專利名稱：用脂肪組織來源的細胞治療心血管疾病的方法
相關申請本申請要求標題為“用脂肪組織來源的細胞治療心血管疾病的方法”的2003年2月20日申請的美國臨時申請?zhí)?0/449,279和標題為“用脂肪組織來源的細胞治療心血管疾病的方法”的2003年4月15日申請的美國臨時申請?zhí)?0/462,911的優(yōu)先權。將前述申請的內容明確并入本文作為參考。
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明一般涉及來源于脂肪組織的細胞，更具體地，涉及脂肪來源的干細胞和祖細胞(progenitor cell)，涉及使用脂肪來源的干細胞和祖細胞的方法，涉及含有脂肪來源的干細胞和祖細胞的組合物，和用于制備和使用脂肪來源的干細胞和祖細胞的系統(tǒng)，所述脂肪來源的干細胞和祖細胞用于治療心血管疾病和病癥。
2.相關文獻描述心血管疾病和病癥是所有工業(yè)化國家中死亡和勞動能力喪失的主要原因。僅在美國，心血管疾病就占死亡率的約40％，并侵襲5800萬美國人(美國心臟協(xié)會，2002)。使得心血管疾病尤其具有破壞性的主要因素之一是心臟損失后不能自身修復。因為心肌細胞，即心肌細胞不能分裂和在受損部位重新增殖，由于損傷或者疾病導致的心臟細胞損失很大程度上是不可逆的(Abbate等人，2002；Remme，2000)。
在可以利用的治療形式中，人到人的心臟移植在治療嚴重心血管疾病和病癥中最有效。實際上，普通心臟移植受體的一年和五年生存率在當前為70％。然而，當前，由于許多原因，移植是嚴重受限的形式，所述原因即適宜供體的缺乏、該方法的花費和很可能產生移植物排斥和相關問題，如感染、腎功能異常和免疫抑制劑相關的癌(美國心臟協(xié)會，2002)。
移植療法的備選方案是使用再生藥物修復和再生受損的心肌細胞。再生性藥物以臨床靶定的方式控制干細胞(即機體的未特化的主細胞(master cell))自身無限地更新和發(fā)育成成熟的特化細胞。在發(fā)育早期的胚胎、胎兒組織和某些成年器官和組織中發(fā)現(xiàn)干細胞(Pera等人，2000)。已知胚胎干細胞(下文中稱作“ESCs”)變成身體的許多(如果不是所有)細胞和組織類型。ESCs不僅含有個體的所有遺傳信息而且還含有變成身體的200+細胞和組織的任一種的新生能力。從而，這些細胞具有作為再生藥物的巨大潛力。例如，ESCs可以生長成特定組織，如心臟、肺或者腎，然后它們可以用于修復受損和患病的器官(Assady等人，2001；Jacobson等人，2001；Odorico等人，2001)。然而，ESC來源的組織具有臨床局限。因為ESCs必須來源于另一個個體，即，胚胎，所以存在受體的免疫系統(tǒng)排斥新的生物物質的危險。盡管可以利用防止這種排斥的免疫移植藥物，但是公知這些藥物阻斷所希望的免疫應答，如針對細菌感染和病毒的免疫應答。此外，對ESCs來源，即胚胎的倫理上的爭論由來已久并造成了額外的，可能是可預見的將來不可克服的障礙。
成年人干細胞(下文中可互換稱作“ASCs”)代表使用ESCs的備選方案。ASCs靜止地存在于許多非胚胎組織中，可能等待應答外傷或者其他破壞性疾病過程從而它們可以治療受傷的組織(Arvidsson等人，2002；Bonner-Weir和Sharma，2002；Clarke和Frisen，2001；Crosby和Strain，2001；Jiang等人，2002a)。值得注意地，不斷出現(xiàn)的科學證據(jù)表明每個個體攜帶ASCs庫，其與ESCs都具有變成許多(如果不是所有)細胞和組織類型的能力(Young等人，2001；Jiang等人，2002a；Jiang等人，2002b；Schwartz等人，2002)。從而，ASCs，像ESCs具有再生藥物的臨床應用的巨大潛力。
已經表明ASC群體存在于骨髓、皮膚、肌肉、肝臟和腦的一種或多種中(Jiang等人，2002b；Alison，1998；Crosby和Strain，2001)。然而，這些組織中ASCs的頻率很低。例如，估計骨髓中間充質干細胞頻率為100,000個有核細胞中一個到1,000,000個有核細胞中一個(D＇Ippolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993)。類似地，從皮膚摘除ASCs包括數(shù)周內一系列復雜細胞培養(yǎng)步驟(Toma等人，2001)并且骨骼肌來源的ASCs的臨床應用需要兩到三周培養(yǎng)期(Hagege等人，2003)。從而，來自這些組織的ASCs的任何提出的臨床應用需要通過細胞純化和細胞培養(yǎng)方法增加細胞數(shù)、純度和成熟。
盡管細胞培養(yǎng)步驟可以提供增加的細胞數(shù)、純度和成熟，但是需要付出代價。該代價包括下面的技術困難之一或多個由于細胞老化喪失細胞功能、可能有用的非干細胞群體的損失、細胞可能應用于患者的延遲、金錢花費增加，和培養(yǎng)期間細胞受到環(huán)境微生物污染的危險增加。最近檢查骨髓來源的ASCs的治療效果的研究使用基本上完整骨髓以克服與細胞培養(yǎng)有關的問題(Horwitz等人，2001；Orlic等人，2001；Stamm等人，2003；Strauer等人，2002)。然而，臨床益處是次最佳的，并且結果幾乎無疑與有限的ASC劑量和骨髓中內在可利用的純度有關。
最近，已經證明脂肪組織是ASCs的來源之一(Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。不像骨髓、皮膚、肌肉、肝臟和腦，脂肪組織相當容易以相對大量收獲(Commons等人，2001；Katz等人，2001b)。此外，已經表明脂肪來源的ASCs具有在體外產生多種組織，包括骨髓、脂肪、軟骨和肌肉的能力(Ashjian等人，2003；Mizuno等人，2002；Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。從而，脂肪組織給出了用于再生藥物中的ASCs的最佳來源。然而，本領域中缺少收獲脂肪來源的ASCs的適宜方法?，F(xiàn)有方法具有許多缺點。例如，現(xiàn)有方法不能最適地容納用于除去脂肪組織的吸出裝置?，F(xiàn)有方法還缺少從脂肪組織收獲期到組織加工期的部分或完全自動化(Katz等人，2001a)?，F(xiàn)有方法還缺少大于100ml脂肪組織的容量?，F(xiàn)有方法還缺少從脂肪組織收獲期到組織加工期的部分或全部密閉系統(tǒng)。最后，現(xiàn)有方法缺少組分處理能力以減小一個樣品與另一個樣品的物質的交叉污染的伴隨危險?？傊?，從脂肪組織收獲ASCs的現(xiàn)有技術方法沒有克服與從上述皮膚、肌肉、肝臟和腦收獲ASCs相關的技術困難。
因此，考慮到ASCs的巨大的治療潛力，本領域中迫切需要從產生ASCs群體的脂肪組織以高產率、一致性和/或純度收獲ASCs并且快速而可靠地收獲并且對摘除后操作的需要減小或者不存在的裝置、細胞或者方法。理想地，這種裝置、系統(tǒng)或者方法將以適于直接置于受體的方式產生ASCs。這種裝置、系統(tǒng)或方法的獲得以及使用脂肪來源的ASCs治療心血管疾病和病癥的方法和組合物將對這些疾病的治療產生巨大變化。考慮到心血管疾病的普遍和當前治療選擇的不足，迫切需要這種治療。
發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于如下發(fā)現(xiàn)脂肪來源的成年人干細胞可用于治療心血管病癥、疾病和失調。本發(fā)明還基于發(fā)現(xiàn)用于制備脂肪來源的成年干細胞和祖細胞的裝置、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明還基于發(fā)現(xiàn)脂肪來源的成年干細胞和祖細胞用于治療心血管病癥、疾病和失調的方法和組合物。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及使用來源于脂肪組織的細胞的組合物、方法和系統(tǒng)，所述細胞與促進、產生或者支持治療心血管益處所需的添加劑一起直接置于受體中。
在一個實施方案中，在保持密閉的、無菌流體/組織途徑的系統(tǒng)中發(fā)生脂肪組織處理。這通過使用預先裝配、連接的一組密閉無菌容器和允許組織和流體成分在密閉途徑中轉移的管道來實現(xiàn)。該處理設備可以與插入裝置中的一系列處理試劑(例如，鹽水、酶，等等)連通，所述裝置可以控制試劑的加入、溫度，和處理時間選擇，從而減輕操作人員手動操作該過程的需要。在優(yōu)選實施方案中，從組織切除到加工到置于接受者體內的整個方法將都在相同設施中進行，甚至在經歷該方法的患者的相同室內進行。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，處理粗制脂肪組織以基本上除去成熟的脂肪細胞和結締組織從而得到適于放置于接受者體內的許多異質脂肪組織來源的細胞。所述細胞可以與其他細胞、組織、組織碎片，或者細胞生長和/或分化的其他刺激劑聯(lián)合置于接受體體內。在優(yōu)選實施方案中，所述細胞與任何上面提到的添加劑以單一操作方法置于這些細胞所來源的人體中，目的是使該接受者得到治療益處。
在一個實施方案中，治療患者的方法包括步驟a)提供組織除去系統(tǒng)；b)使用所述組織除去系統(tǒng)從患者除去脂肪組織，脂肪組織具有濃縮干細胞；c)處理至少一部分所述脂肪組織以得到與處理前脂肪組織的干細胞濃度不同的干細胞濃度；和d)使用本領域普通技術人員公知的幾種方法，包括但不限于，靜脈內、冠狀動脈內和心內膜心肌內方法對患者施用干細胞和祖細胞而在施用于該患者前不從組織除去系統(tǒng)除去干細胞和祖細胞。
按照本文中公開的方法的系統(tǒng)包括a)組織收集容器，其包括i)組織收集入口，其經構造以收集從患者除去的脂肪組織；和ii)濾器，其置于容器內并且經構造以保留從患者除去的脂肪組織并使從患者除去的非脂肪組織通過；b)混合容器，其與組織收集容器配合以接收從脂肪組織得到的干細胞而不除去來自組織除去系統(tǒng)的干細胞，并且包括添加劑口，其用于施用至少一種添加劑以與其中包含的干細胞混合；和c)出口，其經構造以允許混合容器中的細胞從組織收集系統(tǒng)除去以施用于患者。
文中描述的任何特征或者特征的組合都包括在本發(fā)明的范圍內，條件是根據(jù)上下文、該說明書和本領域中普通技術人員的知識，任何此類組合中包括的特征不相互矛盾。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點在如下詳述中更明顯。
附圖簡述

圖1描繪了處理脂肪組織的組織除去系統(tǒng)。
圖2描繪了圖1的組織除去系統(tǒng)的組織收集容器。
圖3是圖2的組織收集容器的部分橫斷面視圖。
圖4描繪了用于自動化組織除去系統(tǒng)的操作的處理裝置。
圖5A和5B描繪了培養(yǎng)的脂肪來源的干細胞的VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白質的表達。
圖6描繪了脂肪來源的干細胞群體內內皮祖細胞的檢測。
圖7A和7B描繪了正常(7A)和鏈脲佐菌素處理的(7B)小鼠脈管結構的體外發(fā)育。
圖8描繪了與陰性對照比較脂肪來源的干細胞處理的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢復的增加。
圖9A和9B表明增加脂肪來源的干細胞劑量提高移植存活和血管發(fā)生(9A)并描繪了組織樣品中脂肪組織構造的保持。
圖10描繪了梗死的心肌區(qū)域中來自供體的脂肪來源的干細胞移植的組織學時間線(timeline)。
圖11描繪了β-半乳糖苷酶和肌球蛋白重鏈的雙陽性染色。高亮細胞都顯示出藍色β半乳糖苷酶染色，表明它們來源于供體脂肪組織細胞，褐色染色表明心肌蛋白肌球蛋白重鏈的表達。顯示出褐色和藍色染色的細胞(如通過箭頭指出)是呈現(xiàn)出心肌細胞表型的脂肪組織來源的細胞。
圖12描繪了大鼠中阻塞/再灌注損傷后梗死的心肌區(qū)域中來自供體的脂肪來源的干細胞群。
發(fā)明詳述本發(fā)明首次提供了使用脂肪來源的干細胞和祖細胞治療心血管病癥、疾病和失調的經證明的方法。具體地，本發(fā)明第一次闡明本發(fā)明的脂肪來源的干細胞和祖細胞(1)表達血管生成和動脈發(fā)生生長因子，包括胎盤生長因子(PIGF)和血管內皮生長因子(VEGF)，(2)含有在血管形成中具有明確功能的內皮祖細胞(EPC)，(3)在體外發(fā)育成血管，(4)支持體內局部缺血組織生存，(5)誘導后肢的阻塞/再灌注損傷后的再灌注，(6)當心臟損傷后注射到動物時歸巢到心臟，和(7)當心臟損傷后注射到動物時分化成細胞，所述細胞表達與它們分化成心肌細胞相一致的標記。因此，本公開確實闡明本發(fā)明的脂肪來源的干細胞和祖細胞可用于治療心血管疾病和病癥。
為了更易理解本發(fā)明，首先定義某些術語。其他定義在詳細描述全文中給出。
文中所用術語“脂肪組織”指含有多種細胞類型，包括脂肪細胞和微血管細胞的組織。脂肪組織包括干細胞和內皮前體細胞。因此，脂肪組織指脂肪，其包括儲存脂肪的結締組織。
文中所用術語“脂肪組織單位”指脂肪組織的離散的或者可測量的量。脂肪組織單位可以通過測定該單位的重量和/或體積來測量?；谏厦骅b定的數(shù)據(jù)，從患者除去的一單位處理的吸脂物(lipoaspirate)具有細胞組分，其中至少0.1％細胞組分是干細胞。關于本文公開，一單位脂肪組織可以指從患者除去的脂肪組織的全部量，或者小于從患者除去的脂肪組織的全部量的量。從而，一單位脂肪組織可以與另一單位脂肪組織聯(lián)合形成一單位脂肪組織，其具有個體單位總和的重量或者體積。
文中所用術語“部分”指小于全部的物質量。小部分指小于50％的量，大部分指大于50％的量。從而，小于從患者除去的脂肪組織全部量的一單位脂肪組織為所除去的脂肪組織的一部分。
文中所用術語“干細胞”指具有分化成多種其他細胞類型的潛力的多能細胞，其執(zhí)行一種或多種特定功能并能夠自我更新。文中公開的一些干細胞可以是多能的。
文中所用術語“祖細胞”指能夠分化成一種或多種細胞類型的單能、雙能或者多能細胞，其執(zhí)行一種或多種特定功能具有有限的自我更新能力或者無自我更新能力。文中公開的一些祖細胞可以是多能的。
文中所用“干細胞數(shù)”或者“干細胞頻率”指產克隆測定中觀察到的集落數(shù)，所述測定中將脂肪來源的細胞(ADC)以低細胞密度(＜10,000個細胞/孔)接種并在支持MSC生長的生長培養(yǎng)基(例如，DMEM/F12培養(yǎng)基，補加10％胎牛血清、5％馬血清，和抗生素/抗真菌劑)中生長。細胞生長2周后將培養(yǎng)物用蘇木精染色并將大于50個細胞的集落計數(shù)為CFU-F。干細胞頻率計算為從所接種的每100個有核細胞所觀察到的CFU-F數(shù)(例如，在以1,000個有核ADC細胞開始的平板中計數(shù)的15個集落得到干細胞頻率為1.5％)。干細胞數(shù)計算為干細胞頻率乘以所得有核ADC細胞的總數(shù)。從ADC細胞生長的高百分數(shù)(～100％)的CFU-F表達細胞表面分子CD105，骨髓來源的干細胞也表達CD105(Barry等人，1999)。脂肪組織來源的干細胞也表達CD105(Zuk等人，2002)。
文中所用術語“處理的吸脂物”指脂肪組織，其已經經處理以將活性細胞組分(例如，含有干細胞和祖細胞的組分)與成熟脂肪細胞和結締組織分離。該級分在文中稱作“脂肪來源的細胞”或者“ADC”。通常，ADC指通過洗滌和從脂肪組織分離細胞得到的細胞沉淀。該沉淀通常通過離心細胞得到，通過離心，細胞聚集在離心容器的底部。
文中所用短語“心血管病癥、疾病或失調”旨在包括特征為不足的、不希望的或者異常的心臟功能的所有失調，包括局部缺血性心臟病、高血壓心臟病和肺部高血壓心臟病、瓣膜疾病、先天性心臟病和導致受試者中，尤其人類受試者中充血性心力衰竭的任何病癥。不足的或異常的心臟功能可以由疾病、損傷和/或老化導致。作為背景，對心肌損傷的應答按照確定的途徑，其中一些細胞死亡而其他細胞進入休眠狀態(tài)，其中它們還沒有死亡但是功能異常。接著是炎癥細胞的滲入、膠原作為疤痕部分沉積，所有這些都與新血管的向內生長和一定程度的持續(xù)細胞死亡平行發(fā)生。文中所用術語“局部缺血”指由于血流減少而引起的任何局部化的組織局部缺血。術語“心肌局部缺血”指冠狀動脈粥樣硬化和/或心肌的供氧不足導致的循環(huán)紊亂。例如，急性心肌梗死代表對心肌組織的不可逆的局部損害。高損害來自于冠狀循環(huán)中的阻塞(例如，血栓形成或栓塞)事件并產生這樣的環(huán)境，其中心肌代謝需要量超過對心肌組織的供氧。
文中所用術語“血管發(fā)生”指從現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)和組織產生新血管的過程(Folkman，1995)。短語“修復或者重建”指現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的改造。組織局部缺血的減輕嚴重依賴于血管發(fā)生。新血管的自發(fā)生長提供了局部缺血區(qū)域內和周圍的側支循環(huán)，提高了血流，和減輕了局部缺血導致的癥狀。文中所用術語“血管發(fā)生因子”或者“血管發(fā)生蛋白”指能夠從現(xiàn)有脈管系統(tǒng)生長新血管(“血管發(fā)生”)的任何公知的蛋白質。用于本發(fā)明的適宜的血管發(fā)生因子包括，但不限于，胎盤生長因子(Luttun等人，2002)、巨噬細胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Buschmann等人，2003)、血管內皮生長因子(VEGF)-A，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(Mints等人，2002)、神經氈蛋白(Wang等人，2003)、成纖維細胞生長因子(FGF)-1，F(xiàn)GF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6(Botta等人，2000)，Angiopoietin 1、Angiopoietin 2(Sundberg等人，2002)、紅細胞生成素(Ribatti等人，2003)、BMP-2、BMP-4、BMP-7(Carano和Filvaroff，2003)、TGF-β(Xiong等人，2002)、IGF-1(Shigematsu等人，1999)、骨橋蛋白(Asou等人，2001)、多效營養(yǎng)因子(Beecken等人，2000)、激活蛋白(Lamouille等人，2002)、內皮素-1(Bagnato和Spinella，2003)和它們的聯(lián)合。血管發(fā)生因子可以獨立地或者相互聯(lián)合作用。當聯(lián)合時，血管發(fā)生因子可以協(xié)同作用，從而因子的聯(lián)合效果大于單獨采取的各自因子效果的總和。術語“血管發(fā)生因子”或者“血管發(fā)生蛋白”還包括這些因子的功能類似物。功能類似物包括，例如，因子的功能部分。功能類似物還包括抗獨特型抗體，其結合所述因子的受體，從而模擬所述因子的活性以促進血管發(fā)生和/或組織重建。產生這些抗獨特型抗體的方法是本領域中熟知的并且在例如WO 97/23510中描述，將WO 97/23510的內容完整并入本文作為參考。
用于本發(fā)明的血管發(fā)生因子可以從任何適宜的來源產生或者得到。例如，所述因子可以從它們的天然來源純化，或者合成產生或者重組表達產生。所述因子可以作為蛋白質組合物施用于患者。備選地，所述因子可以以編碼該因子的表達質粒的形式施用。適宜的表達質粒的構建是本領域中熟知的。用于構建表達質粒的適宜的載體包括，例如，腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、RNA載體、脂質體、陽離子脂質、慢病毒載體和轉座子。
文中所用術語“動脈發(fā)生”指增強側枝動脈和/或來自現(xiàn)有小動脈連接的其他動脈的生長的過程(Carmeliet，2000；Scholz等人，2001；Scholz等人，2002)。更具體地，動脈發(fā)生是通過來自現(xiàn)有小動脈連接的內皮和平滑肌細胞的增殖原位募集和擴增動脈，從而為局部缺血組織、腫瘤或者炎癥部位提供血液。這些血管大部分生長在受影響的組織外部并且對于將營養(yǎng)物向局部缺血區(qū)域、腫瘤或者炎癥部位的遞送是重要的。動脈發(fā)生是對心肌局部缺血的正常應答的一部分(Mills等人，2000；Monteiro等人，2003)。此外，冠狀動脈旁路移植(CABG)的常規(guī)手術技術實際上不過是產生動脈側枝血管(Sergeant等人，1997)。從而，梗死后增強血管發(fā)生的方法將提高到達局部缺血組織的血流，導致細胞死亡減少和梗死尺寸減小。這些提高將導致改善的心臟功能和治療益處。
文中所用術語“治療”包括減少或者減輕心血管病癥、疾病或者失調的至少一種不利影響和癥狀，所述心血管病癥、疾病或者失調即特征是不足的或者不希望的心臟功能的任何失調。心臟失調的不利影響或者癥狀是本領域中熟知的并且包括，但不限于，呼吸困難、胸痛、心悸、眩暈、syncope、水腫、發(fā)紺、蒼白、疲勞和死亡。
文中所用術語“施用”、“導入”和“移植”在本文中可以互換使用并且指通過方法和途徑將本發(fā)明的ADC置入受試者中，所述置入導致ADC至少部分定位在所希望的部位?？梢酝ㄟ^任何適宜的途徑施用ADC，所述途徑導致遞送到受試者中所希望的位置，在此處至少部分細胞或者細胞組分保持存活。對受試者施用細胞后存活期可以短至幾小時，例如，24小時，到幾天，到長達數(shù)年。
文中所用術語“受試者”包括溫血動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人。在優(yōu)選實施方案中，受試者為靈長類。在更優(yōu)選實施方案中，受試者為人。
現(xiàn)在將涉及本發(fā)明的當前優(yōu)選的實施方案，它們的實例在附圖中闡明?？赡軙r，在附圖中使用相同和類似的參考號，并且描述指相同和相似的部分。應該注意附圖為簡化形式并且不是精確比例。關于本文的公開，僅為了方便和清楚，關于附圖使用方向術語，如頂部、底部、左、右、上、下、上方、上面、下方、下面、后面，和前面。不應將這些方向術語理解為以任何方式限制本發(fā)明范圍。
盡管文中的公開涉及某些闡明的實施方案，但是應該理解這些實施方案作為實例給出并且不作為限制。下面詳細描述的目的(盡管討論代表性實施方案)將被理解為覆蓋這些實施方案的所有修飾、備選方案，和等價方案，它們都在所附權利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍內。本發(fā)明可以與本領域中慣用的多種細胞和組織分離技術結合實施，并且文中包括的這些常用的方法步驟僅僅用于幫助對本發(fā)明的理解。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及存在于脂肪組織中的細胞群體，和對人或者動物患者施用細胞群體以治療心血管疾病和病癥的系統(tǒng)和方法。脂肪組織的細胞群體可以用作治療應用的細胞來源。其中，所述細胞可用于再生性藥物，如可以用再生性細胞治療的疾病，包括心血管疾病和病癥。可以將該群體的細胞施用于患有心血管疾病和病癥的患者而不使用其他脂肪細胞和結締組織。
具體地，本發(fā)明涉及脂肪組織來源的細胞和使用所述細胞的方法，所述細胞的若干性質可以有助于最小化損傷和促進心肌修復和該修復過程中的再生。這些性質包括能夠合成和分泌刺激新血管形成的生長因子；能夠合成和分泌刺激細胞存活和增殖的生長因子；能夠增殖和分化成直接參與新血管形成的細胞；能夠植入受損的心肌和抑制疤痕形成(膠原沉積和交聯(lián))；能夠增殖和分化成能夠促進心肌收縮性的肌細胞；和能夠增殖和分化成心肌細胞。
I.發(fā)明方法1.得到經處理的吸脂物(ADC)的方法已經發(fā)現(xiàn)脂肪組織是干細胞和祖細胞的尤其豐富的來源。該發(fā)現(xiàn)至少部分是由于容易除去脂肪組織的主要非干細胞組分——脂肪細胞。從而，在人和動物研究中，所處理的吸脂物(ADC)含有干細胞，其頻率為至少0.1％，更通常大于0.5％。在本發(fā)明的某些實施方案中，已經得到了含有約2-12％干細胞的ADC。在其他實施方案中，處理ADC以得到細胞群體，其中干細胞構成該群體中高達100％的細胞。根據(jù)文中公開的本發(fā)明所得的干細胞的純度/頻率遠大于公開的頻率骨髓中1/100,000(0.001％)(DTppolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993；Muschler等人，2001)。此外，與收集脂肪組織的相關的發(fā)病率比收集相同體積的骨髓的相關的發(fā)病率低(Nishimori等人，2002)。此外，脂肪組織含有內皮前體細胞，其能夠為患者提供治療(見(Asahara等人，1999；Causal等人，2001；Kawamoto等人，2003；Kawamoto等人，2001))。
在實施文中公開的方法中，施用于患者的細胞從脂肪組織得到。本領域普通技術人員可以通過任意方法得到脂肪組織。例如，通過抽吸輔助的脂肪整復(lipoplasty)、超聲輔助的脂肪整復、和脂肪切除術可以從患者除去脂肪組織。此外，該方法可以包括這些方法的聯(lián)合，如聯(lián)合脂肪切除術和抽吸輔助的脂肪整復。由于所述組織或者其部分將重新植入患者體內，所以應該以某種方式收集脂肪組織使得保持細胞組分的生存力和最小化潛在感染性生物，如細菌和/或病毒污染該組織的可能性。從而，應該以無菌的方式實施組織切除以最小化污染。抽吸輔助的脂肪整復是從患者除去脂肪組織的所希望的方法，因為其提供了收集組織的最小侵入性方法，干細胞損害的可能性最小，其他技術，如超聲輔助的脂肪整復可以伴隨著所述損害。
關于抽吸輔助的脂肪整復方法，通過將插管插入到患者中存在的脂肪組織庫中或附近然后將脂肪抽吸到抽吸裝置中收集脂肪組織。在一個實施方案中，小插管可以連接到注射器，可以手工抽吸脂肪組織(Asken，1990)。對收獲相對適量的脂肪組織(例如，0.1ml到數(shù)百毫升脂肪組織)，使用注射器或者其他類似裝置是所希望的。使用這些相對小的裝置的方法的優(yōu)點是相對于全身麻醉，可以僅通過局部麻醉實施所述方法。高于該范圍(例如，大于數(shù)百毫升)的更大體積脂肪組織可能需要由供體和實施收集方法的人斟酌使用全身麻醉。當希望除去更大體積的脂肪組織時，在該方法中可以使用相對更大的插管和自動化抽吸裝置。
脂肪切除術方法包括，但不限于，其中除去含有脂肪組織的組織(例如，皮膚)作為該方法的附帶部分，即，手術的主要目的是除去組織(例如，肥胖治療或者整容手術中皮膚)的方法，并且其中脂肪組織與主要感興趣的組織一起除去。
將從患者除去的脂肪組織收集到裝置中進行進一步處理。如文中討論的，在一個實施方案中，該裝置經設計并致力于收集用于生產處理的脂肪組織細胞群體的目的，所述細胞群體包括干細胞和/或內皮前體細胞。在其他實施方案中，該裝置可以是醫(yī)生實施抽提方法常用于組織收集的任何常規(guī)裝置。
所收集的組織的量將取決于許多變量，包括，但不限于，供體的身體質量指數(shù)(body mass index)、可接近的脂肪組織收獲部位的可用性、相伴或者預先存在的藥物治療和狀況(如抗凝血療法)、和所收集的組織的臨床目的。造血干細胞(用于再生受體的血細胞形成能力的骨髓或者臍帶血來源的干細胞)的移植經驗表明植入是具有閾值效應的依賴細胞劑量的(Smith和Sweetenham，1995；Barker等人，2001)。從而，可能“越多越好”的一般原理將應用于其他變量設置的極限內并且可能時所述收獲將收集盡可能多的組織。
已經發(fā)現(xiàn)從瘦的個體提取的100ml脂肪組織的干細胞百分數(shù)大于從肥胖供體提取的100ml脂肪組織的干細胞百分數(shù)(表1)。這反映肥胖個體中增加的脂肪含量的稀釋效應。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，從超重供體得到的脂肪量大于從較瘦患者提取的脂肪量。該觀察還表明本發(fā)明的效用不限于具有大量脂肪組織的個體。
表1身體質量指數(shù)對組織和細胞產率的影響
濃縮的干細胞可以在組合物中使用，所述組合物含有脂肪來源的干細胞和/或內皮前體細胞，基本上無成熟脂肪細胞和結締組織。在某些實施方案中，該組合物含有細胞組分，其中至少0.1％的細胞是干細胞。在其他實施方案中，該組合物含有細胞組分，其中干細胞占細胞組分的約2％到12％。不同組合物中還包括更高的干細胞濃度，如高達100％。該組合物可以包括額外的組分，如細胞分化因子、生長促進劑、免疫抑制劑，或者醫(yī)學裝置，如文中所討論。為了得到某些組合物，其中該組合物主要含有一種類型的細胞(例如，脂肪來源的干細胞或者脂肪來源的內皮前體細胞)，可以使用用于制備不同細胞類型的任何適宜的方法，如使用細胞特異抗體，其識別和結合存在于干細胞或者內皮前體細胞上的抗原。
對于多數(shù)應用，活性細胞群體的制備將需要耗竭脂肪組織的成熟的負荷脂肪的脂肪細胞組分。這通常通過一系列洗滌和解聚步驟實現(xiàn)，其中首先洗滌組織以減少游離脂質(從破碎的脂肪細胞釋放)和外周血成分(組織收獲期間從切斷的血管釋放)的存在，然后解聚以從結締組織基質釋放完整的脂肪細胞和其他細胞群體。在某些實施方案中，完整脂肪細胞組分或者非干細胞組分與脂肪組織的干細胞組分分離。在其他實施方案中，僅一部分或幾部分脂肪細胞組分與干細胞分離。從而，在某些實施方案中，干細胞可以與內皮前體細胞一起施用。
洗滌是任選的但是優(yōu)選的步驟，其中組織與溶液混合以洗除游離脂質和單一細胞組分，如血液中的那些組分，留下完整的脂肪組織碎片。在一個實施方案中，將從患者除去的脂肪組織與等滲鹽水或者其他生理溶液(例如，Baxter Inc.的Plasmalyte或者Abbott Labs的Normoso)混合。通過本領域中普通技術人員公知的任一方法，包括，但不限于，過濾、倒出、沉降或者離心，可以將完整脂肪組織碎片與游離脂類和細胞分離。在本發(fā)明的所闡明的實施方案中，通過使用如文中討論的組織收集容器內放置的濾器將脂肪組織與非脂肪組織分離。在其他實施方案中，用組織收集容器分離脂肪組織與非脂肪組織，所述容器利用倒出、沉降和/或離心技術分離物質。
然后用任意常規(guī)的技術或者方法解聚完整組織碎片，所述技術或方法包括機械力(切碎或剪切力)、使用一種或者組合蛋白質水解酶，如膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、釋放酶H1或者如美國專利號5,952,215中公開的Blendzyme家族的成員，和胃蛋白酶的酶消化，或者機械和酶促方法的聯(lián)合。例如，通過使用膠原酶介導的脂肪組織解離的方法可以解聚完整組織碎片的細胞組分，所述方法類似于如美國專利號5,372,945中公開的用于收集脂肪組織中微血管內皮細胞的方法。可用于實施本發(fā)明的使用膠原酶的其他方法在美國專利號5,830,714和5,952,215中，和由Williams等人，1995(Williams等人，1995)公開。類似地，如(Twentyman和Yuhas，1980)中公開的，可以使用中性蛋白酶代替膠原酶。此外，方法可以使用酶的聯(lián)合，如膠原酶和胰蛋白酶的聯(lián)合，如(Russell等人，1976)中公開；或者酶(如胰蛋白酶)和機械解離的聯(lián)合，如(Engelholm等人，1985)中公開。
通過減少成熟脂肪細胞的存在可以從解聚的組織碎片得到活性細胞群體(經處理的吸脂物)。然后經處理的吸脂物與脂肪組織在其中解聚的液體的懸浮液穿過另一容器，如細胞收集容器。該懸浮液可以流過一個或多個管道到達細胞收集容器，這可以通過使用泵，如蠕動泵，從組織收集容器抽取懸浮液并將其泵入細胞收集容器中。其他實施方案可以使用重力或者真空，同時保持密閉系統(tǒng)。懸浮液中細胞的分離可以通過浮力密度沉降、離心、淘析、過濾、差別粘附并從固相部分洗脫、抗體介導的選擇、電荷的差異、免疫磁珠、熒光激活細胞分類術(FACS)、或者其他方法實現(xiàn)。這多種技術和實施這些技術的裝置的實例可以在(Hemstreet等人，1980；Schweitzer等人，1995；Gryn等人，2002；Prince等人，2002；Watts等人，2002；Mainwaring和Rowley，1985；Greenberg和Hammer，2001)和美國專利號6,277,060；6,221,315；6,043,066；6,451,207；5,641,622；和6,251,295中發(fā)現(xiàn)。
在所闡明的實施方案中，使用旋轉膜濾器將懸浮液中的細胞與懸浮液的非細胞組分分離。在其他實施方案中，使用離心將懸浮液中的細胞與非細胞組分分離。在一個此類代表性實施方案中，細胞收集容器可以是彈性包，其經構造置于離心機(例如，手工或者通過機器人)中。在其他實施方案中，不使用彈性包。離心后，細胞組分形成沉淀，可以將其用緩沖液重懸浮從而細胞可以穿過一個或多個管道到達本文中討論的混合容器?？梢酝ㄟ^任何適宜的方法提供懸浮液。例如，可以將緩沖液注射到細胞收集容器上的孔，或者細胞收集容器可以包括緩沖液儲備物，通過破裂該儲備物可以將緩沖液與細胞沉淀混合。當使用旋轉膜濾器時，重懸浮是任選的，因為分離步驟后細胞保持在液體體積中。
盡管本發(fā)明的某些實施方案涉及完全解離脂肪組織以分離活性細胞與成熟脂肪細胞和結締組織的方法，但是本發(fā)明的其他實施方案涉及其中脂肪組織僅部分解離的方法。例如，可以用一種或多種酶實施部分解離，相對于保持在脂肪組織以完全解離該組織的酶，用于部分解離的所述酶從至少一部分脂肪組織較早除去。這種方法需要較少的處理時間。
在一個具體實施方案中，將組織用無菌緩沖的等滲鹽水洗滌并與膠原酶在一定的膠原酶濃度、溫度下孵育并孵育足夠時間以提供足夠解離。在優(yōu)選實施方案中，所用的膠原酶將由相關當局(例如，美國食品和藥物管理局)批準用于人。適宜的膠原酶制劑包括重組和非重組膠原酶?？梢詮腇.Hoffmann-La Roche Ltd，Indianapolis，IN和/或Advance Biofactures Corp.，Lynbrook，NY得到非重組膠原酶?？梢匀缑绹鴮＠?,475,764公開的得到重組膠原酶。
在一個實施方案中，溶液含有濃度為約10μg/ml到約50μg/ml的膠原酶并在約30℃到約38℃孵育約20分鐘到約60分鐘。這些參數(shù)將隨著膠原酶的來源而變，通過經驗研究優(yōu)化，以便證明該系統(tǒng)可以以適宜的時間時限有效提取所希望的細胞群體。尤其優(yōu)選的濃度、時間和溫度為20μg/ml膠原酶(與中性蛋白酶分散酶；Blendzyme 1，Roche)在37℃下孵育45分鐘。備選的優(yōu)選實施方案應用0.5單位/mL膠原酶(與中性蛋白酶嗜熱菌蛋白酶；Blendzyme 3混合)。在尤其優(yōu)選的實施方案中，所用膠原酶經過相關當局(例如，美國食品和藥物管理局)批準用于人。所用膠原酶應該沒有微生物和污染物，如內毒素。
解離后，可以洗滌/沖洗活性細胞群體以除去解離過程的添加劑和/或副產物(例如，膠原酶和新近釋放的游離液體)。通過離心或者如上討論的本領域普通技術人員公知的其他方法可以濃縮活性細胞群體。處理后洗滌/濃縮步驟可以分開或者同時應用。
在一個實施方案中，濃縮細胞并通過將細胞群體穿過連續(xù)流動旋轉膜系統(tǒng)等，例如，美國專利號5,034,135；和5,234,608中公開的系統(tǒng)離心細胞并除去膠原酶。
除了前面的，還有許多洗滌后方法用于進一步純化活性細胞群體。這些方法包括陽性選擇(選擇靶細胞)、陰性選擇(選擇性除去不想要的細胞)，或者它們的聯(lián)合。
在一個實施方案中，選擇具有粘附性質的固相材料以允許差別粘附和/或細胞洗滌步驟后插入系統(tǒng)的經處理的吸脂物內的細胞亞群被洗脫。該一般方法已經用于臨床輸血中，其中用差別捕獲白細胞的濾器耗竭污染白細胞的紅細胞(Soli等人，2001)。該類型的濾器由PallBedical(Leukogard RS和Purecell RCQ)和Asahi(RS2000)銷售。差別粘附也應用于單核細胞(Berdel等人，1982)和表皮干細胞(Bickenbach和Dunnwald，2000)的陽性選擇。在該實施方案中，經處理的吸脂物將在流動和預定的緩沖條件下穿過過濾材料，所述緩沖條件用以促進靶細胞和不希望的細胞群體的差別粘附。對于陽性選擇，濾器材料和條件將允許靶細胞的優(yōu)先粘附而不想要的材料將自由穿過濾器并用過量緩沖液洗除。通過改變條件，如流速、pH、離子強度、和/或粘附所需的陽離子的存在可以從濾器洗脫靶細胞。過濾材料可以是三維網孔、小顆粒的填充盒、中空纖維或者具有高表面積的其他機制的形式。在優(yōu)選實施方案中，該過濾裝置將是圖1中所示的一次性裝備的組成部分并且將插入圖4中所示裝置中。所述裝備和裝置將從所指定的圖中所示的那些實例稍微改變；圖1包括濾器和濾器座，圖4允許插入保持密閉、無菌流體途徑所需的濾器座和管(包括閥門)。備選地，混合室(圖4的組件108；圖1的組件30)可以分別用裝置配件和濾器/濾器座替換。
該差別粘附方法的備選實施方案將包括使用識別在靶細胞和不希望的細胞上差別表達的表面分子的抗體和/或抗體組合。基于特定細胞表面標記(或者標記的組合)表達的選擇是另一種常用的技術，其中抗體(直接或間接)附著到固相支持體結構(Geiselhart等人，1996；Formanek等人，1998；Graepler等人，1998；Kobari等人，2001；Mohr等人，2001)。該方法顯然可用于陽性和陰性選擇中，其中，例如，使用CD45抗體可以除去殘留白細胞。類似地，Reyes等人已經將抗體的復雜混合應用于從人骨髓選擇多能成年祖細胞(Reyes等人，2001)。例如，特異結合脂肪細胞的抗體如AP2(Joyner等人，1999)可用于優(yōu)先耗竭殘留的脂肪細胞(包括不成熟的脂肪細胞和adipoblast)。通過使用對靶細胞群體特異的抗體可以應用陽性選擇。例如，Quirici等人用針對神經生長因子受體的抗體富集骨髓來源的間充質干細胞(Quirici等人，2002)。
在基于抗體的方法的一個實施方案中，可以將抗體(例如AP2)或者抗體混合物(例如，AP2、CD3、CD19、CD11b)加入經處理的吸脂物中。本領域技術人員可以認識到許多其他抗體和抗體組合并且這些實例僅作為實例提供。孵育后，在允許這些抗體最佳結合它們的相關抗原的預定條件下，通過將細胞穿過旋轉膜濾器或者細胞洗滌室的其他實施方案洗滌以除去未結合的過量抗體。然后細胞將穿過固相結構，其類似于上面實施方案中描述的固相結構但是其中固相附著二級抗體，該抗體能夠高親和性附著現(xiàn)在結合到細胞表面的一級抗體。靶細胞，例如，脂肪組織來源的干細胞，將由于沒有表達所選抗體(抗體混合物)識別的細胞表面抗原而自由穿過該濾器，從而產生陰性選擇系統(tǒng)。在該實施方案中，將一次性裝備(圖3)和裝置(圖4)進行非常類似于上面實施方案中所描述的微小改變。
通過包括第三種添加劑以非常相似的方式實現(xiàn)抗體介導的陽性選擇實施方案，所述添加劑促進細胞從固相支持體脫離。在該實施方案中，可以加入木瓜蛋白酶或者木瓜凝乳蛋白酶以切割抗體分子和從固相支持體釋放細胞(Civin等人，1990)。另一種備選方案是使用與細胞表面抗原競爭結合抗體的特定肽，如Tseng-Law等人，美國專利號6,017,719中所述。
在另一實施方案中，細胞沉淀可以經重懸浮、在形成連續(xù)或者不連續(xù)密度梯度的液體材料上(或下)分層，和置于離心機中以基于細胞密度分離細胞群體。適于形成這些梯度的介質的實例包括Percoll和Ficoll-Paque(Qian等人，1998)(Smits等人，2000)或Ficoll-Paque(Lehner和Holter，2002；Van，V等人，2001)。該實施方案將能夠從細胞群體分離出某些殘留的血細胞群體和不成熟的脂肪細胞(前脂肪細胞)。
在類似實施方案中，也可以使用連續(xù)流動方法，如脫落(apheresis)(Smith，1997)，和淘析(用或不用逆流)(Lasch等人，2000)，也可以使用(Ito和Shinomiya，2001)的方法。這些機理已經用于分級分離血細胞，包括基于年齡分離血紅細胞(Lasch等人，2000)，用該一般方法從經處理的吸脂物進一步純化目標細胞對本領域技術人員是顯而易見的。該實施方案可能需要修飾圖4中的裝置和一次性裝備(圖3)從而該裝置將與另一裝置整合以提供脫落或者淘析能力。
通過短期細胞擴增后附著到塑料已經應用于骨髓來源的成年干細胞群體(Jaiswal等人，2000)。該方法使用培養(yǎng)條件優(yōu)先擴增一種群體而其他群體得到保持(從而通過用生長選擇的細胞稀釋減少)或者由于缺少所需的生長條件而損失。Sekiya等人已經描述了在這點上用于骨髓來源的干細胞的條件(Sekiya等人，2002)。該方法(利用或不利用差別附著到組織培養(yǎng)塑料)可用于本發(fā)明的其他實施方案中。在該實施方案中，從圖4中所示裝置除去細胞并將細胞置于提供細胞培養(yǎng)組分的另一裝置中。這可以是常規(guī)實驗室組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱或者生物反應器型的裝置，如Tsao等人，美國專利號6,001,642，或者Armstrong等人，美國專利號6,238,908所述。在備選實施方案中，混合組分(圖4中所示裝置的組件108；圖3中的組件30)可以由允許經處理的吸脂物的短期粘附和/或細胞培養(yǎng)的生物反應器組分替換。該備選實施方案將允許將生物反應器組件整合到裝置并且不需要從該裝置除去細胞并置于另一裝置中。
i.得到經處理的吸脂物的闡明方法用以從患者除去脂肪組織的組織除去系統(tǒng)的一個實例在圖1中闡明。在廣義實施方案中，組織除去系統(tǒng)10包括組織收集容器12和連接到組織收集容器12的混合容器30?；旌先萜?0和組織收集容器12之間的連接優(yōu)選定義了密閉系統(tǒng)，其中從組織收集容器12導向混合容器30的組織不暴露于外部環(huán)境。系統(tǒng)10還包括出口32，其經構造以允許濃縮干細胞從組織收集系統(tǒng)10除去以施用于患者。組織收集容器12包括組織收集入口14和濾器16。濾器16布置在該容器內，并且經構造以例如在從患者除去組織時保持脂肪組織和穿過非脂肪組織。更具體地，濾器16允許穿過自由液體、血液和鹽水，而在脂肪組織的最初收獲期間或者在另一實施方案中，脂肪組織的最初收獲后保持脂肪組織碎片。在那點上，濾器16包括許多孔，它們具有相同或不同的大小，但是大小為約20μm到5mm。在優(yōu)選實施方案中，濾器為厚約200μm的醫(yī)學級聚酯篩，其具有約265μm的孔大小和約47％的有效篩孔面積。該材料在洗滌期間保持組織但是在組織解離后允許細胞穿過網孔。從而，當從患者抽吸組織時，非脂肪組織可以與脂肪組織分離。混合容器30包括添加口30，其經構造以允許使用者向混合容器30施用添加劑以與混合容器30中所含干細胞混合。在優(yōu)選實施方案中，組織收集容器12的尺寸應該允許在濾器中保持約1升組織碎片。在其他實施方案中，組織收集容器12的大小可以保持更大或更小體積的組織碎片；例如，組織收集容器的大小可以儲存至少100mL脂肪組織碎片，和高達約2L脂肪組織碎片。
關于圖1的系統(tǒng)10中存在的額外特征，組織入口14通過管22連接到插管24以限定組織除去線。在所闡明的實施方案中，插管24是集成的、單一用途吸脂術插管，并且該管為彈性管。該管的尺寸使得可以將其插入患者以從該患者除去脂肪組織。系統(tǒng)中所用的管22應該能夠抵抗與吸脂輔助的脂肪整復相關的負壓以減小壓扁的可能性。組織收集容器12還包括置于濾器16上與組織入口14相反側的抽吸孔18。抽吸孔18經構造以連接到抽吸裝置20，其可以經手工操作或者自動操作。抽吸裝置20可以是注射器或者可以是電真空等。抽吸裝置20應該能夠提供為容器12和插管24提供足夠負壓以從患者抽吸組織。如所闡明的，抽吸裝置20通過管22連接到抽吸孔18。
組織除去系統(tǒng)10圖解為還包括位于組織收集容器12和混合容器30之間的細胞收集容器26。細胞收集容器26位于系統(tǒng)10內從而細胞(如干細胞)穿過組織收集容器12到達細胞收集容器26再穿過混合容器30。在所闡明的實施方案中，細胞收集容器26通過細胞收集孔48與組織收集容器12連接。在系統(tǒng)10的實施方案中，細胞收集容器26包括細胞濃縮器(未顯示)，其方便懸浮液中細胞的分離。細胞濃縮器的一個實例是離心裝置，其可以基于例如，細胞的大小或密度將細胞與其他物質分開。另一實例是如上文討論的旋轉膜濾器。系統(tǒng)10還圖解為包括濾器28，其構造使得細胞從細胞收集容器26穿過濾器28到達混合容器30，和防止例如大于細胞的物質穿過。細胞收集容器26還包括到達廢物容器36的出口。細胞收集容器26中所含的物質的流動方向由一個或多個閥門的位置確定，這些閥門可以控制物質流向廢物容器36或者混合容器30。
在所圖解的實施方案中，細胞濾器28含有許多直徑或者長度小于200μm的孔。在某些實施方案中，孔的直徑小于200μm。在其他實施方案中，孔的直徑為20到200μm。細胞濾器28可以遠離細胞收集容器26或者可以包含在細胞收集容器26內。細胞濾器28還可以集成在細胞收集容器26中。系統(tǒng)10的額外的實施方案不包括細胞濾器28。細胞收集容器可以由任何適宜的材料制造。例如，細胞收集容器26可以是塑料袋，如常規(guī)用于血庫中處理血液的那些塑料袋；或者在其他實施方案中，細胞收集容器26可以是結構上剛性的。在某些實施方案中，細胞收集容器26可以包括組分制備室和細胞洗滌/分離室。
在某些實施方案中，組分制備室包括一個或多個孔，其用于加入增強分離施用于患者的干細胞的試劑，如生長因子或者用于懸浮細胞的緩沖液，如上文討論。在這些實施方案中，組分制備室優(yōu)選包括混合裝置以混合或者攪拌容器中的細胞和添加劑。組分制備室還包括用于除去其中收集的細胞的一個或多個孔?？梢蕴峁┮粋€孔以容許細胞穿過而流向混合容器30?？梢蕴峁┢渌讓⒓毎蛘卟糠旨毎麑蚱渌袠?，如植入材料，包括骨碎片，或者導向細胞培養(yǎng)或者純化裝置。在一個實施方案中，細胞洗滌/分離室包括旋轉膜濾器組分，其可以用作細胞濃縮器，還可以或者優(yōu)選地作為離心裝置的備選方案。
還圖解系統(tǒng)10包括組織回收線路34，其用于提供從組織收集容器12到混合容器30的管道。從而，組織回收線路34穿過或者引導組織收集容器12中的組織到達混合容器30，在混合容器30中組織可以與從細胞收集容器26得到的細胞混合。在所圖解的實施方案中，組織回收線路34延伸到組織容器12中以除去濾器16中所含的脂肪組織。使用一個或多個泵或者抽吸裝置使組織穿過或者通過組織回收線路34以輸送已經沖洗但是不一定解離的脂肪組織。
在一個實施方案中，系統(tǒng)10包括溫度控制裝置，其關于系統(tǒng)10放置以調節(jié)組織收集容器12中所含物質的溫度。在某些實施方案中，溫度控制裝置為加熱器，在其他實施方案中，溫度控制裝置為冷卻器。在額外實施方案中，溫度控制裝置能夠在加熱器和冷卻器之間轉換。溫度控制裝置可以是調節(jié)組織收集容器12中所含脂肪組織的溫度的裝置或者可以是用于改變被輸送到組織收集容器12的液體的溫度的裝置。已經發(fā)現(xiàn)加熱脂肪組織促進該組織的解離以增強活性細胞組分的分離。此外，希望在某些實施方案中冷卻一部分組織，優(yōu)選活性細胞組分以提供對該細胞的保護。甚至細胞的稍稍冷卻也可提供適宜的保護以增強處理期間細胞的存活。
組織除去系統(tǒng)10的出口32圖解為混合容器20的元件。在額外實施方案中，出口32的位置與混合容器32分離。出口32優(yōu)選含有封口，其保持組織除去系統(tǒng)10的密閉結構，在某些實施方案中，出口32含有流體不可透過的膜(例如，液體和空氣不可透過的膜)。出口32的結構應該為在適宜條件下使混合容器30中的組合物穿過到達患者。例如，如果用注射器抽取組合物，出口32將能夠容納注射器針頭而不危害該系統(tǒng)或者組合物的無菌性。在額外實施方案中，如果該出口連接到裝置，該裝置經設定施用組合物，但是不抽取組合物，如插管，其通過應用正壓力使組合物通過插管移動而施用該組合物，出口32的構造應該允許混合容器30中所含組合物穿過該插管。在其他實施方案中，出口32可以含有，或者以密閉系統(tǒng)方式連接到用于施用組合物的裝置，如注射器針頭或者用于通過正壓力施用組合物的插管。
組織除去系統(tǒng)10還圖解為包括廢物容器36，其用于從收集容器12收集廢物。在所圖解的實施方案中，廢物容器36還經連接并在適當位置上以接受來自細胞收集容器26的廢物。提供了與洗滌線路39流體連通的洗滌容器38，以通過洗滌孔46輸送洗滌液體，如鹽水或者其他適宜的緩沖液到組織收集容器12。組織收集容器12還包括空氣入口40，其用于控制組織收集容器12中的壓力量。提供組織收集容器12上的添加線路42以允許將添加劑加入組織收集容器12中。關于文中公開的方法，提供添加線路42以將一種或多種酶輸送到組織收集容器12以方便活性細胞組分與濾器16中所含的剩余脂肪組織分離。如所圖解的，添加線路42含有針頭44，其可用于從適宜的容器接收酶。
組織除去系統(tǒng)10組件的一個具體實施方案在圖2和圖3中闡明，其中同樣的數(shù)字代表同樣的部分。在圖2和3的具體實施方案中，組織收集容器12包括一個物體，當對該容器應用抽吸時該物體保持其形狀。更具體地，組織收集容器12包括剛性物體，例如，由醫(yī)學級聚酯制造的物體，其含有醫(yī)學級聚酯的大體上為圓錐形的濾袋，該濾袋的網孔大小為275μm。該剛性組織收集容器可以具有約8英寸高和約5英寸直徑的尺寸；壁厚度可以為約0.125英寸。該圓柱的內部由兩個用于抽吸管的孔、兩個具有管用于通過無菌?？考夹g連接的孔，和兩個用于通過用針頭刺穿橡膠隔片的孔進入。可以用不同材料、網孔大小和數(shù)目和類型的孔實現(xiàn)相同的功能。例如，小于100μm或者大至幾千微米的網孔大小將實現(xiàn)相同的目的，即允許鹽水和血細胞穿過而保留脂肪組織聚集物和碎片。類似地，通過使用備選的剛性塑料材料，通過用非一次性的可多次使用的無菌插管代替一次性插管，或者通過本領域技術人員公知的許多其他修飾可以實現(xiàn)裝置目的。然而，在組織除去系統(tǒng)10的其他實施方案中，組織收集容器12可以包括可壓扁的物體，如組織收集袋。在此類系統(tǒng)中，優(yōu)選為袋提供支持體，如內部或者外部框架，其幫助減小對袋應用抽吸時該袋將壓扁的可能性。
為了減小組織除去系統(tǒng)10內的污染，可以在多種線路或管道上提供一個或多個夾子23以控制物質通過線路流到該系統(tǒng)的多種組件。夾子23允許使用者有效封閉組織除去系統(tǒng)10的多個區(qū)域。在優(yōu)選實施方案中，系統(tǒng)10的一個或多個組件是一次性的。在該實施方案中避免重復使用組件有助于減小與反復使用多種組件有關的污染。此外，在一次性裝備中提供組件提供了能夠一次消毒所有組件的優(yōu)點，這可以極大地減少實施文中公開的方法所需的時間。在完全或部分自動化的實施方案中，可以實現(xiàn)計算機控制的閥門作為夾子23的補充或者替代。
此外，組織除去系統(tǒng)10可以包括額外的裝置或者組件，其允許確定濾器16中保留的物質的體積，以允許記錄關于提取或者處理步驟的文字信息，或者執(zhí)行其他補充功能，如在操作期間將所述裝置連接到架子或者襯墊。
組織除去系統(tǒng)10的組件應該由不與生物流體或者組織反應并且不與用于處理生物流體和組織的試劑反應的材料制成。此外，用于制造多種組件的材料應該能夠抵抗消毒，例如，通過高壓滅菌和放射，包括但不限于β-或γ-放射進行的消毒。管道和插管把柄可以由任何適宜的材料，如聚乙烯制成。插管可以由任何適宜的材料(包括不銹鋼)制成。
根據(jù)文中公開的本發(fā)明，組織除去系統(tǒng)10提供了密閉系統(tǒng)，其方便除去、處理和施用脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的成年干細胞。該系統(tǒng)置于患者附近以除去脂肪組織，可以處理組織而不需要從該系統(tǒng)除去該組織。從而，提供了系統(tǒng)，其為患者提供新鮮的干細胞增強的組合物，并減小了與培養(yǎng)和保存干細胞相關的潛在危險。
因此，基于本公開，本發(fā)明提供了使用下面的步驟從患者提取組織的方法(i)關于常規(guī)脂肪整復準備患者；(ii)從包裝材料將插管和組織除去系統(tǒng)轉移到無菌區(qū)域；(iii)將抽脂泵(帶有常規(guī)捕集器和內嵌的微生物濾器)連接到從組織收集容器引出的軟管接頭；(iv)確保管螺旋夾沒有夾住組織收集容器的抽吸孔；(v)使用插管作為常規(guī)抽脂插管以除去不想要的脂肪組織；(vi)用組織收集容器收集所希望量的脂肪組織后，在手工操作實施方案中用兩個管螺旋夾封閉組織收集容器；(vii)確保組織收集容器被正確標記患者識別標簽，按照慣例記錄標簽上的其他信息(步驟的日期和時間，等等)，和(viii)從患者提取脂肪組織。
關于所圖解的組織除去系統(tǒng)10，通過用嵌入式流體捕集器將管22連接到抽吸源20并將插管24插入收獲部位將組織直接收集到處理組件中。然后將脂肪組織抽吸入組織收集容器12，在12中脂肪組織被組織收集容器12內的濾器16保留。組織收集后，可以將收集的脂肪組織用洗滌容器38中的洗滌液，如無菌等滲鹽水洗滌，所述洗滌液通過洗滌線路39加到組織收集容器12中。當所圖解的實施方案中組織收集容器12由剛性材料制成以維持抽吸下的收集時，鹽水加入期間從機架(housing)轉移的空氣可以通過空氣入口40放出。備選地，空氣可以轉移到廢物容器36或者類似的支撐位置。一旦沖洗組織，可以允許廢物材料流入廢物容器36。
收集組織后，可以將針頭44插入含有膠原酶溶液的無菌小瓶中，然后該溶液進入組織收集容器12，在12中該溶液與脂肪組織在或者約37℃混合15-60分鐘。如需要可以重復洗滌步驟并且洗脫活性細胞群體后可以洗滌解離的組織以便產率最大化。在組織解離結束時，組織收集容器12直立以允許脂肪細胞的浮懸。然后讓活性細胞群體流入細胞收集容器26中，在26中細胞與膠原酶和殘留的游離脂質分離?？梢酝ㄟ^本領域中普通技術人員公知的任意方法洗滌和/或濃縮細胞，所述方法包括但不限于順序離心/重懸浮洗滌或者連續(xù)流動機制。然后允許濃縮的、經洗滌的細胞流入混合容器30中，在30中這些細胞與來自組織回收線路34和/或任何計劃的添加劑混合后從出口32除去以施用于患者。細胞收集容器26中所含物質可以在用細胞濾器28過濾后洗滌以加強除去不想要的殘留細胞和組織聚集物，它們在應用時可以導致栓塞。
在處理期間，如果需要可以向多種容器加入一種或多種添加劑以提高結果。添加劑的某些實例包括優(yōu)化洗滌和解離的試劑、增強處理期間活細胞群體的生存力的添加劑、抗微生物劑(例如，抗生素)、裂解脂肪細胞和/或血紅細胞的添加劑，或者富集目的細胞群體(通過差別附著到固相部分或者促進細胞群體的大量減少或者富集)的添加劑。
在上面的實施方案中，組織收集容器12為組織除去系統(tǒng)10的處理組件內在的。備選地，可以使用單獨的組織收集容器，如2002年9月12日申請的標題為“保護非胚胎細胞不受造血組織損害”的專利申請?zhí)?0/242,094中描述的組織收集容器可完整或者部分使用并隨后將解離的材料轉移到處理組件中，所述專利申請要求普通轉讓的2001年9月14日申請的美國臨時專利申請60/322,070的益處，將這些專利申請的內容特意并入本文作為參考。其他可能的組織收集容器在美國專利號6,316,247和5,372,945中公開。
如上面指出的，在本發(fā)明的某些實施方案中，通過提供可以自動執(zhí)行該方法的步驟的一個或多個額外的裝置可以自動化所述方法。在這些實施方案中，處理裝置(例如，微處理器或者個人計算機)是部分或完全自動化上述步驟的裝置?？梢赃M行此類自動化的步驟的實例包括，但不限于，通過控制系統(tǒng)或者處理裝置的泵或閥門控制流體和組織沿著特定管道途徑的進出；用壓力傳感器檢測堵塞；混合機制，使用容積機制測量將沿著特定途徑移動的組織和/或流體的量；用熱控制裝置保持多種組分的溫度；用時間選擇和軟件機制洗滌和濃縮細胞，和集成該過程。在一個實施方案中，軟件可以控制該過程的參數(shù)以允許產生根據(jù)特定操作人員限定的參數(shù)制備的細胞群體。從而，一種或多種自動化裝置提高了所述方法的性能，并提供了脂肪組織的自動收獲和脂肪組織的處理以施用于患者。
一種具體的自動化裝置在圖4中圖解。將組織除去容器(未顯示)置于裝置100中，使用不同顏色標記的引導標記112-118將管正確排列和插入到適宜的途徑中。裝置100包括許多閥門105和110，許多泵104和109。將管置于一系列閥門105、110和泵104、109，它們受到集成微處理系統(tǒng)的控制以按照用戶限定的程序協(xié)調流體和組織流動。通過用戶界面板106介導程序選擇。將鹽水容器置于支持結構101上并連接到組織收集容器。將膠原酶或者其他組織解離介質或混合物的小瓶或管(未顯示)在點103處插入組織收集容器中。將廢物袋(未顯示)插入支持結構111中，細胞分離室/細胞收集容器置于支持結構107中，組織/細胞混合容器置于支持結構108中。組織收集容器置于攪拌/孵育室102中。
可以將脂肪組織收集到組織收集容器中而該容器位于該裝置中或者該裝置位置之前。該裝置可以含有任選的透明插入物119或者其他裝置以允許確定組織收集容器內的組織的體積。備選地，通過測量攪拌/孵育室102(相應于組織收集容器12)所含物質的重量可以確定體積。該體積可以顯示在用戶界面屏106上。
然后微處理器打開線路114和115上的閥門105并開動線114上的泵104以將鹽水導入收集室102并除去廢物物質115進入廢物袋111。在該過程期間，收集室通過搖動攪動并通過集成到室102的加熱裝置保持在程序設定的溫度。在某些實施方案中，組織處理可以使用預熱的鹽水，在該情況下攪拌/孵育室的加熱裝置的作用是保持溫度在確定的程序設定點而不是升高溫度。
一旦洗滌組織，從0％到100％的某一分數(shù)的完整的、經洗滌的脂肪組織可以通過開動線路116上的泵109和閥門110從孵育室102除去。此時抽取的物質保持在混合室108中。通過打開線路113上的閥門105，關閉113上的其他閥門和開動泵104可以將解離介質103加入室102中剩余的物質。加入解離介質后，室102經攪動并保持在如上描述的溫度下。在程序化孵育期結束時，停止攪動以允許脂肪細胞浮選。可以加入額外的鹽水以促進該過程。脂肪細胞浮選后，打開線112和115上的閥門以允許從室102除去靶細胞群體進入細胞洗滌室107中。經洗滌的細胞通過線路117除去進入混合室108，將上清液和洗滌溶液通過線路118除去進入廢物室111。額外的鹽水通過線路114穿過該系統(tǒng)以完成洗滌過程。細胞在室108中與早先處理的通過線路116除去的任何完整組織混合?？赏ㄟ^本領域中技術人員公知的任何方法實現(xiàn)混合，所述方法包括但不限于室的攪拌搖動/翻轉，或者通過壓縮脈沖或者通過移動滾筒。然后通過一次性裝備的混合室中的孔除去混合的物質。
該裝置包括根據(jù)預先程序設定的參數(shù)106的自動化該過程的微處理器控制的機制。該系統(tǒng)還可以包括使用壓力傳感器檢測堵塞和類似安全和質量控制機制。在優(yōu)選實施方案中，該系統(tǒng)的軟件組件將包括“運行數(shù)據(jù)”的自動化收集，所述數(shù)據(jù)包括，例如，一次性組件的批號、溫度和體積測量、組織體積和細胞數(shù)參數(shù)、所應用的酶的劑量、孵育時間、操作人員身份、日期和時間、患者身份，等等。在該裝置的優(yōu)選實施方案中，將集成條形碼閱讀系統(tǒng)以允許這些變量(例如，一次性裝備批號和失效期、膠原酶的批號和失效期、患者/樣品標識符，等等)的數(shù)據(jù)作為處理文件的一部分進入裝置控制器。這將減少數(shù)據(jù)輸入錯誤的機會。使用USB或者本領域中公知的其他接口或者系統(tǒng)可以將該裝置整合到控制系統(tǒng)。這樣，該裝置將提供數(shù)據(jù)輸入和過程記錄的集成控制。這些參數(shù)的打印報告將是該裝置的程序化操作的用戶定義的參數(shù)的一部分。自然，這將需要在軟件中集成打印機組件(硬件和驅動程序)或者打印機驅動程序以及該裝置的硬件中打印機的接口輸出連接器(例如，USB端口)。
在另一實施方案中，整合到控制器的軟件將提示用戶進行將管和其他元件正確插入裝置的步驟。軟件將還開始自動化檢測以證實管的正確插入、不存在堵塞，等等。
該裝置中處理的一般方法將使用與該公開中別處關于手工細胞處理所描述的參數(shù)相同的參數(shù)。
用于細胞處理的分階段機制的許多其他構造將對本領域技術人員是顯而易見的，并且僅包括本描述作為一個實例。例如，洗滌和解離期間組織和鹽水的混合可以通過本實例中的攪拌或者通過流體再循環(huán)發(fā)生。細胞洗滌可以通過連續(xù)流動機制如旋轉膜方法、差別粘附、差別離心(包括，但不限于差別沉降、速度、或者梯度分離)，或者通過方法的聯(lián)合來介導。類似的，允許細胞的進一步操作的其他組分包括加入生長因子或者其他生物應答修飾劑(Lind，1998)(Hanada等人，1997)(Lieberman等人，1998)，將細胞與天然或者合成的組分混合，所述組分將與細胞一起植入接受者(Fukuda，2001；Sodian等人，2002；Ye等人，2000)。
處理后操作可以還包括細胞培養(yǎng)(Caplan和Bruder，2001；DeUgarte等人，2003；Zuk等人，2001)、基因轉移(Luskey等人，1990；Morizono等人，2003)，或者進一步細胞純化(Greenberg和Hammer，2001；Mainwaring和Rowley，1985；Schweitzer等人，1995)。執(zhí)行這些功能的機制可以集成到圖4中所示裝置或者可以整合到單獨的裝置中。
在本發(fā)明的額外實施方案中，可以將收集到常規(guī)脂肪組織捕集器的組織轉移到經設計用于處理其他組織的處理裝備。例如，Baxter Inc.生產和銷售用于骨髓移植收獲背景中的一系列塑料袋和濾器(″BoneMarrow Collection Kit with Flexible Pre-Filters and Inline Filters″，產品號，4R2107，美國專利號4,346,703和5,724,988)。該袋裝置含有具有集成的800μm濾器的大的錐形袋，所述濾器可用于洗滌收集的脂肪組織。在該實例中，大于800μm的脂肪組織碎片將保持在該袋中。通過反復加入鹽水(或者其他洗滌溶液)然后通過濾器下面的孔除去廢物可以洗滌這些碎片?？梢酝ㄟ^手工或者使用桌面搖動裝置實現(xiàn)混合，通過使用加熱墊可以升溫?？梢栽谠摯那粌劝l(fā)生解離。解離后，細胞將穿過集成的800μm濾器(和任選地通過與試劑盒提供的一個或多個更小網孔大小的濾器)并收集到收集袋(也提供)中。該袋將置于離心機(例如，Sorval RC-3C)中，細胞可以在該離心機中順序洗滌和濃縮。也可以用現(xiàn)有的細胞洗滌裝置(主要為洗滌人血液產品開發(fā))如Baxter Inc(Cytomate或Baxter CS3000)或Cobe Inc.(Cobe Spectra)銷售的裝置洗滌細胞?？梢杂蒙a商提供的配件將一次性元件集成或者可以通過使用無菌連接裝置，如Terumo Inc生產的那些裝置連接這些一次性元件。類似地，該較少集成的方法中描述的機制可以連接到中央控制器并作為更集成的裝置的組件裝配?？梢杂萌鋭颖没蛘弑媒M自動化流體流動，使用手工或者自動化夾具打開和關閉流體路徑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，組織除去系統(tǒng)和加工裝備將存在于接受治療的患者的附近，如手術室或者門診病人處理室(有效地在患者的床邊)。這允許快速、有效組織收獲和加工，除去了樣品處理/標記錯誤的機會從而允許整個過程的執(zhí)行在一個手術步驟中進行。
提供下面的實施例以闡明該技術可以應用的特定條件和背景，這些實施例不打算限制本公開中包括的本發(fā)明和權利要求的范圍。
2.用經處理的吸脂物(ADC)治療心血管疾病和病癥的方法如在本公開中闡明的，在尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的ADC可用于治療心血管疾病和病癥。通過實施本發(fā)明的方法得到的脂肪組織來源的干細胞和祖細胞具有一些性質，這些性質有助于減小和/或最小化損傷和促進損傷后心肌或者心血管修復和再生。這些性質包括能夠合成和分泌刺激新血管形成的生長因子；能夠合成和分泌刺激細胞存活和增殖的生長因子；能夠增殖和分化成直接參與新血管形成的細胞；能夠植入受損的心肌和抑制疤痕形成(膠原沉積和交聯(lián))；能夠增殖和分化成能夠促進心肌收縮性的肌細胞；和能夠增殖和分化成心肌細胞。
使用本發(fā)明的脂肪來源的成年干細胞的前面減小和/或最小化損傷和促進損傷后心肌或者心血管修復和再生的方法在本公開下面的實施例部分詳細描述。具體地，本發(fā)明第一次闡明本發(fā)明的脂肪來源的干細胞(或者ADC)表達多種血管生成生長因子，包括胎盤生長因子(PIGF)和血管內皮生長因子(VEGF)，含有內皮祖細胞(EPC)，其在血管形成中具有確定的功能，體外發(fā)育成血管，支持體內局部缺血性組織存活，誘導后肢的阻塞/再灌注損傷后的再灌注，當動物心臟損傷后注射到動物時歸巢到心臟，和分化成表達標記的細胞，所述標記與當動物心臟損傷后注射到動物時它們分化成心肌細胞的標記一致。
因此，在本發(fā)明的一方面，從供體的脂肪組織提取脂肪組織來源的細胞并將其用于通過文中闡明的一種或多種機制引起對損害或者再生的心肌或者其他心肌組織的治療益處。在優(yōu)選實施方案中，從人的脂肪組織提取細胞并將該細胞植入所述人中，從而減小與針對移植物的抗原和/或免疫原應答有關的潛在并發(fā)癥。通常評價患者以評估心肌損傷或者疾病，這可以通過醫(yī)生或者其他臨床供應者實施一個或多個下面的步驟來完成患者的健康史、體檢、和客觀數(shù)據(jù)，包括但不限于EKG、血清心臟酶圖譜，和超聲波心動描記法。
在一個實施方案中，在患者接受經設計用以減少血液凝固和治療心肌梗死的任意產品之前進行收獲步驟。然而，在某些實施方案中，可以在收獲步驟之前讓患者接受阿司匹林。此外，一種優(yōu)選的方法包括在任何試圖的血管再形成步驟之前收集脂肪組織。然而，如本領域中技術人員理解的，將預期收集的時間選擇不同并且取決于多種因素，包括患者穩(wěn)定性、患者凝固圖譜、供給者的可用性，和質量照顧標準。最后，收集的時間選擇將由負責對受侵襲的患者進行護理的開業(yè)醫(yī)生決定。
從患者收集的脂肪組織的體積可以為約0cc到約2000cc，在一些實施方案中，高達約3000cc。所除去的脂肪的體積將在患者之間不同并且將取決于許多因素，包括但不限于年齡、體質、凝血圖、血液動力學穩(wěn)定性、梗死的嚴重性、共-發(fā)病、和醫(yī)生的偏愛。
細胞可以施用于其中心肌功能受損的任何背景下的患者。這些背景的實例包括，但不限于，急性心肌梗死(心臟病發(fā)作)、充血性心力衰竭(作為治療或者作為移植的橋接)，和冠狀動脈旁路移植術手術的補充，等等?？梢灶A先提取細胞并將其以冷凍保存的方式保存或者可以在明確需要時或者接近該時間時提取細胞。如文中討論的，可以將細胞施用于患者，或者直接應用于受損的組織，或者受損組織附近，而不進一步處理或者按照其他的方法進一步純化、修飾、刺激或者改變細胞。例如，從患者所得細胞可以施用于需要該細胞的患者而不在將它們施用于該患者前培養(yǎng)所述細胞。在一個實施方案中，將在患者的床邊實施脂肪組織的收集。可以用血液動力學監(jiān)視患者的臨床狀態(tài)。
根據(jù)文中公開的本發(fā)明，可以在從患者收獲脂肪組織后不久將脂肪來源的細胞遞送給該患者。例如，可以在處理脂肪組織后將細胞立即施用以得到脂肪來源的干細胞的組合物。在一個實施方案中，遞送的優(yōu)選計時應該在梗死后數(shù)小時到數(shù)天后發(fā)生以利用心臟損傷后存在的神經激素環(huán)境。最后，遞送的計時將取決于患者可用性和處理脂肪組織所需的處理時間。在另一實施方案中，如果將再次輸注于患者的細胞受到如文中討論的額外的修飾、純化、刺激或者其他操作，那么遞送計時將相對更長。此外，梗死后可以多次施用脂肪來源的細胞。例如，細胞可以在更長的時間內(例如數(shù)小時)連續(xù)施用，或者可以在更長的時間內多次快速濃注施用。在某些實施方案中，細胞的最初施用將在梗死后約12小時內施用，如在6小時，或者一次和多次細胞劑量將以12小時間隔施用。
施用于患者的細胞數(shù)可以例如與脂肪組織處理后的細胞產率有關。細胞總數(shù)的一部分可以保留用于以后使用或者冷藏。此外，所遞送的劑量將取決于細胞向患者的遞送途徑。當使用心外和心內遞送系統(tǒng)時，需要較少的細胞，因為這些系統(tǒng)和方法可以提供治療心血管疾病的最直接的途徑。在本發(fā)明的一個實施方案中，將要遞送到患者的細胞，例如，未純化的細胞數(shù)預計為約5.5×104個細胞。然而，可以以數(shù)量級調節(jié)該數(shù)目以實現(xiàn)所希望的療效。
細胞可以與添加劑一起應用以增強、控制或者指導預定的療效。例如，在一個實施方案中，如文中描繪，可以通過抗體介導的陽性和/或陰性細胞選擇進一步純化細胞以富集細胞群體以增加功效、減少發(fā)病率，或者促進所述方法的容易性。類似地，細胞可以與生物相容的基質一起應用，所述基質通過支持和/或指導植入細胞的命運而促進體內組織工程化。同樣地，可以將細胞基因操作后施用從而它們表達基因產物，認為或預定所述基因產物促進所述細胞提供的治療應答。操作的實例包括控制(增加或減少)促進血管發(fā)生或者脈管發(fā)生的因子(例如VEGF)的表達、促進分化成特定細胞譜系的發(fā)育基因(例如，MyoD)或者刺激細胞生長和分化的發(fā)育基因(例如，bFGF-1)的表達的操作。
還可以將細胞在支架材料上進行細胞培養(yǎng)后植入。從而，使用ADC可以在天然或者合成的基質或支架上合成組織工程化瓣膜、心室補片、心包膜、血管，和其他結構后插入或者植入接受者(Eschenhagen等人，2002；Zimmermann等人，2004；Zimmermann等人，2002；Nerem和Ensley，2004)。實際上，已經闡明了脂肪組織來源的干細胞和祖細胞體外分化成心肌細胞的細胞表達標記(Gaustad等人，2004；Rangappa等人，2003)。
3.用于治療心血管疾病和病癥的ADC的施用途徑在一個實施方案中，優(yōu)選將細胞直接施用于目的計劃益處的部位。這可以通過直接注射到心臟的外部表面(心外膜)、通過插入適宜的插管通過內表面(心內的)直接注射到心肌、通過動脈或者靜脈輸液(包括逆行流動機制)或者通本文中公開的或者本領域中公知的其他方法實現(xiàn)。本領域中普通技術人員公知的施用途徑包括但不限于，靜脈內、冠狀動脈內、心肌內、心肌外膜、心室內、后竇或者靜脈內。
如上文提到的，通過一些途徑可以施用細胞，這些途徑包括通過靜脈或者動脈輸液(包括逆行流動輸液)全身性施用或者直接注射到心臟。全身性施用，尤其通過外圍靜脈通路全身性施用依賴于心臟的天然灌注從而具有最小侵入性和脂肪組織來源的細胞能夠靶定損傷部位的優(yōu)點。細胞可以以單次快速濃注注射，這可通過緩慢輸液或者通過相隔數(shù)小時的交錯系列應用或者如果細胞經適宜保存，可以相隔數(shù)天或者數(shù)周交錯系列應用?？梢酝ㄟ^導管插入術應用細胞從而通過使用氣囊控制心肌血流增強細胞通過心臟的首次穿過。關于外周靜脈通路，可以通過導管以單次快速濃注或者以多次更小的等分試樣注射細胞。還可以通過心外膜注射將細胞直接應用于心肌。這可以在打開心臟方法(如冠狀動脈旁路移植手術)或者放置心室輔助裝置的背景下在直接觀察下應用。裝備針頭的導管可以用于將細胞以心內方式直接遞送到心肌，這可以允許直接應用的較小的侵入性方法。
在一個實施方案中，遞送途徑包括通過標準外周靜脈導管、中央靜脈導管、或者肺動脈導管的靜脈內遞送。在其他實施方案中，可以通過當前可接受的方法得到的冠狀動脈內途徑遞送細胞。通過位于患者脈管系統(tǒng)內遠端和近端氣囊的連續(xù)充氣/放氣可以控制細胞的流動，從而產生暫時的無流動區(qū)，其促進細胞植入或者細胞治療作用。在另一實施方案中，可以通過心內(心室的內表面)方法遞送細胞，該方法需要使用相容的導管以及能夠成像或者檢測所計劃的靶組織。備選地，可以通過心外膜(心臟的外表面)方法遞送細胞。該遞送可以通過打開心臟方法時的直接觀察或者通過需要專門的細胞遞送儀器的胸腔鏡方法實現(xiàn)。此外，應該按照單獨或者與上面鑒別的一種或多種方法聯(lián)合的下述途徑遞送細胞皮下、肌內、舌下、逆行冠狀輸液、冠狀旁路機制、離體膜充氧(ECMO)設備和通過心包窗。
在一個實施方案中，將細胞作為血管內快速濃注或者定時輸液施用于患者。在另一實施方案中，可以將細胞重懸在人工或者天然培養(yǎng)基或者組織支架中后施用于患者。
施用于患者的細胞劑量將取決于收獲的脂肪組織量和供體的身體質量指數(shù)(作為可利用的脂肪組織的量度)。也可通過心肌損傷或者退化的程度確定所獲的組織的量。本發(fā)明的范圍包括使用多次組織收獲的多次治療或者使用應用間細胞的適宜保存的單次收獲的多次治療。
所處理的吸脂物的部分在施用于患者前可以保存起來。對于短期保存(少于6小時)，可以將細胞在室溫或者室溫下保存在密閉容器中，容器中補加或者不補加營養(yǎng)溶液。中期保存(小于48小時)優(yōu)選在2-8℃下等滲的緩沖液(例如，Plasmalyte)的容器中進行，所述容器含有防止細胞貼壁的材料或者由防止細胞貼壁的材料組成。長期保存優(yōu)選通過適宜的冷藏進行并且將細胞保存在促進細胞功能保持的條件下，如2002年9月13日申請的普通擁有和轉讓的PCT申請?zhí)朠CT/US02/29207和2001年9月14日申請的美國臨時申請?zhí)?0/322,070中公開的條件，這里引用所述專利申請作為參考。
按照本發(fā)明的一個方面，施用于患者的脂肪組織來源的細胞可以作為生長因子遞送載體。例如，通過工程化細胞以表達適于減輕與心血管病癥或疾病有關的癥狀的一種或多種生長因子，可以將細胞施用于患者，并且工程化以釋放一種或多種生長因子。所述釋放可以以受控的方式長期釋放。因為可以控制釋放，所以生長因子以脈沖的或者定期的方式釋放從而在組織的損傷區(qū)域附近生長因子局部升高和/或生長因子的量局部下降。
施用于患者的細胞不僅幫助恢復受損或者不健康組織的功能，而且促進受損組織的重建。
可以進行細胞遞送但是其不限于下面的場所診所、門診部、急診室、醫(yī)院病房、重病監(jiān)護室、手術室、導管插入室，和放射室。
在一個實施方案中，將通過但不限于下面的臨床量度之一闡明細胞遞送療法的效果心臟射血分數(shù)增加、心力衰竭率降低、梗死尺寸減小、患病率(肺水腫、腎衰竭、心率不齊)的減小、運動耐受性的改善或者其他生命質量量度，和死亡率降低。該方法后數(shù)天到數(shù)周時間里細胞療法的效果將變得明顯。然而，有益效果可以在早至該方法后數(shù)小時后觀察到，并且可以持續(xù)數(shù)年。
通常在細胞遞送之前和期間監(jiān)視患者。監(jiān)視方法包括，但不限于凝血研究、氧飽和、血流動力學監(jiān)視，和心律監(jiān)視。細胞遞送后，患者需要約24小時對副反應的監(jiān)視。用于評估所述方法的功能改進的跟蹤研究可以包括但不限于患者功能性能力(例如，用力時呼吸困難、爆發(fā)性夜間呼吸困難、咽峽炎)、超聲波心動描記法、核灌注研究、磁共振成像、正電子成像術，和冠狀血管造影術。
如前面提出的，在優(yōu)選實施方案中，將ADC，即活性脂肪來源的干細胞群體直接施用于患者。換句話說，將活性細胞群體(即干細胞和/或內皮前體細胞)施用于患者而不從系統(tǒng)除去或者在施用于患者前暴露于系統(tǒng)的外部環(huán)境。提供密閉的系統(tǒng)減小了施用于患者的材料污染的可能性。從而，在密閉系統(tǒng)中處理脂肪組織提供了相對于現(xiàn)有方法的益處，因為活性細胞群體更可能是無菌的。在這種實施方案中，干細胞和/或內皮前體細胞暴露于外部環(huán)境或者從系統(tǒng)除去的唯一時間是細胞被吸入應用裝置或者施用于患者時。在一個實施方案中，應用裝置可以是密閉系統(tǒng)的部分。從而，用于這些實施方案中的細胞不經處理以用于培養(yǎng)或者冷藏并且可以不經處理而施用于患者，或者可以與其他組織或者細胞混合后施用于患者。
在其他實施方案中，保存至少一部分活性細胞群體以用于以后的植入/灌注?？梢詫⒃撊后w分成一份以上的等分試樣或者單位從而干細胞或者內皮前體細胞群體的部分保留用于以后應用而部分立即應用于患者。細胞庫中所有或部分細胞的中到長期保存也在本發(fā)明的范圍內，如2002年9月12日申請的標題為“保存非胚胎細胞防止非造血組織的危害”的美國專利申請?zhí)?0/242,094中公開的，該申請要求普通轉讓的2001年9月14日申請的美國臨時專利申請60/322,070的益處，將這些文獻特別并入本文作為參考。處理結束時，可以將濃縮的細胞裝入遞送裝置，如注射器，以通過本領域中普通技術人員公知的任意方法置于接受者中。
II.藥物組合物活性細胞群體可以單獨應用或者與其他細胞、組織、組織碎片、生長因子，如VEGF和其他公知的血管生成和動脈生成性生長因子、生物活性或惰性化合物、可以再吸收的塑料支架，或者旨在增強群體的遞送、功效、耐受性或者功能的其他添加劑聯(lián)合應用。通過插入DNA或者通過將DNA以這樣的方式置于細胞培養(yǎng)物中使得改變、增強或者補充細胞的功能以得到結構或者治療目的來修飾細胞群體。例如，干細胞的基因轉移技術是本領域中技術人員公知的，如(Morizono等人，2003；Mosca等人，2000)中公開，并且可以包括病毒轉染技術，更具體地，如(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等人，2000)中公開的腺相關病毒基因轉移技術。還可以如(Muramatsu等人，1998)中公開的實施基于非病毒的技術。
另一方面，細胞可以與編碼原-血管生成和/或心肌生成的生長因子的基因結合，所述基因允許細胞在心臟修復或再生期間作為它們的生長因子的自身來源。還可以應用編碼抗凋亡因子的基因或者試劑?？梢酝ㄟ^本領域中公知的任意技術加入基因(或者基因的聯(lián)合)，所述技術包括，但不限于腺病毒轉導、“基因槍”、脂質體介導的轉導，和逆轉錄病毒或者慢病毒介導的轉導、質粒、腺相關病毒。細胞可以與攜帶基因遞送載體的載體材料一起植入，所述基因遞送載體能夠隨時間釋放和/或遞送基因到細胞從而轉導可以持續(xù)或者在原位啟動。尤其當細胞和/或含有該細胞的組織施用于該細胞和/或含有該細胞的組織從中得到的患者之外的患者時，可以對接受該細胞和/或含有該細胞的組織的患者施用一種或多種免疫抑制劑以減小，優(yōu)選防止移植物的排斥。文中所用術語“免疫抑制藥物或試劑”旨在包括一種或者干擾正常免疫功能的藥物試劑。適宜用于文中公開的方法的免疫抑制劑的實例包括抑制T-細胞/B細胞共刺激途徑的試劑，如美國專利
發(fā)明者J·K·弗拉塞爾, M·H·赫德里克, M·朱, B·M·斯特雷姆, E·丹尼爾斯, I·烏盧爾 申請人:馬克羅珀爾生物外科公司