專利名稱：改良的轉(zhuǎn)化體以及用其制造聚酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為了酶合成共聚聚酯所必需的基因、利用該基因發(fā)酵合成聚酯的微生物、以及使用該微生物制造聚酯的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)知道至今為止在大量的微生物中，將聚羥基鏈烷酸(以下，簡稱為PHA)等聚酯作為能源儲存物質(zhì)儲藏在菌體內(nèi)。作為其代表例是3-羥基丁酸(以下，簡稱為3HB)的均聚物聚-3-羥基丁酸(以下，簡稱為P(3HB))，其在巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)中于1925年最初被發(fā)現(xiàn)(參照非專利文獻1)。P(3HB)為熱塑性高分子，由于可以在自然環(huán)境中被生物降解，因此作為環(huán)保塑料而受到注目。可是，由于P(3HB)結(jié)晶性高，具有硬而脆的性質(zhì)，在實際應(yīng)用上限制了其應(yīng)用范圍。因此，形成了以改良該性質(zhì)為目的的研究。
其中，公開了含有3-羥基丁酸(3HB)和3-羥基戊酸(以下，簡稱為3HV)的共聚物(以下，簡稱為P(3HB-co-3HV))的制備方法(參照專利文獻1、2)。該P(3HB-co-3HV)與P(3HB)相比，由于富有柔軟性，被認為可以應(yīng)用于廣泛的用途。可是，實際應(yīng)用時，即使P(3HB-co-3HV)增加3HV的摩爾分數(shù)，其物理特性也缺乏變化，特別是使用于膜等時，由于柔軟性沒有提高到所需程度，只能利用于洗發(fā)液瓶子或1次性剃刀的把手等硬質(zhì)成型體的領(lǐng)域。
近年，進行了對3HB和3-羥基己酸(以下，簡稱為3HH)這兩種成分的共聚聚酯(以下，簡稱為P(3HB-co-3HH))的制造方法的研究(參照專利文獻3、4)。這些專利文獻的P(3HB-co-3HH)的制造方法是使用從土壤分離的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸或橄欖油等油脂發(fā)酵生產(chǎn)。另外，還形成了關(guān)于P(3HB-co-3HH)的性質(zhì)的研究(參照非專利文獻2)。在此報告中，將碳原子數(shù)12個或12個以上的脂肪酸作為唯一的碳源，培養(yǎng)豚鼠氣單胞菌，發(fā)酵生產(chǎn)3HH為11～19摩爾％的P(3HB-co-3HH)。已知，該P(3HB-co-3HH)隨著3HH摩爾分數(shù)的增加，由P(3HB)的硬而脆的性質(zhì)漸漸地變?yōu)轱@示柔軟的性質(zhì)，并顯示超過P(3HB-co-3HV)的柔軟性?？墒牵谠撝苽浞椒ㄖ?，由于菌體生產(chǎn)量為4g/L、聚合物含量為30％，聚合物生產(chǎn)率低，為面向?qū)嵱没?，需要進一步探索獲得高生產(chǎn)率的方法。
PHA合成酶基因是從生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)的豚鼠氣單胞菌(A.caviae)克隆的(參照專利文獻5、非專利文獻3)。將該基因?qū)敫火B(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha，舊名為真氧產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus))得到轉(zhuǎn)化體，使用植物油脂作為碳源培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，達到了菌體含量4g/L、聚合物含量80％(參照非專利文獻4)。另外，還公開了以大腸桿菌等細菌或植物為宿主的P(3HB-co-3HH)的制造方法，但沒有記載其生產(chǎn)率(參照專利文獻6)。
上述聚合物P(3HB-co-3HH)，通過控制3HH摩爾分數(shù)，可以具有由硬質(zhì)聚合物到軟質(zhì)聚合物的寬范圍物理特性，因此，可以期待向電視機的框體等要求硬度的物體到線或膜等要求柔軟性的物體的廣泛領(lǐng)域的應(yīng)用?？墒?，這些制備方法的聚合物生產(chǎn)率依然低，仍不足以作為該聚合物實用化的生產(chǎn)方法。
最近，由吉瀬等報道了一種構(gòu)建大腸桿菌的方法，該方法是通過在進化工學(xué)上改變來源于豚鼠氣單胞菌的P(3HB-co-3HH)合成酶并將其基因?qū)氲酱竽c桿菌中，從而構(gòu)建與導(dǎo)入了野生型基因的大腸桿菌相比，高蓄積P(3HB-co-3HH)的大腸桿菌(參照非專利文獻5)。其中，可以得到E2-50株以及T3-11株作為P(3HB-co-3HH)合成酶比活性提高了的菌株。E2-50株是P(3HB-co-3HH)合成酶的第149個氨基酸天冬酰胺被絲氨酸取代的突變菌株，T3-11株是第171個氨基酸天冬氨酸被甘氨酸取代的突變菌株。E2-50株的變異酶比活性提高到天然型的約1.5倍，T3-11株提高到天然型的約1.2倍?？墒?，通常，由于大腸桿菌不能利用廉價的油脂作為碳源，另外，不具有合成P(3HB-co-3HH)的構(gòu)成單元的途徑中必要的乙酰輔酶A縮合酶，因此，如果不從其它的途徑導(dǎo)入油脂分解類或底物供給類的基因等，則不能得到廉價并且有效的生產(chǎn)體系。另外，アマラ等也取得了比活性提高到5倍的突變體，但在將葡萄糖作為碳源時的聚合物生產(chǎn)率只不過稍有提高(參照非專利文獻6)。在大腸桿菌中，提高了活性的變異型聚合物合成酶不能充分地發(fā)揮其能力，另外，大腸桿菌也不能直接利用廉價的植物油脂作為碳源等，在經(jīng)濟性方面缺乏作為聚合物生產(chǎn)宿主的實用性。
由Leaf等進行了將菌體生產(chǎn)率高的酵母作為宿主的生物降解性聚酯的生產(chǎn)研究(參照非專利文獻7)。在作為酵母的一種的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中導(dǎo)入富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(R.eutropha)的聚酯合成酶基因而制作轉(zhuǎn)化體，并通過以葡萄糖作為碳源進行培養(yǎng)，確認了P(3HB)的蓄積?？墒牵谏鲜鲅芯恐猩a(chǎn)的聚合物含量停留在0.5％，該聚合物是具有硬而脆的性質(zhì)的P(3HB)。并且還進行了在釀酒酵母中表達來源于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的聚酯合成酶基因，將脂肪酸作為碳源生產(chǎn)含有碳原子數(shù)5或5以上的單體的共聚物研究。此時，生產(chǎn)的聚合物含量也停留在0.5％(參照非專利文獻8)。另外，還進行了在巴斯德畢赤氏酵母(PichiaPastoris)的過氧化物酶體中，定位表達來源于相同的假單胞菌種的聚酯合成酶基因，并且將油酸作為碳源生產(chǎn)聚酯的研究。按照該研究，示出了每單位干燥菌體蓄積了1％重量的聚合物(參照非專利文獻9)。可是，這種程度的蓄積量，是完全不夠的。
已知酵母的增殖快，菌體生產(chǎn)率高。其中，過去，屬于假絲酵母(candida)屬的酵母作為單細胞蛋白質(zhì)備受矚目，研究了將正構(gòu)烷烴作為碳源生產(chǎn)菌體作為飼料。另外，近年還報道了開發(fā)假絲酵母(Candida)屬的宿主載體體系，使用了基因重組技術(shù)的物質(zhì)生產(chǎn)(參照非專利文獻10)。將產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)作為宿主的α-淀粉酶的生產(chǎn)率高達約12.3g/L，期待具有這樣高的物質(zhì)生產(chǎn)能力的假絲酵母(candida)屬微生物作為聚合物生產(chǎn)用宿主。另外，與細菌相比，由于菌體與培養(yǎng)液的分離容易，還可以使聚合物的提取精制工序更加簡單。
因此，雖然開發(fā)了使用假絲酵母(candida)屬酵母等生產(chǎn)具有優(yōu)異的物理特性的P(3HB-co-3HH)的方法，但在聚合物的生產(chǎn)率方面還必須進一步加以改良(參照專利文獻7)。作為提高單位菌體的聚合物生產(chǎn)量的方法之一，可以舉出增加聚合物合成酶的菌體內(nèi)量的方法。作為增加聚合物合成酶的菌體內(nèi)量的方法，有使用強啟動子的方法或使用拷貝數(shù)多的質(zhì)粒的方法、在質(zhì)?；蛉旧w中導(dǎo)入多個酶表達單元的方法等?？墒?，已知如果增加單位菌體的酶的分子數(shù)，將引起生產(chǎn)的聚合物的分子量降低(參照非專利文獻11、12)。由于聚合物的分子量對生物降解性聚合物的物理特性帶來很大的影響，因此，期望開發(fā)不導(dǎo)致分子量的降低而提高生產(chǎn)率的方法。
專利文獻1特開昭57-150393號公報專利文獻2特開昭59-220192號公報專利文獻3特開平5-93049號公報專利文獻4特開平7-265065號公報專利文獻5特開平10-108682號公報專利文獻6國際公開第00/43525號小冊子專利文獻7國際公開第01/88144號小冊子非專利文獻1M.Lemoigne，Ann.Inst.Pasteur，39，144(1925)非專利文獻2Y.Doi，S.Kitamura，H.Abe，Macromolecules 28，4822-4823(1995)非專利文獻3T.Fukui，Y.Doi，J.Bacteriol，vol.179，No.15，4821-4830(1997)非專利文獻4T.Hukui等，Appl.Microbiol.Biotecnol.49，333(1998)非專利文獻5T.Kichise等，Appl.Environ.Microbiol.68，2411-2419(2002)非專利文獻6Amara AA.等，Appl.Microbiol.Biotecnol.59，477-482(2002)非專利文獻7Microbiology，vol.142，pp1169-1180(1996)非專利文獻8Poirier Y.等，Appl.Microbiol.Biotecnol.67，5254-5260(2001)非專利文獻9Poirier Y.等，F(xiàn)EMS Microbiology Lett.，vol.207，pp97-102(2002)非專利文獻10化學(xué)與生物 Vol.38，No.9，614(2000)非專利文獻11Sim S.J.等，Neture Biotechnology，vol.15，pp63-67(1997)非專利文獻12Gerngross T.U.，Martin D.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.92，pp6279-6283(1995)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題本發(fā)明鑒于上述現(xiàn)狀，其目的在于提供一種可以在酵母中以有功能并且有效的方式表達的PHA合成酶突變基因、用含有該突變基因的基因表達盒轉(zhuǎn)化酵母得到的轉(zhuǎn)化體，以及通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體而制造的具有生物降解性以及優(yōu)異的物理特性的P(3HB-co-3HH)等聚酯。
解決問題的手段本發(fā)明者們進行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶的氨基酸序列中導(dǎo)入特定的突變，將編碼該突變的氨基酸序列的基因與在酵母中實質(zhì)上發(fā)揮功能的啟動子、終止子相連，構(gòu)建基因表達盒，再將該基因表達盒導(dǎo)入到酵母中，得到轉(zhuǎn)化株，通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化株，可以從該培養(yǎng)生產(chǎn)并回收聚酯并且預(yù)計生產(chǎn)率極高。
即，本發(fā)明涉及在酵母中應(yīng)用來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶突變體的基因。
具體地，涉及一種含有PHA合成酶突變基因和在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子的基因表達盒，所述PHA合成酶突變基因是編碼在含有序列表1所示氨基酸序列的來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶中，進行至少1個以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的PHA合成酶突變體的PHA合成酶突變基因。
(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代另外，本發(fā)明還涉及在編碼上述PHA合成酶突變體的PHA合成酶突變基因中，添加編碼過氧化物酶體定位信號的DNA而形成的基因。
作為其優(yōu)選的實施方案，是關(guān)于上述基因，其中的過氧化物酶體定位信號含有由序列號2或序列號3所示的氨基酸序列；更加優(yōu)選的實施方案，是關(guān)于上述基因，其中編碼過氧化物酶體定位信號的DNA堿基序列為序列號4或序列號5所示的堿基序列。
作為其他的優(yōu)選的實施方案，是關(guān)于上述基因，其中編碼來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶的基因中至少1個CTG密碼子變換為TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
另外，本發(fā)明還涉及含有上述基因和在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子的基因表達盒。
另外，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化體，其是將1個或1個以上所述基因表達盒導(dǎo)入到酵母中得到的轉(zhuǎn)化體；優(yōu)選其中的酵母為麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)。
另外，本發(fā)明還涉及一種制造聚酯的方法，其特征在于，從培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中收獲聚酯；優(yōu)選所述聚酯為共聚下述式(1)表示的3-羥基丁酸和下述式(2)表示的3-羥基己酸而得到的共聚聚酯。 以下，詳細地說明本發(fā)明。
(1)聚酯合成酶的有用的突變體在本發(fā)明中，將在序列號1表示的來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶的氨基酸序列中，進行至少1個以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的PHA合成酶突變體作為有用的突變體使用。
(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代在此，例如，所說的「Asn-149」，是指氨基酸序列中第149位的天冬酰胺，(a)的氨基酸取代是將第149位的天冬酰胺變換為絲氨酸。
作為獲得上述突變體的方法，可以舉出例如以下的方法。改變來源于豚鼠氣單胞菌等細菌的聚酯合成酶的氨基酸序列，取得改良了酶活性·底物特異性·熱穩(wěn)定性等性質(zhì)的突變體的方法已知有多種，特別是，利用分子進化技術(shù)的方法(特開2002-199890號公報)等由于可以迅速地得到期望的突變體，因此，有用性高。另外，可以通過計算機輔助酶構(gòu)象或預(yù)想的構(gòu)象來鑒定有用的氨基酸突變等，例如可以使用Shrike程序(特開2001-184831號公報)。
這樣被鑒定的氨基酸取代(突變)是否顯示目的宿主的預(yù)想效果，需要對應(yīng)于實際情況才可以確認。這是因為，T.Kichise等Appl.Environ.Microbiol.68，2411-2419(2002)、或Amara AA.等Appl.Microbiol.Biotechnol.59，477-482(2002)利用分子進化技術(shù)從大腸桿菌得到的突變體，是最適應(yīng)用于取得這些突變體的大腸桿菌的生長條件的突變體，不能保證在不同的生長或增殖條件或?qū)ζ渌木N也合適，另外，在計算機上構(gòu)建的突變體的準確度仍然是不足的。
另外，通過分子進化技術(shù)得到的突變，可以通過將其進行組合來獲得更加合適的突變體，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用進行了2個或2個以上上述(a)～(h)的氨基酸取代而得到的突變體。
(2)酵母突變基因的構(gòu)建作為編碼了通過上述(1)中記載的方法而得到的突變體的基因，可以舉出與在序列號1表示的來源于豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶的氨基酸序列中，進行上述(1)的氨基酸取代對應(yīng)的DNA突變的基因等。另外，優(yōu)選導(dǎo)入了在適應(yīng)于酵母的PHA合成酶基因中，對應(yīng)于上述(1)的氨基酸取代的DNA突變的基因。
作為適應(yīng)于酵母的PHA合成酶基因，沒有特別的限定，可以舉出，例如，在麥芽糖假絲酵母中編碼與豚鼠氣單胞菌PHA合成酶基因相同的氨基酸序列的基因，即ORF2(記載于WO 01/88144的序列號3)等。
即，如果直接使用來源于細菌的基因，則有在宿主酵母中讀取密碼子顯示異常的情況，例如，在麥芽糖假絲酵母中，密碼子CTG不被翻譯成亮氨酸而是被翻譯成絲氨酸(H.Sugiyama et al，Yeast 11，43-52(1995))。這樣的問題，可以通過使用改良的基因來解決，在這種改良的基因中，預(yù)先將至少1個CTG密碼子變換為對應(yīng)于亮氨酸的其他密碼子(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA)。另外，考慮到宿主所用基因的密碼子使用頻率，可以構(gòu)建·利用具有變更為使用頻率高的密碼子的基因。
為了在上述適應(yīng)于酵母的PHA合成酶基因中導(dǎo)入上述(1)中記載的氨基酸取代(突變)，可以使用定點誘變法將基因密碼子的突變導(dǎo)入到目標位點。以定點誘變方式在基因的氨基酸序列中引入突變的方法，可以使用重組DNA法、PCR法等來進行。例如，在希望導(dǎo)入突變的PHA合成酶基因的目的位點兩側(cè)存在適當?shù)南拗泼缸R別序列時，可以通過盒式誘變法來進行用上述限制酶切斷序列，取出含有希望導(dǎo)入突變的位點的區(qū)域，將其插入通過化學(xué)合成等只在目的位點導(dǎo)入突變的DNA片段。另外，通過PCR導(dǎo)入位點特異性突變的方法還可以如下進行用突變引物和擴增引物擴增PHA合成酶基因的一側(cè)，所述突變引物在需要導(dǎo)入突變的位點導(dǎo)入了目標突變，所述擴增引物不具有包含該基因一個末端序列的突變；用另一突變引物和另一擴增引物擴增所述基因的另一側(cè)，所述另一突變引物具有與上述突變引物互補的序列，所述另一擴增引物不具有包含該基因另一末端序列的突變；將得到的2種擴增片段退火后，再用上述2種擴增引物進行PCR。對于以定點方式得到的構(gòu)建體，通過測定堿基序列進行確認。堿基序列可以通過在該技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，使用自動堿基序列分析儀等來測定。
一般地，使用酵母發(fā)酵生產(chǎn)聚酯時，碳源為葡萄糖或油脂類、脂肪酸類等，只要是酵母可以利用的物質(zhì)，則可以不受特別限制地使用。特別是，將油脂類、脂肪酸類或正構(gòu)烷烴(n-paraffin)等作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)聚酯時，這些碳源經(jīng)過β氧化路線進行代謝，β氧化路線的代謝中間體可以有效地作為聚酯合成的底物使用(T.Fukui，Y.Doi，J.Bacteriol.，179，No.15，4821-4830(1997)；Q.Ren等，J.Bacteriol.，182，No.10，2978-2981(2000))。在此，在酵母中的β氧化由于是在作為細胞內(nèi)小體的過氧化物酶體內(nèi)進行，為了高效地合成聚酯，優(yōu)選參與聚酯合成的酶處于過氧化物酶體中。
向過氧化物酶體輸送的蛋白質(zhì)，在游離的核糖體上合成，通過處于此蛋白質(zhì)序列中的過氧化物酶體定位信號的作用，向過氧化物酶體進行輸送(S.Subramani，J.Membrane Biol.，125，99-106(1992)、板井康能，化學(xué)與生物，35，No.10，687-695(1997)、E.H.Hettema，Biochim.Biophys.Acta，1451，17-34(1999))。
因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選將編碼這些過氧化物酶體定位信號的DNA添加在編碼參與聚酯合成的酶的基因，即上述PHA合成酶突變基因上，由此，可以將參與聚酯合成的酶，即PHA合成酶突變體定位在過氧化物酶體上部，從而可以高效地合成聚酯。
已知處于羧基末端的過氧化物酶體定位信號含有3個氨基酸的序列「(絲氨酸/丙氨酸/半胱氨酸)-(賴氨酸/精氨酸/組氨酸)-亮氨酸」。在這里，例如，所說的(絲氨酸/丙氨酸/半胱氨酸)是指絲氨酸、丙氨酸或半胱氨酸的任何一種的意思。為了使PHA合成酶突變體定位在過氧化物酶體中，可以將上述3個氨基酸添加在該酶的羧基末端上。其中，優(yōu)選將最常見的羧基末端過氧化物酶體定位信號「絲氨酸-賴氨酸-亮氨酸」(以下簡稱為SKL)(序列號2)、或在熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)中作為羧基末端過氧化物酶體定位信號(J.D.Aitchison et al.，J.Biol.Chem.，266，23197-23203(1991))的「丙氨酸-賴氨酸-異亮氨酸」(以下簡稱為AKI)(序列號3)添加在羧基末端。
對應(yīng)于上述氨基酸的堿基序列沒有特別的限制，例如，如果是例如SKL，可以使用序列號4、如果是AKI，可以使用序列號5。
另外，作為過氧化物酶體定位信號，還已知存在于N末端附近的9個氨基酸的序列「(精氨酸/賴氨酸)-(亮氨酸/纈氨酸/異亮氨酸)-(5個氨基酸)-(組氨酸/谷氨酸)-(亮氨酸/丙氨酸)」。將這些序列插入到PHA合成酶突變體中，也可以使該酶定位于過氧化物酶體中。
為了將編碼了上述過氧化物酶體定位信號的DNA添加在PHA合成酶突變基因中，可以使用化學(xué)合成法、PCR法等。
(3)基因表達盒的構(gòu)建本發(fā)明的基因表達盒，是含有上述(2)的突變基因和在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子的物質(zhì)。
為了在酵母中表達上述(2)的突變基因，在該基因的5’上游，啟動子、上游活化區(qū)域(UAS)等DNA序列是必要的，而在該基因的3’下游，poly(A)附加信號、終止子等DNA序列是必要的。在酵母的染色體上如果具有滿足上述條件的適當?shù)奈稽c，也可以直接插入該基因，另外，也可以在具有適當?shù)膯幼雍徒K止子的質(zhì)粒中插入該基因，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母。
在本發(fā)明中，優(yōu)選在該基因的5’上游連結(jié)啟動子、在該基因3’下游連結(jié)終止子，從而構(gòu)建出基因表達盒，并用其轉(zhuǎn)化酵母。使用的啟動子、終止子只要是在作為宿主的酵母中發(fā)揮功能的，任何序列均可以使用。啟動子有組成型表達的和誘導(dǎo)型表達的，任何一種啟動子均可使用。在本發(fā)明中，使用麥芽糖假絲酵母作為宿主時，上述啟動子、終止子優(yōu)選在麥芽糖假絲酵母中發(fā)揮功能的物質(zhì)，因此優(yōu)選來源于麥芽糖假絲酵母。更加優(yōu)選使用來源于麥芽糖假絲酵母的ALK1、ALK2、ALK5基因的啟動子、來源于ALK1基因的終止子。
例如，作為啟動子，可以使用麥芽糖假絲酵母的ALK1基因(GenBankD00481)的啟動子ALK1p(WO 01/88144)、ALK5基因的啟動子ALK5p(序列號6)等。另外，還可以使用通過在這些啟動子的上游添加多個ARR(alkaneresponsible region)序列而提高了啟動子活性的啟動子(木暮等，2002年日本農(nóng)藝化學(xué)大會演講要旨集，p191)(序列號7)。另外，作為終止子，可以使用麥芽糖假絲酵母的ALK1基因的終止子ALK1t(WO 01/88144)等。
另外，上述啟動子、終止子的堿基序列只要是在麥芽糖假絲酵母中發(fā)揮功能的序列，也可以是缺失、取代和/或添加1個或多個堿基的堿基序列。在此，所說的「缺失、取代和/或添加1個或多個堿基的堿基序列」是指按照在蛋白質(zhì)酶增刊基因擴增PCR法TAKKAJ 35(17)，2951-3178(1990)或HenryA.Erlich編加藤郁之進鑑譯PCR技術(shù)(1990)等記載的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，以可以缺失、取代和/或添加的數(shù)目進行堿基缺失、取代和/或添加而得到的堿基序列。
在添加了編碼過氧化物酶體定位信號的DNA的編碼豚鼠氣單胞菌PHA合成酶突變體的基因中，在其5’上游連接上述啟動子，在其3’下游連接終止子。
用于構(gòu)建基因表達盒的載體，可以是任何能在大腸桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒，另外，它們還可以具有能在酵母中自主復(fù)制的區(qū)域。能在酵母中自主復(fù)制的載體在菌體內(nèi)被保持。另外，還可以將基因表達盒整合到染色體上。作為載體的一例，可以使用能在麥芽糖假絲酵母中自主復(fù)制的pUTU1(M.Ohkuma，et al.，J.Biol.Chem.，vol.273，3948-3953(1998))。
作為將啟動子以及終止子和結(jié)構(gòu)基因連結(jié)，構(gòu)建本發(fā)明的基因表達盒的方法，沒有特別的限定。除了后述的本實施例中記載的方法以外，為了形成限制酶位點，還可以使用PCR法。例如，可以使用WO 01/88144中記載的方法。
(4)宿主對本發(fā)明所說的酵母，沒有特別限制，可以使用菌株保藏單位(例如IFO、ATCC等)保藏的Aciculoconidium屬、Ambrosiozyma屬、Arthroascus屬、Arxiozyma屬、阿舒氏囊霉菌屬(Ashbya屬)、Babjevia屬、Bensingtonia屬、Botryoascus屬、Botryozyma屬、酒香酵母屬(Brettanomyces屬)、布氏彈孢酵母屬(Bullera屬)、Bulleromyces屬、假絲酵母屬(Candida屬)、Citeromyces屬、Clavispora屬、隱球酵母屬(Cryptococcus屬)、Cystofilobasidium屬、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces屬)、德克氏酵母屬(Dekkera屬)、Dipodascopsis屬、雙足囊菌屬(Dipodascus屬)、Eeniella屬、Endomycopsella屬、絲囊霉屬(Eremascus屬)、假囊酵母屬(Eremothecium屬)、Erythrobasidium屬、Fellomyces屬、Filobasidium屬、Galactomyces屬、地霉屬(Geotrichum屬)、小季氏酵母屬(Guilliermondella屬)、有孢漢遜氏酵母屬(Hanseniaspora屬)、漢遜氏酵母屬(Hansenula屬)、Hasegawaea屬、Holtermannia屬、Hormoascus屬、Hyphopichia屬、伊氏酵母菌屬(Issatchenkia屬)、克勒克氏酵母屬(Kloeckera屬)、克勒克氏孢屬(Kloeckeraspora屬)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces屬)、Kondoa屬、Kuraishia屬、Kurtzmanomyces屬、Leucosporidium屬、油脂酵母屬(Lipomyces屬)、Lodderomyces屬、鱗斑霉屬(Malassezia屬)、梅奇酵母屬(Metschnikowia屬)、Mrakia屬、Myxozyma屬、拿遜氏酵母菌(Nadsonia屬)、Nakazawaea屬、針孢酵母屬(Nematospora屬)、Ogataea屬、卵孢酵母屬(Oosporidium屬)、Pachysolen屬、Phachytichospora屬、Phaffia屬、畢赤氏酵母屬(Pichia屬)、Rhodosporidium屬、紅酵母屬(Rhodotorula屬)、糖酵母屬(Saccharomyces屬)、類糖酵母屬(Saccharomycodes屬)、復(fù)膜孢糖酵母屬(Saccharomycopsis屬)、Saitoella屬、Sakaguchia屬、Saturnospora屬、裂芽酵母屬(Schizoblastosporion屬)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces屬)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces屬)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus屬)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces屬)、Sporopachydermia屬、Stephanoascus屬、梗孢酵母屬(Sterigmatomyces屬)、Sterigmatosporidium屬、Symbiotaphrina屬、Sympodiomyces屬、Sympodiomycopsis屬、有孢圓酵母屬(Torulaspora屬)、Trichosporiella屬、絲孢酵母屬(Trichosporon屬)、三角酵母屬(Trigonopsis屬)、Tsuchiyaea屬、Udeniomyces屬、Waltomyces屬、威克酵母屬(Wickerhamia屬)、擬威克酵母屬(Wickerhamiella屬)、擬威爾氏酵母屬(Williopsis屬)、Yamadazyma屬、Yarrowia屬、Zygoascus屬、接合糖酵母屬(Zygosaccharomyces屬)、擬接合魏立氏酵母屬(Zygowilliopsis屬)、Zygozyma屬等酵母。
另外，作為本發(fā)明轉(zhuǎn)化宿主使用的酵母，沒有特別的限定，但在上述之中，優(yōu)選假絲酵母屬、Yarrowia屬的酵母，更加優(yōu)選麥芽糖假絲酵母、ヤロウイア·リポリテイカ(Yarrowia lipolytica)，特別優(yōu)選麥芽糖假絲酵母。
另外，在作為轉(zhuǎn)化宿主使用的酵母中，麥芽糖假絲酵母AC16株于平成12年11月15日以保藏號FERM BP-7366在日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心進行國際保藏。
(5)轉(zhuǎn)化體的制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是在酵母中導(dǎo)入1個或1個以上上述(3)的基因表達盒而形成的。
為了將參與聚合物合成的基因表達盒重組載體導(dǎo)入到酵母中，可以按照已知的方法進行。例如，可以使用鈣法(Lederberg，E.M.et al.，J.Bacteriol.，119，1072(1974))或電穿孔法(Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，1.8，第4頁(1994))等。另外，還可以利用Fast Track TM-Yeast Transformation KitSM(Geno Technology)這樣的市售的轉(zhuǎn)化試劑盒。
作為宿主的一例，可以使用麥芽糖假絲酵母CHA1株(S.Kawai，et al.，Agric.Biol.Chem.，vol.55，59-65(1991))。使用上述的轉(zhuǎn)化法，用含有參與聚合物合成的基因表達盒的質(zhì)粒載體等轉(zhuǎn)化本菌株，可以制備如后述實施例所示的具有pARR-ORF2S等質(zhì)粒的麥芽糖假絲酵母轉(zhuǎn)化體。
另外，作為導(dǎo)入了pARR-149NSx2的轉(zhuǎn)化體的AC16 pUTA-149NSx2(保藏號FERM BP-10019，基于布達佩斯條約將原保藏日平成15年5月8日的國內(nèi)保藏移交為國際保藏)、質(zhì)粒pARR-149NS/171DGx2(保藏號FERMBP-10017，保藏日平成16年4月27日，基于布達佩斯條約的國際保藏)分別被國際保藏在日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。
(6)聚酯的制造本發(fā)明的聚酯的制造方法是從培養(yǎng)本發(fā)明的上述轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中收獲聚酯。
即，本發(fā)明的聚酯的制造可以是在培養(yǎng)基中添加上述轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)后，通過從得到的該培養(yǎng)菌體或培養(yǎng)物中回收聚酯來進行。在這里，培養(yǎng)溫度為該菌體的可以繁殖的溫度，優(yōu)選15℃～40℃，更加優(yōu)選20℃～40℃，特別優(yōu)選28℃～34℃。另外，培養(yǎng)時間沒有特別的限定，但優(yōu)選間歇培養(yǎng)1～7天，或者也可以連續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)基只要是酵母可以利用的則沒有特別限定，例如，可以使用含有碳源、氮源、無機鹽類、其他的有機營養(yǎng)源等的培養(yǎng)基。
作為碳源，只要是酵母可以利用的物質(zhì)，則沒有特別的限定，可以使用例如碳水化合物、油脂類、脂肪酸類、正構(gòu)烷烴等。作為碳水化合物，可以舉出，例如葡萄糖、蔗糖、甘油等。作為油脂類，可以舉出，例如菜子油、椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油等。作為脂肪酸類，可以舉出，例如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸等飽和·不飽和脂肪酸或這些脂肪酸的酯或鹽等脂肪酸衍生物。作為正構(gòu)烷烴，可以舉出，例如十二烷、十四烷等。
另外，啟動子的表達為誘導(dǎo)型時，可以在適當?shù)臅r候添加誘導(dǎo)物質(zhì)(例如，醇等)。誘導(dǎo)物質(zhì)有時也是主要的碳源。
作為一例，在麥芽糖假絲酵母的培養(yǎng)時，也可以使用油脂類作為碳源進行培養(yǎng)。另外，在不能利用油脂或不能有效利用油脂的酵母中，還可以通過在培養(yǎng)基中添加脂肪酶來改善。另外，還可以通過轉(zhuǎn)化脂肪酶基因來賦予油脂利用能力。
作為氮源，除了例如氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽以外，還可以舉出胨、肉膏、酵母提取物等。
作為無機鹽類，可以舉出，例如磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。
作為其他的有機營養(yǎng)源，可以舉出，例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等氨基酸類；維生素B1、維生素B12、維生素H(biotin)、煙酰胺、泛酸、維生素C等維生素類等。
在本發(fā)明中，聚酯從菌體回收可以使用例如下面的方法。培養(yǎng)結(jié)束后，用離心分離器等從培養(yǎng)液中分離菌體，將該菌體用蒸餾水以及甲醇等洗凈后，使之干燥。用氯仿等有機溶劑從該干燥菌體中抽提聚酯。在通過過濾等從含有該聚酯的有機溶劑溶液中除去菌體成分，在該濾液中加入甲醇或己烷等不良溶劑使聚酯沉淀。沉淀的聚酯通過過濾或離心分離與上清液脫離，使之干燥，從而可以回收聚酯。在本發(fā)明中，由于可以使用酵母作為生產(chǎn)聚酯的菌體，因此，可以利用上述簡便的分離回收方法。
得到的聚酯可以通過例如氣相色譜法或核磁共振法等來進行分析。分子量可以利用GPC法測定?；厥盏母稍锞酆衔镉寐确氯芙夂螅梢允褂冒惭b了Shodex K805L(昭和電工社制)的島津制造所制造的GPC系統(tǒng)，將氯仿作為移動相來分析該溶液。分子量標準試樣可以使用市售的標準聚苯乙烯。
如上述，在本發(fā)明中，用含有編碼酶活性改良了的麥芽糖假絲酵母PHA合成酶突變體的基因、或添加了編碼過氧化物酶體定位信號的DNA且編碼酶活性改良了的麥芽糖假絲酵母PHA合成酶突變體的基因，并含有在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子的基因表達盒，構(gòu)建麥芽糖假絲酵母重組株，并培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，可以高效地合成聚酯。
另外，在本發(fā)明中，作為聚酯，可以優(yōu)選制造共聚下述式(1)表示的3-羥基丁酸和下述式(2)表示的3-羥基己酸而得到的聚酯P(3HB-co-3HH)。 發(fā)明的效果按照本發(fā)明，可以在酵母中，有效地生產(chǎn)具有生物降解性以及優(yōu)異的物理特性的共聚以上述式(1)、(2)表示的3-羥基丁酸或3-羥基己酸為例的3-羥基鏈烷酸而得到的共聚聚酯。
附圖的簡單說明[

圖1]是簡單圖示實施例中從pUAL1構(gòu)建pSTARR的過程和用到的各種質(zhì)粒。
是簡單圖示實施例中從pSTARR構(gòu)建pARR-149NSx2等的過程和所用的各種質(zhì)粒。
實施發(fā)明的最佳方案以下，通過實施例更加具體地說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不是將其技術(shù)范圍限定在這些實施例中。
(實施例1)PHA合成酶基因的合成和修飾基于序列號1所示的來源于麥芽糖假絲酵母的PHA合成酶(T.Fukui，etal.，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，vol.170，69-75(1999))的氨基酸序列，合成該PHA合成酶基因。
另外，麥芽糖假絲酵母是將CTG密碼子翻譯成絲氨酸而不是亮氨酸的酵母。因此，在亮氨酸密碼子中沒有分配CTG。在麥芽糖假絲酵母中，對應(yīng)于各氨基酸的密碼子優(yōu)先選擇使用頻率高的密碼子。密碼子的使用頻率以Klaus Wolf著的Nonconventional Yeast in Biotechnology(published出版)作為參考。這樣，設(shè)計PHA合成酶基因ORF2(WO 01/88144的序列號3)，化學(xué)合成后，克隆到載體pUCNT(記載于WO 94/03613)中。
接著，為了將該PHA合成酶第149個氨基酸天冬酰胺取代為絲氨酸，使用序列號8和序列號9作為PCR引物，對已克隆了PHA合成酶基因的pUCNT進行擴增。在擴增時使用了Stratagene社制造的Pfu聚合酶。PCR的條件是將96℃1分鐘、60℃1分鐘、68℃11分鐘作為1個循環(huán)，將其反復(fù)進行18次后，加入限制酶DpnI，將作為模板的質(zhì)粒切斷，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從轉(zhuǎn)化體回收質(zhì)粒。使用序列號10～14的引物，確認堿基序列。堿基序列的決定使用了PERKIN ELMER APPLIED BIOSYSTEMS社制造的DNA測序儀310遺傳分析器。這樣，構(gòu)建了只將基因突變導(dǎo)入到目的位點的PHA合成酶突變基因ORF2-149NS。
(實施例2)含有PHA合成酶突變基因的表達盒的構(gòu)建為了在麥芽糖假絲酵母中表達PHA合成酶，將來源于麥芽糖假絲酵母的啟動子連結(jié)在實施例1中記載的PHA合成酶突變基因ORF2、ORF2-149NS各自的5’上游，將同樣來源的終止子連結(jié)在所述基因各自的3’下游。作為啟動子，使用在Alk2基因(GenBank X55881)啟動子的上游添加了ARR序列的啟動子ARRp，在每一種基因的3’下游連結(jié)麥芽糖假絲酵母Alk1基因(GenBank D00481)的終止子ALK1t。ARRp是由東京大學(xué)提供的基因(序列號15)，通過在PstI位點與EcoRI-XhoI接頭結(jié)合，在EcoT14I位點結(jié)合序列號16所示的合成DNA，將ARRp變換為可以被XhoI以及NdeI消化。用EcoRI將載體pUAL1(記載于WO 01/88144)切斷后，通過平滑末端化并進行連接反應(yīng)，構(gòu)建除去了EcoRI切斷位點的pUAL2。用PvuI/PvuII將pUAL2切斷，結(jié)合在pSTV28(寶酒造社制)的PvuI/SmaI位點，構(gòu)建pSTAL1。將pSTAL1用EcoRI/NdeI消化，與上述ARRp連接，構(gòu)建pSTARR。在圖1中示出了從pUAL1構(gòu)建pSTARR的模式和各種質(zhì)粒的模式圖。
為了在麥芽糖假絲酵母中表達實施例1中記載的ORF2、ORF2-149NS，并且定位到過氧化物酶體，在ORF2、ORF2-149NS的羧基末端添加過氧化物酶定位信號。作為添加的過氧化物酶定位信號，在羧基末端使用了Ser-Lys-Leu(SKL)氨基酸序列。以將被克隆到pUCNT中的ORF2以及ORF2-149NS作為模板，使用序列號17和18作為引物，構(gòu)建ORF2S和ORF2S-149NS。在pSTARR的NdeI和PstI位點結(jié)合這些PHA合成酶突變基因，從而構(gòu)建出pSTARR-ORF2S和pSTARR-ORF2S149NS。
最終連結(jié)PHA合成酶突變基因的載體是pUTA-1(記載于WO01/88144)。用XhoI/SalI從pSTARR-ORF2S、pSTARR-ORF2S149NS切出表達盒，使之與pUTA-1的SalI位點結(jié)合，構(gòu)建pARR-ORF2S以及pARR-149NS。另外，用SalI消化pARR-ORF2S以及pARR-149NS，并與XhoI/SalI切割pSTARR-ORF2S和pSTARR-ORF2S149NS得到的表達盒結(jié)合，構(gòu)建出pARR-ORF2Sx2以及pARR-149NSx2。在圖2中示出了從pSTARR構(gòu)建pARR-149NSx2等的模式和各種質(zhì)粒的簡單的圖。
(實施例3)轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建酵母菌培養(yǎng)所用的試劑，只要不是特別說明均使用從和光純藥購買的試劑。宿主為ADE1基因破壞株，使用被國際保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心的麥芽糖假絲酵母AC16株(FERM BP-7366)，在該宿主中分別導(dǎo)入含有上述本發(fā)明基因表達盒的質(zhì)粒pARR-ORF2S、pARR-149NS、pARR-ORF2Sx2以及pARR-149NSx2。在宿主中導(dǎo)入質(zhì)粒的方法是電穿孔法?；?qū)胙b置使用了BTX社制造的ELECTRO CELLMANIPULATOR 600。比色杯使用了BIO MEDICAL CORPORATION CO.LTD制造的BM6200。在100μl感受態(tài)細胞中加入1μl質(zhì)粒，然后從中取出100μl感受態(tài)細胞/質(zhì)粒溶液，注入到比色杯中，并安裝在脈沖發(fā)生器上。接著，在靜電容量40μF、阻抗值246ohm、電壓1.9KV的條件下施加電脈沖。脈沖后，在各自的比色杯中加入1M的山梨糖醇1ml，緩和地進行混合，在室溫放置1小時。導(dǎo)入質(zhì)粒后，用選擇平板(0.67w/v％ Yeast Nitrogen basewithout amino acid(Difco社制)，2w/v％葡萄糖，2w/v％瓊脂)進行培養(yǎng)，取得轉(zhuǎn)化體。其中，導(dǎo)入了質(zhì)粒pARR-149NSx2的轉(zhuǎn)化體作為AC16pUTA-149NSx2被保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(FERM BP-10019)。
(實施例4)使用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)聚合物導(dǎo)入了聚合物生產(chǎn)必要的基因的麥芽糖假絲酵母轉(zhuǎn)化體如下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用YNB培養(yǎng)基(0.67w/v％ Yeast Nitrogen base without amino acid，2w/v％葡萄糖)作為預(yù)培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，將在M2培養(yǎng)基(12.75g/L硫酸銨、1.56g/L磷酸二氫鉀、0.33g/L磷酸一氫鉀·3水合物、0.08g/L氯化鉀、0.5g/L氯化鈉、0.41g/L硫酸鎂·7水合物、0.4g/L硝酸鈣·7水合物和0.01g/L氯化鐵(III)·4水合物)中添加了2w/v％的棕櫚油和0.45ml/L溶解在鹽酸中的痕量元素(1g/mL硫酸鐵(II)·7水合物、8g/mL硫酸鋅(II)·7水合物、6.4g/mL硫酸鎂(II)·4水合物、0.8g/mL硫酸銅(II)·5水合物)的培養(yǎng)基作為生產(chǎn)培養(yǎng)基使用。
將各轉(zhuǎn)化體的甘油貯存液500μl接種到加入了50ml預(yù)培養(yǎng)用培養(yǎng)基的500ml坂口氏燒瓶中，培養(yǎng)20小時，再以10v/v％接種到加入了300ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的2L坂口氏燒瓶中。將其在培養(yǎng)溫度30℃、振蕩速度90rpm、培養(yǎng)2天的條件下進行培養(yǎng)。通過離心分離從培養(yǎng)液中回收菌體，懸浮在80ml的蒸餾水中，用超高壓均化器(APV社制造的Rannie 2000，在15,000Psi進行15分鐘)破碎后，進行離心分離，將得到的沉淀物用甲醇洗凈后，冷凍干燥。
將得到的干燥菌體粉碎，添加100ml氯仿，攪拌過夜進行提取。過濾除去菌體，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1～2ml，在濃縮液中添加約10ml的己烷，使聚合物析出。此時的培養(yǎng)結(jié)果示于表1。分子量測定按如下進行。將10mg回收的干燥聚合物溶解在5ml氯仿中后，通過過濾除去不溶物。對溶液進行分析，該分析使用安裝了Shodex K805L(300×8mm、2柱相連)(昭和電工社制)的島津制作所制造的GPC系統(tǒng)，將氯仿作為移動相。分子量標準試樣使用市售的標準聚苯乙烯，測出的為重均分子量。3HH摩爾分數(shù)通過NMR分析(JOEL，JNM-EX400)來測定。


如上述結(jié)果所示，與通過含有包含編碼野生型PHA合成酶的基因的表達盒的質(zhì)粒pARR-ORF2S、pARR-ORF2Sx2轉(zhuǎn)化的酵母相比，在通過含有包含編碼本發(fā)明PHA合成酶突變體的基因的表達盒的質(zhì)粒pARR-149NS、pARR-149NSx2轉(zhuǎn)化的酵母中，聚合物含量和3HH摩爾分數(shù)提高。這些結(jié)果不僅可以確認本發(fā)明PHA合成酶突變體活性得到提高的效果，而且發(fā)現(xiàn)了得到的PHA的分子量也有增加的傾向。這樣，確認了本發(fā)明的PHA合成酶突變體的有用性。
(實施例5)二重突變體使用實施例1記載的方法制作將PHA合成酶第171個氨基酸天冬氨酸取代為甘氨酸而得到的突變體。作為用于導(dǎo)入突變的引物，使用了序列號19和序列號20。另外，以實施例1制作的PHA合成酶突變基因ORF2-149NS作為模板，用與實施例1同樣的方法制作將第149個氨基酸天冬酰胺取代成絲氨酸、第171個氨基酸天冬氨酸取代為甘氨酸的二重突變體。這樣，得到了PHA合成酶突變基因ORF2-171DG以及PHA合成酶二重突變基因ORF2-149NS/171DG。
接著，使用這些突變基因，按照實施例2記載的方法，將序列號17和18作為引物添加信號序列，將它們克隆到質(zhì)粒pSTARR中，構(gòu)建出pSTARR-ORF2S171DG和pSTARR-ORF2S149NS/171DG。將這些突變基因表達盒按照實施例2記載的方法導(dǎo)入到pUTA-1中，權(quán)建質(zhì)粒pARR-171DG和pARR-149NS/171DG。接著，構(gòu)建用LAC4基因(GenBank M84410)的終止子LACt(序列號21)代替終止子ALK1t所得到的表達盒。用PstI/SalI除去pSTARR-ORF2S171DG以及pSTARR-ORF2S149NS/171DG的ALK1t，作為替代，用序列號22和23所示的引物制作導(dǎo)入了LAC4t的質(zhì)粒。將這種含有取代了終止子的PHA合成酶突變基因的表達盒分別用XhoI/SalI切割，并使之結(jié)合在質(zhì)粒pARR-171DG和pARR-149NS/171DG的SalI位點，得到了導(dǎo)入了2個含有PHA合成酶突變基因的表達盒的質(zhì)粒pARR-171DGx2和pARR-149NS/171DGx2。其中，質(zhì)粒pARR-149NS/171DGx2被保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(FERM BP-10017)。
用實施例3的方法將這些質(zhì)粒導(dǎo)入到麥芽糖假絲酵母AC16株(FERMBP-7366)中，用實施例4記載的方法進行聚合物生產(chǎn)和聚合物分析，其結(jié)果示于表2，并與實施例4的結(jié)果進行比較。


如上述結(jié)果所示可知，與通過含有包含編碼野生型PHA合成酶的基因的表達盒的質(zhì)粒pARR-ORF2Sx2轉(zhuǎn)化的酵母相比，在通過含有包含編碼本發(fā)明PHA合成酶突變體的突變基因的表達盒的質(zhì)粒pARR-171DGx2轉(zhuǎn)化的酵母中，聚合物含量提高，在通過含有包含編碼PHA合成酶二重突變體的二重突變基因的表達盒的質(zhì)粒pARR-149NS/171DGx2轉(zhuǎn)化的酵母中，聚合物含量進一步提高，同時3HH摩爾分數(shù)提高。這樣，確認了本發(fā)明的PHA合成酶突變體的有用性。
工業(yè)實用性按照本發(fā)明，可以在酵母中，有效地生產(chǎn)具有生物降解性以及優(yōu)異的物理特性的共聚以上述式(1)、(2)表示的3-羥基丁酸或3-羥基己酸為首的3-羥基鏈烷酸而得到的共聚聚酯。
權(quán)利要求
1.一種基因表達盒，該基因表達盒含有聚羥基鏈烷酸合成酶突變基因和在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子，所述聚羥基鏈烷酸合成酶突變基因是編碼在含有序列表1所示氨基酸序列的來源于豚鼠氣單胞菌的聚羥基鏈烷酸合成酶中，進行至少1個以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的聚羥基鏈烷酸合成酶突變體的聚羥基鏈烷酸合成酶突變基因(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代。
2.一種基因，該基因是將編碼過氧化物酶體定位信號的DNA添加到聚羥基鏈烷酸合成酶突變基因中而得到的基因，所述聚羥基鏈烷酸合成酶突變基因是編碼在含有序列表1所示氨基酸序列的來源于豚鼠氣單胞菌的聚羥基鏈烷酸合成酶中，進行至少1個以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的聚羥基鏈烷酸合成酶突變體的聚羥基鏈烷酸合成酶突變基因(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代。
3.按照權(quán)利要求2記載的基因，其中，過氧化物酶體定位信號包含由序列號2或序列號3所示氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求3記載的基因，其中，編碼過氧化物酶體定位信號的DNA堿基序列是序列號4或序列號5表示的序列。
5.按照權(quán)利要求2～4中的任一項記載的基因，其中，在編碼來源于豚鼠氣單胞菌的聚羥基鏈烷酸合成酶的基因中，至少1個CTG密碼子被變換為TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
6.一種基因表達盒，該基因表達盒包含權(quán)利要求2～5中的任一項記載的基因和在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子。
7.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，該轉(zhuǎn)化體是在酵母中導(dǎo)入1個或1個以上權(quán)利要求1或6記載的基因表達盒而形成的。
8.按照權(quán)利要求7記載的轉(zhuǎn)化體，其中，酵母是麥芽糖假絲酵母。
9.一種制造聚酯的方法，其特征在于，從培養(yǎng)權(quán)利要求7或8記載的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中收獲聚酯。
10.按照權(quán)利要求9記載的制造聚酯的方法，其中，聚酯是共聚下述式(1)表示的3-羥基丁酸和下述式(2)表示的3-羥基己酸而得到的共聚聚酯。[化1]
全文摘要
本發(fā)明涉及包含導(dǎo)入了突變的來源于豚鼠氣單胞菌的聚羥基鏈烷酸(PHA)合成酶基因和在酵母中發(fā)揮功能的啟動子以及終止子的基因表達盒；將該基因表達盒導(dǎo)入到酵母中而得到的轉(zhuǎn)化體；使用了該轉(zhuǎn)化體的聚酯的制造方法。按照本發(fā)明，可以在酵母中有效地生產(chǎn)具有生物降解性以及優(yōu)異的物理特性的共聚3－羥基鏈烷酸而得到的共聚聚酯。
文檔編號C12N1/19GK1791673SQ200480013329
公開日2006年6月21日 申請日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者大窪雄二, 長岡哲也, 橫溝聰, 松本圭司, 高木正道, 太田明德 申請人:株式會社鐘化