專利名稱：一種用于神經(jīng)元細(xì)胞基因表達(dá)的啟動子構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于細(xì)胞特異性基因表達(dá)的啟動子構(gòu)建體，更具體而言為可用于神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)的啟動子構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如中風(fēng)、癲癇、頭和脊髓外傷、帕金森氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化，以及許多神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病，不僅會對個體產(chǎn)生毀滅性的影響，而且還會因長期護(hù)理和勞動力帶來很高的社會成本。這些疾病的共同特征就是神經(jīng)元丟失。上述病癥中的許多與一種或多種基因的機能紊亂或作用喪失有關(guān)，對常規(guī)治療手段不能很好應(yīng)答。因此，向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中轉(zhuǎn)移入基因被認(rèn)為是一種治療這些病癥的有效方法，這其中包括一種治療基因的遞送和表達(dá)。該方法可以調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)性因子、抗-凋亡蛋白、抗氧化分子以及其他治療因子的表達(dá)水平，從而修復(fù)，阻止或預(yù)防神經(jīng)元的退化?；蛑委熯€為CNS惡性腫瘤的治療提供了很大的希望。
CNS是體內(nèi)最復(fù)雜的器官，其獨一無二的特點為CNS中基因治療的成功設(shè)置了許多障礙。這些特點包括由于顱骨和血腦屏障的物理障礙使得很難到達(dá)CNS；神經(jīng)元分化完全的特點以及用治療基因有效轉(zhuǎn)染CNS的困難。而且，發(fā)現(xiàn)于CNS中的細(xì)胞類型非常多種多樣，其中許多都對生理功能發(fā)揮著關(guān)鍵作用并且對任一種變化都高度敏感。這就要求只能局限于具體CNS細(xì)胞類型的CNS基因治療要不斷發(fā)展，從而確保只在目的細(xì)胞中發(fā)揮療效，同時限制因非一目的CNS細(xì)胞中基因表達(dá)引發(fā)的副作用。
所選細(xì)胞類型中的特異性基因表達(dá)可以通過使用配體-相連遞送載體在靶基因遞送水平實現(xiàn)，這種遞送載體通過所述配體與靶細(xì)胞上的獨一無二的細(xì)胞表面受體結(jié)合。特異性基因表達(dá)還可以通過使用細(xì)胞-特異性啟動子及增強子在靶轉(zhuǎn)錄本的水平上實現(xiàn)。細(xì)胞-特異性啟動子是將特定細(xì)胞功能限制在特定分化細(xì)胞類型的主要方法之一。這些啟動子指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的能力可以通過特定類型細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)濃度及活性來調(diào)節(jié)。
將轉(zhuǎn)基因?qū)肽承┘?xì)胞有時會因轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的過量破壞或干擾細(xì)胞功能。由于其特異性，所以細(xì)胞-特異性啟動子能夠使轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄維持在細(xì)胞代謝可接受的水平，從而避免耗損蛋白質(zhì)合成材料以及對轉(zhuǎn)染細(xì)胞有毒的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的過度累積。因為細(xì)胞-特異性啟動子源自于基因組序列，所以還可能減少活化宿主細(xì)胞防衛(wèi)機制的機率，對細(xì)胞因子-誘導(dǎo)啟動子失活的敏感性往往低于病毒啟動子。通過使用細(xì)胞-特異性啟動子，基因表達(dá)的穩(wěn)定性可望得到提高。但是，由于細(xì)胞特異性的細(xì)胞啟動子的轉(zhuǎn)錄活性往往很弱，因而大大限制了其在基因治療中的使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個方面提供了一種重組核酸分子，其中含有一種可操作地連接于一種異源增強子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子，其中所述增強子提高了所述啟動子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性。一些實施方案中，所述啟動子是血小板衍生生長因子β-鏈啟動子，所述增強子是巨細(xì)胞病毒立即早期基因增強子元件。各種實施方案中，所述重組核酸分子還可以進(jìn)一步包含一可操作連接的治療基因編碼序列。
本發(fā)明的另一個方面，提供了一種提高神經(jīng)元特異性啟動子轉(zhuǎn)錄活性的方法，其中包括在神經(jīng)元特異性啟動子上可操作地連接一種異源增強子。
本發(fā)明的另一個方面，提供了一種試劑盒，其中含有一種神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞-系，上述權(quán)利要求中任一項所述的表達(dá)載體，以及用于指導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞-系和表達(dá)重組基因產(chǎn)物的說明書。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供了其中含有本發(fā)明所述重組核酸的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和非人動物。另外還提供了一種在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，該方法包括用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化神經(jīng)元細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種治療受試者神經(jīng)元性疾病的方法，其中包括向所述受試者施用一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有一種可操作地連接于治療基因編碼序列的上述重組核酸分子。
本發(fā)明的另一個方面，提供了一種增強神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子轉(zhuǎn)錄活性的方法，其中包括在神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子上可操作地連接一種異源增強子。


圖1.圖示的是在PGL3載體中測試了的下列啟動子的簡圖全長的巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV)；CMV立即早期基因增強子(CMVIE)；和血小板-衍生生長因子β-鏈啟動子(PDGF-β)；以及CMVIE-PDGF-β。另外還標(biāo)出了熒光素酶基因(luc)和poly A尾(polyA)的位置。
圖2.圖示了瞬時轉(zhuǎn)染后，神經(jīng)元細(xì)胞PCI2和MTc17.2中下列每一種啟動子構(gòu)建體驅(qū)動的熒光素酶表達(dá)的熒光素酶活性水平CMV，CMVIE，PDGF-β和CMVIE-PDGF-β。熒光素酶活性用RLU/mg蛋白質(zhì)表示。
圖3.pCMVIE-PDGF-β-luc注射2天后，大鼠海馬免疫組織化學(xué)染色的顯微照片。海馬切片用抗熒光素酶蛋白質(zhì)抗體(紅)和NeuN標(biāo)記物(綠色)染色。
圖4.高倍放大顯微照片顯示了注射pCMVIE-PDGF-β-luc(a、b、c)和pCMVluc(d、e、f)2天后，大鼠紋狀體中熒光素酶(紅)和NeuN(綠色)雙重標(biāo)記的結(jié)果。
圖5.圖示了立體定位注射入大鼠紋狀體后，每一種質(zhì)粒平均熒光素酶表達(dá)的時程測定。數(shù)值表示為平均值+SEM。
圖6.A圖示了腺聯(lián)病毒(AAV)和桿狀病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染后，大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中下列每一種啟動子構(gòu)建體驅(qū)動的熒光素酶表達(dá)的熒光素酶活性水平CMV，CMVIE，PDGF-β和CMVIE-PDGF。熒光素酶活性用RLU/mg蛋白質(zhì)表示。B圖示了將含啟動子構(gòu)建體的AAV載體立體定位注射入大鼠紋狀體后，每一種啟動子驅(qū)動的平均熒光素酶表達(dá)的時程測定。數(shù)值表示為平均值+SEM。
具體實施例方式
在各個方面，本發(fā)明涉及基因表達(dá)和基因表達(dá)的調(diào)控。使用的術(shù)語″基因″與通常定義的含義相同，是指一段可操作連接的核酸序列。
本發(fā)明提供了一種重組核酸分子，其中含有一個嵌合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞中的序列可操作地連接于調(diào)控區(qū)域時(″可操作連接序列″)，該區(qū)域能夠活化該序列的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明所述的重組核酸分子其中含有一種可操作地連接于一種異源增強子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子，其中所述增強子能夠提高所述啟動子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性。術(shù)語″神經(jīng)元細(xì)胞″和″神經(jīng)元″，本申請中可交互使用，采用其通常含義是指任一種神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)細(xì)胞，通常包括細(xì)胞體，幾種樹狀突和軸突。術(shù)語″重組’是指重新組合在一起的物質(zhì)，因此，一種重組核酸分子是指由連接在一起的核酸序列組成的分子或者是利用分子生物學(xué)技術(shù)制備的分子。
所述異源的增強子可以是滿足下列要求的任一核苷酸序列天然狀態(tài)下不與神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子連接在一起，但是可操作地連接后能提高神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性。提高轉(zhuǎn)錄活性是指與單獨使用神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子時的轉(zhuǎn)錄水平相比，可操作連接的序列的轉(zhuǎn)錄水平的任一種可檢測的升高，這種升高可以用常規(guī)轉(zhuǎn)錄試驗檢測，包括使用實施例所述的報道基因構(gòu)建體。
因此，所述增強子含有至少一段能增強可操作連接啟動子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列。通常，增強子和啟動子一旦與合適的分子例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就能夠升高和/或活化轉(zhuǎn)錄，因此本發(fā)明包括提供了這樣的分子的實施方案，無論是體外或體內(nèi)。舉例，但不限制本發(fā)明，真核轉(zhuǎn)錄因子包括，但不限于NFAT，AP1，AP-2，Spl，OCT-I，OCT-2，OAP，NF-KB，CREB，CTF，TFIIA，TFIIB，Pit-I，C/EBP，SRF(Mitchell P J and Tijan R(1989)Science 245371；Eukaryotic transcriptionfactor-DNA complexes.Patikoglou G，Burley SK.Annu Rev Biophys Biomol Struct1997；26289-325.)。一些實施方案中，那些能有效增強轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列保留有作為增強子的序列所需的轉(zhuǎn)錄因子的最小結(jié)合位點。由于為了將可操作連接序列的轉(zhuǎn)錄水平提高到所需要的程度，一些實施方案中，所述重組核酸可以包含多個拷貝的相同序列，或者兩個或多個不同的核苷酸序列，其中的每一個都能有效增加轉(zhuǎn)錄。對于可以使用的不同增強子而言，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點可以是已知的，或者也可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用已知方法鑒定出的，例如通過DNA足跡法，凝膠遷移率改變試驗等。所述因子還可以根據(jù)已知的共有序列基序預(yù)先確定。
所述增強子可以是一種巳知的強的病毒增強子或啟動子元件例如Rous肉瘤病毒(RSV)啟動子(Gorman CM，Merlino GT，Willingham MC，Pastan I，Howard BH.TheRous sarcoma virus long terminal repeat is a strong promoter when introducedinto a variety of eukaryotic cells by DNA-mediated transfection.Proc NatlAcad Sci USA 1982；796777-6781)，SV40啟動子(Ghosh PK，Lebowitz P，F(xiàn)risqueRJ，Gluzman Y.Identification of a promoter component involved in positioningthe 5’termini of simian virus 40 early mRNAs.Proc Natl Acad Sci USA 1981；78100-104)，包含CMV立即早期(IE)基因增強子(CMVIE增強子)的CMV增強子或啟動子(Boshart M，Weber F，Jahn G，Dorsch-Hasler K，F(xiàn)leckenstein B，SchaffnerW.A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene ofhuman cytomegalovirus.Cell 1985；41521-530；Niwa H，Yamamura H，MiyazakiJ.Efficient selection for high-expression transfectants with a noveleukaryotic vector.Gene 1991；108193-200；還可參見美國專利5,849,522和5,168,062)。在一個具體實施方案中，所述增強子是人CMVIE增強子，一個實施方案中含有代表來自人CMV立即早期基因TATA框中的第573-187位核苷酸所示的下列序列1 CCTGGGTCGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATACGGG51 GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG101 TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA151 ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA ATAGGGACTT TCCATTGACG201 TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA GTACATCAAG251 TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG301 CCCCCTGGCA TTATGCCCAG TACATGACCT TATGGGACTT TCTACTTGGC351 AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGT(SEQ ID NO.9)所述增強子還可以是該核苷酸序列的等位變體和衍生物(例如序列的缺失，插入，倒置，取代或添加)，這類變體或衍生物提供的其他已知增強子序列能夠增加可操作連接序列的神經(jīng)元細(xì)胞-特異性轉(zhuǎn)錄。
不同實施方案中，這類變體和衍生物是基本上同源的，所以能夠與SEQ ID N09或其他增強子序列在中度或嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與濾膜-結(jié)合序列的雜交可以例如65℃下在0.5M NaHPO4，7％(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中完成，然后用0.2×SSC/0.1％(w/v)SDS在42℃下洗滌(參見，Ausubel，et cas.(eds)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，New York，at p.2.10.3)。替代地，嚴(yán)謹(jǐn)條件下與濾膜-結(jié)合序列的雜交可以例如65℃下在0.5M NaHPO4，7％(w/v)SDS，1mM EDTA中完成，然后用O.1×SSC/0.1％(w/v)SDS在68℃下洗滌(參見，Ausubel，et al.(編著)，1989，同上)。雜交條件可以根據(jù)目的序列的情況用巳知方法進(jìn)行調(diào)整(參見，Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays″，Elsevier，New York)。通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件是在一定的離子強度和pH條件下將溫度選定為比特定序列的熱解鏈溫度低約5℃。嚴(yán)謹(jǐn)雜交還可以是例如5×SSC和50％甲酰胺中42℃下雜交，然后用由0.1×SSC組成的緩沖液℃下雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交的洗滌時間為例如至少15分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘，75分鐘，90分鐘，105分鐘或120分鐘。
還可以將序列之間的同源程度表示為將序列最佳對齊時的同一性百分比，意指所述序列之間正確配對的概率。用于同一性比較的序列最佳對齊可以使用多種算法執(zhí)行，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，見1981，Adv.Appl.Math 2482，thehomology alignment algorithm ofNeedleman and Wunsch，1970，J.MoL Biol.48443，the search for similarity method of Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，以及這些算法的電腦執(zhí)行形式(例如，GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.)。序列對齊還可以用BLAST算法執(zhí)行，描述見Altschuletal.，1990，J.AM.M.215403-10(使用公開的設(shè)置默認(rèn)值)。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件可以獲自the National Center for Biotechnology Information(通過國際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。不同實施方案中，使用這類算法測定時，所述變體和衍生物具有大于50％，80％-100％，至少80％，至少90％或至少95％的序列同源性。
所述神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子可以是能夠活化神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄的任一核苷酸序列，意味著該序列能夠活化神經(jīng)元細(xì)胞中可操作連接序列的轉(zhuǎn)錄。如果可操作連接序列在任一這類細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄足夠低以致不影響所述細(xì)胞的生理功能，那么就可以認(rèn)為該啟動子基本上不活化轉(zhuǎn)錄。神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子可以包括神經(jīng)元基因，例如神經(jīng)突觸素I，神經(jīng)元-特異性烯醇酶，神經(jīng)絲-L和神經(jīng)肽Y使用的啟動子和特異性針對特定類型神經(jīng)元細(xì)胞的啟動子。例如，酪氨酸羥化酶基因啟動子(4.8kb 5’UTR)特異性用于含兒茶酚胺的和CNS神經(jīng)元，多巴胺-p-羥化酶基因啟動子特異性用于腎上腺素和noradrenegic神經(jīng)元，L7 Purkinje細(xì)胞蛋白質(zhì)啟動子特異性用于視網(wǎng)膜圓柱細(xì)胞兩極神經(jīng)元。對于這些及其他神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子，包括D1A多巴胺受體基因啟動子，人次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶啟動子，SCG10啟動子，Tα1α-微管蛋白啟動子，醛縮酶C啟動子，β-微管蛋白基因啟動子，GnRH基因增強子和啟動子，谷氨酸脫羧酶65基因啟動子，β-半乳糖苷α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子，神經(jīng)元性尼古丁乙酰膽堿受體β3基因啟動子，GABA(A)受體Δ亞單位基因啟動子，神經(jīng)元-特異性FE65基因啟動子，N-型鈣通道α1B亞單位基因啟動子和微管-相關(guān)蛋白1B基因啟動子，參見下列文獻(xiàn)Harrington CA，Lewis EJ，Krzemien D，ChikaraishiDM.Identification and cell type specificity of the tyrosine hydroxylase genepromoter.Nucleic Acids Res 1987，152363-2384；CokerGT3rd，Vinnedge L，O’Malley KL；Characterization of rat and 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所述啟動子含有至少一段核苷酸序列，該序列能活化可操作連接序列的神經(jīng)元細(xì)胞特異性表達(dá)，一些實施方案中，所述核苷酸序列保留有作為增強子的序列所需的轉(zhuǎn)錄因子的最小結(jié)合位點。一些實施方案中，所述重組核酸包含多個拷貝的相同序列，或者兩個或多個不同的核苷酸序列，其中的每一個都能有效激活轉(zhuǎn)錄活性。對于可以使用的各種啟動子而言，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點可以是巳知的或者本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過上述本領(lǐng)域巳知方法鑒定出來。
現(xiàn)已查明血小板衍生生長因子-鏈(PDGF-β)啟動子(Sasahara M，F(xiàn)ries JW，Raines EW，Gown AM，Westrum LE，F(xiàn)rosch MP，Bonthron DT，Ross R，Collins T.PDGF-β-chain in neurons of the central nervous system，posterior pituitary，andin a transgenic model.Cell 1991；64217-227)對于包括多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞來說是特異性的，一個實施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子是PDGF-β啟動子。在一個具體的實施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子是人PDGF-β啟動子，一個實施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子含有下列這段對應(yīng)于人PDGF-β基因轉(zhuǎn)錄起始位點第-1492～-5位核苷酸的序列1 CTAGAGGATC CACAGTCTCC TGAGTAGCTG GGACTACAGG AGCTTGTTAC51 CACACCCAGC TCCAGTTTAT AAATTCATCT CCAGTTTATA AAGGAGGAAA101 CCGAGGTACT GAGAGGTTAA AAAACCTTCC TGCAGACACT TGTCCAGCAA151 GTGGCCACTC CAGGATTTGG ACCAAGGTGA TGTGTCTTCA GGCTGTGTCT201 CTGCCACTGT GCCACGCTGC TGGGTGGTAG GCAGCAGTGG GTGGGTGCCT251 GCAGTGGTCT GTAAAGACCA CCTGAGATGT CCTTCCTCCT CTGTTCCACC
301 CTGTCCAGGT CCAAGAAGAC AGTCTATGAA GAGAGAGCAG GTGTGACTCT351 CTCAGTGTGC TCCTCTGTGA GAACCAGGCT GACATCCCAA AGGGAAGGGC401 GGATAACAGA GACAGTGCAA GCGGAGGAGA TGAGGGTGCC TCAAAGCCGG451 GAGGCTGGGT GATGCAGGAG CCTGCGTGTC CCGAGGGGGG TGCTGGGCCC501 AGTGTGAGTA CGTGTGACTG TGACTGAGAC AGTGTGACTG CTGAAGGCAG551 GGACACAGCA GCTCCCTGAC TGGGGGCAGA AGGCGTTAAC TGTGTGAAGG601 CTGGTTGTGG GTGGGTGGGC TCTGGGCCTC GAACCCGGGG GCTGAGGGAG651 ATAGTAAACA GCAGGGTGAC TGACGGGAAG ATCATGTTGG TAGCCCTGCG701 AAGATGCTGC AGGGCTGTGG GGGTTTGTGT GACTTTGCAG TTCAACAAAT751 TCAAATTCAG CCAACGCTGG CAGGGCCTGT TGTGCCAGGC AACCAGCTAG801 GAGGAGGAGA CTCGGACCCA GCTTGCAGCT GAAGGGCGCT GGCTGCCGGG851 TTCTGTGGGT TCACCTTGCG GTGTCTTCCC TTGCTAACAC TGAGTCCTTA901 CAATAGCCCC ATCTCCAGGT TGAGGCTAGA TGGAGGGGAC AGAGGGAAGT951 GACTTGCCCA AGGTGACCCA AGCTCCCGAG TGCCAGGGCA GGATCTGAAT1001 TCAGGCTCTC AGACTGCAGA GCCTGAGTCC CTCCCTGCCA TGCCTGTGCC1051 AGGGTGGAAA TGTCTGGTCC TGGAGGGGAG CGTGGACTCC TGGCCTTGGC1101 TCTGGAGACA TCCCCCTAGA CCACGTGGGC TCCTAACCTG TCCATGGTCA1151 CTGTGCTGAG GGGCGGGACG GTGGGTCACC CCTAGTTCTT TTTTCCCCAG1201 GGCCAGATTC ATGGACTGAA GGGTTGCTCG GCTCTCAGAG ACCCCCTAAG1251 CGCCCCGCCC TGGCCCCAAG CCCTCCCCCA GCTCCCGCGT CCCCCCCCTC1301 CTGGCGCTGA CTCCGGGCCA GAAGAGGAAA GGCTGTCTCC ACCCACCTCT1351 CGCACTCTCC CTTCTCCTTT ATAAAGGCCG GAACAGCTGA AAGGGTGGCA1401 ACTTCTCCTC CTGCAGCCGG GAGCGGCCTG CCTGCCTCCC TGCGCACCCG1451 CAGCCTCCCC CGCTGCCTCC CTAGAGTCGA GGAACTAA (SEQ ID NO.10)所述啟動子還可以包含該核苷酸序列的等位變體和衍生物(例如序列的缺失，插入，倒置，取代或添加)，這類變體或衍生物提供的其他神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子序列能夠活化可操作連接序列的神經(jīng)元細(xì)胞-特異性轉(zhuǎn)錄。各種實施方案中，使用該術(shù)語時這類可變區(qū)和衍生物是基本上同源的，或者用上述算法測定時同源性大于50％，80％-100％，至少80％，至少90％或至少95％。
當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄泻偷诙怂嵝蛄刑幱谝环N功能相關(guān)狀態(tài)時，這兩核酸序列就是可操作地連接在一起的。例如，如果一種啟動子能活化一種編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該編碼序列就是可可操作地連接于該啟動子。類似地，當(dāng)一種異源增強子能夠增加可操作連接序列的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄時，那么該增強子與神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子之間就是可操作連接。與啟動子隔開時增強子能夠發(fā)揮作用，同樣地，增強子可以可操作地連接于神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子但是可以不必是鄰接的。但是，通常，可操作連接序列是鄰接的。
本發(fā)明的一個實施方案中，CMVIE增強子可操作地連接于PDGF-β啟動子的上游。另一個實施方案中，CMVIE增強子可操作地連接于PDGF-β啟動子的上游，而且二者是鄰接的。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述重組核酸分子包含由SEQ ID NO.10和位于其上游的SEQ ID NO.9以及二者之間的接頭序列組成的下列序列
5′CCTGGGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGAGCTCCTAGAGGATCCACAGTCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGAGCTTGTTACCACACCCAGCTCCAGTTTATAAATTCATCTCCAGTTTATAAAGGAGGAAACCGAGGTACTGAGAGGTTAAAAAACCTTCCTGCAGACACTTGTCCAGCAAGTGGCCACTCCAGGATTTGGACCAAGGTGATGTGTCTTCAGGCTGTGTCTCTGCCACTGTGCCACGCTGCTGGGTGGTAGGCAGCAGTGGGTGGGTGCCTGCAGTGGTCTGTAAAGACCACCTGAGATGTCCTTCCTCCTCTGTTCCACCCTGTCCAGGTCCAAGAAGACAGTCTATGAAGAGAGAGCAGGTGTGACTCTCTCAGTGTGCTCCTCTGTGAGAAGCAGGCTGACATCCCAAAGGGAAGGGCGGATAACAGAGACAGTGCAAGCGGAGGAGATGAGGGTGGCCTCAAAGCCGGGAGGCTGGGTGATGCAGGAGCCTGCGTGTCCCGAGGGGGTGCTGGGCCCAGTGTGAGTACGTGTGACTGTGACTGAGACAGTGTGACTGCTGAAGGCAGGGACACAGCAGCTCCCTGACTGGGGGCAGAAGGCGTTAACTGTGTGAAGGCTGGTTGTGGGTGGGTGGGCTCTGGGCCTCGAACCCGGGGGCTGAGGGGAGATAGTAAACAGCAGGGTGACTGACGGGAAGATCATGTTGGTACCCTGCGAAGATGCTGCAGGGCTGTGGGGGTTTGTGTGACTTTGCAGTTCAACAAATTCAAATTCAGCCAACGCTGGCAGGGCCTGTTGTGCCAGGCAACCAGCTAGGAGGAGGAGACTCGGACCCAGCTTGCAGCTGAAGGGCGCTGGCTGCCGGGTTCTGTGGGTTCACCTTGCGGTGTCTTCCCTTGCTAACACTGAGTCCTTACAATAGCCCCATCTCCAGGTTGAGGCTAGATGGAGGGGACAGAGGGAAGTGACTTGCCCAAGGTGACCCAAGCTCCCGAGTGCCAGGGCAGGATCTGAATTCAGGCTCTCAGACTGCAGAGCCTGAGTCCCTCCCTGCCATGCCTGTGCCAGGGTGGAAATGTCTGGTCCTGGAGGGGAGCGTGGACTCCTGGCCTTGGCTCTGGAGACATCCCCCTAGACCACGTGGGCTCCTAACCTGTCCATGGTCACTGTGCTGAGGGGCGGGACGGTGGGTCACCCCTAGTTCTTTTTTCCCCAGGGCCAGATTCATGGACTGAAGGGTTGCTCGGCTCTCAGAGACCCCCTAAGCGCCCCGCCCTGGCCCCAAGCCCTCCCCCAGCTCCCGCGTCCCCCCCCTCCTGGCGCTGACTCCGGGCCAGAAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCTCGCACTCTCCCTTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAAGGGTGGCAACTTCTCCTCCTGCAGCCGGGAGCGGCCTGCCTGCCTCCCTGCGCACCCGCAGCCTCCCCCGCTGCCTCCCTAGAGTCGAGGAACTAA3′(SEQ ID NO.11)所述重組核酸分子還可以包含至少一段可操作連接的編碼序列。不同實施方案中，所述可操作連接序列可以編碼一種報道物蛋白例如熒光素酶或者綠色熒光蛋白或者可以本身是一段有治療作用的基因序列。
就可操作連接而言，一些實施方案中，所述神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子和所述異源增強子可以與可操作連接序列位于同一條鏈上，一些實施方案中，位于可操作連接序列的5’端一側(cè)。這類實施方案中，所述啟動子可以直接連接在可操作連接序列的5’端一側(cè)，或者也可以在這些區(qū)域之間存在有插入序列。一些實施方案中，所述啟動子和增強子可以位于可操作連接序列的3’端。一個實施方案中，一種或多種編碼序列連接于PDGF-β啟動子的下游。另一個實施方案中，一種或多種編碼序列以鄰接的方式連接于PDGF-β啟動子的下游。
本發(fā)明所述重組核酸分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法構(gòu)建，描述參見，例如，Sambrook et al.(2001)in Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，及其他實驗手冊。在本發(fā)明的各個方面，核酸分子可以使用例如下列文獻(xiàn)所述的技術(shù)化學(xué)合成Itakura等人的美國專利US4,598,049；Caruthers等人的美國專利US4,458,066；以及Itakura的美國專利US4,401,796和4,373,071。這類合成核酸實質(zhì)上(by their nature)是″重組的″，當(dāng)在本申請中使用了該術(shù)語時(是將該分子構(gòu)成部分逐步合并在一起得到的產(chǎn)物)。
在另一些實施方案中，可將分離的核酸結(jié)合。所謂的分離，是指分離的物質(zhì)已經(jīng)基本上從其他成分例如生物成分分離或者純化出來從而可以對其本身進(jìn)行操作或處理，在其他情況下例如體內(nèi)時，它們是連接在一起的。因此，術(shù)語’分離的’包括用常規(guī)純化方法純化得到的物質(zhì)，通過在宿主中重組表達(dá)制備得到的物質(zhì)，以及化學(xué)合成的物質(zhì)。例如，當(dāng)一種啟動子不再緊緊鄰接于(即，共價鍵連接至)在其來源生物體天然生成基因組中通常鄰接的編碼序列時，那么這種啟動子就是分離的。許多方法都可以用于克隆或連接DNA的片段，這取決于DNA片段末端的特點，選擇合適的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明的另一個方面，提供了一種其中含有本發(fā)明所述重組核酸分子的表達(dá)載體。所述載體可以是一種質(zhì)?；蛘咭环N病毒或者病毒衍生物。另外，用常規(guī)方法構(gòu)建這類載體也已為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明所述載體還可以含有有助于宿主細(xì)胞中載體繁殖和篩選的其他序列元件，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可篩選標(biāo)記物的編碼序列和報道基因。此外，本發(fā)明所述載體還可以包含用作一個或多個限制酶識別位點的序列。
一個實施方案中，可以將CMVIE增強子和PDGF-β啟動子插入pGL3質(zhì)粒(Promega)多克隆位點構(gòu)建出一種質(zhì)粒表達(dá)載體，如實施例所述。在上述得到的載體中，本發(fā)明所述啟動子構(gòu)建體可操作地連接于合并在pGL3質(zhì)粒內(nèi)的熒光素酶報道基因。一些實施方案中，可以將CMVIE增強子和PDGF-β啟動子插入AAV和桿狀病毒構(gòu)建一種病毒表達(dá)載體，如實施例所述。
可以將本發(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞可以包括能夠表達(dá)所述表達(dá)載體編碼的蛋白質(zhì)。所述宿主細(xì)胞包括培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞和位于活生物體內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞，所述的培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞包括神經(jīng)元細(xì)胞系，培養(yǎng)的神經(jīng)元干細(xì)胞和原代神經(jīng)元。因此，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語″宿主細(xì)胞″不僅指特定的受試者細(xì)胞而且也指這類細(xì)胞的后代或可能的后代。由于細(xì)胞分化，突變或環(huán)境影響會使后代體內(nèi)發(fā)生某些改變，所以，這樣的后代實際上不一定與親代細(xì)胞完全相同，但是也包括在本申請使用的該術(shù)語的范圍之內(nèi)。
可以通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)，將載體DNA導(dǎo)入細(xì)胞。術(shù)語″轉(zhuǎn)化″和″轉(zhuǎn)染″是指用于將外源核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共-沉淀，DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂染法(lipofection)，電穿孔，微注射和病毒-介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。適于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法已為本領(lǐng)域所熟知，可以參見例如，Sambrook et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring HarborLaboratory press(2001))，及其他實驗手冊。
一種細(xì)胞、組織、器官或生物體當(dāng)其中導(dǎo)入了一種外源核酸時，就可以認(rèn)為是″經(jīng)轉(zhuǎn)化的″，″經(jīng)轉(zhuǎn)染的″或者″轉(zhuǎn)基因的″。轉(zhuǎn)基因的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體還包括所述細(xì)胞或生物體的后代以及通過使用轉(zhuǎn)基因生物體作為親體的育種方法制備的后代，由于重組核酸構(gòu)建體的存在而表現(xiàn)出一種改變了的表型。因此，一種轉(zhuǎn)基因生物是一種經(jīng)異源核酸轉(zhuǎn)化的生物體，或者包含所述轉(zhuǎn)基因的該生物體的后代。
在各個方面本發(fā)明提供了其中含有本發(fā)明各種實施方案所述重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和非-人動物。
就哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，大家都知道，這取決于使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，只有一種小部分細(xì)胞才可以在其基因組中插入外源DNA。為了鑒定和篩選這些整合體，可以將一種可篩選標(biāo)記物的編碼基因隨同目的基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
優(yōu)選地，可篩選標(biāo)記物包括能賦予抗藥性的可篩選標(biāo)記物，例如，G418，潮霉素和甲氨蝶呤(methotrexate)。編碼可篩選標(biāo)記物的核酸可以與編碼肽化合物的核酸位于同一載體上或者分別位于不同的載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^藥物篩選鑒定出被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞。
正如在下面實施例中描述的那樣，本發(fā)明的一個將CMVIE增強子與PDGF-β啟動子聯(lián)合在一起的實施方案，在保持神經(jīng)元細(xì)胞特異性的同時，可以提高轉(zhuǎn)錄水平，包括體內(nèi)和體外。
PDGF-β大量表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，現(xiàn)已查明PDGF-β啟動子片段可將轉(zhuǎn)基因靶向至轉(zhuǎn)基因動物中的分化神經(jīng)元。但是，與其他神經(jīng)元-特異性啟動子相比，PDGF-β啟動子是一種相對較弱的轉(zhuǎn)錄激活劑。
一個公開的實施方案中，通過將CMVIE增強子與PDGF-β啟動子聯(lián)合，本發(fā)明人首次獲得了這樣一種啟動子構(gòu)建體，該啟動子構(gòu)建體特異性用于神經(jīng)元細(xì)胞，而且與單獨使用PDGF-β啟動子相比，可以更高水平和更長時間活化可操作連接序列的轉(zhuǎn)錄。此前已經(jīng)查明含有PDGF--β啟動子的重組腺聯(lián)病毒載體能夠比攜帶CMV啟動子的滴度-競爭(titer-matched)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)明顯更多的多巴胺能神經(jīng)元。因此，令人奇怪的是，當(dāng)CMVIE增強子與PDGF-β啟動子聯(lián)合時，能夠提高神經(jīng)元細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性的水平。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CMV啟動子在神經(jīng)系統(tǒng)的不同細(xì)胞中其活性是可變的，這一結(jié)果也是出人意料的。一種被CMV啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因傾向于表達(dá)于發(fā)育中大腦的腦室區(qū)，輻射性纖維和移動性成神經(jīng)細(xì)胞，而不是成熟的神經(jīng)元。這一結(jié)果與下述發(fā)現(xiàn)是一致的CMV傳染對成人大腦的影響很小，但是對發(fā)育中人腦內(nèi)的作用是災(zāi)難性的，這部分是由于CMV啟動子在發(fā)育中神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)水平較高。
成熟鼠腦的轉(zhuǎn)基因試驗表明CMV啟動子限制性表達(dá)于限制類型的神經(jīng)元中。最近的一篇論文報道了使用鼠CMV啟動子時的星形細(xì)胞-特異性表達(dá)。類似地，含CMV啟動子的桿狀病毒載體主要介導(dǎo)成熟大腦的膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，而當(dāng)使用Rous肉瘤病毒長末端重復(fù)(RSV LTR)啟動子時發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元中的表達(dá)。這些報道之間的差別可能與下述發(fā)現(xiàn)有關(guān)CMV啟動子序列的輕微變化能夠在CNS神經(jīng)元中產(chǎn)生完全不同的表達(dá)模式。這些序列-特異性表達(dá)部分是由于CMV啟動子的復(fù)雜程度，其中含有cAMP，CREB/ATF，NF-KB，SPI，YY1，視黃酸，AP-1，NF1的結(jié)合位點，其自身立即早期蛋白產(chǎn)物，以及含有一種甲基化信號肽。
但是，顯然當(dāng)與一種神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子例如PDGF-β啟動子聯(lián)合時，CMVIE增強子能夠提高和延長可操作連接序列的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明消除了基因治療中使用神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子時的主要的限制。
盡管用CMVIE增強子和PDGF-β啟動子的構(gòu)建體舉例說明了本發(fā)明的一種實施方案，當(dāng)時本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能夠認(rèn)識到通過常規(guī)表達(dá)試驗可以很容易地鑒定其他構(gòu)建體。PDGF-β啟動子和CMVIE增強子中間每一個與一種合適的增強子或者啟動子聯(lián)合時，視情況而定(as the case may be)能夠提供一種適合于神經(jīng)元細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動子構(gòu)建體。此外，還應(yīng)該認(rèn)識到的是，CMVIE增強子和PDGF-β啟動子的聯(lián)合可以用于其他實施方案。因此可以通過下述操作鑒定出其他合適的神經(jīng)元啟動子將一種能夠激活神經(jīng)元細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動子與CMVIE增強子聯(lián)合，然后測定神經(jīng)元細(xì)胞中可操作連接序列增強子的表達(dá)是否升高。類似地，可以通過下述操作鑒定出其他合適的增強子將一種異源增強子與PDGF-β啟動子聯(lián)合，然后測定神經(jīng)元細(xì)胞中可操作連接序列的表達(dá)是否升高?？梢詫⑺龅钠渌线m的增強子和啟動子聯(lián)合形成本發(fā)明的其他范例性實施方案。
本發(fā)明的一個方面，提供了一種提高強神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子轉(zhuǎn)錄活性的方法，其中包括在神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子上可操作地連接一種異源增強子。不同實施方案中，所述增強子和所述啟動子可以是如上所述的增強子和啟動子，包括人CMVIE增強子和人PDGF-β啟動子。本發(fā)明的一個實施方案中，所述增強子可操作地連接于神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子的上游。
所述重組核酸分子，在其不同的實施方案中可用于在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)外源DNA序列，例如，研究神經(jīng)元細(xì)胞中的基因功能和基因表達(dá)調(diào)控。
高水平、長期且細(xì)胞特異性的基因表達(dá)是通過基因治療有效治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病所必需的。因此一個實施方案中，所述重組核酸分子可以有效地用于基因治療以治療神經(jīng)元性疾病，包括中風(fēng)、局部缺血、癲癇、頭和脊髓外傷、帕金森氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化，以及神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病。例如，帕金森氏病中，黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失最終導(dǎo)致多巴胺不足和相關(guān)運動神經(jīng)元(motor)損傷。因此其中含有CMVIE增強子和PDGF-β啟動子構(gòu)建體的表達(dá)載體可用于發(fā)展帕金森氏病的基因治療，通過借助最佳載體將治療基因轉(zhuǎn)移入多巴胺能神經(jīng)元。
本發(fā)明一個方面提供了一種治療受試者神經(jīng)元性疾病的方法，其中包括向所述受試者施用一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有一種可操作地連接于治療基因編碼序列的本發(fā)明所述重組核酸分子。治療基因包括生長因子基因(包括成纖維細(xì)胞生長因子基因家族的基因、神經(jīng)生長因子基因家族和胰島素-樣生長因子基因)，和抗凋亡基因(包括bcl-2基因家族)在內(nèi)。
用于將DNA導(dǎo)入體內(nèi)哺乳動物細(xì)胞的方法是已知的，包括用于基因治療的方法，可用于將本發(fā)明的表達(dá)載體DNA施用給因神經(jīng)系統(tǒng)疾病而需要基因治療的受試者。可以使用下列方法將本發(fā)明的核酸遞送至體內(nèi)細(xì)胞，例如DNA的直接注射，受體-介導(dǎo)的DNA攝入，病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者非-病毒轉(zhuǎn)染以及以脂類為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染，所有這些方法都涉及使用基因治療載體?？梢允褂靡环N遞送裝置(例如，″基因槍″)將DNA注射入體內(nèi)的細(xì)胞。這類裝置可以從市場上購買(例如，購自BioRad)。一個實施方案中，通過將表達(dá)載體直接注射入中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊髓液的方式，施用所述表達(dá)載體。
用作基因治療的反轉(zhuǎn)錄病毒-介導(dǎo)的基因遞送已經(jīng)研究的很清楚，用于制備重組反轉(zhuǎn)錄病毒的方法以及用所述病毒體外或體內(nèi)感染細(xì)胞的方法可以參見CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F(xiàn).M.et al.(eds.)Greene PublishingAssociates，(1989)，及其他實驗手冊。用于基因治療的其他巳知病毒載體包括腺病毒和腺聯(lián)病毒，美國專利US 6,180,613中所述的用于將DNA遞送至神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的病毒載體，以及Sarkis C et al.，(Efficient transduction of neural cells invitro and in vivo by a baculovirus-derived vector.Proc Natl Acad Sci USA 2000Dec 19；9714638-43)一文報道的桿狀病毒-衍生載體。
在為獲得細(xì)胞-特異性基因表達(dá)需要大量DNA的情況下，可以使用能夠插入大的DNA質(zhì)粒的非-病毒的多聚基因載體。這些載體包括陽離子聚合物或者脂類描述見下列文獻(xiàn)Davis ME，Non-viral gene delivery system；Current opinion inbiotechnology 2002，13128-131；Niidome T and Huang L，Hene therapy progressand prospectsnonviral vectors.Gene Therapy，2002，91647-1652；Li S andHuang L，Nonviral gene therapypromises and challenges.Gene Therapy，2000，731-34；Boussif O，Lezoualc’h，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B，BehrJ-P.A versatile vector for gene andoligonucleotide transfer into cells inculture and in vivo聚乙烯亞胺.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995；927297-7302；Abdallah B，Hassan A，Benoist C，Goula D，Behr JP，Demeneix BA.A powerfulnonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain聚乙烯亞胺.Hum Gene Ther.1996；71947-1954；Goula D，Remy JS，Erbacher P，Wasowicz M，Levi G，Abdallah B，Demeneix BA.Size，diffusibility andtransfection performance of linear PEI/DNA complexes in the mouse centralnervous system.Gene Therapy，1998；5712-717。
可以將與陽離子聚合物例如聚乙烯亞胺(PEI)形成復(fù)合物的質(zhì)粒DNA遞送至神經(jīng)元細(xì)胞，一個實施方案中，治療神經(jīng)元性疾病的方法還包括下列步驟在施用前，將所述表達(dá)載體與一種聚合的基因載體混合。一個實施方案中，所述聚合的基因載體是PEI。
為了將所述載體特異性地遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域中的神經(jīng)元細(xì)胞，可以使用本領(lǐng)域巳知的立體定位微注射，描述見實施例。對于人類患者而言，將所述立體定位框架底座固定在顱骨內(nèi)，然后使用高分辨率MRI讓帶有立體定位框架底座的大腦成像。使用合適的立體定位軟件，將圖像轉(zhuǎn)換為適合于用于靶向注射載體DNA的立體定位框架的三維坐標(biāo)。
所有文獻(xiàn)在此引入作為參考。
盡管本申請中公開了本發(fā)明的各種實施方案，但是仍然可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識作出不脫離本發(fā)明范圍的調(diào)整和修改。這類改動包括為了以基本相同方式獲得同樣結(jié)果，而用已知等效物替換本發(fā)明任一個方面。除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語的都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。
″包含″一詞作為一種含義開放的術(shù)語使用，基本上等同于短語″包括但不限于″。下列實施例是為了說明本發(fā)明的各個方面，而決不對本申請中公開的本發(fā)明的各個方面構(gòu)成限制。
實施例1.材料與方法質(zhì)粒構(gòu)建PGL3-基礎(chǔ)載體購自Promega。psubPDGF-EGFP(Paterna et al.，2000)為Prof.HBueler(Institute of Molecular Biology，University of Zurich，Switzerland)友情惠贈。熒光素酶構(gòu)建體pCMVIE-PDGF-luc，pCMVIEluc，pPDGFluc，pCMVIuc是在pGL3-基礎(chǔ)載體基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的。為了制備pCMVIE-PDGF-luc，使用PCR從psubPDGF-EGFP和pRc/CMV2(Invitrogen life technologies，California，USA)分別擴增出PDGF-β啟動子和CMV立即早期(CMVIE)增強子，然后分別插入pGL3-基礎(chǔ)載體多克隆位點中Sac I/Hind III和Kpn I/Sac I之間。PCMVIEluc和pPDGFluc是通過將CMVIE增強子和PDGF啟動子的PCR產(chǎn)物插入pGL3-基礎(chǔ)載體的Kpn I/Sac I和SacI/Hind III位點。為了構(gòu)建pCMVluc，從pRc/CMV2擴增出CMV全長啟動子，插入pGL3-基礎(chǔ)載體的Kpn I/Hind III位點。本試驗中使用的這四種不同的質(zhì)粒載體的圖解結(jié)構(gòu)顯示于圖1。
所有質(zhì)粒DNA都用大腸桿菌DH5a擴增，然后用常規(guī)方法(Qiagen，Hilden，Germany)純化。通過DNA測序驗證PCR擴增獲得的質(zhì)粒。PCR擴增使用的寡核苷酸如下所列，用斜體字母標(biāo)示出限制酶切位點。
CMVIE增強子正向引物，5′-ATTCGGTACC CCTGGGTCGACATTGA-3′ (SEQ.ID NO.1)反向引物，5′-CAACGAGCTC ACCATGGTAATAGCGATG-3′(SEQ.ID NO.2)CMV啟動子正向引物，5′-ATTAGGTACC CGATGTACGGGCCAGATATACG-3′(SEQ.ID NO.3)反向引物，5′-TAATAAGCTT ACTAGTGGATCCGAGCTCGGTA-3′(SEQ.ID NO.4)PDGF-β啟動子正向引物，5′-AATTGAGCTCCTAGAGGATCCACAGTCT-3′ (SEQ.ID NO.5)反向引物，5′-CAGCAAGCTTTTCAGTTCCTCGACTCTAG-3′(SEQ.ID NO.6)DNA/聚合物復(fù)合物的制備質(zhì)粒DNA用5％葡萄糖稀釋。PEI(25kDa；Sigma-Aldrich，San Diego，CA)以10mM含水原液使用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和動物試驗中，PEI與DNA之間的相對用量分別為為每一當(dāng)量DNA磷酸酯對應(yīng)于10和14當(dāng)量的PEI氮。PEI的需要量是根據(jù)下列因素得出的1μg DNA含有3nmol的磷酸酯，1μl 10mM PEI含有10nmol胺氮(aminenitrogen)。通過下述得到復(fù)合物向DNA溶液中加入適量PEI溶液，簡單渦旋混合，室溫下放置30分鐘。
病毒載體的制備重組桿狀病毒構(gòu)建體使用Bac-To-Bac Baculovirus Expression System(GibcoBRL，Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA)而成。將置于CMV啟動子下的熒光素酶cDNA或CMVIE增強子和PDGF-β啟動子插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl，CMV或CMVIE增強子和PDGF-β啟動子插入Notl & Xbal之間，熒光素酶cDNA插入Xhol & HindIII之間。將制備的重組桿狀病毒在Sf9昆蟲細(xì)胞中增殖，使用O’Reilly DR，Miller LK，and Luchow VA(Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual.New YorkW.H.Freeman and Company，1992)公開的常規(guī)方法。將來自昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物的出芽(Budded)病毒用0.2-μm孔徑的濾膜過濾，然后通過超速離心濃縮。將病毒沉淀重懸于PBS，然后通過Sf9細(xì)胞噬斑試驗測定感染滴度。
重組腺聯(lián)病毒(AAV)構(gòu)建體使用AAV Helper-Free System(Stratagene，La Jolla，CA)構(gòu)建而成。將CMV、PDGF-β和CMVIE增強子-PDGF-β啟動子構(gòu)建體插入Kpn I和III之間的pAAV-熒光素酶，制得AAV表達(dá)質(zhì)粒pAV-CMV-luc、pAAV-PDGF-luc和pAAV-C1 VIE/PDGF-luc。全部質(zhì)粒都在大腸桿菌DH5α株中擴增，使用Qiagen plasmidMaxiprep試劑盒(Qiagen，Ontario，Canada)制備。通過使用PEI方法將上述三種AAV表達(dá)質(zhì)粒其中之一、AAV包裝質(zhì)粒pAAV-RC以及腺病毒輔助質(zhì)粒pHelper(1∶1∶1摩爾比)共一轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后三天，收集細(xì)胞，然后通過兩輪凍/融循環(huán)使AAV從細(xì)胞中釋放出來。通過一-步重力流(gravity flow)肝素親和層析柱純化AAV顆粒，描述見Auricchio A et al.(Isolation of highly infectious andpureadeno-associated virus type 2 vectors with a single-step gravityflow column.Hum Gene Ther.2001；1271-76)。使用購自Progen，Germany的ELISA試劑盒測定純化后的AAV顆粒的滴度。
細(xì)胞培養(yǎng)體外轉(zhuǎn)染試驗在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞、新生小鼠小腦干細(xì)胞MTC 17.2以及大鼠原代皮層神經(jīng)元中完成。MTC 17.2和原代神經(jīng)元在37℃ 5％CO2條件下培養(yǎng)于添加了10％FBS的DMEM中，PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含有15％FCS的RPMI 1640。
轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)細(xì)胞及熒光素酶活性試驗對于PC12和MTC 17.2的轉(zhuǎn)染而言，轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞脫落下來，使用0.5毫升上述培養(yǎng)基，將細(xì)胞以5×104/孔細(xì)胞密度平鋪于24-孔平板。孵育過夜后，將培養(yǎng)基更換為300μl Opti-HEM，向平板的每一孔中加入10μl一等份的含0.1pmole DNA的DNA/PEI復(fù)合物。37℃下用DNA/PEI復(fù)合物孵育細(xì)胞3小時。用0.5ml新鮮的完全培養(yǎng)基替換每個孔中的培養(yǎng)基，然后再繼續(xù)孵育細(xì)胞24小時。孵育后，用100μl細(xì)胞裂解緩沖液(Promega)使細(xì)胞通透性增加。對于大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染而言，將細(xì)胞種植入46-孔平板用于桿狀病毒感染或96-孔平板用于AAV感染。使用熒光素酶試驗試劑盒(promega)測量細(xì)胞提取物中的熒光素酶活性。將相對發(fā)光單位用細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)濃度歸一化，該蛋白質(zhì)濃度是用蛋白質(zhì)測定試劑盒(Bio-Radlabs，Hercules，Calif)測得的。
體內(nèi)試驗-動物本試驗使用成熟雄性Wistar大鼠(重量為250-320g)。將這些大鼠分成幾組對于熒光素酶提取試驗，每一時間間隔使用4只大鼠pCMVIE-PDGF-luc(n＝32)，pCMVIEIuc(n＝4)，pPDGFluc(n＝4)，pCMVluc(n＝12)；對于免疫組織化學(xué)試驗假操作組(n＝6)，pCMVIE-PDGF-luc注射組(n＝6)，pCMVluc注射組(n＝6)；對于PCR試驗(n＝3)，在注射后的不同時間將大鼠隨機分配給每個組。將大鼠以一籠4只，置于光-暗循環(huán)(12h/12h)、22℃恒溫和60％濕度的條件下，用普通試驗室大鼠食物飼喂。在所有動物的操作和護(hù)理中，遵照由世界衛(wèi)生組織制定的(1985)并且被新加坡國立大學(xué)實驗動物中心采用的the International Guiding Principles forAnimal Research進(jìn)行。所有大鼠全部由新加坡國立大學(xué)實驗動物中心繁育和供給，在實驗前后都圈養(yǎng)于動物中心。
-注射方法通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉的方式將大鼠麻醉(60mg/kg體重)，然后置于腦立體定位裝置，壓尺(nose bar)設(shè)定在0或-3.5毫米(用于海馬注射)。將DNA分別雙側(cè)3點注射入紋狀體[坐標(biāo)(從前囟點和硬膜算起)前面(A)，+1.5毫米，外側(cè)(lateral)(L)，+2.0mm，腹側(cè)(ventral)(V)，5.0mm；A，+0.5mm，L，+3mm，V，-5.0mm以及A，-0.3mm，L，+3mm，V，-5.0mm]或者注射入海馬(坐標(biāo)A，-4.4mm，L，+3.2mm，V，-2.5mm)。就每一注射而言，注射量都為5μl，其中含有置于PEI/DNA復(fù)合物中的1μg DNA。注射速率為1ul/分鐘，每次注射結(jié)束讓針頭在原位保持5分鐘然后慢慢拔出。
-PCR檢測來自組織樣本的熒光素酶基因在紋狀體注射pCMVIE-PDGF-luc后2天，從大鼠大腦采集紋狀體、海馬、皮層和黑質(zhì)組織樣本。通過用刀片剁碎的方式將組織均質(zhì)化，然后按照DNAeasy Tissue試劑盒(Qiagen)的常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA。熒光素酶PCR擴增用的寡核苷酸引物如下5’引物5’-ATTGC TCA ACA GTA TGG GCA-3’(SEQ.ID NO.7)3’引物5’-CGA AGA AGG AGA ATA GGG TTG-3’(SEQ.ID NO.8)擴增產(chǎn)物的預(yù)期大小為540bp。擴增循環(huán)如下94℃5min，1個循環(huán)；94℃，45s，55℃30s，72℃，30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。為了排除整個過程中的污染，對注射了PEI的普通大鼠大腦同時設(shè)置雙份進(jìn)行處理。
熒光素酶試驗深度麻醉后，通過心內(nèi)灌注0.1M磷酸鹽緩沖鹽水PBS(pH7.4)處死大鼠。摘出大腦，解剖為包括紋狀體、海馬、皮層和黑質(zhì)的四個不同部分，收集入eppendorf管。將組織樣本-80℃保存?zhèn)溆?。分別加入PBS緩沖液(每50mg組織加100μlPBS)后，通過置于冰上超聲處理10秒鐘將組織樣本均質(zhì)化，然后在微量離心機中4℃下以13,000rpm離心。取10微升上清室溫下用于熒光素酶活性試驗，使用購自Promega的測定試劑盒。測量在一種單-孔光度計(Berthold Lumat LB 9501)中10秒鐘完成。
-免疫組織化學(xué)分析用pCMVIE-PDGF-luc、pCMVluc注射或假操作后2天，殺死大鼠(n＝3)。深度麻醉后，首先向所有大鼠灌注Ringer’s溶液，然后接著灌注2％的多聚甲醛0.1M PBS溶液(pH 7.4)。在灌注以后，取出含紋狀體和海馬的大腦皮層，在同樣的固定液中再-固定2-4小時，然后轉(zhuǎn)移入含15％蔗糖的0.1M PBS中，4℃保存過夜。將每一大腦切削為30m厚的冠狀冰凍切片，收集后保存于0.1M PBS。
將Free-floating切片在含0.2％Triton X-100的pH 7.4的0.1M PBS中洗滌20分鐘，然后用5％常用山羊血清PBS溶液封閉1小時。然后，將切片用第一抗體抗熒光素酶抗體(Promega；1∶150稀釋)和抗神經(jīng)元-特異性核蛋白單克隆抗體(NeuN)(Chemicon International，USA；1∶500稀釋)孵育過夜。切片用0.1M PBS洗滌，然后抗-兔IgG Tritc偶聯(lián)物(Sigma-Aldrich，Inc.，USA；dilution 1∶100)和抗-鼠IgG Fitc偶聯(lián)物(Sigma-Aldrich；dilution 1∶100)孵育1小時。在孵育以后，將切片用PBS洗滌3遍。然后，將其收集在明膠-包被過的載片上，用DAKO熒光封固劑固定然后蓋上蓋玻片。對照切片不用第一抗體孵育。
-用共焦掃描顯微術(shù)目測雙重標(biāo)記切片用Carl Zeiss LSM410共焦激光掃描顯微鏡檢查。每一種切片首先用488nm激光譜線和發(fā)射濾片BP 510-525掃描，檢測Fitc熒光素；然后用543nm激光譜線和一種發(fā)射濾膜LP 570掃描，檢測Tritc熒光素。
-定量分析3只大鼠中的每一個在細(xì)胞定量分析中都用NeuN共定位pCMVIE-PDGF-luc和pCMV-luc。每只大鼠各隨機選取4張切片用于細(xì)胞計數(shù)。每張切片隨機選取一共3個兩側(cè)區(qū)域進(jìn)行檢測。每一區(qū)域在Carl ZeissLSH410共焦激光掃描顯微鏡下用200x放大倍數(shù)觀察。對每一畫面中的共定位細(xì)胞計數(shù)，然后分別計算出NeuN在pCMVIE-PDGF-luc和pCMV-luc陽性細(xì)胞中的共定位百分?jǐn)?shù)。使用Student’s t-檢驗測定不同質(zhì)粒中共定位程度的統(tǒng)計顯著性。
2.結(jié)果表1.從紋狀體或海馬中再-注射入pCMVIE-PDGF-luc或pCMVluc后2天殺死的大鼠獲取的、含有或不含神經(jīng)元-標(biāo)記物NeuN免疫反應(yīng)性的、熒光素酶免疫反應(yīng)活性陽性的細(xì)胞的數(shù)目。

*轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的百分比＝雙標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目/熒光素酶免疫反應(yīng)活性細(xì)胞的總數(shù)。
使用CMVIE-PDGF嵌合啟動子提高體外基因表達(dá)為了消除不同質(zhì)粒骨架對基因表達(dá)的影響，所有熒光素酶報道質(zhì)粒都用相同的pGL3-基礎(chǔ)載體的骨架構(gòu)建(圖1)。神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染過后，體外將pCMVIE-PDGF-luc的熒光素酶表達(dá)與pCMVluc、pPDGFluc和pCMVIEluc進(jìn)行比較。如圖2所示，在兩種測試細(xì)胞中，與pPDGFluc和pCMVIEluc相比，pCMVIE-PDGF-luc使得表達(dá)顯著提高。這些細(xì)胞中，與來自pPDGFluc的PDGF活性相比，pCMVIE-PDGF-luc中在PC12和MTC17.2中的PDGF活性分別升高了8倍和90倍。這種提高要比單用PDGF和CMVIE的簡單加和表達(dá)顯著的多。PC12細(xì)胞和MT C17.2細(xì)胞中pCMVIE-PDGF-luc與pCMVluc之比分別為0.88和2.92，表明所述嵌合啟動子將基因表達(dá)提高至接近或者甚至超過了CMV啟動子。
大腦中所述嵌合啟動子CMVIE-PDGF的神經(jīng)元-特異性我們隨后對CMVIE-PDGF啟動子是否能夠保持PDGF-β啟動子的神經(jīng)元特異性進(jìn)行了研究。從接受了紋狀體或海馬注射pCMVIE-PDGF-luc和pCMVluc的大鼠制備切片，用抗熒光素酶和神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的抗體共-染色。海馬中，CMVIE-PDGF-luc和CMV的表達(dá)模式差別很大。表達(dá)CMVIE-PDGF-luc的細(xì)胞主要位于顆粒狀(granular)神經(jīng)元細(xì)胞層。用NeuN標(biāo)記物對CMVIE-PDGF-luc著染細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)共定位，結(jié)果表明這些細(xì)胞中的大部分是神經(jīng)元細(xì)胞(圖3)。細(xì)胞計數(shù)表明海馬中89％的含熒光素酶的細(xì)胞還含有NeuN(表1)。相反，CMV-luc表達(dá)細(xì)胞呈擴散的解剖學(xué)分布漫出了神經(jīng)元細(xì)胞層，對應(yīng)于神經(jīng)元、星形細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。定量分析表明只有50％的熒光素酶染色細(xì)胞是神經(jīng)元(表1)。紋狀體中，CMV-luc著染細(xì)胞呈擴散分布，而CMVIE-PDGF-luc則只限于神經(jīng)元(圖4)，與海馬中觀察得到的結(jié)果一樣。細(xì)胞計數(shù)表明對于CMVIE-PDGF-Luc來說，表達(dá)luc的神經(jīng)元所占比例為91％，顯著高于CMV-Luc(48％)(表1)。
使用CMVIE-PDGF嵌合啟動子提高體內(nèi)基因表達(dá)在注射入大鼠紋狀體后，對CMVIE-PDGF、PDGF-β和CMVIE增強子啟動子在誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)方面的效力進(jìn)行了比較。從每一大鼠大腦采集組織樣本用于熒光素酶試驗。每一質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶活性水平見圖5。早在注射后24時所有四種質(zhì)粒構(gòu)建體中都已檢測到了熒光素酶的表達(dá)。CMVIE-PDGF-luc的表達(dá)在5天中一直增加，然后保持穩(wěn)定直至第14天。在注射后1天時CMVIE和PDGF-的表達(dá)水平很低，3天后變得檢測不到(數(shù)據(jù)未顯示)，表明這兩種啟動子的活性很弱。與體外試驗觀察到的結(jié)果類似，在體內(nèi)，與CMVIE和PDGF-β啟動子相比，CMVIE-PDGF的活性也升高。
通過ZAI病毒載體范圍內(nèi)的嵌合的啟動子CMVIE-PDGF提高基因表達(dá)上述試驗使用質(zhì)粒DNA載體。為了檢驗插入病毒載體后CMVIE增強子-PDGF-β啟動子構(gòu)成的嵌合啟動子是否還能提高基因表達(dá)，我們制備了含有所述嵌合啟動子的重組桿狀病毒和腺聯(lián)病毒，然后在大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元的細(xì)胞培養(yǎng)物中和大鼠大腦中對其進(jìn)行了檢驗。如圖6A所示，與PDGF-β啟動子相比，CMVIE增強子-PDGF-β啟動子顯著提高了基因表達(dá)，比用AAV載體時提高了19倍，比用桿狀病毒載體時提高了15-倍。這種提高比單用PDGF-β啟動子和CMVIE增強子簡單相加的表達(dá)以及使用CMV啟動子的表達(dá)要顯著的多。在注射入大鼠紋狀體之后，AAV載體中的CMVIE增強子-PDGF--β啟動子驅(qū)動了比PDGF-β和CMV啟動子更高水平的體內(nèi)基因表達(dá)，增加了5倍(圖6B)。
序列表<110>Wang，ShuLiu，BeihuiWang，Xu<120>一種啟動子構(gòu)建體及其在神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)移中的用途<130>93231-2<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>1attcggtacc cctgggtcga cattga 26<210>2<211>28<212>DNA<213>人工<220>
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<223>引物<400>4taataagctt actagtggat ccgagctcgg ta 32<210>5<211>28<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>5aattgagctc ctagaggatc cacagtct 28<210>6<211>29<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>6cagcaagctt ttcagttcct cgactctag 29<210>7<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>7attgctcaac agtatgggca20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>8cgaagaagga gaatagggtt g 21<210>9
<211>387<212>DNA<213>巨細(xì)胞病毒<220>
<221>misc_feature<223>巨細(xì)胞病毒立即早期增強子<400>9cctgggtcga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaatacggg gtcattagtt 60catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga120ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca180atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca240gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg300ccccctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tctacttggc agtacatcta360cgtattagtc atcgctatta ccatggt387<210>10<211>1488<212>DNA<213>人<220>
<221>misc_feature<223>人血小板-衍生的生長因子Beta-鏈啟動子<400>10ctagaggatc cacagtctcc tgagtagctg ggactacagg agcttgttac cacacccagc 60tccagtttat aaattcatct ccagtttata aaggaggaaa ccgaggtact gagaggttaa120aaaaccttcc tgcagacact tgtccagcaa gtggccactc caggatttgg accaaggtga180tgtgtcttca ggctgtgtct ctgccactgt gccacgctgc tgggtggtag gcagcagtgg240gtgggtgcct gcagtggtct gtaaagacca cctgagatgt ccttcctcct ctgttccacc300ctgtccaggt ccaagaagac agtctatgaa gagagagcag gtgtgactct ctcagtgtgc360tcctctgtga gaagcaggct gacatcccaa agggaagggc ggataacaga gacagtgcaa420gcggaggaga tgagggtgcc tcaaagccgg gaggctgggt gatgcaggag cctgcgtgtc480ccgagggggg tgctgggccc agtgtgagta cgtgtgactg tgactgagac agtgtgactg540ctgaaggcag ggacacagca gctccctgac tgggggcaga aggcgttaac tgtgtgaagg600ctggttgtgg gtgggtgggc tctgggcctc gaacccgggg gctgagggag atagtaaaca660
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<223>CMVIE-PDGF-Beta嵌合啟動子<400>11cctgggtcga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaatacggg gtcattagtt 60catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga120ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca180atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca240gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg300ccccctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tctacttggc agtacatcta360cgtattagtc atcgctatta ccatggtgag ctcctagagg atccacagtc tcctgagtag420ctgggactac aggagcttgt taccacaccc agctccagtt tataaattca tctccagttt480ataaaggagg aaaccgaggt actgagaggt taaaaaacct tcctgcagac acttgtccag540
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1.一種重組核酸分子，其中含有一種可操作地連接于一種異源增強子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子，其中所述增強子能夠提高所述啟動子的神經(jīng)元細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性。
2.權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述增強子是一種病毒增強子或啟動子。
3.權(quán)利要求2所述的核酸分子，其中所述增強子是RSV啟動子、SV40啟動子或者CMV增強子或啟動子。
4.權(quán)利要求3所述的核酸分子，其中所述啟動子是PDGFβ啟動子。
5.權(quán)利要求4所述的核酸分子，其中所述增強子是CMVIE增強子。
6.權(quán)利要求5所述的核酸分子，其中所述增強子包含SEQ ID NO.9所示序列。
7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的核酸分子，其中所述啟動子包含SEQ ID NO.10所示序列。
8.上述權(quán)利要求中任一項所述的核酸分子，其中所述啟動子可操作地連接于所述增強子的下游。
9.權(quán)利要求8所述的核酸分子，其中含有SEQ ID NO.11所示的序列。
10.權(quán)利要求9所述的核酸分子，其中進(jìn)一步還含有可操作地連接于所述啟動子的編碼序列。
11.權(quán)利要求10所述的核酸分子，其中所述編碼序列是一種治療性基因序列。
12.一種表達(dá)載體，其中含有權(quán)利要求10所述的核酸分子。
13.權(quán)利要求12所述的載體，其中所述的載體是一種質(zhì)粒。
14.權(quán)利要求12所述的載體其中所述的載體是一種病毒或者病毒-衍生物。
15.權(quán)利要求14所述的載體，其中所述的載體是一種桿狀病毒或者腺聯(lián)病毒。
16.一種在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，其中包括用權(quán)利要求12所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化神經(jīng)元細(xì)胞。
17.一種治療受試者神經(jīng)元性疾病的方法，其中包括向所述受試者施用一種含有權(quán)利要求11所述重組核酸分子的表達(dá)載體。
18.權(quán)利要求17所述的方法該方法進(jìn)一步還包括將所述表達(dá)載體與一種聚合物的基因載體混合的步驟。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述聚合物的載體是一種陽離子聚合物或者脂類。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述載體是聚乙烯亞胺。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中通過將表達(dá)載體直接注射入中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊髓液的方式，施用所述表達(dá)載體。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述表達(dá)載體通過立體定位的微注射施用至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
23.權(quán)利要求20-22中任一項所述的方法，其中所述的神經(jīng)元性疾病是中風(fēng)、局部缺血、癲癇、頭和脊髓外傷、帕金森氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化，或者神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病。
24.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或者非-人動物其中包含權(quán)利要求9-11中任一項所述的重組核酸分子。
25.一種提高神經(jīng)元特異性啟動子轉(zhuǎn)錄活性的方法，其中包括在神經(jīng)元特異性啟動子上可操作地連接一種異源增強子。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述增強子可操作地連接于所述啟動子的上游。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述增強子是RSV啟動子、SV40啟動子或者CMV增強子或啟動子。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子是人PDGF-β啟動子。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述增強子是人CMVIE。
30.一種試劑盒，其中含有一種神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞-系，上述權(quán)利要求中任一項所述的表達(dá)載體，以及用于指導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞-系和表達(dá)重組基因產(chǎn)物的說明書。
31.權(quán)利要求11所述重組分子在制備用于治療受試者神經(jīng)元性疾病的藥物中的用途。
32.權(quán)利要求31所述的用途，其中所述的神經(jīng)元性疾病是中風(fēng)、局部缺血、癲癇、頭和脊髓外傷、帕金森氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化，或者神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病。
33.權(quán)利要求12所述表達(dá)載體在制備用于治療受試者神經(jīng)元性疾病的藥物中的用途。
34.權(quán)利要求33所述的用途，其中所述的表達(dá)載體與一種聚合物的基因載體混合在一起。
35.權(quán)利要求34所述的用途，其中所述聚合物的基因載體是一種陽離子聚合物或者脂類。
36.權(quán)利要求35所述的用途，其中所述載體是聚乙烯亞胺。
37.權(quán)利要求30-36中任一項所述的用途，其中通過將表達(dá)載體直接注射入中樞神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊髓液的方式，施用所述表達(dá)載體。
38.權(quán)利要求37所述的用途，其中所述施用是通過立體定位微注射完成的。
39.權(quán)利要求33-38中任一項所述的在治療神經(jīng)元性疾病中的用途，其中所述的疾病是中風(fēng)、局部缺血、癲癇、頭和脊髓外傷、帕金森氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化，或者神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病。
40.一種通過下述方法表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞-系的重組蛋白質(zhì)用權(quán)利要求12所述載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞或細(xì)胞-系，然后使得經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)所述重組蛋白質(zhì)。
41.權(quán)利要求40所述重組蛋白在制備用于治療受試者神經(jīng)疾病的藥物中的用途。
42.權(quán)利要求41所述的用途，其中所述的疾病是中風(fēng)、局部缺血、癲癇、頭和脊髓外傷、帕金森氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化，或者神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病。
43.一種用于提高神經(jīng)元細(xì)胞或細(xì)胞-系中轉(zhuǎn)錄活性的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一種可操作地連接于一種異源增強子的下游的神經(jīng)元細(xì)胞-特異性啟動子，基本如本申請所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嵌合的啟動子構(gòu)建體，可用于神經(jīng)元細(xì)胞特異性基因表達(dá)。本發(fā)明提供了一種重組核酸分子，其中含有一種神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動子例如血小板衍生生長因子β－鏈啟動子，該啟動子可操作地連接于一種能提高該啟動子轉(zhuǎn)錄活性的異源的增強子，例如巨細(xì)胞病毒立即早期基因增強子。本發(fā)明所述啟動子構(gòu)建體能夠提高和延長神經(jīng)元細(xì)胞中的基因表達(dá)，可以有效地用于基因治療神經(jīng)元性疾病。
文檔編號C12N15/864GK1826411SQ200480009292
公開日2006年8月30日 申請日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者王朔, 劉北會, 王旭 申請人:新加坡科技研究局