專利名稱：預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┛鼓[瘤效果的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獲得可用作預(yù)測(cè)組蛋白去乙酰化酶抑制劑的藥效、具體地說，預(yù)測(cè)抗腫瘤效果的基因的方法，以及包括研究該基因的表達(dá)方式的預(yù)測(cè)該組蛋白去乙酰化酶抑制劑的藥效(抗腫瘤效果)的方法。
背景技術(shù)：
近年來，考慮了患者的個(gè)體差異的“定制醫(yī)療”得到重視，需要尋求用于識(shí)別藥物對(duì)其有效的癌、無效的癌的標(biāo)志。其內(nèi)容是預(yù)先驗(yàn)證藥物有效的可能性，然后對(duì)患者給藥，由此提高藥物的奏效率，同時(shí)避免毒性，抑制無意義的藥物使用，從而在倫理方面、醫(yī)療方面嘗試提高藥物的成本性能。另外在癌癥治療中，這可作為填補(bǔ)基礎(chǔ)研究和臨床之間的鴻溝的重要的手段，因此有望開發(fā)出預(yù)測(cè)抗癌藥的藥效的方法。
例如，有報(bào)告指出式(I) 所示化合物(以下也稱為化合物A；SEQ ID NO.1)、特別是式(II)
所示立體異構(gòu)體(FK228)具有組蛋白去乙?；敢种谱饔?，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗腫瘤活性(例如參照日本特公平7-64872號(hào)公報(bào)、“Experimental Cell Research”(美國(guó))，1998年，第241號(hào)，126-133頁(yè))。但是，還有很多問題尚未解決沒有證明能夠預(yù)測(cè)該化合物的抗腫瘤效果的因子的報(bào)道，體外試驗(yàn)結(jié)果是否可直接適用于體內(nèi)，是否對(duì)任何腫瘤都在體內(nèi)顯示有用的效果，等等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供獲得一種基因的方法，該基因可作為藥效預(yù)測(cè)指標(biāo)，用于預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿?、特別是已知具有強(qiáng)烈的組蛋白脫乙酰抑制作用的化合物A的藥效。本發(fā)明還提供預(yù)測(cè)該組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幮У姆椒ǎ涮卣髟谟谘芯吭摶虻谋磉_(dá)模式。
本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果根據(jù)腫瘤的種類而變動(dòng)，并且觀察到該變動(dòng)與某些特定的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)模式的變化相關(guān)聯(lián)，對(duì)這些特定的基因(蛋白質(zhì))進(jìn)行鑒定，觀察腫瘤中這些基因的表達(dá)模式，依據(jù)該觀察，發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)或評(píng)價(jià)組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幮У姆椒ǎ瑥亩瓿闪吮景l(fā)明。即，本發(fā)明如下所示。
(1)獲得可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑藥效預(yù)測(cè)的指標(biāo)的基因的方法，該方法包含以下步驟①研究體內(nèi)組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果，將腫瘤細(xì)胞分類為對(duì)該組蛋白去乙?；敢种苿┚哂懈惺苄缘募?xì)胞種類(感受性腫瘤細(xì)胞)和具有抵抗性的細(xì)胞種類(抵抗性腫瘤細(xì)胞)的步驟，以及②對(duì)在上述步驟①中分類的感受性腫瘤細(xì)胞和抵抗性腫瘤細(xì)胞分別研究其基因表達(dá)模式，并選擇(i)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，或者(ii)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因的步驟。
(2)(1)中所述方法，其中組蛋白去乙?；敢种苿┦且韵碌幕瘜W(xué)式(I) 所示化合物或其可藥用的鹽。
(3)(1)或(2)所述方法，其中，腫瘤細(xì)胞來自前列腺癌、胃癌或腎癌。
(4)預(yù)測(cè)組蛋白去乙酰化酶抑制劑的抗腫瘤效果的方法，其特征在于在至少1種腫瘤細(xì)胞中研究(1)所述方法得到的至少一個(gè)基因的表達(dá)量。
(5)(4)中所述方法，其中組蛋白去乙?；敢种苿┦且韵碌幕瘜W(xué)式(I)
所示化合物或其可藥用的鹽。
(6)(4)或(5)中所述方法，其中至少一個(gè)基因是在感受性細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因。
(7)(4)或(5)所述方法，其中至少一個(gè)基因是在感受性細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因。
(8)預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果的方法，其特征在于在至少1種腫瘤細(xì)胞中研究(1)中所述方法得到的至少一個(gè)在感受性細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，和至少一個(gè)在感受性細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因的表達(dá)量。
(9)(4)-(8)中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞來自前列腺癌、胃癌或腎癌。


圖1是表示FK228對(duì)人前列腺癌((a)；PC-3)和腎癌((b)；ACHN)的抗腫瘤效果的圖，縱軸表示腫瘤增殖率，橫軸表示初次給藥后經(jīng)過的天數(shù)。以第0天時(shí)腫瘤的體積為1，腫瘤增殖率以之后的腫瘤體積的相對(duì)比例表示。
本發(fā)明提供獲得作為預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幮А⑻貏e是預(yù)測(cè)抗腫瘤效果的指標(biāo)的基因的方法。通過分析由所述方法得到的基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)模式，可以獲得該組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)其治療是否有效，或者該組蛋白去乙?；敢种苿?duì)于對(duì)象癌癥是否有效等的信息，可以應(yīng)用于“定制醫(yī)療”。另外，可以無需實(shí)際給予人體，即可發(fā)現(xiàn)可在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤效果的組蛋白去乙?；敢种苿?。
“組蛋白去乙?；敢种苿笔侵冈诮M蛋白去乙酰化酶的活性部位與底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的化合物，或者結(jié)合在與組蛋白去乙?；傅幕钚圆课徊煌牟课?、具有改變組蛋白去乙酰化酶的酶活性的作用的化合物，包括已公知的作為組蛋白去乙?；敢种苿┯猛镜幕衔铮€包含報(bào)道的具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘乃谢衔?無論合成、天然與否)以及今后可能報(bào)道的所有化合物。具體有上述化合物A或其鹽、其衍生物(例如將化合物A乙酰化所得或?qū)-S鍵還原得到的硫醇化物等)。還有曲古抑菌素A、丁酸鈉、suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA)、MS-275、含環(huán)狀異羥肟酸的肽、Apicidin、Trapoxin等也是報(bào)道具有組蛋白去乙?；敢种苹钚缘幕衔?。
化合物A具有基于手性碳原子和雙鍵的光學(xué)異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體等立體異構(gòu)體(例如FK228)，所有這些異構(gòu)體以及它們的混合物也包含在本發(fā)明所使用的組蛋白去乙?；敢种苿┑姆秶鷥?nèi)。
化合物A、FK228或它們的鹽的溶劑合物(例如包合物(例如水合物等))也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如無特別說明，本說明書中只提及化合物A時(shí)，是指包括式(II)所示化合物(FK228)的不論立體異構(gòu)與否的化合物組。
化合物A或其鹽是公知的物質(zhì)，可以購(gòu)買得到。例如化合物A的立體異構(gòu)體之一FK228可如下獲得將可生產(chǎn)該物質(zhì)的屬于色桿菌屬的菌株在需氧條件下培養(yǎng)，從該培養(yǎng)肉湯中回收相應(yīng)物質(zhì)?？缮a(chǎn)FK228的屬于色桿菌屬的菌株例如有紫色色桿菌WB 968(FERM BP-1968)。具體可以按照日本特公平7-64872號(hào)(對(duì)應(yīng)美國(guó)專利4977138號(hào))公報(bào)的記載，由該生產(chǎn)菌獲得FK228。從更容易獲得的角度考慮，優(yōu)選由可生產(chǎn)FK228的屬于色桿菌屬的菌株回收FK228，但從無需或者減少純化步驟的角度考慮，合成或半合成的FK228更有利。同樣，對(duì)于FK228以外的化合物A可以按照以往公知的方法半合成、全合成。更具體的，可以按照Khan W.Li，等人報(bào)告的方法(J.Am.Chem.Soc.，vol.118，7237-7238(1996))制備。
化合物A的鹽有與無機(jī)堿形成的鹽(例如鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽，鈣鹽、鎂鹽等堿土金屬鹽；銨鹽)，與有機(jī)堿形成的鹽(例如三乙胺鹽、二異丙基乙胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、二環(huán)己胺鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽等有機(jī)胺鹽)，無機(jī)酸加成鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)，有機(jī)羧酸·磺酸加成鹽(例如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽等)，與堿性或酸性氨基酸(例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等)形成的鹽等與堿形成的鹽或酸加成鹽。
本發(fā)明中，體內(nèi)、體外如通常本領(lǐng)域所使用的該用語(yǔ)，即，“體內(nèi)”是指對(duì)象生物體的機(jī)能或反應(yīng)在體內(nèi)表達(dá)的狀態(tài)，“體外”是指該機(jī)能或反應(yīng)在試管內(nèi)(組織培養(yǎng)體系、細(xì)胞培養(yǎng)體系、無細(xì)胞體系等)中表達(dá)。
本發(fā)明的獲得可以作為預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果的指標(biāo)的基因的方法至少包括以下步驟。
①研究體內(nèi)組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果，將腫瘤細(xì)胞分類為對(duì)該組蛋白去乙?；敢种苿┚哂懈惺苄缘募?xì)胞種類(感受性腫瘤細(xì)胞)和具有抵抗性的細(xì)胞種類(抵抗性腫瘤細(xì)胞)的步驟，以及②對(duì)在上述步驟①中分類的感受性腫瘤細(xì)胞和抵抗性腫瘤細(xì)胞中，分別研究其基因表達(dá)模式，并選擇(i)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，或者(ii)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因的步驟。
本發(fā)明中使用的作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的腫瘤細(xì)胞(以下也簡(jiǎn)稱為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞)只要是具有組蛋白去乙?；傅募?xì)胞即可，并沒有特別限定，但評(píng)價(jià)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果、特別是評(píng)價(jià)該抑制劑的腫瘤部位特異性，這也是本發(fā)明的課題之一，因此所使用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞優(yōu)選為來自希望研究其效果的腫瘤的細(xì)胞。例如，要評(píng)價(jià)對(duì)前列腺癌的效果時(shí)，可以使用人前列腺培養(yǎng)癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞等，要評(píng)價(jià)對(duì)腎癌的效果時(shí)，可以使用人培養(yǎng)腎癌細(xì)胞ACHN細(xì)胞等。包括這些癌細(xì)胞的作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞使用的各種培養(yǎng)人癌細(xì)胞可以從市場(chǎng)購(gòu)買，也可以從各種細(xì)胞庫(kù)等獲得。另外，如果考慮長(zhǎng)期的治療效果或者對(duì)每名患者的有效性，即定制醫(yī)療，則也可以培養(yǎng)由患者的腫瘤得到的癌細(xì)胞，使用該癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。
研究體內(nèi)組蛋白去乙?；敢种苿?duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果的步驟例如按照以下的順序進(jìn)行。
首先，將作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的腫瘤細(xì)胞接種到小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠、豚鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，試驗(yàn)性制備形成腫瘤的體系。所述體系中，在腫瘤接種后給予組蛋白去乙?；敢种苿ㄟ^測(cè)定腫瘤的增殖率來評(píng)價(jià)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果。增殖率的測(cè)定可簡(jiǎn)便地通過測(cè)定所形成的腫瘤的大小來進(jìn)行。
將腫瘤細(xì)胞接種給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這可以按照本領(lǐng)域常規(guī)做法實(shí)施。例如有將在裸鼠身上繼代繁殖的實(shí)體腫瘤的一部分接種到小鼠身上的方法。另外，組蛋白去乙?；敢种苿┩ǔ？梢砸酝瑯拥姆椒ńo予與為得到抗腫瘤效果而給予的量相同的量。即，可以采用腹腔內(nèi)、靜脈、肌內(nèi)或經(jīng)口給藥。給藥量根據(jù)要給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類、體重、接種癌的種類不同而不同，通常對(duì)小鼠靜脈內(nèi)給藥時(shí)，可給予1mg/kg-5mg/kg左右。
以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥為目的，將組蛋白去乙?；敢种苿┲瞥扇芤簳r(shí)的溶劑只要是可溶解組蛋白去乙酰化酶抑制劑、且對(duì)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的腫瘤細(xì)胞或?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物不顯示毒性的溶劑即可，并沒有特別限制，通常可用乙醇、PEG400、10％HCO-60溶液、二甲基亞砜等以及它們的混合溶劑等制備濃縮液，然后用生理鹽水等生理緩沖液稀釋成所需濃度使用。
將特定組蛋白去乙?；敢种苿┮匀我獾慕o藥量給藥時(shí)，將腫瘤細(xì)胞分別分類為“感受性腫瘤細(xì)胞”和“抵抗性腫瘤細(xì)胞”將增殖抑制率為70％或以上(優(yōu)選80％或以上)、可見強(qiáng)增殖抑制效果的腫瘤細(xì)胞作為對(duì)組蛋白去乙酰化酶抑制劑的“感受性腫瘤細(xì)胞”；將增殖抑制率為30％或以下(優(yōu)選20％或以下)、可見弱增殖抑制效果的腫瘤細(xì)胞作為對(duì)組蛋白去乙?；敢种苿┑摹暗挚剐愿惺苄阅[瘤細(xì)胞”。
例如組蛋白去乙?；敢种苿榛衔顰時(shí)，腫瘤細(xì)胞可分類為化合物A感受性腫瘤細(xì)胞和化合物A抵抗性感受性腫瘤細(xì)胞。
化合物A感受性腫瘤細(xì)胞是指對(duì)于化合物A，根據(jù)上述基準(zhǔn)，可見腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)的增殖抑制效果的形式的腫瘤細(xì)胞，例如如后述實(shí)施例所示，有前列腺癌細(xì)胞PC-3。除此之外，胃癌的細(xì)胞SC-6也是化合物A感受性腫瘤細(xì)胞的一種?；衔顰抵抗性腫瘤細(xì)胞是指對(duì)于化合物A，根據(jù)上述基準(zhǔn)，只可見腫瘤細(xì)胞的弱的增殖抑制效果的形式的腫瘤細(xì)胞，例如如后述實(shí)施例所示，有腎癌細(xì)胞ACHN。除此之外，腎癌細(xì)胞A498也是化合物A抵抗性腫瘤細(xì)胞的一種。
分別對(duì)分類的感受性腫瘤細(xì)胞以及抵抗性腫瘤細(xì)胞研究其基因表達(dá)模式，進(jìn)一步選擇(i)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，或者(ii)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因(以下將該基因總稱為抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因)，該步驟可以使用本說明書中記載的各技術(shù)以及本領(lǐng)域通常實(shí)施的方法進(jìn)行。從可以一次性分析大量的基因表達(dá)模式的優(yōu)勢(shì)看，優(yōu)選采用基因芯片技術(shù)。
分析腫瘤細(xì)胞中抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因的表達(dá)模式，這成為無需將組蛋白去乙酰化酶抑制劑給予患者，通過體外試驗(yàn)即可預(yù)測(cè)該組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幮У挠辛Φ氖侄?。
本發(fā)明提供預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果的方法，其特征在于在至少一種、優(yōu)選2種以上的腫瘤細(xì)胞中研究抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因的表達(dá)量。
分析基因的表達(dá)模式的方法還可使用本領(lǐng)域通常實(shí)施的方法進(jìn)行。例如可以有如下的順序。
(1)從作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的腫瘤細(xì)胞中提取基因、特別是mRNA或蛋白質(zhì)。
所述步驟可通過通常本領(lǐng)域所采用的方法進(jìn)行，也可以利用包括必要的試劑的試劑盒。由腫瘤細(xì)胞中提取基因或蛋白質(zhì)可以由適當(dāng)匯合的腫瘤細(xì)胞中提取，但由于從在小鼠等動(dòng)物中繼代、再移植、增殖的腫瘤切片可提取更大量，因此優(yōu)選由該腫瘤切片中提取。
(2)使用與特定的基因(或特定的蛋白質(zhì))具有特異性親和性的物質(zhì)檢測(cè)該特定基因(或特定的蛋白質(zhì))的存在。這里，特定的基因(或特定的蛋白質(zhì))是上述可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑藥效預(yù)測(cè)的指標(biāo)的基因或該基因所編碼的蛋白質(zhì)，具體如后述表1-3中例舉的基因。
本發(fā)明中測(cè)定的特定基因(或特定的蛋白質(zhì))即使是一種，測(cè)定也足夠有效，但需要了解更詳細(xì)的抗腫瘤效果時(shí)，優(yōu)選同時(shí)測(cè)定2種或以上的特定的基因(或特定的蛋白質(zhì))。更優(yōu)選對(duì)選自在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因組，或者在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因組的至少各一種的表達(dá)進(jìn)行分析。
對(duì)特定的基因或特定的蛋白質(zhì)具有特異性親和性的物質(zhì)只要具有可檢測(cè)出它們?cè)谶@些實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的表達(dá)程度的靈敏度即可，對(duì)其沒有特別限制。這里，“特異性親和性”是指只與目標(biāo)基因或蛋白質(zhì)雜交或結(jié)合的性質(zhì)。用于檢測(cè)特定的基因的該物質(zhì)有與該基因的全部或部分完全互補(bǔ)的，或者在滿足上述性質(zhì)的范圍內(nèi)含有1至數(shù)個(gè)錯(cuò)配的物質(zhì)。具體有含有該基因的堿基序列的全部或部分以及它們的互補(bǔ)序列的寡或多核苷酸等，可以根據(jù)要檢測(cè)的基因的形態(tài)適當(dāng)選擇。所述物質(zhì)只要具有與該基因的特異性親和性，則對(duì)其來源并沒有特別限定，可以是合成的，也可以從該基因中切取必要的部分、通過常規(guī)方法純化的物質(zhì)。它們還可以用熒光物質(zhì)、酶或放射性同位素等標(biāo)記。用于檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)的該物質(zhì)例如可以是與該蛋白質(zhì)具有特異性親和性的抗體或其片段，其特異性親和性是指通過抗原抗體反應(yīng)，特異性識(shí)別并結(jié)合該蛋白質(zhì)的能力。該抗體或其片段只要是可與該蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的片段即可，并沒有特別限定。可以是多克隆抗體、單克隆抗體及它們的功能性片段的任何一種。這些抗體或其功能性片段可通過通常本領(lǐng)域所進(jìn)行的方法制備。這些抗體或其片段可以通過熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素等標(biāo)記。
由實(shí)驗(yàn)細(xì)胞提取基因、特別是mRNA，以及提取蛋白質(zhì)，可以使用本領(lǐng)域通常實(shí)施的方法，還可適當(dāng)組合實(shí)施。提取mRNA時(shí)，使用與上述特定的基因具有特異性親和性的物質(zhì)，通過RNA印跡、RT-PCR法等本領(lǐng)域通常采用的手法研究其表達(dá)模式。提取蛋白質(zhì)時(shí)，使用與上述特定的蛋白質(zhì)具有特異性親和性的物質(zhì)，通過免疫印跡、蛋白質(zhì)印跡等本領(lǐng)域通常采用的手法研究其表達(dá)模式。
該基因的表達(dá)模式的分析除上述方法之外，從一次可分析大量的基因的表達(dá)模式的優(yōu)勢(shì)考慮，還優(yōu)選采用基因芯片的技術(shù)。
通過分析抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因的表達(dá)模式，可以預(yù)測(cè)參與試驗(yàn)的組蛋白去乙?；敢种苿┦欠駥?duì)參與試驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞有效地顯示抗腫瘤活性。例如，當(dāng)分成在感受性腫瘤細(xì)胞中比在抵抗性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高2倍或以上的基因組(抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因A)和在抵抗性腫瘤細(xì)胞中比在感受性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高2倍或以上的基因組(抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因B)時(shí)，該組蛋白去乙酰化酶抑制劑有望對(duì)抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因A表達(dá)高的腫瘤細(xì)胞和/或抗腫瘤效果預(yù)測(cè)基因B表達(dá)低的腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤效果。
使用基因芯片時(shí)，可以進(jìn)行如下的操作預(yù)測(cè)藥效。
1.從化合物A給藥前的癌癥患者中采集腫瘤組織的一部分。
2.由腫瘤組織提取RNA。
3.由提取的RNA進(jìn)行cDNA的合成、cRNA的合成、cRNA的片段化。
4.通過基因芯片進(jìn)行雜交。
5.洗滌并染色基因芯片，掃描。
6.研究與感受性腫瘤的藥效預(yù)測(cè)候補(bǔ)基因組的表達(dá)圖譜的相同性(*)在分析圖像中，表達(dá)量高的基因(標(biāo)準(zhǔn)化值(normalizeddata)為1或以上)表示為紅，表達(dá)量低的基因(標(biāo)準(zhǔn)化值(normalizeddata)不足1)表示為藍(lán))。
7.判斷為相同性越高的腫瘤其藥效表達(dá)的可能性也越高。
以從患者體內(nèi)臨床采集腫瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞使用時(shí)，可以預(yù)測(cè)反映了每個(gè)患者的個(gè)體特異性的抗腫瘤效果。
本發(fā)明可以提供利用如上所述的評(píng)價(jià)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果的方法，篩選具有腫瘤部位(種類)特異性抗腫瘤活性的組蛋白去乙?；敢种苿┑姆椒?。通過使用作為對(duì)象的來自腫瘤的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用供試的組蛋白去乙?；敢种苿┨幚?，按照上述方法，研究其抗腫瘤效果的有無，由此可判斷各抑制劑的腫瘤部位特異性。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例具體且詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其任何的限定。
實(shí)施例1化合物A感受性腫瘤和化合物A抵抗性腫瘤的評(píng)價(jià)(1)試劑制備稱量必要量的FK228，加入溶劑(10％HCO-60/鹽水)，進(jìn)行超聲波溶解。在實(shí)驗(yàn)開始之前，將陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)紫杉醇溶解于Cremophor EL/乙醇(1∶1)液中，冷藏保存。用時(shí)加入9倍量的生理鹽水稀釋，制成2.4mg/mL(溶劑成分5％Cremophor EL-5％乙醇-90％鹽水)。
(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥物的抗腫瘤試驗(yàn)中，由日本Charles River購(gòu)入BALB/cANnNCrJ-nu/nu小鼠(雄性，6周齡)，經(jīng)一周或以上的馴化飼養(yǎng)后用于試驗(yàn)。小鼠在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝取水和餌料。
(3)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤分別將2～3×107個(gè)人培養(yǎng)腎癌細(xì)胞株1系(ACHN由ATCC獲得)、人培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株1系(PC-3由ATCC獲得)接種到裸鼠皮下，將繁殖的實(shí)體腫瘤繼代3代或以上，用于實(shí)驗(yàn)。
(4)實(shí)驗(yàn)接種和分組將在裸鼠體內(nèi)繼代的實(shí)體腫瘤制成約3mm見方的腫瘤組織切片，接種到小鼠右背部皮下。腫瘤接種后，在腫瘤體積(1/2×長(zhǎng)徑×短徑2)達(dá)到100-300mm3時(shí)，將小鼠進(jìn)行分組，每組6只，使腫瘤分布均勻。
(5)給藥在分組當(dāng)天(第0天)開始給藥。對(duì)于FK228給藥組按照每4天3次(q 4d×3)靜脈內(nèi)給予FK228(3.2和1.8mg/kg)。對(duì)陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)紫杉醇給藥組連續(xù)5天(q d×5)靜脈內(nèi)給予紫杉醇(24mg/kg)。對(duì)于對(duì)照組只給予溶劑(10％HCO-60/鹽水)(q 4d×3)。各給藥液量根據(jù)在給藥日測(cè)定的體重，按照0.1mL/10g體重計(jì)算。FK228的3.2mg/kg/天(q 4d×3)和紫杉醇的24mg/kg/天(q d×5)分別是它們的MTD量。
(6)腫瘤尺寸和體重的測(cè)定從第0天起每周測(cè)定2次腫瘤尺寸(長(zhǎng)徑、短徑)和體重。
(7)抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)腫瘤的增殖程度通過腫瘤增殖率(Relative Tumor Volume)評(píng)價(jià)。以第0天的腫瘤體積為1時(shí)，增殖抑制率以之后的腫瘤體積的相對(duì)比例表示。
結(jié)果如圖1所示。FK228在3.2mg/kg的給藥量下顯示了對(duì)PC-3的強(qiáng)抗腫瘤作用(圖1(a))，但對(duì)ACHN(圖1(b))未顯示抗腫瘤作用。
實(shí)施例2化合物A感受性腫瘤和化合物A抵抗性腫瘤的評(píng)價(jià)<材料·順序>
(1)實(shí)驗(yàn)材料藥物化合物A(FK228)給藥量3.2mg/kg給藥容量10mL/kg溶劑10％HCO-60/鹽水溶液劑型溶液(用時(shí)配置)腫瘤細(xì)胞人前列腺癌PC-3(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠接種部位s.c.)人胃癌SC-6；由財(cái)團(tuán)法人實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所獲得(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠接種部位s.c.)人腎癌ACHN(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠 移植部位s.c.)人腎癌A498；由ATCC獲得(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠 接種部位s.c.)繼代動(dòng)物雄性BALB c/nu/nu(2)順序和結(jié)果按照實(shí)施例1所示的方法，在裸鼠的皮下接種3mm見方的腫瘤切片(人前列腺癌PC-3、人胃癌SC-6、人腎癌ACHN和人腎癌A498)，腫瘤體積大約為100-300mm3(長(zhǎng)徑9mm、短徑8mm)時(shí)，將3.2mg/kg FK228靜脈內(nèi)給藥，此時(shí)的腫瘤增殖抑制率分別為98％、84％、20％和29％。由該結(jié)果可知PC-3和SC-6為化合物A感受性腫瘤，ACHN和A498為化合物A抵抗性腫瘤。
實(shí)施例3通過基因芯片分析化合物A感受性腫瘤和化合物A抵抗性腫瘤的基因表達(dá)模式實(shí)施例2中研究了可確認(rèn)為感受性或抵抗性的腫瘤中的基因表達(dá)模式。
(1)實(shí)驗(yàn)材料腫瘤細(xì)胞人前列腺癌PC-3(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠接種部位s.c.)人胃癌SC-6；由財(cái)團(tuán)法人實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所獲得(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠接種部位s.c.)人腎癌ACHN(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠接種部位s.c.)人腎癌A498；由ATCC獲得(腫瘤切片3mm×3mm×3mm/小鼠接種部位s.c.)繼代動(dòng)物雄性BALB c/nu/nuRNA提取Rneasy Mini Kit(50)(Qiagen)RNase，DNase free water(Life Technologies)DNA合成Superscript Choice System(Life Technologies)Etchachinmate(Nippon gene)T7-(dT)24Primer(Amersham Pharmacia)cRNA合成BioArray RNA Transcript Labeling Kit(AmershamPharmacia)cRNA片段化Trizma Base(SIGMA)冰醋酸(SIGMA)乙酸鎂(SIGMA)乙酸鉀(SIGMA)雜交Eukaryotic Hybridization Control Kit(AmershamPharmacia)0.5M EDTA溶液(SIGMA)MES鈉鹽(SIGMA)
MES游離酸一水合物(SIGMA)鯡魚精DNA(Promega)乙?；Ｑ灏椎鞍兹芤?Life Technologies)使用chip HuGene FL矩陣(Amersham Pharmacia)(2)細(xì)胞制備和RNA提取在裸鼠的皮下接種3mm見方的腫瘤切片(人前列腺癌PC-3、人胃癌SC-6、人腎癌ACHN和人腎癌A498)，在腫瘤體積大約為100～300mm3(長(zhǎng)徑9mm、短徑8mm)時(shí)摘除腫瘤，按照RNeasyMini Kit(50)(Qiagen)的說明提取總RNA。對(duì)RNA進(jìn)行定量，通過電泳確認(rèn)。
(3)cRNA的合成按照基因芯片手冊(cè)第2章～第4章、RNeasy Mini Kit和RNATranscript Labeling Kit手冊(cè)進(jìn)行RNA的純化、cDNA的合成、cRNA的合成、cRNA的片段化。
(4)雜交、洗滌-染色、掃描雜交、洗滌-染色、掃描按照基因芯片手冊(cè)第5章～第7章進(jìn)行。
(5)分析使用GeneSpring(微矩陣數(shù)據(jù)分析軟件)Silicon Genetics社制)進(jìn)行分析。
分析條件如下所示。
分析條件·至少4個(gè)腫瘤細(xì)胞中的一個(gè)腫瘤的原始數(shù)據(jù)為100或以上。
·化合物A感受性腫瘤間或化合物A抵抗性腫瘤間的標(biāo)準(zhǔn)化值之差為2倍以內(nèi)。
·化合物A感受性腫瘤與化合物A抵抗性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)化值之差為2倍或以上。
結(jié)果，得到27個(gè)在化合物A感受性腫瘤中比在化合物A抵抗性腫瘤中表達(dá)量高2倍或以上的基因(表1)，得到49個(gè)在化合物A抵抗性腫瘤中比在化合物A抵抗性腫瘤中表達(dá)量高2倍或以上的基因(表2～3)。
表1在化合物A感受性腫瘤中表達(dá)高，在化合物A抵抗性腫瘤中表達(dá)量低的基因

表2～3在化合物A感受性腫瘤中表達(dá)低、在化合物A抵抗性腫瘤中表達(dá)高的基因表2


表3

工業(yè)實(shí)用性由本發(fā)明的方法得到的可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑的藥效、特別是抗腫瘤效果的指標(biāo)的基因是顯示與組蛋白去乙?；敢种苿┑南嚓P(guān)性及與對(duì)該組蛋白去乙?；敢种苿┑母惺苄曰虻挚剐猿氏嚓P(guān)性的基因，這些基因顯示出可用作組蛋白去乙?；敢种苿┧幮ьA(yù)測(cè)標(biāo)志的可能性。
序列表文字SEQ ID NO.1Xaa是以NH2(CHCH3)COOH表示的氨基酸。
式COOH CH2CH(CHCHC2H4SH)OH的羧基與第一個(gè)氨基酸Val的氨基結(jié)合，羥基與第4個(gè)氨基酸Val的羧基結(jié)合，SH基與第2個(gè)氨基酸Cys的SH基以二硫鍵結(jié)合。
本申請(qǐng)是以在日本申請(qǐng)的特愿2003-041790為基礎(chǔ)，其內(nèi)容全部包含在本說明書中。
序列表<110>藤澤制藥工業(yè)株式會(huì)社<120>預(yù)測(cè)組蛋白去乙酰化酶抑制劑抗腫瘤效果的方法<130>09608<150>JP 2003-041790<151>2003-02-19<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4<212>PRT<213>色素桿菌屬<220>
<221>位點(diǎn)<222>(3)<223>Xaa是分子式為NH2C(CHCH3)COOH的氨基酸<221>位點(diǎn)<222>(1)，(2)，(4)<223>分子式COOHCH2CH(CHCHC2H4SH)OH中的羧基與第一氨基酸纈氨酸的氨基結(jié)合，羥基與第四氨基酸纈氨酸的羧基結(jié)合，SH基通過二硫鍵與第二氨基酸半胱氨酸的SH基結(jié)合。
<400>1Val Cys Xaa Val 權(quán)利要求
1.獲得可作為組蛋白去乙?；敢种苿┧幮ьA(yù)測(cè)的指標(biāo)的基因的方法，該方法至少包含以下步驟①研究體內(nèi)組蛋白去乙?；敢种苿?duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效果，將該腫瘤細(xì)胞分類為對(duì)該組蛋白去乙?；敢种苿┚哂懈惺苄缘募?xì)胞種類(感受性腫瘤細(xì)胞)和具有抵抗性的細(xì)胞種類(抵抗性腫瘤細(xì)胞)的步驟，以及①對(duì)在上述步驟②中分類的感受性腫瘤細(xì)胞和抵抗性腫瘤細(xì)胞分別研究其基因表達(dá)模式，并選擇(i)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，或者(ii)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，組蛋白去乙?；敢种苿┦且韵碌幕瘜W(xué)式(I) 所示化合物或其可藥用的鹽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞來自前列腺癌、胃癌或腎癌。
4.預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果的方法，其特征在于在至少1種腫瘤細(xì)胞中研究權(quán)利要求1的方法得到的至少一個(gè)基因的表達(dá)量。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中組蛋白去乙?；敢种苿┦且韵碌幕瘜W(xué)式(I) 所示化合物或其可藥用的鹽。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中至少一個(gè)基因是在感受性細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因。
7.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中至少一個(gè)基因是在感受性細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因。
8.預(yù)測(cè)組蛋白去乙?；敢种苿┑目鼓[瘤效果的方法，其特征在于在至少1種腫瘤細(xì)胞中研究權(quán)利要求1的方法得到的至少一個(gè)在感受性細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，和至少一個(gè)在感受性細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因的表達(dá)量。
9.如權(quán)利要求4～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，腫瘤細(xì)胞來自前列腺癌、胃癌或腎癌。
全文摘要
本發(fā)明為了提供對(duì)于預(yù)測(cè)組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)需要治療的腫瘤的藥效、特別是對(duì)預(yù)測(cè)抗腫瘤效果有效的基因，本發(fā)明提供獲得可作為組蛋白去乙?；敢种苿┑乃幮ьA(yù)測(cè)的指標(biāo)的基因的方法，該方法至少包含以下步驟①將腫瘤細(xì)胞分類為組蛋白去乙?；敢种苿└惺苄阅[瘤細(xì)胞和抵抗性腫瘤細(xì)胞的步驟，以及②對(duì)感受性腫瘤細(xì)胞和抵抗性腫瘤細(xì)胞分別研究其基因表達(dá)模式，并選擇(i)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低的基因，或者(ii)在感受性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低、在抵抗性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高的基因的步驟。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1777675SQ20048001050
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2004年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者笹川由香, 直江吉?jiǎng)t 申請(qǐng)人:安斯泰來制藥有限公司