專利名稱：通過(guò)對(duì)懸浮的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行灌流式培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)懸浮的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行灌流式培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行，其中，通過(guò)過(guò)濾從細(xì)胞中分離出生物物質(zhì)。
本領(lǐng)域中已知有類似的方法，例如Tokashiki et al.1993.Cytotechnology，vol.13149-159所著的關(guān)于灌流式培養(yǎng)的綜述。在通過(guò)過(guò)濾從細(xì)胞中分離出生物物質(zhì)的灌流式培養(yǎng)中，優(yōu)選的過(guò)濾是這樣的1)細(xì)胞被過(guò)濾器保留，同時(shí)2)包含生物物質(zhì)的液體通過(guò)過(guò)濾器。對(duì)過(guò)濾器開(kāi)展這兩項(xiàng)任務(wù)的效果的量度標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞培養(yǎng)物中平均的細(xì)胞總濃度和通過(guò)過(guò)濾器的總體積的乘積(過(guò)濾器性能)。過(guò)濾器性能與生物物質(zhì)的產(chǎn)量是成比例的。
但是，通過(guò)過(guò)濾從細(xì)胞中分離出生物物質(zhì)的灌流式培養(yǎng)的不好之處在于，該過(guò)程中會(huì)發(fā)生過(guò)濾器堵塞。過(guò)濾器堵塞限制了能通過(guò)過(guò)濾器的體積總量，因而限制了過(guò)濾器性能，也就還限制了生物物質(zhì)的產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)懸浮的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行灌流式培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行，其中，通過(guò)過(guò)濾從細(xì)胞中分離出生物物質(zhì)，其中過(guò)濾器堵塞減少(即，過(guò)濾器性能提高)。
該目的是通過(guò)本發(fā)明達(dá)成的，通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中存在至少為0.001w/w％的一定量的非離子表面活性劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
非離子表面活性劑在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基的用途可從US 5,372,943中已知，但是，在US 5,372,943中，該用途用于在細(xì)胞培養(yǎng)基中提供以生物可利用形式存在的必要脂類。本申請(qǐng)人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的不含血清的培養(yǎng)基中使用非離子表面活性劑還會(huì)減少過(guò)濾器堵塞。
原則上，用于不含血清的培養(yǎng)基中的非離子表面活性劑的量的上限并不是關(guān)鍵的。但是，其可以例如被非離子表面活性劑的毒性水平和/或溶解性所限制。上限進(jìn)一步地可取決于方法中所用的條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定該上限。通常，細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的非離子表面活性劑的量的上限是1w/w％。
在本發(fā)明的方法中，非離子表面活性劑優(yōu)選是脂肪酸酯，例如脂肪酸的甘油酯或雙甘油酯，或如結(jié)構(gòu)式1所示的聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯(polyoxyalkylene sorbitan fatty acid ester)， 其中，R1、R2、R3和R4每個(gè)都獨(dú)立代表H或脂肪酸殘基，即脂肪酸和醇縮合后的殘留部分，前提條件是R1至R4中的至少一個(gè)是脂肪酸殘基，其中A代表乙烯或丙烯基團(tuán)，n、o、p和q每個(gè)都獨(dú)立代表0至100之間的值，其中優(yōu)選地，n、o、p和q的總和為50至300之間。
優(yōu)選地，脂肪酸殘基含有10-20個(gè)C原子。脂肪酸的例子包括癸酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、塔羅油酸等。
結(jié)構(gòu)式1的商業(yè)可獲得的化合物的例子包括TweenTM化合物，例如TweenTM-80、TweenTM-21、TweenTM-40、TweenTM-60、TweenTM-20、TweenTM-61、TweenTM-65、TweenTM-81、TweenTM-85。當(dāng)然，在本發(fā)明的方法中使用不同非離子表面活性劑的組合也是可能的。
在本發(fā)明的方法中，脂肪酸酯是特別有利的，因?yàn)檫@些酯的少量存在對(duì)生物物質(zhì)的醫(yī)藥用途不會(huì)有阻礙。
優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基中非離子表面活性劑的量為至少0.005w/w％，更優(yōu)選地，至少0.01w/w％，最優(yōu)選地，至少0.02w/w％。
可用于本發(fā)明方法中的動(dòng)物細(xì)胞是，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO(Chinese Hamster Ovary，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、雜交瘤、BHK(BabyHamster Kidney，幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞和人類細(xì)胞，例如HEK-293細(xì)胞和人淋巴母細(xì)胞。
原則上，所有適合保留細(xì)胞的過(guò)濾器都可以用來(lái)進(jìn)行過(guò)濾。此類過(guò)濾器的例子是靜止過(guò)濾器(static filter)，例如中空纖維過(guò)濾器或切向流過(guò)濾器或旋轉(zhuǎn)式過(guò)濾器，例如旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。優(yōu)選地，如果生物物質(zhì)是生物藥物產(chǎn)品，則使用內(nèi)部過(guò)濾器，因?yàn)槭褂猛獠窟^(guò)濾器需要額外的認(rèn)證，以使對(duì)生物藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程合乎GMP(優(yōu)良生產(chǎn)操作)標(biāo)準(zhǔn)。合適的內(nèi)部過(guò)濾器的例子是內(nèi)部旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
最合適的過(guò)濾器孔徑取決于要被保留下來(lái)的細(xì)胞的細(xì)胞直徑，其可被本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易地確定。優(yōu)選地，孔徑被選擇為篩網(wǎng)上的孔的大小接近于懸浮的細(xì)胞的直徑，確保細(xì)胞的高保留率而細(xì)胞殘骸能通過(guò)過(guò)濾器。優(yōu)選地，孔徑在500×3000-50×300之間。
本發(fā)明原則上可用于適合培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基。選擇細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)條件的原則都是公知的，例如Freshney，R.I.Culture of animal cells(a manual of basic techniques)，4th edition 2000，Wiley-Liss的第8和9章以及Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&TissuecultureLaboratory Procedures 1993，John Wiley&Sons中所提供的。
對(duì)生物藥物產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，不含血清的培養(yǎng)基相對(duì)含有血清源的培養(yǎng)基是優(yōu)選的，因?yàn)檠逶吹呐囵B(yǎng)基通常是被病毒污染的，存在朊病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，可能對(duì)生物藥物產(chǎn)品的下游加工(即，從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化出生物藥物產(chǎn)品來(lái))造成大的阻礙。因?yàn)閬?lái)自哺乳動(dòng)物源的化合物也存在感染風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基不僅僅不含血清，還不含哺乳動(dòng)物源。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基不僅不含哺乳動(dòng)物源，而且還不含動(dòng)物源。
細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、溫度、溶解氧濃度和滲量(osmolarity)原則上并不是很關(guān)鍵的，其取決于所選用的細(xì)胞的種類。優(yōu)選地，pH、溫度、溶解氧濃度和滲量被選為最適于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道怎么樣找到用于灌流式培養(yǎng)的最佳pH、溫度、溶解氧濃度和滲量。通常，最佳pH在6.6至7.6之間，最佳溫度在30至39℃之間，最佳滲量在260至400mOsm之間，細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解氧濃度在5至95％空氣飽和度之間。
適于通過(guò)灌流式培養(yǎng)由動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物物質(zhì)原則上是所有可由動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物物質(zhì)，例如，治療和診斷用的蛋白質(zhì)，例如單克隆抗體、生長(zhǎng)因子和酶，DNA，例如可在基因療法中使用的，疫苗，激素等。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)生物藥物產(chǎn)品，其是具有醫(yī)藥用途的生物物質(zhì)。生物藥物產(chǎn)品的例子是以下這些(括號(hào)內(nèi)是相關(guān)生物藥物產(chǎn)品的示例性商標(biāo)名稱)替特普酶Tenecteplase(TN KaseTM)、(重組)抗血友病因子(ReFactoTM)、淋巴母細(xì)胞干擾素α-n1(WellferonTM)、(重組)凝血因子(NovoSevenTM)、依那西普Etanercept(EnbrelTM)、曲妥珠單抗Trastuzumab(HerceptinTM)、英利昔單抗Infliximab(RemicadeTM)、巴利昔單抗Basiliximab(SimulectTM)、達(dá)昔單抗Daclizumab(ZenapaTM)、(重組)凝血因子IX(BenefixTM)、促紅細(xì)胞生成素alpha(Epogen)、G-CSF(NeupogenFilgrastim)、干擾素alpha-2b(Infergen)、重組胰島素(Humulin)、干擾素beta 1a(Avonex)、因子VIII(KoGENate)、葡糖腦苷脂酶(CerezymeTM)、干擾素beta 1b(Betaseron)、TNF alpha受體(Enbrel)、卵泡刺激素(Gonal-F)、阿昔單抗Mab abcixmab(Synagis，ReoPro)、Mab ritiximab(Rituxan)、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(Activase，Actilyase)、人生長(zhǎng)激素(Protropin，Norditropin，GenoTropinTM)?？赡芫哂嗅t(yī)藥應(yīng)用的DNA的例子是基因治療用的質(zhì)粒DNA。目前正在臨床試驗(yàn)中對(duì)一些基因治療用的DNA的醫(yī)藥應(yīng)用進(jìn)行試驗(yàn)。疫苗的例子是活的、口服的、四價(jià)輪狀病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂犬病疫苗(RanAvertTM)、肝炎B疫苗(RECOMBIVAX HB，Engerix)和滅活肝炎A疫苗(VAQTATM)。
在所謂的下游加工中，可對(duì)通過(guò)過(guò)濾器的生物物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的純化。下游加工通常包含若干純化步驟，其組合方式和順序可以多種多樣。下游加工中純化步驟的例子是分離步驟(例如，通過(guò)親和色譜和/或離子交換色譜)、生物物質(zhì)的濃縮步驟(例如，通過(guò)超濾或滲濾(diafiltration))、交換緩沖液的步驟和/或去除或滅活病毒的步驟(例如，通過(guò)過(guò)濾滅病毒、改變pH或溶劑的去垢劑處理)。
下述實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，但并非加以限制。
實(shí)施例1PFU-83雜交瘤細(xì)胞是大鼠/小鼠異源雜交瘤細(xì)胞，其產(chǎn)生對(duì)抗促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的大鼠IgG(J.W.A.M.van Oers et al.1989，Endocrinology，124，pp1239-1246)。PFU-83雜交瘤細(xì)胞于37℃下被培養(yǎng)于最少限度的不含哺乳動(dòng)物源的培養(yǎng)基中。所用的最少限度的不含哺乳動(dòng)物源的培養(yǎng)基是3∶1 DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基，其中含有抗壞血酸(5mg/l)、重組人胰島素(5mg/l)、谷胱甘肽(1mg/l)、PluronicTMF68(500mg/l)、以Na2SeO3形式存在的硒(15μg/l)、碳酸氫鈉(3g/l)、乙醇胺(7μg/l)，添加有谷氨酰胺(glutamin)(終濃度為584.5mg/l)、丙酮酸鈉(終濃度為110mg/l)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(5mg/l)，滲量為320mOsm。pH被調(diào)為7.0，溶解氧濃度被設(shè)為30％空氣飽和度。在7l的Applikon發(fā)酵罐中對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行處理，工作體積設(shè)為4l，其中使用孔徑為325×2300的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，存在有不同濃度的Tween-80(0、15mg/l和50mg/l；相應(yīng)于大約0、0.015和0.050w/w％)。存活細(xì)胞濃度在4至5日后達(dá)到大約5×106。
所有不同的批次細(xì)胞保留率都為100％。觀察達(dá)到過(guò)濾器被完全堵塞的時(shí)間(當(dāng)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器被注滿淹沒(méi)時(shí)的時(shí)間點(diǎn))，計(jì)算旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器性能。旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器性能被定義為通過(guò)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的總體積和發(fā)酵罐中平均的細(xì)胞總濃度的乘積。用Fuchs-Rosenthal血球計(jì)數(shù)器和用于對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色的臺(tái)盼藍(lán)(trypan-blue)拒染法，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算發(fā)酵罐運(yùn)行期間取得的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中存活和死亡細(xì)胞的總數(shù)，由此確定發(fā)酵罐中的細(xì)胞濃度。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于下表1中。從表1可見(jiàn)，加入Tween-80后，達(dá)到堵塞的時(shí)間，以及旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器性能都增加了。
表權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)懸浮的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行灌流式培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行，其中，通過(guò)過(guò)濾從細(xì)胞中分離所述的生物物質(zhì)，所述方法的特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中存在有至少0.001w/w％的如結(jié)構(gòu)式1所示的聚氧化烯山梨聚糖脂肪酸酯， 其中，R1、R2、R3和R4每個(gè)都獨(dú)立代表H或脂肪酸殘基，即脂肪酸和醇縮合后的殘留部分，前提條件是R1至R4中的至少一個(gè)是脂肪酸殘基，其中A代表乙烯或丙烯基團(tuán)，n、o、p和q每個(gè)都獨(dú)立代表0至100之間的值。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，結(jié)構(gòu)式1中，n、o、p和q的總和在50至300之間。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，細(xì)胞培養(yǎng)基中存在至少0.01w/w％的如結(jié)構(gòu)式1所示的化合物。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述如結(jié)構(gòu)式1所述的化合物是TweenTM化合物。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的過(guò)濾是用內(nèi)部過(guò)濾器來(lái)進(jìn)行的。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)部過(guò)濾器是旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物物質(zhì)是生物藥物產(chǎn)品。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基也是不含哺乳動(dòng)物源的。
10.如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物物質(zhì)通過(guò)下游加工被進(jìn)一步純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法，所述方法通過(guò)在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中對(duì)懸浮的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行灌流式培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行，其中，通過(guò)過(guò)濾從細(xì)胞中分離出生物物質(zhì)，所述方法的特征在于，細(xì)胞培養(yǎng)基中存在有至少0.001w/w％的非離子表面活性劑。已發(fā)現(xiàn)，非離子表面活性劑存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中能改善過(guò)濾性能。
文檔編號(hào)C12M3/00GK1780905SQ200480011791
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者蘭納德斯·阿杜爾夫斯·保羅范德?tīng)?申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司