專(zhuān)利名稱：在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位點(diǎn)及其用途的制作方法
本非臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)要求2003年5月9日提交的、現(xiàn)已放棄的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/469,126的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及膜糖蛋白的研究和用途。更具體說(shuō)，本發(fā)明提供了生產(chǎn)維持天然構(gòu)象的無(wú)膜的膜糖蛋白的方法。
相關(guān)領(lǐng)域描述很多膜糖蛋白以高度約束和能量富集的構(gòu)象組裝在細(xì)胞內(nèi)。含膜病毒的膜蛋白是能量富集蛋白的實(shí)例。這些蛋白通過(guò)中間體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)組裝，二硫鍵使該中間體處于穩(wěn)態(tài)。因?yàn)檫@個(gè)高能量構(gòu)型，所以從其結(jié)合膜中抽提它們時(shí)，維持這些蛋白的天然構(gòu)象如果不是說(shuō)不可能，也是非常困難的。從膜中抽提這些蛋白導(dǎo)致這些蛋白折疊成為非天然的松散構(gòu)型，這會(huì)使對(duì)這些蛋白的結(jié)構(gòu)分析難于進(jìn)行。在病毒膜蛋白的情況下，非天然構(gòu)象使這些蛋白在亞基病毒疫苗應(yīng)用中無(wú)效。
在流感病毒的情況下，由于HA1-HA2膜糖蛋白中蛋白酶可及位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)(Wiley和Skehel，1977)克服了該構(gòu)象問(wèn)題。用該蛋白酶一處理完整病毒，該位點(diǎn)就允許蛋白胞外域釋放。釋放胞外域保留了它的天然構(gòu)象，因此可以通過(guò)X射線晶體學(xué)(Wiley和Skehel，1977)的原子解析確定其結(jié)構(gòu)。
然而，大部分膜蛋白不含如流感病毒中發(fā)現(xiàn)的這種蛋白酶可及位點(diǎn)。這一事實(shí)和其他蛋白純化方法的失敗，使得不可能獲得天然構(gòu)象的這些蛋白。因此，之前領(lǐng)域缺乏一種生產(chǎn)維持天然構(gòu)象的無(wú)膜的膜糖蛋白的方法。本發(fā)明提供了對(duì)于這個(gè)本領(lǐng)域中長(zhǎng)期持續(xù)的需求和期望的解決方案。
發(fā)明摘要本發(fā)明提供用天然存在的細(xì)胞蛋白酶來(lái)生產(chǎn)膜蛋白域的操作程序，該域從雙分子層膜釋放后保持其天然構(gòu)象。這個(gè)蛋白水解酶切和釋放的事件發(fā)生在已經(jīng)把蛋白運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)外后，也就是在二硫鍵形成、折疊和與其他蛋白寡聚化(如果需要)過(guò)程發(fā)生后。在使弗林蛋白酶進(jìn)入高爾基體后，該蛋白就轉(zhuǎn)化成非膜關(guān)聯(lián)物質(zhì)，它可以通過(guò)防止失去天然構(gòu)象的操作程序從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中純化。該操作程序提供生產(chǎn)病毒膜蛋白域的新機(jī)會(huì)，以用于結(jié)構(gòu)分析和疫苗試驗(yàn)。
帶有弗林插入的病毒可以在宿主細(xì)胞中生長(zhǎng)到較高的滴度，而并不表達(dá)弗林。這些突變病毒可以用作疫苗，因?yàn)楫?dāng)把它們注入哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，這些病毒會(huì)感染并開(kāi)始裝配過(guò)程，但在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的蛋白組裝最后階段“自我毀滅”。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)膜糖蛋白域的方法，其中該域是無(wú)膜的，并且維持天然構(gòu)象。該方法可包括下述步驟將弗林蛋白酶切割序列插入到將該膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域；在宿主細(xì)胞中表達(dá)該糖蛋白；用弗林蛋白酶在宿主細(xì)胞的高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)中切割糖蛋白，由此產(chǎn)生膜糖蛋白域；從宿主細(xì)胞分泌該糖蛋白域；和從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化該糖蛋白域，其中該域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)α-病毒膜糖蛋白域的方法，該膜糖蛋白用作亞基疫苗候選物，其中所述域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。該方法通常包括下述步驟將弗林蛋白酶切割序列插入到將膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域；在宿主細(xì)胞中表達(dá)該糖蛋白；用弗林蛋白酶在宿主細(xì)胞的高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)中切割糖蛋白，由此產(chǎn)生膜糖蛋白域；從宿主細(xì)胞分泌該糖蛋白域；和從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化該糖蛋白域，其中該域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)α-病毒疫苗候選物的方法。該方法包括下述步驟將弗林蛋白酶切割序列插入到將α-病毒的膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域；將編碼包含弗林蛋白酶切割序列的膜糖蛋白的序列摻入到一個(gè)編碼α-病毒的載體上；在不表達(dá)弗林蛋白酶的宿主細(xì)胞中表達(dá)α-病毒；和收集宿主細(xì)胞產(chǎn)生的α-病毒，其中收集的病毒即是對(duì)α-病毒疫苗的候選物。
本發(fā)明其他和進(jìn)一步的方面、特征和優(yōu)點(diǎn)在下面的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的描述中是顯而易見(jiàn)的。給出這些實(shí)施例是為了公開(kāi)的目的。


圖1由氨基酸129-140分隔開(kāi)辛德畢斯病毒的E1糖蛋白中的功能和結(jié)構(gòu)域。在殘基130、133或139插入弗林蛋白酶切割位點(diǎn)將把該蛋白切割成17kD的功能域(從膜中釋放)和結(jié)構(gòu)域(保留在膜上)。在E1392和393位點(diǎn)會(huì)釋放整個(gè)胞外域。
圖2由辛德畢斯病毒突變體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，該蛋白質(zhì)在E1糖蛋白上含有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。數(shù)字標(biāo)識(shí)顯示了在E1上應(yīng)該發(fā)生切割的氨基酸位點(diǎn)。Y420，野生型病毒；P75，非病毒信使RNA；E1，包膜蛋白2；C，殼體蛋白。
圖3由辛德畢斯病毒突變體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，該蛋白質(zhì)在位置E1393(F393)處含有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。將兩種正常病毒的糖蛋白標(biāo)識(shí)為E1、E2，弗林蛋白酶截?cái)嗟腅1蛋白標(biāo)識(shí)為E1*。C是殼體蛋白。P75，含有非病毒RNA的突變體；Y420，野生型病毒。
發(fā)明詳述弗林蛋白酶是存在于真核細(xì)胞高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的蛋白酶(Moehring等，1993)。它的功能是在蛋白就要運(yùn)達(dá)它們的最終細(xì)胞目的地之前，切割蛋白。弗林蛋白酶識(shí)別共有氨基酸序列RXRR(SEQ ID No.1)、RXRK(SEQ ID No.2)或KXKR(SEQ ID No.3)(其中X是任意氨基酸，Moehring等，1993)，當(dāng)含有這些序列的蛋白到達(dá)高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，將其切割。
本發(fā)明中，將一個(gè)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)引入到一個(gè)膜糖蛋白的暴露域(位于外部)。修飾的蛋白將經(jīng)過(guò)正常的折疊和組裝過(guò)程，獲得其天然構(gòu)型。這些事件對(duì)于將它運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)外是必需的。運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)外后，該蛋白沿著分泌途徑行進(jìn)到細(xì)胞表面。當(dāng)該蛋白到達(dá)高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，弗林蛋白酶將其切割。蛋白水解事件將該蛋白的胞外域從雙分子層膜釋放，而不會(huì)損壞其構(gòu)象。該蛋白現(xiàn)在是一個(gè)分泌蛋白，可以通過(guò)合適的純化程序從周?chē)囵B(yǎng)基中純化。
為了證實(shí)該方法的可行性，選擇α-病毒辛德畢斯病毒原型作為模型。該α-病毒代表一類(lèi)對(duì)人類(lèi)重要疾病負(fù)有責(zé)任的病毒(蟲(chóng)媒病毒)，這些疾病有登革熱、西尼羅河熱、委內(nèi)瑞拉腦炎、黃熱病等。雖然有超過(guò)600種已知藥劑，但是現(xiàn)在可用的只有一種有效疫苗(抗黃熱病)。通過(guò)生產(chǎn)抽提病毒蛋白的亞基或變性病毒來(lái)生產(chǎn)疫苗的嘗試都失敗了，因?yàn)槿狈ι鲜龅奶烊坏鞍讟?gòu)象。
辛德畢斯病毒的E1糖蛋白在病毒感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝成一個(gè)緊湊、高度約束和能量富集的構(gòu)象。正確的折疊是將其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面的先決條件。從膜上去除病毒E1蛋白的嘗試導(dǎo)致其天然構(gòu)象的丟失，因?yàn)槎蜴I攪亂使蛋白成為非天然構(gòu)象。
已經(jīng)顯示，該蛋白的正確折疊形式被分為兩個(gè)獨(dú)立的二硫鍵穩(wěn)定域，這兩個(gè)域之間的連接大約在氨基酸E1-129處(Mulvey和Brown，1994)(圖1)。這些域(氨基酸1-129)中的第一個(gè)包含穿膜功能(功能域)，而第二個(gè)域(130-398)維持二十面晶格結(jié)構(gòu)的完整(結(jié)構(gòu)域)。下面列出的數(shù)據(jù)顯示，在將功能域和結(jié)構(gòu)域分開(kāi)的區(qū)域插入弗林蛋白酶切割位點(diǎn)導(dǎo)致功能域從膜蛋白復(fù)合物中以天然構(gòu)象釋放。
選擇弗林蛋白酶切割位點(diǎn)插入的位置，可根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)確定，或在結(jié)構(gòu)無(wú)法獲得的情況下，根據(jù)生化和/或序列分析來(lái)確定。通常，該位點(diǎn)應(yīng)該是在具有顯著極性或帶電荷的殘基片斷上，最可能是在蛋白的表面。如果三維結(jié)構(gòu)是已知的話，插入位點(diǎn)應(yīng)該在表面環(huán)中，該環(huán)將排列好的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件與延伸疏水界面連接。
當(dāng)該蛋白的結(jié)構(gòu)無(wú)法獲得時(shí)，基于疏水性的方法、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法和同源序列比對(duì)經(jīng)?？梢詭椭沂驹摵蜻x位點(diǎn)。如果可以獲得少量蛋白，有限的蛋白水解消化，然后通過(guò)層析共分級(jí)分離和N末端多肽測(cè)序/質(zhì)譜可以幫助確定該候選位點(diǎn)，該位點(diǎn)是蛋白酶消化可及的，且對(duì)于形成完整蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)不必需在這樣位點(diǎn)的切割使蛋白分離成單獨(dú)的域。
本發(fā)明獲得無(wú)膜的膜糖蛋白的快速方法可以應(yīng)用于很多病毒，例如HIV、皰疹病毒、冠狀病毒等。通常，可以把弗林蛋白酶切割位點(diǎn)插入到任何病毒膜蛋白，只要該病毒能夠在缺乏弗林蛋白酶的CHO細(xì)胞系中，或在支持病毒復(fù)制的弗林蛋白酶缺陷型細(xì)胞系中復(fù)制即可。釋放的病毒糖蛋白中無(wú)膜的胞外域可以用作亞基疫苗。
在另一實(shí)施方式中，可以在弗林蛋白酶陰性的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生帶有弗林蛋白酶插入的高滴度的病毒顆粒。當(dāng)注入哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，這些病毒就會(huì)感染并開(kāi)始組裝過(guò)程，但是由于弗林蛋白酶的切割，病毒在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)在蛋白組裝最后階段會(huì)“自我毀滅”。該方法對(duì)于很多病毒均適用(例如HIV、皰疹病毒)，只要弗林蛋白酶陰性細(xì)胞系可以支持變異病毒的生長(zhǎng)即可。
這里使用的“膜糖蛋白”指任意完整的膜蛋白，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組裝并借助通過(guò)高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞路徑運(yùn)輸至最終目的地。
這里使用的“無(wú)膜的膜糖蛋白”指已經(jīng)從膜上釋放的完整的膜蛋白，該蛋白是通過(guò)蛋白酶在胞外域某點(diǎn)上切割蛋白進(jìn)行的。
這里使用的“天然構(gòu)象”指蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊所獲得的構(gòu)象。對(duì)于病毒蛋白來(lái)說(shuō)，也指成熟的感染性病毒中存在的功能形式。
本發(fā)明涉及生產(chǎn)膜糖蛋白域的方法，其中所述域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法可以用來(lái)生產(chǎn)病毒膜糖蛋白域，如α-病毒膜糖蛋白域。產(chǎn)生的病毒膜糖蛋白域可以用作亞基疫苗候選物。
首先，將弗林蛋白酶切割序列插入到將膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域。通常，合適的區(qū)域包括蛋白表面、表面環(huán)或具有明顯極性的殘基的區(qū)域。優(yōu)選地，該弗林蛋白酶切割序列是SEQ ID No.1、2或3的序列。宿主細(xì)胞中一表達(dá)該修飾糖蛋白，通過(guò)弗林蛋白酶切割就在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)中把該糖蛋白分離成不同域。然后，可以從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中純化該糖蛋白域，其中純化蛋白域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)α-病毒疫苗候選物的方法。該方法包括將弗林蛋白酶切割序列插入到將α-病毒膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域。通常，合適的區(qū)域包括蛋白表面、表面環(huán)或具有明顯極性的殘基的區(qū)域。優(yōu)選地，該弗林蛋白酶切割序列是SEQ IDNo.1、2或3的序列或片斷，或這些弗林蛋白酶切割序列之一的明顯突變體。然后將該修飾糖蛋白摻入到編碼α-病毒的載體中，并在不表達(dá)弗林蛋白酶的宿主細(xì)胞中表達(dá)。由這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生的α-病毒即α-病毒疫苗候選物。
給出下述實(shí)施例的目的在于說(shuō)明本發(fā)明的各種實(shí)施方式，而并無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明很適合實(shí)現(xiàn)其目的和獲得上述的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及這里包含的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在權(quán)利要求的范圍限定的本發(fā)明精神的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出改動(dòng)和用于其他用途。
實(shí)施例1蛋白域在弗林蛋白酶切割后以天然構(gòu)象釋放為了從膜蛋白復(fù)合體中釋放辛德畢斯病毒的E1糖蛋白的第一個(gè)域，將弗林蛋白酶切割位點(diǎn)插入到將該蛋白的結(jié)構(gòu)域與功能域分離開(kāi)的區(qū)域。在病毒RNA的全長(zhǎng)cDNA克隆中，用Quick-ChangeTM突變技術(shù)(Strategene)來(lái)完成該過(guò)程(Rice等，1987)。
表1顯示了用于產(chǎn)生這些突變的引物。當(dāng)可能時(shí)，用天然存在的氨基酸序列在位置E1-130(RXRK，SEQ ID No.2)、E1-133(KXKR，SEQ ID No.3)和E1-139(RXRR，SEQ ID No.1)制造突變，以置入弗林蛋白酶敏感序列。對(duì)這些位點(diǎn)的選擇基于下述研究，該研究證明這些位點(diǎn)暴露在蛋白表面并因此可用于蛋白酶切割(Pbinney等，2000；Phinney和Brown，2000)。
據(jù)預(yù)測(cè)，這些突變會(huì)在E1蛋白接觸帶有弗林蛋白酶的細(xì)胞時(shí)，導(dǎo)致其遠(yuǎn)端E1蛋白域釋放。這會(huì)將分子量為58KD的完整E1蛋白改變成兩個(gè)分子量大約為17kD和41kD的蛋白。為了在病毒糖蛋白的正常折疊過(guò)程中控制氨基酸改變效應(yīng)，將含有突變的病毒RNA轉(zhuǎn)染到不含弗林蛋白酶的CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞系(CHO-RPE40)(Moehring等，1993；Moehring和Moehring，1983)。
圖2顯示用E1突變體F130、F133和F139的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白。將切割位點(diǎn)置于位置E1-130和E1-133導(dǎo)致產(chǎn)生新的蛋白種類(lèi)，凝膠遷移中，其分子量大約為41和17KD，與預(yù)測(cè)相符。17kD蛋白的量相當(dāng)少，因?yàn)檫@里顯示的蛋白是與細(xì)胞結(jié)合的蛋白，而很可能大多數(shù)17kD蛋白被分泌到培養(yǎng)基中。在野生型轉(zhuǎn)染(Y420)或轉(zhuǎn)染非病毒信息(P75)的細(xì)胞中，并沒(méi)有看到這些蛋白。
E1393突變體是用來(lái)釋放整個(gè)E1胞外域(見(jiàn)圖1)。圖3顯示了從BHK細(xì)胞培養(yǎng)基中免疫沉淀的蛋白的SDS PAGE，該細(xì)胞是用393突變體的RNA轉(zhuǎn)染的。
在突變體E1139的情況下，在E1392處的突變不能產(chǎn)生期望表型(數(shù)據(jù)未顯示)。用突變弗林蛋白酶E1392的cDNA克隆產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，使得某種蛋白釋放到培養(yǎng)基中，該蛋白的凝膠遷移速度比糖蛋白E2更快，并被抗全病毒的抗體免疫沉淀。野生型E1有439個(gè)氨基酸(58kDa)，野生型E2有423個(gè)氨基酸(53kDa)，而截短的E1胞外域預(yù)計(jì)有392個(gè)氨基酸(51kDa)，從羧基端丟失了47個(gè)氨基酸。
如圖3所示，E1393突變體(F393)比野生型E1產(chǎn)生更多的截短E1，說(shuō)明在393切割位點(diǎn)發(fā)生了有效加工。
表1用于產(chǎn)生E1弗林蛋白酶敏感突變的引物組

實(shí)施例2每割帶有弗林蛋白酶插入的病毒表2顯示感染病毒生產(chǎn)中弗林蛋白酶位點(diǎn)插入的影響。表2顯示含有弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的突變體在其RNA轉(zhuǎn)染到含有弗林蛋白酶敏感序列的BHK-21細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生非常低水平的感染病毒。
相反，當(dāng)這些突變體轉(zhuǎn)染到?jīng)]有弗林蛋白酶活性的CHO-RPE40細(xì)胞時(shí)，則產(chǎn)生野生(Y420)量的病毒。對(duì)于F-130和F-133突變體來(lái)說(shuō)，此結(jié)果顯示弗林蛋白酶切割位點(diǎn)在這些位置的存在，并不阻止E1的正確折疊，當(dāng)該位點(diǎn)摻入到感染病毒中時(shí)。在BHK細(xì)胞中，感染病毒的生產(chǎn)被抑制了5-6個(gè)數(shù)量級(jí)，因?yàn)楦チ值鞍酌敢呀?jīng)將折疊的E1蛋白切割成兩個(gè)單獨(dú)域。突變體F-139在BHK細(xì)胞中顯示了類(lèi)似的生長(zhǎng)抑制，即使并未發(fā)生E1的明顯切割。在139取代的情況下，該突變位置去除了兩個(gè)糖基化位點(diǎn)(Pletnev等，2001)之一，這是由該部分糖基化蛋白更快的凝膠遷移所證明的。糖基化位點(diǎn)的去除可能導(dǎo)致構(gòu)象變化，而阻止感染病毒的生產(chǎn)。
E1 193突變體從BHK細(xì)胞產(chǎn)生的滴度為103病毒粒子，相比而言，野生型病毒在相似的RNA轉(zhuǎn)染條件下產(chǎn)生的滴度為109。突變體393在CHO RPE40細(xì)胞(弗林蛋白酶陰性細(xì)胞)中產(chǎn)生107到108病毒粒子/毫升。因此E1 393突變體比野生型或E1130和E1 133突變體產(chǎn)生的病毒明顯少(表2)。這個(gè)差異的原因并不清楚，但可能暗示在弗林蛋白酶393-取代的糖蛋白中，折疊效率或寡聚物形成效率降低。
表2E1弗林蛋白酶突變體的復(fù)制

下面是本申請(qǐng)引用的文獻(xiàn)Moehring等，Expression of mouse furin in a Chinese hamster cell resistantto Pseudomonas exotoxin A and viruses complements the genetic lesion.J Biol.Chem.2682590-4(1993).
Moehring和Moehring，Strains of CHO-K1 cells resistant to Pseudomonasexotoxin A and cross-resistant to diphtheria toxin and viruses.Infecct.Immun.41998-1009(1983).
Mulvey和Brown，F(xiàn)ormation and rearrangement of disulfide bonds duringmaturation of the Sindbis virus E1glycoprotein.J.Virol.68805-812(1994).
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本說(shuō)明書(shū)中涉及的任何專(zhuān)利和出版物均說(shuō)明了該發(fā)明所屬于的本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。另外，這些專(zhuān)利和出版物在本申請(qǐng)中以相同形式引入作為參考，即在引入各出版物作為參考時(shí)，作出具體地個(gè)別說(shuō)明。
序列表<110>D.T.布朗(BROWN，DENNIS T.)<120>在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位點(diǎn)及其用途<130>CLFR236WO<140>PCT/US2004/014485<141>2004-05-07<150>60/469,126<151>2003-05-09<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>未知生物的描述弗林切割位點(diǎn)中的共有氨基酸序列<220>
<221>MOD_RES<222>(2)<223>X＝任何天然存在的氨基酸<400>1Arg Xaa Arg Arg1<210>2<211>4<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>未知生物的描述弗林切割位點(diǎn)中一致的氨基酸序列
<220>
<221>MOD_RES<222>(2)<223>X＝任何天然存在的氨基酸<400>2Arg Xaa Arg Lys1<210>3<211>4<212>PRT<213>未知生物<220>
<223>未知生物的描述弗林切割位點(diǎn)中一致的氨基酸序列<220>
<221>MOD_RES<222>(2)<223>X＝任何天然存在的氨基酸<400>3Lys Xaa Lys Arg1<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F130的正義引物<400>4gcacactcgc gcgcggaaag tagg 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述突變體F130的反義引物<400>5cctactttcc gcgcgcgagt gtgc 24<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F133的正義引物<400>6ccgcgatgaa agtaaaacgc cgtattgtgt acg 33<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F133的反義引物<400>7ccgtactcaa tacggcgttt tactttcatg cgg 33<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F139的正義引物<400>8ctacgggagg actaggagat tcctagatgt gt 32
<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F139的反義引物<400>9acacatctag gaatctccta gtcctcccgt ac 32<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F392的正義引物<400>10gagcaccccg agacacaaaa gagaccaaga atttc 35<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F392的反義引物<400>11gaaattcttg gtctcttttg tgtctcgggg tgctc 35<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F393的正義引物
<400>12gagcaccccg cacagaaata gacgagaatt tcaagc 36<210>13<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述突變體F393的反義引物<400>13gccggcttga aattctcgtc tatttctgtg cggggt 3權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)膜糖蛋白域的方法，其中所述域是無(wú)膜的，并且維持天然構(gòu)象，所述方法包括下述步驟將弗林蛋白酶切割序列插入將所述膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域；在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述糖蛋白；用弗林蛋白酶在所述宿主細(xì)胞的高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)中切割所述糖蛋白，由此產(chǎn)生膜糖蛋白域；從所述宿主細(xì)胞分泌所述糖蛋白域；和從所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化所述糖蛋白域，其中所述域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述弗林蛋白酶切割序列插入在選自蛋白表面、表面環(huán)和具有明顯極性的殘基區(qū)域的區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述弗林蛋白酶切割序列選自SEQID No.1-3的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜糖蛋白是病毒膜糖蛋白。
5.一種生產(chǎn)α-病毒膜糖蛋白域的方法，該膜糖蛋白域用作亞基疫苗候選物，其中所述域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象，所述方法包括下述步驟將弗林蛋白酶切割序列插入到將所述膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域；在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述糖蛋白；用弗林蛋白酶在所述宿主細(xì)胞的高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)中切割所述糖蛋白，由此產(chǎn)生膜糖蛋白域；從所述宿主細(xì)胞分泌所述糖蛋白域；和從所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化所述糖蛋白域，其中所述域是無(wú)膜的，并維持天然構(gòu)象。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將所述弗林蛋白酶切割序列插入到選自蛋白表面、表面環(huán)和具有明顯極性的殘基區(qū)域的區(qū)域。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述弗林蛋白酶切割序列選自SEQID No.1-3的序列。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述α-病毒選自辛德畢斯病毒、引起西尼羅河熱的病毒、委內(nèi)瑞拉腦炎病毒和引起黃熱病的病毒。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述α-病毒膜糖蛋白是辛德畢斯病毒E1膜糖蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，將弗林蛋白酶切割序列插入到所述E1膜糖蛋白中選自130、133和393的位置。
11.一種生產(chǎn)α-病毒疫苗候選物的方法，所述該方法包括下述步驟將弗林蛋白酶切割序列插入到將所述α-病毒的膜糖蛋白分成單獨(dú)域的區(qū)域；將一個(gè)編碼包含所述弗林蛋白酶切割序列的所述膜糖蛋白的序列摻入到一個(gè)編碼所述α-病毒的載體上；在不表達(dá)弗林蛋白酶的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述α-病毒；和收集所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的α-病毒，其中收集的病毒即α-病毒疫苗候選物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，將所述弗林蛋白酶切割序列插入到選自蛋白表面、表面環(huán)或具有明顯極性的殘基區(qū)域的區(qū)域。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述弗林蛋白酶切割序列選自SEQ ID No.1-3的序列。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述α-病毒選自辛德畢斯病毒、引起西尼羅河熱的病毒、委內(nèi)瑞拉腦炎病毒和引起黃熱病的病毒。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述膜糖蛋白是辛德畢斯病毒E1膜糖蛋白。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，將弗林蛋白酶切割序列插入到所述E1膜糖蛋白中選自130、133和393的位置。
全文摘要
在膜糖蛋白域之間插入弗林蛋白酶的切割位點(diǎn)。在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)弗林蛋白酶切割，把蛋白分成單個(gè)無(wú)膜的域，并保留其天然構(gòu)象。該操作程序可用于生產(chǎn)病毒膜蛋白域，用于結(jié)構(gòu)分析和疫苗試驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1809643SQ200480012377
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者D·T·布朗 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)