專利名稱：：泛酸內(nèi)酯水解酶的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及可用于泛酸內(nèi)酯(pantolactone)對映異構(gòu)體的光拆分(opticalresolution)的酶，涉及編碼所述酶的基因，還涉及所述酶在制備R-泛酸或其鹽或R-泛酰醇(R-panthenol)的方法中的用途。對映異構(gòu)體在其生理效應，即毒理和藥理效應，與酶的反應以及其感知特征(sensorialcharacteristics)方面是不同的。已知僅有R-泛酸內(nèi)酯是R-泛酸制備中的中間產(chǎn)物，R-泛酸是維生素，其對人類和動物的生長、繁殖以及正常生理功能來說都是必要的。泛酸作為輔酶A的前體以及作為脂肪酸合成酶的?；d體，涉及到超過一百種的不同代謝途徑，其中包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類的能量代謝，以及脂類、神經(jīng)遞質(zhì)、甾類激素、卟啉和激素的合成。直到近來，廣泛用于R-泛酸內(nèi)酯制備的方法是對化學合成的R-和S-泛酸內(nèi)酯進行的光拆分。此種方法非常昂貴，因為其需要使用昂貴的光拆分試劑。此外，對泛酸內(nèi)酯的R-對映異構(gòu)體的回收也相當困難。因此，提供可用于泛酸內(nèi)酯的R-和S-對映異構(gòu)體的光拆分的泛酸內(nèi)酯水解酶是人們所需要的。使用這種酶，尤其是水解泛酸內(nèi)酯的S-或R-形式，是分離泛酸內(nèi)酯的兩種對映異構(gòu)體的更為經(jīng)濟且更容易操作的方法。R-泛酸的鹽的例子包括R-泛酸鈣。在一種實施方式中，本發(fā)明提供了編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的核苷酸序列，所述泛酸內(nèi)酯水解酶是從馬肝臟、A.nigerATCC9142、A.nigerawamoriATCC38854或A.nigerMacRaeATCC46951中獲得的。公眾可從AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，10801UniversityBoulvard，Manassas，VA20110-2209USA獲得上述菌株。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的核苷酸序列，所述序列包含當泛酸內(nèi)酯水解酶來自馬肝臟時，如SEQIDNO1所示的核苷酸序列；當泛酸內(nèi)酯水解酶來自A.nigerMacRaeATCC46951時，如SEQIDNO5所示的核苷酸序列；當泛酸內(nèi)酯水解酶來自A.nigerATCC9142時，如SEQIDNO7所示的序列；以及當泛酸內(nèi)酯水解酶來自A.nigerawamoriATCC38854時，如SEQIDNO9所示的序列。所述核苷酸序列可以包含上述每種泛酸內(nèi)酯水解酶的編碼序列以及調(diào)控序列?！罢{(diào)控序列”在此被定義為指導可操作地連接的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列的排列。一個此類表達控制序列的例子是啟動子。“啟動子”包括在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必要核酸序列。啟動子還可選地包括遠端增強子或阻遏元件，其可定位于轉(zhuǎn)錄起始位點之后的多達數(shù)千個堿基對上?！敖M成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境及發(fā)育條件下都有活性的啟動子?！罢T導型”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控中具有活性的啟動子。術(shù)語“可操作地連接”指核酸表達控制序列(例如啟動子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的排列)以及第二種核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達控制序列指導對應于第二種序列的核酸的轉(zhuǎn)錄?？梢允褂煤怂嵝蛄械钠?，例如，在雜交試驗中作為探針。在宿主生物中插入核苷酸序列，令其轉(zhuǎn)錄及翻譯，以制造功能性多肽的情況下，技術(shù)人員將認識到，由于密碼簡并性，很多種多核苷酸序列都將編碼同樣的多肽。這些變異體也明確地包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明還明確地包括下述序列，所述序列彼此之間實質(zhì)上相同(按照下文所述來確定)，它們編碼是野生型多肽的突變體的多肽或保留有多肽功能的多肽(例如由對多肽氨基酸的保守取代得到的)。此外，變異體可以是編碼下述顯性失活突變體的。如果按照下文所述進行最大一致性比對時，兩條核酸序列或多肽各自的核苷酸序列或氨基酸殘基是同樣的，這兩條核苷酸序列或多肽會被認為是“相同的”。在關(guān)于兩條或多條核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“相同的”或百分比“相同性”指在比較窗(comparisonwindow)上進行最大一致性比較及比對時，用下述序列比較算法中的一種或通過手工比對及眼睛觀察來測量的情況下，兩條或多條序列或亞序列是同樣的，或其中同樣的氨基酸殘基或核苷酸具有特定的百分比。當序列相同性的百分比針對蛋白質(zhì)或肽來使用時，應認識到，不相同的殘基位置通常是由于保守的氨基酸取代而導致不同的，其中氨基酸殘基被取代為其它具有相似化學性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基，因此并不改變分子的功能屬性。當序列因保守取代而不同時，可因取代的保守本質(zhì)，將百分比序列相同性上調(diào)以進行校正。進行這種調(diào)節(jié)的方法是本領域技術(shù)人員公知的。典型地，這包括將保守取代作為部分而非完全的錯配進行評分，因而提高百分比序列相同性。因此，例如，在給相同的氨基酸1分，給非保守取代0分的情況下，給保守取代0和1之間的分數(shù)。按照，例如，Meyers&Miller，ComputerApplic.Biol.Sci.411-17(1988)的算法，例如，在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView，Calif.，USA)中實現(xiàn)，來計算對保守取代的給分。在關(guān)于兩條核酸或多肽的上下文中，短語“實質(zhì)上相同”指在比較窗上進行最大一致性比對時，用下述序列比較算法中的一種或通過手工比對及眼睛觀察來測量的情況下，具有至少60％，優(yōu)選80％，最優(yōu)選90-95％的核苷酸或氨基酸殘基相同性的序列或亞序列。該定義還指能與待測序列雜交的序列的互補序列。對序列比較而言，典型地，一條序列用作參照序列，將待測序列與其進行比較。使用序列比較算法時，將待測和參照序列都輸入到計算機中，如果需要的話，指定亞序列坐標，以及指定序列算法程序參數(shù)。可以使用缺省的程序參數(shù)，或者指定其它參數(shù)。然后序列比較算法會基于程序參數(shù)，對待測序列相對于參照序列的百分比序列相同性進行計算。本文中使用的“比較窗”包括指一種片斷，其連續(xù)位置的數(shù)量選自由20至600，通常大約50至大約200，更通常為大約100至大約150所構(gòu)成的組，其中，序列可與具有同樣數(shù)量的連續(xù)位置的參照序列進行比較，這是在兩條序列被最優(yōu)排列之后進行的。對序列進行排列以進行比較的方法是本領域內(nèi)公知的。“經(jīng)保守修飾的變異體”用于氨基酸及核酸序列。就具體的核酸序列而言，經(jīng)保守修飾的變異體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者，當核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，有多種功能上相同的核酸密碼子編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸這種氨基酸。因此，在丙氨酸被密碼子確定的每個位置上，密碼子可變?yōu)樯鲜鱿鄳艽a子中的任何一個，而不會改變編碼出的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，其是經(jīng)保守修飾的變異中的一種。本文中每條編碼多肽的核酸序列也還描述該核酸的每種可能的沉默變異。技術(shù)人員將認識到，核酸中的每個密碼子(AUG除外，其通常是編碼甲硫氨酸的唯一的密碼子)都可被修飾，以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變異都隱含在每條被描述過的序列中。對氨基酸序列而言，技術(shù)人員將認識到，對核酸的個別取代、缺失或增加，或?qū)﹄?、多肽或蛋白質(zhì)序列進行的在被編碼的序列中改變單個氨基酸或小百分比(即，小于20％，例如15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％)的氨基酸的取代，是“經(jīng)保守修飾的變異體”，其中的改變是氨基酸被化學上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本領域內(nèi)是公知的。下述六組中的每一組都含有可以互相保守取代的氨基酸丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；精氨酸(R)、賴氨酸(K)；異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；以及苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(見，例如，Creighton，Proteins(1984))。兩條核酸序列或多肽實質(zhì)上相同的標志是第一條核酸編碼的多肽可與因?qū)沟诙l核酸編碼的多肽而產(chǎn)生的抗體進行免疫交叉反應。因此，例如，當兩條肽僅僅只由于保守取代而有不同時，則典型地，其中一條多肽與第二條多肽實質(zhì)上相同。兩條核酸序列實質(zhì)上相同的另一種標志是這兩個分子或其互補體在如下文所述的嚴謹條件下能相互雜交。短語“與……特異性雜交”指在嚴謹雜交條件下，當序列存在于復雜混合物(例如，細胞總DNA或RNA，或文庫DNA或RNA)中時，分子僅與特定的核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈或雜交。短語“嚴謹雜交條件”指探針將與其目標序列而不與其它序列雜交的條件，典型地，其目標序列處于核酸序列的復雜混合物中。嚴謹條件是取決于序列的，在不同的情況下也有所不同。較長的序列會在較高的溫度下特異性雜交。通常，高嚴謹度條件被選擇為比在給定的離子強度和pH下特異性序列的熱融溫度(Tm)低大約5-10℃。低嚴謹度條件通常被選擇為比Tm低大約15-30℃。Tm是(在給定的離子強度、pH和核酸濃度下，)平衡時，互補于目標的探針中的50％與目標序列雜交的溫度(目標序列過量存在時，Tm處，平衡時50％的探針被結(jié)合)。嚴謹條件將是下述條件鹽濃度低于大約1.0M的鈉離子，典型地，大約0.01至1.0M的鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3，對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言溫度為至少大約30℃，對長探針(例如，多于50個核苷酸)而言，溫度為至少大約60℃。嚴謹條件還可以通過加入去穩(wěn)定試劑，例如甲酰胺來獲得。對選擇性或特異性雜交而言，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選10倍于背景雜交。如果在嚴謹條件下不能相互雜交的核酸所編碼的多肽是實質(zhì)上相同的，那么這樣的核酸也仍然是實質(zhì)上相同的。這會發(fā)生于，例如，用由遺傳密碼允許的最大密碼子簡并度產(chǎn)生核酸拷貝的情況下。在此類情況下，典型地，核酸在中度嚴謹雜交條件下雜交。在本發(fā)明中，用本文中公開的核酸序列，在嚴謹條件下進行標準的Southern印跡實驗，可鑒定出含有本發(fā)明核酸的基因組DNA(gDNA)或cDNA。就此種公開的目的而言，適合于此類雜交的嚴謹條件包括在37℃下在40％甲酰胺、1MNaCl、1％十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液中雜交，在至少大約50℃的溫度下于0.2XSSC中洗至少一次，20分鐘，溫度通常是在大約55℃至大約60℃；或是相當?shù)臈l件。陽性雜交至少是背景的兩倍。普通技術(shù)人員很容易認識到，其它雜交及洗滌條件可用于提供具有相似嚴謹度的條件。關(guān)于兩條多核苷酸相同的另一種標志是通過一對寡核苷酸引物擴增出來的參照序列，在嚴謹雜交條件下可被用作為探針，以從cDNA或基因組文庫中分離出待測序列，或在northern或Southern印跡實驗中鑒定出待測序列。本發(fā)明還包括本文所定義的表達載體。表達載體包括上文列出的多核苷酸序列中任一種的一個或多個拷貝。本發(fā)明的表達載體可以含有本文定義的任何多核苷酸序列。因此，在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種表達載體，所述載體包含編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的核苷酸序列，所述泛酸內(nèi)酯水解酶來自馬肝臟、Bacillussubtilis、A.nigerATCC9142、A.nigerawamoriATCC38854或A.nigerMacRaeATCC46951；或者所述載體包含編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的核苷酸序列，所述泛酸內(nèi)酯水解酶來自馬肝臟，如SEQIDNO2所示，來自Bacillussubtilis，如SEQIDNO4所示，來自A.nigerATCC9142，如SEQIDNO8所示，來自A.nigerawamoriATCC38854，如SEQIDNO10所示，以及來自A.nigerMacRaeATCC46951，部分如SEQIDNO6所示?？蛇x地，表達載體中的多核苷酸序列可與上文定義的表達控制序列可操作地連接。在本文中使用的短語“表達載體”是可復制的(replicatable)載體，其帶有編碼本文列出的多核苷酸序列的DNA序列，并能調(diào)控這些DNA序列的表達。在本文上下文中，術(shù)語“可復制的”指，在引入載體的給定類型的宿主細胞中，載體可被復制。在感興趣的多核苷酸序列上游接近該多核苷酸的地方，可能會提供有編碼信號肽的序列，其存在確保了帶有載體的宿主細胞所表達的被編碼的多肽得以分泌。信號序列可以是與被選出的多核苷酸序列天然相連接的，或者可以來自另一種來源。載體可以是傳統(tǒng)用于重組DNA工藝的任何載體，對載體的選擇將通常取決于其將被引入的宿主細胞。因此，載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外物質(zhì)存在的載體，其復制獨立于染色體復制；此種載體的例子是質(zhì)粒、噬菌體、粘?；蛎阅闳旧w。另外，載體可以是下述載體，當其被引入到宿主細胞中時，會整合到宿主細胞基因組中，并與其被整合到的宿主細胞基因組一起復制。本發(fā)明的表達載體可以帶有本發(fā)明的任何DNA序列，可被用于表達本發(fā)明的任何多肽。本發(fā)明還包括經(jīng)培養(yǎng)的細胞或宿主細胞，其中含有一條或多條本文公開的多核苷酸序列和/或一個或多個本文公開的表達載體。在本文中使用的“經(jīng)培養(yǎng)的細胞”包括，任何能夠在給定條件下生長，并能表達本發(fā)明的多核苷酸編碼的一種或多種多肽的細胞。優(yōu)選地，經(jīng)培養(yǎng)的細胞是酵母、真菌、細菌或藻類。更優(yōu)選地，經(jīng)培養(yǎng)的細胞是Escherichiacoli、Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Aspergillusniger或Bacillussubtilis。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了從馬肝臟、A.nigerATCC9142、A.nigerawamoriATCC38854或A.nigerMacRaeATCC46951中獲得的泛酸內(nèi)酯水解酶。在又一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種泛酸內(nèi)酯水解酶，其氨基酸序列包含當來自馬肝臟時，SEQIDNO2所示的氨基酸序列；當來自A.nigerMacRaeATCC46951時，SEQIDNO6所示的氨基酸序列；當來自A.nigerATCC9142時，SEQIDNO8所示的氨基酸序列；當來自A.nigerawamoriATCC38854時，SEQIDNO10所示的氨基酸序列。SEQIDNO2所示的來自馬肝臟的和SEQIDNO4所示的來自Bacillussubtilis的泛酸內(nèi)酯水解酶顯示S-泛酸內(nèi)酯水解酶活性。SEQIDNO8所示的來自A.nigerATCC9142的、SEQIDNO10所示的來自A.nigerawamoriATCC38854的和部分如SEQIDNO6所示的來自A.nigerMacRaeATCC46951的泛酸內(nèi)酯水解酶顯示R-泛酸內(nèi)酯水解酶活性。在另一種實施方式中，本發(fā)明包含上述氨基酸序列的片段，所述片段具有完整蛋白質(zhì)的酶活性。根據(jù)本發(fā)明的“氨基酸序列的片段”可被定義為缺少一段氨基酸的序列，該段氨基酸對蛋白質(zhì)正確折疊來說可能是必要的。然而，一旦蛋白質(zhì)被折疊，該段氨基酸就可被刪除，而不會破壞單個蛋白質(zhì)的功能。這些段可以存在于被折疊的蛋白質(zhì)中，例如環(huán)，或者可以是與被折疊的蛋白質(zhì)的活性不直接相關(guān)的N-或C-末端序列。此外，本發(fā)明包括包含所述R-和S-泛酸內(nèi)酯水解酶活性的蛋白質(zhì)的衍生物。所述衍生物包括被固定的酶，例如通過內(nèi)含(inclusion)被固定，其中所述的酶被保留于膜裝置上，例如中空纖維、聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或微囊體。還可能通過交聯(lián)或通過產(chǎn)生酶晶體來對酶進行固定。另一種對酶進行固定的可能方法是將其結(jié)合到正在生長的多聚物上，例如二氧化硅溶膠凝膠或二氧化硅石墨溶膠凝膠，或者通過將酶結(jié)合到預制載體上，例如EupergitC、Eupergit250L、PEG、Celite和AmberliteXAD-7。對本發(fā)明的R-和S-泛酸內(nèi)酯水解酶適用的另一種固定酶的技術(shù)是將其分散在與水無法混溶的有機溶劑中。通常，通過本領域內(nèi)已知的幾乎所有固定技術(shù)，可對具有酶活性的蛋白質(zhì)，例如本發(fā)明的酶進行固定。在又一種實施方式中，本發(fā)明涉及用經(jīng)分離的泛酸內(nèi)酯水解酶選擇性水解R-或S-泛酸內(nèi)酯水解酶的用途，這可用于對泛酸內(nèi)酯的R-對映異構(gòu)體的工業(yè)生產(chǎn)，泛酸內(nèi)酯的R-對映異構(gòu)體是生產(chǎn)R-泛酸和R-泛酰醇的前體。因此，本發(fā)明的一個目的是提供用本文所述的經(jīng)分離的泛酸內(nèi)酯水解酶來對R-或S-泛酸內(nèi)酯進行選擇性水解的方法或途徑。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)R-泛酸或其鹽或R-泛酰醇的方法，其中包括在本發(fā)明的泛酸內(nèi)酯水解酶存在下對R-或S-泛酸內(nèi)酯進行選擇性水解的步驟。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了克隆與已知序列直接相鄰的核苷酸序列的方法，例如編碼新穎的泛酸內(nèi)酯水解酶或其部分的核苷酸序列。具體而言，本發(fā)明包括能擴增未知序列的新的PCR策略。所述新的PCR策略包括在第一條和第二條DNA鏈的合成中使用同一種引物。該引物能與將被擴增的gDNA的已經(jīng)已知的區(qū)域雜交。該引物顯示與已知序列100％的同源性。在該引物的幫助下，進行第一次PCR，提供基因組DNA的第一條單鏈拷貝，到達未知序列。用一部分第一次PCR反應產(chǎn)物作為模板來進行第二次PCR，其中使用的(嵌套)引物能與定位于第一次PCR中所用的引物的3’方向上的DNA片段雜交，但邏輯上仍處于序列的已知部分。該嵌套引物與第一次聚合酶反應產(chǎn)生的單鏈DNA進行隨機雜交之后，產(chǎn)生該單鏈DNA的反義鏈，其自身作為用于第二次PCR、產(chǎn)生第二條鏈的同樣的引物的模板。在最后，起始于已知序列內(nèi)部，延伸于鄰近的基因組DNA或延伸于缺失部分序列的任何其它DNA的DNA片段通過與新片段兩端都能雜交的一種引物被制造出來。因此，在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了克隆與已知序列直接相鄰的核苷酸序列的方法，所述方法包括PCR擴增，所述擴增包括a)用第一次PCR的單鏈DNA作為模板進行第二次PCR，在所述第二次PCR中用能與第一次PCR產(chǎn)生的單鏈DNA隨機雜交的引物；以及b)由此，仍用步驟a)中的隨機雜交引物，產(chǎn)生自身作為第二條鏈模板的反義鏈。下述實施例對編碼泛酸內(nèi)酯水解酶基因的鑒定、表征和表達進行了詳細的描述。這些實施例僅是示例性的，而非欲以任何方式對本發(fā)明的范圍加以限制。實施例1從可商購的馬肝臟酯酶丙酮粉末來純化(S)-泛酸內(nèi)酯水解活性將1g馬肝臟酯酶丙酮粉末(FlukaHoldingAG，Industriestrasse25，P.O.Box260，CH-9471Buchs，瑞士)溶于40ml50mM的Tris/HCl中，pH7.5，其中含有2M硫酸銨、1mMCaCl2、1mMMgCl2和10μMEDTA(緩沖液A)。通過離心分離出未溶解的物質(zhì)，之后，用0.45μM過濾器進行過濾滅菌。將蛋白質(zhì)溶液上樣到用緩沖液A平衡過的丁基瓊脂糖柱HR26/10(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)中。用100ml緩沖液A洗該柱。之后應用400ml從0至100％線性梯度的緩沖液B(沒有硫酸銨的緩沖液A)。內(nèi)酯酶在梯度中間被洗脫出來。收集顯示泛酸內(nèi)酯水解活性的片斷，將緩沖液換為pH8.0的20mMTris/HCl、1mMCaCl2、1mMMgCl2以及10μMEDTA。收集的片斷上樣到MonoQ-預填(pre-packed)柱HR26/10(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)中，應用0至350mMNaCl的線性梯度。蛋白質(zhì)在該梯度的開始即被洗脫出來。再次收集活性片斷，濃縮到1ml，上樣至Superdex200柱(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)上。用pH8.0的50mMTris/HCl、1mMCaCl2、1mMMgCl2以及10μMEDTA作為洗脫緩沖液，內(nèi)酯酶作為最后一個峰被洗脫出來，其顯示大約31kDa的分子大小，與SDS-PAGE所示的尺寸相符。通過在37℃將酶于pH9.0的200mMTris/乙酸緩沖液、5mMMgCl2中培養(yǎng)60分鐘進行測定，發(fā)現(xiàn)最高比活性為13.3U/(mg蛋白質(zhì))。通過HPLC來測定(S)-和(R)-泛酸內(nèi)酯的濃度。實施例2對來自馬肝臟的(S)-泛酸內(nèi)酯水解酶進行初步的表征(a)分子大小、結(jié)構(gòu)以及等電點根據(jù)SDA-PAGE，變性蛋白具有大約35kDa的分子量。用經(jīng)校正的凝膠過濾柱的洗脫時間，天然蛋白質(zhì)的分子量被計算為大約31kDa。這意味著來自馬肝臟的內(nèi)酯酶是30至35kDa的單體。用2D凝膠，等電點被測定為pH5.5的范圍內(nèi)。(b)N-末端和內(nèi)部氨基酸測序用胰蛋白酶對2D凝膠電泳之后富集的蛋白質(zhì)進行消化。通過質(zhì)譜對產(chǎn)生的肽進行分析。SEQNO11中示出了肽No.66的N-末端序列。該序列與MS-譜一起顯示，該蛋白質(zhì)屬于已知為衰老標記蛋白-30或鈣調(diào)蛋白(regucalcins)的蛋白質(zhì)家族，其主要被發(fā)現(xiàn)于脊椎動物中。來自大鼠、小鼠、人、雞、兔、牛、Xenopuslaevis的鈣調(diào)蛋白序列，以及來自Drosophilamelanogaster的兩條較少同源性的序列已被測定。然而，來自馬的該基因還未被分離及測序。(c)金屬依賴性為測定不同二價金屬對馬肝臟酶的泛酸內(nèi)酯酶活性的影響，將1.3、2.6、5.2或10.4mM的Ca2+、Mg2+或Mn2+加入到由pH9.0的200mMTris/乙酸鹽和50mM(R，S)-泛酸內(nèi)酯組成的反應混合物中。在37℃對反應混合物進行60分鐘的培養(yǎng)，用等體積的含有2mMEDTA的甲醇來終止反應。通過HPLC測定(S)-泛酸內(nèi)酯的減少。鈣令酶活性降低，而鎂和錳則使酶活性增高。(d)熱穩(wěn)定性在30至80℃的溫度下，將經(jīng)純化的酶在5.2mMMgCl2和pH9.0的200mMTris/乙酸鹽中培養(yǎng)15分鐘。冰上30分鐘之后，用標準試驗方法來測定活性(60分鐘，37℃)。直到60℃酶依然是穩(wěn)定的。其在65℃開始失活，在70℃丟失超過50％的活性。實施例3克隆來自馬肝臟的(S)-泛酸內(nèi)酯酶用來自所有已知哺乳動物基因(見下文)的序列信息來設計引物，用于針對從來自Bavaria的一年齡“Hafflinger”的馬肝臟制得的cDNA進行的PCR，所述cDNA由RocheMolecularBiochemicals，Penzberg，德國友情提供。用QIAGENRNeasyMaxiKit(Qiagen，Hilden，德國)來制備來自肝臟組織的總RNA。馬肝臟內(nèi)酯酶與鈣調(diào)蛋白家族其它成員之間的同源性顯示于表1中。測定是通過GCG程序包中的GAP程序，使用標準參數(shù)來測定的。相似性的數(shù)字顯示于表中對角線的右邊，而相同性的數(shù)字顯示于對角線左邊。表1鈣調(diào)蛋白家族中的氨基酸序列相似性和相同性雞雞；X.laevXenopuslaevis；D.melaDrosophilamelanogaster用TitanOneTubeRT-PCTKit(RocheMolecularBiochemicals，Penzberg，德國)和覆蓋了起始密碼子及終止密碼子上游50bp序列的同源引物，利用RT-PCT擴增出885bp的片段(SEQIDNO1的1-885位核苷酸)。反應按照廠商推薦的方法進行。用于第一次PCR的N-末端5’引物(SEQIDNO12)和C-末端3’-引物(3’-CAGTTTCCTTAAGGGGGGATA-5’)(SEQIDNO13)的構(gòu)建基于來自牛(SEQIDNO14)、兔(SEQIDNO15)、人(SEQIDNO16)、大鼠(SEQIDNO17)、小鼠(SEQIDNO18)、雞(SEQIDNO19)和Xenopus(SEQIDNO20)的N-末端序列以及來自牛(SEQIDNO21)、兔(SEQIDNO22)、人(SEQIDNO23)、大鼠(SEQIDNO24)、小鼠(SEQIDNO25)、雞(SEQIDNO26)和Xenopus(SEQIDNO27)的C-末端序列。將該片段克隆到TA克隆載體(Invitrogen，Carlsberg，CA，USA)中。測序證明其來自馬肝臟鈣調(diào)蛋白。通過被稱為5’/3’RACE的方法，用RocheMolecularBiochemicals，Penzberg，德國提供的單獨的試劑盒，分離出缺失的5’-末端用完美匹配的引物(SEQIDNO28)從經(jīng)分離的馬肝臟cDNA生產(chǎn)單鏈DNA。純化該單鏈DNA，加上polyC尾巴，用第一條引物5’端的嵌套引物、polyG引物來進行另一次PCR。代表著基因的缺失的5’-末端的DNA片段被擴增出來。用根據(jù)已經(jīng)已知的序列設計的正向引物(SEQIDNO29)和主要根據(jù)牛和兔基因設計的起始于基因最后一個氨基酸的引物(SEQIDNO30)來克隆出3’-末端。在最后一次PCR中，用獲得的序列信息來設計覆蓋基因起始和終止密碼子的5’-和3’-引物，按照上文所述從總RNA中分離出內(nèi)酯酶的全長cDNA。該cDNA和氨基酸序列展示于SEQIDNO1和SEQIDNO2中。該基因由900bp/299個氨基酸構(gòu)成。用一種商業(yè)途徑可獲得的表達載體，例如來自Qiagen的pQE60，在E.coli中表達完整的基因，其C-末端與His標簽融合。按照標準程序?qū)由螲is標簽的蛋白質(zhì)進行表達和純化，產(chǎn)生出顯示(S)-泛酸內(nèi)酯酶活性的33kDa的蛋白質(zhì)。實施例4由可商購的A.niger脂肪酶A粗制劑來純化(R)-泛酸內(nèi)酯水解活性在可從商業(yè)途徑獲得的不同種的由A.niger發(fā)酵獲得的酶產(chǎn)品中，鑒定出了特異性水解(R)-泛酸內(nèi)酯的活性。為純化具體的酶，使用了來自AmanoPharmaceuticalsCo.Ltd.，Nagoya，Japan的被稱為LipaseA“Amano”的商業(yè)制劑。根據(jù)從與內(nèi)酯酶共同純化的兩個酶獲得的序列數(shù)據(jù)，該制劑來自經(jīng)凍干和破碎的過量表達來自A.tubigensis的脂肪酶的A.awamori細胞。將該材料溶于pH7.5的20mMTris/HCl、2.5mM的MgCl2(標準緩沖液)中。加入5％的乙醇，以增加材料的溶解度。通過離心(30分鐘，15000rpm，4℃)以及接著的過濾(用0.45μm的過濾器)，分離出無法進入到溶液中的材料。先在Amiconcell超濾器(50kDa分離點)中通過超濾對已溶解的部分進行第一次純化，以去除任何鹽類和小分子化合物，它們會擾亂后續(xù)的陰離子交換色譜步驟。然后將蛋白質(zhì)上樣至HR26/10預填Q-瓊脂糖凝膠柱(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)。用200ml標準緩沖液洗柱，然后通過0至350mMNaCl的線性梯度(400m1)洗脫出蛋白質(zhì)。含有活性的片斷被收集起來。加入硫酸銨，至終濃度為1.5M，將經(jīng)過處理的蛋白質(zhì)溶液上樣至HR26/10丁基瓊脂糖凝膠預填柱(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)中。用200ml含有1.5M硫酸銨的標準緩沖液洗滌，通過1.5至0M遞減的硫酸銨梯度(400ml)分離出蛋白質(zhì)。此時活性在兩個峰被洗脫出，并被分別收集。兩次收集物的體積被減少到小于2ml。用標準緩沖液，通過在Superdex200柱上進行凝膠過濾分離出兩種濃縮物。每種分離物的活性片段被收集和濃縮。收集物II的活性趨向于稍早于收集物I被洗脫出來，這表明，相應蛋白質(zhì)的分子量可能稍高。80U/ml(40℃)是針對收集物I和收集物II分別已測出的最高活性。如2D凝膠所示，蛋白質(zhì)制劑不完全是同源的，這表示真正的比活性甚至會更高。然而，因為內(nèi)酯酶活性對應于凝膠過濾洗脫曲線中38kDa的蛋白質(zhì)條帶，也是最終制劑中占優(yōu)勢的蛋白質(zhì)，該條帶最有可能是內(nèi)酯酶。根據(jù)凝膠過濾的結(jié)果，天然內(nèi)酯酶具有75kDa的分子量。這暗示著該酶的同型二聚體結(jié)構(gòu)。實施例5對(R)-泛酸內(nèi)酯水解酶進行初步的表征(a)天然形式的結(jié)構(gòu)和分子量用如實施例4所述的條件，在72ml處，用Superdex200(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)洗脫出酶。從標準曲線推斷，這反映了75kDa的分子量。SDS-PAGE表明分子量為38kDa。上述數(shù)據(jù)的組合暗示來自A.niger的(R)-泛酸內(nèi)酯酶是由兩個相同的38kDa亞基組成的同型二聚體。(b)熱穩(wěn)定性在pH7.5的20mMTris/HCl中于0、30、40、50、55、60、70℃對50μl經(jīng)稀釋的酶(0.1U)進行一小時的培養(yǎng)。冰上15分鐘之后，用標準試驗方法測定殘余活性。直到50℃酶都是穩(wěn)定的。在更高的溫度下，其開始失活。(c)最佳溫度采用下述條件，于20、30、40、50、55和60℃，對來自商業(yè)來源(見實施例5)的強烈富集的(R)-泛酸內(nèi)酯酶進行30分鐘的培養(yǎng)100mM(R，S)-泛酸內(nèi)酯100mMMgCl2200mMTris/HCl，pH8.00.05U(R)-泛酸內(nèi)酯酶，最終體積為10μl。在所用的條件下，來自商業(yè)化A.niger制劑的(R)-泛酸內(nèi)酯酶的最佳溫度為大約50℃。(d)輔助因子依賴性和抑制來自A.niger的(R)-泛酸內(nèi)酯酶的活性需要Mg2+或Mn2+。加入1mMEDTA會完全抑制其活性。(e)最佳pH當pH在7.0至11.0之間變化時，該酶并未顯示出“正常的”pH-活性曲線。在40℃，對200mMTEA-乙酸鹽緩沖液(pH7.0至11.0)中的10mgAmanoLipaseA進行20分鐘的培養(yǎng)，所述緩沖液含有0.1％Span80，20mM乙酸鎂。加入等體積的500mMMES緩沖液來終止樣品的反應，所述緩沖液pH為5.5，含有50mMEDTA；對樣品進行離心(10,000g，10分鐘)，然后通過HPLC進行分析，其中，用0.46×15cmCHIRADEX柱，用70∶30的水-甲醇來洗脫，1ml/分鐘，20℃。最高活性在pH為大約10時達到。從這個位置到pH11.0之間，活性并無可觀的改變。最高選擇性在pH大約9.0時達到。實施例6培養(yǎng)A.nigerATCC9142、9029、26875、62863和10864，并對其(R)-泛酸內(nèi)酯酶活性進行評測為獲知內(nèi)酯酶活性是否在Aspergillus屬中廣泛存在，在下述條件下培養(yǎng)五個A.niger菌株培養(yǎng)基(相對于每升的量)1.2gNaNO3、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4×7H2O、0.5g酵母提取物、5％葡萄糖和0.04ml的痕量金屬溶液，所述溶液如Vishniac和Santer，Bacteriol.Rev.21195-213(1957)所述。用每ml5×106個孢子于30℃去接種11瓶中的300ml預培養(yǎng)物。8小時后，將預培養(yǎng)物加入到21發(fā)酵罐中的1.71培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐帶有pH和溶解氧控制。通過自動加入5MNaOH將pH保持在5.5。在低通氣條件(5-10％的空氣飽和度)下對細胞進行14小時的培養(yǎng)。之后將溶解氧水平增加至30-50％空氣飽和度。5小時后，收獲菌絲體，對其進行過濾，用去礦物質(zhì)水洗兩次，冷凍于液氮中。用FrenchPress對其中的一部分直接進行裂解。用標準試驗方法對培養(yǎng)基和細胞裂解液進行針對泛酸內(nèi)酯酶活性的研究。(R)-泛酸內(nèi)酯酶活性主要被發(fā)現(xiàn)于所有被測試的A.niger菌株的裂解液中。在培養(yǎng)基中僅發(fā)現(xiàn)了非常小的活性。實施例7對來自脂肪酶制劑的經(jīng)富集的(R)-泛酸內(nèi)酯酶進行胰蛋白酶消化產(chǎn)生的小肽的氨基酸序列進行測定在2D凝膠上對實施例5的經(jīng)過富集的制劑進行分析。用胰蛋白酶對兩個主要的點進行消化，其分別是33和40kDa，4.7和5.6的pI。通過HPLC來分離產(chǎn)生的肽(設備HewlettPackard1090，柱VydacC18(0.21×25cm)，210nm處吸收，流速0.20ml/分鐘，緩沖液A0.075％TFA，緩沖液B80％乙腈中的0.065％TFA，梯度2％B(0-10分鐘)，2-75％B(10-120分鐘))。通過Edman降解法來對選出的肽進行測序，點C[pI5.6，39kDa(PollC)]Fxn42(肽1)(SEQIDNO81)、Fxn57(肽3)(SEQIDNO82)、Fx73(肽2)(SEQIDNO83)、Fx74(SEQIDNO84)和Fx81(SEQIDNO85)，點C[pI4.7，33kDa(PollA/B)]N末端(SEQIDNO86)、Fx58(SEQIDNO87)、Fx64(SEQIDNO88)、Fx65(SEQIDNO89)、Fx73(SEQIDNO90)和Fx68(SEQIDNO91)。X代表未確定的氨基酸，圓括號中的氨基酸是無法被明確確定的。用所有短肽序列作為目標進行數(shù)據(jù)庫搜索，沒有得到可靠的信息能幫助確定兩個主要的點中的哪一個代表著內(nèi)酯酶。因此，我們利用一套陰離子交換色譜對實施例5的內(nèi)酯酶制劑進行進一步的富集。在預填MonoQ柱HR16/10(AmershamPharmaciaBiotechEuropeGmbH，Dübendorf，瑞士)上，0至350mMNaCl梯度下，對蛋白質(zhì)溶液(在pH7.5的20mMTris/HCl、2.5mMMgCl2中)進行分離。對所有片斷的活性進行測定。按照廠商(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)所述進行等電聚焦以及SDS-PAGE，對活性片斷進行分析。比較SDS-PAGE凝膠和IEF得出的片斷活性數(shù)據(jù)，暗示內(nèi)酯酶是38至40kDa的蛋白質(zhì)，pI在pH5.6左右。該數(shù)據(jù)與點PollC吻合得非常好。因此，該點的氨基酸序列就被用于設計PCR引物和用于Southern印跡試驗的寡核苷酸。收集最具有活性的片斷，再在2D凝膠上進行分析，分析顯示，較之之前的2D凝膠，PollC相對于PollA/B更加清楚地富集。實施例8設計用于Southern印跡試驗的簡并寡核苷酸以及用于從A.niger克隆(R)-泛酸內(nèi)酯酶的PCR引物使用來自不同Aspergillus種的12條不同的植酸酶序列，通過GCG程序包版本10.2的CODONFREQUENCY程序，得到Aspergillus的密碼子使用情況，將其用于減少由于遺傳密碼簡并性所造成的可能的不同DNA序列組合的數(shù)目。用Aspergillus密碼子使用情況作為決定性因素，引物3’-末端都考慮到了每種可能的組合，但引物5’-末端就忽略了一些稀有的密碼子。在用寡核苷酸進行雜交實驗的情況下，用同樣的方式對3’-和5’-末端進行處理。名稱中含有“S(sense)”或“AS(anti-sense)”的寡核苷酸是用于PCR的。名稱中不含S或AS的寡核苷酸是用于雜交實驗的。用于從A.niger中克隆(R)-泛酸內(nèi)酯酶的寡核苷酸是Fxn42(SEQIDNO31)、Fxn42S(SEQIDNO32)、Fxn42AS(SEQIDNO33)、Fx57(SEQIDNO34)、Fxn57S(SEQIDNO35)、Fxn57AS(SEQIDNO36)、Fx73(SEQIDNO37)、Fx73S(SEQIDNO38)、Fx73AS(SEQIDNO39)、Fx74(SEQIDNO40)、Fx74S(SEQIDNO41)和Fx74AS(SEQIDNO42)。實施例9從A.nigerATCC9142、A.nigerNRRI3135、A.nigerssp.awamori(ATCC38854)或A.nigerMacRae(ATCC46951)中分離基因組DNA用1×106孢子/ml去接種300ml的YPD培養(yǎng)基[Shermanetal.，Laboratorycoursemanualformethodsinyeastgenetics，ColdSpringHarborLaoratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1986)]。在猛烈振蕩下(200rpm)，于30℃對培養(yǎng)物進行過夜培養(yǎng)。用Whatman濾紙通過過濾收集菌絲體，用PBS(等滲磷酸緩沖液)洗，在液氮中冷凍。在冰冷的研缽中，將菌絲體磨成細粉末。將該粉末重新懸浮于1/3體積的pH8.0的50mMTris/HCl、1.0％SDS、50mMEDTA中，于65℃頻繁顛倒條件下培養(yǎng)15分鐘。將溶液冷卻至50℃。加入蛋白酶K(終濃度為100μg/ml)。將溶液在50℃培養(yǎng)1小時。另外加入100mg/ml的蛋白酶K，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。加入1/3體積的苯酚/氯仿/異戊醇(50/49/1)。徹底且輕柔的混合之后，對乳化液進行離心(12000g，20分鐘，4℃)。移出水相，再次萃取。另一個離心步驟(12000g，10分鐘，4℃)之后，用氯仿對水相進行萃取。向水相中加入0.7倍體積的異丙醇，輕柔混合溶液15分鐘。通過離心(10000g，30分鐘，4℃)收集沉淀DNA。向殘留的上清液中加入1/10體積的pH5.2的3MKCl，在輕柔振蕩下培養(yǎng)15分鐘。再一次離心步驟之后，用70％的乙醇對兩份沉淀洗兩次，空氣中干燥，溶于0.5ml水中。最后，用RNase處理DNA以去除殘留的RNA。實施例10克隆來自A.nigerATCC9142的(R)-泛酸內(nèi)酯酶按照實施例6所述來制備A.nigerATCC9142的基因組DNA(gDNA)。用來自Stratagene(Stratagene，LaJolla，CA，USA)的RobocyclerInfinity作為PCR儀，用來自RocheMolecularBiochemicals(Penzberg，德國)的TAQ聚合酶試劑盒來進行PCR1μlgDNA(1/10稀釋)步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-50℃1μl引物S(100pM/μl)步驟41分鐘-72℃1μl引物AS(100pM/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的TAQ聚合酶40μlH2O步驟2至4重復35次。引物組合對所有引物都會進行關(guān)于自身錨定(self-priming)的檢查。Fxn57AS是唯一會產(chǎn)生相當數(shù)量自身結(jié)合產(chǎn)物的引物，自身錨定產(chǎn)物為大約300至320bp。用55℃的雜交溫度，PCR5、6、8、10和11仍會產(chǎn)生一條或多條產(chǎn)物。60℃下采用30秒擴增和30個循環(huán)，PCR5、6、8、10和11仍會產(chǎn)生一條或多條與較低雜交溫度下產(chǎn)生的條帶相對應的PCR產(chǎn)物。用來自Qiagen(Qiagen，Hilden，德國)的QIAEXII凝膠抽提試劑盒從瓊脂糖凝膠中分離出PCR反應12的840bp的產(chǎn)物，將其溶于40μlH2O中。1μl840bp的片段(110稀釋)步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-55℃1μl引物S(10pMol/μl)步驟430秒-72℃1μl引物AS(10pMol/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的TAQ聚合酶40μlH2O步驟2至4重復30次。使用了反應2、5、10、11和12的引物組合。除反應2之外，其它所有反應都有PCR產(chǎn)物產(chǎn)生。這意味著引物42S/AS、57S/AS、73S/AS和74S/AS的序列是840bp片段的部分。這四對引物的高度接近性強烈預示，840bp的片段是感興趣的內(nèi)酯酶基因的一部分。這種假設得到了測序的支持。肽Fx57(SEQIDNO90)的氨基酸序列在840bp的片段中得到了證實，而肽Fxn42(SEQIDNO45)的序列僅得到了部分證實。還可以分離出A.nigerMacRae的相應DNA片段。關(guān)于A.awamori的情況，通過該方法僅能分離出引物Fxn57S和Fx73AS的產(chǎn)物。上述Aspergillus的序列在DNA水平上與A.nigerATCC9142的序列具有大約90％的相同性。為分離內(nèi)酯酶基因的5’-和3’-末端，使用下述方法(a)分離3’-末端1μlA.nigerATCC9142的gDNA步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-55℃1μl引物Oal2AS或Oal3S(10pMol/μl)步驟430秒-72℃1μl來自RocheMolecularBiochemicals的TAQ聚合酶41μlH2O步驟2至4重復30次。用等體積的苯酚/氯仿對PCR混合進行兩次萃取，再用氯仿單獨進行一次。然后通過加入1/10體積的pH5.2的3M乙酸鉀和2倍體積的乙醇沉淀出DNA。15分鐘的離心(Eppendorf板式離心管中，14000rpm)之后，用70％的乙醇洗沉淀，空氣干燥，最終溶于20μl滅菌水中。第二次PCR4μl來自第一次PCR的DNA步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-58℃1μl引物Oal4S或Oal1AS(10pMol/μl)步驟41分鐘-72℃1μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelityMix38μlH2O步驟2至4重復35次。用Oal4S引物，產(chǎn)生了一段900bp的DNA分子。測序顯示其編碼基因的3’-末端。(b)分離5’-末端用DIG標記過的寡核苷酸Fxn42、Fxn57、Fx73和Fx74作為探針，使用帶有X-光膠片化學熒光探測的DIG系統(tǒng)(RocheMolecularBiochemicals)，對A.nigerATCC9142的基因組DNA進行雜交實驗。雜交和探測按照廠商的推薦來進行。用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SacI和XhoI來對10μg的基因組DNA進行消化。用RocheMolecularBiochemicals雜交溶液在42℃進行過夜雜交。室溫用2×SSC、0.1％SDS進行兩次洗滌步驟之后，接著在50℃用0.5×SSC、0.1％SDS再進行兩次洗滌步驟。用CSPD(Disodium2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1，2-dioxetane-3，2’-(5’-chloro)tricyclo[3.3.1.13，7]decan}-4-yl)-1-phenylphospate)作為底物，對堿性磷酸酶進行探測，之后將X-光膠片曝光于濾光器(filter)1小時。膠片上沒有合用的信號。因此，使用反應5和11的隨機錨定的DIG標記過的PCR產(chǎn)物(見實施例11)作為探針。按照同樣的方法來進行雜交，只是洗滌條件稍微改變?yōu)槭覝叵?×5分鐘，55℃下2×15分鐘。膠片上顯示了下述條帶為克隆整個基因或至少是其缺失的5’-末端，根據(jù)雜交實驗，用HindIII對A.nigerATCC9142的染色體DNA進行消化，產(chǎn)生出大約4kb的含有內(nèi)酯酶基因的片段，實驗方法如下20μl染色體DNA20μl10x緩沖液5μlHindIII(10U/μl)175μlH2O在37℃培養(yǎng)16小時。用來自Qiagen(Qiagen，Hilden，德國)的PCR純化試劑盒對經(jīng)過消化的DNA進行純化，并洗脫為100μl。下述連接反應在16℃過夜進行。將經(jīng)過純化的DNA用水稀釋到2ml。按照廠商(RocheMolecularBiochemicals)推薦加入連接酶和連接酶緩沖液。連接完成的溶液被用作模板，進行不同的PCR，其中使用經(jīng)部分分離的內(nèi)酯酶基因的內(nèi)部引物5μl連接反應溶液步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-55℃1μlsense引物(10pMol/μl)步驟43分鐘-72℃1μianti-sense引物(10pMol/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟2至4重復32次。四種引物組合，Oal3S/Fxn57AS、Oal4S/Fxn57AS、Oal3S/Oal8AS和Oal4S/Oal8AS，都能產(chǎn)生單條4kb的DNA片段。所有引物對都定向于基因的外部。因此，內(nèi)酯酶基因應該位于作為自連接HindIII片段的環(huán)狀DNA分子上。用來自Qiagen的QIAEXII凝膠抽提試劑盒從凝膠中分離出片段，按照廠商(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA，USA)推薦的二去氧方法，用ABI310GeneticAnalyzer來進行測序。獲得的序列證實，分離出的片段含有來自A.nigerATCC9142的(R)-泛酸內(nèi)酯酶基因的兩個末端。用引物Oal10S和Oal12AS，也可能分離出A.nigerssp.awamori的同源基因，其中含有與所有被測出的肽完全一樣的氨基酸序列。唯一的區(qū)別僅在于肽Fxn42的序列。此時Fxn42來自對兩個肽的測序。最可能的情況是，當進行HPLC來分離經(jīng)過消化的酶片段時，同時洗脫出了兩個不同的肽。測序首先僅揭示了主要的肽的序列，但其卻帶有很強的背景。對第一個肽的測序完成后，剩下的就是第二個肽的序列，其具有另外四個氨基酸a)K-P-F-A-H-Q-V-K(SEQIDNO43)和b)R-H-H-N-A-P-A-P-T-P-E-D-P-E-R-R(SEQIDNO44)給出K-P-F-A-H-Q-V-K-T-x-E-D(SEQIDNO45)，其為Fxn42。這還解釋了為何基于肽Fxn42的寡核苷酸Fxn42S和Fxn42AS無法給出合用的結(jié)果。根據(jù)氨基酸序列，來自菌株ATCC9142的蛋白質(zhì)具有36573Da的分子量，280nm處估計的吸光率為1.83(1mg/ml蛋白質(zhì)溶液)，而來自A.nigerssp.awamori的氨基酸序列的分子量被計算為36547Da，對1mg/ml蛋白質(zhì)溶液而言，估計的E280nm為1.831(Paceetal.，1995)。實施例11對來自A.nigerATCC9142的(R)-泛酸內(nèi)酯酶基因進行克隆和表達對按照實施例10中所述的全部三種方法獲得的序列進行比較，將其進行裝配，產(chǎn)生一條連續(xù)的覆蓋整個內(nèi)酯酶基因的2443bp的序列。為測定該基因的起始密碼子、終止密碼子和可能的內(nèi)含子，將從來自商業(yè)制劑的純化基因得到的肽的可獲得的氨基酸序列，與GCG程序包版本10.2的兩個程序TESTCODE和CODONPREFERENCE獲得的結(jié)果聯(lián)合使用。雖然按照同樣的方式兩個程序都測定出了終止密碼子和一個內(nèi)含子，而起始密碼子卻并不明顯，具體而言，因為沒有肽Fx74(SEQIDNO84)的其它可獲得的N-末端已被測序的肽。對數(shù)據(jù)庫搜索期間發(fā)現(xiàn)的向同源氨基酸序列的所有可能的翻譯進行的比較也沒有幫助，因為蛋白質(zhì)的N-末端部分是完全異源的。因此，在肽Fx74的位置上游但仍在同一個閱讀框內(nèi)發(fā)現(xiàn)的兩個甲硫氨酸殘基被選出，將其用于構(gòu)建不同的表達盒。在SEQIDNO7的666-742號堿基對之間發(fā)現(xiàn)了富含CT的區(qū)域。然而，該富含CT的區(qū)域的位置并非像起始密碼子那樣真正地偏好Met而不是其它氨基酸，因為在真菌中該區(qū)域與起始密碼子之間的距離通常有相當大的變化。此外，在基因的下游鑒定出了可能的聚腺苷化位點。對來自A.nigerATCC9142的基因的72bp長的內(nèi)含子而言，從第976至981位核苷酸的DNA段最可能代表5’-剪切位點，從第1029至1035位或從1016至1022位核苷酸的段最可能代表推測出的內(nèi)部保守序列(consensussequence)，從第1045至1047位核苷酸的DNA段最可能代表3’-剪切位點(SEQIDNO7)。A.nigerMacRae基因的相應序列在51bp長的內(nèi)含子(SEQIDNO79)中定位于bp32至37、66至72、以及80至82。對A.nigerssp.awamori的oal基因的50bp長的內(nèi)含子而言，5’-剪切位點始自第203位核苷酸(GTGCCC)，內(nèi)部保守區(qū)域在第236位核苷酸處(AACTAAC)，3’-剪切位點在第250位核苷酸處(CAG)(SEQIDNO9)。5’-剪切位點的保守序列是GTPuNGPy。列出的位點中沒有一個在第5位有G。用于套索(lariat)形成的內(nèi)部位點的酵母的保守序列是TACTAAC。3’-剪切位點具有PyAG的保守序列[Unkles，Geneorganizationinindustrialfilamentousfungi.InAppliedmoleculargeneticsoffilamentousfungi(Kinghoun，ed.)，pp.28-53.BlackieAcademic&Professional，WesterCleddensRoad，Bishopbriggs，GlasgowG642NZ，UK，Glasgow(1992)]。產(chǎn)生了下述cDNA-用于在E.coli中表達的oal(SEQIDNO98)-用于在Saccharomycescerevisiae中表達的oalEco(SEQIDNO94)-用于在S.cerevisiae中表達的oalEShort(用SEQIDNO95的第32位處的第二個可能的Met的31個氨基酸的較短的版本)-用于在E.coli中表達的oalS(oalS被制成是因為Fxn42肽的令人誤解的序列，其最終被鑒定為人工產(chǎn)物)-用于在S.cerevisiae中表達的oalSEco-用于在E.coli中表達的含有C-末端his-標簽的oalhis-用于在S.cerevisiae中表達的oalEhis-用于在E.coli中表達的含有N-末端his-標簽的oalNhis(SEQIDNO92)-用于在S.cerevisiae中表達的oalENhis(SEQIDNO96)(構(gòu)建體oalsec，其含有A.terreuscbs的植酸酶的信號肽，該信號肽用于在S.cerevisiae中的表達和分泌)通常的工序首先，在兩次PCR中分離出oal基因的假設編碼序列(cDNA)。通過第三次PCR將兩種PCR產(chǎn)物裝配起來。使用下述引物OallAS(SEQIDNO46)、Oal2AS(SEQIDNO47)、Oal3S(SEQIDNO48)、Oal4S(SEQIDNO49)、Oal5S(SEQIDNO50)、Oal6AS(SEQIDNO51)、Oal7AS(SEQIDNO52)、Oal8AS(SEQIDNO53)、Oal9AS(SEQIDNO54)、Oa110S(SEQIDNO55)、Oal10SEco(SEQIDNO56)、OalENhis(SEQIDNO57)、Oal10SShis(SEQIDNO58)、Oal11S(SEQIDNO59)、Oal12AS(SEQIDNO60)、Oal12ASEco(SEQIDNO61)、Oal12AShis(SEQIDNO62)、Oal12ASHisEco(SEQIDNO63)、Oal13S(SEQIDNO64)、Oa113AS(SEQIDNO65)、Oal14S(SEQIDNO66)、Oal14AS(SEQIDNO67)、Oal15S(SEQIDNO68)、Oal15AS(SEQIDNO69)、Oa116S(SEQIDNO70)(第二個Met)、OalsecS(SEQIDNO71)、OalsecAS(SEQIDNO72)、pQE80EcoS(SEQIDNO73)、pQE80EcoNhisS(SEQIDNO74)、pQE80BamAS(SEQIDNO75)、pQE80BamhisAS(SEQIDNO76)、pQE80EcoSshort(SEQIDNO77)和CP-a(SEQIDNO78)。Oal11S直接始自起始密碼子的更為上游的位點前面，而Oal9AS始自假設的終止密碼子下游若干核苷酸處。為能在第三次PCR中不用內(nèi)含子將得到的兩種PCR產(chǎn)物裝配起來，Oal14S和Oal14AS是互補的，其含有從外顯子I的終點到外顯子II的起點之間的序列。1μlgDNA(1/10稀釋)步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-55℃1μlOal11S(10pMol/μl)步驟41分鐘-72℃1μlOal14AS(10pMol/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟2至4重復35次。1μlgDNA(1/10稀釋)步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-55℃1μlOal14S(10pMol/μl)步驟41分鐘-72℃1μlOal9AS(10pMol/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟2至4重復35次。對A.nigerATCC9142的gDNA進行的PCR給出了具有期望大小的PCR產(chǎn)物。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行純化。用來自Qiagen(Qiagen，Hilden，德國)的QIAEXII試劑盒從凝膠中提取出PCR產(chǎn)物，將其用于第三次PCRPCR產(chǎn)物1和2各0.5μl步驟15分鐘-95℃1μl核苷酸混合物步驟230秒-95℃5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液步驟330秒-55℃1μlOal12S(10pMol/μl)步驟41分鐘-72℃1μlOal10AS(10pMol/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟2至4重復30次。通過瓊脂糖凝膠電泳對終產(chǎn)物進行純化，從凝膠中提取出來，并按照Invitrogen(carlsbad，CA，USA)提供的方法將其克隆進TA-載體，用于對PCR產(chǎn)物進行直接克隆。所有其它必需的克隆步驟都按照Sambrooketal.(1989)所述來進行。通過測序檢測出來的含有正確插入(oal1)的質(zhì)粒在所有后續(xù)的構(gòu)建步驟中被用作模板。(a)用于在E.coli和Saccharomycescerevisiae中表達的構(gòu)建體oal和oalEco按照下述方案，用引物pQE80EcoS和pQE80BamAS對oal1進行PCR，以產(chǎn)生構(gòu)建體Eco-oal-Bam1μl含有作為插入的oal1的質(zhì)粒(10ng)1μl核苷酸混合物5μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液1μlpQE80EcoS(10pMol/μl)1μlpQE80BamAS(10pMol/μl)1μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟15分鐘-95℃步驟130秒-95℃步驟130秒-55℃步驟41分鐘-72℃步驟2至4重復30次。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行純化，從凝膠中提取人們感興趣的片段(QIAEXII，Qiagen)，用EcoRI和BamHI進行消化，用瓊脂糖凝膠電泳再次進行純化，將其連接到來自Qiagen的載體pQE80上，轉(zhuǎn)化進E.coliTop10。分離出四個克隆的質(zhì)粒，對插入進行測序。含有正確構(gòu)建體的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進E.coliM15或相當?shù)腅.coli菌株。所有分子技術(shù)都是技術(shù)人員已知的標準技術(shù)。對酵母表達構(gòu)建體而言，將所用的引物換為Oal10EcoS和Oal12ASEco，用EcoRI對PCR產(chǎn)物進行單獨消化，通過載體上的EcoRI限制性位點，將終產(chǎn)物克隆進pYES2或用于S.cerevisiae的相當?shù)谋磉_載體。按照Hinnenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929-1933(1978)或按照與菌株同時提供的說明書，來進行對S.cerevisiae菌株，例如INVScl(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的轉(zhuǎn)化。(b)用于在E.coli中表達的構(gòu)建體pQE80oalS(用第二個可能的Met的31個氨基酸的減短版本)用跟上述內(nèi)容一樣的PCR方案，用同樣的模板，引物用pQE80EcoSshort和pQE80BamAS。按照(a)中所述對PCR反應完成之后的反應液進行處理。(c)用于在S.cerevisiae中表達的構(gòu)建體oalS使用引物Oal16S和Oal12ASEco。其它都按照(a)中所述來進行。(d)用于在E.coli中表達的含有C-末端his-標簽的構(gòu)建體pQE80oalhis使用引物pQE80EcoS和pQE80BamhisAS來進行PCR，見(a)。(e)用于在S.cerevisiae中表達的構(gòu)建體oalhis使用引物Oal10Seco和Oal12ASHisEco來進行PCR，見(a)。(f)用于在E.coli中表達的含有N-末端His-標簽的構(gòu)建體pQE80oalNhis使用引物pQE80EcoNhisS和pQE80BamAS來進行PCR(見a)。(g)用于在S.cerevisiae中表達的構(gòu)建體oalENhis使用引物OalENhis和Oal12ASEco來進行PCR(見a)。(h)構(gòu)建體oalsec，其含有A.terreuscbs的植酸酶的信號肽，該信號肽用于在S.cerevisiae中的表達和分泌用三次獨立的PCR來制備該構(gòu)建體。首先，通過對保守植酸酶基因進行PCR分離出信號序列[Lehmannetal.，ProteinEng.1349-57(2000)]。1.0μl含有作為插入的保守植酸酶基因的質(zhì)粒(10ng)1.0μl核苷酸混合物5.0μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液1.0μlCP-a(10pMol/μl)1.0μlOalsecAS(10pMol/μl)1.0μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟15分鐘-95℃步驟130秒-95℃步驟130秒-55℃步驟430秒-72℃步驟2至4重復30次。1.0μl含有oal1基因的質(zhì)粒(10ng)1.0μl核苷酸混合物5.0μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液1.0μlOalsecS(10pMol/μl)1.0μlOal12ASEco(10pMol/μl)1.0μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟15分鐘-95℃步驟130秒-95℃步驟130秒-55℃步驟445秒-72℃步驟2至4重復30次。通過在1.5％的瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳來純化PCR產(chǎn)物，從凝膠中提取PCR產(chǎn)物(QIAEXII，Qiagen)，將其用于第三次PCR0.5μlPCR1的產(chǎn)物0.5μlPCR2的產(chǎn)物1.0μl核苷酸混合物5.0μl帶Mg2+的PCR標準緩沖液1.0μlCP-a(10pMol/μl)1.0μlOal12ASEco(10pMol/μl)1.0μl來自RocheMolecularBiochemicals的HighFidelity聚合酶混合液40μlH2O步驟15分鐘-95℃步驟130秒-95℃步驟130秒-55℃步驟41分鐘-72℃步驟2至4重復30次。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行純化，從凝膠中提取出PCR產(chǎn)物，用EcoRI進行消化，再次用瓊脂糖凝膠電泳進行純化，按照上述連接到S.cerevisiae表達載體中。實施例12oal的表達(a)在E.coli中在E.coliM15中表達pQE80oal、pQE80oalS、pQE80oalhis和pQE80oalNhis，所述E.coliM15含有pREP4，其含有l(wèi)ac啟動子的阻遏子(見德國，Hilden的Qiagen的表達說明書)。將過夜培養(yǎng)物稀釋至600nm的OD為0.1，在30℃培養(yǎng)至OD600nm為1.5。然后用0.5mMIPTG誘導培養(yǎng)物，再在30℃培養(yǎng)6小時。通過離心(5000g，20分鐘)收獲細胞，冷凍于-80℃。按照廠商提供的方案，用B-PER(Pierce，Rockford，IL，USA)對它們進行裂解。再一次離心步驟之后，將上清液用于對(R)-泛酸內(nèi)酯的水解。在含有構(gòu)建體pQE80oalS和pQE80oalhis的轉(zhuǎn)化子中，上清液和細胞裂解液中都沒有發(fā)現(xiàn)活性，而用構(gòu)建體pQE80oal和pQE80oalNhis的情況下，可溶蛋白質(zhì)中的大約5％是具有活性的(R)-泛酸內(nèi)酯酶。用與沒有His-標簽的基因同樣的方法，來表達含有N-末端His-標簽的構(gòu)建體。用來自Qiagen(Hilden，德國)的“QIAexpressionist”所述的方案，從細胞裂解液中對天然形式的加上His-標簽的蛋白質(zhì)進行純化。(b)在S.cerevisiae中構(gòu)建體oalEco、oalES、oalEhis、oalENhis和oalsec在S.cerevisiaeINVScl或類似相當?shù)木曛斜磉_。轉(zhuǎn)化并在SDura-培養(yǎng)基[Shermanetal.，Laboratorycoursemanualformethodsinyeastgenetics，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1986)]上涂布之后，在30℃對平板進行3至4天的培養(yǎng)，撿出培養(yǎng)出的菌落，將其轉(zhuǎn)移至2mlSDura-液體培養(yǎng)基中，在猛烈振蕩下于30℃培養(yǎng)3天。上述培養(yǎng)物被用作為25mlSDura-培養(yǎng)基的預培養(yǎng)物。在猛烈振蕩下于30℃再培養(yǎng)3天后，用制備的培養(yǎng)物[Shermanetal.，如上所述]接種21瓶中的500mlYPD培養(yǎng)基。再在相同條件下培養(yǎng)3天之后，通過離心從培養(yǎng)基中分離出細胞，用Y-PER(Pierce，Rockford，IL)進行裂解。如在E.coli中表達的情況一樣，僅有oalEco和oalENhis構(gòu)建體導致了活性(R)-泛酸內(nèi)酯酶的表達，其僅在細胞裂解液中被發(fā)現(xiàn)。用75mlYPD培養(yǎng)物，也可以產(chǎn)生300U的(R)-泛酸內(nèi)酯酶。相應的裂解液顯示大約5U/mg總蛋白的比活性。用上述內(nèi)含子位置的序列數(shù)據(jù)，還可用類似的方式對來自A.awamori的oal基因和來自A.nigerATCC46951的oal基因進行構(gòu)建和表達。實施例13對在E.coli或S.cerevisiae中異源表達的Oal進行固定，以及將其用于對(RS)-泛酸內(nèi)酯的水解拆分為在生物反應器中發(fā)揮多種用途，對來自A.niger的(R)-泛酸內(nèi)酯酶進行固定。在E.coli或S.cerevisiae中表達之后，通過化學手段，例如B-PER(E.coli)或Y-PER(S.cerevisiae)(Pierce，Rockford，IL，USA)，或通過機械手段例如超聲波或高壓對細胞進行破碎。通過離心來澄清裂解液。將制劑直接用于固定。或者，在固定之前，用另一項純化步驟，例如硫酸銨沉淀，來進一步地增加Oal比活性。按照下述方法來固定該生物催化劑(1)在二氧化硅溶膠凝膠(SilicaSol-Gel)上固定按照文獻[GillandBallesteros，J.Am.Chem.Soc.1208587-8598(1998)]所述來制備聚(硅酸甘油)-1.0(PGS-1.0)，將其溶于其質(zhì)量一半的冰冷的水中。取其中100或200mg的部分，與50或100mg冰冷的生物催化劑貯存液制劑(來自若干制劑的可溶的酶)徹底地混合，混合于2ml或5ml小瓶中的50mM磷酸鹽中進行，pH7.0，將小瓶輕柔旋轉(zhuǎn)2分鐘，以在瓶壁上形成水凝膠的薄層。將小瓶置于冰上20分鐘，然后(開啟)轉(zhuǎn)移至冰箱。水凝膠在5℃成熟48-72小時，以形成干凝膠(xerogel)。通過在5℃以100rpm振蕩，用2×1或2×4mlpH為7的50mM磷酸緩沖液來洗滌有干凝膠的小瓶，然后是2×1或2×4mlpH為7的50mMTEA-乙酸鹽，其中含有10mM乙酸鎂。(2)將Oal固定于二氧化硅聚乙烯醇溶膠凝膠(Sol-GelSilica-PolyvinylAlcohol)上方法與(1)中類似，不同之處是在與內(nèi)酯酶貯存液結(jié)合之前，DGS溶液要與恰當數(shù)量的聚乙烯醇(PVA，來自Aldrich，13％w/w的水中的85K)混合。后續(xù)方法如(1)所示。(3)將Oal固定到用戊二醛活化并支持的聚乙烯亞胺上將聚乙烯亞胺(1g，無水，高分子量，分支聚合物，來自Aldrich)、CA(0.2g，36％Ac)和乙酸丁酸纖維素(0.2g，48％的乙酸和丁酸含量，來自Aldrich)溶于5mL的二氯甲烷中，用溶液對7g漂白土(FullersEarth，30-60目，來自Aldrich)進行包衣。經(jīng)過濕包衣的材料在空氣中于室溫下干燥0.5小時，直到給出大約9g的被包衣的漂白土。然后將其重新懸浮于戊二醛(8mL，50％w/w，來自Aldrich)和磷酸緩沖液(50mL，50mM，pH8)的冰冷的混合物中，以200rpm攪拌2小時。用水洗(4×10mL)經(jīng)過活化的支持物，然后用磷酸緩沖液洗(4×10mL，20mM，pH8)，然后排出液體。將濕的支持物與冰冷的內(nèi)酯酶貯存液(50mM磷酸中，pH8)混合，以200rpm對懸浮液進行20-30小時的攪拌。將液體從被固定的酶上輕柔移走，用磷酸鹽洗(3×5mL)濕的固定物，用乙醇胺(20mL，20mM，pH8)進行處理，再用磷酸鹽洗(2×5mL，20mM，pH7)，然后排出液體。(4)用于對(RS)-泛酸內(nèi)酯進行水解拆分的反應條件反應在2或4mL的小瓶中進行，其中使用50或100mg的生物催化劑以及1或2mL的0.5M外消旋內(nèi)酯(在0.75M三乙胺-乙酸鹽中，pH8.5，含有20mM的乙酸鎂)。將小瓶在40℃、200rpm下培養(yǎng)必需的時間段，將溶液排出，并用手性HPLC進行分析，在開始下一次循環(huán)之前用新鮮的底物溶液洗(2×1或2mL)催化劑。用等體積的500mMMES緩沖液來終止用于分析的樣品的反應，所述緩沖液pH為5.5，其中含有50mMEDTA，離心(10000g，10分鐘)然后通過HPLC進行分析，其中使用0.46×15cm的CHIRADEX柱，用7030的水-甲醇進行洗脫，1mL/分鐘，在20℃進行。在15分鐘的時候?qū)Τ跏妓俣冗M行測量，在每個循環(huán)的末尾測定E值。表2中概括了選用的被固定的酶制劑在對(RS)-泛酸內(nèi)酯進行分批拆分過程中的作用。溶膠凝膠和共價固定方案都被證明為有效的，甚至在24個每批為1小時的循環(huán)后，催化劑保留了其初始活性的62-72％，并顯示出對映異構(gòu)體的過量(excess)值和對(R)-泛酸內(nèi)酯的對映體選擇性分別為89-98％和71-88％。此外，當延長批次進行的時間進行試驗時，催化劑運作方式也是非常相似的，即當每批反應進行一天而不是1小時的情況下，其展示出了良好的長時間操作穩(wěn)定性。表2通過被固定的內(nèi)酯酶制劑對(RS)-泛酸內(nèi)酯進行分批拆分催化劑*Biocatalyst/Prod.Organism(Recomb.Activity)實施例14被固定的由重組E.coli表達的Oal對(RS)-泛酸內(nèi)酯進行連續(xù)拆分的應用按照實施例14(2)中所述來制備的經(jīng)溶膠凝膠-PVA固定的重組內(nèi)酯酶生物催化劑(E.coli中表達的)，被用于在填充床(packed-bed)反應器中對外消旋內(nèi)酯進行連續(xù)拆分將被固定的生物催化劑(1.1g，0.21kUg-1，總共0.231kU)干填入帶有Teflon末端(endpiece)的0.46×15cm的Omnifit加套玻璃柱中。其與1×10cm的Omnifit加套玻璃柱相連，1×10cm的玻璃柱中填有1-2mm的纖維素珠，其是通過兩個裝有50mL玻璃/Teflon注射器的注射器泵填入的。這些柱都與循環(huán)水浴相連，拆分進行期間被保持在40℃。按照下述方法對反應器進行調(diào)節(jié)室溫下以5mLmin-1的速率加入Tris-乙酸鹽緩沖液(100mM，pH7，含有100mM乙酸鎂)，進行30分鐘；接著是在室溫下以1∶1的體積比，2mLmin-1的總流速，加入外消旋內(nèi)酯溶液(水中1.5M)和Tris-乙酸緩沖液(2.5M，pH8.25，含有50mM乙酸鎂)的組合，進行30分鐘。然后將流速降為1.2mLmin-1，將柱子加熱到40℃，系統(tǒng)被允許平衡15分鐘。因此對反應器進行了大約45分鐘的操作，在冰浴上收集洗脫液，在此條件下，以46-48％的不變的轉(zhuǎn)化率對總共52.7mL的進料物(相當于5.14gRSPL)進行了處理。用硫酸(10％v/v水溶液)將洗脫液的pH調(diào)為6.5，用二氯甲烷對溶液進行萃取(10×75mL)，有機層在無水硫酸鎂上干燥，旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)，產(chǎn)生由10％的RPL和90％的SPL(由手性HPLC分析得出)組成的(S)-泛酸內(nèi)酯富含物(2.67g，理論上98％)。用硫酸(40％w/w)對水相進行酸化，至pH1.5，加熱至70℃，1小時，再在冰上冷卻，用氯化鈉飽和，然后用二氯甲烷萃取(10×75mL)，有機層在無水硫酸鎂上干燥，旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)，產(chǎn)生(R)-泛酸內(nèi)酯富含物(2.23g，理論產(chǎn)量92％)，其對映異構(gòu)體純度為93％。對(R)-/(S)-的組合回收率為95％。實施例(13)和(14)的結(jié)果清楚地表明，重組內(nèi)酯酶對于水解拆分外消旋泛酸內(nèi)酯來說是有效的生物催化劑，該催化劑還可被有效固定，固定物可用于生產(chǎn)對映異構(gòu)過量達90-98％的高度富集的(R)-泛酸內(nèi)酯，不管是分批操作還是連續(xù)操作的情況下都如此。實施例15克降和表達來自B.subtilis的(S)-泛酸內(nèi)酯特異性內(nèi)酯酶用來自牛和馬肝臟的內(nèi)酯酶的氨基酸序列，我們發(fā)現(xiàn)了若干種其它顯示與上述序列具有有限同源性的序列。通過PCR將它們中間來自B.subtilis的yvre基因(YVREBACSU，被注釋為SMP30/CGR1家族的成員/假設的33.2kDa蛋白)從基因組DNA中克隆出來，其中使用的引物的5’和3’-末端還含有后續(xù)向表達載體中克隆的步驟所需要的限制性位點(EcoRI和PstI)。PCR條件與從A.niger的基因組DNA分離oal基因(見實施例8)所用的條件相同。用EcoRI和PstI來消化PCR產(chǎn)物和載體(來自Stratagene(LaJolla，CA，USA)的PET41a)，通過瓊脂糖凝膠電泳來純化，連接，并將其轉(zhuǎn)化進E.coliTop10細胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。使用該種策略，該基因被融合進來自E.coli的GST蛋白基因的閱讀框中。根據(jù)廠商提供的方案來進行表達和純化。用其中額外含有5mMCaCl2的標準試驗在40C來測定被純化的蛋白質(zhì)的活性。該酶顯示了對(S)-泛酸內(nèi)酯的非常高的選擇性。該制劑具有相對于每mg富集融合蛋白1-2U的比活性。該酶僅在Mg2+或Ca2+離子存在的情況下具有活性。序列表<110>帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>新穎的酶<130>21717<160>99<170>PatentInversion3.1<210>1<211>900<212>DNA<213>Equuscaballus<220><221>CDS<222>(1)..(900)<223><400>1atgtcttccattaagattgagtgtgttctgcccgagaactgccagtgc48MetSerSerIleLysIleGluCysValLeuProGluAsnCysGlnCys151015ggtgagtcgccagtgtgggaggaagcgtccagctctctgctcttcgta96GlyGluSerProValTrpGluGluAlaSerSerSerLeuLeuPheVal202530gatattcctgccaaaaaggtttgccggtgggatgcgctcagcaagcaa144AspIleProAlaLysLysValCysArgTrpAspAlaLeuSerLysGln354045gtgcagcgaatgaccgtggatgccccggttggctcagtggccctccgc192ValGlnArgMetThrValAspAlaProValGlySerValAlaLeuArg505560cagtcgggaggctatgtcgccacaattggaacgaagttctgtgctttg240GlnSerGlyGlyTyrValAlaThrIleGlyThrLysPheCysAlaLeu65707580aactgggaagatcagtcagtagttgtcctggccgcggtagagaaagac288AsnTrpGluAspGlnSerValValValLeuAlaAlaValGluLysAsp859095aagaaaaacaatcgattcaatgacgggaaggtggatcccgcggggaga336LysLysAsnAsnArgPheAsnAspGlyLysValAspProAlaGlyArg100105110tactttgctggcaccatggctgaggaaacagccccggcagttacggag384TyrPheAlaGlyThrMetAlaGluGluThrAlaProAlaValThrGlu115120125cggcaccaagggtccctgtacgccctctttcctgaccaccacgtggaa432ArgHisGlnGlySerLeuTyrAlaLeuPheProAspHisHisValGlu130135140aagtactttgaccaggtggacatctccaacggtttggattggtccctg480LysTyrPheAspGlnValAspIleSerAsnGlyLeuAspTrpSerLeu145150155160gaccacaaaatcttctattacatcgacagcctgtcctactctgtggat528AspHisLysIlePheTyrTyrIleAspSerLeuSerTyrSerValAsp165170175gcctttgactatgacctgctgacaggaaggatctctaaccgcagaagt576AlaPheAspTyrAspLeuLeuThrGlyArgIleSerAsnArgArgSer180185190gtttacaagctggagaaggaagaacatatcccagatggaatgtgtatt624ValTyrLysLeuGluLysGluGluHisIleProAspGlyMetCysIle195200205gatactgaggggaagctctgggtggcctgttacaacggaggaagagtg672AspThrGluGlyLysLeuTrpValAlaCysTyrAsnGlyGlyArgVal210215220attcgtttagatcctgagacagggaaaagactccaaactgtgaagttg720IleArgLeuAspProGluThrGlyLysArgLeuGlnThrValLysLeu225230235240cctgttgataaaaccacttcgtgctgcttcggagggaaggattactct768ProValAspLysThrThrSerCysCysPheGlyGlyLysAspTyrSer245250255gaaatgtacgtgacctgcgcccgggctggactcgaccccgaggctctc816GluMetTyrValThrCysAlaArgAlaGlyLeuAspProGluAlaLeu260265270tcgcggcagcctgaagctggtggcattttcaagataactggcctgggg864SerArgGlnProGluAlaGlyGlyIlePheLysIleThrGlyLeuGly275280285gtcaaaggaattcctccctatgcctacgcaggatga900ValLysGlyIleProProTyrAlaTyrAlaGly290295<210>2<211>299<212>PRT<213>Equuscaballus<400>2MetSerSerIleLysIleGluCysValLeuProGluAsnCysGlnCys151015GlyGluSerProValTrpGluGluAlaSerSerSerLeuLeuPheVal202530AspIleProAlaLysLysValCysArgTrpAspAlaLeuSerLysGln354045ValGlnArgMetThrValAspAlaProValGlySerValAlaLeuArg505560GlnSerGlyGlyTyrValAlaThrIleGlyThrLysPheCysAlaLeu65707580AsnTrpGluAspGlnSerValValValLeuAlaAlaValGluLysAsp859095LysLysAsnAsnArgPheAsnAspGlyLysValAspProAlaGlyArg100105110TyrPheAlaGlyThrMetAlaGluGluThrAlaProAlaValThrGlu115120125ArgHisGlnGlySerLeuTyrAlaLeuPheProAspHisHisValGlu130135140LysTyrPheAspGlnValAspIleSerAsnGlyLeuAspTrpSerLeu145150155160AspHisLysIlePheTyrTyrIleAspSerLeuSerTyrSerValAsp165170175Al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rPheGluProGlyAspIle195200205LeuPheLeuArgValGlyLeuProThrThrTrpAspAsnMetThrAsp210215220GluGluArgValLysTyrSerGlnGlnGluThrProAsnHisAlaGly225230235240LeuGluGlnSerGluArgValValArgPheLeuTrpAspGlnHisPhe245250255AlaAlaValAlaGlyAspAlaValSerPheGluValTyrProProVal260265270GluLysGluTrpAspLeuHisHisPheLeuLeuAlaGlyTrpGlyLeu275280285ProIleGlyGluMetPheAspLeuGluGlyLeuLysGluValCysGlu290295300ArgLeuGlyArgTrpThrPhePheValSerSerSerProLeuAsnCys305310315320GlyArgGlyValSerSerProProAsnCysMetAlaIlePhe325330<210>98<211>975<212>DNA<213>Aspergillusniger<220><221>CDS<222>(1)..(975)<223><400>98atggccgactccctcccgaaaacctacgacgacctccccgacaagcgg48MetAlaAspSerLeuProLysThrTyrAspAspLeuProAspLysArg151015cgctactggcccgcaacccccaactccgccgacgagggactggggatg96ArgTyrTrpProAlaThrProAsnSerAlaAspGluGlyLeuGlyMet202530ctccgtctcctcactccagaaattgtcgccaacgcagcacgcacccag144LeuArgLeuLeuThrProGluIleValAlaAsnAlaAlaArgThrGln354045atccagaccggcgagcgcgtatgcctgaactgggacctggagaagctg192IleGlnThrGlyGluArgValCysLeuAsnTrpAspLeuGluLysLeu505560aacccaccaggcttcggccgcaaacccttcgcccaccacgtaaaatgg240AsnProProGlyPheGlyArgLysProPheAlaHisHisValLysTrp65707580gtctccgaaggccacgccttcgacgacgaataccacttcaacccgcaa288ValSerGluGlyHisAlaPheAspAspGluTyrHisPheAsnProGln859095caatcctcccaatgggacggtctgcgacaccacaacgccccggctcca336GlnSerSerGlnTrpAspGlyLeuArgHisHisAsnAlaProAlaPro100105110acccccgacgaccctaaccgccgggtcttctacggcggcaccacctcc384ThrProAspAspProAsnArgArgValPheTyrGlyGlyThrThrSer115120125accgagatcctcgacccctcgtccacccgaatcggcatagcccactgg432ThrGluIleLeuAspProSerSerThrArgIleGlyIleAlaHisTrp130135140gccaagaaaggcatcgccggccgcggcgtcctcatcgactacgcctcc480AlaLysLysGlyIleAlaGlyArgGlyValLeuIleAspTyrAlaSer145150155160tacgtgcaacgaaccaagggcgtcacagtaaacgccctaacccgccac528TyrValGlnArgThrLysGlyValThrValAsnAlaLeuThrArgHis165170175accgtctccctggacgacgtcctcaccatcgcgaaggaatgcaacatc576ThrValSerLeuAspAspValLeuThrIleAlaLysGluCysAsnIle180185190accttcgaaccaggcgacattctcttcctgcgcgtcggtctaccgact624ThrPheGluProGlyAspIleLeuPheLeuArgValGlyLeuProThr195200205acatgggataacatgaccgatgaggagagggtcaagtatagtcagcag672ThrTrpAspAsnMetThrAspGluGluArgValLysTyrSerGlnGln210215220gaaacgcccaaccatgcaggattagagcagagtgagcgtgtggtgcgg720GluThrProAsnHisAlaGlyLeuGluGlnSerGluArgValValArg225230235240ttcctttgggatcagcatttcgccgctgtagcgggtgatgcggtcagc768PheLeuTrpAspGlnHisPheAlaAlaValAlaGlyAspAlaValSer245250255tttgaggtgtatccgccggtagagaaggagtgggatttacatcatttt816PheGluValTyrProProValGluLysGluTrpAspLeuHisHisPhe260265270ttgctggctgggtggggactaccgattggggagatgtttgatcttgag864LeuLeuAlaGlyTrpGlyLeuProIleGlyGluMetPheAspLeuGlu275280285gggttgaaggaggtgtgtgagaggttgggaaggtggacgtttttcgtt912GlyLeuLysGluValCysGluArgLeuGlyArgTrpThrPhePheVal290295300agttctagtccgttgaactgtgggagaggtgtgtcgagtccgccgaat960SerSerSerProLeuAsnCysGlyArgGlyValSerSerProProAsn305310315320tgtatggcaattttt975CysMetAlaIlePhe325<210>99<211>325<212>PRT<213>Aspergillusniger<400>99MetAlaAspSerLeuProLysThrTyrAspAspLeuProAspLysArg151015ArgTyrTrpProAlaThrProAsnSerAlaAspGluGlyLeuGlyMet202530LeuArgLeuLeuThrProGluIleValAlaAsnAlaAlaArgThrGln354045IleGlnThrGlyGluArgValCysLeuAsnTrpAspLeuGluLysLeu505560AsnProProGlyPheGlyArgLysProPheAlaHisHisValLysTrp65707580ValSerGluGlyHisAlaPheAspAspGluTyrHisPheAsnProGln859095GlnSerSerGlnTrpAspGlyLeuArgHisHisAsnAlaProAlaPro100105110ThrProAspAspProAsnArgArgValPheTyrGlyGlyThrThrSer115120125ThrGluIleLeuAspProSerSerThrArgIleGlyIleAlaHisTrp130135140AlaLysLysGlyIleAlaGlyArgGlyValLeuIleAspTyrAlaSer145150155160TyrValGlnArgThrLysGlyValThrValAsnAlaLeuThrArgHis165170175ThrValSerLeuAspAspValLeuThrIleAlaLysGluCysAsnIle180185190ThrPheGluProGlyAspIleLeuPheLeuArgValGlyLeuProThr195200205ThrTrpAspAsnMetThrAspGluGluArgValLysTyrSerGlnGln210215220GluThrProAsnHisAlaGlyLeuGluGlnSerGluArgValValArg225230235240PheLeuTrpAspGlnHisPheAlaAlaValAlaGlyAspAlaValSer245250255PheGluValTyrProProValGluLysGluTrpAspLeuHisHisPhe260265270LeuLeuAlaGlyTrpGlyLeuProIleGlyGluMetPheAspLeuGlu275280285GlyLeuLysGluValCysGluArgLeuGlyArgTrpThrPhePheVal290295300SerSerSerProLeuAsnCysGlyArgGlyValSerSerProProAsn305310315320CysMetAlaIlePhe32權(quán)利要求1.一種編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的核苷酸序列，所述泛酸內(nèi)酯水解酶來自馬肝臟、A.nigerATCC9142、A.nigerawamoriATCC38854或A.nigerMacRaeATCC46951。2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其中包含當來自馬肝臟時，如SEQIDNO1所示的核苷酸序列；當來自A.nigerMacRaeATCC46951時，如SEQIDNO5所示的核苷酸序列；當來自A.nigerATCC9142時，如SEQIDNO7所示的序列；以及當來自A.nigerawamoriATCC38854時，如SEQIDNO9所示的序列。3.一種表達載體，其中包含編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的核苷酸序列，所述泛酸內(nèi)酯水解酶來自馬肝臟、Bacillussubtilis、A.nigerATCC9142、A.nigerawamoriATCC38854或A.nigerMacRaeATCC46951。4.用如權(quán)利要求3所述的表達載體轉(zhuǎn)化過的宿主細胞。5.一種泛酸內(nèi)酯水解酶，來自馬肝臟、A.nigerATCC9142、A.nigerawamoriATCC38854或A.nigerMacRaeATCC46951。6.一種泛酸內(nèi)酯水解酶，其氨基酸序列包含當來自馬肝臟時，如SEQIDNO2所示的氨基酸序列；當來自A.nigerMacRaeATCC46951時，如SEQIDNO6所示的氨基酸序列；當來自A.nigerATCC9142時，如SEQIDNO8所示的氨基酸序列；以及當來自A.nigerawamoriATCC38854時，如SEQIDNO10所示的氨基酸序列。7.如權(quán)利要求5或6所述的泛酸內(nèi)酯水解酶，其中所述泛酸內(nèi)酯水解酶是被固定的。8.如權(quán)利要求6所述的泛酸內(nèi)酯水解酶或如SEQIDNO4所示的從Bacillussubtilis獲得的泛酸內(nèi)酯水解酶在對R-或S-泛酸內(nèi)酯進行選擇性水解中的用途。9.一種生產(chǎn)R-泛酸或其鹽或R-泛酰醇的方法，所述方法包括如下步驟在如權(quán)利要求6所述的泛酸內(nèi)酯水解酶或如SEQIDNO4所示的從Bacillussubtilis獲得的泛酸內(nèi)酯水解酶存在的情況下，對R-或S-泛酸內(nèi)酯進行選擇性水解。10.一種克隆與已知序列直接相鄰的核苷酸序列的方法，所述方法包括PCR擴增，所述擴增包括a)用第一次PCR的單鏈DNA作為模板進行第二次PCR，在所述第二次PCR中用能與第一次PCR產(chǎn)生的單鏈DNA隨機雜交的引物；以及b)由此，仍用步驟a)中的隨機雜交引物，產(chǎn)生自身作為第二條鏈的模板的反義鏈。全文摘要本發(fā)明涉及編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的核苷酸序列，以及含有上述核苷酸序列的載體和宿主細胞，和由上述核苷酸序列編碼的泛酸內(nèi)酯水解酶。本發(fā)明還提供了制造和使用泛酸內(nèi)酯水解酶的方法。文檔編號C12Q1/68GK1768141SQ200480008504公開日2006年5月3日申請日期2004年3月19日優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日發(fā)明者愛琦巴爾·吉爾,郭達海,馬丁·萊瑪恩,德莫特·P·莫納戈,嬈·翰奴曼薩·瓦里威提申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司