專利名稱：使用嵌入核酸檢測(cè)核酸中甲基化改變的分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA雜交分析和改進(jìn)的寡核苷酸或嵌入核酸(INA)分析。本發(fā)明特別涉及使用這些分析區(qū)分DNA中包含5甲基胞嘧啶堿基的特定堿基序列的方法。
背景技術(shù)：
許多方法可以用于檢測(cè)具體的核酸分子。這些方法一般地依靠靶DNA和核酸探針之間序列依賴的雜交，所述探針長(zhǎng)度可以從短的寡核苷酸(20堿基或更少)到數(shù)千堿基的序列。
對(duì)直接檢測(cè)而言，靶DNA最常見根據(jù)凝膠電泳確定的大小而分離并在用與靶序列互補(bǔ)的探針雜交(Southern和Northern印跡)前轉(zhuǎn)移到固相支持物中。探針可以是天然的核酸或類似物例如INA或鎖核酸(LNA)、PNA、HNA、ANA和MNA。該探針可被直接標(biāo)記(如使用32P)或可以使用間接的檢測(cè)方法。間接的方法通常依靠向該探針摻入“標(biāo)記”例如生物素或地高辛配基，然后該探針通過例如酶聯(lián)底物轉(zhuǎn)化或化學(xué)發(fā)光的方法檢測(cè)。
另一個(gè)廣泛使用的直接檢測(cè)核酸的方法為“夾心”雜交。在此方法中，捕捉探針連接到固相支持物上，溶液中的靶DNA與結(jié)合的探針雜交。未結(jié)合的靶DNA被沖洗去，而結(jié)合的DNA使用雜交到靶序列的第二探針檢測(cè)。檢測(cè)可以使用以上概述的直接或間接法。“分支DNA”信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)是運(yùn)用夾心雜交原理(Urdea Ms分支DNA信號(hào)擴(kuò)增，Biotechnology 12926-928)的例子。
運(yùn)用核酸雜交直接檢測(cè)核酸序列的迅速成長(zhǎng)的領(lǐng)域是DNA微陣列(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays.Cell 1029-15(2000)；Watson，New tools.A new breed of high tech detectives.Science289850-854(2000))。在這個(gè)方法中，單個(gè)核酸種類，其可以從寡核苷酸變動(dòng)到更長(zhǎng)的序列例如cDNA克隆，被固定到網(wǎng)格形狀的固相支持物上。加標(biāo)簽的或標(biāo)記的核酸群體然后與所述陣列雜交，定量陣列中與各斑點(diǎn)的雜交水平。最常見的是放射活性的或熒光標(biāo)記的核酸(例如cDNAs)用于雜交，盡管其他的檢測(cè)系統(tǒng)也被采用。
從核酸序列群體中擴(kuò)增具體序列最廣泛使用的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Dieffenbach C和Dveksler G編，PCR PrimerA LaboratoryManual。Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在這個(gè)擴(kuò)增方法中，寡核苷酸，通常位于互補(bǔ)DNA鏈上15到30核苷酸長(zhǎng)度，處于待擴(kuò)增的DNA區(qū)域的任一端，用來在變性的單鏈DNA上引發(fā)DNA合成。使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逐次循環(huán)的變性、引物雜交和DNA鏈合成使得引物之間的序列得以指數(shù)的擴(kuò)增。RNA序列可以通過首先使用反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制生產(chǎn)互補(bǔ)DNA拷貝而擴(kuò)增。擴(kuò)增的DNA片段可以通過多種的方法檢測(cè)，包括凝膠電泳、與標(biāo)記的探針雜交、使用能后續(xù)識(shí)別的加標(biāo)簽引物(例如通過酶聯(lián)分析)、使用在與靶DNA雜交時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的加熒光標(biāo)簽的引物(例如Beacon和TaqMan系統(tǒng))。
除PCR之外，其他的方法已經(jīng)開發(fā)用于檢測(cè)和擴(kuò)增具體的序列。一個(gè)例子為連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany F使用克隆熱穩(wěn)定連接酶檢測(cè)遺傳病和擴(kuò)增DNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193(1991)).
目前供選的檢測(cè)DNA中甲基化改變的方法取決于此種序列在DNA的亞硫酸氫鹽修飾以后的PCR擴(kuò)增，所述甲基化改變例如在前列腺癌GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)的。在亞硫酸氫鹽處理的DNA中，胞嘧啶被變?yōu)槟蜞奏?由此在PCR過程中被擴(kuò)增成胸腺嘧啶)而甲基化胞嘧啶是非反應(yīng)性的，保持為胞嘧啶(Frommer M，McDonald LE，MillarDS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL在單個(gè)DNA鏈中產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶殘基的正顯示的基因組測(cè)序方案。PNAS891827-1831(1992)；Clark SJ；Harrison J，Paul CL和Frommer M.高靈敏的甲基化胞嘧啶作(High sensitivity mapping of methylatedcytosines).Nucleic Acids Res.222990-2997(1994)).因此(在亞硫酸氫鹽處理后)包含5-甲基胞嘧啶堿基的DNA在序列上與對(duì)應(yīng)的未甲基化DNA不同。Frommer等1992的結(jié)果是亞硫酸氫鹽方法用于在DNA中測(cè)序5-甲基胞嘧啶殘基的基礎(chǔ)。若干年后這個(gè)分析被用作US5786146中CpG島甲基化狀態(tài)的PCR分析的基礎(chǔ)。引物可以選擇來非選擇性擴(kuò)增目的基因組區(qū)域以確定其甲基化狀態(tài)，或可以設(shè)計(jì)成能有選擇地?cái)U(kuò)增其中特定的胞嘧啶被甲基化的序列(Herman JG，GraffJR，Myohanen S，Nelkin BD和Baylin SB.Methylation-specific PCRanovel PCR assay for methylation status of CpG islands.PNAS 939821-9826(1996)).
另外的用于檢測(cè)胞嘧啶甲基化的方法包含用其切割能被位點(diǎn)特異的DNA甲基化阻斷的限制性內(nèi)切酶消化，繼之以Southern印跡和對(duì)目的區(qū)雜交探針分析。該方法局限于在所述位點(diǎn)處DNA被甲基化具有顯著的比例(通常＞10％)，和有足夠的檢測(cè)DNA，通常10pg的情形。用其切割被位點(diǎn)特異的DNA甲基化阻斷的限制性內(nèi)切酶消化，繼之以使用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)兩側(cè)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這個(gè)方法可以利用較少量的DNA，但由于DNA甲基化之外的原因任何缺少完全的酶解作用都可導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)。
若干年前，已經(jīng)開發(fā)其中全部的脫氧核糖磷酸骨架已經(jīng)用在結(jié)構(gòu)上同型的不帶電的聚酰胺骨架替換的肽核酸(PNA)，所述聚酰胺骨架包括N-(2-氨乙基)甘氨酸單位(Ray A和Norden B.Peptide nucleic acid(PNA)its medical and biotechnical applications and for the future.FASEBJ 141041-1060(2000)).
已經(jīng)開發(fā)了利用PNA配體用于靈敏地和特異地檢測(cè)DNA的方法，其不要求PCR擴(kuò)增(WO 02/38801)。最近，一種新的DNA配體，嵌入核酸(INA)已經(jīng)被開發(fā)，其具有獨(dú)特的有用性質(zhì)本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)使用INA探針用于檢測(cè)目的核酸的新分析方法。
發(fā)明詳述第一方面，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中靶核酸存在的方法，該方法包括(a)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理含核酸的樣品；(b)向處理過的樣品以嵌入核酸(INA)形式提供能夠結(jié)合到核酸的靶區(qū)域的檢測(cè)配體，并讓測(cè)檢配體與靶核酸結(jié)合足夠的時(shí)間；和(c)測(cè)量檢測(cè)配體與樣品中核酸分子的結(jié)合以檢測(cè)樣品中靶核酸的存在。
第二方面，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中靶核酸甲基化的方法，該方法包括(a)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理含核酸的樣品；(b)向處理過的樣品以嵌入核酸(INA)形式提供以能夠區(qū)別核酸甲基化和未甲基化的胞嘧啶的檢測(cè)配體，并允許檢測(cè)配體與靶核酸結(jié)合足夠的時(shí)間；和(c)檢測(cè)檢測(cè)配體與樣品中核酸的結(jié)合，這樣的結(jié)合是靶核酸甲基化程度的指示。
第三方面，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中靶核酸存在的方法，該方法包括(a)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理含核酸的樣品；(b)提供結(jié)合有捕捉配體的支持物，所述捕捉配體能夠識(shí)別靶核酸序列的第一部分；
(c)用處理過的樣品接觸該支持物足夠的時(shí)間使核酸結(jié)合到捕捉配體，如此使樣品中的靶核酸通過該捕捉配體結(jié)合到支持物；(d)用能夠識(shí)別靶核酸序列第二部分的檢測(cè)配體接觸支持物，并允許檢測(cè)配體與結(jié)合到支持物的靶核酸結(jié)合足夠的時(shí)間；以及(e)測(cè)量檢測(cè)配體與結(jié)合到支持物的核酸的結(jié)合以確定樣品中靶核酸的存在，其中至少一種捕捉配體或檢測(cè)配體為嵌入核酸(INA)形式。
第四方面，本發(fā)明提供判斷檢測(cè)樣品中靶核酸甲基化程度的方法，該方法包括(a)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理含核酸的樣品；(b)提供結(jié)合有捕捉配體的支持物，所述捕捉配體能夠識(shí)別靶核酸序列的第一部分；(c)用處理過的樣品接觸支持物足夠的時(shí)間，以允許DNA結(jié)合到捕捉配體，如此使樣品中的靶核酸通過捕捉配體結(jié)合到支持物；(d)用能夠區(qū)別DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的檢測(cè)配體接觸支持物，以使檢測(cè)配體結(jié)合到支持物上的任何靶核酸；和(e)測(cè)量檢測(cè)配體與支持物的結(jié)合，以致結(jié)合的程度或量是靶核酸甲基化的程度的指示，其中至少一種捕捉配體或檢測(cè)配體如嵌入核酸(INA)形式。
在第五方面，本發(fā)明提供檢測(cè)含甲基化CpG或CpNpG的DNA的方法，該方法包括(a)用亞硫酸氫鹽處理含DNA的樣品以將DNA中未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶；(b)向處理過的樣品提供能夠區(qū)別DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的檢測(cè)INA配體；和(c)根據(jù)檢測(cè)INA配體結(jié)合的存在與否檢測(cè)甲基化DNA。
第六方面，本發(fā)明提供判斷檢測(cè)樣品中靶DNA甲基化程度的方法，該方法包括(a)用亞硫酸氫鹽處理含DNA的樣品以將未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶；(b)提供磁珠、多孔微量板或成形顆粒形式的固相支持物，其上結(jié)合有能夠識(shí)別靶DNA序列第一部分的INA、PNA或寡核苷酸配體形式的捕捉配體；(c)用處理過的懷疑含靶DNA的樣品接觸支持物，如此使樣品中的靶DNA通過捕捉配體結(jié)合到支持物；(d)用能夠區(qū)別DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的INA、PNA或寡核苷酸配體形式的檢測(cè)配體接觸支持物；和(e)通過測(cè)量結(jié)合的檢測(cè)配體量確定結(jié)合到支持物上的DNA的甲基化程度，其中至少一種捕捉或檢測(cè)配體是INA。
在一個(gè)優(yōu)選的形式中，捕捉配體是INA。在另一個(gè)優(yōu)選的形式中，檢測(cè)配體是INA。
在第七方面，本發(fā)明涉及修飾未甲基化的胞嘧啶但不修飾甲基化的胞嘧啶的試劑，和一種或多種能夠區(qū)別核酸中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的INA探針形式的配體在分析靶核酸甲基化的方法中的應(yīng)用。
在第八方面，本發(fā)明提供分析已經(jīng)用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理的核酸的試劑盒，包括至少一種能夠區(qū)別DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的INA配體。
優(yōu)選地，該試劑盒包含一種或多種固定到固相支持物的INA配體。試劑盒也可以包含擴(kuò)增處理過的DNA的引物。
核酸可以包括包括或拷貝自真核生物基因組，原核生物和病毒，及線粒體核酸，在其他的細(xì)胞器發(fā)現(xiàn)的核酸和細(xì)胞外的核酸。如此處定義的核酸，還可以包含DNA和RNA形式和天然的或其人工衍生物，例如嵌入核酸(INA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、環(huán)己酰核酸(CNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、己糖醇核酸(HNA)、甘露醇核酸(MNA)和其嵌合的組合。
核酸可以衍生自正常的或患病的有機(jī)體，其已經(jīng)被細(xì)菌、病毒、viroidor真核生物或朊病毒感染。核酸還可能衍生自修飾的(轉(zhuǎn)基因的)有機(jī)體(不管該修飾的有機(jī)體是否由種系的-、暫時(shí)的-或體細(xì)胞的-轉(zhuǎn)染方法得到)，所述有機(jī)體包含來自不同物種或人工合成來源的核酸。核酸可以衍生自具有插入或連接的設(shè)備的有機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官，所述設(shè)備通過機(jī)械的、電子的或化學(xué)的方式釋放(例如支架、貼片、起搏器等等)。核酸可以衍生自下述方法得到的有機(jī)體非標(biāo)準(zhǔn)的接合生殖方法，人工授精，胚胎干細(xì)胞克隆方法，或核轉(zhuǎn)移(從體細(xì)胞或種系核)，或細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或膜的提取物修飾的細(xì)胞或核，或外源因子修飾的細(xì)胞，(包括轉(zhuǎn)決定和轉(zhuǎn)分化方法)，或從相同或不同物種的線粒體或其他細(xì)胞器輸入或修飾的，或其組合。核酸可以衍生自自體的-，異源的-或外移植物；組織或器官移植物；或已經(jīng)移植人細(xì)胞到其他有機(jī)體中的組織，(例如在模式有機(jī)體介入心臟病學(xué))。核酸可以衍生自下列有機(jī)體通過基因敲除、敲入或降低的方法生產(chǎn)或修飾的有機(jī)體，(或者在體內(nèi)、離體、或通過基因組或轉(zhuǎn)錄組被暫時(shí)或永久地改變的任何方法，例如被RNAi、核糖酶、適配子(aptamer)、轉(zhuǎn)位子活化、藥物或小分子操作法改變，例如由于PNA、INA、ANA、MNA、LNA、HNA、CNA分子或其他的基于核酸的共軛物的干擾(包括然而并非局限于Trojan肽)。核酸除了來自染色體不平衡的個(gè)體或有機(jī)體，或來自不同自體的細(xì)胞群體的嵌合體，例如雌雄間體的個(gè)體或有機(jī)體；或來自二倍體、非整倍體或片段非整倍體的細(xì)胞群體的嵌合體的個(gè)體或有機(jī)體之外，還可以衍生自人全部的生命階段從受精到死后48小時(shí)或從(正常的或異位的)懷孕的任何階段的個(gè)體，以及胚胎或胎兒材料。核酸可以衍生自源于上述任何或所有來源的原始或培養(yǎng)細(xì)胞系，或來自存儲(chǔ)的材料例如組織樣本、組織和器官以及來自細(xì)胞(以及細(xì)胞系)和它們的分離自人組織、自體以及異源移植物、異種移植物的衍生物，以及可以來源于冷凍或(存儲(chǔ)的；天然的或人工保存或干化的)、解剖或切除來源的樣品；來源例如顯微鏡用載玻片、嵌入塊或液體培養(yǎng)基中的樣品、或提取自合成或天然的表面或液體中的樣品。
優(yōu)選地，核酸是DNA，更優(yōu)選動(dòng)物或人的基因組DNA。
修飾劑優(yōu)選選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。更優(yōu)選，所述試劑是亞硫酸氫鈉，其在有水的情況下將胞嘧啶修飾成尿嘧啶。
亞硫酸氫鈉(NaHSO3)迅速地與胞嘧啶的5，6-雙鍵反應(yīng)形成磺酸化胞嘧啶反應(yīng)中間體，該中間體易于脫氨，并在有水的情況下產(chǎn)生尿嘧啶亞硫酸鹽。如有必要，亞硫酸鹽基團(tuán)可在適度的堿性條件下除去，產(chǎn)生尿嘧啶。因此，潛在地全部胞嘧啶將轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。然而任何甲基化的胞嘧啶由于甲基化的保護(hù)不能被修飾試劑轉(zhuǎn)化。
嵌入核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可序列特異性地雜交到核酸(DNA和RNA)。由于INA顯示若干合乎需要的性質(zhì)，從而是基于探針的雜交分析中替代核酸探針的候選物。INA是雜交到核酸形成雜交物的聚合物，所述雜交物比對(duì)應(yīng)的天然存在的核酸/核酸復(fù)合物在熱力學(xué)上更穩(wěn)定。它們不是已知降解肽或核酸的酶的底物。因此，INA應(yīng)該在生物樣品中更穩(wěn)定，而且具有比天然存在的核酸片段更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期限。與非常取決于離子強(qiáng)度的核酸雜交不同，INA與核酸的雜交相當(dāng)?shù)鬲?dú)立于離子強(qiáng)度，并且在強(qiáng)烈地不支持天然存在的核酸雜交到核酸上的情況下在低離子強(qiáng)度是有利的。INA的結(jié)合強(qiáng)度除取決于通常的雙鏈結(jié)構(gòu)中以特殊方式堆積的堿基之間的氫鍵相互作用之外，還取決于分子中嵌入基團(tuán)的數(shù)目。INA識(shí)別DNA的序列辨別力比DNA識(shí)別DNA的辨別力更有效。
優(yōu)選地，INA是(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(1-芘基甲基)-甘油的亞磷酰胺。
INA以可商業(yè)供應(yīng)的方式通過修改標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方法而合成。INA的完整定義及其合成可以在WO 03/051901，WO 03/052132，WO 03/052133和WO 03/052134(Unest A/S)中找到，上述專利在此引入作為參考。
在INA探針和標(biāo)準(zhǔn)的核酸探針之間的確存在許多差異。這些差異可以方便地分為生物學(xué)的、結(jié)構(gòu)的和物理化學(xué)的差異。正如以上和以下的討論，當(dāng)試圖在典型情況下采用核酸的應(yīng)用中使用INA探針時(shí)，這些生物學(xué)的、結(jié)構(gòu)的、和物理化學(xué)的差異可以導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的結(jié)果。在化學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常觀察到這種不同組成的非等價(jià)性。
關(guān)于生物差異，核酸是在活的物種生命中作為基因傳遞和表達(dá)的因子起著重要作用的生物材料，它們的體內(nèi)性質(zhì)是了解得相當(dāng)清楚的。然而INA是最近開發(fā)的完全人造的分子，由化學(xué)家構(gòu)思并使用合成有機(jī)化學(xué)方法制備。它沒有已知的生物功能。
在結(jié)構(gòu)上，INA也顯著地不同于核酸。盡管兩者可以采用常見的核堿基(A，C，G，T和U)，這些分子的組成是結(jié)構(gòu)上多變化的。RNA、DNA和INA的骨架由重復(fù)的磷酸二酯核糖和2-脫氧核糖單位組成。INAs不同于DNA或RNA在于具有一個(gè)或多個(gè)通過接頭分子連接到該聚合物的大的扁平的分子。該扁平的分子嵌入在雙鏈結(jié)構(gòu)中相對(duì)INA的互補(bǔ)DNA鏈的堿基之間。
INA和DNA或RNA之間的物理/化學(xué)差異也是很多的。INA結(jié)合到互補(bǔ)DNA比核酸探針結(jié)合到相同靶序列更迅速。與DNA或RNA片段不同，除非嵌入基團(tuán)位于末端位置，INAs與RNA的結(jié)合差。由于互補(bǔ)DNA鏈上嵌入基團(tuán)和堿基之間強(qiáng)相互作用，INA/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性比類似的DNA/DNA或RNA/DNA復(fù)合物高。
與其他的DNA例如DNA或RNA片段或PNAs不同，INAs不顯示自身聚集或結(jié)合性質(zhì)。
概括地說，因?yàn)镮NA以序列特異性雜交到核酸，INA為開發(fā)基于探針的分析的有用候選物和特別適用于試劑盒和篩選分析。然而INA探針，不是核酸探針的等同物。因此，任何改善基于探針的分析的特異性、敏感性和可靠性的試劑盒或組合物可以有效用于檢測(cè)、分析和定量含DNA的樣品。INAs具有用于所述目的的必要性質(zhì)。
在步驟(b)，可以使用兩個(gè)檢測(cè)配體，其中一個(gè)配體能夠結(jié)合到包含一個(gè)或多個(gè)甲基化的胞嘧啶的核酸區(qū)域，而另一個(gè)配體能夠結(jié)合到(步驟(a))處理前不包含甲基化胞嘧啶的對(duì)應(yīng)區(qū)域。由于樣品可以包含靶核酸的許多拷貝，經(jīng)常所述拷貝具有不同的甲基化的量。因此，兩個(gè)配體結(jié)合的比例將與樣品中靶核酸的甲基化程度成比例。這兩個(gè)配體可以在一個(gè)檢測(cè)中一同添加或可以在平行試驗(yàn)中單獨(dú)加入。各配體可以包含在一個(gè)檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)或分開檢測(cè)的獨(dú)特的標(biāo)記，或具有相同標(biāo)記并分別地在單獨(dú)的檢測(cè)中檢測(cè)。
優(yōu)選地，捕捉配體選自INA探針、PNA探針、LNA探針、HNA探針、ANA探針、MNA探針、CNA探針、寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、單鏈DNA、RNA、適配子、抗體、蛋白、肽、其組合，或其嵌合的形式。
更優(yōu)選，捕捉配體是INA探針、PNA探針或寡核苷酸探針。進(jìn)一步優(yōu)選，捕捉配體是INA探針。
支持物是任何適合的支持物，例如塑料材料、熒光珠、磁珠、成形粒子、板、微量滴定板、合成或天然膜、乳膠珠、聚苯乙烯、柱支持物、玻璃珠或載玻片、納米管、纖維或其他有機(jī)的或無機(jī)的支持物。優(yōu)選地，支持物是磁珠、熒光珠、成形粒子或一孔或多孔的微量滴定板。
固相基質(zhì)一般地是玻璃或聚合物，最常使用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物可以以管、珠、盤或微量培養(yǎng)板，或任何其他的適于進(jìn)行分析的表面的形式。結(jié)合方法是現(xiàn)有技術(shù)公知的，通常組成為共價(jià)交聯(lián)結(jié)合或物理吸附分子到不溶性載體上。
在優(yōu)選的形式中，步驟(b)包括多個(gè)排列在固相支持物上的捕捉配體。陣列可以包含多拷貝相同配體以在陣列上捕捉相同靶核酸或可以包含多個(gè)不同的靶向到不同核酸的配體以在陣列上捕捉多個(gè)靶核酸分子。一般地，陣列包括大約10到200,000個(gè)捕捉配體。然而可以理解陣列可以具有任意數(shù)目的捕捉配體。
在一種形式中，捕捉寡核苷酸探針、INA探針、或捕捉PNA探針可以位于陣列上用于捕捉亞硫酸氫鹽處理的核酸以測(cè)量核酸的甲基化狀態(tài)。陣列技術(shù)是已公知的并已經(jīng)用于在未處理的樣品中檢測(cè)基因或核苷酸序列的存在。然而本發(fā)明可以擴(kuò)展陣列技術(shù)的有用性以提供諸多不同來源的核酸關(guān)于甲基化狀態(tài)的有價(jià)值的信息。
在優(yōu)選的形式中，樣品可以是任何生物樣品，例如干細(xì)胞、血液、尿、糞便、精液、腦脊髓液、細(xì)胞或組織例如腦、結(jié)腸、泌尿生殖組織、肺、腎、生血組織、乳房、胸腺、睪丸、卵巢，或子宮，環(huán)境的樣品，微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌、原生動(dòng)物、類病毒等等。干細(xì)胞包括含真正祖細(xì)胞的細(xì)胞群體。這也適用于生殖細(xì)胞群體以及包括與體細(xì)胞融合形成能夠采用特定表型的雜交細(xì)胞的干細(xì)胞。
優(yōu)選地，修飾劑能夠修飾未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶。修飾劑優(yōu)選選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽和檸檬酸鹽。優(yōu)選地，試劑是亞硫酸氫鈉，以及胞嘧啶被修飾為尿嘧啶。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“修飾”表示未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為另一核苷酸，這將區(qū)分未甲基化和甲基化的胞嘧啶。優(yōu)選地，所述試劑將未甲基化的胞嘧啶修飾為尿嘧啶。優(yōu)選地，用來修飾未甲基化胞嘧啶的試劑是亞硫酸氫鈉。其他類似地修飾未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶的試劑也可以用于本發(fā)明的這一方法中。例子包括但不限于亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。優(yōu)選地，所述試劑是亞硫酸氫鈉，其在有水的情況下將胞嘧啶修飾成尿嘧啶。
亞硫酸氫鈉(NaHSO3)與胞嘧啶的5，6-雙鍵容易地反應(yīng)，但與甲基化的胞嘧啶反應(yīng)很差。胞嘧啶與亞硫酸氫鹽離子反應(yīng)形成易于脫氨的磺酸化胞嘧啶反應(yīng)中間體，生成磺酸化尿嘧啶?；撬猁}基團(tuán)可在堿性條件下除去，產(chǎn)生尿嘧啶。因此全部的未甲基化的胞嘧啶將被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶將免于轉(zhuǎn)化，從而可以制備識(shí)別含胞嘧啶序列或?qū)?yīng)的含尿嘧啶序列的配體。兩個(gè)探針結(jié)合的比例可以提供給定的核酸中甲基化程度的精確測(cè)量。
重要的是，在許多情形下無需擴(kuò)增核酸以獲得需要的信息，因此克服潛在的錯(cuò)誤和產(chǎn)生更快速和更簡(jiǎn)便的適于自動(dòng)化的分析。對(duì)本發(fā)明而言在捕捉后擴(kuò)增或在處理前選擇核酸也是可能的。
在優(yōu)選的形式中，檢測(cè)配體涉及含CpG或CpNpG的DNA區(qū)域，其中N指定四個(gè)可能堿基A、T、C或G中的任何一個(gè)。優(yōu)選地，含CpG-或CpNpG-的DNA區(qū)域處于基因的調(diào)控區(qū)域，或任何調(diào)控元件的增強(qiáng)子區(qū)域，所述調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、癌基因、逆元件、可移動(dòng)的序列，或活性被環(huán)境因素改變的其他調(diào)控元件，所述環(huán)境因素包括化學(xué)品、毒素、藥物、輻射、合成或天然的化合物和微生物或其他的傳染因子如病毒、細(xì)菌、真菌和朊病毒。例如，啟動(dòng)子或調(diào)控元件是腫瘤抑制基因啟動(dòng)子、癌基因或任何可以控制或影響一個(gè)或多個(gè)與疾病狀態(tài)相關(guān)或改變正常狀態(tài)例如老化的基因的其他的元件或區(qū)域。
樣品DNA中存在含甲基化的CpG或CpNpG的區(qū)域可以顯示細(xì)胞功能性變化，特別是關(guān)于細(xì)胞重新編程。變化還可以是增殖異常。其可以包括低級(jí)星形細(xì)胞瘤、退行發(fā)育性星形細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、白血病、乳癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤，或正常細(xì)胞分裂、干細(xì)胞群體的分化或代謝/分解代謝失調(diào)。
為幫助核酸修飾劑的反應(yīng)，可以添加任選的添加劑例如尿素、甲氧胺和其混合物。
步驟(b)一般地用于捕捉在本方法后面的步驟中分析其甲基化的目的核酸。因此，步驟(b)實(shí)現(xiàn)目的核酸的捕捉和濃縮。優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)INA探針用于步驟(b)中。
在一個(gè)優(yōu)選的形式中，步驟(b)包括多個(gè)排列在固相支持物上的捕捉配體。所述陣列可以包括多拷貝的相同配體以在陣列上捕捉相同的靶核酸用于隨后的檢測(cè)。另外地，所述陣列可以包含多個(gè)靶向到不同的DNA分子的不同的捕捉配體，以在陣列上捕捉許多不同的靶DNA樣品用于隨后的檢測(cè)。在優(yōu)選的形式中，捕捉配體結(jié)合到微量滴定板的孔上以可以進(jìn)行多重測(cè)定。
在步驟(d)，可以使用兩個(gè)檢測(cè)配體，其中一個(gè)配體能夠結(jié)合到包含一個(gè)或多個(gè)甲基化的胞嘧啶的核酸區(qū)域，而第二配體能夠結(jié)合到不包含甲基化胞嘧啶的核酸對(duì)應(yīng)區(qū)域。樣品可以包含靶核酸的許多拷貝，而所述拷貝具有不同量的甲基化。因此，兩個(gè)配體結(jié)合的比例將與樣品中靶核酸的甲基化程度成比例。這兩個(gè)配體可以在一個(gè)檢測(cè)中一同添加或可以在平行試驗(yàn)中單獨(dú)加入。各配體可以包含獨(dú)特的標(biāo)記，在一個(gè)檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)或分別檢測(cè)，或具有相同的標(biāo)記并分別地在單獨(dú)的檢測(cè)中檢測(cè)。
為檢測(cè)檢測(cè)配體與靶核酸的結(jié)合，優(yōu)選配體具有連接在其上的可檢測(cè)標(biāo)記物。結(jié)合的標(biāo)記物的存在顯示配體結(jié)合的程度。適合的標(biāo)記物包括但不限于，化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、酶、半抗原，和樹枝狀聚合物(dendrimer)。
本發(fā)明使用的檢測(cè)配體用于檢測(cè)在亞硫酸氫鹽修飾后樣品中含CpG或CpNpG的DNA，可以特異性區(qū)分未處理的DNA、甲基化的和未甲基化的DNA。對(duì)非甲基化的DNA而言，寡核苷酸或PNA或INA探針形式的檢測(cè)配體優(yōu)選在3’CpG或CpNpG對(duì)中具有T或A以將其與保留在甲基化的DNA中的C區(qū)分開來。
本發(fā)明的探針可以設(shè)計(jì)成“基本上地”與待測(cè)試的基因組座位的一條鏈互補(bǔ)并包括合適的G或C核苷酸。這意味著引物應(yīng)該充分地互補(bǔ)以在允許結(jié)合的條件下與各自目的區(qū)域雜交。換句話說，所述探針優(yōu)選應(yīng)該與待雜交的5’和3’兩側(cè)序列具有足夠的互補(bǔ)性。
本發(fā)明的INA探針可以使用本領(lǐng)域已知的任何適合的方法制備。優(yōu)選地，探針按照WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133和WO 03/052134(Unest A/S)的教導(dǎo)制備，上述專利在此引入作為參考。
根據(jù)本發(fā)明涉及靶核酸的甲基化狀態(tài)的方法可以使用任何純化或未純化的形式的核酸樣品作為原材料，只要它包含，或懷疑包含特定的含靶區(qū)域(通常CpG或CpNpG)的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的形式中，未擴(kuò)增的樣品用于本發(fā)明的方法。
INA混合物或具體的INA分子可被用于在通過檢測(cè)配體捕捉前的擴(kuò)增富集步驟中。單個(gè)或許多的INAs能被用于特異性地或隨機(jī)地?cái)U(kuò)增亞硫酸氫鹽處理的核酸。
目的核酸分子可以在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(a)前選擇或濃縮。富集或選擇步驟包括但不限于，物理方法包括超聲處理和剪切、酶消化、酶處理、限制性消化、核酸酶處理、Dnase處理、濃縮、抗體捕捉，化學(xué)法包括酸或堿消化及其組合。例如，針對(duì)5-甲基胞嘧啶的抗體可以用來捕捉核酸例如富含5-甲基胞嘧啶或高度甲基化的基因組DNA。核酸來自通過任何適合的物理或酶的方法進(jìn)行裂解以將其打斷成大小更適合處理的核酸的基因組DNA。
用來檢測(cè)甲基化CpG或CpNpG的含核酸的樣本可以來自任何來源，并可以通過多種方法提取，例如Maniatis等描述的方法(MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY.，pp 280，281，1982)。
當(dāng)樣品中的核酸包含兩條鏈，必須在其被修飾前分開核酸的這些鏈。鏈分離可以單獨(dú)步驟或與化學(xué)處理同時(shí)進(jìn)行而實(shí)現(xiàn)。鏈分離可以使用不同的適合的變性條件完成，包括物理的、化學(xué)的、或酶的方法，詞“變性”包括所有這些意思。一個(gè)分離核酸鏈的物理方法包括加熱所述核酸直到它變性。對(duì)DNA來說一般熱變性可以包括溫度范圍從大約80到105℃，持續(xù)時(shí)間范圍從大約1到10分鐘。還可以通過稱作解旋酶的酶類或通過具有解旋酶活性的酶RecA和在已知使DNA變性的riboATP存在的情況下誘導(dǎo)鏈分離。適于用解旋酶進(jìn)行DNA鏈分離的反應(yīng)條件描述于Kuhn Hoffmann-Berling(CSH-QuantitativeBiology，4363，1978)和使用Rec A的技術(shù)綜述于C.Radding(Ann.Rev.Genetics，16405-437，1982).
可檢測(cè)的標(biāo)記物可以是化學(xué)發(fā)光的、熒光的或放射性的或包含微球體或納米晶體形式的第二標(biāo)記物或標(biāo)識(shí)。熒光的或放射性的微球體或納米晶體可以共價(jià)結(jié)合到捕捉或檢測(cè)配體。
優(yōu)選雜交到靶核酸的特異性用來區(qū)分甲基化胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶。
許多適合的結(jié)合到核酸并且其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光染料是已知的，一些熒光染料對(duì)單鏈DNA是選擇的。檢測(cè)系統(tǒng)還可以是攜帶正電荷區(qū)域的酶，所述區(qū)域有選擇地結(jié)合到DNA并且可以使用酶法分析檢測(cè)，或帶有正電荷的放射性分子的酶，所述分子有選擇地結(jié)合到捕捉的DNA。適合的實(shí)體還可以是核/殼CdSe/ZnS半導(dǎo)體納米晶體(Gerion等2002J Am Chem Soc 247070-7074)。
在該方法中使用INA探針作為配體之一與使用寡核苷酸或PNA探針相比具有非常顯著的優(yōu)點(diǎn)。INA結(jié)合更快達(dá)到平衡并顯示更大的序列特異性，并且由于INAs攜帶一個(gè)或多個(gè)嵌入基團(tuán)，它們比其他的配體例如寡核苷酸或PNAs以更高的結(jié)合系數(shù)結(jié)合靶DNA分子。結(jié)合特性可以通過選擇不同數(shù)目的嵌入基團(tuán)添加到INA而修飾。
由于本發(fā)明可以使用直接檢測(cè)方法，該方法可以產(chǎn)生真實(shí)和精確的樣品中靶核酸量的測(cè)量。所述方法沒有被現(xiàn)有技術(shù)方法固有的潛在偏見影響，現(xiàn)有技術(shù)的方法依賴于例如PCR方法信號(hào)放大，其中通常用于此種方法的酶可以通過不同序列的擴(kuò)增率的差別而引入系統(tǒng)偏離。
有許多檢測(cè)器系統(tǒng)和儀器可用于檢測(cè)或測(cè)量熒光或放射性。許多廠商正在進(jìn)行設(shè)備的改進(jìn)和提升。應(yīng)當(dāng)理解許多不同的量具能用于本發(fā)明。例如，多光子檢測(cè)是檢測(cè)極低量選擇的放射性同位素的專有系統(tǒng)。它比現(xiàn)有方法靈敏1000倍。它的敏感性為1000個(gè)碘125原子，定量測(cè)定zeptomole量的生物材料。它需要小于1微微居里的同位素，這比一玻璃杯水中的活性少100倍。一類MPD儀器已經(jīng)存在用于測(cè)量樣品中的放射性。它們?yōu)榕渲糜糜?6孔，384孔和更多孔的儀器。MPD使用與電腦控制電子設(shè)備結(jié)合的并發(fā)多路檢測(cè)光子，以有選擇地計(jì)數(shù)那些與操作者選擇的放射性同位素相容的光子。由于能夠使用多種不同的同位素，這是多色的系統(tǒng)。MPD圖象系統(tǒng)比磷光圖像靈敏100倍。這樣的儀器在配體或支持物被制成是放射性的本發(fā)明的檢測(cè)部分特別適合。
包含結(jié)合到其上的捕捉配體或檢測(cè)配體的珠可以通過測(cè)量熒光的細(xì)胞分類器來加工或測(cè)量。例子或適合的儀器包括流式細(xì)胞儀和其改良形式。
根據(jù)本發(fā)明的方法特別適于按比例加大和自動(dòng)化加工許多樣品。
盡管如上所述，如果有必要擴(kuò)增有限量的DNA以提供探測(cè)足夠的檢測(cè)材料，描述的方法可與這樣的擴(kuò)增方法聯(lián)用。此外，PCR可被用來有選擇地?cái)U(kuò)增已經(jīng)用針對(duì)甲基化或未甲基化的核酸的INA配體捕捉的DNA。
甲基化的DNA在本發(fā)明詳述的特定的修改中，該方法可用于區(qū)別已經(jīng)用亞硫酸氫鈉處理的DNA中甲基化胞嘧啶的存在。由于胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶而甲基胞嘧啶保持未反應(yīng)，來自甲基化和未甲基化分子的亞硫酸氫鹽處理的DNA序列是不同的。通過選擇對(duì)選定的靶區(qū)域特異性的INA配體(4到100殘基長(zhǎng)度，優(yōu)選20±10殘基長(zhǎng)度)，雜交的特異性可用于區(qū)分在CpG或CpNpG位點(diǎn)甲基化的胞嘧啶(其保持為胞嘧啶)和未甲基化的CpG或CpNpG位點(diǎn)甲基化的胞嘧啶，在未甲基化的CpG或CpNpG處胞嘧啶被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，從而保證只估價(jià)其中不在CpG或CpNpG位點(diǎn)的胞嘧啶已經(jīng)充分反應(yīng)并被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ姆肿印?br> 可以類似地檢測(cè)在其他位點(diǎn)的甲基化的胞嘧啶。合適的INA探針能被用作對(duì)照來鑒定與亞硫酸氫鹽未完全反應(yīng)的分子(一個(gè)或多個(gè)未被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ陌奏?的存在。然而應(yīng)當(dāng)理解，其他的可以區(qū)分DNA甲基化狀態(tài)的配體可以相似的方式使用。
該方法適應(yīng)用于多種形式包括多孔板，微陣列、光纖陣列和懸浮顆粒。合適選擇供陣列形式使用的特異配體可以實(shí)現(xiàn)在多個(gè)靶區(qū)域同時(shí)確定單個(gè)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。
多態(tài)性/突變和epimutation檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于區(qū)分基因的不同等位基因，其中捕捉配體和/或檢測(cè)配體的序列將與一個(gè)等位基因匹配而與另一個(gè)不匹配。
DNA定量通過使用本發(fā)明的方法，有可能直接確定DNA群體在特定的區(qū)域具有一個(gè)序列的分子對(duì)另一個(gè)序列的分子的比例。這可以通過將代表序列的替換形式的配體偶聯(lián)到支持物上而完成，所述支持物例如不同顏色熒光染料的微球體、納米晶體或放射性的分子、粒子和微量滴定板。這樣的序列差異可以是基因原來堿基序列的差異或原始DNA甲基化差異引起的亞硫酸氫鹽處理的DNA堿基順序的差異。
細(xì)胞定量該方法可以用于確定在群體(例如在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞)中在基因組的特定位點(diǎn)堿基序列有差異的細(xì)胞的比例。
變異該方法適應(yīng)用于多種形式包括多孔板，微陣列、光纖陣列和懸浮顆粒。合適選擇供陣列形式使用的特異INA探針可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定不同的DNA序列的存在，例如，用于在多個(gè)靶區(qū)域確定單個(gè)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。
整個(gè)說明書中，除非上下文另有需要，詞“包括”或變體例如“包含”或“含有”，理解為暗示包含陳述的元件，整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的組，然而并非排除任何其他的元件，整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的組。
已經(jīng)包括在本說明書內(nèi)的任何文獻(xiàn)、動(dòng)作、材料、裝置、物品等的討論僅用于提供本發(fā)明背景的目的。由于其在該申請(qǐng)的各權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期前在澳大利亞已經(jīng)存在，并不等于承認(rèn)這些事件的任何部分或全部形成與本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)或公知常識(shí)。
為更清楚地了解本發(fā)明，優(yōu)選的形式是參考以下的附圖和實(shí)施例來描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示夾心INA信號(hào)放大。
圖2顯示使用磁珠或可檢測(cè)的粒子的夾心INA信號(hào)放大技術(shù)。
圖3顯示使用抗體捕捉甲基化DNA的示意圖。
圖4顯示使用微球體檢測(cè)甲基化DNA的示意圖。
圖5顯示使用微球體檢測(cè)甲基化DNA的示意圖。
圖6顯示當(dāng)比較不接受抗體的基因組DNA樣品與抗體捕捉的樣品時(shí)提供的富集率的結(jié)果。
圖7顯示使用抗體捕捉多配體分析的非PCR信號(hào)放大的結(jié)果。結(jié)果顯示使用下列1.無抗體富集LNCaP DNA(甲基化DNA)，2.抗體富集的Du145DNA(未甲基化的DNA)和3.抗體富集的LNCaP DNA(甲基化DNA)獲得的信號(hào)。
圖8顯示甲基化DNA檢測(cè)和隨后的擴(kuò)增的示意圖。
圖9顯示INA捕捉和PCR方法的瓊脂糖凝膠圖像。特異用于未甲基化的基因組DNA序列的INA配體被連接到磁珠上并與亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA混合。所述珠/DNA復(fù)合物被洗滌，結(jié)合的分子用作下游區(qū)域PCR的模板。泳道；標(biāo)記，1，2，3。
泳道1HepG2 DNA(已知在靶位點(diǎn)甲基化)，泳道2Du145 DNA(已知在靶位點(diǎn)未甲基化)，泳道3BL13 DNA(已知在靶位點(diǎn)未甲基化)。
圖10顯示INA針對(duì)未甲基化的DNA的特異性。該圖顯示DNA甲基化的百分比。
圖11顯示INA針對(duì)甲基化的DNA的特異性。該圖顯示DNA甲基化的百分比。
圖12顯示PNA、INA和寡核苷酸樣品與合成的設(shè)計(jì)為GSTP1基因的甲基化區(qū)域的110bp寡核苷酸雜交產(chǎn)生的信號(hào)。該寡核苷酸按描述稀釋然后標(biāo)記并與樣品雜交。由此可見，INA產(chǎn)生與PNA配體相似的信號(hào)強(qiáng)度，如果不比其強(qiáng)度高的話。
圖13顯示使用INAs和使用常規(guī)的寡核苷酸作對(duì)比的雜交結(jié)果。頂端兩排信號(hào)使用INAs產(chǎn)生。底端兩排信號(hào)使用常規(guī)的寡核苷酸產(chǎn)生。從結(jié)果可以清楚地看出使用INA配體產(chǎn)生品質(zhì)更好的雜交信號(hào)。
發(fā)明的實(shí)施方式定義實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)/epigenomics/methylomics對(duì)樣品的核酸中5-甲基胞嘧啶殘基的分析，樣品來自全部生命周期階段的人、動(dòng)物、細(xì)菌(包括nanobacterial和細(xì)胞外的以及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌)和病毒，來自受精直到死后48小時(shí)的所有細(xì)胞、組織和器官，和分離自人組織、自體和非自體移植物、異種移植物的細(xì)胞(及細(xì)胞系)和它們的衍生物，以及來自冷凍的或(別的方式儲(chǔ)存的)分割的或切除的來源、組織來源例如顯微鏡用載玻片的樣品，嵌入在塊或液體培養(yǎng)基中的樣品，或提取自合成或天然的表面或液體的樣品。
實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)/epigenomics/methylomics包括健康個(gè)體的細(xì)胞、組織和器官(健康如WHO所定義)，以及患病個(gè)體的細(xì)胞、組織和器官之間天然產(chǎn)生的5-甲基胞嘧啶差異的分析(患病的概念包括參考Harrison內(nèi)科學(xué)原理，12th版，Jean D Wilson等編輯，McGraw Hill Inc，及后續(xù)版本中所述或所指的全部人類疾病、痛苦、小毛病和異常癥狀，以及OMIM，Online Mendelian Inheritance inMan，www.ncbi.gov中描述的所有疾病、痛苦、小毛病和異常癥狀)，但重點(diǎn)是首位的致死因素，即惡性的贅生物、(癌)、缺血性心臟病、腦血管疾病、慢性阻塞性肺病、肺炎和流行性感冒、動(dòng)脈疾病、(包括動(dòng)脈粥樣硬化和主動(dòng)脈瘤)、糖尿病，和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、加上社會(huì)性地衰弱癥狀，比如憂慮、壓力有關(guān)神經(jīng)精神病學(xué)癥狀和肥胖，和所有由異常染色體數(shù)或染色體重排、(包括常染色體和性染色體的非整倍性，在種系或體細(xì)胞條件下的重復(fù)、缺失、易位和插入)，以及相似的線粒體基因組異常引起的癥狀。
正常的或患病的個(gè)體可以來自，(a)不同種族和演化世系的群體(b)，菌株和地理分離株(c)，亞種，(d)相同或不同性別的孿生子或高級(jí)多胎，(e)來自正常的接合生殖方法、人工授精、胚胎干細(xì)胞方法克隆得到的個(gè)體，或核轉(zhuǎn)移，(來自體細(xì)胞或種系的細(xì)胞核)，或通過細(xì)胞質(zhì)的提出物或外緣因子修飾細(xì)胞或核，(轉(zhuǎn)決定和轉(zhuǎn)分化)，或來自輸入或修飾線粒體或其他的細(xì)胞器得到的個(gè)體，(f)，來自轉(zhuǎn)基因敲除、敲入或降低方法(在體內(nèi)或是離體)，或通過基因活性被暫時(shí)或永久地改變的任何方法，例如通過RNAi、核糖酶、轉(zhuǎn)位子活化、藥物或小分子操作法、PNA、INA、AMA、AHA、等等或基于核酸的結(jié)合物，(包括然而并非局限于Trojan肽)改變得到的個(gè)體，或處于懷孕(正常的或異位的)任何階段的個(gè)體。
實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)/epigenomics/methylomics指來自以細(xì)胞外的或細(xì)胞內(nèi)的方式與人類疾病相關(guān)的原核或真核生物和病毒(或其組合)的核酸中5-甲基胞嘧啶殘基的分析，用于在正常變化的和患病的系統(tǒng)中確定和治療地改變變化的參數(shù)和下列潛在機(jī)制的目的(i)遺傳性疾病；
(ii)由環(huán)境誘導(dǎo)因子引起的非遺傳的或后生的疾病，不管是生物學(xué)的或非生物學(xué)的來源，(環(huán)境的在這種意義上講還包括有機(jī)體本身內(nèi)部的環(huán)境，在懷孕的整個(gè)階段期間，或在受精和不育處理的癥狀下)；(iii)遺傳的或非遺傳性疾病的傾向，包括由“朊病毒”類因子，通過暴露到壓力變化和失重、或通過輻射作用導(dǎo)致的疾??；(iv)所有細(xì)胞類型、組織、器官系統(tǒng)和生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)在老化的過程中5-甲基胞嘧啶的改變，包括老化有關(guān)的抑郁癥、疼痛、神經(jīng)精神病學(xué)的和神經(jīng)退行性的病癥和絕經(jīng)前后的病癥，(包括在兩性中生育力的降低)；(v)在癌癥(或由體細(xì)胞的核酸劑量改變而加強(qiáng)的疾?。话ň哂挟惓Ｈ旧w組型的細(xì)胞由于核酸擴(kuò)增、刪除、重排、易位和插入事件引起的改變)中5-甲基胞嘧啶的改變，以及在不同的細(xì)胞周期現(xiàn)象(包括細(xì)胞周期對(duì)晝夜節(jié)律、光周期、睡眠、記憶、和“時(shí)差綜合癥”的影響)中它們的變異或變化；(vi)最廣義定義的新陳代謝網(wǎng)絡(luò)中5-甲基胞嘧啶的改變，來自通過胚胎發(fā)生的受精卵、胎兒的發(fā)育、出生、青春期、成人期以及老年期(包括通過組織缺氧、血缺氧、任何類型的輻射(不管是電離的或非電離的、或來自化療處理、或暴露高緯度)、壓力、或通過線粒體、細(xì)胞核或細(xì)胞器基因組之間的不平衡帶來的代射影響；(vii)由于在分子、細(xì)胞、組織、器官以及完整的有機(jī)體水平對(duì)蛋白、多肽、肽、以及DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA等或?qū)﹄倪m配子(包括任何具有翻譯后添加，翻譯后切割產(chǎn)物，翻譯后修飾(例如inteins和exeins，泛素化產(chǎn)物和降解產(chǎn)物)的反應(yīng)而產(chǎn)生的5-甲基胞嘧啶的改變；對(duì)含稀有的天然氨基酸的蛋白、多肽和肽，以及單個(gè)的稀有氨基酸例如與學(xué)習(xí)、腦的生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡相關(guān)的D-絲氨酸的反應(yīng)而產(chǎn)生的改變；對(duì)藥物、生物藥劑、化學(xué)實(shí)體(此處化學(xué)實(shí)體和生物藥劑的定義見于G.Ashton 2001，Nature Biotechnology 19，307-3111)，代謝產(chǎn)物、新的鹽、前體藥物、現(xiàn)有化合物的酯、疫苗、抗原、聚酮化合物、非核糖體肽、維生素和來自任何天然來源的分子(例如來自植物的環(huán)杷明(cyclopamine))的反應(yīng)而產(chǎn)生的改變；
(viii)由于在分子、細(xì)胞、組織、器官和完整有機(jī)體水平對(duì)單鏈或雙鏈RNA和DNA病毒的反應(yīng)而產(chǎn)生的5-甲基胞嘧啶的改變，不管所述病毒來自外部來源還是內(nèi)部活化的例如在內(nèi)源的轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)座子中活化，(SINES和LINES)；(ix)由于在分子、細(xì)胞、組織、器官和完整有機(jī)體水平對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄本的反轉(zhuǎn)錄拷貝的反應(yīng)而產(chǎn)生的5-甲基胞嘧啶的改變，不管RNA轉(zhuǎn)錄本是基因的或非基因的來源，(或是否包含內(nèi)含子)；(x)由于在分子、細(xì)胞、組織、器官和完整有機(jī)體水平對(duì)下列物質(zhì)的反應(yīng)而產(chǎn)生的5-甲基胞嘧啶的改變(a)DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA等等(或DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA、全部組合中的任意適配子)；包括在所有流體包括血液和腦脊髓液以及在懷孕之前、期間和之后母體流體中循環(huán)的DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA等分子(b)結(jié)合的生物分子的組合，所述分子為肽和核酸的嵌合物；或天然分子例如膽固醇部分、激素和核酸的嵌合物，以及(xi)由于干細(xì)胞，或使用最廣義的perturbogen已經(jīng)被(或正在被)的轉(zhuǎn)決定或轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞(包括來自非人源例如兩棲類卵母細(xì)胞、植物、動(dòng)物、細(xì)菌或病毒來源、藥物、抗體、或任何其混合物的perturbogen)的反應(yīng)引起的5-甲基胞嘧啶的改變，沿著對(duì)任何其他已存在的或新的細(xì)胞類型的軌道，優(yōu)選沿著至或來自干細(xì)胞的軌道，(或者在體內(nèi)、離體或與新的環(huán)境或天然的以及合成基質(zhì)或者其組合有關(guān)進(jìn)行)。
核酸術(shù)語(yǔ)“核酸”覆蓋天然存在的核酸、DNA和RNA。術(shù)語(yǔ)“核酸類似物”包含天然存在的核酸、DNA和RNA的衍生物，以及天然存在的核酸的合成類似物。合成類似物包括一種或多種核苷酸類似物。術(shù)語(yǔ)核苷酸類似物包括全部能夠被結(jié)合到核酸骨架和能夠特異性堿基配對(duì)(見下文)，基本上類似于天然存在的核苷酸的核苷酸類似物。
因此術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸類似物”表示任何基本上由多個(gè)核苷酸和/或核苷酸類似物和/或插入的假核苷酸組成的分子。對(duì)本發(fā)明有用核酸或核酸類似物可以包括許多具有不同的骨架單體單位的核苷酸。
優(yōu)選地，單鏈核酸或核酸類似物能夠與基本上互補(bǔ)的單鏈核酸和/或核酸類似物雜交以形成雙鏈的核酸或核酸類似物。更優(yōu)選這樣的雙鏈類似物能夠形成雙螺旋。優(yōu)選地，雙螺旋由氫鍵作用形成，更優(yōu)選地，雙螺旋選自A型、B型、Z型及其中間體的雙螺旋。
因此，本發(fā)明有用的核酸和核酸類似物包括，但不局限于DNA、RNA、LNA、PNA、MNA、ANA、HNA、INA和其混合物與其雜交物，以及磷原子修飾的上述物質(zhì)，例如而不是局限于硫代磷酸酯、甲基phospholates、亞磷酰胺、phosphorodithiates、phosphoroselenoates、磷酸三酯和phosphoboranoates。此外，非含磷化合物可以用來連接到核苷酸，例如而不是局限于甲基亞氨基甲基、formacetate、thioformacetate與包括酰胺的連接基團(tuán)。特別是核酸與核酸類似物可以包括一種或多種插入的假核苷酸。
在上下文中，“混合物”指包括各種不同種的核苷酸或核苷酸類似物的核酸或核酸類似物鏈。此外，在上下文中，“雜交物”的意思包括含一條鏈的核酸或核酸類似物，該鏈包含具有一種或多種骨架的核苷酸或核苷酸類似物，和含另一個(gè)鏈，其包含具有不同種的骨架的核苷酸或核苷酸類似物。
INA是指按照WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133和WO 03/052134(Unest A/S)教導(dǎo)的嵌入核酸，上述專利在此引入作為參考。HNA是指如Van Aetschot等1995描述的核酸。MNA是指Hossain等，1998描述的核酸。ANA涉及Allert等，1999描述的核酸。LNA可以是WO 99/14226(Exiqon)描述的任何LNA分子，優(yōu)選地，LNA選自WO 99/14226的摘要中描繪的分子。更優(yōu)選地，LNA是指Singh等，1998，Koshkin等，1998或Obika等，1997描述的核酸。PNA是指Nielsen等，1991描述的肽核酸。
術(shù)語(yǔ)核苷酸指定核酸或核酸類似物的構(gòu)件，而術(shù)語(yǔ)核苷酸包括天然存在的核苷酸和其衍生物以及能夠完成與天然存在的核苷酸和其衍生物基本上相同的功能的核苷酸。天然存在的核苷酸包括含四種主要核堿基腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一的脫氧核糖核苷酸，和含四種核堿基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一的核糖核苷酸。除了上述主要的或常用堿基，其他可以存在于一些核酸分子中的較少常用的天然存在的堿基包括5-甲基胞嘧啶(met-C)和6-甲基腺嘌呤(met-A)。
核苷酸類似物可以是任何能夠結(jié)合到核酸骨架并能夠特異性堿基配對(duì)的類似核苷酸的分子。非天然存在的核苷酸包括但不局限于下列物質(zhì)中包含的核苷酸DNA，RNA，PNA，INA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，α-L-核糖-LNA，α-L-木糖-LNA，β-D-木糖-LNA，α-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二環(huán)-DNA，6-氨基-二環(huán)-DNA，5-表-二環(huán)-DNA，α-二環(huán)-DNA，三環(huán)-DNA，二環(huán)[4.3.0]-DNA，二環(huán)[3.2.1]-DNA，二環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA，β-D-核糖吡喃糖基-NA，α-L-來蘇吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，α-L-RNA或α-D-RNA，β-D-RNA.
核苷酸和核苷酸類似物的功能是能夠特異性與互補(bǔ)的核苷酸通過該互補(bǔ)核苷酸核堿基的氫鍵相互作用，以及能夠結(jié)合至核酸或核酸類似物中。天然存在的核苷酸，以及一些核苷酸類似物能夠通過酶作用結(jié)合至核酸或核酸類似物中，例如通過RNA或DNA聚合酶。然而，核苷酸或核苷酸類似物還可以通過化學(xué)方法結(jié)合至核酸或核酸類似物中。
此外，核酸或核酸類似物可以通過偶聯(lián)兩個(gè)小的核酸或核酸類似物到另一個(gè)上面而制備，例如這可通過酶法例如連接酶或通過化學(xué)法而完成。
核苷酸或核苷酸類似物包括骨架單體單位和核堿基。核堿基可以是天然存在的核堿基或其衍生物或其能夠完成基本上相同功能的類似物。核堿基的功能是能夠特異性地與一個(gè)或多個(gè)其他的核堿基通過氫鍵聯(lián)合。因此核堿基的重要特征是它只能與一個(gè)或幾個(gè)其他的核堿基形成穩(wěn)定的氫鍵，但是不能與大多數(shù)其他的核堿基通常包括它本身形成穩(wěn)定的氫鍵。一個(gè)核堿基與另一個(gè)核堿基的特異相互作用通常命名為“堿基配對(duì)”。
堿基配對(duì)在預(yù)先決定和互補(bǔ)的核苷酸之間產(chǎn)生特異的雜交?；パa(bǔ)的核苷酸是包括能夠堿基配對(duì)的核堿基的核苷酸。
在常用的天然存在的核堿基中，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配對(duì)；以及鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對(duì)。因此，包含A的核苷酸與包含T或U的核苷酸互補(bǔ)，而包含G的核苷酸與含C的核苷酸互補(bǔ)。
核苷酸可以進(jìn)一步被衍生化包含附加的分子實(shí)體。核苷酸可以在核堿基上或在單體單位的骨架上衍生。優(yōu)選的在堿基上的衍生位點(diǎn)包括8-位腺嘌呤，5-位尿嘧啶，5-或6-位胞嘧啶，和7-位鳥嘌呤。雜環(huán)的修飾可以歸為三種結(jié)構(gòu)類型增強(qiáng)的堿基堆積、附加的氫鍵作用、和這些類別的組合。通過擴(kuò)展平面系統(tǒng)的π電子云增強(qiáng)堿基堆積的修飾由在嘧啶的5位和7-脫氮嘌呤的7-位上共軛的、親脂性的修飾來表示。在嘧啶5-位修飾的置換包括丙炔、己炔、噻唑和只是甲基；7-位脫氮嘌呤的取代基包括碘、丙炔基、和氰基基團(tuán)。還可能修飾胞嘧啶的5-位從丙炔到五元雜環(huán)和到三環(huán)稠合系統(tǒng)，其發(fā)源自4-和5-位(胞嘧啶箝位)。第二種雜環(huán)修飾由2-氨基-腺嘌呤代表，其中附加的氨基基團(tuán)在A-T堿基對(duì)提供另一氫鍵，類似于G-C堿基對(duì)的三個(gè)氫鍵。提供組合效果的雜環(huán)修飾由2-氨基-7-脫氮-7-修飾的腺嘌呤和具有異源雙鏈體的乙氧基氨基官能團(tuán)的三環(huán)胞嘧啶類似物來代表。此外，N2-修飾的2-氨基腺嘌呤修飾的寡核苷酸是通常的修飾。在核糖或脫氧核糖部分上優(yōu)選的衍生位點(diǎn)是非連接碳位置C-2’和C-4’修飾，連接碳C-1’，C-3’和C-5’的修飾，糖氧的置換、O-4’，脫水糖修飾(構(gòu)象限制的)、環(huán)糖修飾(構(gòu)象限制的)、核糖呋喃糖基環(huán)大小變化、糖到糖的連接位點(diǎn)、(C-3’到C-5’/C-2’到C-5’)，雜原子環(huán)修飾的糖以及上述修飾的組合。然而，其他位點(diǎn)可以衍生，只要核酸或核酸類似物的總體堿基配對(duì)特異性沒有破壞。最后，如果骨架單體單位包括磷酸基，一些骨架單體單位的磷酸酯可被衍生化。
此處使用的寡核苷酸或寡核苷酸類似物是基本上由核苷酸和/或核苷酸類似物和/或嵌入假核苷酸的序列組成的分子。優(yōu)選寡核苷酸或寡核苷酸類似物包含5到100個(gè)單獨(dú)的核苷酸。寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以包括DNA、RNA、LNA、2’-O-甲基RNA、PNA、ANA、HNA和其混合物，以及任何其他的核苷酸和/或核苷酸類似物和/或嵌入假核苷酸。
對(duì)應(yīng)的核酸核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物當(dāng)它們能夠雜交被認(rèn)為是對(duì)應(yīng)的。優(yōu)選對(duì)應(yīng)的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在低嚴(yán)格條件下雜交，更優(yōu)選對(duì)應(yīng)的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在中等嚴(yán)格條件下雜交，更優(yōu)選對(duì)應(yīng)的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在高嚴(yán)格條件下雜交。
此處使用的高嚴(yán)格條件應(yīng)該表示通常Southern印跡和雜交中所用的嚴(yán)格程度，如Southern E.M.，1975，J.Mol.Biol.98503-517的描述。為此目的，常規(guī)的實(shí)踐包括預(yù)雜交和雜交的步驟。這樣的步驟通常使用含以下物質(zhì)的溶液完成6xSSPE，5％Denhardt’s，0.5％SDS，50％甲酰胺，100μg/ml變性鮭魚精子DNA(在42℃溫育18小時(shí))，隨后用2×SSC和0.5％SDS(在室溫和在37℃)洗滌，并用0.1×SSC和0.5％SDS洗滌(在68℃溫育30分鐘)，如Sambrook等.，1989，“Molecular Cloning/A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor)的描述，此處引入作為參考。
此處使用的中等嚴(yán)格條件應(yīng)該表示在包含1mM EDTA、10mMNa2HPO4·H2O、140mM NaCl、pH7.0的緩沖液中雜交。優(yōu)選地，提供大約1.5μm各核酸或核酸類似物鏈。替代的中等嚴(yán)格程度可以表示在包含50mM KCI，10mM TRIS-HCI(pH9.0)，0.1％Triton X-100，2mM MgCl2的緩沖液中的雜交。
低嚴(yán)格條件表示在1M NaCl、10mM Na3PO4、pH7.0的緩沖液中的雜交。
此外，對(duì)應(yīng)的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸在給定的序列基本上彼此互補(bǔ)，例如大于70％互補(bǔ)，例如大于75％互補(bǔ)，例如大于80％互補(bǔ)，例如大于85％互補(bǔ)，例如大于90％互補(bǔ)，例如大于92％互補(bǔ)，例如大于94％互補(bǔ)，例如大于95％互補(bǔ)，例如大于96％互補(bǔ)，例如大于97％互補(bǔ)。
優(yōu)選給定的序列長(zhǎng)至少10個(gè)核苷酸，例如至少15個(gè)核苷酸，例如至少20個(gè)核苷酸，例如至少25個(gè)核苷酸，例如至少30個(gè)核苷酸，例如10到500個(gè)核苷酸，例如10到100個(gè)核苷酸，例如10到50個(gè)核苷酸。更優(yōu)選對(duì)應(yīng)的核苷酸或核苷酸類似物基本上全長(zhǎng)互補(bǔ)。
交叉雜交術(shù)語(yǔ)交叉雜交包括在至少兩個(gè)核酸或核酸類似物之間非所需的雜交。因此術(shù)語(yǔ)交叉雜交可以用來描述例如核酸探針或核酸類似物探針序列雜交到除其預(yù)定目標(biāo)序列以外的其他的核酸序列或核酸類似物序列。
交叉雜交經(jīng)常發(fā)生在探針和一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)的非靶序列之間，即使這些序列具有比探針和其對(duì)應(yīng)的靶序列低的互補(bǔ)程度。這種不需要的效果起因于探針相對(duì)于靶大量過剩和/或迅速的退火動(dòng)力學(xué)。交叉雜交還在少數(shù)核堿基之間通過氫鍵作用發(fā)生，例如在PCR反應(yīng)的引物之間，導(dǎo)致形成引物二聚物和/或非特定的PCR產(chǎn)物。
包括一種或多種對(duì)同類型核苷酸類似物具有高親合力的核苷酸類似物的核酸根據(jù)堿基配對(duì)趨向于形成二聚物或更高級(jí)復(fù)合物。包含核苷酸類似物例如但不局限于LNA、2’-O-甲基RNA和PNA的探針通常對(duì)包含同類型骨架單體單位的寡核苷酸類似物具有高親合力。因此即使單獨(dú)的探針分子只有低互補(bǔ)程度它們還是趨向于雜交。
自雜交術(shù)語(yǔ)自雜交包括核酸或核酸類似物分子通過在其自身上折疊而退火到本身，產(chǎn)生例如發(fā)夾結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的過程，或一個(gè)分子結(jié)合到另一相同的分子導(dǎo)致分子聚集的過程。在大多數(shù)應(yīng)用中避免自雜交是非常重要的。此外，自雜交還可以增加本底信號(hào)和顯著地降低分子生物學(xué)方法或分析的靈敏度。二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生可以抑制與所需的核酸靶序列的雜交。在大多數(shù)分析中，例如當(dāng)核酸或核酸類似物被用作PCR反應(yīng)的引物或作為核酸外切酶分析的熒光/猝滅劑標(biāo)記的探針時(shí)，上述自雜交是不希望得到的。在兩個(gè)分析中，自雜交將抑制雜交到靶核酸而且另外降低核酸外切酶分析中熒光團(tuán)猝滅的程度。
包括一種或多種對(duì)同類型的核苷酸類似物具有高親合力的核苷酸類似物的核酸趨向于自雜交。包含核苷酸類似物例如但不局限于LNA、2’-O-甲基RNA和PNA的探針通常具有自雜交高親合力。因此即使單獨(dú)的探針分子只具有低互補(bǔ)程度，它們還是趨向于自雜交。
解鏈溫度核酸的解鏈?zhǔn)侵鸽p鏈核酸分子兩條鏈的分離。解鏈溫度(Tm)表示存在50％螺旋狀(雜交的)對(duì)比卷曲(未雜交的)形式時(shí)的攝氏溫度。
高解鏈溫度表示穩(wěn)定的復(fù)合物和因此在單獨(dú)的鏈之間具有高親合力。類似地，低解鏈溫度表現(xiàn)在單獨(dú)的鏈之間相對(duì)低的親合力。因此，通常在兩條鏈之間強(qiáng)的氫鍵作用產(chǎn)生高解鏈溫度。
此外，在雙鏈核酸的核堿基之間插入嵌入劑還可以穩(wěn)定雙鏈核酸并因此產(chǎn)生高解鏈溫度。
此外，解鏈溫度取決于周圍環(huán)境的物理/化學(xué)狀態(tài)。例如解鏈溫度取決于鹽濃度和pH。
解鏈溫度可以通過許多分析來確定，例如可以通過使用紫外光譜來確定雜交的形成和分解(解鏈)。
嵌入核酸(INA)或嵌入假核苷酸本說明書中嵌入核酸(INA)還命名為嵌入假核苷酸。
假核苷酸或多核苷酸類似物包括嵌入劑并具有一個(gè)或多個(gè)以下合乎需要的特征在預(yù)定位置嵌入到雙螺旋中；I.大大增加對(duì)DNA的親合力；II.抑制或降低自雜交和交叉雜交；III.區(qū)分不同的核酸，比如RNA和DNA；IV.大大增加雜交的特異性；V.增加核酸酶的穩(wěn)定性；VI.顯著地增強(qiáng)鏈的侵入；
VII.顯示雜交時(shí)熒光強(qiáng)度的變化。
嵌入假核苷酸具有下列通式結(jié)構(gòu)X-Y-Q其中X是能夠結(jié)合至核酸或核酸類似物骨架的骨架單體單位，Q是包含至少一個(gè)基本上平面共軛系的嵌入劑，其能夠與DNA的核堿基共堆積；以及Y是連接骨架單體單位和嵌入劑的接頭部分。
更優(yōu)選嵌入假核苷酸具有下列通式結(jié)構(gòu)X-Y-Q其中X是能夠結(jié)合至通式核酸或核酸類似物的骨架的骨架單體單侍， 其中n＝1到6R1是三價(jià)或五價(jià)取代的磷原子，R2分別選自能夠形成至少兩個(gè)鍵的原子，R2任選分別地取代，以及R6是保護(hù)基；Q是含至少一個(gè)基本上平面共軛系的嵌入劑，其能夠與DNA的核堿基共堆積；以及Y是連接骨架單體單位的任何R2和嵌入劑的接頭部分；和其中Q和Y的總長(zhǎng)度為大約 到 。
當(dāng)嵌入劑是芘，例如，Q和Y的總長(zhǎng)度為大約9到13，優(yōu)選從大約9到11。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合至核酸或核酸類似物的骨架”是指嵌入假核苷酸可以被插入到核酸和/或核酸類似物序列中。
術(shù)語(yǔ)“平面共軛系”是指基本上全部包括在共軛系中的原子位于一個(gè)平面。
術(shù)語(yǔ)“基本平面共軛系”是指任何時(shí)候至多20％的所有包括在共軛系中的原子沒有位于同一平面。
術(shù)語(yǔ)“共軛系”是指含有三個(gè)或更多個(gè)相鄰原子的原子p軌道重疊的化學(xué)鍵的結(jié)構(gòu)單位(Gold等，1987.Compendium of ChemicalTerminology，Blackwell Scientific Publications，Oxford，UK).
共堆積是共軸堆積的簡(jiǎn)略形式。共軸堆積是能量有利的結(jié)構(gòu)，其中平面分子沿著堆積樣機(jī)構(gòu)中的共軸成行于彼此的上面(平面對(duì)著平面)。共堆積需要單獨(dú)分子的兩個(gè)π電子云之間的相互作用。就嵌入假核苷酸來說，與核堿基以雙鏈體的形式共堆積，優(yōu)選在相對(duì)的鏈上有π電子系統(tǒng)的相互作用，更優(yōu)選在兩條鏈上有π電子系統(tǒng)的相互作用。共堆積相互作用在分子間和分子內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。例如核酸采用雙鏈體結(jié)構(gòu)以允許核堿基共堆積。
骨架單體單位可以采用任何適合的骨架單體單位。骨架單體單位包括可以結(jié)合至寡核苷酸或寡核苷酸類似物骨架的部分嵌入假核苷酸。此外，骨架單體單位可以包括一個(gè)或多個(gè)離去基團(tuán)、保護(hù)基和/或活性基團(tuán)，其在包含骨架單體單位的寡核苷酸或寡核苷酸類似物合成期間或合成之后可以任何方式除去或改變。
術(shù)語(yǔ)‘骨架單體單位’只包括骨架單體單位本身，它不包括，例如，將骨架單體單位連接到嵌入劑的接頭。因此，嵌入劑以及接頭不是骨架單體單位的的一部分。
因此，骨架單體單位只包括選自下列原子，其中單體結(jié)合至序列中能夠形成與相鄰核苷酸的骨架單體單位連接的原子；或至少在兩個(gè)位點(diǎn)連接到其他原子的骨架單體單位的原子；或在一個(gè)位點(diǎn)連接到骨架單體單位而不連接到其他原子的原子。
骨架單體單位原子因此被定義成當(dāng)該單體結(jié)合至序列中時(shí)，該原子參與相鄰核苷酸的骨架磷原子之間的直接連接(最短路徑)，其中那相鄰的核苷酸是天然存在的核苷酸。
骨架單體單位可以是任何適合的骨架單體單位。骨架單體單位可以例如選自下列骨架單體單位DNA，RNA，PNA，INA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，α-L-核糖-LNA，α-L-木糖-LNA，β-D-木糖-LNA，α-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二環(huán)-DNA，6-氨基-二環(huán)-DNA，5-表-二環(huán)-DNA，α-二環(huán)-DNA，三環(huán)-DNA，二環(huán)[4.3.0]-DNA，二環(huán)[3.2.1]-DNA，二環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA，β-D-核糖吡喃糖基-NA，α-L-來蘇吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，α-L-RNA或α-D-RNA，β-D-RNA.
LNA(鎖核酸)的骨架單體單位是空間限制的DNA骨架單體單位，其包括限制通常的DNA骨架單體單位構(gòu)象自由度的分子內(nèi)橋。LNA可以是任何WO 99/14226(Exiqon)描述的LNA分子。優(yōu)選的LNA包括連接2’-O位置到4’-C位置的甲基接頭，然而其他的LNA例如其中2’氧原子被氮或硫取代的LNA也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
嵌入假核苷酸的骨架單體單位優(yōu)選在被結(jié)合至寡核苷酸和/或核苷酸類似物中時(shí)具有下列通式 其中n＝1到6，優(yōu)選n＝2到6，更優(yōu)選n＝3到6，更優(yōu)選n＝2到5，更優(yōu)選n＝3到5，更優(yōu)選n＝3到4；R1是三價(jià)或五價(jià)取代的磷原子，優(yōu)選R1是 或 其中R2可以分別選自能夠形成至少兩個(gè)鍵的原子，該原子任選分別地取代，優(yōu)選R2分別選自O(shè)、S、N、C、P，任選分別地取代。術(shù)語(yǔ)“分別地”是指R2可以代表相同分子中一個(gè)、兩個(gè)或更多不同的基團(tuán)。在兩個(gè)R2之間鍵可以飽和或不飽和或是環(huán)狀系統(tǒng)的一部分或其組合。各R2可以分別用任何適合的取代基取代，例如選自H、低級(jí)烷基、C2-C6鏈烯基、C6-C10芳基、C7-C11芳甲基、C2-C7酰氧基甲基、C3-C8烷氧基羰氧基甲基、C7-C11aryloyloxymethyl、C3-C8S-?；?2-硫乙基的取代基。
“烷基”基團(tuán)是指任選取代的飽和的脂肪族烴、包括直鏈、支鏈和環(huán)狀的烷基。優(yōu)選地，烷基具有1到25個(gè)碳和包含不超過20個(gè)雜原子。更優(yōu)選，它是1到12個(gè)碳低級(jí)烷基，更優(yōu)選1到6碳，更優(yōu)選1到4碳。雜原子優(yōu)選選自氮、硫、磷和氧。
“鏈烯基”基團(tuán)是指任選取代的含至少一個(gè)雙鍵的碳?xì)浠衔?，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀的鏈烯基基團(tuán)，所有這些基團(tuán)都可以被任選取代。優(yōu)選地，鏈烯基具有2到25個(gè)碳和包含不超過20個(gè)雜原子。更優(yōu)選，它是2到12個(gè)碳的低級(jí)鏈烯基，更優(yōu)選2到4個(gè)碳。雜原子優(yōu)選選自氮、硫、磷和氧。
“炔基”基團(tuán)是指任選取代的含至少一個(gè)三鍵的不飽和烴，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀的炔基基團(tuán)，所有這些基團(tuán)都可以被任選取代。優(yōu)選地，炔基具有2到25個(gè)碳和包含不超過20個(gè)雜原子。更優(yōu)選，它是2到12個(gè)碳的低級(jí)炔基，更優(yōu)選2到4個(gè)碳。雜原子優(yōu)選選自氮、硫、磷和氧。
“芳基”是指任選取代的具有至少一個(gè)帶有共軛π電子系統(tǒng)的環(huán)的芳基，包括碳環(huán)芳基、雜環(huán)芳基、二芳基和三芳基基團(tuán)。芳基置換取代基的例子包括烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、取代氨基、羧基、羥基、烷氧基、硝基、磺酰、鹵素、硫醇和芳氧基。
“碳環(huán)芳基”是指芳環(huán)上所有的原子是碳原子的芳基。如上所述，芳基的碳原子被任選取代。優(yōu)選地，碳環(huán)芳基是任選取代的苯基。
“雜環(huán)芳基”是指在芳環(huán)上具有1到3個(gè)雜原子作為環(huán)原子和其余的環(huán)原子是碳原子的芳基。適合的雜原子包括氧、硫，和氮。雜環(huán)芳基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低級(jí)烷基吡咯、嘧啶基、吡嗪基、和咪唑基。雜環(huán)芳基的芳基如上所述被任選取代。
在兩個(gè)或更多個(gè)R2上的取代基可以替代連接以形成環(huán)狀系統(tǒng)，例如任何上述定義的環(huán)狀系統(tǒng)。優(yōu)選R2用選自H、甲基、R4、羥基、鹵素和氨基的原子或基團(tuán)取代，更優(yōu)選R2用選自H、甲基、R4的原子或基團(tuán)取代。更優(yōu)選R2分別選自O(shè)、S、NH、N(Me)、N(R4)、C(R4)2、CH(R4)或CH2，其中R4定義如下。
R3是甲基、β-氰乙基、p-硝基乙氧苯基、o-氯苯基、或p-氯苯基。
R4是低級(jí)烷基，優(yōu)選低級(jí)烷基例如甲基、乙基或異丙基、或雜環(huán)的例如嗎啉代、吡咯烷基或2，2，6，6-四甲基吡咯烷基，其中低級(jí)烷基定義為C1-C6，例如C1-4。
R5是烷基、烷氧基、芳基或H，附帶條件是當(dāng)X2＝O-時(shí)R5是H，優(yōu)選R5選自低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、芳氧基。在優(yōu)選方案中，芳氧基選自苯基、萘基或吡啶。
R6是保護(hù)基，選自任何適合的保護(hù)基。優(yōu)選R6選自三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、2-氯三苯甲基、1，1，1，2-四氯-2，2-二(p-甲氧基苯基)-乙烷(DATE)、9-苯基黃嘌呤-9-基(pixyl)和9-(p-甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)或其他在“Current Protocols In Nucleic Acid Chemistry”volume 1，Beaucage Wiley等中提及的保護(hù)基。更優(yōu)選，保護(hù)基可以選自單甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。最優(yōu)選保護(hù)基可以是4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
R9選自O(shè)、S、N任選取代的，優(yōu)選R9選自O(shè)、S、NH、N(Me)。
R10選自O(shè)、S、N、C、任選取代。
X1選自Cl、Br、I或N(R4)2。
X2選自Cl、Br、I、N(R4)2、或O-。
如上所述相對(duì)于取代基，骨架單體單位可以是非環(huán)狀的或環(huán)狀系統(tǒng)的一部分。
優(yōu)選地，嵌入假核苷酸的骨架單體單位選自非環(huán)形的骨架單體單位。非環(huán)形的是指包括任何骨架單體單位，其不包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)，例如骨架單體單位優(yōu)選不包括核糖或脫氧核糖基團(tuán)。
特別地，優(yōu)選嵌入假核苷酸的骨架單體單位是非環(huán)形的骨架單體單位，其能夠穩(wěn)定凸出的插入物(定義如下)。
嵌入假核苷酸的骨架單體單位可以選自包括至少選自化學(xué)基團(tuán)的骨架單體單位，所述化學(xué)基團(tuán)選自三價(jià)和五價(jià)磷原子，例如五價(jià)磷原子。更優(yōu)選，嵌入假核苷酸的骨架單體單位的磷酸酯原子可以選自包括至少一個(gè)選自下列化學(xué)基團(tuán)的骨架單體單位磷酸二酯、磷酸酯、氨基磷酸酯和亞磷酰胺基團(tuán)。
優(yōu)選的骨架單體單位包括至少一個(gè)選自下列的化學(xué)基團(tuán)磷酸、磷酸酯、磷酸二酯、氨基磷酸酯和亞磷酰胺基團(tuán)，其中當(dāng)該骨架單體單位結(jié)合至核酸骨架時(shí)，至少一個(gè)磷原子到相鄰核苷酸的至少一個(gè)磷原子的距離，不包括該磷原子，為最大6原子長(zhǎng)，例如2，例如3，例如4，例如5，例如6原子長(zhǎng)。
優(yōu)選骨架單體單位能夠以某種方式結(jié)合至核酸或核酸類似物的磷酸酯骨架，以使至多5個(gè)原子(更優(yōu)選至多4個(gè))分開嵌入假核苷酸骨架單體單位的磷原子和最近鄰的磷原子，更優(yōu)選5個(gè)原子分開嵌入假核苷酸骨架單體單位的磷原子和最近鄰磷原子，在兩個(gè)情況下，不包括該磷原子本身。
在特別優(yōu)選的形式中，所述嵌入假核苷酸包括含有亞磷酰胺的骨架單體單位，和更優(yōu)選骨架單體單位包括三價(jià)的亞磷酰胺。適合的三價(jià)亞磷酰胺是可以結(jié)合至核酸和/或核酸類似物的骨架中的三價(jià)亞磷酰胺。通常，amidit基團(tuán)可以不結(jié)合至核酸的骨架中，而是amidit基團(tuán)或amidit基團(tuán)的一部分可以作為離去基團(tuán)和/或保護(hù)基。然而，優(yōu)選骨架單體單位包括亞磷酰胺基團(tuán)，因?yàn)檫@樣的基團(tuán)可以促進(jìn)骨架單體單位摻入到核酸骨架中。
被插入到寡核苷酸或寡核苷酸類似物中的嵌入假核苷酸的骨架單體單位可以包括磷酸二酯鍵。另外，嵌入假核苷酸的骨架單體單位可以包括五價(jià)的氨基磷酸酯。優(yōu)選嵌入假核苷酸的骨架單體單位是非環(huán)形的骨架單體單位，后者可以包括五價(jià)的氨基磷酸酯。
離去基團(tuán)骨架單體單位可以包括一個(gè)或多個(gè)離去基團(tuán)。離去基團(tuán)是化學(xué)基團(tuán)，當(dāng)嵌入假核苷酸或核苷酸是單體時(shí)其是骨架單體單位的一部分，但只要嵌入假核苷酸或核苷酸已經(jīng)結(jié)合至寡核苷酸或寡核苷酸類似物，則其不再存在于分子中。
離去基團(tuán)的性質(zhì)依賴于骨架單體單位。例如，當(dāng)骨架單體單位是磷amidit，離去基團(tuán)可以，例如是二異丙胺基團(tuán)。通常，當(dāng)骨架單體單位是磷amidit，離去基團(tuán)例如以二異丙胺的形式附于磷原子上，并且離去基團(tuán)在偶聯(lián)磷原子到親核基團(tuán)時(shí)被除去，而余下的磷酸基或其一部分可以變成核酸或核酸類似物骨架的一部分。
反應(yīng)基團(tuán)此外，骨架單體單位可以包括能夠與另一核苷酸或寡核苷酸或核酸或核酸類似物進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)形成核酸或核酸類似物的活性基團(tuán)，反應(yīng)后得到的產(chǎn)物比在反應(yīng)前長(zhǎng)一個(gè)核苷酸。因此，當(dāng)核苷酸處于它們的游離態(tài)，即未結(jié)合至核酸時(shí)，它們可以包括能夠與另一核苷酸或核酸或核酸類似物反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)。
該反應(yīng)基團(tuán)可以通過保護(hù)基而被保護(hù)。在該化學(xué)反應(yīng)前，該保護(hù)基可以除去。從而保護(hù)基將不是新形成的核酸或核酸類似物的一部分。反應(yīng)基團(tuán)的例子是親核試劑，例如DNA或RNA骨架單體單位的5’-羥基。
保護(hù)基團(tuán)骨架單體單位還可以包括在合成期間除去的保護(hù)基團(tuán)。除去該保護(hù)基可以實(shí)現(xiàn)在嵌入假核苷酸和核苷酸或核苷酸類似物或另一個(gè)嵌入假核苷酸之間的化學(xué)反應(yīng)。
特別是，核苷酸單體或核苷酸類似物單體或嵌入假核苷酸單體可以包含保護(hù)基，但只要核苷酸或核苷酸類似物或嵌入假核苷酸已經(jīng)結(jié)合至核酸或核酸類似物，則該保護(hù)基不再存在于分子中。此外，骨架單體單位可以包括在摻入核苷酸或核苷酸類似物或嵌入假核苷酸之后存在于寡核苷酸或寡核苷酸類似物的保護(hù)基，但保護(hù)基在向寡核苷酸或寡核苷酸類似物引入另外的核苷酸或核苷酸類似物以后可以不再存在，或者保護(hù)基可以在全部的寡核苷酸或寡核苷酸類似物合成以后除去。
保護(hù)基可以通過眾多本技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所知的適合的技術(shù)除去。優(yōu)選地，保護(hù)基可以通過選自下列的處理除去酸處理、苯硫酚處理和堿處理。
用來保護(hù)骨架單體單位的5’末端或5’末端類似物的優(yōu)選保護(hù)基可以選自三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、2-氯三苯甲基、1，1，1，2-四氯-2，2-二(p-甲氧基苯基)-乙烷(DATE)、9-苯基黃嘌呤-9-基(pixyl)和9-p-甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)或其他的在“Current Protocols InNucleic Acid Chemistry”volume 1，Beaucage Wiley等提到的保護(hù)基。更優(yōu)選保護(hù)基可以選自單甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。最優(yōu)選保護(hù)基可以是4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)基團(tuán)可以通過酸處理，例如通過在3％三氯乙酸或在3％二氯乙酸的CH2Cl2中短暫保溫(30到60秒為足夠)處理而除去。
保護(hù)骨架單體單位的磷酸酯或亞磷酰胺基團(tuán)的優(yōu)選保護(hù)基可以例如選自甲基和2-氰乙基。甲基保護(hù)基可以例如通過用苯硫酚或2-氨基甲酰2-丙烯腈-1，1-二硫羥酸二鈉處理而除去。2-氰乙基基團(tuán)可以通過堿處理，例如用濃氨水、1∶1含水甲胺和濃氨水或用氨氣處理而除去。
嵌入劑術(shù)語(yǔ)嵌入劑覆蓋任何包含至少一個(gè)基本平面共軛系的分子部分，所述平面共軛系能夠與核酸的核堿基共同堆積。優(yōu)選嵌入劑由至少一個(gè)能夠與核酸或核酸類似物的核堿基共同堆積的基本平面共軛系組成。
優(yōu)選嵌入劑包括選自下列的化學(xué)基團(tuán)多芳香物質(zhì)或雜多芳香物質(zhì)，更優(yōu)選所述嵌入劑基本上由多芳香物質(zhì)或雜多芳香物質(zhì)組成。最優(yōu)選，嵌入劑選自多芳香物質(zhì)和雜多芳香物質(zhì)。
多芳香物質(zhì)或雜多芳香物質(zhì)可以由任意合適數(shù)目的環(huán)組成，例如1個(gè)，例如2個(gè)，例如3個(gè)，例如4個(gè)，例如5個(gè)，例如6個(gè)，例如7個(gè)，例如8個(gè)，例如超過8個(gè)。此外，多芳香物質(zhì)和雜多芳香物質(zhì)可以用一種或多種選自下列基團(tuán)取代羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫代、氰基、烷基硫代、雜環(huán)、芳基、雜芳基、羧基、carboalkoyl、烷基、鏈烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基和氨基。
在一個(gè)優(yōu)選的形式，嵌入劑可以選自能夠發(fā)熒光的多芳香物質(zhì)和雜多芳香物質(zhì)。
在另一個(gè)更優(yōu)選的形式，該嵌入劑可以選自能夠形成激發(fā)二聚體、激態(tài)復(fù)合物、熒光共振能量傳遞(FRET)或電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物的多芳香物質(zhì)和雜多芳香物質(zhì)。
因此，嵌入劑可以優(yōu)選選自下列基團(tuán)菲咯啉、吩嗪、菲啶、蒽醌、芘、蒽、環(huán)烷烴(napthene)、菲、二萘品苯、、并四苯、吖啶酮、苯并蒽、二苯乙烯、乙二酸一?；拎ね瓦?、疊氮苯、卟啉、補(bǔ)骨脂素和任何用一種或多種下列基團(tuán)取代的上述嵌入劑羥基、溴、氟、氯、碘、巰基、硫代、氰基、烷基硫代、雜環(huán)、芳基、雜芳基、羧基、carboalkoyl、烷基、鏈烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基和/或氨基。
優(yōu)選嵌入劑選自下列基團(tuán)菲咯啉、吩嗪、菲啶、蒽醌、芘、蒽、環(huán)烷烴、菲、二萘品苯、、并四苯、吖啶酮、苯并蒽、1-2-二苯乙烯、乙二酸一酰基吡啶瞳巴唑、疊氮苯、卟啉和補(bǔ)骨脂素。
嵌入劑的例子不應(yīng)被理解為以任何方式的限制，而是只提供用作嵌入劑的可能結(jié)構(gòu)的例子。此外，還包括在各嵌入劑上一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)的置換獲得修飾的結(jié)構(gòu)。
嵌入假核苷酸的嵌入部分通過接頭連接到骨架單位。當(dāng)從骨架沿著接頭走到嵌入部分時(shí)，接頭和嵌入劑連接定義為接頭原子和共軛系部分第一個(gè)原子之間的鍵，當(dāng)寡核苷酸或寡核苷酸類似物雜交到包括所述嵌入假核苷酸的寡核苷酸類似物時(shí)，該鍵能與寡核苷酸或寡核苷酸類似物鏈的核堿基共同堆積。
該接頭可以包括共軛系和該嵌入劑可以包括另一個(gè)共軛系。在這種情況下，接頭共軛系不能夠與相對(duì)的寡核苷酸或寡核苷酸類似物鏈的核堿基共同堆積。
接頭嵌入假核苷酸的接頭是連接嵌入劑和嵌入假核苷酸的骨架單體的部分。接頭可以在原子之間包括一個(gè)或多個(gè)原子或鍵。
通過此處定義的骨架和插入部分的定義，接頭是連接骨架和嵌入劑的最短路徑。如果嵌入劑直接連接到骨架，所述接頭是鍵。接頭通常由一連串原子或原子的支鏈組成。鏈可以是飽和和不飽和的。接頭還可以是有或者沒有共軛鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。例如，接頭可以包括一連串m個(gè)選自C、O、S、N、P，Se，Si，Ge，Sn和Pb原子，其中鏈一端連接到嵌入劑而鏈另一個(gè)端連接到骨架單體單位。
接頭和嵌入假核苷酸的嵌入劑的總長(zhǎng)度優(yōu)選在8和13A之間。因此，m應(yīng)該根據(jù)具體的嵌入假核苷酸的嵌入劑的大小來選擇。也就是說，當(dāng)嵌入劑小時(shí)m應(yīng)該相對(duì)大而當(dāng)嵌入劑大時(shí)m應(yīng)該相對(duì)小。然而為大多數(shù)目的，m為從1到7的整數(shù)，例如從1到6，例如從1到5，例如來自1到4。如上所述，接頭可以是不飽和的鏈或另一個(gè)包含共軛鍵的系統(tǒng)。例如，接頭可以包括環(huán)狀的共軛結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，當(dāng)接頭是飽和鏈時(shí)m從1到4。
當(dāng)嵌入劑為芘時(shí)，m優(yōu)選為從1到7的整數(shù)，例如從1到6，例如從1到5，例如從1到4，更優(yōu)選從1到4，更優(yōu)選從1到3，最優(yōu)選m是2或3。
當(dāng)嵌入劑具有如下結(jié)構(gòu) m優(yōu)選從2到6，更優(yōu)選2。
鏈接頭可以用一種或多種下列原子取代C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb。
在一種形式中，接頭是氮雜烷基、氧雜烷基、硫代烷基或烷基鏈。例如，接頭可以是用一個(gè)或多個(gè)選自下列原子C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb取代的烷基鏈。在優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭由不分枝的烷基鏈組成，其中鏈的一端連接到嵌入劑而鏈的另一端連接到骨架單體單位，其中每個(gè)C用2個(gè)H取代。更優(yōu)選，不分枝的烷基鏈為1到5個(gè)原子長(zhǎng)，例如從1到4個(gè)原子長(zhǎng)，例如從1到3個(gè)原子長(zhǎng)，例如從2到3個(gè)原子長(zhǎng)。
在另一個(gè)形式中，接頭是包含選自下列原子C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。例如接頭可以是用一種或多種選自下列原子C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb取代的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
在另一個(gè)形式中，該接頭由1到6個(gè)C原子、0到3個(gè)O、S、N原子組成。更優(yōu)選，該接頭由1到6個(gè)C原子和0到1個(gè)O、S和N原子組成。在優(yōu)選的形式中，接頭由一連串C、O、S和N原子組成，任選被取代。優(yōu)選地，鏈應(yīng)該由至多3個(gè)原子組成，從而包括0到3個(gè)分別選自下列的原子C、O、S、N，任選被取代。
在優(yōu)選形式中，接頭由一連串C、N、S和O原子組成，其中鏈的一端連接到嵌入劑而鏈的另一端連接到骨架單體單位。
接頭構(gòu)成上述定義的嵌入假核苷酸通式X-Y-Q中的Y，由此X和Q不是接頭的一部分。
嵌入假核苷酸嵌入假核苷酸或INA分子優(yōu)選具有通式結(jié)構(gòu)X-Y-Q其中X是能夠結(jié)合至核酸或核酸類似物骨架的骨架單體單位；Q是包括至少一個(gè)基本上平面共軛系的嵌入劑，所述共軛系能夠與核酸的核堿基共同堆積；和Y是連接骨架單體單位和嵌入劑的接頭部分；其中Q和Y的總長(zhǎng)度為大約7到20。
此外，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌入假核苷酸包括骨架單體單位，其中骨架單體單位能夠以某種方式結(jié)合至核酸或核酸類似物的磷酸酯骨架，以便至多4個(gè)原子分開最接近于嵌入劑的骨架的兩個(gè)磷原子。
嵌入假核苷酸優(yōu)選不包括能夠形成Watson-Crick氫鍵作用的核堿基。因此嵌入假核苷酸優(yōu)選不能夠Watson-Crick堿基配對(duì)。
優(yōu)選Q和Y的總長(zhǎng)度從大約7到20，更優(yōu)選，從大約8到15，更優(yōu)選從大約8到13，更優(yōu)選從大約8.4到12，最優(yōu)選從大約8.59到10或從大約8.4到10.5。
例如當(dāng)嵌入劑為芘，Q和Y的總長(zhǎng)度優(yōu)選從大約8到13，例如從大約9到13，更優(yōu)選從大約9.05到11，例如從大約9.0到11，更優(yōu)選從大約9.05到10，例如從大約9.0到10，最優(yōu)選大約9.8。
接頭(Y)和嵌入劑(Q)的總長(zhǎng)度應(yīng)該通過確定從接頭離嵌入劑最遠(yuǎn)的非氫原子中心到嵌入劑離骨架單體單位最遠(yuǎn)的基本平面共軛系的非氫原子中心的距離而確定。優(yōu)選距離應(yīng)該是不以任何方式破壞或扭曲鍵角和正常的化學(xué)規(guī)律的最大距離。
距離應(yīng)該優(yōu)選通過計(jì)算具有最低構(gòu)象能水平的自由嵌入假核苷酸的結(jié)構(gòu)來測(cè)定，然后確定從接頭離嵌入劑最遠(yuǎn)的非氫原子中心到嵌入劑離骨架單體單位最遠(yuǎn)的基本平面共軛系的非氫原子中心可能的最大距離，無需比可自由旋轉(zhuǎn)的鍵(如非雙鍵或參與環(huán)狀結(jié)構(gòu)的鍵)的簡(jiǎn)單旋轉(zhuǎn)更多的彎折、拉伸或其他的扭曲結(jié)構(gòu)。優(yōu)選通過從頭開始或力場(chǎng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)能量有利的結(jié)構(gòu)。
距離可以通過由以下步驟組成的方法確定
目的嵌入假核苷酸結(jié)構(gòu)通過電腦使用ChemWindow6.0程序(BioRad)繪制；所述結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入到計(jì)算機(jī)程序SymAppsTM(BioRad)；使用計(jì)算機(jī)程序SymAppsTM(BioRad)計(jì)算包括嵌入假核苷酸的鍵長(zhǎng)度和成鍵角的3-維結(jié)構(gòu)；該3維結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)入計(jì)算機(jī)程序RasWin Molecular Graphics Ver2.6-ucb；使用RasWin Molecular Graphics Ver.2.6-ucb旋轉(zhuǎn)鍵獲得最大的距離(距離如上述定義)；以及確定所述距離。
嵌入假核苷酸可以是上述的骨架單體單位、接頭和嵌入劑的任何組合。
在另一個(gè)優(yōu)選的形式中，嵌入假核苷酸選自下列基團(tuán)1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷酰胺。更優(yōu)選，嵌入假核苷酸選自(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷酰胺和(R)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亞磷酰胺。
嵌入假核苷酸的制備嵌入假核苷酸或INA分子可以通過任何適合的方法合成。一個(gè)適合的方法包括步驟a1)提供含有嵌入劑的化合物，所述嵌入劑包括至少一個(gè)能夠與核酸的核堿基共同堆積的基本平面共軛系，和任選包括連接到反應(yīng)基團(tuán)的接頭部分；b1)提供包括至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的接頭前體分子，該兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可以任選被分別地保護(hù)；和c1)將嵌入劑與接頭前體反應(yīng)從而獲得嵌入劑-接頭；
d1)提供包括至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的骨架單體前體單位，該兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可以任選被分別地保護(hù)和/或掩蔽并任選包括接頭部分；和e1)將嵌入劑-接頭與骨架單體前體前體反應(yīng)從而獲得嵌入劑-接頭-骨架單體前體；或a2)提供包括至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的骨架單體前體單位，該兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可以任選被分別地保護(hù)和/或掩蔽并任選包括接頭部分；和b2)提供包括至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的接頭前體分子，該兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可以任選被分別地保護(hù)；c2)將單體前體單位與接頭前體反應(yīng)從而獲得骨架-接頭；d2)提供含有嵌入劑的化合物，所述嵌入劑包括至少一個(gè)能夠與核酸的核堿基共同堆積的基本平面共軛系，和任選包括連接到反應(yīng)基團(tuán)的接頭部分；和e2)將嵌入劑與骨架-接頭反應(yīng)從而獲得嵌入劑-接頭-骨架單體前體；或a3)提供含有嵌入劑的化合物，所述嵌入劑包括至少一個(gè)能夠與核酸的核堿基共同堆積的基本平面共軛系，和連接到反應(yīng)基團(tuán)的接頭部分；b3)提供包括至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的骨架單體前體單位，該兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可以任選被分別地保護(hù)和/或掩蔽，和包括接頭部分；c3)將嵌入劑-接頭部分與骨架單體前體一接頭反應(yīng)從而獲得嵌入劑-接頭-骨架單體前體；f)任選保護(hù)和/或去保護(hù)該嵌入劑-接頭-骨架單體前體；g)提供能夠?qū)蓚€(gè)假核苷酸、核苷酸和/或核苷酸類似物連接在一起的含磷化合物；h)將含磷化合物與嵌入劑-接頭-骨架單體前體反應(yīng)；和i)獲得嵌入假核苷酸。
優(yōu)選地，選擇嵌入劑反應(yīng)基團(tuán)以便它可以與接頭反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)。因此，如果接頭反應(yīng)基團(tuán)是親核試劑，則優(yōu)選嵌入劑反應(yīng)基團(tuán)是親電子試劑，更優(yōu)選選自下列基團(tuán)的親電子試劑鹵烷基、甲磺酰氧基烷基和甲苯磺酰氧基烷基。更優(yōu)選嵌入劑反應(yīng)基團(tuán)是氯甲基。此外，該嵌入劑反應(yīng)基團(tuán)可以是例如包括羥基、巰基、selam、胺或其混合物的親核基團(tuán)。
優(yōu)選地，環(huán)狀或非環(huán)狀的鏈烷可以是包括至少三個(gè)接頭反應(yīng)基團(tuán)的多取代鏈烷或烷氧基。更優(yōu)選該多取代鏈烷包括三個(gè)親核基團(tuán)，例如而非局限于，鏈烷三醇、氨基鏈烷二醇或巰基鏈烷二醇。優(yōu)選多取代鏈烷包含一個(gè)反應(yīng)性比其它基團(tuán)強(qiáng)的親核基團(tuán)，或者兩個(gè)所述親核基團(tuán)可以通過保護(hù)基保護(hù)。更優(yōu)選環(huán)狀或非環(huán)狀的鏈烷是2，2-二甲基-4-甲基羥基-1，3-dioxalan，更優(yōu)選鏈烷是D-α，β-異亞丙基甘油。
優(yōu)選地，接頭反應(yīng)基團(tuán)應(yīng)能與嵌入劑反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)，例如接頭反應(yīng)基團(tuán)可以是親核基團(tuán)，例如選自羥基、巰基、selam和胺，優(yōu)選羥基。或者所述接頭反應(yīng)基團(tuán)可以是親電子基團(tuán)，例如選自鹵素、triflates、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯的基團(tuán)。在優(yōu)選的形式中，至少2個(gè)接頭反應(yīng)基團(tuán)可以被保護(hù)基保護(hù)。
該方法可以進(jìn)一步包括連接保護(hù)基到嵌入劑-前體單體的一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的步驟。例如，DMT基團(tuán)可以通過提供連接到鹵素，例如Cl的DMT并將DMT-Cl與至少一個(gè)接頭反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)而添加。因此，優(yōu)選至少一個(gè)接頭反應(yīng)基團(tuán)是可利用的并且一個(gè)是保護(hù)的。如果該步驟在與含磷試劑反應(yīng)前完成，則含磷試劑可以只與一個(gè)接頭反應(yīng)基團(tuán)相互作用。
含磷試劑可以例如是亞磷酰胺，例如NC(CH2)2OP(Npri2)2或NC(CH2)2OP(Npri2)Cl。優(yōu)選含磷試劑可以與嵌入劑-前體在存在堿的情況下起反應(yīng)，所述堿例如N(et)3、N(‘pr)2Et和CH2Cl2。
嵌入假核苷酸合成方法的一個(gè)具體例子在實(shí)施例1和圖7中概述。
一旦確定了寡核苷酸或寡核苷酸類似物合適的序列，它們優(yōu)選使用可商購(gòu)的方法和設(shè)備通過化學(xué)法合成。例如，固相亞磷酰胺方法可用于生產(chǎn)包括嵌入假核苷酸的短寡核苷酸或寡核苷酸類似物。
例如寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以通過任一在“CurrentProtocols in Nucleic acid Chemistry”Volume 1，Beaucage Wiley等中描述的方法合成。
含嵌入假核苷酸的寡核苷酸合成核酸對(duì)靶核酸的高親合力可以大大便利檢測(cè)分析，此外對(duì)靶核酸具有高親合力的合成核酸可以用于大量其他的目的，例如基因靶向和核酸純化。含嵌入劑的寡核苷酸或寡核苷酸類似物已經(jīng)顯示增加對(duì)同源互補(bǔ)核酸的親合力。
當(dāng)由寡核苷酸或寡核苷酸類似物與同源互補(bǔ)DNA組成的雜交物(DNA雜交物)的解鏈溫度比由相同核苷酸序列組成的缺乏嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物作為寡核苷酸或寡核苷酸類似物和同源的互補(bǔ)DNA之間的雜交物(對(duì)應(yīng)的DNA雜交物)的解鏈溫度顯著高時(shí)，可以生產(chǎn)含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物。
優(yōu)選地，DNA雜交物的解鏈溫度比對(duì)應(yīng)的DNA雜交物高從1到80℃，更優(yōu)選至少2℃，更優(yōu)選至少5℃，更優(yōu)選至少10℃。
寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以具有至少一個(gè)內(nèi)部嵌入假核苷酸。在內(nèi)部安置嵌入劑單位可以實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)上更大的柔性。含內(nèi)部安置嵌入假核苷酸的核酸類似物從而可以比內(nèi)部不安置嵌入假核苷酸的核酸類似物對(duì)同源互補(bǔ)核酸具有更高的親合力。包含至少一個(gè)內(nèi)部嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物還能區(qū)分RNA(包括RNA樣的核酸類似物)和DNA(包括DNA樣的核酸類似物)。此外內(nèi)部安置的熒光嵌入單體可以用作診斷工具。
嵌入假核苷酸可以放置在給定的寡核苷酸或寡核苷酸類似物內(nèi)任何合乎需要的位置。例如，嵌入假核苷酸可以放置在寡核苷酸或寡核苷酸類似物的末端，或嵌入假核苷酸可以放置在寡核苷酸或寡核苷酸類似物的內(nèi)部位置。
當(dāng)寡核苷酸或寡核苷酸類似物包括超過1個(gè)嵌入假核苷酸時(shí)，嵌入假核苷酸可以放置在彼此相關(guān)的任何位置。例如，它們可以彼此緊挨著放置，或者它們可以如此放置以使1個(gè)，例如2個(gè)，例如3個(gè)，例如4個(gè)，例如5個(gè)，例如超過5個(gè)核苷酸分開嵌入假核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在寡核苷酸或者寡核苷酸類似物內(nèi)的兩個(gè)嵌入假核苷酸相鄰地放置，即它們可以放置在寡核苷酸或者寡核苷酸類似物內(nèi)任何位置，只要1個(gè)核苷酸分開該兩個(gè)嵌入假核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選的形式，兩個(gè)嵌入劑分別放置于寡核苷酸或者寡核苷酸類似物的各末端或非常接近于各末端。
寡核苷酸或者寡核苷酸類似物可以包括任何類型的核苷酸和/或核苷酸類似物，例如此處上述的核苷酸和/或核苷酸類似物。例如，寡核苷酸或者寡核苷酸類似物可以包括包含在DNA、RNA、LNA、PNA、ANA INA、和HNA內(nèi)的核苷酸和/或核苷酸類似物。因此，寡核苷酸或者寡核苷酸類似物可以包括一個(gè)或多個(gè)下列亞基PNA，同型-DNA，b-D-阿卓吡喃糖基-NA，b-D-葡糖吡喃糖基-NA，b-D-異吡喃糖基-NA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，□-L-核糖-LNA，□-L-木糖-LNA，□-D-木糖-LNA，□-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二環(huán)-DNA，6-氨基-二環(huán)-DNA，5-表-二環(huán)-DNA，□-二環(huán)-DNA，三環(huán)-DNA，二環(huán)[4.3.0]-DNA，二環(huán)[3.2.1]-DNA，二環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA，□-D-核糖吡喃糖基-NA，□-L-來蘇吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，2’-OR-RNA，□-L-RNA，α-D-RNA，β-D-RNA，即寡核苷酸類似物可以選自PNA，同型-DNA，b-D-阿卓吡喃糖基-NA，b-D-葡糖吡喃糖基-NA，b-D-異吡喃糖基-NA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，□-L-核糖-LNA，□-L-木糖-LNA，□-D-木糖-LNA，□-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二環(huán)-DNA，6-氨基-二環(huán)-DNA，5-表-二環(huán)-DNA，□-二環(huán)-DNA，三環(huán)-DNA，二環(huán)[4.3.0]-DNA，二環(huán)[3.2.1]-DNA，二環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA，□-D-核糖吡喃糖基-NA，□-L-來蘇吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，2’-OR-RNA，□-L-RNA，α-D-RNA，β-D-RNA及其混合物。
寡核苷酸或者寡核苷酸類似物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是由寡核苷酸或者寡核苷酸類似物組成的包括至少一個(gè)嵌入假核苷酸與基本互補(bǔ)DNA的雜交物(DNA雜交物)的解鏈溫度比由基本互補(bǔ)DNA和其互補(bǔ)的DNA組成的雙鏈體的解鏈溫度顯著地高。
因此，寡核苷酸或者寡核苷酸類似物可以比天然存在的核酸以更高的親合力與DNA形成雜交物。解鏈溫度優(yōu)選提高2到30℃，例如從5到20℃，例如從10℃到15℃，例如從2℃到5℃，例如從5℃到10℃，例如從15℃到20℃，例如從20℃到25℃，例如從25℃到30℃，例如從30℃，到35℃，例如從35℃到40℃，例如從40℃到45℃，例如從45℃到50℃。
特別是，解鏈溫度的增加可以由于嵌入劑的插入而獲得，因?yàn)椴迦肟梢苑€(wěn)定DNA雙鏈體。因此，優(yōu)選嵌入劑能夠在DNA的核堿基之間插入。優(yōu)選地，嵌入假核苷酸在雙鏈體中以凸出插入物或者末端插入物放置(見下文)，所述嵌入假核苷酸在一些核酸或者核酸類似物中可以允許嵌入。
包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸和基本互補(bǔ)RNA(RNA雜交物)或者RNA樣核酸類似物(RNA樣雜交物)的寡核苷酸或者寡核苷酸類似物的解鏈溫度，可以比由基本互補(bǔ)RNA或者RNA樣靶和不包含嵌入假核苷酸的寡核苷酸類似物組成的雙鏈體的解鏈溫度顯著地高。優(yōu)選寡核苷酸或者寡核苷酸類似物的大多數(shù)或所有嵌入假核苷酸安置于一端或兩端。
因此，寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物可以與RNA或者RNA樣核酸類似物或者RNA樣寡核苷酸類似物以比天然存在的核酸更高的親合力形成雜交物。解鏈溫度優(yōu)選提高2到20℃，例如從5到15℃，例如從10℃到15℃，例如從2℃到5℃，例如從5℃到10℃，例如從15℃到20℃或更多。
當(dāng)安置在寡核苷酸或者寡核苷酸類似物的末端時(shí)，嵌入假核苷酸優(yōu)選只穩(wěn)定RNA和RNA樣靶。然而這不排除在待與RNA或者RNA樣核酸類似物雜交的寡核苷酸或者寡核苷酸類似物中安置嵌入假核苷酸，以使嵌入假核苷酸位于形成的雜交物的內(nèi)部區(qū)域。這樣做的目的是可以獲得某些雜交不穩(wěn)定性或者影響雜交后形成的分子內(nèi)和分子間復(fù)合物的總體二維或者三維結(jié)構(gòu)。
包含一個(gè)或多個(gè)嵌入假核苷酸的寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物可以形成三條鏈的結(jié)構(gòu)(三鏈體結(jié)構(gòu))，所述三鏈體結(jié)構(gòu)由通過Hoogsteen堿基配對(duì)結(jié)合到同源互補(bǔ)的核酸或者核酸類似物或者寡核苷酸或者寡核苷酸類似物的寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物組成。寡核苷酸或者寡核苷酸類似物可以提高三鏈體結(jié)構(gòu)的Hoogsteen堿基配對(duì)的解鏈溫度。
寡核苷酸或者寡核苷酸類似物可以不依賴于特殊序列限制如嘌呤富集/嘧啶富集的核酸或者核酸類似物雙鏈體靶序列的存在的方式，而提高三鏈體結(jié)構(gòu)中Hoogsteen堿基配對(duì)的解鏈溫度。因此，三鏈體結(jié)構(gòu)中的Hoogsteen堿基配對(duì)具有比雙鏈體靶的Hoogsteen堿基配對(duì)顯著地高的解鏈溫度，如果該寡核苷酸或者寡核苷酸類似物沒有嵌入假核苷酸的話。
因此，寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物與同源互補(bǔ)的核酸或核酸類似物或寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以以比天然存在的核酸更高的親合力形成三鏈體結(jié)構(gòu)。解鏈溫度優(yōu)選可以提高2到50℃，例如從2到40℃，例如從2到30℃，例如從5到20℃，例如從10℃到15℃，例如從2℃到5℃，例如從5℃到10℃，例如從10℃到15℃，例如從15℃到20℃，例如從20℃到25℃，例如從25℃到30℃，例如從30℃到35℃，例如從35℃到40℃，例如從40℃到45℃，例如從45℃到50℃。
特別是，解鏈溫度的增加可以由于嵌入劑的插入而獲得，因?yàn)椴迦肟梢苑€(wěn)定DNA三鏈體。因此，優(yōu)選嵌入劑能夠在三鏈體結(jié)構(gòu)的核堿基之間插入。優(yōu)選地，嵌入假核苷酸在雙鏈體中以凸出插入物或者末端插入物放置(見下文)，所述嵌入假核苷酸在一些核酸或者核酸類似物中可以允許插入。
三鏈體的形成可以或可以不在鏈侵入時(shí)進(jìn)行，該方法中Hoogsteen堿基配對(duì)的第三鏈侵入靶雙鏈體并替換部分或所有相同的鏈以與互補(bǔ)鏈形成Watson-Crick堿基對(duì)。這可以被開發(fā)用于若干目的。只要存在雙鏈的核酸或核酸類似物靶，寡核苷酸和寡核苷酸可以合適地使用，并且不可能、可行或設(shè)想要分開靶鏈，通過區(qū)域的單鏈侵入或互補(bǔ)區(qū)域的雙鏈侵入檢測(cè)，無需事先解鏈雙鏈的核酸或核酸類似物靶，用于三鏈體形成和/或鏈侵入。因此，提供包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其能夠侵入核酸或核酸類似物分子的雙鏈區(qū)域。
提供包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其能以序列特異性的方式侵入雙鏈核酸或核酸類似物。包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的侵入寡核苷酸和/或寡核苷酸類似物將以序列特異性的方式以比替換的鏈更高的親和力結(jié)合到互補(bǔ)鏈。
包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸和同源互補(bǔ)DNA的寡核苷酸類似物組成的雜交物(DNA雜交物)的解鏈溫度，通常比由寡核苷酸或寡核苷酸類似物和同源互補(bǔ)RNA或RNA樣核酸類似物靶或RNA-樣寡核苷酸類似物靶組成的雜交物(RNA雜交物)的解鏈溫度顯著地高。該寡核苷酸可以是上述任何寡核苷酸類似物。例如，寡核苷酸可以是含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的DNA寡核苷酸(類似物)或包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的下列寡核苷酸或其混合物同型-DNA，b-D-阿卓吡喃糖基-NA，b-D-葡糖吡喃糖基-NA，b-D-異吡喃糖基-NA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，□-L-核糖-LNA，□-L-木糖-LNA，□-D-木糖-LNA，□-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二環(huán)-DNA，6-氨基-二環(huán)-DNA，5-表-二環(huán)-DNA，□-二環(huán)-DNA，三環(huán)-DNA，二環(huán)[4.3.0]-DNA，二環(huán)[3.2.1]-DNA，二環(huán)[4.3.0]酰胺-DNA，□-D-核糖吡喃糖基-NA，□-L-來蘇吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，2’-OR-RNA，□-L-RNA，α-D-RNA，β-D-RNA。
因此，寡核苷酸或寡核苷酸類似物對(duì)DNA的親合力比寡核苷酸或寡核苷酸類似物對(duì)RNA或RNA樣靶的親合力顯著地高。因此在包含有限數(shù)量的寡核苷酸或寡核苷酸類似物和同源互補(bǔ)DNA和同源互補(bǔ)RNA或同源互補(bǔ)RNA樣靶的混合物中，寡核苷酸或寡核苷酸類似物優(yōu)選雜交到同源互補(bǔ)DNA。
優(yōu)選地，DNA雜交物的解鏈溫度比同源互補(bǔ)RNA或RNA樣雜交物的解鏈溫度高至少2℃，例如高至少5℃，例如至少10℃，如至少15℃，例如至少20℃，如至少25℃，例如至少30℃，如至少35℃，例如至少40℃，例如從2至30℃，例如從5至20℃，例如從10℃至15℃，例如從2℃至5℃，例如從5℃至10℃，例如從10℃至15℃，例如從15℃至20℃，例如從20℃至25℃，例如從25℃至30℃，例如從30℃至35℃，例如從35℃至40℃，例如從40℃至45℃，例如從45℃至50℃，例如從50℃至55℃，例如從55℃至60℃。
包含至少一個(gè)嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以雜交到核酸或核酸類似物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠穩(wěn)定這種對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的雜交。二級(jí)結(jié)構(gòu)可以是但不局限于莖環(huán)結(jié)構(gòu)、Faraday接合、回折、H結(jié)、和凸出。二級(jí)結(jié)構(gòu)可以是RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中包括至少一個(gè)嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的設(shè)計(jì)方式使嵌入假核苷酸在三個(gè)以三通方式連接形成的雙鏈體之一的末端在所述二級(jí)結(jié)構(gòu)和寡核苷酸寡核苷酸類似物之間雜交。
嵌入假核苷酸的位置寡核苷酸或寡核苷酸類似物設(shè)計(jì)的方式使其可以雜交到同源互補(bǔ)核酸或核酸類似物(靶核酸)。優(yōu)選寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以基本上互補(bǔ)到該靶核酸。更優(yōu)選，至少一個(gè)嵌入假核苷酸被安置以便當(dāng)寡核苷酸類似物與該靶核酸雜交時(shí)，嵌入假核苷酸被安置為凸出的嵌入物，即，嵌入假核苷酸的上游相鄰核苷酸和下游相鄰核苷酸雜交到靶核酸中的相鄰核苷酸。
嵌入假核苷酸可以緊挨著雙鏈體的任何一端或兩端放置，該雙鏈體在含嵌入假核苷酸的寡核苷酸類似物和其靶核苷酸或核苷酸類似物之間形成，例如嵌入假核苷酸可以安置為懸垂的共同堆積末端。
寡核苷酸或寡核苷酸類似物的所有嵌入假核苷酸或INA可以安置以使寡核苷酸類似物與靶核酸雜交時(shí)，所有的嵌入假核苷酸安置成凸出嵌入物和/或懸垂的、共同堆積末端。
包含嵌入假核苷酸的寡核苷酸的例子描繪如下
N1-(P)q-N2，N1-(P-N3)q-N2，(P)q-N2，N1-(P)q，(P)q-N2-(P)r，N1-(P)q-N2，N1(P-N3)q-N2-(P-N3)r-N4，其中N1，N2，N3，N4分別表示至少一個(gè)核苷酸的核苷酸和/或核苷酸類似物序列，P表示嵌入假核苷酸，q和r分別選自從1到10的整數(shù)。
甲基化基因組DNA甲基化的程度或量與許多條件如老化、干細(xì)胞分化、遺傳異常、癌癥及其他疾病狀態(tài)關(guān)聯(lián)。大量重要的甲基化狀態(tài)的暗示陳述如下。
已經(jīng)進(jìn)行了胚胎干細(xì)胞與成人胸腺細(xì)胞的融合以檢查融合后在DNA甲基化水平發(fā)生的重新編程。不活動(dòng)的體細(xì)胞染色體X通過完整染色體檢查的顯現(xiàn)變成活動(dòng)的(Tada等，2001；Current Biology，11，1553-1558)。
以偶發(fā)的結(jié)腸直腸癌的臨床病理學(xué)特征在特殊的DNA區(qū)域中檢查甲基化模式，作為鑒定這種腫瘤的便宜和精確的途徑(Ward等，2001；Gut，48，821-829)，和人結(jié)腸隱窩干細(xì)胞中的甲基化模式(Ro等，2001，Proc Natl Acad Sci，USA，98，10519-10521；Yatabe等，2001，Proc.Natl.Acad Sci USA，在線版本)。
前列腺癌和用5-氮胞苷處理以重新活化特定基因的細(xì)胞系中的甲基化模式(Chetcuti等，2001，Cancer Research，61，6331-6334)。
子宮內(nèi)膜癌的各種不同雌激素受體中的甲基化模式，其中通過甲基化基因失活發(fā)生在許多癌癥，但在正常的個(gè)體不以高頻率出現(xiàn)(Sasaki等，2001，Cancer Research，61，3262-3266)。
膀胱癌中的甲基化模式(markl等，2001，Cancer Research，61，5875-5884)。
乳癌中的甲基化模式(Nielsen等，2001，Cancer Letters，163，59-69)。
在涉及肺癌和乳癌的特定啟動(dòng)子中的甲基化模式(Burbee等，2001，J Natl Cancer Institute，93，691-699)。
在食管腺癌患者血漿中自由DNA的甲基化模式(Kawakami等，2000，J Natl Cancer Institute，92，1805-1811)。
遺傳性擴(kuò)散胃癌中CDH1啟動(dòng)子的甲基化(Grady等，2000，Nature Genetics，26，16-17)。
基因組印記，其中，例如基因的父本等位基因是活動(dòng)的，母本等位基因是不活動(dòng)的，反之亦然。通過相關(guān)基因或它們附近的序列甲基化的改變實(shí)現(xiàn)失活。本質(zhì)上，DNA區(qū)域在一個(gè)性別的生殖系中變成甲基化的，而在另一個(gè)性別中則不是如此(Mann，2001，Stem Cells，19，287-294)。
通過核轉(zhuǎn)移或體外受精克隆不同的物種(綿羊、牛、山羊、豬和小鼠)的研究中基因組范圍的甲基化模式。因此，被插入至卵母細(xì)胞中的供體核的甲基化模式差異很大，這被認(rèn)為是當(dāng)前的克隆實(shí)驗(yàn)中高失敗率的原因。這些分化的核或許需要更多重新編程這種較少分化的核，如在胚胎干細(xì)胞中(Kang等，2001；Nature Genetics，28，173-177；Humphreys等，2001，Science，293，95-97)。
在24種癌細(xì)胞系中過量超甲基化模式與正常組織的對(duì)比(Smiraglia等，2001，Hμman Molecular Genetics，10，1413-1419)。
甲基化DNA嵌入到非甲基化微基因構(gòu)建體中以檢查對(duì)基因表達(dá)和印記的作用(Holmgren等，2001，Current Biology，11，1128-1130)。
在成熟B細(xì)胞淋巴瘤中的甲基化模式，其中特定的基因通過甲基化被失活(Malone等，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98，10404-10409)。
在急性骨髓性白血病中特定基因的甲基化模式(Melki等，1999，Leukemia，13，877-883)。
在基因敲除小鼠中Mecp2基因的分析。該蛋白涉及結(jié)合到DNA中甲基化位點(diǎn)并被認(rèn)為涉及Rett綜合癥，該癥是遺傳的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂(Guy等，Nature Genetics，27，322-326)。
5個(gè)特定的基因在自然老化過程和潰瘍性結(jié)腸炎中的甲基化模式(Issa等，2001，Cancer Research，61，3573-3577)。
在凋亡過程中甲基化的損失，其影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，細(xì)胞周期調(diào)控、可動(dòng)元件在基因組內(nèi)的移動(dòng)(Jackson-Grusby等，2001，NatureGenetics，27，31-39)。
在不同物種如人和小鼠中啟動(dòng)子和基因區(qū)域甲基化模式的比較，以確定涉及基因調(diào)控的CpG島的進(jìn)化保守程度或其缺失(Cuadrado等，2001，EMBO Reports，21，586-592)。
不同發(fā)育階段睪丸精子的DNA甲基化模式(Manning等，2001，Urol Int，67，151-155)。
使用單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色分析DNA甲基化模式(Piyathilake等，2000，Biotechnic and Histochem，75，251-258)。
基因和假基因甲基化模式之間的差異(Grunau等，2000，HumanMol Genet，9，2651-2663)。
模式無脊椎動(dòng)物，例如果蠅(Drosophila melanogaster)5-甲基胞嘧啶的含量(Gowher等，2000，EMBO J，19，6918-6923)。
使用CpG島的甲基化模式對(duì)人啟動(dòng)子的大規(guī)模作圖(loshikhes等，2000，Nature Genetics，26，61-63)。
在哺乳動(dòng)物發(fā)育期間由于ATRX基因表達(dá)的變化，所述基因引起智力遲鈍、面部變形、泌尿生殖的異常和α地中海貧血，在染色質(zhì)重塑、DNA甲基化和基因表達(dá)過程中的誘導(dǎo)變化(Gibbons等，2000，Nature Genetics，24，368-371)。
涉及前列腺癌的GSTP1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化和未甲基化結(jié)構(gòu)域之間的邊界(Millar等，2000，J Biological Chemistry，275，24893-24899；Millar等，1999，Oncogene，18，1313-1324)。
在正常老化過程中甲基化的改變(Toyota等，1999，Seminars inCancer Biology，9，349-357)。
在老化和心血管系統(tǒng)動(dòng)脈粥樣硬化中甲基化的變化(Post等，1999，Cardiovascular Research，43，985-991)和在結(jié)腸直腸粘膜的自然老化和癌癥中甲基化的改變(Ahuja等，1998，Cancer Research，58，5489-5494)。
在睪丸生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞中的甲基化模式(Coffigny等，1999，Cytogenet Cell Genets，87，175-181)。
在模式脊椎動(dòng)物如斑馬魚發(fā)育期間DNA甲基化的變化(Macleod等，1999，Nature Genetics，23，139-140)。
在人組織血液ABO基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化模式(Kominato等，1999，J Biol Chem，274，37240-37250)。
在哺乳動(dòng)物著床前發(fā)育期間使用單克隆抗體確定的甲基化模式(Rougier等，1999，Genes and Development，12，2108-2113)。
通過各種不同的癌癥化學(xué)治療的藥物誘導(dǎo)的甲基化模式(Nyce，1997，Mutation Research，386，153-161；Nyce 1989，Cancer Research，49，5829-5836)和在苯巴比妥誘導(dǎo)的以及自發(fā)的肝臟腫瘤中DNA甲基化的改變(Ray等，1994，Molecular Carcinogenesis 9，155-166)。
通過亞硫酸氫鹽測(cè)序方法分析5-甲基胞嘧啶殘基(Grigg，1996，DNA Sequence，6，189-198)。
使用甲基化DNA結(jié)合柱分離CpG島(Cross等，1994，NatureGenetics，6，236-244)。
KSHV裂解生長(zhǎng)是通過甲基化敏感性開關(guān)誘導(dǎo)的嗎？(Laman和Boshoff，Trends Microbiol 2001 Oct；9(10)464-6)。皮膚多發(fā)性出血性肉瘤相關(guān)的皰疹病毒(KSHV或HHV-8)的潛伏和裂解生長(zhǎng)都與發(fā)病機(jī)理有關(guān)。
從大量不同甲基化狀態(tài)的例子和上述提供的暗示可以看出，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明提供研究甲基化的強(qiáng)大工具和因此可以用于疾病和健康的許多方面。
材料和方法固相支持物表1顯示用于連接本發(fā)明的捕捉配體的固相支持物的一些例子。
表2顯示供本發(fā)明使用的檢測(cè)系統(tǒng)的可能選擇。
表1附著捕捉配體標(biāo)記的固相支持物

表2檢測(cè)配體的檢測(cè)系統(tǒng)

嵌入核酸(INA)嵌入核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可序列特異性地雜交到核酸(DNA和RNA)。由于INA顯示若干合乎需要的性質(zhì)，從而是基于探針的雜交分析中作為核酸探針替代物的候選物。INA是雜交到核酸形成比對(duì)應(yīng)的核酸/核酸復(fù)合物熱力學(xué)更穩(wěn)定的雜交物的聚合物。它們不是已知降解肽或核酸的酶的底物。因此，INA應(yīng)該在生物樣品中更穩(wěn)定，而且具有比天然存在的核酸片段更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期限。與非常取決于離子強(qiáng)度的核酸雜交不同，INA與核酸的雜交相當(dāng)?shù)鬲?dú)立于離子強(qiáng)度，并且在其強(qiáng)烈地不支持天然存在的核酸雜交到核酸上的情況下在低離子強(qiáng)度是有利的。INA的結(jié)合強(qiáng)度除取決于通常的雙鏈結(jié)構(gòu)中以特殊的方式堆積的堿基之間的氫鍵之外，還取決于改造至分子中嵌入基團(tuán)的數(shù)目。INA識(shí)別DNA的序列辨別力比DNA識(shí)別DNA的辨別力更有效。
INA通過以可商業(yè)供應(yīng)的方式修改標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成步驟而合成。
在INA探針和標(biāo)準(zhǔn)的核酸探針之間的確存在許多差異。這些差異可以方便地分為生物學(xué)的、結(jié)構(gòu)的和物理化學(xué)的差異。正如以上和以下的討論，當(dāng)試圖在典型情況下已采用核酸的應(yīng)用中使用INA探針時(shí)，這些生物學(xué)的、結(jié)構(gòu)的、和物理化學(xué)的差異可以導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的結(jié)果。在化學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常觀察到這種不同組合物的非等價(jià)性。
關(guān)于生物差異，核酸是在活的物種生命中作為基因傳遞和表達(dá)的因子起著重要作用的生物材料。它們的體內(nèi)性質(zhì)了解得相當(dāng)?shù)赝笍?。然而，INA是最近開發(fā)的完全人造的分子，由化學(xué)家構(gòu)思并使用合成有機(jī)化學(xué)制備。它沒有已知的生物功能。
在結(jié)構(gòu)上，INA也顯著地不同于核酸。盡管兩者可以采用常見的核堿基(A，C，G，T和U)，這些分子的組成是結(jié)構(gòu)上多樣化的。RNA、DNA和INA的骨架包括重復(fù)的磷酸二酯核糖和2-脫氧核糖單位。INAs不同于DNA或RNA在于具有一個(gè)或多個(gè)通過接頭分子連接到該聚合物的大的扁平分子。該扁平分子嵌入在雙鏈結(jié)構(gòu)中與INA相對(duì)的互補(bǔ)DNA鏈的堿基之間。
INA和DNA或RNA之間的物理/化學(xué)差異也是很多的。INA結(jié)合到互補(bǔ)DNA比核酸探針結(jié)合到相同靶序列更迅速。與DNA或RNA片段不同，除非嵌入基團(tuán)位于末端位置，INAs與RNA的結(jié)合差。由于互補(bǔ)DNA鏈上嵌入基團(tuán)和堿基之間強(qiáng)相互作用，INA/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性比類似的DNA/DNA或RNA/DNA復(fù)合物高。
與其他的DNA如DNA或RNA片段或PNAs不同，INAs不顯示自身聚集或結(jié)合性質(zhì)。
概括地說，因?yàn)镮NAs以序列特異性雜交到核酸，INAs是開發(fā)基于探針的分析的有用候選物和特別適用于試劑盒和篩選分析。然而，INA探針不是核酸探針的等同物。因此，任何可以改善基于探針的分析的特異性、敏感性和可靠性的試劑盒或組合物將用于檢測(cè)、分析和定量含DNA的樣品。INAs具有用于所述目的的必要性質(zhì)。
INA用于本發(fā)明實(shí)施例的例子是(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(1-芘基甲基)-甘油的亞磷酰胺。然而，應(yīng)當(dāng)理解還可以使用其他化學(xué)形式的INAs。
亞硫酸氫鈉-特定的脫氨方法用亞硫酸鈉處理核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法可以在大量參考文獻(xiàn)中找到，包括Frommer等1992，Proc Natl Acad Sci 891827-1831；Grigg和Clark1994 BioAssays 16431-436；Shapiro等1970，J Amer Chem Soc92422-423；Wataya和Hayatsu 1972，Biochemistry 113583-3588。通過本發(fā)明人還對(duì)這些方案進(jìn)行了一些改進(jìn)。
檢測(cè)系統(tǒng)包被磁珠用于附著到磁珠的INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以有許多途徑進(jìn)行修飾。在這個(gè)例子中，為使INA通過雜雙功能的接頭如EDC共價(jià)附著到珠上，INA包含5’或者3’氨基基團(tuán)。然而，INA還可以用5’基團(tuán)如生物素修飾，因此生物素被動(dòng)地附著于用親和素或鏈親和素基團(tuán)修飾的磁珠上。
10μL羧酸酯修飾的MagnabindTM珠(Pierce)或100μLDynabeadsTM鏈親和素(Dynal)被轉(zhuǎn)移到干凈的1.5ml管和90μl PBS溶液被加到該磁珠中。
混合所述珠然后磁化并棄去上清液。所述珠用PBS洗滌兩次每次100μL，最后重懸在90μL pH4.5的50mM MES緩沖液中或另一個(gè)由生產(chǎn)商提供的說明書確定的緩沖液。
1μL的250μM INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA(濃度取決于由寡核苷酸雜交實(shí)驗(yàn)確定的選擇的INA的比活)被添加到樣品中，渦旋震動(dòng)該管并在室溫下放置10-20分鐘。
然后添加10μL新鮮制備的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，樣品經(jīng)渦旋振蕩和在室溫或者4℃溫育直至60分鐘。
接著樣品被磁化，棄去上清液，并且如有必要，所述珠通過添加100μL的0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封閉10分鐘。
該珠再用PBS溶液洗滌兩次，最后重懸于100μL PBS溶液中。使用磁珠的雜交10μL INA包被的MagnabindTM珠被轉(zhuǎn)移到干凈的管和40μLExpressHybTM緩沖液(Clontech)或者原液或蒸餾水1∶1的稀釋液或任何其他的商業(yè)的或自制的雜交緩沖液中。緩沖液還可以包含已知濃度的陽(yáng)離子/陰離子或兩性離子(zwittergents)或者其他的添加劑如肝素和聚氨基酸。
1-5μL熱變性的DNA樣品然后被加到上述溶液中，渦旋振蕩該管然后在55℃或另外的溫度(這取決于選擇的INA的解鏈溫度)溫育20-60分鐘。
樣品被磁化，棄去上清液和用1×SSC/0.1％SDS在雜交溫度從較早步驟開始洗滌珠兩次，每次5分鐘，在洗滌的間隙磁化樣品。雙重INA捕捉INA#1通過INA的N末端或C末端胺連接到羧酸酯修飾的磁珠和洗滌除去未結(jié)合的INA。
INA/珠復(fù)合物然后使用合適的雜交和洗滌條件雜交到溶液中的靶DNA。
然后使用合適的方法從磁珠釋放靶DNA并轉(zhuǎn)移到含有靶向到DNA分子的相對(duì)端的第二INA/磁珠復(fù)合物的管中。
第二INA/珠復(fù)合物或寡核苷酸/珠復(fù)合物然后使用合適的雜交和洗滌條件雜交到溶液中的靶DNA。
互補(bǔ)到靶DNA的中央?yún)^(qū)域的第三INA或寡核苷酸能被用作檢測(cè)分子。該檢測(cè)分子可以以多種方式標(biāo)記。
(i)INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用放射性同位素如P32或I125直接標(biāo)記然后與靶DNA雜交。
(ii)INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA可以用熒光分子如Cy-3或Cy-5標(biāo)記然后與靶DNA雜交。
(iii)胺修飾的INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA可以用任一種上述方法標(biāo)記然后連接到羧酸酯修飾的已知大小的微球體上，然后洗滌該球以除去未結(jié)合的標(biāo)記INA、PNA或寡核苷酸。這個(gè)珠復(fù)合物接著用來生產(chǎn)檢測(cè)特定的DNA分子的信號(hào)放大系統(tǒng)。
(iv)INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA可以附著于用熒光或者放射性基團(tuán)標(biāo)記的樹枝狀聚合物分子，該復(fù)合物用來產(chǎn)生信號(hào)放大。
(v)INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA以任一種上述方法標(biāo)記和雜交到固相支持物上的靶DNA，可以使用單鏈特異的核酸酶例如綠豆核酸酶或S1核酸酶釋放到溶液中。釋放的檢測(cè)分子可以在適合的裝置中讀取。
放射標(biāo)記的檢測(cè)球的制備INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用分子如胺基、巰基基團(tuán)或者生物素在3’或5’標(biāo)記。
標(biāo)記分子還可以具有結(jié)合在分子中第一標(biāo)記物的相對(duì)端的第二個(gè)標(biāo)記物如P32或I125。
這個(gè)雙重標(biāo)記檢測(cè)分子可以使用雜雙功能的接頭如EDC共價(jià)連接到羧酸酯或例如已知大小的改性乳膠珠上。根據(jù)該分析還可以使用其他適合的基質(zhì)。
未結(jié)合的分子能因此通過洗滌除去，留下包被有大量特異的檢測(cè)/信號(hào)放大分子的珠。
接著這些珠與目的DNA樣品雜交產(chǎn)生信號(hào)放大。
熒光標(biāo)記的檢測(cè)球的制備INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用分子如胺基、巰基基團(tuán)或者生物素在3’或5’標(biāo)記。
標(biāo)記分子還可以具有結(jié)合在分子中第一標(biāo)記物的相對(duì)端的第二標(biāo)記物如Cy-3或Cy-5。
這個(gè)雙重標(biāo)記檢測(cè)分子現(xiàn)在可以使用雜雙功能的接頭如EDC共價(jià)連接到羧酸酯或例如已知大小的改性乳膠珠上。
未結(jié)合的分子能因此通過洗滌除去，留下包被有大量特異的檢測(cè)/信號(hào)放大分子的珠。
接著這些珠與目的DNA樣品雜交產(chǎn)生信號(hào)放大。
酶標(biāo)記的檢測(cè)球的制備INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用分子如胺基、巰基基團(tuán)在3’或5’標(biāo)記。
標(biāo)記分子還可以具有通過雜雙功能的接頭在分子中第一標(biāo)記物的相對(duì)端結(jié)合的第二標(biāo)記物，如生物素或其他的分子，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
這個(gè)雙重標(biāo)記檢測(cè)分子現(xiàn)在可以使用雜雙功能的接頭如EDC共價(jià)連接到羧酸酯或已知大小的改性乳膠珠上。
未結(jié)合的分子能因此通過洗滌除去，留下包被有大量特異的檢測(cè)/信號(hào)放大分子的珠。
接著這些珠與目的DNA樣品雜交產(chǎn)生信號(hào)放大。
因此，通過結(jié)合分子如鏈親和素或包含生色底物的酶促反應(yīng)可達(dá)到信號(hào)放大。
INA寡聚體組合在所有上述情況中，最初的雜交事件包括利用包被有與目的核酸互補(bǔ)的INA的磁珠。
第二雜交事件可以包括任一如上所述的方法。
這個(gè)雜交反應(yīng)可以用互補(bǔ)到目的DNA、PNA的第二INA，或者互補(bǔ)到目的核酸的寡核苷酸或修飾的寡核苷酸來進(jìn)行。由于在這些分析中熒光珠具有合宜的大小，攜帶＞106熒光染料分子，并且單個(gè)熒光珠可以容易地檢測(cè)，該方法具有分析來自一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞的一個(gè)或幾個(gè)DNA分子靈敏度的潛力。
樹枝狀聚合物和適配子樹枝狀聚合物是樹枝樣的分子，其可以以可控的方式通過化學(xué)方法人工合成，從而可以產(chǎn)生用特異分子標(biāo)記的多層。它們從中心到外圍或正好相反逐步合成。
控制樹枝狀聚合物結(jié)構(gòu)和其產(chǎn)生的一個(gè)最重要參數(shù)是在每個(gè)步驟產(chǎn)生的分支的數(shù)目；這決定構(gòu)造所需的分子需要的重復(fù)步驟的數(shù)目。
樹枝狀聚合物可以合成，包含放射性標(biāo)記如I125或P32或熒光標(biāo)記物如Cy-3或Cy-5以增強(qiáng)信號(hào)放大。
替代地，樹枝狀聚合物可以合成以包含用于連接修飾的INA、PNA或DNA分子的羧酸酯基團(tuán)或任何其他的反應(yīng)基團(tuán)。
方法使用固相支持體和磁珠檢測(cè)甲基化的DNA圖1和圖2分別顯示使用固相支持物和磁珠通過夾心INA信號(hào)放大的本發(fā)明方法。盡管INA被舉例說明作為圖1和圖2中的檢測(cè)配體，應(yīng)當(dāng)理解其他的檢測(cè)配體如寡核苷酸也可被用于這些方法。
提供微量滴定孔形式的固相支持體并包被有N-氧琥珀酰亞胺以幫助INA或其他的配體附著于孔。
互補(bǔ)到靶核苷酸序列第一部分的第一INA被加到孔中并且附著于該固相支持物。
亞硫酸氫鹽處理的DNA然后被加到孔中，實(shí)現(xiàn)與INA的雜交以捕捉已經(jīng)雜交到INA并隨后結(jié)合到孔上的靶DNA。
然后洗滌所述孔以除去雜交溶液并且任何非雜交的DNA只留下捕捉在孔上的雜交DNA。
其次，互補(bǔ)到靶核苷酸序列第二部分的第二INA連接到具有熒光標(biāo)記物的微球體珠。然后將第二連接的INA與已經(jīng)結(jié)合到孔內(nèi)的靶DNA雜交。然后洗滌該孔以除去未雜交的第二INA/微球體復(fù)合物，只留下INA/微球體復(fù)合物和與靶DNA序列相連的熒光標(biāo)記物。
然后測(cè)量熒光以確定靶DNA的水平。
使用微球體檢測(cè)甲基化的DNA方法學(xué)參考圖3和圖4，顯示使用微球體檢測(cè)甲基化的DNA。
用捕捉INA包被微量滴定(i)捕捉INA(0.01-100pM每孔)的50mM磷酸鹽緩沖液，1mMEDTA pH8.5(100μL)用來包被N-氧琥珀酰亞胺包被的微量滴定孔(Costar Cat#2498)，在4℃持續(xù)16-24小時(shí)。
(ii)微量板用100μL 50mM磷酸鹽緩沖液，1mM EDTA pH8.5洗滌。
(iii)150μL 3％BSA，50mM磷酸鹽緩沖液，1mM EDTA pH8.5被添加到各孔，板置于4℃?zhèn)溆谩?br> 用檢測(cè)INA包被熒光染料(i)熒光染料(Molecular Probes)超聲處理5次，5秒以裂解任何聚集的物質(zhì)。
(ii)檢測(cè)探針I(yè)NA在250μL超聲處理的50mM 2[N-嗎啉代]乙烷磺酸(MES)pH6.0中稀釋到300pM到0.3pM的濃度范圍，添加250μL超聲處理的熒光染料，溶液在室溫下放置30分鐘。
(iii)0.5毫克1-乙基-3[3二甲胺丙基]碳化二亞胺[EDAC]，SigmaCat#E1769，被添加到樣品中，樣品在室溫下暗處放置4-6小時(shí)，然后在4℃孵育16小時(shí)。
(iv)55μL 1M甘氨酸被添加到珠，珠在室溫下放置2小時(shí)。
(v)所述珠以14,000rpm在臺(tái)式離心機(jī)離心5-20分鐘(取決于珠的大小，通常0.5μm珠需要5分鐘而0.1μm珠需要20分鐘)，丟棄上清液。
(vi)珠用500μL PBS/1％BSA洗滌兩次，在洗滌步驟之間進(jìn)行上述的離心。
(vii)珠然后重懸在200μL PBS/1％BSA中，在4℃下儲(chǔ)存于暗處備用。
(viii)結(jié)合到所述珠的INA配體數(shù)目的變化可用于優(yōu)化靈敏度和使本底水平最小化。
DNA雜交(i)對(duì)照鮭魚精子DNA或如Clark等所述(Clark SJ，Harrison J，Paul CL和Frommer M.High sensitivity mapping of methylated cytosines.Nucleic Acids Res.222990-2997(1994))以亞硫酸氫鹽處理的DNA與連接到微量滴定孔上的INA配體雜交，然后添加到各孔。
(ii)DNA樣品與100μL ExpressHybTM緩沖液(Clontech)混合，被加到孔中，所述滴定板用粘附膜覆蓋或孔用礦物油(Sigma)覆蓋用于長(zhǎng)時(shí)保溫，樣品在45-60℃之間孵育1-16小時(shí)。
(iii)然后孔用150μL 2×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗滌兩次，每次5-10分鐘。
(iv)孔另外用150μL 0.1×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗滌5-10分鐘，丟棄洗滌液。
(V)INA/熒光染料用100μL ExpressHybTM緩沖液(Clontech)稀釋1/100，100μL樣品被加到所述孔中。所述滴定板用粘附膜覆蓋或孔用礦物油(Sigma)覆蓋用于長(zhǎng)時(shí)保溫，在45-60℃之間孵育1-16小時(shí)。
(vi)然后孔用150μL 2×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗滌兩次，每次5-10分鐘。
(vii)孔另外用150μL 0.1×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗滌5-10分鐘，丟棄洗滌液。
(viii)最后用合適的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)(黃色珠500/520)在Victor II熒光讀板機(jī)測(cè)量每個(gè)孔具體珠的熒光強(qiáng)度。
(ix)從所有的讀數(shù)中減去沒有INA附著的孔所測(cè)量到的背景值。生產(chǎn)包被放射性同位素標(biāo)記的珠的方法(i)針對(duì)靶DNA或目的核酸區(qū)域合成特定的寡核苷酸(INA或PNA)。該寡核苷酸INA或PNA含有使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法合成(SigmaGenosys)的3′胺基。
(ii)然后使用如下γP32dATP使寡核苷酸(INA或PNA)5’激酶化寡核苷酸(20ng/μl)1μl
×10PNK緩沖液 1μlT4 PNK 1μlγP32dATP 2μL無菌水 5μL(iii)樣品在37℃孵育1小時(shí)然后被加熱到95℃作用5分鐘以滅活該酶。
(iv)0.1μM羧酸酯修飾的熒光珠(Molecular Probes Cat# F-8803)用無菌水1/10,000，1/100,000和1/1,000,000稀釋，然后激酶化的寡核苷酸連接到如下的珠珠 1μl標(biāo)記的寡核苷酸(INA或PNA) 3μL50mM MES pH8.0 5μL10mg/ml EDC(Pierce) 2μL(v)然后在室溫溫育所述珠1小時(shí)以實(shí)現(xiàn)激酶化的寡核苷酸通過3’胺連接到珠上。
(vi)所述珠然后在微量離心機(jī)中以全速旋轉(zhuǎn)15分鐘以沉淀包被的珠。
(vii)除去上清液，用100μL PBS溶液洗滌所述珠，并離心同上。
(viii)除去上清液，所述珠重懸于50μL PBS。
(ix)然后用標(biāo)準(zhǔn)的閃爍計(jì)數(shù)器使用Cerenkov計(jì)數(shù)方案測(cè)量包被的珠的CPM。具有最高放射性的珠用作分析中的檢測(cè)系統(tǒng)。
該方案的指導(dǎo)思想是生產(chǎn)具有最高比活的最小數(shù)量的珠，以便只需要很少的珠結(jié)合到靶序列就可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。
亞硫酸氫鹽處理DNA向2μg DNA中加入2μL(1/10體積)3M NaOH(6g溶于50ml水中，新鮮配制)使終體積為20μL?；旌衔镌?7℃溫育15分鐘。在高于室溫的溫度下溫育可用于提高變性的效率。
溫育后，添加208μL 2M偏亞硫酸氫鈉(7.6g溶于20ml水或Tris/EDTA與416ml 10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D，新鮮配制)。樣品用200μL礦物油覆蓋。然后樣品在55℃溫育過夜?；蛘撸瑯悠房梢栽跓嵫h(huán)控制裝置上循環(huán)，溫育大約4小時(shí)或過夜如下步驟1，55℃/2小時(shí)在PCR機(jī)器上循環(huán)；步驟2，95℃/2分鐘。步驟1可以在任何適合的溫度從大約37℃到大約90℃下進(jìn)行并且可以持續(xù)5分鐘到16小時(shí)的不同時(shí)間。步驟2可以在任何適合的溫度從大約70℃到大約99℃下進(jìn)行并且可以持續(xù)大約1秒鐘到60分鐘或更長(zhǎng)的不同時(shí)間。
在用偏亞硫酸氫鈉處理以后，除去油，并且如果DNA濃度低的話添加1μL tRNA(20mg/ml)或2μL糖原。這些添加劑是可選擇的并且可用于提高通過與靶DNA共沉淀而獲得的DNA的產(chǎn)量，尤其是當(dāng)DNA以低濃度存在時(shí)。
如同下述進(jìn)行異丙醇清除處理向樣品添加800μL水，混合然后加入1毫升異丙醇。再次混合樣品并在-20℃放置至少5分鐘。樣品在微量離心機(jī)離心10-15分鐘并用80％ETOH洗滌小球兩次，每次均進(jìn)行渦旋振蕩。該洗滌處理除去任何殘留的與核酸一起沉淀的鹽。
小球被干燥然后重懸于適合體積例如50μL的T/E(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5中。pH10.5的緩沖液被認(rèn)為特別有效。樣品視需要在37℃到95℃溫育1分鐘到96小時(shí)，以懸浮核酸。
抗體方法基因組中甲基化DNA序列的抗體選擇該方法在圖3中顯示并總結(jié)如下。
I.將針對(duì)5-甲基胞嘧啶的抗體包被至磁珠上。(A)II.在洗滌除去未結(jié)合的抗體后，磁珠被加到基因組DNA。(B)
III.任何包含5-甲基胞嘧啶的DNA結(jié)合到包被有抗體的珠，將大多數(shù)未甲基化的DNA自由地留在溶液中。
IV.抗體/珠被洗滌產(chǎn)生純的甲基化DNA序列群體，其能因此進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。(C)多配體方法使用嵌入核酸(INA)配體的多配體一個(gè)優(yōu)選的方法顯示于圖4。使用該方法如下檢測(cè)目的序列I.INA，設(shè)計(jì)成目的序列的5’區(qū)域，連接到磁珠或可檢測(cè)的顆粒上。(A)II.INA/珠復(fù)合物與亞硫酸氫鹽處理的DNA混合并洗滌以除去非靶DNA.(B)III.然后添加第二INA、PNA或寡核苷酸(其被設(shè)計(jì)成目的序列的3’區(qū)域)。第二INA、PNA或寡核苷酸包含基因組中沒有發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的序列標(biāo)簽，其隨后被用于檢測(cè)。(c)IV.然后洗滌樣品，包含相同標(biāo)簽的第二INA被再次添加，并洗滌所述珠。(D)V.添加第三和第四INA等，雜交并洗滌。(E)VI.標(biāo)簽序列現(xiàn)在使用結(jié)合到INAs 1-4的標(biāo)簽序列的標(biāo)記(熒光/放射性)INA、PNA或寡核苷酸來檢測(cè)。(F)另一優(yōu)選的方法顯示于圖5。使用該方法如下檢測(cè)目的序列I.INA偶聯(lián)至設(shè)計(jì)成目的序列的5′區(qū)域的磁珠或可檢測(cè)的顆粒。(A，B)II.INA/珠復(fù)合物與亞硫酸氫鹽處理的DNA混合并洗滌以除去非靶DNA.(C)III.然后添加設(shè)計(jì)成目的序列的3′區(qū)域的第二INA/珠。第二INA/珠復(fù)合物被熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記用于檢測(cè)。(D)IV.然后洗滌樣品和再次添加熒光或放射性標(biāo)記的第三INA/珠復(fù)合物。(D)
V.添加第三和第四INA等，雜交并洗滌。
VI.使用所有檢測(cè)珠復(fù)合物的總和實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。(E)抗體捕捉多配體分析本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)針對(duì)5-甲基胞嘧啶的抗體(通常被用來使染色體染色)可用于捕捉或濃縮具有高甲基化區(qū)域的核酸。一旦捕捉，核酸可以按照本發(fā)明的方法分析。
該分析描述如下。
A.偶聯(lián)5-甲基胞嘧啶抗體到磁珠上I.0.1μL(0.5μg)5-甲基胞嘧啶的單克隆抗體(Oncogene Cat#NA81)被添加到125μL Dynal Pan小鼠IgG(cat#110.22)，根據(jù)廠家說明書洗滌。
II.樣品在室溫下?lián)u動(dòng)45分鐘。
III.珠用PBS/0.1％牛血清白蛋白洗滌四次。
I.珠然后重懸于125μL PBS/0.1％BSA。
B.基因組DNA的預(yù)富集I.根據(jù)廠家說明書用EcoR1和Hind III預(yù)消化的6.5μg基因組LNCaP DNA被添加到洗滌過的珠上。
II.樣品在室溫下?lián)u動(dòng)45分鐘。
III.珠用PBS/0.1％牛血清白蛋白洗滌四次。
IV.珠然后重懸在40μL水中。
C.亞硫酸氫鹽處理捕捉的DNAI.20μL捕捉的DNA用亞硫酸氫鹽處理如下。
II.2μL(1/10體積)3M NaOH。該混合物在37℃溫育15分鐘。
III.溫育后，添加208μL 2M偏亞硫酸氫鈉。樣品用200μL礦物油覆蓋。
IV.然后樣品在55℃溫育過夜。
V.在用偏亞硫酸氫鈉處理后，除去油，加入1μL tRNA(20mg/ml).
VI.向樣品添加800μL水，混合然后添加1毫升異丙醇。樣品再次混合并在4℃放置30分鐘。
VII.樣品在微量離心機(jī)離心10-15分鐘并用80％ETOH洗滌小球兩次，每次均進(jìn)行渦旋振蕩。
VIII.小球被干燥然后重懸在50μL T/E(10mM Tris/0.1mMEDTA)pH10.5中。
IX.樣品在72℃溫育1小時(shí)。
D.PNA捕捉珠的制備以下PNA被人工合成以識(shí)別GSTP！基因的甲基化序列(登記號(hào)M244852)。
PNA 5’胺-CTA ACG CGC CGA AACI.10μL羧酸酯修飾的MagnabindTM珠(Pierce cat#21353)被轉(zhuǎn)移至干凈的1.5毫升管中，90μL PBS溶液被加到磁珠中。
II.混合珠然后磁化并棄去上清。珠用PBS洗滌兩次，每次100μL并最后重懸在90μL 50mM MES緩沖液pH4.5中。
III.1μL 250μM PNA被添加到樣品中，渦旋振蕩管并在室溫下放置10-20分鐘。
IV.然后添10μL新鮮制備的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，樣品經(jīng)渦旋振蕩和在室溫或者4℃溫育直至60分鐘。
V.所述樣品然后磁化，棄去上清液。
V1.所述珠通過添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封閉10分鐘。
VII.該珠然后用PBS溶液洗滌兩次，最后重懸于100μL PBS溶液中。
E.包被有PNA的捕捉珠雜交到抗體富集的亞硫酸氫鹽處理的DNA
I.10μL PNA包被的珠隨同5μL抗體富集的亞硫酸氫鹽處理的DNA和35μL用蒸餾水1∶1稀釋的ExpressHyb溶液(Clontech)一起被添加到新鮮的1.5毫升離心管中。
II.混合樣品并在55℃放置1小時(shí)。
III.樣品用×2SSC/0.1％SDS在55℃洗滌1次，磁化并丟棄上清液。
IV.樣品另用×1SSC/0.1％SDS在55℃洗滌1次，磁化并丟棄上清液。
V.最后樣品重懸于20μL ×1SSC/0.1％SDS。
F.激酶處理檢測(cè)寡核苷酸四個(gè)特定的檢測(cè)寡核苷酸設(shè)計(jì)為用于最初的PNA捕捉區(qū)域下游的甲基化區(qū)域。這些引物的序列顯示如下檢測(cè)-15’-TAAATCACGACGCCGACCGCTCTT-胺3’(SEQ IDNO1)檢測(cè)-25’-AAAACGCGAACCGCGCGTACTCA-胺3’(SEQ IDNO2)檢測(cè)-35’-CCTAAAAACCGCTAACGACACTA-胺3’(SEQ IDNO3)檢測(cè)-45’-TAAACCACGATATAAAACGACACTC-胺3’(SEQ IDNO4)合成的寡核苷酸激酶處理如下寡核苷酸 40ng×10緩沖液2μLT4激酶2μLγP324pl加水至20μl該反應(yīng)37℃加熱60分鐘然后酶在95℃熱變性處理5分鐘。
G.連接該激酶化的寡核苷酸到熒光珠
I.5μL激酶化的檢測(cè)寡核苷酸如下被偶聯(lián)到1μL 10-7稀釋的Molecular Probes羧酸酯熒光染料0.5μM(Cat#-F 8812粉紅色)10-7熒光染料0.5μM1μl激酶化的檢測(cè)寡核苷酸 5μl50mM MES pH8.0 12μL10mg/ml EDC(Sigma) 2μLII.珠在室溫放置1小時(shí)。
III.珠用SSC/0.1％SDS洗滌一次并重懸如下IV.檢測(cè)1.20μL×0.1SSC/0.1％SDSV.檢測(cè)2.10μL×0.1SSC/0.1％SDSVI.檢測(cè)3.10μL×0.1SSC/0.1％SDSVII.檢測(cè)4.10μL×0.1SSC/0.1％SDSH.檢測(cè)寡核苷酸雜交到PNA捕捉的抗體富集的亞硫酸氫鹽處理的DNAI.來自F節(jié)的珠被磁化并移出上清液。
II.47μL用蒸餾水1∶1稀釋的ExpressHyb溶液(Clontech)被添加到樣品中。
III.3μL各檢測(cè)珠1-4(總體積12μL)被添加到樣品中。
IV.樣品在55℃保溫1小時(shí)。
V.樣品用×2SSC/0.1％SDS在55℃洗滌一次，磁化并丟棄上清液。
VI.樣品另用×1SSC/0.1％SDS在55℃洗滌，磁化并丟棄上清液。
VII.最后珠重懸于5毫升InstaGel閃爍液，并且使用Cerenkov方案通過閃爍計(jì)數(shù)確定放射性。
結(jié)果圖6顯示當(dāng)比較不接受抗體的基因組DNA樣品與抗體捕捉樣品時(shí)的富集率。
圖7顯示使用抗體捕捉多配體分析的非PCR信號(hào)放大。結(jié)果顯示使用下列DNA獲得的信號(hào)1.無抗體富集LNCaP DNA(甲基化DNA)，2.抗體富集的Du145 DNA(未甲基化的DNA)和3.抗體富集的LNCaP DNA(甲基化DNA)。
INA探針捕捉基因組DNA序列和使用PCR的檢測(cè)分析概括成圖8。使用該方法目的序列檢測(cè)如下I.針對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的甲基化區(qū)域，或亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的未甲基化區(qū)域的INA，被設(shè)計(jì)為目的序列的5’區(qū)域，然后偶聯(lián)到磁珠或任何固相上。
II.INA/珠復(fù)合物與亞硫酸氫鹽處理的DNA混合并洗滌以除去非靶DNA。
III.捕捉的物質(zhì)然后用作PCR原料檢測(cè)捕捉位點(diǎn)下游的序列，其中陽(yáng)性PCR表明捕捉到所需的序列。
IV.INA配體還可以被結(jié)合到任何可通過形狀辨別的顆粒上，因此可以在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行成千上萬(wàn)的反應(yīng)。
V.INA、PNA或寡核苷酸等等，連接于這種顆粒上以使INA1連接于形狀1的顆粒...INA2連接于形狀2的顆粒...INA3連接于形狀3的顆粒...等等，所述顆粒然后全部放入一個(gè)管中等等用于隨后的反應(yīng)。
V1.INAs還可以物理方式結(jié)合到PCR板的孔，并且全部的反應(yīng)在單個(gè)孔內(nèi)完成。這允許試劑盒形式，其中產(chǎn)生的陽(yáng)性信號(hào)可以通過在板中的位置而解碼(用于甲基化/非甲基化)(參見以下圖9用于瓊脂糖凝膠試驗(yàn)結(jié)果)。
偶聯(lián)胺修飾的核酸到磁珠上I.10μL羧酸酯修飾的MagnabindTM珠(Pierce)被轉(zhuǎn)移至干凈的1.5毫升管中，90μL PBS溶液被加到磁珠中。
II.混合所述珠然后磁化并且棄去上清液。珠用PBS洗滌兩次，每次100μL，最后重懸在90μL pH4.5的50mM MES緩沖液中或另外的由生產(chǎn)商提供的說明書確定的緩沖液。
III.1μL 250μM INA(濃度取決于由寡核苷酸雜交實(shí)驗(yàn)確定的選擇的INA的比活)被添加到樣品中，渦旋震動(dòng)該管并在室溫下放置10-20分鐘。
IV.然后添加10μL新鮮制備的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，樣品經(jīng)渦旋振蕩和在室溫或者4℃溫育直至60分鐘。
V.樣品然后被磁化，棄去上清液，如有必要所述珠通過添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封閉10分鐘。
VI.該珠然后用PBS溶液洗滌兩次，最后重懸于100μL PBS溶液中。
使用INA包被的磁珠雜交到基因組DNA10μL INA包被的MagnabindTM珠被轉(zhuǎn)移到干凈的管和40μLExpressHybTM緩沖液(Clontech)或原液或蒸餾水1∶1的稀釋液或任何其他的商業(yè)或自制的雜交緩沖液中。緩沖液還可以包含已知濃度的陽(yáng)離子/陰離子或兩性離子(zwittergents)或者其他的添加劑如肝素和聚氨基酸。
1-5μL熱變性的DNA樣品然后被加到上述溶液中，渦旋振蕩該管并在55℃或另外的溫度溫育20-60分鐘，所述溫度取決于選擇的INA的解鏈溫度。
樣品被磁化，棄去上清液和用1×SSC/0.1％SDS在雜交溫度從較早步驟開始洗滌兩次，每次5分鐘，在洗滌的間隙磁化樣品。
PCR擴(kuò)增INA捕捉的DNA如下所述在1μL處理的DNA，1/5體積最終重懸樣品體積中完成PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在25μL包含1μL亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的反應(yīng)混合物中完成，使用Promega PCR master混合物，各引物為6ng/μl。用于擴(kuò)增來自亞硫酸氫鹽處理的DNA的GSTP1的鏈特異的巢式引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(F)GST-10(1307-1332)(SEQID NO5)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT第一輪擴(kuò)增條件(SEQ ID NO6).
1μL第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移至包含如下引物的第二輪擴(kuò)增反應(yīng)混合物(R)GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(F)GST-12(1281-1306)(SEQ ID NO7)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(R)(SEQ IDNO8)。GSTP1的序列(登記號(hào)M24485)顯示引物的位置。PCR產(chǎn)物的樣品在ThermoHybaid PX2熱循環(huán)儀上在標(biāo)準(zhǔn)條件下擴(kuò)增。
在每50毫升瓊脂糖包含1滴溴化乙錠(CLP#5450)的1％TAE中制備瓊脂糖凝膠(2％)。5μL PCR得到的產(chǎn)物用1μL 5X瓊脂糖上樣緩沖液混合并且使用潛水式水平電泳槽在125mA下用X1 TAE電泳。標(biāo)志是低100-1000bp類型。在紫外線照射下使用Kodak UVldoc EDAS290系統(tǒng)目測(cè)凝膠。
圖9顯示INA捕捉和PCR方法的瓊脂糖凝膠圖像。特異于未甲基化的基因組DNA序列的INA配體被連接到磁珠上并與亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA混合。所述珠/DNA復(fù)合物被洗滌，結(jié)合的分子用作下游區(qū)域PCR的模板。泳道；標(biāo)志，1，2，3，其中泳道1HepG2 DNA(已知在靶位點(diǎn)甲基化)，泳道2Du145 DNA(已知在靶位點(diǎn)未甲基化)，泳道3BL13 DNA(已知在靶位點(diǎn)未甲基化)。
結(jié)果表明使用針對(duì)結(jié)合到磁珠上的未甲基化靶核酸的INA配體，INA能夠特異性捕捉未甲基化的亞硫酸氫鹽處理的全部基因組DNA。在泳道1(HepG2)使用的基因組DNA是在INA針對(duì)的基因組座位處甲基化的。用于泳道2(Du145)和3(BL13)的基因組DNA是在INA針對(duì)的基因組座位處未甲基化的，導(dǎo)致在兩個(gè)泳道都得到陽(yáng)性PCR信號(hào)。此外，這個(gè)例子表明該方法可以通過PCR檢測(cè)用于快速測(cè)定甲基化/未甲基化的靶核酸的存在。
使用甲基化混合物的INA配體的特異性INA捕捉珠的制備下列INA被人工合成以識(shí)別GSTP1基因的甲基化的序列和相同區(qū)域(登記號(hào)M24485)未甲基化的版本。(Y表示假嵌入核苷酸)甲基化的INA-1 5’胺-YA TCY GGC YGC GCY AAC YTA Y(SEQ ID NO9)未甲基化的INA-2 5’胺-CTA ACG CGC CGA AAC(SEQ IDNO10)I.10μL羧酸酯修飾的MagnabindTM珠(Pierce cat# 21353)被轉(zhuǎn)移至干凈的1.5ml管中，90μL PBS溶液被加到磁珠中。
II.混合珠然后磁化并棄去上清。珠用PBS洗滌兩次，每次100μL并最后重懸在90μL 50mM MES緩沖液pH4.5中。
III.1μL 250μM PNA被添加到樣品中，渦旋振蕩管并在室溫下放置10-20分鐘。
IV.然后添10μL新鮮制備的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，樣品經(jīng)渦旋振蕩和在室溫或者4℃溫育直至60分鐘。
V.所述樣品然后磁化，棄去上清液。
VI.所述珠通過添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封閉10分鐘。
該珠然后用PBS溶液洗滌兩次，最后重懸于100μL PBS溶液中。
INA配體雜交到合成的甲基化和未甲基化的GSTP1序列兩個(gè)合成的110bp寡核苷酸被設(shè)計(jì)為代表GSTP1基因甲基化和未甲基化的區(qū)域。
未甲基化的序列5’AGGGAATTTTTTTTTGTGATGTTTTGGTGTGTTAGTTTGTTGTGTATATTTTGTTGTGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTTGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGATTTTAG-3’(SEQ ID NO11)甲基化的序列5’AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG-3’(SEQ ID NO12)然后以以下甲基化∶未甲基化的比例混合甲基化和未甲基化的序列100∶0％ 25∶75％99∶1％ 10∶90％95∶5％ 5∶95％90∶10％ 1∶99％75∶25％ 0100％50∶50％雜交反應(yīng)I.40μL用蒸餾水1∶1稀釋的ExpressHyb溶液(Clontech)被添加到5μL偶聯(lián)的珠中。
II.添加5μL寡核苷酸混合物，并通過吸量管有力吹吸混合溶液以重懸所述顆粒。
III.樣品然后在50℃溫育30分鐘以允許靶序列的結(jié)合。
IV.所述珠磁化并除去上清液。
V.所述珠然后用×2 SSC/0.1％SDS在50℃洗滌一次，5分鐘。
VI.所述珠磁化并除去去上清液。
VII.所述珠另用×1 SSC/0.1％SDS在50℃洗滌一次，5分鐘。
檢測(cè)寡核苷酸的激酶化對(duì)結(jié)合到甲基化或者未甲基化的合成寡核苷酸序列的3’區(qū)域的兩個(gè)檢測(cè)寡核苷酸(oligo)進(jìn)行合成。
甲基化的檢測(cè)子5’-AAA CTA ACA CAC CAA AAC ATC ACAAA-胺-3’(SEQ ID NO13)未甲基化的檢測(cè)子5’-GAA CTA ACG CGC CGA AAC ATC GCGAA-胺-3’(SEQ ID NO14)寡核苷酸激酶化如下寡核苷酸 100ng×10緩沖液2μlT4激酶2μlγP324μl加水至20μl反應(yīng)在37℃加熱60分鐘，然后該酶在95℃加熱變性5分鐘。用PCR級(jí)水調(diào)整反應(yīng)體積至55μL。
激酶化的寡核苷酸雜交到INA捕捉磁珠I.洗滌過的INA捕捉珠在45μL用蒸餾水1∶1稀釋的ExpressHyb溶液(Clontech)中重懸。
II.添加5μL激酶化的寡核苷酸，通過吸量管有力吹吸混合溶液以重懸所述顆粒。
III.樣品然后在50℃溫育30分鐘以允許靶序列的結(jié)合。
IV.所述珠磁化并除去上清液。
V.所述珠然后用×2 SSC/0.1％SDS在50℃洗滌一次，5分鐘。
VI.所述珠磁化并除去去上清液。
VII所述珠另用×1 SSC/0.1％SDS在50℃洗滌一次，5分鐘。
VIII.所述珠磁化并除去去上清液。
IX.最后珠重懸于5毫升InstaGel閃爍液，并且使用Cerenkov方案通過閃爍計(jì)數(shù)確定放射性。
結(jié)果顯示于圖10和圖11，其中分別顯示INA針對(duì)未甲基化的和甲基化DNA的特異性。
INAs對(duì)比PNAs對(duì)比寡核苷酸的特異性捕捉珠的制備為確定INA對(duì)比PNA對(duì)比寡核苷酸的特異性，人工合成以下的探針。
INA探針 5’胺-YA TCY GGC YGC GCY AAC YTA Y(SEQ IDNO15)PNA探針 5’胺-ATC GCC GCG CAA CTA A(SEQ ID NO16)寡核苷酸探針 5’胺-AAT CCC CGA AAT CGC CGC GCA ACTAA(SEQ ID NO17)探針被人工合成以識(shí)別GSTP1基因甲基化的序列(登記號(hào)碼M24485)。
I.10μL羧酸酯修飾的MagnabindTM珠(Pierce cat#21353)被轉(zhuǎn)移至干凈的1.5毫升管中，90μL PBS溶液被添加到磁珠中。
II.混合珠然后磁化并棄去上清。珠用PBS洗滌兩次，每次100μL并最后重懸在90μL 50mM MES緩沖液pH4.5中。
III.1μL 250μM PNA被添加到樣品中，渦旋振蕩管并在室溫下放置10-20分鐘。
IV.然后添加10μL新鮮制備的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，樣品經(jīng)渦旋振蕩和在室溫或者4℃溫育直至60分鐘。
V.所述樣品然后磁化，棄去上清液。
VI.所述珠通過添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封閉10分鐘。
VII.該珠然后用PBS溶液洗滌兩次，最后重懸于100μL PBS溶液中。
珠/探針復(fù)合物雜交到合成的GSTP1序列合成的110bp寡核苷酸被設(shè)計(jì)為代表GSTP1基因甲基化的區(qū)域。5’AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG-3’(SEQ ID NO18)合成的寡核苷酸以1/10，1/100和1/1,000激酶化如下寡核苷酸 2μL×10緩沖液2μLT4激酶2μLγP324μL加水至20μL該反應(yīng)37℃加熱60分鐘然后酶在95℃熱變性處理5分鐘。
雜交反應(yīng)I.用蒸餾水1∶1稀釋的ExpressHyb溶液(Clontech)40μL被添加到1.5毫升離心管中的5μL磁珠包被的探針中。
II.添加5μL激酶化的寡核苷酸，并通過吸量管有力吹吸混合溶液以重懸所述顆粒。
III.樣品然后在55℃溫育30分鐘以允許靶序列的結(jié)合。
IV.所述珠磁化并除去上清液。
V.所述顆粒然后用×2SSC/0.1％SDS在55℃洗滌兩次，每次5分鐘。
VI.所述珠另用×1SSC/0.1％SDS在55℃洗滌一次，5分鐘。
VII.除去上清液，最后珠重懸于5毫升InstaGel閃爍液，并且使用Cerenkov方案通過閃爍計(jì)數(shù)確定放射性。
圖12顯示PNA、INA和寡核苷酸樣品與設(shè)計(jì)為GSTP1基因甲基化區(qū)域的合成的110bp寡核苷酸雜交。所述寡核苷酸按描述的方法稀釋然后標(biāo)記并與樣品雜交。由此可見，INA產(chǎn)生與PNA探針相似的信號(hào)強(qiáng)度，如果不比其強(qiáng)度高的話。
圖12顯示當(dāng)PNA、INA和寡核苷酸被設(shè)計(jì)為檢測(cè)相同的基因組座位時(shí)產(chǎn)生的結(jié)果。PNA、INA和寡核苷酸配體與系列稀釋的合成的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的序列雜交。雜交后，洗滌樣品以除去未結(jié)合的分子，然后定量測(cè)量保留的特異性結(jié)合的分子?？梢钥吹絀NA產(chǎn)生比PNA更高的特異性和檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度與常規(guī)的寡核苷酸相比增加15倍。使用陣列型雜交在固相支持物上比較INA配體對(duì)比寡核苷酸為檢測(cè)INA配體對(duì)比寡核苷酸的雜交，人工合成以下針對(duì)各種不同基因座位的INA探針，其符號(hào)如下。M＝甲基化序列檢測(cè)，U＝未甲基化的序列檢測(cè)。
探針 序列 序列號(hào)ABCB1-M 2GTTTATTAAGACGTTTTATATTTTA19ABCB1-U 2GTTTATTAAGATGTTTTATATTTTA20ABCG2-M 2TTTTTGGATGTTCGGGTTTTTTTAG21ABCG2-U 2TTTTTGGATGTTTGGGTTTTTTTAG22BRCA-M2TTGGGTTTTTGCGTTTAGGAGGTTT23BRCA-U2TTGGGTTTTTGTGTTTAGGAGGTTT24CD38-M2GTAATTAGTTACGGAATTTTGAGGT25CD38-U2GTAATTAGTTATGGAATTTTGAGGT26CFTR-M2GAAAAGGTTAGCGTTGTTTTTAAAT27CFTR-U2GAAAAGGTTAGTGTTGTTTTTAAAT28EZH2-M2TTAGTTTGTTGCGGATTAAAATATA29EZH2-U2TTAGTTTGTTGTGGATTAAAATATA30MAGEA2-M 2TTTATTTTTGTCGTGAATTTAGGGA31MAGEA2-U 2TTTATTTTTGTTGTGAATTTAGGGA32
PRKCDBP-M 2GAAGGTTAATTTGGTTTGTTTGAGT 33PRKCDBP-U 2GAAGGTTAATTTTGTTTGTTTGAGT 34PTGS2-M2AAAAGATATTTGGCGGAAATTTGTG 35PTGS2-U2AAAAGATATTTGGTGGAAATTTGTG 36RASSF1-U 2TTATTGAGTTGTGGGAGTTGGTATT 37RASSF1-M 2TTATTGAGTTGCGGGAGTTGGTATT 38為將INA配體與寡核苷酸比較，人工合成相同的寡核苷酸序列。
通過10x多重反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用Qiagen多重PCR試劑盒(Qiagen P/N 206143)從每個(gè)選擇的基因組區(qū)域生成PCR產(chǎn)物。
偶聯(lián)INA配體和寡核苷酸到固相支持物上I.切割8cm×12cm區(qū)域的Biodyne C轉(zhuǎn)移膜(Pall P/70155A)并且用0.1N HCI略加清洗。
II.膜在新鮮制備的EDC(Sigma)水溶液中浸15分鐘。
III.在水中清洗該膜并且放入96孔點(diǎn)印跡裝置。
IV.500ng INA和寡核苷酸在20μL PBS中稀釋并且通過吸量管吸取到合適的孔中。
V.該膜在室溫下放置10分鐘然后施加真空使孔干燥。
VI.該孔然后用200μL PBS/0.1％Tween 20沖洗，洗滌之間施加真空。
VII.從印跡裝置除去所述膜，膜上剩余活性位點(diǎn)用0.1N NaOH在室溫下猝滅10分鐘。
VIII.用蒸餾水清洗該膜并最后在使用前空氣干燥30分鐘。
P32標(biāo)記的多重探針的制備利用引物-基因標(biāo)記系統(tǒng)(Promega Cat#U1100)制備放射性探針PCR產(chǎn)物 2μlPCR級(jí)水 21μl
樣品在95℃加熱5分鐘，然后在冰上驟冷。
dNTP混合物6μl引物混合物15μlP32dATP 5μlKlenow1μl探針在室溫下放置1小時(shí)然后使用wizard DNA清除系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書純化。
包被的膜的預(yù)雜交/雜交I.膜在10毫升包含100μg/ml剪切的鮭魚精DNA(Sigma)的ExpressHyb溶液(Clontech)的滾瓶中55℃以7rpm每分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)1小時(shí)。
II.探針煮沸5分鐘，在冰上驟冷5分鐘然后被加到膜上。
III.在瓶中55℃下以7rpm每分鐘旋轉(zhuǎn)過夜進(jìn)行雜交。
清洗膜I.所述膜然后以×2SSC/0.1％SDS在55℃洗滌兩次，每次20分鐘。
II.所述膜另用×1SSC/0.1％SDS在50℃滌一次，20分鐘。
III.所述膜最后用×0.1SSC/0.1％SDS在55℃洗滌1次，20分鐘。
IV.膜包裹在保鮮膜中并暴露于Molecular Dynamics磷屏成像儀。
使用INAs對(duì)比常規(guī)的寡核苷酸的雜交結(jié)果陳述于圖13。頂部?jī)尚行盘?hào)使用INAs產(chǎn)生。底端兩排信號(hào)使用常規(guī)的寡核苷酸產(chǎn)生。從圖13可以清楚地看出，使用INAs產(chǎn)生優(yōu)良品質(zhì)的雜交信號(hào)。
INA與PNA相比的優(yōu)點(diǎn)INA配體可以在標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸平臺(tái)上人工合成而PNA配體必須在專門的肽合成機(jī)器上合成。
PNA配體不能在標(biāo)準(zhǔn)的分子方法如PCR、反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)PCR、等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)、延伸反應(yīng)中用作引物。相反，INA配體可用于上述所有方法中使它們成為更有用的分子生物學(xué)工具。
INA配體被制成對(duì)核酸外切酶有抗性。
INA配體可以設(shè)計(jì)為選擇性地結(jié)合到DNA而PNA配體結(jié)合到DNA和RNA。
INA配體還顯示內(nèi)源的熒光使它們?cè)谌鐚?shí)時(shí)PCR的應(yīng)用中成為有用的分子，而PNA配體不具有該性質(zhì)。
當(dāng)和PNA配體對(duì)比時(shí)，INA配體還具有降低的自親合力。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PNA配體還是相當(dāng)“粘的”，這是因?yàn)樗鼈兯坪醴翘禺愋哉车奖砻嫔稀．?dāng)兩個(gè)INA配體用于相同系統(tǒng)時(shí)尤其明顯。1NA配體看來不產(chǎn)生這個(gè)問題。
總結(jié)本發(fā)明的方法可以用于使用一個(gè)結(jié)合到固相支持物的配體(優(yōu)選寡核苷酸或INA)和一個(gè)偶聯(lián)到微球體的配體來檢測(cè)任何DNA?？梢允褂锰烊坏墓押塑账峄騃NAs，但由于INAs的特異性、穩(wěn)定性和雜交率，其是優(yōu)選的。
在一個(gè)具體的修改方案中，本發(fā)明的方法可用于區(qū)分已經(jīng)用亞硫酸氫鈉處理的DNA中甲基化胞嘧啶的存在。雜交的特異性可用于區(qū)分未與亞硫酸氫鹽完全反應(yīng)的分子(一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶未變?yōu)槟蜞奏?以及區(qū)分CpG位點(diǎn)處甲基化的胞嘧啶(其仍然是胞嘧啶)和未甲基化的CpG位點(diǎn)，在此處胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぁ?br> 在另一修改中，本發(fā)明方法可用于區(qū)分胞嘧啶未與亞硫酸氫鹽試劑完全反應(yīng)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶的DNA。
由于用亞硫酸氫鹽處理通過轉(zhuǎn)變所有的胞嘧啶(然而并非5-甲基胞嘧啶)為尿嘧啶而改變DNA序列，因此制備的特異INAs識(shí)別具有5甲基胞嘧啶的區(qū)域但不識(shí)別剛好沒有5甲基胞嘧啶的相同序列。
本發(fā)明的方法還可以用于區(qū)分基因中不同的等位基因，其中寡核苷酸或INAs中的一種或兩種序列將與一個(gè)等位基因很好地匹配，但與另一個(gè)則錯(cuò)配。
本發(fā)明的方法具有前述的眾多應(yīng)用，包括在設(shè)計(jì)用于迅速檢測(cè)大量DNA樣品甲基化狀態(tài)的多陣列芯片中的具體應(yīng)用。可檢測(cè)的顆粒還可以用來按比例放大和使檢測(cè)和篩選過程自動(dòng)化。
應(yīng)當(dāng)理解該方法適用許多其他的狀態(tài)和條件，其中不同的甲基化狀態(tài)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在疾病或改變的細(xì)胞狀態(tài)中起作用。僅僅一些受CpG甲基化影響的基因的例子顯示于表3。很清楚本發(fā)明適合于檢測(cè)或測(cè)量這種甲基化狀態(tài)等。
本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)特定的實(shí)施方案顯示的發(fā)明進(jìn)行許多的變化和/或修改，而不脫離廣泛描述的本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和范圍。因此本發(fā)明實(shí)施方案在各方面被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
表3受CpG或CpNpG甲基化影響的基因的例子

序列表<110>人類遺傳標(biāo)記控股有限公司(Human Genetic Signature Pty Ltd)<120>使用嵌入核酸檢測(cè)核酸中甲基化改變的分析<130>SCT053180-47<160>38<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>human<400>1taaatcacga cgccgaccgc tctt 24<210>2<211>23<212>DNA<213>Human<400>2aaaacgcgaa ccgcgcgtac tca 23<210>3<211>23<212>DNA<213>Human<400>3ctaaaaacc gctaacgaca cta 23
<210>4<211>25<212>DNA<213>Human<400>4taaaccacga tataaaacga cactc 25<210>5<211>27<212>DNA<213>Human<400>5tttgttgttt gtttattttt taggttt 27<210>6<211>26<212>DNA<213>Human<400>6aacctaatac taccaattaa ccccat 26<210>7<211>29<212>DNA<213>Human<400>7gggatttggg aaagagggaa aggtttttt 29
<210>8<211>26<212>DNA<213>Human<400>8actaaaaact ctaaaaaccc catccc 26<210>9<211>21<212>DNA<213>Human<400>9yatcyggcyg cgcyaacyta y 21<
210>10<211>15<212>DNA<213>Human<400>10ctaacgcgcc gaaac 15<210>11<211>110<212>DNA<213>Human<400>11agggaatttt tttttgtgat gttttggtgt gttagtttgt tgtgtatatt ttgttgtggt 60tttttttttg gtttttttgg ttagttgtgt ggtgattttg gggattttag 110
<210>12<211>110<212>DNA<213>Human<400>12agggaatttt ttttcgcgat gtttcggcgc gttagttcgt tgcgtatatt tcgttgcggt 60tttttttttg gttttttcgg ttagttgcgc ggcgatttcg gggattttag 110<210>13<211>26<212>DNA<213>Human<400>13aaactaacac accaaaacat cacaaa 25<210>14<211>26<212>DNA<213>Human<400>14gaactaacgc gccgaaacat cgcgaa 26<210>15<211>21<212>DNA<213>Human<400>15yatcyggcyg cgcyaacyta y 21
<210>16<211>16<212>DNA<213>Human<400>16atcgccgcgc aactaa 16<210>17<211>26<212>DNA<213>Human<400>17aatccccga aatcgccgcgc aactaa 26<210>18<211>110<212>DNA<213>Human<400>18agggaatttt ttttcgcgat gtttcggcgc gttagttcgt tgcgtatatt tcgttgcggt 60tttttttttg gttttttcgg ttagttgcgc ggcgatttcg gggattttag 110<210>19<211>25<212>DNA<213>Human<400>19gtttattaag acgttttata tttta 25
<210>20<211>25<212>DNA<213>Human<400>20gtttattaag atgttttata tttta 25<210>21<211>25<212>DNA<213>Human<400>21tttttggatg ttcgggtttt tttag 25<210>22<211>25<212>DNA<213>Human<400>22tttttggatg tttgggtttt tttag 25<210>23<211>25<212>DNA<213>Human<400>23ttgggttttt gcgtttagga ggttt 25
<210>24<211>25<212>DNA<213>Human<400>24ttgggttttt gtgtttagga ggttt 25<210>25<211>25<212>DNA<213>Human<400>25gtaattagtt acggaatttt gaggt 25<210>26<211>25<212>DNA<213>Human<400>26gtaattagtt atggaatttt gaggt 25<210>27<211>25<212>DNA<213>Human<400>27gaaaaggtta gcgttgtttt taaat 25
<210>28<211>25<212>DNA<213>Human<400>28gaaaaggtta gtgttgtttt taaat 25<210>29<211>25<212>DNA<213>Human<400>29ttagtttgtt gcggattaaa atata 25\<210>30<211>25<212>DNA<213>Human<400>30ttagtttgtt gtggattaaa atata 25<210>31<211>25<212>DNA<213>Human<400>31tttatttttg tcgtgaattt aggga 25
<210>32<211>25<212>DNA<213>Human<400>32tttatttttg ttgtgaattt aggga 25<210>33<211>25<212>DNA<213>Human<400>33gaaggttaat ttcgtttgtt tgagt 25<210>34<211>25<212>DNA<213>Human<400>34gaaggttaat tttgtttgtt tgagt 25<210>35<211>25<212>DNA<213>Human<400>35aaaagatatt tggcggaaat ttgtg 25
<210>36<211>25<212>DNA<213>Human<400>36aaaagatatt tggtggaaat ttgtg 25<210>37<211>25<212>DNA<213>Human<400>37ttattgagtt gtgggagttg gtatt 25<210>38<211>25<212>DNA<213>Human<400>38ttattgagtt gcgggagttg gtatt 2權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中靶核酸存在的方法，包括用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理含核酸的樣品；向處理過的樣品以嵌入核酸(INA)形式提供能夠結(jié)合到核酸靶區(qū)域的檢測(cè)配體，并允許檢測(cè)配體與靶核酸結(jié)合足夠的時(shí)間；以及檢測(cè)檢測(cè)配體與樣品中核酸分子的結(jié)合以表明靶核酸的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中核酸獲取自真核生物基因組、原核生物、病毒、線粒體核酸，其他細(xì)胞器中發(fā)現(xiàn)的核酸、細(xì)胞外核酸、DNA和RNA形式以及天然或人工的DNA或RNA衍生物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中天然或人工的DNA和RNA衍生物選自INA，ANA，MNA，PNA，LNA，HNA，CNA，和其嵌合組合。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述核酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求1-4之一的方法，其中所述試劑選自亞硫酸氫鹽、醋酸鹽或檸檬酸鹽。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉，該試劑在存在水的情況下將胞嘧啶修飾成尿嘧啶。
7.權(quán)利要求1-6之一的方法，其中INA是(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(1-芘基甲基)-甘油的亞磷酰胺。
8.權(quán)利要求1-7之一的方法，其中在未處理的核酸中靶區(qū)域包括至少一個(gè)5’-甲基胞嘧啶。
9.權(quán)利要求1-7之一的方法，其中檢測(cè)配體針對(duì)DNA中含CpG-或CpNpG的區(qū)域，其中N代表四種可能的堿基A，T，C或G之一。
10.權(quán)利要求9的方法，其中DNA中含CpG-或CpNpG的區(qū)域處于基因的調(diào)控區(qū)域，或任何調(diào)控元件的增強(qiáng)子區(qū)域，所述調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、癌基因、逆元件、可移動(dòng)序列，或活性被環(huán)境因素改變的其他調(diào)控元件，所述環(huán)境因素包括化學(xué)品、毒素、藥物、輻射、合成或天然的化合物和微生物或其他的傳染因子如病毒、細(xì)菌、真菌和朊病毒。
11.權(quán)利要求1到10之一的方法，其中在處理樣品之前，核酸經(jīng)過富集或選擇步驟。
12.權(quán)利要求10的方法，其中富集或選擇步驟選自包括超聲和剪切的物理方法、酶消化、酶處理、限制性消化、核酸酶處理、Dnase處理、濃縮、抗體捕捉，包括酸消化或堿消化的化學(xué)方法及其組合。
13.權(quán)利要求11的方法，其中富集或選擇步驟是用針對(duì)5’甲基胞嘧啶的抗體處理以獲得甲基化的核酸樣品。
14.權(quán)利要求1到13之一的方法，其中該方法通過向處理過的核酸以嵌入核酸(INA)形式提供能夠區(qū)分核酸中甲基化和未堿甲基化胞嘧啶的檢測(cè)配體而檢測(cè)靶核酸的甲基化，從而檢測(cè)檢測(cè)配體與樣品中核酸的結(jié)合是靶核酸甲基化程度的指示。
15.權(quán)利要求1到14之一的方法，其中能夠識(shí)別靶核酸序列第一部分的捕捉配體結(jié)合到固相支持物上，從而處理過的核酸通過第一捕捉配體結(jié)合到支持物，結(jié)合的核酸然后暴露給能夠識(shí)別靶核酸序列第二部分的檢測(cè)配體，并使檢測(cè)配體與結(jié)合在支持物上的靶核酸結(jié)合足夠的時(shí)間，其中測(cè)量檢測(cè)配體與結(jié)合到支持物的核酸的結(jié)合以確定樣品中靶核酸的存在，其中至少一種捕捉配體或檢測(cè)配體是INA配體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中配體選自INA探針、肽核酸(PNA)探針、LNA探針、HNA探針、ANA探針、MNA探針、寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、單鏈DNA、RNA、適配子、抗體、蛋白、肽、其組合，和其嵌合的形式。
17.權(quán)利要求16的方法，其中捕捉配體選自INA探針、PNA探針和寡核苷酸探針。
18.權(quán)利要求15的方法，其中捕捉配體和檢測(cè)配體都是INA配體。
19.權(quán)利要求15到18之一的方法，其中檢測(cè)配體是能夠區(qū)分DNA中甲基化和未甲基化胞嘧啶的INA配體，以及檢測(cè)配體結(jié)合的程度或量是靶核酸甲基化程度的指示。
20.權(quán)利要求15到19之一的方法，其中支持物選自塑料材料、熒光珠、磁珠、成形粒子、板、微量滴定板、合成或天然膜、乳膠珠、聚苯乙烯、柱支持物、玻璃珠或載玻片、納米管、陣列、纖維、有機(jī)和無機(jī)的支持物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中支持物是磁珠、熒光珠、成形粒子、珠陣列或一孔或多孔的微量滴定板。
22.權(quán)利要求15到21之一的方法，其中多個(gè)捕捉配體排列于固相支持物上。
23.權(quán)利要求1到22之一的方法，其中INA檢測(cè)配體具有附于其上的可檢測(cè)標(biāo)記。
24.權(quán)利要求23的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記選自化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光染料、放射性物質(zhì)、酶、半抗原和樹枝狀聚合物。
25.權(quán)利要求1到24之一的方法，其中結(jié)合到INA配體的核酸被進(jìn)一步加工或處理。
26.權(quán)利要求25的方法，其中核酸使用針對(duì)核酸區(qū)域的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。
27.權(quán)利要求26的方法，其中引物是INA配體。
28.分析用修飾未甲基化胞嘧啶的試劑處理過的核酸的試劑盒，包括至少一種能夠區(qū)分DNA中甲基化和未甲基化胞嘧啶的INA配體。
29.權(quán)利要求28的試劑盒，其中一種或多種INA配體固定于固相支持物上。
30.權(quán)利要求29的試劑盒，其中固相支持物選自塑料材料、熒光珠、磁珠、成形粒子、板、微量滴定板、合成或天然膜、乳膠珠、聚苯乙烯、柱支持物、玻璃珠或載玻片、納米管、陣列、纖維、有機(jī)和無機(jī)的支持物。
31.權(quán)利要求28到30之一的試劑盒，進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增處理過的DNA的引物。
32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中引物是INA引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)樣品中靶核酸存在的方法，包括用修飾未甲基化的胞嘧啶的試劑處理含核酸的樣品；向處理過的樣品以嵌入核酸(INA)形式提供能夠結(jié)合到核酸靶區(qū)域的檢測(cè)配體，允許檢測(cè)配體結(jié)合到靶核酸足夠的時(shí)間；和檢測(cè)檢測(cè)配體結(jié)合到樣品中核酸分子以指示靶核酸的存在。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1764729SQ200480007913
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月24日
發(fā)明者道格拉斯·斯彭切爾·米勒, 約翰·羅伯特·梅爾基, 杰夫雷·W·格里格, 喬治·L·加博爾·米克洛斯 申請(qǐng)人:人類遺傳標(biāo)記控股有限公司