專利名稱：光誘導(dǎo)的固定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使蛋白交聯(lián)或固定到載體上的方法。
背景技術(shù)：
分子可被動地通過疏水性或離子相互作用，或通過附著于活化的表面基團(tuán)而共價(jià)地固定到載體或固體表面上。針對用于固相化學(xué)和生物學(xué)篩選的固定的巨大重要性的要求，已經(jīng)廣泛地研究了該技術(shù)的分析用途。該技術(shù)已經(jīng)在生物技術(shù)的許多不同領(lǐng)域，例如診斷、生物傳感器、親和色譜法和ELISA分析中分子的固定中得到廣泛的應(yīng)用。DNA微陣列的最新發(fā)展證實(shí)了固定技術(shù)的價(jià)值，在DNA微陣列中將多重寡核苷酸或cDNA樣品以空間可尋址的方式固定在固體表面上。通過幫助整體分析活生物中的基因表達(dá)，這些陣列已經(jīng)為遺傳學(xué)研究帶來了徹底的改革。已經(jīng)開發(fā)出類似的方法用于蛋白分析，其中僅僅需要少至1皮克的蛋白結(jié)合至微陣列上的各個(gè)點(diǎn)來用于隨后的分析。然后可分析結(jié)合到該微陣列的蛋白的功能或結(jié)構(gòu)特性，從而便于以先前未知的規(guī)模和速度進(jìn)行篩選。另外可使用結(jié)合至固體表面的生物分子來捕獲存在于混合物中的其它未結(jié)合分子。
近年來，為了以有控制的方式使生物分子固定在固體表面上，同時(shí)使結(jié)合部分有最小表面遷移，以及完全保持其天然結(jié)構(gòu)和功能的目的，這種技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)成為深入研究的主題(Veilleux J(1996)IVD Technology，March p.26-31)。最簡單類型的蛋白固定利用了表面與普通蛋白高的固有的結(jié)合親和性。例如蛋白借助于許多弱的聯(lián)系，包括范德華相互作用和氫鍵鍵合相互作用而物理地吸附到疏水性的底物。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是其避免對待結(jié)合的蛋白進(jìn)行修飾。另一方面，如此結(jié)合的蛋白可能不均勻地分布于固體支持物和/或可能是失活的，因?yàn)槔缙渚鄞乜赡軐?dǎo)致在任何隨后的功能測定中活性位點(diǎn)/結(jié)合區(qū)的位阻。
固定的備選方法依賴于利用一些強(qiáng)共價(jià)鍵使蛋白結(jié)合至固體表面(Wilson D.S.，Nock S.，2001，Current Opinion in ChemicalBiology 681-85)。實(shí)例包括使生物素?；牡鞍坠潭ǖ酵坑墟溍箍股锼氐闹С治锷希约笆购芯劢M氨酸序列的His-標(biāo)記的蛋白固定至螯合Ni2+的支持物上?？捎糜诟街谶m當(dāng)表面的蛋白表面上的其它官能團(tuán)包括借助于席夫堿使胺與醛反應(yīng)、使胺基與具有戊二醛的胺表面交聯(lián)以形成肽鍵、使存在于蛋白和支持物表面上的羧酸基團(tuán)與碳二亞胺交聯(lián)、以在2個(gè)硫醇基之間形成二硫鍵和在硫醇基和金表面之間形成硫醇-Au鍵為基礎(chǔ)的交聯(lián)。
胺偶聯(lián)是廣泛使用的固定化學(xué)方法。N-羥基琥珀酰亞胺酯由羧甲基葡聚糖基質(zhì)的羧基部分經(jīng)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)在水中進(jìn)行反應(yīng)而形成，其然后自發(fā)地與蛋白上的胺基反應(yīng)以形成共價(jià)鍵(Johnsson B.，等人，1991，Anal Biochem 198268-77)。固定后，用1M乙醇胺氫氯化物使支持物上未反應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺酯失活以封閉沒有結(jié)合蛋白的區(qū)域。該方法是繁重的，這是因?yàn)橥ǔＴ陂_始下一步驟之前必須除去在化學(xué)固定方法的每個(gè)步驟中所使用的試劑。
Veilleux J(1996)(見上文)描述了經(jīng)二硫鍵固定生物分子的方法。用弱還原劑，例如二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇或三(2-羧乙基)膦氫氯化物處理蛋白樣品以還原半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，然后其結(jié)合至涂覆有順丁烯二酰亞胺的支持物表面。備選地可用2-亞氨氫氯化硫醇(Traut氏試劑)修飾蛋白上的伯胺基團(tuán)以導(dǎo)入新的巰基，此后將其固定至順丁烯二酰亞胺表面。顯示經(jīng)二硫鍵將蛋白固定在金底物上可用于來自楊樹的Cupredoxin蛋白質(zhì)體藍(lán)素(Andolfi，L.等人2002，Arch.Biochem.Biophys.39981-88)。因?yàn)樵摰鞍兹狈Χ蜴I，所以用Cys同時(shí)取代表面暴露的殘基Ile21和Glu25。從純化的突變質(zhì)體藍(lán)素的3D晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)了在插入的半胱氨酸之間形成二硫鍵。在細(xì)菌中胞內(nèi)表達(dá)的突變質(zhì)體藍(lán)素在細(xì)胞質(zhì)中暴露于還原環(huán)境，從而使得插入的半胱氨酸被還原，并且因此可介導(dǎo)分離的蛋白直接吸附到金底物上。因此蛋白的硫醇基結(jié)合特性依賴于蛋白表面上半胱氨酸殘基的體內(nèi)或體外化學(xué)還原。
已經(jīng)描述了用于核糖核酸酶(RNA酶)的、使硫醇基團(tuán)結(jié)合特性工程化進(jìn)入蛋白內(nèi)的備選方法，該核糖核酸酶具有4個(gè)必需的胱氨酸(Sweeney，R.Y.等人2000 Anal Biochem.286312-314)。在這種情況下單個(gè)半胱氨酸殘基取代了Ala19，其位于RNA酶A的N-末端附近的表面環(huán)中。表達(dá)的RNA酶中的半胱氨酸作為與2-硝基-5-硫代苯甲酸的混合二硫化物而受到保護(hù)。隨后用過量的二硫蘇糖醇去保護(hù)后，RNA酶與附著于交聯(lián)的瓊脂糖樹脂的碘乙酰基偶聯(lián)而不喪失酶活性。此外，制備用于固定的蛋白需要其暴露于保護(hù)劑和去保護(hù)劑中，這可能負(fù)面影響其天然結(jié)構(gòu)和/或功能。
US 6,350,368中描述了用于將依賴FAD的酶偶聯(lián)到電極上的方法，由此脫輔基酶與共價(jià)鍵合至能夠化學(xué)締合(例如通過硫醇基)或附著于電極(例如金)表面上的結(jié)合部分的功能化FAD復(fù)合。進(jìn)一步用電子介體基團(tuán)使固定的FAD-酶復(fù)合物功能化并且可將其用于使分析物或光信號變形的電化學(xué)系統(tǒng)。
也已經(jīng)研究了光誘導(dǎo)的固定技術(shù)，導(dǎo)致將醌化合物用于光化學(xué)連接至包含碳的支持物上(EP0820483)。用紫外光至可見光范圍中的非電離的電磁輻射輻照后發(fā)生活化?？墒褂谜诒挝飦砘罨С治锏哪承﹨^(qū)域以用于隨后的生物分子附著。照射光化學(xué)活化的化合物后，蒽醌將作為自由基發(fā)生反應(yīng)并且與聚合物表面形成穩(wěn)定的醚鍵。由于在天然的生物分子中沒有發(fā)現(xiàn)蒽醌，所以必須將適當(dāng)?shù)呐潴w導(dǎo)入生物分子。就蛋白而言，附加的樣品制備步驟可能需要熱化學(xué)偶聯(lián)至醌而且可能不是位點(diǎn)特異性的。
在US 5,412,087和US 6406844中公開了光誘導(dǎo)的固定技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其中描述了用于制備結(jié)合至底物的接頭的方法。給接頭分子的末端提供用光可除去的保護(hù)基，例如硝基芳族化合物保護(hù)的反應(yīng)性官能團(tuán)。曝光后，保護(hù)基被丟失，并且接頭可在其氨基或羧基末端與單體，例如氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。此外該單體本身可攜帶相似的光可除去的保護(hù)基，其也可在隨后的反應(yīng)周期期間通過光被取代。該方法具有特定的固相合成應(yīng)用，但是不便于蛋白與支持物的定向結(jié)合。
在US 3,959,078中公開了用于固定酶的具有熱化學(xué)和光化學(xué)功能性取代基的雙官能試劑。描述了芳基疊氮化物(arylazide)的衍生物，其使得疊氮基能夠與酶和與固相支持物熱化學(xué)反應(yīng)的取代基進(jìn)行光介導(dǎo)的活化和共價(jià)偶聯(lián)。通過該方法不能控制所固定的酶分子的方向。
在WO 91 16425和Collioud A等人(1993)Bioconjugate Chem.4528-536中描述了利用異雙官能的濕潤劑N-[間-[3-(三氟甲基)二氮雜環(huán)丙烷-3-基]苯基]-4-順丁烯二酰亞胺丁酰胺(N-[m-[3-(trifluoromethyl)diazirin-3-yl]phenyl]-4-maleimidobutyramine)將蛋白定向地、光依賴性地、共價(jià)固定在固體支持物上的方法。這種交聯(lián)試劑的芳基二氮雜環(huán)丙烷(aryldiazirine)官能可以促進(jìn)光依賴性的、卡賓介導(dǎo)的、共價(jià)鍵合至惰性支持物或生物分子，例如蛋白、碳水化合物和核酸。交聯(lián)劑的順丁烯二酰亞胺官能使得能夠通過半胱氨酸硫醇的熱化學(xué)修飾而結(jié)合至硫醇化表面?？赏ㄟ^順丁烯二酰亞胺官能和蛋白表面上暴露的硫醇基之間的熱化學(xué)相互作用來獲得交聯(lián)試劑與蛋白的定向結(jié)合，然而這種處理可能修飾靶蛋白的結(jié)構(gòu)和活性。然而，交聯(lián)試劑經(jīng)卡賓官能與蛋白的光誘導(dǎo)共價(jià)偶聯(lián)的缺點(diǎn)是其不能提供靶蛋白有控制的方向。
對于大多數(shù)描述的固定方法，其共同點(diǎn)在于使用一種或多種熱化學(xué)/化學(xué)步驟，有時(shí)用危險(xiǎn)的化學(xué)品，其中一些很可能對結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和/或功能具有有害效應(yīng)?，F(xiàn)有的方法經(jīng)常是侵入性的，由此將外來的基團(tuán)導(dǎo)入蛋白以起官能團(tuán)的作用，這會導(dǎo)致蛋白變性，以及降低其生物活性和底物特異性。
在蛋白偶聯(lián)和固定的領(lǐng)域中需要改善偶聯(lián)的方法，其中保持了偶聯(lián)或固定成分的結(jié)構(gòu)和功能特性并且可控制偶聯(lián)的方向。
發(fā)明概述本發(fā)明提供使蛋白或肽經(jīng)穩(wěn)定的鍵(共價(jià)鍵或硫醇-Au鍵)偶聯(lián)在載體上，同時(shí)保持偶聯(lián)蛋白或肽的天然結(jié)構(gòu)和功能特性，并且避免使用一種或多種化學(xué)品的步驟的方法。這與用于蛋白固定的傳統(tǒng)偶聯(lián)方法形成對照，傳統(tǒng)方法一般包括幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)，其可能是昂貴的、費(fèi)時(shí)的以及對結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)/功能有害。此外可控制根據(jù)本發(fā)明的方法所偶聯(lián)的蛋白或肽的方向，以使得保存其特性，例如酶特性。比較起來，大部分已知的蛋白偶聯(lián)方法導(dǎo)致蛋白以隨機(jī)的方向固定在載體上，其伴隨有降低生物活性和增加檢測極限的顯著風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明利用蛋白和肽的固有性質(zhì)，其中在用可被芳族氨基酸吸收的光長時(shí)間輻照后，蛋白或肽中鄰近芳族氨基酸殘基的二硫鍵破壞。然后使用由蛋白或肽中光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞產(chǎn)生的硫醇基來將蛋白或肽固定至載體。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供使包含二硫鍵的蛋白或肽偶聯(lián)在載體上的方法，包括下列步驟輻照蛋白或肽而產(chǎn)生硫醇基，以及將輻照的蛋白或肽與能夠結(jié)合硫醇基的載體溫育。此外，通過使蛋白或肽與能夠結(jié)合硫醇基的載體一起溫育，和在載體存在時(shí)輻照蛋白或肽以在蛋白或肽中產(chǎn)生硫醇基，由此獲得與載體上的硫醇配體結(jié)合基團(tuán)的偶聯(lián)，而使本發(fā)明所述的偶聯(lián)成為可能。根據(jù)這種偶聯(lián)或固定的方法，輻照包括激發(fā)一種或多種芳族氨基酸的波長的光。蛋白中輻照的芳族氨基酸可包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，或備選地芳族氨基酸是色氨酸。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，輻照包括在295nm、254nm或275nm附近的波長。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，輻照的蛋白或肽偶聯(lián)到包括肽或蛋白或任何其它生物分子的載體上。備選地，輻照的蛋白或肽與包括金的支持物、或是用硫醇結(jié)合基團(tuán)衍生化的支持物、或包括硫醇基或二硫鍵的支持物偶聯(lián)，其中與支持物的偶聯(lián)可能是一種固定。任選地載體或支持物包括間隔區(qū)。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供包括根據(jù)使蛋白或肽偶聯(lián)在載體上的公開方法所產(chǎn)生的偶聯(lián)蛋白或肽的載體或支持物。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，根據(jù)使蛋白或肽偶聯(lián)在載體上的公開方法偶聯(lián)的蛋白或肽包括酶、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白結(jié)構(gòu)域、抗原、抗體或結(jié)合蛋白以及其它的蛋白或肽。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，根據(jù)使蛋白或肽偶聯(lián)在載體上的公開方法偶聯(lián)的載體包括制藥學(xué)上的藥物。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面是包括根據(jù)使蛋白或肽偶聯(lián)在載體上的公開方法所產(chǎn)生的偶聯(lián)蛋白的載體或支持物用于生物功能性測定或用于提供生物功能性測定的試劑盒中的用途。這種用于生物功能性測定的用途包括生物傳感器、色譜法、免疫檢測、酶測定、核苷酸結(jié)合檢測、蛋白-蛋白相互作用、蛋白修飾、載體靶向或蛋白靶向。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，提供用于鑒定能夠通過輻照破壞的包含二硫鍵的蛋白或肽的方法。
附圖簡述

圖1顯示作為295nm處照射時(shí)間的函數(shù)的350nm處角質(zhì)酶的熒光發(fā)射強(qiáng)度。
圖2顯示蛋白的SH基團(tuán)和5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)的SS基團(tuán)之間的偶聯(lián)反應(yīng)以及硝基硫代苯甲酸鹽(NTB)的化學(xué)計(jì)量釋放。
圖3顯示作為295nm處照射時(shí)間的函數(shù)的角質(zhì)酶在350nm處的Trp熒光(F)發(fā)射強(qiáng)度的增加[F/Fo](實(shí)線)和在角質(zhì)酶樣品中隨熒光發(fā)射增加的特異比率[F/Fo]新形成的游離硫醇基的濃度(空心圓形)。
圖4顯示在(A)于25℃沒有DTT[實(shí)心圓形]；(B)于70℃沒有DTT[實(shí)心黑線]；(C)加熱至70℃并冷卻至25℃后，于25℃沒有DTT[空心圓形]；(D)加熱至70℃，加入DTT并冷卻至25℃，于25℃具有DTT[實(shí)心灰線]的溫育期間在用295nm光激發(fā)后，1μM角質(zhì)酶溶液的熒光發(fā)射光譜。
圖5顯示在pH7.0的水溶液中芳族氨基酸殘基的光譜特性。
圖6顯示分子內(nèi)猝滅的探針Bodipy FL-L-胱氨酸的結(jié)構(gòu)，在存在游離的SH基團(tuán)時(shí)其SS鍵破壞，結(jié)果形成Bodipy基團(tuán)的熒光。
圖7顯示通過與Bodipy FL-L-胱氨酸反應(yīng)，在296nm處紫外光照射之前和之后，蛋白樣品中游離SH基團(tuán)的檢測。顯示了經(jīng)以下處理的突變角質(zhì)酶(W69A)(A)；天然角質(zhì)酶(B)蛋白樣品的Bodipy基團(tuán)熒光發(fā)射光譜未照射和減去Bodipy探針( )；未照射且具有Bodipy探針(●)，以及具有bodipy的照射(○)的處理。
圖8顯示通過與Bodipy FL-L-胱氨酸反應(yīng)，在296nm處紫外光照射之前和之后，蛋白樣品中游離SH基團(tuán)的檢測。顯示了經(jīng)以下處理的雞卵清溶菌酶(lysosyme)(A)；雪白根霉(Rhizopus niveus)甘油三酯脂酶(B)；人纖溶酶原(C)；人胎盤堿性磷酸酶(D)；凝乳酶(E)；人免疫球蛋白(F)蛋白樣品的Bodipy基團(tuán)熒光發(fā)射光譜未照射且減去Bodipy探針；未照射且具有Bodipy探針；以及具有bodipy的照射的處理。
圖9顯示8半徑內(nèi)的不同空間Trp S-S三聯(lián)體附近球形的等值線圖表。沿著X軸繪制不同的三聯(lián)體，并且根據(jù)其與角質(zhì)酶三聯(lián)體(1cex；分等級為No.1)的相似性分等級，以及沿著Y軸繪制不同殘基組。＞1的分值是指殘基/組是過表現(xiàn)(over-represented)的，而＜1的分值是指殘基/組是欠表現(xiàn)(under-represented)的。
圖10顯示8半徑內(nèi)的不同空間Trp S-S三聯(lián)體附近球形的等值線圖表。沿著X軸繪制不同的三聯(lián)體，并且根據(jù)其與角質(zhì)酶三聯(lián)體(1cex；分等級為No.1)的相似性分等級，以及沿著Y軸繪制不同殘基組。＞1的分值是指殘基/組是過表現(xiàn)的，而＜1的分值是指殘基/組是欠表現(xiàn)的。在該分析中包括α-乳清蛋白中的2個(gè)Trp S-S三聯(lián)體，其中發(fā)現(xiàn)當(dāng)紫外光輻照時(shí)，Trp60-Cys73-Cys91是可破壞的，而Trp118-Cys28-Cys111不是可破壞的。
圖11顯示在存在于免疫球蛋白的IGG1三聯(lián)體A中鑒定的8半徑內(nèi)不同空間Trp S-S三聯(lián)體附近球形的等值線圖等。沿著X軸繪制不同的三聯(lián)體，并且根據(jù)其與角質(zhì)酶三聯(lián)體(1cex；分等級為No.1)的相似性分等級，以及沿著Y軸繪制不同殘基組。＞1的分值是指殘基/組是過表現(xiàn)的，而＜1的分值是指殘基/組是欠表現(xiàn)的。
圖12顯示在存在于免疫球蛋白的IGG1三聯(lián)體B中鑒定的8半徑內(nèi)不同空間Trp S-S三聯(lián)體附近球形的等值線圖表。沿著X軸繪制不同的三聯(lián)體，并且根據(jù)其與角質(zhì)酶三聯(lián)體(1cex；分等級為No.1)的相似性分等級，以及沿著Y軸繪制不同殘基組。＞1的分值是指殘基/組是過表現(xiàn)的，而＜1的分值是指殘基/組是欠表現(xiàn)的。
圖13顯示，在SH-活化的石英載玻片上固定角質(zhì)酶期間，在296nm處的連續(xù)或限制照射下，在TIRF流動池中檢測的在296nm處激發(fā)時(shí)，在330nm處的熒光發(fā)射的時(shí)程。步驟A中用2.0μM的角質(zhì)酶溶液沖洗流動室；步驟B將流動室與2.0μM角質(zhì)酶溶液溫育；步驟C/D用緩沖液A漂洗流動室；以及步驟E用去污劑和緩沖液A漂洗流動室。
圖14A顯示在SH-活化的或羥基化的石英載玻片上固定的天然角質(zhì)酶，在連續(xù)或限制照射下的最終熒光發(fā)射強(qiáng)度(在330nm處，在296nm處激發(fā)時(shí))。B顯示在SH-活化的石英載玻片上固定的天然角質(zhì)酶和突變角質(zhì)酶(W69A)，在連續(xù)光照或在黑暗中的最終熒光發(fā)射強(qiáng)度(在330nm處，在296nm處激發(fā)時(shí))。
圖15顯示被紫外光照射的、經(jīng)固定在SH-活化的或羥基化的石英載玻片上的角質(zhì)酶水解的丁酸4-甲基傘形酯(4-methylumbelliferylbutyrate)的熒光發(fā)射強(qiáng)度(在450nm處，在365nm處激發(fā)時(shí))。
圖16顯示在296nm處連續(xù)照射10分鐘(A)，或連續(xù)照射(C)和在黑暗中(B)時(shí)，在(A)溶菌酶、(B)溶菌酶和(C)凝乳酶固定于SH-活化的或羥基化的石英載玻片上期間，在TIRF流動池中檢測的在296nm處激發(fā)，在330nm處的熒光發(fā)射的時(shí)程。
在圖16A、B和C中，在步驟(a/A)中用蛋白(溶菌酶或凝乳酶)溫育流動室10分鐘(最初沖洗/流動6.66分鐘)；在步驟(b/B)中用緩沖液洗滌流動室10分鐘(最初沖洗/流動6.66分鐘)；在步驟(c/C)中用Helmanex，2％ pH10-11，洗滌流動室4-5分鐘(最初沖洗/流動3.33分鐘)；以及在步驟(d/D)中用緩沖液洗滌流動室以保持讀取(最初流動3.33分鐘)。
圖17A顯示作為在296nm處照射或置于實(shí)驗(yàn)室光下的函數(shù)的角質(zhì)酶樣品(與置于黑暗中的樣品相比)的相對活性。B顯示在存在5.1mM DTT(●，●)或沒有DTT(○)時(shí)角質(zhì)酶樣品的相對活性。沒有DTT的樣品在300分鐘的數(shù)據(jù)點(diǎn)是在1600分鐘測量的。
定義如在此所使用的，術(shù)語“紫外光”或“輻照”或“紫外光照射”或“紫外光輻照”是紫外光的波長范圍或單個(gè)波長，或用于多光子激發(fā)的紅外(IR)/可見光，其特異地激發(fā)芳族氨基酸，或可模仿芳族氨基酸的其它芳族系統(tǒng)，優(yōu)選大約295nm、275nm或254nm的波長，更優(yōu)選激發(fā)色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的波長，最優(yōu)選激發(fā)色氨酸的波長295nm。
如在此所使用的術(shù)語“蛋白”包括多肽、蛋白的片段和抗體或任何其它基于氨基酸的材料。此外術(shù)語“蛋白”包括酶、抗體、抗原、轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)合蛋白，例如DNA結(jié)合蛋白、或蛋白結(jié)構(gòu)域。
如在此所使用的，術(shù)語“空間鄰近”涉及組合物內(nèi)2個(gè)化學(xué)基團(tuán)之間的物理距離，從而三維接近的基團(tuán)被認(rèn)為是空間鄰近的。如果輻照后芳族氨基酸吸收激發(fā)能量，那么蛋白中空間鄰近芳族殘基的二硫鍵可以起猝滅劑的作用。空間鄰近色氨酸殘基并且可能起猝滅劑作用的二硫鍵的半個(gè)胱氨酸之間的物理距離可以是但不限于1至10的范圍。
如在此所使用的，術(shù)語“載體”可以是可溶性化合物或聚合物，或不溶性化合物或聚合物，其中化合物或聚合物包括硫醇結(jié)合配體，例如能夠與輻照誘導(dǎo)的硫醇基偶聯(lián)的反應(yīng)性SH或SS鍵。術(shù)語載體也可以是另一種生物分子，例如另一種蛋白、肽或多肽。此外術(shù)語“載體”應(yīng)理解為包括包含能夠與輻照誘導(dǎo)的硫醇基偶聯(lián)的材料的支持物，例如金支持物或攜帶硫醇結(jié)合配體的衍生化支持物。
如在此所使用的，術(shù)語“支持物”可以是任何支持物材料，例如電子芯片、載玻片、晶片、顆粒、樹脂、孔、管或膜，其包括但不限于包括聚合物的任何材料，例如黃玉、聚苯乙烯、聚乙烯、聚酯、聚醚酰亞胺(polyethermides)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯[PMMA]、聚偏1，1-二氟乙烯[PVDF]、硅氧烷；金剛石；玻璃，例如石英和硅石；硅，例如硅晶片；金屬；膜，例如尼龍膜、硝化纖維素濾器；多孔材料，例如凝膠、瓊脂糖或纖維素；陶瓷等，此外其包括有或沒有插入間隔區(qū)而便于結(jié)合硫醇基的支持物所有形式的衍生物。
如在此所使用的，術(shù)語“間隔區(qū)”包括一系列的化合物，其目的是提供蛋白和載體之間的連接或使固定的蛋白高出支持物的表面。
如在此所使用的，術(shù)語“制藥學(xué)上的藥物”包括旨在用于診斷、治愈、緩解、治療或預(yù)防人或其它動物的疾病的制品；和旨在影響人或其它動物身體的結(jié)構(gòu)或任何功能的制品(除了食品外)，以及旨在用作任何上述指定的制品的成分的制品。
如在此所使用的，術(shù)語“生物功能測定”包括生物傳感器、免疫檢測、酶測定、核苷酸結(jié)合檢測、色譜法、蛋白-蛋白相互作用、蛋白修飾、載體靶向或蛋白靶向。
如在此所使用的，術(shù)語“生物傳感器”包括整合生物學(xué)或生物學(xué)衍生的敏感元件，例如氨基酸(例如半胱氨酸)、蛋白、抗體、核酸、微生物或細(xì)胞的分析設(shè)備。敏感元件是整合在物理化學(xué)轉(zhuǎn)換器內(nèi)或與物理化學(xué)轉(zhuǎn)換器緊密相關(guān)的。生物傳感器的總體目的是產(chǎn)生與單個(gè)分析物或一組相關(guān)分析物成比例的離散或連續(xù)的數(shù)字電子信號。
發(fā)明詳述本發(fā)明利用蛋白的固有特性，考慮到了蛋白中輻照誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化，且所述變化被認(rèn)為可延遲其光降解作用。當(dāng)?shù)鞍妆┞队谧贤夤廨椪諘r(shí)，一些二硫鍵破壞形成活化的硫醇。盡管通常在結(jié)構(gòu)性的核心中和接近折疊蛋白的表面/在折疊蛋白的表面上存在二硫鍵，接近芳族氨基酸的二硫鍵對紫外光誘導(dǎo)的破壞是最敏感的。在蛋白暴露于紫外光期間，由芳族氨基酸殘基側(cè)鏈所吸收的能量被轉(zhuǎn)移到鄰近的二硫鍵，其起猝滅劑的作用(Neves-Petersen MT.，等人，2002，ProteinScience 11588-600)。然而，轉(zhuǎn)移到二硫鍵的能量流動和可能形成的中間化學(xué)產(chǎn)物，例如在光激發(fā)樣品后形成的自由基/離子最終用來觸發(fā)其破壞。蛋白中二硫鍵以空間鄰近色氨酸的方式存在經(jīng)常是天然存在的，表明光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞是廣泛的現(xiàn)象(Petersen MTN.，等人，1999，Protein Engineering 12535-548；Neves-PetersenMT等人，2002，Protein Science 11588-600；Vanhooren A等人2002，Biochemistry 10；41(36)11035-11043)。
用于將蛋白定向固定在載體上的這種輻照誘導(dǎo)現(xiàn)象的開發(fā)是本發(fā)明的基礎(chǔ)。來自真菌豌豆腐皮鐮孢(Fusarium solani pisi)的角質(zhì)酶，是用來說明光誘導(dǎo)的二硫鍵還原及將其固定在載體上的方法的幾種模式蛋白之一，然而本發(fā)明的應(yīng)用決不僅限于模式蛋白。角質(zhì)酶是能夠降解存在于植物葉子表面上的不溶性脂類聚酯基質(zhì)角質(zhì)的脂解酶。角質(zhì)酶是工業(yè)上重要的酶，并且建議將其摻入用于除去脂肪的去污劑中。其具有2個(gè)二硫鍵；一個(gè)接近活性位點(diǎn)，而一個(gè)在蛋白的相反極的遠(yuǎn)端，非常接近于蛋白的單個(gè)色氨酸殘基。接近活性位點(diǎn)的二硫鍵的化學(xué)還原會使酶失活(Soliday CL，等人，1983，BiochemBiophys Res Commun 1141017-22)。
在其天然構(gòu)象中，豌豆腐皮鐮孢角質(zhì)酶的單個(gè)色氨酸殘基由于存在鄰近的二硫鍵而是高度猝滅的。在295nm延長的選擇性地輻照角質(zhì)酶后，單個(gè)Trp殘基的熒光量子產(chǎn)率隨著鄰近的二硫鍵的破壞而同時(shí)增加。角質(zhì)酶中Trp殘基的量子產(chǎn)率增加反映了二硫鍵的損失及其猝滅激發(fā)態(tài)的Trp殘基的能力。
已知二硫鍵是激發(fā)態(tài)芳族殘基的優(yōu)良猝滅劑。在空間上緊密鄰近的任何芳族殘基都可導(dǎo)致鄰近的二硫鍵的光誘導(dǎo)的破壞。因此蛋白中存在的3種芳族氨基酸，即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，都是光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞的潛在介質(zhì)。當(dāng)用從240nm延伸至300nm波長范圍的光輻照時(shí)，將激發(fā)所有的芳族殘基，單獨(dú)的芳族殘基具有不同的最大吸收值(表1在中性pH獲得的數(shù)據(jù))。
表1
由于芳族氨基酸殘基的激發(fā)光譜只是部分重疊的，所以在單個(gè)或狹窄波長范圍下的蛋白輻照將單獨(dú)的殘基激發(fā)至不同的程度。在295nm處的輻照可用于選擇性地激發(fā)蛋白中的色氨酸殘基。在280nm處的輻照將同時(shí)激發(fā)酪氨酸和色氨酸殘基，然后其可同時(shí)導(dǎo)致光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞。當(dāng)通過多光子激發(fā)進(jìn)行輻照時(shí)，例如當(dāng)進(jìn)行雙光子激發(fā)時(shí)，用具有在單個(gè)光子實(shí)驗(yàn)中所使用光子的一半能量(兩倍波長)的光子(光)輻照樣品。例如，可用295nm處的紫外光，或用在大約690nm波長的雙光子激發(fā)實(shí)現(xiàn)色氨酸的電子激發(fā)。此外激發(fā)的酪氨酸殘基可通過稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制導(dǎo)致鄰近的色氨酸殘基的激發(fā)，其反過來可導(dǎo)致二硫鍵破壞。
對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，可從蛋白的三維結(jié)構(gòu)中各個(gè)二硫鍵的位置和鄰近的氨基酸預(yù)測在所選擇的波長下給定蛋白中二硫鍵的破壞。在空間上與芳族氨基酸殘基鄰近的二硫鍵很可能對紫外光是最不穩(wěn)定的。已經(jīng)檢查了包含空間緊密鄰近的空間三聯(lián)體TrpCys-Cys的蛋白亞群的三維結(jié)構(gòu)，以便鑒定哪些氨基酸位于三聯(lián)體的色氨酸殘基的緊密鄰近位置。這個(gè)分析已經(jīng)鑒定了具有與角質(zhì)酶相似的三聯(lián)體周圍鄰近氨基酸組成的蛋白，其可用于預(yù)測哪些蛋白將具有在紫外光照射后破壞的三聯(lián)體二硫鍵。可用來預(yù)測其是否可能對紫外光誘導(dǎo)的破壞敏感的蛋白中空間TrpSS三聯(lián)體周圍的氨基酸組成特性如下1)芳族氨基酸殘基位于二硫鍵的10內(nèi)；2)預(yù)期芳族Trp側(cè)鏈的發(fā)射偶極平面垂直于二硫鍵吸收偶極平面的那些Trp-SS三聯(lián)體不能在激發(fā)態(tài)Trp和二硫鍵之間交換激發(fā)能量；3)在蛋白的紫外光-可破壞的Trp S-S三聯(lián)體的8半徑內(nèi)存在氨基酸殘基的特異亞群，如對于角質(zhì)酶、溶菌酶、脂酶、纖溶酶原、凝乳酶和α-乳清蛋白，(以及免疫球蛋白-見下文)的證實(shí)的，其不同于一般蛋白中氨基酸存在的平均頻率。在氨基酸的這些特異亞群中，酰胺氨基酸殘基(Asn、Gln)是過表現(xiàn)的，并且在大多數(shù)情況下短脂族殘基(Gly、Ala、Val)和/或長脂族殘基(Leu、Ile)的出現(xiàn)率也是過表現(xiàn)的。
比較8埃圖譜和12埃以及15埃圖譜，可觀察到圖譜的等值線是如何減弱的。亞群的氨基酸組成接近于平均蛋白的組成。對所有3個(gè)圖譜均可作出的現(xiàn)察是在幾乎每個(gè)三聯(lián)體中，存在欠表現(xiàn)的帶電氨基酸組(His、Lys、Arg)(Asp、Glu)和脯氨酸殘基。
免疫球蛋白中位于Trp-SS三聯(lián)體8半徑接近性內(nèi)的氨基酸殘基，具有過表現(xiàn)的包含羥基的氨基酸，而在許多IgG Trp S-S三聯(lián)體中芳族殘基也是過表現(xiàn)的。在許多免疫球蛋白中酰胺氨基酸(Asn、Gln)中的一個(gè)或兩者和脂族殘基出現(xiàn)率也都是過表現(xiàn)的，其中TrpSS空間三聯(lián)體周圍的氨基酸組成非常類似于角質(zhì)酶三聯(lián)體周圍的組成(IGG1三聯(lián)體A組的免疫球蛋白部分)。在這些免疫球蛋白中我們也觀察到欠表現(xiàn)的帶電氨基酸(His、Lys、Arg)(Asp、Glu)和脯氨酸殘基的組。綜合起來，這些參數(shù)可用來鑒定蛋白中哪些二硫鍵能夠光誘導(dǎo)地偶聯(lián)到能夠偶聯(lián)硫醇基的載體上。
這種蛋白之一是山羊α-乳清蛋白，其中位于山羊α-乳清蛋白三聯(lián)體的色氨酸殘基8球形周圍內(nèi)的氨基酸殘基與角質(zhì)酶的是非常相似的。此外，最近已經(jīng)表明在紫外光激發(fā)山羊α-乳清蛋白后，鄰近于色氨酸殘基的二硫鍵破壞并且形成游離的硫醇基(Vanhooren A等人，2002，見上文)。也可能完全根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)，即其氨基酸序列預(yù)測給定蛋白中推定的二硫鍵的紫外光穩(wěn)定性，前提是已知同源蛋白的三維結(jié)構(gòu)并且可用于給定蛋白的三維結(jié)構(gòu)的同源性建模。
也顯而易見的是重組DNA技術(shù)的已知方法可用于將氨基酸取代導(dǎo)入蛋白序列中，以產(chǎn)生附加的光可破壞的二硫鍵。這種取代可將色氨酸殘基或其它的芳族氨基酸殘基導(dǎo)入蛋白，使其空間鄰近于內(nèi)源的或重組工程化的二硫鍵，或備選地可將二硫鍵以空間接近內(nèi)源芳族殘基的方式導(dǎo)入。備選地可將芳族和二硫鍵同時(shí)以彼此空間接近的方式導(dǎo)入。用295nm的光輻射是優(yōu)選的，因?yàn)槠淙菰S選擇性地激發(fā)蛋白中的色氨酸殘基，其反過來可導(dǎo)致單個(gè)或有限數(shù)目的二硫鍵破壞。用于光誘導(dǎo)二硫鍵破壞、適于在一定波長范圍內(nèi)輻照蛋白的各種光源包括但不限于研究級的分光計(jì)，例如RTC PTI分光計(jì)的75-W氙弧光燈、氘燈、高壓汞燈。可通過使光源與單色儀偶聯(lián)來獲得單個(gè)波長下的輻照。單個(gè)和多光子激發(fā)的來源包括高峰值功率脈沖的或連續(xù)波(CW)激光器。
光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞后在蛋白中形成新的硫醇基?？赏ㄟ^基于5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)[DTNB]的測定測量其新生(denovo)外觀。就角質(zhì)酶來說，在295nm處輻照，檢測到平均每個(gè)照射的蛋白形成的一個(gè)硫醇基。在天然角質(zhì)酶中沒有游離的硫醇，而鄰近于單個(gè)色氨酸殘基的二硫化物的破壞只產(chǎn)生一個(gè)易接近溶劑的、可通過這種方法檢測的硫醇。在蛋白上形成的光誘導(dǎo)的易接近的硫醇基將結(jié)合任何硫醇結(jié)合配體或載體上的游離硫醇基。
這種偶聯(lián)至載體的方法可用于構(gòu)建各種類型的二硫化物連接的寡聚物或聚合物。可將給定蛋白或肽或其它生物分子中的光誘導(dǎo)的硫醇基與包括肽或蛋白的載體偶聯(lián)。只要偶聯(lián)反應(yīng)中蛋白和載體分子的濃度足夠高，就將在相鄰的分子之間發(fā)生基于SS的交聯(lián)。當(dāng)光誘導(dǎo)的蛋白包含SS橋時(shí)，擁有空間鄰近的芳族殘基不是必需的，因?yàn)榭赏ㄟ^向偶聯(lián)反應(yīng)加入芳族殘基，或可模擬它們的化合物而提供對該反應(yīng)的芳族影響。
這種將光誘導(dǎo)的硫醇與載體偶聯(lián)的方法可有效地應(yīng)用于其它類型的載體分子，例如制藥學(xué)上的藥物，以便于促進(jìn)其有效的遞送。例如，使包含二硫鍵的水溶性分子(包括但不限于肽或蛋白)經(jīng)光誘導(dǎo)硫醇與藥物偶聯(lián)可幫助不溶于水、微溶于水或疏水性藥物的溶解作用和遞送。此外偶聯(lián)于藥物的分子可用來保護(hù)藥物遠(yuǎn)離其生理環(huán)境，由此改善其體內(nèi)穩(wěn)定性。這種特定的特性使得這種技術(shù)對于遞送例如蛋白這樣的不穩(wěn)定藥物是很有吸引力的。通過在治療位點(diǎn)進(jìn)行植入，偶聯(lián)分子的藥物的定位遞送將減少患者對于藥物的全身性暴露。一般將載體連接的前體藥物定義為包含使給定的活性物質(zhì)與瞬時(shí)載體基團(tuán)暫時(shí)連接的前體藥物，所述載體基團(tuán)可產(chǎn)生改善的物理化學(xué)或藥物動力學(xué)特性，且通?？赏ㄟ^水解切割在體內(nèi)容易地除去該載體。在本發(fā)明中，使藥物連接分子的光介導(dǎo)的二硫鍵破壞可用于從植入患者中的分子偶聯(lián)形式實(shí)現(xiàn)活性藥物的控釋。這將使藥物遞送至患者的頻率最小化，并且提供光控制的施藥。我們也可通過只照射其中必須釋放藥物的身體區(qū)域而使藥物遞送過程最優(yōu)化。這些特性將改善患者的順應(yīng)性，特別是用于慢性適應(yīng)癥、需要頻繁注射的藥物(例如某些蛋白或代謝物的缺陷)。就經(jīng)皮的藥物遞送來說，可在紅外光的穿透范圍內(nèi)，通過紅外光(借助于雙光子激發(fā))誘導(dǎo)控制的藥物釋放，而更大的紫外光(或借助于三光子激發(fā)的紅外光)穿透將促進(jìn)藥物在患者內(nèi)更深地釋放。同樣，如在PDT(光動力學(xué)療法)中所使用的，例如在癌癥/腫瘤患者的治療中，利用光學(xué)纖維使得能夠在身體內(nèi)以各種深度遞送光。由于暴露于溶劑的二硫鍵可在還原的環(huán)境中破壞，所以當(dāng)與藥物偶聯(lián)的載體進(jìn)入例如細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)間隙的還原環(huán)境時(shí)也可釋放藥物。
這種光誘導(dǎo)硫醇偶聯(lián)的方法也可用于將蛋白固定到支持物上。在偶聯(lián)至支持物期間形成的鍵的最常見類型是二硫鍵和硫-金屬鍵(主要是硫-金)，其中可形成自組裝的層。因?yàn)閮煞N類型的鍵都是穩(wěn)定的，所以固定后徹底的洗滌不會取代該蛋白?？赏ㄟ^改變蛋白濃度、或紫外光輻照的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，以及隨后用例如L-半胱氨酸、(2-(2-吡啶基二硫代)乙烷胺(ethaneamine)氫氯化物(PDEA)的試劑或用硫醇-脂雙分子層封閉表面上剩余的活化的硫醇基來控制支持物上蛋白的密度(Hong Q.，等人，2001，Biochemical SocietyTransactions 29(4)587-582)。因此封閉具有均勻分布的固定蛋白的支持物以防止非特異的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，固定的方法不包括任何化學(xué)步驟，因?yàn)橥ㄟ^紫外光輻射形成的硫醇活化的蛋白在支持物上自發(fā)地自組裝。所述的硫醇和二硫化物的交換反應(yīng)是使分子結(jié)合至支持物的有效和快速的方法。本發(fā)明的特殊優(yōu)點(diǎn)是其避免了與蛋白中游離硫醇的化學(xué)產(chǎn)生相關(guān)的幾個(gè)缺點(diǎn)。如實(shí)施例10中所示，通過用于產(chǎn)生游離硫醇的還原劑(DTT或β-巰基乙醇)使一些蛋白，例如角質(zhì)酶失活。如果使用包括硫醇基的還原劑在蛋白中化學(xué)產(chǎn)生游離的硫醇，那么必須在進(jìn)行固定前將其除去，在該步驟期間可重新形成二硫鍵。備選的還原劑，例如缺乏硫醇基的2-羧乙基)膦具有與其它基團(tuán)反應(yīng)的缺點(diǎn)。另外利用還原劑破壞二硫鍵還具有關(guān)于其化學(xué)穩(wěn)定性及其還原活性依賴于pH的缺點(diǎn)。
也可空間地控制支持物上蛋白的固定。目前激光技術(shù)容許具有1微米或更小尺寸的焦點(diǎn)。如果將包含SS橋的特殊蛋白或靶分子與結(jié)合硫醇的支持物溫育，那么光誘導(dǎo)的硫醇基的形成和偶聯(lián)就可限于照射的焦點(diǎn)。應(yīng)控制溶液的粘度以使得可能使照射的分子分散超過斑點(diǎn)大小的擴(kuò)散過程最小化。這種方法將使得可識別的和不同的分子能夠非常致密地堆積在支持物表面上。因此本發(fā)明的方法可用于用分子加載微陣列。
在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，可以以均一的和可重復(fù)的方式控制固定蛋白的方向。在蛋白中延長的色氨酸殘基的選擇性激發(fā)將只導(dǎo)致破壞被轉(zhuǎn)移激發(fā)能量的二硫鍵。可從蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測光可破壞的二硫鍵從而形成游離硫醇基的位置，其中從三維模型、核磁共振(NMR)或X射線衍射晶體學(xué)分析了解蛋白結(jié)構(gòu)。在通過輻照蛋白中的色氨酸殘基只誘導(dǎo)單個(gè)硫醇基的情況中，如對于角質(zhì)酶的情況，則將唯一地借助于這個(gè)硫醇基發(fā)生蛋白在支持物上的固定。與二硫鍵破壞和硫醇基形成的備選方法，例如利用還原劑的方法相反，本發(fā)明的光誘導(dǎo)方法導(dǎo)致二硫鍵的靶向破壞，從而形成一個(gè)或只有一些可準(zhǔn)確地預(yù)測其位置的易接近硫醇基。因此隨后固定的蛋白將具有單一或非常有限數(shù)目的方向。因?yàn)榻琴|(zhì)酶只有單個(gè)用于固定的遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的硫醇基，所以通過固定不會限制底物的易接近性。與角質(zhì)酶和溶菌酶的情況一樣，借助于遠(yuǎn)離蛋白活性位點(diǎn)的表面易接近的硫醇基的固定也不大可能改變蛋白的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)特性。換言之，本發(fā)明的固定方法可用來保持固定蛋白的天然狀態(tài)。在根據(jù)本發(fā)明方法以相同方向被固定的蛋白上進(jìn)行的所有功能/結(jié)構(gòu)測定，將產(chǎn)生來源于蛋白均一群體的數(shù)據(jù)。被固定的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的一致性及其天然狀態(tài)的保持對于篩選或測定蛋白的催化、結(jié)合或任何其它生物學(xué)特性具有第一重要性，并且提供了本發(fā)明的許多有價(jià)值的優(yōu)點(diǎn)之一。就具有抗微生物特性的蛋白，例如溶菌酶來說，能夠使所述的蛋白固定到表面上(例如，食物、皮膚、包裝)以防止微生物生長和感染是有用的。
在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，可破壞使蛋白固定至支持物的鍵，從而使蛋白釋放到溶液中。這對于二硫鍵，以及硫醇金屬鍵都是可能的。
可以用與破壞其中芳族氨基酸在空間上鄰近的蛋白上二硫鍵相同的方式，例如用紫外光輻照破壞蛋白和支持物之間的二硫鍵。芳族氨基酸可位于被固定的蛋白本身上，或以芳族氨基酸，例如色氨酸溶液的形式提供，以應(yīng)用于支持物表面。已知通過大約254nm的光使二硫化物鍵(SS)本身破壞。備選地，可用(二硫蘇糖醇)DTT或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它還原劑使蛋白和支持物之間的二硫鍵破壞。固定鍵破壞后，可純化釋放的蛋白，必要時(shí)可將其用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面是通過用O2-等離子體(plasma)處理或Piranha除去經(jīng)硫醇Au鍵固定的蛋白而使金表面再生，由此除去金表面的包括蛋白的表層。
實(shí)施例實(shí)施例1紫外光照射后在角質(zhì)酶中形成游離的硫醇基利用分離自豌豆腐皮鐮孢的具有脂酶/酯酶特性的角質(zhì)酶檢查紫外光照射后蛋白中二硫鍵的破壞。
角質(zhì)酶的穩(wěn)定態(tài)熒光發(fā)射強(qiáng)度在下列條件下，使角質(zhì)酶制劑受到295nm的紫外光輻照以追蹤其連續(xù)照射的穩(wěn)態(tài)的熒光發(fā)射強(qiáng)度在石英大比色杯(1cm光程長度)中，在295nm連續(xù)照射3ml 2μM的角質(zhì)酶母液漸增的時(shí)段(0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)和5小時(shí))。通過與由RTC 2000PTI分光計(jì)提供的單色儀偶聯(lián)的氙弧光燈提供295nm的光激發(fā)。將比色杯安裝在恒溫樣品池中，保持25℃的恒溫。通過用磁體700rpm連續(xù)攪拌使角質(zhì)酶樣品保持為均勻的溶液。將激發(fā)和發(fā)射狹縫(slit)設(shè)置為6nm。在5小時(shí)的照射期間自始至終地連續(xù)監(jiān)控350nm處的角質(zhì)酶熒光強(qiáng)度。圖1顯示了用295nm光照射后，在350nm處的2μM角質(zhì)酶溶液的時(shí)間依賴性的熒光發(fā)射強(qiáng)度。在第一個(gè)7200秒熒光強(qiáng)度非常迅速地增加，然后是熒光產(chǎn)額看來似乎穩(wěn)定的平穩(wěn)段。
紫外光照射后角質(zhì)酶中游離硫醇的檢測如下確定紫外光照射后角質(zhì)酶中形成的游離硫醇基的濃度通過基于如圖2所示的硫醇基與5，5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)[DTNB]的反應(yīng)，或與Ellman氏試劑的反應(yīng)(Ellman GG，1959 Arch.Biochem.Biophys.8270-77；Hu ML.，1994，Meth.Enzymology 233380-385)的分光光度測定檢測和定量角質(zhì)酶上的硫醇基。如上所述在石英大比色杯(1cm光程長度)中，利用RTC 2000 PTI分光計(jì)用295nm光照射在存在于20mM pH8.5的TrisHCl中的3ml 17.3μM的角質(zhì)酶溶液不同的時(shí)段。測量350nm處樣品的時(shí)間依賴性的熒光發(fā)射強(qiáng)度。所有的狹縫設(shè)置為2nm帶寬。在其295nm照射之前或之后，向900μl的角質(zhì)酶溶液中加入過量的DTNB(100μl在無水甲醇中的8.5mM DTNB母液)。甲醇中的DTNB母液在4℃穩(wěn)定最多2周(Hu ML.，1994，見上文)。在混合兩種成分后，立即用紫外光/可見光的Pharmacia分光光度計(jì)，測量412nm處釋放的NTB離子(硝基硫代苯甲酸鹽離子，ε412nm＝13600M-1cm-1)的吸光度，并且在25℃反應(yīng)20和24分鐘時(shí)間后再次測量。游離的硫醇濃度與412nm處的吸光度值成比例。在20和24分鐘之間讀數(shù)是穩(wěn)定的。24分鐘后每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是3個(gè)測量值的平均。對照樣品包括在無水甲醇中的100μl的8.5mMDTNB母液，其與900μl未輻照的角質(zhì)酶(在20mM TrisHCl pH8.5中的17.3μM角質(zhì)酶溶液)混合。提高照射的角質(zhì)酶樣品的濃度以保證照射后形成的游離硫醇基的量超出DTNB方法的檢測極限。
在未照射的角質(zhì)酶對照樣品中利用DTNB測定沒有檢測到游離的硫醇基。這與在天然的角質(zhì)酶中缺乏游離的硫醇基相一致，因?yàn)樵撁钢兴械?個(gè)半胱氨酸殘基都參與二硫鍵。將照射期間在角質(zhì)酶樣品中形成的硫醇基的量測量為熒光強(qiáng)度增加(F/Fo)的函數(shù)。圖3表明在紫外光激發(fā)后角質(zhì)酶在295nm的Trp熒光發(fā)射強(qiáng)度的時(shí)間依賴性的增加，和在不同比率的熒光發(fā)射增加(F/Fo)檢測到的游離硫醇基的濃度增加之間的正相關(guān)。
這些結(jié)果支持色氨酸(Trp)的起始熒光強(qiáng)度由于附近存在完整的二硫鍵而高度猝滅，以及角質(zhì)酶中單個(gè)內(nèi)源Trp熒光強(qiáng)度的增加是由于角質(zhì)酶在295nm照射后附近的二硫鍵切割的工作模型。
實(shí)施例2天然角質(zhì)酶中輻照誘導(dǎo)的二硫鍵的破壞依賴于空間鄰近的Trp殘基的存在為了證明角質(zhì)酶中色氨酸殘基在輻射誘導(dǎo)的二硫鍵破壞中的作用，將天然蛋白的Trp熒光發(fā)射強(qiáng)度與其中所有的二硫鍵都被化學(xué)破壞的被還原的角質(zhì)酶相比較。為了便于還原其所有的二硫鍵，通過加熱使角質(zhì)酶蛋白部分變性。使用輻照后天然和變性的角質(zhì)酶的Trp熒光發(fā)射強(qiáng)度來證明Trp殘基在空間上鄰近二硫鍵，用于將激發(fā)能量從Trp轉(zhuǎn)移到二硫鍵的重要性。
用DTT還原天然的角質(zhì)酶在天然的角質(zhì)酶中，在折疊蛋白內(nèi)的二硫鍵難以接近溶劑，且其不能通過DTT直接還原。然而，如果在pH8.5的緩沖液中加熱角質(zhì)酶至超過其解折疊溫度，那么隨后的解折疊過程將有助于DTT接近蛋白的二硫鍵。對角質(zhì)酶的稀釋溶液進(jìn)行熱變性步驟以避免蛋白的沉淀。選擇用于角質(zhì)酶熱變性的緩沖液(20mM Tris-HCl 8.5)顯示相對于溫度和體積變化來說最小的pH變化，且此外Tris-HCl具有最小的電離作用焓。從溶液的OD 280nm，利用角質(zhì)酶在280nm的消光系數(shù)(13500M-1cm-1)估計(jì)角質(zhì)酶溶液的濃度。
如下進(jìn)行用DTT還原角質(zhì)酶的二硫鍵將650μl懸浮在20mMTrisHCl pH8.5中的1μM角質(zhì)酶的樣品從25℃加熱到70℃，向其加入過量的DTT(8.5μl的在20mM TrisHCl pH8.5中的3.7M DTT)，以產(chǎn)生終濃度為50mM的DTT。
天然或還原的角質(zhì)酶的Trp熒光發(fā)射強(qiáng)度測量在下列條件下用RTC 2000 PTI分光計(jì)測量在295nm激發(fā)后，1μM角質(zhì)酶樣品的發(fā)射光譜，狹縫設(shè)置為2nm帶寬(A)在無DTT時(shí)于25℃下溫育角質(zhì)酶；(B)在無DTT時(shí)于70℃下溫育角質(zhì)酶；(C)加熱至70℃并冷卻至25℃后，在無DTT時(shí)于25℃下溫育角質(zhì)酶；(D)加熱至70℃，加入DTT并冷卻至25℃后，在有DTT時(shí)于25℃下溫育角質(zhì)酶。對于Raman基值校正光譜。
圖4中顯示了4種發(fā)射光譜。在25℃溫育的角質(zhì)酶的發(fā)射光譜(A)與從70℃冷卻至25℃后的角質(zhì)酶發(fā)射光譜(C)相同，表明在pH8.5的角質(zhì)酶的加熱解折疊是可逆的過程。這可與解折疊狀態(tài)(B)的角質(zhì)酶的發(fā)射光譜相比較。在存在DTT時(shí)加熱至70℃后在25℃的角質(zhì)酶(D)的Trp發(fā)射熒光強(qiáng)度大于(A)中的沒有DTT的天然角質(zhì)酶。如實(shí)施例1所顯示的，這些光譜用來證實(shí)角質(zhì)酶(在295nm激發(fā)后)的Trp熒光發(fā)射強(qiáng)度的增加和其二硫鍵的還原之間的相關(guān)性。
在獲得樣品(A)以及(C)在295nm角質(zhì)酶Trp殘基的連續(xù)激發(fā)后的連續(xù)波譜的過程中，如實(shí)施例1所示觀察到熒光發(fā)射增加。樣品(A)和(C)的相似熒光增加與在天然角質(zhì)酶再折疊后的三維結(jié)構(gòu)中觀察到的Trp和二硫鍵之間的緊密接近度相一致。在295nm角質(zhì)酶的Trp殘基的連續(xù)激發(fā)后，對于樣品(B)或(D)沒有觀察到熒光發(fā)射的這種增加。這些數(shù)據(jù)支持的結(jié)論是角質(zhì)酶中Trp殘基和二硫鍵之間的緊密接近度是光誘導(dǎo)機(jī)制所必需的，并且當(dāng)在70℃，pH8.5解折疊蛋白時(shí)，喪失了這個(gè)接近度。這很可能是為何角質(zhì)酶在70℃的Trp熒光量子產(chǎn)率比在25℃的量子產(chǎn)率高的原因，盡管預(yù)期由于更高的溫度導(dǎo)致在Trp和溶劑分子之間碰撞猝滅而產(chǎn)生更低的量子產(chǎn)率。
實(shí)施例3.蛋白中光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞的特異性已經(jīng)使豌豆腐皮鐮孢的角質(zhì)酶基因突變，以編碼突變的角質(zhì)酶多肽，其中由非熒光的氨基酸丙氨酸替代單個(gè)的色氨酸殘基(W69A)。以下證明突變體與天然角質(zhì)酶相比缺乏光誘導(dǎo)的二硫鍵破壞，進(jìn)一步證實(shí)需要空間上緊密鄰近二硫鍵的芳族氨基酸(例如trp)。重組表達(dá)突變的角質(zhì)酶(W69A)。將存在于50mM Tris-HCl pH7.0中的3ml2μM的突變體或天然蛋白溶液轉(zhuǎn)入比色杯，在25℃恒溫，以700rpm進(jìn)行磁力攪拌，利用來自偶聯(lián)至單色儀的RTC 2000 PTI分光光度計(jì)的75W氙燈在296nm處照射，分別使用10和2nm的激發(fā)和發(fā)射狹縫。如在圖5中所顯示的，從芳族氨基酸在pH7的水溶液中的吸收(A)和發(fā)射光譜(F)可看出，色氨酸是唯一由波長為296nm的光激發(fā)的芳族殘基。在296nm照射之前或之后，將突變體或天然的角質(zhì)酶溶液(1ml)與終濃度為20μM的分子內(nèi)猝滅探針BODIPY FL L-胱氨酸(圖6)在黑暗中在25℃溫育20分鐘。然后在480nm處(BODIPY FLL-胱氨酸的激發(fā)波長)激發(fā)每種包括BODIPY FL L-胱氨酸的角質(zhì)酶樣品，并記錄500和620nm之間的發(fā)射光譜，其中分別利用設(shè)置為4和2nm的激發(fā)和發(fā)射狹縫。在照射期間角質(zhì)酶樣品中產(chǎn)生的任何硫醇基將與探針Bodipy FL L-胱氨酸(包含2個(gè)bodipy基團(tuán))的SS基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致這個(gè)分子的破壞并且隨后增加2個(gè)bodipy基團(tuán)之間的距離。這反過來導(dǎo)致每個(gè)bodipy基團(tuán)熒光發(fā)射強(qiáng)度的增加。如圖7所示，與天然的角質(zhì)酶(B)相反，突變角質(zhì)酶(A)的照射沒有產(chǎn)生增加的Bodipy熒光，表明在突變體中沒有硫醇基形成。這表明在296nm照射后，突變角質(zhì)酶中鄰近于W69A突變的二硫鍵由于在緊密空間接近度中缺乏Trp殘基而保持完整。
通過進(jìn)一步的研究證實(shí)紫外光照射后天然的角質(zhì)酶中破壞的二硫鍵的特性。已知天然的角質(zhì)酶具有2個(gè)二硫鍵，其中一個(gè)接近于活性位點(diǎn)，且其完整性對催化活性是必不可少的，而第二個(gè)遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)，且接近于Trp殘基。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)在紫外光照射后天然的角質(zhì)酶保持其酶活性，所以很明顯只有表面局部化的二硫鍵破壞。Prompers等人，1999，F(xiàn)EBS Lett.456409-16的NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)也表明紫外光照射破壞的SS橋是接近于Trp殘基的一個(gè)橋。紫外光輻照后天然角質(zhì)酶中DTNB可檢測的硫醇基的形成為定量二硫鍵的破壞提供了另外的工具。紫外光照射后每個(gè)角質(zhì)酶分子只檢測到一個(gè)硫醇基。這與表面局部化的二硫鍵的破壞相一致，其中第二個(gè)硫醇基不易接近溶劑。第二個(gè)二硫鍵的至少一個(gè)胱氨酸殘基易接近溶劑，但沒有檢測到破壞。
實(shí)施例4.預(yù)測具有光可誘導(dǎo)的Trp-SS三聯(lián)體的蛋白在Research Collaboration for Structural Bioinformatics(RCSB)的蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中鑒定了包括二硫鍵和芳族殘基的蛋白，其中所選擇的(trp)殘基吲哚環(huán)中的碳或氮原子位于二硫鍵S原子的5或小于5內(nèi)(Bergman等人2000，Nucleic AcidsResearch，28235-242)。只考慮那些已知NMR或X射線晶體結(jié)構(gòu)的蛋白。利用分子顯像程序位于www.expasy.org.spdbv的DeepView/Swiss-Pdb Viewer測量三聯(lián)體原子之間的距離(Guex，N和Peitsch，M.C.，1997，Electrphoresis 182714-2723)。針對具有少于90％的序列同一性并且屬于每一個(gè)不同酶種類[EC編號和分類法]的蛋白排序列表來匹配所選擇的蛋白。為了分析的目的，不考慮其中trp-SS三聯(lián)體位于配體中的蛋白(水解酶)。此外，由于分子二聚體、三聚體、單位細(xì)胞中分子的附加或重復(fù)，所以在PDB條目中出現(xiàn)超過一次的三聯(lián)體只作為一次考慮。
發(fā)現(xiàn)在水解酶當(dāng)中Trp-SS三聯(lián)體是普遍的，角質(zhì)酶是所述水解酶的成員。根據(jù)其特性對位于在每種這些蛋白中鑒定的Trp-SS三聯(lián)體的8、12和15半徑內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行計(jì)算和分類(其中圓球形的區(qū)域中心是最接近于二硫鍵的色氨酸的吲哚環(huán))Gly、Ala、Val(短脂族的)；Leu、Ile(長脂族的)；Pro；Ser、Thr(包含羥基的)；Cys、Met(含硫的)；Asn、Gln(酰胺的)；Asp、Glu(酸性的)；His、Lys、Arg(堿性的)；Phe、Tyr、Trp(芳族的)?？偟膩碚f已經(jīng)由Mathews，Christopher K.和van Holde，K.E.，in“Biochemistry”第二版，The Benjamin/Cummings PublishingCompany，Inc.，1996，ISBN0-8053-3931-0確定了蛋白中每組氨基酸的平均出現(xiàn)頻率，其是23.4％(Gly、Ala、Val)；12.1％(Leu、Ile)；4.6％(Pro)；13.1(Ser、Thr)；4.5(Cys、Met)；8.3％(Asn、Gln)；11.7％(Asp、Glu)；13.8％(His、Lys、Arg)和8.1％(Phe、Tyr、Trp)。
根據(jù)殘基的特性計(jì)數(shù)每種殘基的出現(xiàn)率并且歸類。通過從芳族殘基的數(shù)目減去1個(gè)色氨酸，并且從來自每種圓球狀殘基列表的包含硫的殘基中的出現(xiàn)率數(shù)目減去2個(gè)半胱氨酸來除去來自三聯(lián)體殘基的影響。然后如下計(jì)算對于每個(gè)組在亞群中的出現(xiàn)頻率，f(亞群)式2.1 f(亞群)＝該組中殘基的數(shù)目/亞群中總的殘基數(shù)目。
使用f(亞群)計(jì)算分?jǐn)?shù)分值，其是亞群中的出現(xiàn)頻率除以蛋白中總的出現(xiàn)頻率(參見表2.1)式2.2 分值＝f(亞群)/f(蛋白)因此“分值”＞1是指殘基/組是過表現(xiàn)的“分值”＜1是指殘基/組是欠表現(xiàn)的對于每種三聯(lián)體，在電子數(shù)據(jù)表中按列排列每種殘基的分值后，利用數(shù)據(jù)分析工具包的相關(guān)性工具計(jì)算三聯(lián)體與一種角質(zhì)酶(W69、S31、S109)的相似性。這個(gè)操作產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)，其是角質(zhì)酶的三聯(lián)體和三聯(lián)體(n)之間相似性的量度。
如下計(jì)算相關(guān)系數(shù)式2.3 其中t[cut]和t[n]分別表示角質(zhì)酶的三聯(lián)體和三聯(lián)體n，并且是所考慮的三聯(lián)體的標(biāo)準(zhǔn)差。
使用相關(guān)系數(shù)就其相對于角質(zhì)酶的相似性對三聯(lián)體進(jìn)行分類。以分值的等值線圖表對結(jié)果進(jìn)行圖形化表示，其中小于1的分值表示比預(yù)期少出現(xiàn)的殘基組，等于或高于1的分值表示以預(yù)期頻率出現(xiàn)以及以高于預(yù)期的頻率出現(xiàn)的殘基組。
特別地在8半徑內(nèi)，鑒定出氨基酸殘基的特異亞群，其明顯區(qū)別于普通蛋白中氨基酸的平均出現(xiàn)頻率，特別是關(guān)于以下殘基的半度(Phe、Tyr、Trp)(Asp、Glu)(Asn、Gln)和Pro(圖9)。因此，酰胺殘基(Asn、Gln)是過表現(xiàn)的，并且在大多數(shù)情況下短脂族殘基(Gly、Ala、Val)和/或長脂族殘基(Leu、Ile)的出現(xiàn)率也是過表現(xiàn)的。在幾乎每個(gè)三聯(lián)體中，存在欠表現(xiàn)的帶電氨基酸(His、Lys、Arg)(Asp、Glu)和Pro殘基的組。
在三聯(lián)體的8半徑內(nèi)見到的保守氨基酸特異亞群不如在12和15中明顯。免疫球蛋白中trp-SS三聯(lián)體8半徑接近度內(nèi)的氨基酸殘基分析顯示了包含羥基的氨基酸的過表現(xiàn)，而在許多IgG TrpS-S三聯(lián)體中芳族殘基也是過表現(xiàn)的。在許多免疫球蛋白中酰胺氨基酸(Asn、Gln)中的一個(gè)或兩者和脂族殘基出現(xiàn)率也都是過表現(xiàn)的，其中TrpSS空間三聯(lián)體周圍的氨基酸組成非常類似于角質(zhì)酶三聯(lián)體周圍的組成(IGG1三聯(lián)體A組的免疫球蛋白部分)。在這些免疫球蛋白中我們也觀察到欠表現(xiàn)的帶電氨基酸(His、Lys、Arg)(Asp、Glu)和Pro殘基的組(圖11和12)。其中芳族Trp側(cè)鏈的發(fā)射偶極平面垂直于二硫鍵吸收偶極平面的那些Trp-SS三聯(lián)體不太可能在激發(fā)態(tài)Trp和二硫鍵之間交換激發(fā)能量。
檢驗(yàn)這組蛋白的一些成員的光可誘導(dǎo)特性，所述蛋白包括與在角質(zhì)酶Trp-SS三聯(lián)體8半徑內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相似的Trp-SS三聯(lián)體和氨基酸殘基亞群。利用分子內(nèi)猝滅探針BODIPY FL L-胱氨酸(圖6)，如實(shí)施例3對于突變體角質(zhì)酶所描述的，測定每種蛋白的光可誘導(dǎo)的二硫鍵破壞。如圖8A-F所示，下列蛋白雞卵清溶菌酶、雪白根霉甘油三酯脂酶、人纖溶酶原、人胎盤堿性磷酸酶、凝乳酶B和人免疫球蛋白全部顯示包括光-可誘導(dǎo)的Trp-SS三聯(lián)體。
蛋白α-乳清蛋白包括4個(gè)二硫鍵，其中只有2個(gè)在紫外光照射時(shí)破壞，即Cys6-Cys120和Cys73-Cys91(Vanhooren等人(2002)Biochemistry，41(36)11035-11043)。盡管α-乳清蛋白中Cys73-Cys91和Cys28-Cys11均具有至少一個(gè)位于色氨酸吲哚環(huán)最近原子4內(nèi)的硫原子，但只有前者對光誘導(dǎo)的破壞敏感。與三聯(lián)體Trp118-Cys28-Cys111相反，三聯(lián)體Trp60-Cys73-Cys9位于圓球形區(qū)域8半徑內(nèi)，其氨基酸組成與角質(zhì)酶三聯(lián)體的相似，特別是關(guān)于以下殘基的豐度的(Phe、Tyr、Trp)、(Asp、Glu)、(Asn、Gln)和Pro殘基(圖10)。
實(shí)施例5.光誘導(dǎo)的角質(zhì)酶偶聯(lián)。
已經(jīng)在實(shí)施例1、2和3中顯示了來自豌豆腐皮鐮孢的模式蛋白角質(zhì)酶以及其它幾個(gè)蛋白中應(yīng)答照射而形成游離的SH基團(tuán)。然后角質(zhì)酶的反應(yīng)性硫醇基可與溶液中的載體分子偶聯(lián)，所述載體分子具有游離的和易接近溶劑的硫醇基或易接近溶劑的二硫鍵。如圖2和6中所示，通過用295nm的光輻照誘導(dǎo)使角質(zhì)酶中游離的硫醇基與DTNB和BODIPY FL L-胱氨酸的二硫基偶聯(lián)來說明光誘導(dǎo)的角質(zhì)酶偶聯(lián)于溶液中載體分子的方法。在實(shí)施例3(圖8)中也證明了BODIPY FLL-胱氨酸和蛋白溶菌酶、脂酶、纖溶酶原、堿性磷酸酶、凝乳酶、免疫球蛋白中每一種之間的光誘導(dǎo)偶聯(lián)。
如下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。如實(shí)施例1和2所描述的，利用RTC 2000 PTI分光計(jì)，在石英大比色杯(1cm光程長度)中用295nm光照射在20mMTrisHCl pH8.5中的3ml 17.3μM角質(zhì)酶溶液不同的時(shí)段。在295nm照射之前或之后，將過量的DTNB(溶于無水甲醇中的100μl 8.5mMDTNB母液)加入900μl角質(zhì)酶溶液中?；旌蟽煞N組分后，立即用紫外光/可見光Pharmacia分光光度計(jì)測量412nm處釋放的NTB離子的吸光度(硝基硫代苯甲酸鹽離子，ε412nm＝13600M-1cm-1)，并且在25℃的20和24分鐘反應(yīng)時(shí)間后再次測量。與DTNB的偶聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致形成化學(xué)計(jì)算量的NTB離子。因此，偶聯(lián)的角質(zhì)酶的濃度與412nm處的吸光度值成比例。對照樣品包括溶解在無水甲醇中的100μl 8.5mMDTNB母液，其與900μl未輻照的角質(zhì)酶(溶于20mM Tris-HCl pH8.5中的17.3μM角質(zhì)酶溶液)混合。
實(shí)施例6.光誘導(dǎo)的蛋白固定。
在例如來自豌豆腐皮鐮孢的角質(zhì)酶的蛋白中應(yīng)答照射而形成的游離的反應(yīng)性硫醇基(如實(shí)施例1、2和3中所示)，可以用來將蛋白與硫醇反應(yīng)性的支持物或載體分子連接，不管其是金還是用硫醇基衍生化的金，或用SH基團(tuán)衍生化的石英表面，或用SH基團(tuán)衍生化的聚合物支持物或載體分子。固定的蛋白顯示保持其功能特性(例如酶活性)。
首先通過用將羧甲基修飾為N-羥基琥珀酰亞脂酯的NHS/EDC進(jìn)行活化而用SH基團(tuán)將聚合物支持物衍生化。然后通過與溶于0.1M pH8.0的硼酸鹽緩沖液中的半胱胺溫育，以及隨后與溶于0.1M pH8.0的硼酸鹽緩沖液中的DTT或DTE(二硫赤蘚糖醇)溫育而在支持物上引入硫醇基。在固定前用0.1M pH8.0的硼酸鹽緩沖液沖洗支持物。
也可使蛋白與用SH基團(tuán)衍生化的石英支持物連接，并且如以許多蛋白為例說明的，利用下列程序通過全內(nèi)反射熒光(TIRF)光譜學(xué)監(jiān)控固定步驟1用于TIRF光譜學(xué)的石英載玻片的表面制備通過在70-75℃浸入鉻酸硫酸(chromosulfuric acid)(Merck1.02499/Z624399)中1小時(shí)來清潔石英載玻片(12cm2)，然后于室溫在水中漂洗。然后通過于99-100℃浸入溶于去離子水中的5w/v％過硫酸鉀(99％ K2S2O8，Acros Organics 20201-000)中1小時(shí)，以增加OH基團(tuán)的數(shù)目來使載玻片羥基化。用去離子水漂洗羥基化的載玻片并迅速干燥。
然后通過將溶于間二甲苯(99+％，Acros Organics 1808600100)中的150μl 0.03％v/v 3-巰醇基丙基-三甲氧基硅烷(Merck 63800)應(yīng)用于羥基化的載玻片，來制備SH-活化的載玻片。使二甲苯溶劑從載玻片完全蒸發(fā)，然后用純的二甲苯；乙醇和去離子水接連沖洗表面，最后干燥產(chǎn)生均勻的光學(xué)上理想的硅烷涂層。
步驟2通過TIRF光譜學(xué)將蛋白固定在石英載玻片上將SH-活化的或?qū)φ樟u基化的載玻片用甘油安裝在石英棱鏡上，用10μm的聚氨酯墊圈附著于流動室，并裝配在偶聯(lián)至熒光分光光度計(jì)、提供有75W氙弧光源的TIRF儀器中。通過以0.25ml-1的流速沖洗流動室或與下列溶液溫育進(jìn)行蛋白的固定a)25mM Tris-HCL，pH8.5(緩沖液A)，處理5-10分鐘，使載玻片水合化。
b)25℃，溶于緩沖液A中的0.5-2.0μM蛋白溶液，處理10-20分鐘。
c)緩沖液A，處理10分鐘。
d)非離子去污劑，例如2v/v％ Helmanex II(Hellma GmbH & CoKH，德國)，處理5分鐘。
e)緩沖液A在連續(xù)的紫外光照射、280或296nm處限定的紫外光照射(10分鐘光，或1秒光/分鐘)或黑暗(對照)的條件下進(jìn)行蛋白固定，并通過330nm處的熒光發(fā)射進(jìn)行監(jiān)控。在測量固定的蛋白活性前用乙醇和H2O漂洗載玻片。
在上述方法的改進(jìn)中，紫外光輻照蛋白樣品，例如2μM角質(zhì)酶溶液，隨后通過與樣品溫育和/或用樣品沖洗而固定在SH衍生化的石英載玻片上，再用緩沖液A清洗，以及任選地用去污劑除去未結(jié)合的蛋白。
步驟3固定活性的酶活性固定步驟后，將熒光酶底物應(yīng)用于石英載玻片，并通過熒光光譜學(xué)檢測反應(yīng)產(chǎn)物。
A.紫外光誘導(dǎo)的角質(zhì)酶固定如圖13所示，通過在330nm檢測熒光來監(jiān)控將角質(zhì)酶在連續(xù)的或限定的照射下固定在SH活化和羥基化的石英載玻片上。沖洗流動室(A-B)，然后與2.0μM角質(zhì)酶溶液溫育(B-C)；用緩沖液A漂洗(C-D)，以及用去污劑和緩沖液A漂洗(E)。在用緩沖液和去污劑沖洗期間除去非緊密結(jié)合至石英載玻片的角質(zhì)酶。從熒光發(fā)射強(qiáng)度推斷出的角質(zhì)酶固定的相對效率在連續(xù)照射下比在限定的照射下的大，且這依賴于SH-活化的石英表面(圖14A)和照射(圖14B)。在限定光條件下的固定可用于減少蛋白光漂白的風(fēng)險(xiǎn)。不顯示出光可誘導(dǎo)的二硫鍵破壞的突變角質(zhì)酶(W69A)不能在相同條件下被固定在SH-活化的石英載玻片上(圖14B)。
根據(jù)下列步驟，通過測量非熒光底物丁酸4-甲基傘形酯的酯鍵切割，伴隨著熒光4-甲基傘形酮的釋放來檢測固定在石英載玻片上的角質(zhì)酶的酶活性a)在石英載玻片表面上沉積溶于25mM Tris-HCl，pH8.0中的25-100μl的10μM丁酸4-甲基傘形酯底物。
b)在室溫下溫育該載玻片30分鐘。
c)通過數(shù)碼照相機(jī)監(jiān)控紫外光激發(fā)(365nm)后，載玻片的熒光發(fā)射強(qiáng)度(450nm)。(備選地可將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入微量滴定板孔并通過UV/VIS分光光度計(jì)監(jiān)控?zé)晒獍l(fā)射。)將底物，丁酸4-甲基傘形酯溶于DMSO，產(chǎn)生25.2mM的母液，將其加入測定緩沖液。
在SH-活化的石英載玻片而不是羥基化的石英載玻片上檢測到活化的角質(zhì)酶(圖15)，這進(jìn)一步證實(shí)角質(zhì)酶與SH-活化的石英支持物的光誘導(dǎo)偶聯(lián)是借助于硫醇基的觀察。
B.紫外光誘導(dǎo)的溶菌酶和凝乳酶的固定如上對于角質(zhì)酶所述的，將2μM溶菌酶或凝乳酶溶液固定在石英載玻片上并通過TIRF光譜學(xué)進(jìn)行監(jiān)控。顯示溶菌酶的固定是光活化的并且依賴于石英載玻片的SH-活化(圖16A對B)。發(fā)現(xiàn)如果將連續(xù)照射限定于10分鐘就能增強(qiáng)溶菌酶固定的偶聯(lián)效率。類似地發(fā)現(xiàn)凝乳酶固定是光活化的并且依賴于與SH-石英表面的偶聯(lián)(圖16C)。
溶菌酶活性的檢測根據(jù)用來檢測角質(zhì)酶活性的步驟檢測固定在石英載玻片上的溶菌酶活性，只是除了使用溶菌酶特異性的底物(EnzCheck Lysozyme，22013，Molecular probes Inc)，并且用光譜學(xué)記錄熒光信號。將一滴125μL的50μg/ml底物(溶于0.1M磷酸/0.1M NaCl pH7.5中)施用在石英載玻片上。在室溫(20-25℃)溫育30分鐘后，將100μL溶液轉(zhuǎn)入黑色多孔板(96孔，Nunc 267742)的孔中。在熒光多孔板讀出器(SpectraMax Gemini XS)中，在495nm激發(fā)樣品，并記錄525nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度(FEI)。濃度和流程都是以來自Molecular probes Inc的EnzCheck Lysozyme活性測定試劑盒22013的方案為基礎(chǔ)的。
溶菌酶活性分析也顯示與對照相比，用紫外光-照射的SH-活化載玻片上的活性較大，所述對照包括黑暗中SH-活化載玻片上或紫外光照射的羥基化載玻片上的固定/吸收。
用EnzCheck Protease試劑盒E6639(Molecular Probes Inc.)，利用溶于10mM Tris pH7.8(試劑盒中包含的緩沖液)中的10μg/mL底物濃度進(jìn)行凝乳酶活性的檢測。將125μL一滴的底物應(yīng)用到石英載玻片上。在室溫(20-25℃)溫育30分鐘時(shí)間后，將100μL溶液轉(zhuǎn)入黑色多孔板(96孔，Nunc 267742)的孔中。在熒光多孔板讀出器(SpectraMax Gemini XS)中，在589nm激發(fā)樣品，并記錄625nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度(FEI)。濃度和流程都是以來自Molecularprobes Inc的EnzCheck Protease活性測定試劑盒E6639的方案為基礎(chǔ)的。
C.紫外光誘導(dǎo)的免疫球蛋白的固定用木瓜蛋白酶蛋白水解消化免疫球蛋白IgG復(fù)合物產(chǎn)生2個(gè)F(ab)片段，每種包括2個(gè)多肽。現(xiàn)有IgG免疫球蛋白Fab片段的結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)表明它們均富含Trp/Cys-Cys三聯(lián)體?，F(xiàn)有Fab片段的三維結(jié)構(gòu)表明存在于CH、VH、CL和VL結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵不易接近溶劑。另外的結(jié)構(gòu)域間二硫鍵存在于位于遠(yuǎn)離抗原結(jié)合部位的Fab片段基部，連接保守區(qū)。這個(gè)二硫鍵易接近溶劑并且位于Trp殘基附近。
可通過紫外光-誘導(dǎo)的F(ab)片段二硫鍵的破壞，例如1CBV小鼠IgG1 F(ab)的C-末端結(jié)構(gòu)域間位于Trp 196 10-11內(nèi)的二硫鍵(Cys136-Cys214)的破壞來實(shí)現(xiàn)F(ab)片段在SH-基團(tuán)衍生化的支持物上的定向固定。位于Fab片段另一末端的抗原結(jié)合部位遠(yuǎn)離固定位點(diǎn)，因此保持其對于抗原識別的有效性。
下列步驟說明F(ab)片段的純化、其紫外光誘導(dǎo)的固定和偶聯(lián)于支持物的有功能活性的F(ab)片段的檢測a)根據(jù)Aybay等人2003，Immunology Letters 85231-235的方法用木瓜蛋白酶(Sigma P4762)消化小鼠IgG1(Sigma M7894)，并且可利用由Pierce Biotechnology，Illinois，美國提供的ImmunoPure F(ab)試劑盒純化F(ab)片段。
b)如上所述借助于280nm至296nm波長的紫外光照射將溶于25mM Tris-HCl，pH8.0中的1-10μM F(ab)片段溶液固定在TIRF儀器流動池中的SH-活化的石英載玻片上?？蓪⒎甲灏被岚ㄔ诠潭ň彌_液中以便于光誘導(dǎo)不接近內(nèi)源芳族氨基酸的蛋白結(jié)構(gòu)域間或結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵的破壞，也可將其有效地用于固定免疫球蛋白F(ab)片段。通過在黑暗中并且在羥基化的支持物上進(jìn)行對照固定測定來測試偶聯(lián)的特異性。在296nm處激發(fā)上的在330nm處的熒光發(fā)射提供了對固定在載玻片上的F(ab)的測量。
c)通過將在Tris-HCl pH8.0中稀釋100×的抗-小鼠IgGF(ab)特異性的異硫氰酸熒光素綴合物(Sigma F2653)導(dǎo)入流動池，以確定在步驟(b)中固定的F(ab)片段的抗原結(jié)合活性。于25℃溫育10-30分鐘后，通過用緩沖液A沖洗流動池除去未結(jié)合的綴合物，然后在495nm處的激發(fā)上在525nm檢測結(jié)合至石英載玻片的綴合物的熒光發(fā)射強(qiáng)度。
D.紫外光-誘導(dǎo)的葡糖氧化酶的固定使用葡糖氧化酶定量液體(例如人血液)中的β-D-葡萄糖。葡糖氧化酶包括易接近溶劑的位于離Trp133 7-9的trp-SS三聯(lián)體(Cys164-Cys206)，并且這個(gè)二硫鍵光誘導(dǎo)的破壞產(chǎn)生適于偶聯(lián)至載體的硫醇基。因?yàn)槎蜴I的位置遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)，所以，其破壞以及隨后產(chǎn)生的硫醇偶聯(lián)于支持物不會消弱葡糖氧化酶的催化活性。如上文對角質(zhì)酶的描述將2μM葡糖氧化酶溶液固定在石英載玻片上，并通過TIRF光譜學(xué)進(jìn)行監(jiān)控。
實(shí)施例7.空間控制的蛋白固定使角質(zhì)酶分子固定在SH-活化的石英載玻片上，將其空間地限制在1-2μm2的區(qū)域內(nèi)。將一小滴溶于25mM Tris-HCl pH8.5中的5μM角質(zhì)酶溶液于室溫沉積在SH-活化的石英載玻片上。用296nm的激光照射小滴，由此激光探針的尖部浸在小滴中并且位于活化石英表面上方1-2mm。利用實(shí)施例6A給出的角質(zhì)酶測定，在載玻片表面上空間限定的區(qū)域內(nèi)檢測固定的角質(zhì)酶活性。
實(shí)施例8.使用紫外光的可逆蛋白固定將紫外光用于釋放通過光誘導(dǎo)的固定以二硫鍵合到硫醇反應(yīng)性表面的蛋白，例如角質(zhì)酶。當(dāng)色氨酸殘基和二硫鍵存在于溶液中時(shí)，輻照色氨酸通過光子誘導(dǎo)的機(jī)理破壞二硫鍵。根據(jù)下列步驟通過紫外光輻照釋放固定的角質(zhì)酶1.將固定有角質(zhì)酶的載玻片放置在TIRF設(shè)備中并且通過在350nm處的熒光發(fā)射監(jiān)控載玻片上吸附的蛋白濃度。
2.用連續(xù)流動的包含20μM色氨酸或芳族氨基酸殘基或模擬芳族殘基的化合物的20mM Tris-HCl pH8.5緩沖液沖洗載玻片。
3.用295nm光輻照載玻片5小時(shí)。
4.用20mM Tris-HCl pH8.5緩沖液清洗載玻片。
5.蛋白洗脫后在350nm處連續(xù)地測量載玻片的熒光。
實(shí)施例9.使用還原劑的可逆固定通過二硫鍵的化學(xué)還原，釋放經(jīng)光誘導(dǎo)的固定由二硫鍵結(jié)合到硫醇反應(yīng)性表面的角質(zhì)酶。此后，在不含還原劑的20mM Tris-HCl pH8.5緩沖液中透析蛋白以恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)。根據(jù)下列步驟通過還原劑釋放固定的角質(zhì)酶1.將固定有角質(zhì)酶的載玻片放置在TIRF設(shè)備中并且通過在350nm處的熒光監(jiān)控載玻片上吸附的蛋白濃度。
2.用連續(xù)流動的緩沖液(含有50mM DTT的20mM Tris-HClpH8.5)清洗載玻片30分鐘、1小時(shí)或最多5小時(shí)。
3.用20mM Tris-HCl pH8.5緩沖液清洗載玻片。
4.蛋白洗脫后在350nm處連續(xù)地測量載玻片的熒光。
實(shí)施例10光輻照或還原劑對蛋白功能和穩(wěn)定性的影響A.光輻照對角質(zhì)酶催化活性的影響與被置于黑暗或在正常的(人造的)實(shí)驗(yàn)室光中照射至少最多約3小時(shí)的蛋白樣品相比，在296nm照射的蛋白樣品(角質(zhì)酶)顯示沒有降低活性(圖17A)。
在PTI熒光分光計(jì)(激發(fā)狹縫設(shè)置為6nm，并且發(fā)射狹縫設(shè)置為1/2nm)中照射角質(zhì)酶(1μM，溶于25mM Tris pH8.5中)。將3ml樣品置于石英比色杯中，在296nm處(在330nm處記錄發(fā)射)連續(xù)照射期間持續(xù)地?cái)嚢?500rpm，7×2mm磁棍)。整個(gè)照射期間，收集5μL樣品用于即時(shí)的活性測量(在5-10分鐘內(nèi))。將對照樣品置于人工光源(氖燈)下的試驗(yàn)臺上，并且用置于黑暗中的樣品作為參考。
測量所有3個(gè)樣品的活性(一式兩份)。為了對照的目的，也分析在緩沖液中的純的底物。
將100μl底物溶液(10μM丁酸4-甲基傘形酯，F(xiàn)luka 19362，溶于25mM Tris pH8.0中)吸入黑色多孔板(96孔，Nunc 267742)的8個(gè)孔中。在熒光多孔板讀出器(SpectraMax Gemini XS)中，在365nm處激發(fā)樣品，并且在最初的8-10分鐘期間每隔1分鐘記錄450nm處產(chǎn)物的熒光發(fā)射強(qiáng)度(FI)。使用熒光的瞬間增加(每分鐘的ΔFI)作為蛋白活性的量度(在最初的10分鐘期間，熒光發(fā)射強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間線性增加，r2＞0.98)。報(bào)道的活性是紫外光照射下樣品的活性或人造光中對照樣品活性除以被置于黑暗中的參考樣品的活性之間的比率。在25℃+/-0.1℃下測量活性。DTT對角質(zhì)酶活性的影響B(tài).還原劑對角質(zhì)酶催化活性的影響將30μM角質(zhì)酶與5.1mM DTT一起溫育不同的時(shí)段。圖17B中展示了在存在DTT時(shí)角質(zhì)酶對三丁酸甘油酯的時(shí)間依賴性活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢姰?dāng)不存在DTT時(shí)角質(zhì)酶保持該特異活性超過26小時(shí)。在存在DTT時(shí)，以30μM角質(zhì)酶對5.1mM DTT的比率，角質(zhì)酶特異活性在溫育45分鐘期間降低至初始活性的41％。溫育4小時(shí)后，特異活性是初始活性的21％。
權(quán)利要求
1.一種使含有二硫鍵的蛋白或肽與載體偶聯(lián)的方法，包括下列步驟，a)輻照蛋白或肽以通過二硫鍵的破壞在蛋白或肽中產(chǎn)生硫醇基，和b)將輻照的蛋白或肽與能夠結(jié)合硫醇基的載體一起溫育，由此獲得偶聯(lián)，或a)將蛋白或肽與能夠結(jié)合硫醇基的載體一起溫育，和b)在存在所述的載體時(shí)輻照蛋白或肽，以通過二硫鍵的破壞在蛋白或肽中產(chǎn)生硫醇基，由此獲得偶聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的輻照步驟包括激發(fā)一種或多種芳族氨基酸的波長的光。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的芳族氨基酸包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述的輻照包括波長為大約295nm、275nm或254nm的光。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的芳族氨基酸是色氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3或5中任何一項(xiàng)的方法，其中波長是大約295nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的方法，其中在存在游離的芳族氨基酸時(shí)輻照所述的蛋白或肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的載體包括肽、蛋白或生物分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的載體是支持物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的偶聯(lián)是固定在所述的支持物上。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的固定受到空間控制。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的支持物包括金。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的支持物是能夠結(jié)合硫醇基的衍生化支持物。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的支持物包括硫醇基或二硫鍵。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中支持物包括間隔區(qū)。
16.包括通過權(quán)利要求1至15中任何一項(xiàng)方法偶聯(lián)的一種或多種蛋白或肽的載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的載體，其中所述的載體是支持物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的載體，其中所述的支持物選自電子芯片、載玻片、晶片、樹脂、孔、管、微陣列和膜。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的載體，其中所述的支持物包括選自黃玉、聚苯乙烯、聚乙烯、聚酯、聚醚酰亞胺、聚丙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚偏1，1-二氟乙烯、硅氧烷、金剛石、石英和硅石、硅、金屬、尼龍、硝化纖維素、瓊脂糖、纖維素和陶瓷的材料。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任何一項(xiàng)的載體，其中一種或多種蛋白或肽選自酶、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白結(jié)構(gòu)域、結(jié)合蛋白、抗原和免疫球蛋白。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的載體，其中所述的免疫球蛋白是F(ab)片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的載體，其中所述的酶選自角質(zhì)酶、凝乳酶、葡糖氧化酶、脂酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和纖溶酶原。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的載體，其中所述的載體包括制藥學(xué)上的藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任何一項(xiàng)的載體用于生物功能反應(yīng)的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的載體的用途，其中所述的生物功能反應(yīng)選自生物傳感器、色譜法，免疫檢測、酶測定、核苷酸結(jié)合檢測、蛋白-蛋白相互作用、蛋白修飾、載體靶向和蛋白靶向。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任何一項(xiàng)的方法用于生產(chǎn)生物傳感器或蛋白/肽微陣列的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求16至23中任何一項(xiàng)的載體用于診斷或用于生物傳感器試劑盒的用途。
28.預(yù)測通過輻照能夠破壞的含有二硫鍵的蛋白或肽的方法，包括步驟a)鑒定和選擇含有二硫鍵的蛋白或肽，和b)鑒定和選擇在(a)中所選擇的蛋白或肽，其進(jìn)一步在所述二硫鍵的10內(nèi)包括芳族氨基酸殘基，以及c)鑒定和選擇在(b)中所選擇的蛋白或肽，其中所述芳族氨基酸的側(cè)鏈偶極平面與所述的二硫鍵平面不是垂直的。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括步驟鑒定和選擇在(b)或(c)中所選擇的蛋白或肽，其中位于所述芳族氨基酸殘基吲哚環(huán)8半徑內(nèi)的氨基酸殘基過表現(xiàn)至少1倍的酰胺氨基酸殘基(Asn、Gln)，以及短脂族氨基酸殘基(Gly、Ala、Va1))和/或長脂族氨基酸殘基(Leu、Ile)，以及欠表現(xiàn)至少1倍的帶電氨基酸(His、Lys、Arg)(Asp、Glu)和脯氨酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明包括通過用輻照在蛋白上誘導(dǎo)形成硫醇基使含有二硫鍵的蛋白與載體偶聯(lián)，和使蛋白與載體偶聯(lián)的方法。蛋白中硫醇基的形成是位于空間上緊密鄰近二硫鍵的芳族氨基酸殘基電子激發(fā)后使二硫鍵破壞的結(jié)果。光誘導(dǎo)的偶聯(lián)方法便于將蛋白定向固定到載體上。
文檔編號C12N11/00GK1764671SQ200480007830
公開日2006年4月26日 申請日期2004年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者S·B·彼得森, M·T·達(dá)克魯茲奧古斯托內(nèi)維斯彼得森 申請人:生物納米光子學(xué)公司