專(zhuān)利名稱：抗大腸桿菌和沙氏門(mén)菌的禽類(lèi)組合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗沙氏門(mén)菌和大腸桿菌感染的組合禽類(lèi)疫苗。特別地，本發(fā)明是有關(guān)用于家禽的分別含有沙氏門(mén)菌和大腸桿菌的突變減毒活菌株的疫苗組合物。本發(fā)明也涉及通過(guò)施用含沙氏門(mén)菌和大腸桿菌的減毒微生物的疫苗來(lái)預(yù)防包括雞在內(nèi)的家禽中的細(xì)菌性疾病的方法。
背景技術(shù)：
在家禽業(yè)中，剛孵化的雞特別容易受沙氏門(mén)菌的感染。這種細(xì)菌通過(guò)排泄物傳播，幼齡動(dòng)物可能通過(guò)該糞便或或許通過(guò)被污染了的加工飼料而感染，這將導(dǎo)致高死亡率并伴隨著嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果。除了沙氏門(mén)菌，通過(guò)排泄物的污染的禽舍的環(huán)境也含有大量的大腸桿菌(E.coli)，通過(guò)呼吸道和腸道在家禽中導(dǎo)致了全身感染。這種大腸桿菌感染被稱為大腸桿菌病。并發(fā)的菌血癥發(fā)展為敗血癥并至死亡，或感染延伸到漿膜表面、心包膜、關(guān)節(jié)處和其他器官。因而大腸桿菌和沙氏門(mén)菌都對(duì)家禽業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重持續(xù)的威脅。
對(duì)沙氏門(mén)菌的治療和預(yù)防策略包括卵黃接種來(lái)治療沙氏門(mén)菌病，如在US6,231,871 B1中描述的那樣。但是，卵黃接種的困難在于需要大型的家禽設(shè)備。大部分的孵卵缺少必要的復(fù)雜的特殊卵黃接種設(shè)備。關(guān)于大腸桿菌的感染，控制誘發(fā)感染和環(huán)境因素，并及早使用抗生素，這是減少禽舍中大腸桿菌存在量的一般公認(rèn)的措施。遺憾的是，出現(xiàn)了對(duì)四環(huán)素、卡那霉素、新霉素、頭孢金素、鏈霉素和紅霉素高頻率的耐藥性。
盡管有商購(gòu)的大腸桿菌活疫苗可用于抵抗火雞的大腸桿菌病，但這些并不是都適合用于雞的疫苗。而且，沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)包括雞在內(nèi)的家禽安全有效的用于抗沙氏門(mén)菌和大腸桿菌感染的組合疫苗，而且是經(jīng)濟(jì)施用的，如通過(guò)噴霧或飲用水大量應(yīng)用在孵化后的雞上。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)包括雞在內(nèi)的家禽安全有效的疫苗組合物，該組合物用于抵抗由包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)的沙門(mén)氏菌和大腸桿菌(Eschierichia coli)引發(fā)的感染和疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防或改善由沙門(mén)氏菌(包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌和其它的如腸炎沙門(mén)氏菌(S.enteritidis)和海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌(S.heidelberg))和大腸桿菌在家禽中引發(fā)感染或疾病的方法。
本發(fā)明的特征是所述疫苗組合物適合大量應(yīng)用，如通過(guò)飲用水或噴霧來(lái)施用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所述活疫苗組合物可以在宿主中引起細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種安全有效的禽類(lèi)疫苗組合物，其包含免疫原性有效量的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明也提供了一種用于預(yù)防和改善家禽中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染或疾病的方法，其包括給所述家禽施用免疫原性有效量的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的組合。
本發(fā)明的其它目的和特征將在下面詳細(xì)的說(shuō)明書(shū)中了解到。
發(fā)明詳述家禽的禽類(lèi)大腸桿菌疾病經(jīng)常與包括血清型O78、O1、O2，和一些特殊的有毒未分型的菌株的大腸桿菌有關(guān)。感染一般通過(guò)呼吸道產(chǎn)生，經(jīng)常接著引發(fā)或感染其它家禽群生疾病。對(duì)3到10周大的雞來(lái)說(shuō)，大腸桿菌病通常引發(fā)高熱，并且有高的發(fā)病率和死亡率。禽類(lèi)大腸桿菌病最嚴(yán)重的表現(xiàn)是敗血癥，其特征是心包炎、肝周炎和空囊炎。其它癥狀包括關(guān)節(jié)炎和蜂窩組織炎。分離自家禽中的大腸桿菌對(duì)一些藥物如氨芐西林、氯霉素、土霉素、新美素、慶大霉素、呋喃西林、萘啶酸、多粘菌素B、磺胺類(lèi)藥有高頻率的耐藥性。但是，具有于2003年3月27日保藏在美國(guó)典型生物保藏中心(ATCC)保藏號(hào)為ATTCPTA-5094的鑒定特征的大腸桿菌aroA基因缺失突變微生物大腸桿菌aroA-可以安全有效的用于包括雞在內(nèi)的家禽的大腸桿菌病中。大腸桿菌aroA-PTA-5094疫苗免疫原，當(dāng)給雞施用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。此外，所述疫苗容易生產(chǎn)并且可以大規(guī)模施用，如噴霧或飲用水。該大腸桿菌aroA-PTA-5094疫苗及其構(gòu)建體在同一申請(qǐng)人的未決的序列號(hào)為＿＿＿的專(zhuān)利申請(qǐng)中有描述，在此一并引入作為參考。另外，本發(fā)明還涉及其它的減毒活大腸桿菌基因突變體，包含缺失突變體，特別是aroA缺失突變體來(lái)作為所述組合疫苗的免疫原部分。
家禽中另一個(gè)明顯的感染源來(lái)自包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)的沙門(mén)氏菌。剛孵化出的禽類(lèi)很容易感染沙門(mén)氏菌，而且具有高的死亡率，這種孵化后立即發(fā)生的結(jié)果可帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果。很多沙門(mén)氏菌能在人類(lèi)和其它動(dòng)物引起感染，控制家禽中沙門(mén)氏菌的感染尤為重要?；畹臏p毒的沙門(mén)氏菌疫苗已顯示可以保護(hù)雞(Cooper，等人，Microb.Pathog.，9255-265，1990；Hassan和Curitis，Res.Micrbial.，141839-950，1990)。重要的是，已發(fā)現(xiàn)具有保藏在澳大利亞官方分析實(shí)驗(yàn)室(Australian Govemment Analytical Laboratories)保藏號(hào)為N93/43266的鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1的鑒定特征的無(wú)毒的鼠傷寒沙門(mén)氏菌aroA缺失突變微生物在抗沙門(mén)氏菌感染和疾病中特別有效。所述鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1微生物及其構(gòu)建物在US 6,231,871中有描述，在此被引入作為參考。另外，本發(fā)明還涉及其它減毒活沙門(mén)氏菌基因突變體，包括基因缺失突變體，特別是aroA缺失的突變體來(lái)作為所述組合疫苗的免疫原部分。
由于卵內(nèi)和口服如強(qiáng)飼法接種可能是困難的和不方便的，優(yōu)選的疫苗組合物應(yīng)適合于如通過(guò)噴霧或飲用水而大量應(yīng)用。同樣，特別優(yōu)選使用簡(jiǎn)單的疫苗組合物，其能夠安全有效的抵抗家禽中大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的感染和疾病。然而，任何多于一種的微生物與單一疫苗的組合物結(jié)合后，可能出現(xiàn)交叉影響，以至達(dá)不到微生物單獨(dú)施用時(shí)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答效果。因此，含有一種以上微生物的疫苗組合物不得不面臨上述問(wèn)題，預(yù)想得到期望的效果，實(shí)際上可能小于每種微生物單獨(dú)施用時(shí)的效果。
另人驚訝的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一種疫苗組合物對(duì)于由沙門(mén)氏菌和大腸桿菌引起的禽類(lèi)疾病和感染是安全和有效的，其含有免疫原性有效量的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的組合，以及藥學(xué)上和接受的載體。優(yōu)選的，本發(fā)明所述組合物含有作為抗原的能夠在宿主中誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的活的減毒的微生物，同時(shí)即使是通過(guò)呼吸系統(tǒng)施用時(shí)其表明是安全的。這里所述安全應(yīng)考慮可以使用經(jīng)濟(jì)有效的大規(guī)模應(yīng)用手段如噴霧(如簡(jiǎn)單的噴霧)或飲用水，或兩者，即使是在年齡非常小的時(shí)候。這一特征是重要的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)幼禽的呼吸粘膜施用兩種細(xì)菌免疫原會(huì)在動(dòng)物身上出現(xiàn)一定的毒性效應(yīng)。
組合疫苗中每種微生物的免疫原性有效量可能由于宿主的年齡、感染的程度、病原體的活力、施用的方式等而有所不同。一般來(lái)說(shuō)，每個(gè)劑量單位合適的有效量可能是大約102到104菌落生成單位(cfu)，優(yōu)選約5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更優(yōu)選約3.0×106cfu到6.0×106cfu的大腸桿菌的基因缺失突變微生物，和約102到1014cfu，優(yōu)選約5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更優(yōu)選約2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物。
一個(gè)或兩個(gè)劑量單位可以通過(guò)普通的技術(shù)人員來(lái)預(yù)測(cè)。如果選擇兩個(gè)劑量單位，那么在約孵出后一天接種然后在一到兩周大時(shí)再接種。一個(gè)劑量單位最好是每只禽約0.5到1ml疫苗，但是這樣的量可以優(yōu)化以遞送上面所描述的每種微生物的免疫原性有效量。
適合用于本發(fā)明所述組合物中的大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物可以是通過(guò)對(duì)氨基酸或維生素或其它必需分子的生物合成途徑進(jìn)行誘導(dǎo)突變來(lái)修飾的大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌微生物；優(yōu)選該突變影響了一種或多種選自下列的氨基酸的生物合成丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；更優(yōu)選對(duì)芳香族維生素的生物合成途徑誘導(dǎo)突變；特別優(yōu)選對(duì)aro途徑誘導(dǎo)突變，更優(yōu)選的是對(duì)aroA基因誘導(dǎo)突變。優(yōu)選的大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失的突變微生物的例子分別是，于2003年3月27日保藏在美國(guó)典型生物中心的編號(hào)為PTA-5094大腸桿菌aroA-微生物，和保藏在澳大利亞官方分析實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)為N93/43266的鼠傷寒沙門(mén)氏菌株STM-1，下面將表示為鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1。
根據(jù)普通技術(shù)人員獲得的信息和技術(shù)可以對(duì)作為本發(fā)明所述疫苗一部分的基因缺失的突變微生物進(jìn)行連續(xù)傳代。連續(xù)傳代可以使得減毒株更適合作為疫苗的免疫原。預(yù)期大約需要最多10次的連續(xù)傳代，優(yōu)選約3到5次。
用于本發(fā)明所述疫苗組合物的藥學(xué)可接受的載體可以是用于獸藥學(xué)組合物的任何常規(guī)的液體載體；優(yōu)選用于組織或細(xì)胞培養(yǎng)基如無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液的平衡鹽溶液，更優(yōu)選蒸餾水。其它適合的基質(zhì)包括乳化劑。普通的技術(shù)人員也可以配制本發(fā)明所述疫苗。當(dāng)該疫苗通過(guò)飲用水應(yīng)用時(shí)，脫脂干奶粉可以作為載體。該脫脂干奶粉對(duì)疫苗起穩(wěn)定作用，并且可能中和了影響疫苗活力的一些微量礦物質(zhì)的作用。
在實(shí)際操作中，大腸桿菌的基因缺失突變微生物可以組合鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物，該組合微生物可以使用液體載體混合并且可以通過(guò)噴霧或飲用水添加劑的方式施用。另外。每種微生物可以各自用液體載體混合后再組合在一起作為噴霧或飲用水添加劑施用，或同時(shí)施用。
因此，本發(fā)明也提供了預(yù)防或改善家禽大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染或疾病的方法，其包括施用家禽免疫原性有效量的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的組合物。
適合用本發(fā)明所述方法的家禽包括雞、鴨子、火雞、鵝、矮腳雞、鵪鶉、雉、鴿子等，優(yōu)選商業(yè)價(jià)值高的雞、鴨子、鵝和火雞，更優(yōu)選雞和火雞，特別優(yōu)選雞。
大腸桿菌的基因缺失突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物可以通過(guò)常規(guī)的方式施用，優(yōu)選在家禽業(yè)中經(jīng)濟(jì)可行的方式如通過(guò)噴霧或飲用水大量施用。
用于本發(fā)明所述方法的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物可以是對(duì)氨基酸或維生素或其它必需分子的生物合成途徑進(jìn)行誘導(dǎo)突變來(lái)修飾的大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌微生物；優(yōu)選該突變影響了一種或多種選自下列的氨基酸的生物合成丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸；更優(yōu)選對(duì)芳香族維生素的生物合成途徑誘導(dǎo)突變；特別優(yōu)選對(duì)aro途徑誘導(dǎo)突變，更優(yōu)選的是對(duì)aroA基因誘導(dǎo)突變。優(yōu)選的大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的例子分別是具有大腸桿菌aroA-PTA-5094和鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1的鑒定特征的那些。
用于本發(fā)明所述方法的免疫原性有效量根據(jù)宿主的年齡和大小、感染的程度、病原體的活力、施用的方式等來(lái)確定。一般來(lái)說(shuō)，合適的有效量是每劑量單位足以提供約102到1014cfu，優(yōu)選約5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更優(yōu)選約3.0×106cfu到6.0×106cfu的大腸桿菌基因缺失突變微生物的量，和每劑量單位足以提供約102到1014cfu，優(yōu)選約5.0×102cfu到5.0×1010cfu，更優(yōu)選約2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失突變微生物的量。
為了更好的理解本發(fā)明，提供以下的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是例證性的而不能在任何情況下理解為對(duì)本發(fā)明的范圍或潛在的原理的限制。事實(shí)上，本發(fā)明不同的修飾，除了那些在此已說(shuō)明和描述之外的，從下面的實(shí)施例和上述的說(shuō)明書(shū)中本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員能夠容易的實(shí)現(xiàn)。這樣的修飾同樣落入本發(fā)明附加的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1AROA基因缺失的大腸桿菌突變體的構(gòu)建I)受體親本微生物是分離自1995年提交到Veterinary Laboratories Agency(VLA)，Addlestone，Surrey，UK并在VLA測(cè)定了血清型的禽類(lèi)大腸桿菌病的臨床病例的大腸桿菌禽類(lèi)分離株。親本株通過(guò)它在一天大的SPF雞上的停留、侵襲、持久性和致病性，和在體外的抗生素敏感性的特征而選擇。受體株通過(guò)將轉(zhuǎn)化的供體(攜帶PNG101的大腸桿菌K12 S17λpir，缺失攜帶100bp的aroA)和野生型的親本株(野生型大腸桿菌分離株EC34195)結(jié)合而產(chǎn)生。
II)缺失的特征aroA基因，能編碼3-磷酸烯醇丙酮酸莽草酸-5-磷酸酯合成酶，一種普遍芳香族生物合成途徑的酶，它位于鄰近serC-aroA操縱子的serC的啟動(dòng)子的末端。受體株aroA基因的缺失導(dǎo)致了需要芳香族代謝物，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、對(duì)氨基苯甲酸酯(PABA)和2，3-二羥基苯甲酸酯。PABA，在脊椎動(dòng)物組織沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的一種代謝物的需要，導(dǎo)致了體內(nèi)生長(zhǎng)的減慢。
III)aroA基因缺失的大腸桿菌突變體的構(gòu)建a)PCR引物設(shè)計(jì)引入SrfI和BglII限制性位點(diǎn)和終止密碼子以擴(kuò)增來(lái)自上述家禽大腸桿菌O78分離株的aroA基因的3’到5’端約650bp的兩段分離的PCR產(chǎn)物。
b)這兩段PCR產(chǎn)物都用BglII消化2小時(shí)，在100伏電壓的條件下電泳1小時(shí)，切下帶并分別用SephaGlas試劑盒純化。
c)將等量體積的純化的各PCR產(chǎn)物混合后連接成pCR2.1。
d)攜帶aroA的連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成DH5α最大感受態(tài)細(xì)胞并通過(guò)限制性酶切圖譜和PCR確定克隆。
e)分離從pCR2.1刪除的完整的aroA基因通過(guò)EcorV和Spel切割然后純化并連接到預(yù)消化過(guò)的(Spel)自殺載體(SacB，pKNG101)，轉(zhuǎn)化成感受態(tài)大腸桿菌K12 S17λpir并通過(guò)限制性酶切圖譜和PCR確定克隆。
f)整合體用供體(攜帶pKNG101的大腸桿菌K12 S17λpir，缺失攜帶100bp的aroA)與野生型大腸桿菌進(jìn)行。
g)在37℃下溫育48小時(shí)后出現(xiàn)菌落然后在添加了慶大霉素、鏈霉素和芳香族氨基酸(DL色氨酸、DL苯丙氨酸和DL酪氨酸各20mg/l)的最小培養(yǎng)基中分培。各個(gè)菌落通過(guò)PCR檢測(cè)。保留產(chǎn)生野生型PCR產(chǎn)物和小了約100bp的突變體PCR產(chǎn)物用于進(jìn)一步的研究。
h)單交換體在添加了10％蔗糖的LG-B肉湯在37℃并溫和攪動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)。連續(xù)稀釋過(guò)夜的培養(yǎng)物然后放置在添加了10％蔗糖的LG-B培養(yǎng)皿上在37℃下溫育16小時(shí)。
i)生長(zhǎng)在含有10％蔗糖的LG-B培養(yǎng)皿上的菌落分別于37℃在LG-B、LG-B+慶大霉素、鏈霉素和最小培養(yǎng)基中分培16小時(shí)。將只生長(zhǎng)在LG-B培養(yǎng)皿(雙交換體)上的菌落在含有5％綿羊血的瓊脂上分培并在4℃下保存。
IV)中間克隆載體自殺載體(SacB，pKNG101)是中間克隆載體。整合體由供體(攜帶缺失了100bp的aroA的S17的PNG101)和野生型大腸桿菌構(gòu)成。
實(shí)施例2主種的制備大腸桿菌aroA-株(實(shí)施例1構(gòu)建的)培養(yǎng)在典型的大豆瓊脂平板1次然后在典型的大豆肉湯中培養(yǎng)3次。培養(yǎng)物分布到玻璃小瓶中，密封并凍干。
實(shí)施例3大腸桿菌基因缺失的突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失的突變微生物的組合在雞中的抗大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染的效力的評(píng)價(jià)在評(píng)價(jià)中，所使用的大腸桿菌基因缺失的突變微生物是在實(shí)施例1和2中所述大腸桿菌aroA-株，所使用的鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失的突變微生物是在US 6,231,871 B1中描述制備的鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1。
為了進(jìn)行評(píng)價(jià)，將103只SPF白色來(lái)亨雞不分性別的分成5組，2組每組25只、2組每組24只和1個(gè)對(duì)照組(不接種、沒(méi)有變化)5只。摘掉翅膀的雞被強(qiáng)迫放置在設(shè)計(jì)好的隔離室中。每個(gè)試驗(yàn)組放置在兩個(gè)隔離室中，每個(gè)隔離室有12或13只雞。
試驗(yàn)組A和B(接種)在1天大時(shí)用手控的噴霧器進(jìn)行一般的噴霧接種。在1天大時(shí)，將試驗(yàn)組A和B中的雞一起關(guān)在一個(gè)小的容器中并且給雞群的頭部進(jìn)行噴霧接種E.col和鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失突變微生物組合疫苗，直到達(dá)到給出的標(biāo)準(zhǔn)劑量(每只雞每0.5ml劑量含有5.0×106cfu的大腸桿菌aroA-PTA-5094和5.0×106cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1)。每個(gè)疫苗，大腸桿菌aroA-PTA-509和鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽(PBS)稀釋混合后接種。在2周大時(shí)，再使用飲用水途徑對(duì)試驗(yàn)組A和B預(yù)先接種。在給雞使用飲用水途徑接種前先使其禁水3小時(shí)。前述的用于噴霧使用的兩種疫苗加入測(cè)定的冷卻蒸餾水直到最終滴度為5.0×106cfu每只疫苗的劑量(0.5ml每只雞)。疫苗用水唯一的來(lái)源是飲用水。一旦疫苗用水用完，飲用者從該單元(隔離室)中移走并添加通常的飲用水源。
在6周大時(shí)，試驗(yàn)組A(接種過(guò)的)和試驗(yàn)組C(未接種的)的每只雞通過(guò)氣管內(nèi)(IT)途徑以每劑量滴度為5.89×108cfu的大腸桿菌078的有毒菌株攻擊。同時(shí)，在6周大時(shí)，試驗(yàn)組B(接種過(guò)的)和試驗(yàn)組D(未接種的)通過(guò)口腔強(qiáng)飼法以每劑量滴度為4.01×106cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗萘啶酸菌株攻擊。
試驗(yàn)組E沒(méi)有接種和沒(méi)有攻擊(陰性對(duì)照組)。接種的和對(duì)照的雞重新放置在隔離室中，直到完成研究。
所有的雞都在獸醫(yī)的照料下喂食和飲用可獲得的任意的食物和水。雞在攻擊后觀察7天。在攻擊7天后，將所有存活的雞進(jìn)行尸體解剖并且試驗(yàn)組A和C用于檢測(cè)是否存在有明顯禽類(lèi)大腸桿菌病損傷。表現(xiàn)出明顯可見(jiàn)損傷如肝周炎、心包炎、空囊炎、蜂窩組織炎、或關(guān)節(jié)炎的沒(méi)有存活的雞，認(rèn)為其呈大腸桿菌病陽(yáng)性。數(shù)據(jù)顯示在表I中。
試驗(yàn)組B和D用于檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌在器官中的菌落形成。數(shù)據(jù)顯示在表II中。
表I大腸桿菌基因缺失的突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失的突變微生物的組合在雞中抗大腸桿菌078和疾病*的效力評(píng)價(jià)
a肝周炎b心包炎c空囊炎d蜂窩組織炎e關(guān)節(jié)炎*給雞施用疫苗來(lái)預(yù)防與大腸桿菌感染有關(guān)的大腸桿菌病。
表II大腸桿菌基因缺失的突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因缺失的突變微生物的組合在雞中的抗沙門(mén)氏菌感染和疾病*的效力評(píng)價(jià)
a口腔強(qiáng)飼法*給雞施用疫苗來(lái)減少在包括腸和盲腸的內(nèi)部器官中形成菌落的沙門(mén)氏菌。
表I和II的結(jié)果表明，由于施用了本發(fā)明所述組合疫苗，與大腸桿菌感染有關(guān)的大腸桿菌病和沙門(mén)氏菌感染的發(fā)生率都明顯下降。在表II中，大幅度的減少了沙門(mén)氏菌的菌落形成，意味著較少的雞被感染并因此很少發(fā)展為全身性疾病，并且很少將疾病傳染給雞的卵。
權(quán)利要求
1.一種禽類(lèi)疫苗組合物，其含有免疫原性有效量的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的組合，和藥學(xué)上可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述載體是適合用于組織或細(xì)胞培養(yǎng)基中的平衡鹽溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述載體是蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述免疫原性有效量是足以提供約5.0×102cfu到5.0×1010cfu的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和約5.0×102cfu到5.0×1010cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述大腸桿菌的基因缺失突變微生物是大腸桿菌aroA-微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述組合物，其中所述微生物是具有ATCC PTA-5094的鑒定特征的大腸桿菌aroA-微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述組合物，其中所述鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物是鼠傷寒沙門(mén)氏菌aroA-微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述組合物，其中所述微生物是具有鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1的鑒定特征的微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述組合物，其中所述大腸桿菌的基因缺失突變微生物是具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑒定特征的微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述組合物，其中所述免疫原性有效量是足以提供約3.0×106cfu到6.0×106cfu的大腸桿菌aroA-PTA-5094和約2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1的量。
11.一種在家禽中預(yù)防或改善大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染或疾病的方法，其包括給所述家禽施用免疫原性有效量的大腸桿菌的基因缺失突變微生物和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其中所述家禽選自雞、鴨、鵝、火雞、矮腳雞、鵪鶉、雉和鴿子。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其中所述組合可以大量施用。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其中所述組合中的大腸桿菌的基因缺失突變微生物是大腸桿菌aroA-微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述方法，其中所述微生物是具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑒定特征的菌株。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其中所述組合中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因缺失突變微生物是鼠傷寒沙門(mén)氏菌aroA-微生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，其中所述微生物是具有鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1的鑒定特征的菌株。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述方法，其中所述大腸桿菌的基因缺失突變微生物是大腸桿菌aroA-微生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述方法，其中所述大腸桿菌微生物是具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑒定特征的微生物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述方法，其中所述免疫原性有效量是足以提供約3.0×106cfu到6.0×106cfu的大腸桿菌aroA-PTA-5094和約2.0×106cfu到6.0×106cfu的鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM-1的量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，其含有基因缺失突變體的鼠傷寒沙門(mén)氏菌微生物和基因缺失突變體的大腸桿菌微生物的組合，適合大量應(yīng)用于家禽。本發(fā)明同時(shí)提供了一種安全有效保護(hù)家禽免于大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染和疾病損傷的方法。
文檔編號(hào)C12N15/03GK1787836SQ200480012919
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月14日
發(fā)明者H·H·范, M·庫(kù)馬 申請(qǐng)人:惠氏公司