)劃痕法(例如使用分叉針刮破皮膚的上層)。
被給予疫苗的患者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人類，但也可以是非人類動(dòng)物，包括但不限于牛、馬、綿羊、豬、禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠。
5.5抗體的制備特異性識(shí)別本發(fā)明多肽，例如但不限于包含SEQ ID NO2、12和14序列的多肽及圖11(SEQ ID NO17-239、241-736和738-1107)和圖12(SEQ ID NO1109-1589、1591-1964、1966-2470)所示的多肽，或hSARS表位的抗體或其抗原結(jié)合片段，可用來(lái)檢測(cè)、篩選和分離本發(fā)明多肽或其片段，或可能編碼其它生物體類似酶的類似序列。例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，免疫特異性結(jié)合hSARS表位的抗體或其片段可用于各種體外檢測(cè)試驗(yàn)中，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡等，以在樣品例如生物材料中檢測(cè)本發(fā)明多肽或優(yōu)選hSARS，所述生物材料包括細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基(例如細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基、昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基、酵母細(xì)胞培養(yǎng)基等)、血液、血漿、血清、組織、痰、鼻咽抽吸物等。
對(duì)本發(fā)明多肽或hSARS的任何表位具有特異性的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何適合方法產(chǎn)生?？鼓康目乖?例如保藏號(hào)為CCTCC-V200303或包含SEQ ID NO15核苷酸序列的hSARS病毒)的多克隆抗體可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的各種方法生產(chǎn)。例如，可將抗原給予各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以誘導(dǎo)產(chǎn)生含有抗原特異性多克隆抗體的抗血清?？墒褂枚喾N佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，取決于宿主物種，佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、無(wú)機(jī)凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔_血藍(lán)蛋白、二硝基酚和對(duì)人類具有潛在用途的佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。這種佐劑在本領(lǐng)域也是熟知的。
單克隆抗體可使用多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備，包括使用雜交瘤技術(shù)、重組體技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)或它們的組合。例如單克隆抗體可使用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，包括本領(lǐng)域公知的雜交瘤技術(shù)和例如在Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas，第563-681頁(yè)(Elsevier，N.Y.，1981)中講授的雜交瘤技術(shù)(兩者通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中)。本文所用術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”不限于通過(guò)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指來(lái)源于單個(gè)克隆的抗體，包括任何真核克隆、原核克隆和噬菌體克隆，而不是指抗體生產(chǎn)的方法。
使用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)和篩選具體抗體的方法是常規(guī)的和本領(lǐng)域熟知的。在非限制性實(shí)例中，小鼠可用目的抗原或表達(dá)這種抗原的細(xì)胞免疫。一旦檢測(cè)出免疫應(yīng)答，例如在小鼠血清中檢測(cè)出對(duì)抗原特異的抗體，則收獲小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞。然后通過(guò)熟知的技術(shù)將脾細(xì)胞與任何適合的骨髓瘤細(xì)胞融合。通過(guò)有限稀釋選擇和克隆雜交瘤。然后用本領(lǐng)域熟知的方法檢測(cè)雜交瘤克隆中分泌能結(jié)合抗原的抗體的細(xì)胞。通常含有高水平抗體的腹水可通過(guò)用陽(yáng)性雜交瘤克隆腹膜內(nèi)接種小鼠來(lái)產(chǎn)生。
識(shí)別特定表位的抗體片段可通過(guò)公知技術(shù)產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab和F(ab′)2片段可通過(guò)使用酶例如木瓜蛋白酶(用于產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(用于產(chǎn)生F(ab′)2片段)，對(duì)免疫球蛋白分子進(jìn)行蛋白酶解來(lái)生產(chǎn)。F(ab′)2片段含有全部輕鏈以及重鏈的可變區(qū)、CH1區(qū)和鉸鏈區(qū)。
本發(fā)明抗體或其片段也可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何抗體合成方法來(lái)生產(chǎn)，具體的說(shuō)通過(guò)化學(xué)合成法，或優(yōu)選通過(guò)重組表達(dá)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。
編碼抗體的核苷酸序列可從本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可獲取的任何信息獲得(即從Genbank、文獻(xiàn)獲得或通過(guò)常規(guī)克隆和序列分析獲得)。如果含有編碼特定抗體或其表位結(jié)合片段的核酸的克隆不可獲得，但抗體分子或其表位結(jié)合片段的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可通過(guò)化學(xué)法合成，或獲得自合適的來(lái)源(例如抗體cDNA文庫(kù)，或從表達(dá)抗體的任何組織或細(xì)胞(如選擇用來(lái)表達(dá)抗體的雜交瘤)產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)或從其中分離的核酸，優(yōu)選poly A+RNA)，通過(guò)使用可與序列的3′和5′末端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或通過(guò)使用對(duì)特定基因序列具有特異性、例如用于從編碼抗體的cDNA文庫(kù)中鑒別cDNA克隆的寡核苷酸探針進(jìn)行克隆來(lái)獲得。通過(guò)PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸隨后可使用本領(lǐng)域熟知的任何方法克隆至可復(fù)制克隆載體中。
一旦確定了抗體的核苷酸序列，抗體的核苷酸序列可使用本領(lǐng)域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術(shù)、定點(diǎn)誘變、PCR等(參見(jiàn)例如上述Sambrook等和Ausubel等編，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY，它們通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中)進(jìn)行操作，以通過(guò)例如在抗體的表位結(jié)合域中或者在可增強(qiáng)或降低抗體生物活性的任何部分中引入氨基酸取代、缺失和/或插入，來(lái)產(chǎn)生具有不同氨基酸序列的抗體。
抗體的重組表達(dá)需要構(gòu)建含有編碼抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體。一旦獲得編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其部分的核苷酸序列，用于生產(chǎn)抗體分子的載體可通過(guò)重組DNA技術(shù)，使用前面各節(jié)討論的本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)?？墒褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法來(lái)構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組?？蓪⒕幋a重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的表位結(jié)合片段、或抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列克隆到這種載體中進(jìn)行表達(dá)。然后，如此制備的表達(dá)載體可被引入到合適的宿主細(xì)胞中以表達(dá)抗體。因此，本發(fā)明包括含有多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼對(duì)本發(fā)明多肽或其片段具有特異性的抗體。
宿主細(xì)胞可用本發(fā)明的兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽。所述兩種載體可含有相同的可選擇標(biāo)記，以使重鏈和輕鏈多肽的表達(dá)相等，或含有不同的可選擇標(biāo)記，以確保維持兩種質(zhì)粒。另外，也可使用編碼和能夠表達(dá)重鏈多肽和輕鏈多肽的單一載體。在這種情況下，輕鏈應(yīng)位于重鏈的前面，以避免出現(xiàn)過(guò)量的有毒游離重鏈(Proudfoot，Nature，32252，1986和Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，772197，1980)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
在另一實(shí)施方案中，抗體也可使用本領(lǐng)域熟知的各種噬菌體展示方法來(lái)產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域被展示在攜帶其編碼多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，這種噬菌體可被用來(lái)展示從所有成分或組合抗體文庫(kù)(例如人的或鼠的)表達(dá)的抗原結(jié)合域，如Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv。表達(dá)結(jié)合目的抗原的抗原結(jié)合域的噬菌體可用抗原來(lái)選擇或鑒定，例如使用標(biāo)記抗原或被結(jié)合或捕捉到固體表面或珠粒的抗原。在這些方法中使用的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13?？乖Y(jié)合域被表達(dá)為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白質(zhì)融合的重組融合蛋白質(zhì)?？捎脕?lái)制備本發(fā)明免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示方法的實(shí)例包括在以下文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法Brinkman等，J.Immunol.Methods，18241-50，1995；Ames等，J.Immunol.Methods，184177-186，1995；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.，24952-958，1994；Persic等，Gene，1879-18，1997；Burton等，Advances in Immunology，57191-280，1994；PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB91/01134；PCT
發(fā)明者陳國(guó)雄, 管軼, J·M·黎國(guó)思, J·S·M·裴偉士, 潘烈文, 袁國(guó)勇, F·C·梁 申請(qǐng)人:香港大學(xué)