專利名稱：基于CD8α鏈的具有降低的免疫原性的基因治療載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及基因治療領(lǐng)域，更特別地，提供用于降低基因治療載體的免疫原性的方法和組合物。
背景技術(shù)：
基因送遞或基因治療是一種用于治療后天和遺傳性疾病的很有前途的方法。一組不斷擴(kuò)增的基因被克隆和識(shí)別，所述基因的異常表達(dá)與威脅生命的人類疾病相關(guān)。在人體內(nèi)表達(dá)這些克隆基因的能力將最終使預(yù)防和/或治愈許多重要的人類疾病成為可能，對(duì)于這些疾病目前的治療方法是不夠的或者根本不存在治療方法。例如，在人類病人中體內(nèi)表達(dá)膽固醇調(diào)節(jié)基因，選擇性阻斷HIV復(fù)制的基因或腫瘤抑制基因?qū)⒎謩e顯著地改善心臟病、HIV、和癌癥的治療。
然而不幸的是，迄今為止所述的基因治療方案仍被種種問(wèn)題所困擾，特別包括基因從載體上表達(dá)的周期短，以及不能有效地再度使用相同的載體，這兩者都是由針對(duì)與載體及其治療運(yùn)載物(payload)相關(guān)的抗原的寄主免疫應(yīng)答引起。加入病毒和/或治療性基因的組織最初被通過(guò)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及CD4+輔助T細(xì)胞介導(dǎo)的寄主細(xì)胞免疫應(yīng)答所攻擊，所述反應(yīng)極大限制了從載體上基因表達(dá)的持續(xù)性。此外，通過(guò)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的寄主體液免疫應(yīng)答通過(guò)抑制相同載體的成功的再度使用，進(jìn)一步限制了現(xiàn)行基因治療方案的有效性。
例如，在一開始使用腺病毒載體之后，產(chǎn)生了針對(duì)主要病毒衣殼(capsid)蛋白，即五臨體、六臨體和尾絲的抗原決定簇的血清特異性抗體。假設(shè)這些衣殼蛋白是腺病毒將其自身黏附到細(xì)胞上并隨后侵染細(xì)胞的工具，那么這些抗體便能夠阻斷或“中和”細(xì)胞被同樣血清型腺病毒再感染。這需要使用不同血清型腺病毒來(lái)提供一種或多種隨后劑量的在基因治療范圍內(nèi)的外源治療性DNA。此外，治療性和病毒基因產(chǎn)物在靶細(xì)胞上被表達(dá)，使得他們對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答敏感。因此，他們被拒絕，基因治療的有益效果被打消，靶器官或組織被破壞。由于這些與免疫相關(guān)的障礙，因此基因治療方案的進(jìn)展被完全妨礙。
因此，本領(lǐng)域?qū)μ禺愋砸种漆槍?duì)基因治療表達(dá)載體以及用這些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的有效方法存在極大的需求。此外，對(duì)用于給予或輸送基因治療運(yùn)載物的改進(jìn)的方法和組合物存在需求。因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是特異性抑制針對(duì)基因治療載體及他們的治療產(chǎn)物的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，從而提高來(lái)自用這些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的外源基因的表達(dá)。
相關(guān)文獻(xiàn)概述已知，當(dāng)通過(guò)其T細(xì)胞受體復(fù)合物已接收到信號(hào)的CTL也通過(guò)其I類MHC分子的α3區(qū)域接收到信號(hào)時(shí)，MHCI類-限制性T細(xì)胞(如，CD8+CTLs)的活性能被抑制。這種所謂的否定(veto)信號(hào)能被刺激物(stimulator)或“否定(veto)”細(xì)胞所表達(dá)的CD8分子傳送。Sanbhara和Miller，Science 2521424-1427(1991)。由此引起的免疫抑制是抗原特異性的和MHC-限制性的，并由通過(guò)應(yīng)答CTL的否定細(xì)胞單向識(shí)別產(chǎn)生，但并非反之亦然。Rammensee et al.，Eur.J.Immunol.12930-934(1982)；Fink et al.，J.Exp.Med.157141-154(1983)；Rammensee et al.，J.Immunol.132668-672(1984)。既然否定活性已被與CD8α鏈的存在相聯(lián)系，那么如果當(dāng)CD8α鏈被表達(dá)時(shí)，如果CD8的表達(dá)被刪除(deleted)并加以確定，否定功能便消失。Hambor et al.，J.Immunol.1451646-1652(1990)；Hambor et al.，Intern.Immunol.28856-8879(1990)；Kaplan et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA868512-8515(1989)。
為開發(fā)這種抗原特異性抑制路徑來(lái)消除不必要的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，多種策略已被建議。這種策略之一包括使用多肽共軛物，所述共軛物將CD8或其功能性區(qū)域共價(jià)連接到指導(dǎo)CD8針對(duì)特異性靶細(xì)胞的否定活性的二級(jí)配體上。見(jiàn)，如，美國(guó)專利號(hào)5,242,687，5,601,828和5,623,056?？蛇x擇地，具有對(duì)連接到CD8α鏈的細(xì)胞外區(qū)域的MHCI類分子具有特異性的單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)的雜交抗體分子已被研究。Qi et al.，J.Exp.Med.1831973-1980(1996)。然而，這樣的分子具有幾個(gè)缺點(diǎn)，仍未發(fā)現(xiàn)實(shí)際臨床用途。
最近，WO02/102852描述了使用具有被設(shè)計(jì)成對(duì)MHCI類親和力增強(qiáng)的氨基酸修飾的可溶性C8α鏈變異體的CTL抑制。值得注意的是，其中教導(dǎo)了所主張的CD8α組合物對(duì)I類MHC分子是特異性的，并因此被期望只抑制CTL的應(yīng)答，并進(jìn)一步教導(dǎo)了與其它免疫抑制劑的組合將在涉及細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答其它因素的情況下被需要，如，MHCII類限制性T細(xì)胞例如CD4+T細(xì)胞。Id.pp.27-28。
發(fā)明概述本發(fā)明基于這一驚人的發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)免疫調(diào)節(jié)分子如CD8的靶向表達(dá)所介導(dǎo)的否定效應(yīng)能有效地和特異性地抑制直接針對(duì)與表達(dá)載體包括其外源遺傳運(yùn)載物相關(guān)的抗原，以及針對(duì)與轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞相關(guān)的抗原的宿主免疫應(yīng)答。本發(fā)明還基于另外一驚人的發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)CD8α的靶向表達(dá)所介導(dǎo)的否定效應(yīng)能有效地和特異性地抑制應(yīng)答的CD4+T細(xì)胞(II類-限制性MHC)以及CD8+T細(xì)胞(I類-限制性MHC)，并且作為結(jié)果產(chǎn)生的直接針對(duì)這些載體相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答的細(xì)胞和體液成分能被抑制。因此，通過(guò)使用本發(fā)明所描述的方法和組合物，可通過(guò)抑制針對(duì)載體相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答來(lái)協(xié)同增強(qiáng)基因治療方案，這些免疫應(yīng)答目前限制基因從載體上表達(dá)并阻止基因治療達(dá)到其全部潛能。
因此，本發(fā)明提供了用于特異性抑制直接針對(duì)表達(dá)載體以及用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞的寄主免疫應(yīng)答的組合物和方法，其中該載體包括為能引發(fā)否定效應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)分子編碼的核酸序列，優(yōu)選CD8多肽，更優(yōu)選CD8α-鏈，最優(yōu)選CD8α-鏈的細(xì)胞外和跨膜區(qū)域。出于目標(biāo)組合物和方法的性質(zhì)，以及上述現(xiàn)有技術(shù)中CD8α-鏈的可溶形式的明顯缺陷，CD8α-鏈跨膜區(qū)域或合適的可替換的跨膜區(qū)域的存在被認(rèn)為是必要的。
一方面，本發(fā)明提供了用于抑制針對(duì)表達(dá)載體的免疫應(yīng)答的方法，包括在體內(nèi)或體外將寄主靶細(xì)胞與編碼CD8多肽，優(yōu)選CD8α-鏈，最優(yōu)選CD8α-鏈的細(xì)胞外和跨膜區(qū)域的全部或功能部分的表達(dá)載體接觸，其中所述的CD8多肽表達(dá)于靶細(xì)胞的表面上，并且由此針對(duì)表達(dá)載體和靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答被特異性抑制。重組載體優(yōu)選進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)額外的編碼目標(biāo)治療蛋白或分子的轉(zhuǎn)基因。正如本文中所描述和例證的，使用本發(fā)明的方法和組合物時(shí)，免疫應(yīng)答的體液和細(xì)胞成分被抑制。
另一方面，本發(fā)明還提供了用于特異性抑制直接針對(duì)載體相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答的方法，包括在體內(nèi)或體外將寄主靶細(xì)胞與包括編碼CD8多肽，優(yōu)選CD8α-鏈，最優(yōu)選CD8α-鏈的細(xì)胞外和跨膜區(qū)域的全部或功能部分的核酸的表達(dá)載體接觸，其中所述的CD8多肽表達(dá)于靶細(xì)胞的表面，并且從而針對(duì)載體相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答被特異性抑制。
本發(fā)明進(jìn)一方面提供了用于提高治療性轉(zhuǎn)基因在寄主內(nèi)表達(dá)的方法，包括給予寄主表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括為CD8多肽，優(yōu)選CD8α-鏈，最優(yōu)選CD8α-鏈的細(xì)胞外和跨膜區(qū)域的全部或功能部分編碼的核酸序列，其中的CD8多肽表達(dá)于靶細(xì)胞的表面，并且從而針對(duì)載體相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答被特異性抑制。在一具體實(shí)例中，治療性轉(zhuǎn)基因與CD8多肽被包含于同一載體上。在一可選擇的具體實(shí)例中，CD8多肽和治療性分子被分別的表達(dá)載體所編碼。如本發(fā)明中所描述的，目標(biāo)方法通過(guò)抑制針對(duì)載體相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答的細(xì)胞和體液成分提高了治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，從而增加了治療性轉(zhuǎn)基因在寄主內(nèi)的持久性，并使在轉(zhuǎn)基因表達(dá)的隨后循環(huán)中再度使用表達(dá)載體成為可能。
進(jìn)一方面，本發(fā)明提供了具有降低免疫原性的改進(jìn)的病毒表達(dá)載體，其中該表達(dá)載體包括基本由為本發(fā)明中所披露的CD8多肽編碼的核酸序列和為至少一種目標(biāo)治療性轉(zhuǎn)基因編碼的核酸序列組成的非病毒核酸。在一具體實(shí)例中，治療性轉(zhuǎn)基因不同于免疫調(diào)節(jié)分子。在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，該CD8多肽包括CD8α-鏈的全部或功能部分。優(yōu)選地，該CD8α-鏈的功能部分包括CD8α-鏈的至少胞外區(qū)域，更優(yōu)選CD8α-鏈的胞外區(qū)域和跨膜區(qū)域。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明中提供的免疫調(diào)節(jié)分子與靶細(xì)胞表面膜相關(guān)聯(lián)，如在轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，插入到膜內(nèi)或共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合到那里。
本發(fā)明預(yù)期使用的合適的載體包括重組和非重組載體，和病毒(例如，腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒載體等等)以及非病毒(如，細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、脂質(zhì)體等等)載體。優(yōu)選病毒載體，最優(yōu)選腺病毒載體。
雖然披露了多種實(shí)施例，但從下面的顯示和描述了本發(fā)明的說(shuō)明性具體實(shí)例的描述來(lái)看，仍然有其它的本發(fā)明實(shí)施例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。正如將被意識(shí)到的那樣，本發(fā)明能在多個(gè)明顯的方面被改變，所有這些都沒(méi)有背離本發(fā)明的主旨和范圍。因此，附圖和詳細(xì)描述在本質(zhì)上被認(rèn)為是說(shuō)明性而非限制性的。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1描述了來(lái)源于不同物種的CD8α-鏈蛋白和核酸序列。還包括記錄序列的入藏登記號(hào)。
圖2A-B描述了野生型CD8α-鏈的氨基酸和核酸序列，包括為人和小鼠蛋白不同區(qū)域的劃分。
圖3描述了用C57B/6脾細(xì)胞刺激的Balb/c脾細(xì)胞。用正常成纖維細(xì)胞(●)，培養(yǎng)基(■)，或帶有小鼠(A)或人(B)來(lái)源的CD8的成纖維細(xì)胞(▲)補(bǔ)充培養(yǎng)物。收集培養(yǎng)物并測(cè)試他們對(duì)C57BL/6-來(lái)源的靶細(xì)胞的裂解能力。
圖4描述了被注射了對(duì)照的成纖維細(xì)胞(■和▲)或mCD8轉(zhuǎn)染的C57BL/6-(H-2b)來(lái)源的(○和●)成纖維細(xì)胞的Balb/c(H-2d)小鼠。兩周后殺死動(dòng)物，收集脾細(xì)胞，用C57BL/6(H-2b)(■和○)或CBA/J(H-2k)(●和▲)脾細(xì)胞刺激并測(cè)試他們對(duì)EL4(H-2b)(■和○)或S.AKR(H-2k)(●和▲)靶細(xì)胞的裂解能力。
圖5描述了靶細(xì)胞(▲)或表達(dá)CD8的靶(■)，通過(guò)同種異體反應(yīng)的(alloreactive)T細(xì)胞或通過(guò)抗原特異性的CTLs(B)來(lái)測(cè)試他們對(duì)裂解的易感性。
圖6描述了在正常的成纖維細(xì)胞(●)和轉(zhuǎn)導(dǎo)了mAdCD8(A，▲)或HAdCD8(B，▲)的成纖維細(xì)胞存在的情況下建立的MLCs(Balb/canti-C57B/6)。對(duì)照培養(yǎng)(■)中沒(méi)有加入成纖維細(xì)胞。這些培養(yǎng)物對(duì)C57BL/6-來(lái)源的靶的裂解活性在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)被測(cè)定。
圖7描述了用腺病毒否定轉(zhuǎn)移載體，mAdCD8的免疫。用上面指示的載體感染C57BL/6小鼠。10天后，收集脾細(xì)胞并在Adβgal病毒的存在下培養(yǎng)。給出了胚細(xì)胞(blast cell)的數(shù)量。
圖8描述了用mAdCD8的否定免疫(A)用Adβgal或mAdCD8免疫C57BL/6小鼠一次。(B)5天后用Adβgal再次免疫像(A)那樣處理的動(dòng)物。在最后一次注射7天后殺死動(dòng)物，在Adβgal存在下培養(yǎng)他們的脾細(xì)胞。培養(yǎng)5天后，測(cè)試細(xì)胞對(duì)Adβgal感染的同系(syngeneic)靶細(xì)胞的裂解能力。
圖9描述了用1×106(或沒(méi)有)刺激物細(xì)胞培養(yǎng)的3×106C7B1/6脾細(xì)胞，按所示轉(zhuǎn)導(dǎo)。4天后，通過(guò)免疫熒光分析培養(yǎng)物中CD4+T淋巴母細(xì)胞的存在。
圖10A-D描述了用不同病毒構(gòu)建物感染后，小鼠和人CD8α-鏈的表面表達(dá)。A.感染的細(xì)胞Mc57T成纖維細(xì)胞；第1欄模擬感染；第2欄用hAdCD8感染；B.感染的細(xì)胞MC57T成纖維細(xì)胞；第1欄模擬感染；第2欄用mAdCD8感染。C.感染的細(xì)胞Balbc未經(jīng)選擇的骨髓細(xì)胞；第1欄用lacZ腺病毒載體(AdlacZ)感染；第2欄用mAdCD8感染。D.感染的細(xì)胞MC57T成纖維細(xì)胞；第1欄模擬感染；第2欄用pAAV-mCD8感染；第3欄用pAAV-hCD8感染。
圖11描述了在加入到MLCs之前已被轉(zhuǎn)導(dǎo)后培養(yǎng)0或5小時(shí)的成纖維細(xì)胞的存在下建立MLCs(Balb/c抗-C57BL/6)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在熒光活化的細(xì)胞分析儀上測(cè)定淋巴母細(xì)胞的數(shù)量。
圖12描述了否定轉(zhuǎn)移載體的體外抑制。在未感染或感染了mAdCD8的MC57成纖維細(xì)胞(H-2b)存在或不存在的情況下建立了BALB/c抗-C57BL/6混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)(X)。在EL4(H-2b)靶細(xì)胞中測(cè)量CTL應(yīng)答。
圖13描述了用AdLacZ或mAdCD8免疫的Balb/c小鼠。在AdLacZ的存在下培養(yǎng)它們的脾細(xì)胞，并測(cè)定針對(duì)感染了AdLacZ的同系P815靶細(xì)胞的特異性裂解活性。
圖14描述了(A)用AdLacZ(■)或mAdCD8(▲)免疫的C57BL/6動(dòng)物。測(cè)試它們的脾細(xì)胞對(duì)同系的AdLacZ EL4靶細(xì)胞的裂解活性。(B)在測(cè)試它們針對(duì)感染AdLacz的EL4靶細(xì)胞的溶解活性之前，用AdLacZ再次免疫這些動(dòng)物。
圖15描述了血紅蛋白β的mRNA序列。
圖16描述了GATA結(jié)合蛋白的mRNA序列。
圖17描述了δ-氨基乙酰丙酸(d-aminoevulinate)合酶的mRNA序列。
圖18描述了葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶的mRNA序列。
圖19描述了鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的mRNA序列。
圖20描述了α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase)的mRNA序列。
圖21描述了β-葡萄糖苷酶的mRNA序列。
圖22描述了α-半乳糖苷酶的mRNA序列。
發(fā)明詳述直接針對(duì)與表達(dá)載體相關(guān)的蛋白的寄主免疫應(yīng)答一直干擾著基因治療技術(shù)的發(fā)展，其中應(yīng)答的細(xì)胞成分嚴(yán)重限制了包含于該載體內(nèi)的基因表達(dá)，應(yīng)答的體液成分使得在有免疫能力的動(dòng)物體內(nèi)再度使用相同的載體變得復(fù)雜。本發(fā)明的成功源于這一驚人的發(fā)現(xiàn)，即在轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體的靶細(xì)胞上表達(dá)免疫調(diào)節(jié)分子如CD8抑制了應(yīng)答的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，因此有效地和特異性地抑制了直接針對(duì)載體相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答的體液和細(xì)胞成分。
因此，本發(fā)明中所描述的組合物和方法能通過(guò)增加表達(dá)載體在寄主細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)性極大地改進(jìn)體內(nèi)和體外的基因治療方案，并因此提高了包含于載體內(nèi)的治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，以及使寄主細(xì)胞再度成功使用同一載體(如相同血清型的重組腺病毒載體)成為可能。在一具體實(shí)例中，提供了包括為免疫調(diào)節(jié)分子，優(yōu)選CD8多肽，更優(yōu)選CD8α-鏈，最優(yōu)選CD8α-鏈的細(xì)胞外和跨膜區(qū)域編碼的核酸序列，以及為一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)治療性分子編碼的核酸序列的表達(dá)載體。在一可選的具體實(shí)例中提供了為在寄主中共同使用的分別的表達(dá)載體，其中之一為CD8多肽編碼，另外其中之一為期望的治療性分子編碼本發(fā)明還提供了抑制針對(duì)表達(dá)載體，特別是重組載體，如腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的免疫應(yīng)答的方法，包括將靶細(xì)胞與為免疫調(diào)節(jié)分子和一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)治療性分子，例如在體內(nèi)和體外基因治療上下文中的治療性分子編碼的表達(dá)載體接觸。正如本文中所描述和例證的，通過(guò)本發(fā)明獲得的寄主免疫應(yīng)答的抗原特異性抑制使表達(dá)載體在細(xì)胞中能更持久的存在，包含于載體內(nèi)的治療性轉(zhuǎn)基因能伴隨提高表達(dá)，以及為繼續(xù)基因治療能再度成功使用同一載體。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于基因治療的組合物和方法，其中針對(duì)與基因治療送遞載體相關(guān)的抗原的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答被取消或減少了。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明針對(duì)于降低或減少針對(duì)表達(dá)載體，基因治療載體，靶細(xì)胞或感染了基因治療載體的靶細(xì)胞的后代的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的方法和組合物。
“體內(nèi)基因治療”和“體外基因治療”意指包含所有過(guò)去的、現(xiàn)在的和未來(lái)的被本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員作為“基因治療”所公知的并被提及的變異和修飾，包括回體(ex vivo)的應(yīng)用。
“表達(dá)載體”意指任何用于將核酸運(yùn)送入靶細(xì)胞的載體。表達(dá)載體通常被分為病毒載體和非病毒載體。病毒表達(dá)載體指的是，但不限于，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，等等。非病毒載體指的是質(zhì)粒載體，裸DNA，偶聯(lián)到不同運(yùn)載體上的裸DNA，或者與脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)制品相關(guān)的裸DNA。通常，表達(dá)載體是重組的，盡管在一些具體實(shí)例中，例如當(dāng)脂質(zhì)體或細(xì)胞消融(ablation)，如生物射彈技術(shù)被使用時(shí)，他們不是重組的。優(yōu)選用于本發(fā)明的重組載體是質(zhì)粒載體以及選自腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒載體。在一些使用重組病毒載體，特別是腺病毒載體的具體實(shí)例中，衣殼蛋白如，腺病毒衣殼的六鄰體蛋白的免疫原性，可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法被降低，盡管這些修飾根據(jù)本發(fā)明中詳述的改進(jìn)不再是必需的。
“基因治療送遞載體”指的是包括上述表達(dá)載體的組合物，其包括但不限于病毒載體和非病毒載體。
“抑制”指的是直接的或間接的，局部的或全部的，無(wú)論是細(xì)胞的((如白血球動(dòng)員))還是體液的，針對(duì)載體相關(guān)抗原和/或靶細(xì)胞特異性抗原的先天或后天免疫應(yīng)答的抑制和/或降低。載體相關(guān)抗原包括，如來(lái)源于核酸載體或包膜(envelope)(如病毒外殼(coat)蛋白等等)的抗原以及來(lái)源于載體基因(如細(xì)菌或病毒核酸和蛋白)和/或包含于載體內(nèi)的任何治療性轉(zhuǎn)基因(如哺乳動(dòng)物核酸和/或蛋白)的抗原。
“特異性免疫抑制”或“抗原特異性免疫抑制”指的是直接針對(duì)抗原如載體相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答的抑制，和不是抗原特異性的常規(guī)免疫抑制相反。因此，舉例來(lái)說(shuō)，寄主細(xì)胞和/或體液對(duì)載體相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答的缺乏，結(jié)合體內(nèi)對(duì)其它外源抗原的免疫能力的證據(jù)，將證明載體相關(guān)抗原的特異性免疫抑制。
“免疫應(yīng)答”優(yōu)選指的是后天的免疫應(yīng)答，如細(xì)胞或體液的免疫應(yīng)答。
“接觸”指的是將基因治療表達(dá)載體以使載體和細(xì)胞之間產(chǎn)生物理接觸的方式和數(shù)量給予細(xì)胞。如果載體是重組病毒顆粒，那么，期望地，細(xì)胞被病毒載體的附著和感染通過(guò)這種物理接觸達(dá)到。如果病毒載體不是重組病毒顆粒，如未被包膜包起來(lái)的病毒核酸或其它的核酸，那么，期望地，達(dá)到細(xì)胞被核酸感染。
這種“接觸”能被本領(lǐng)域那些技術(shù)人員以任何方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并被描述于本文中，通過(guò)它們能達(dá)到載體與靶細(xì)胞間的明顯接觸和相互接觸。任選地，載體，如腺病毒載體，能與雙特異性或多特異性分子(如，抗體或其片段)進(jìn)一步復(fù)合，其中“接觸”涉及載體和雙特異性或多特異性分子的復(fù)合體與靶細(xì)胞的明顯接觸或相互接觸。例如，載體和雙特異性(多特異性)分子能被共價(jià)連接，如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化學(xué)方式，或其它方式。優(yōu)選，載體和雙特異性(多特異性)分子能通過(guò)非共價(jià)作用(如離子鍵、氫鍵、范德華力、和/或非極性相互作用)的方式被連接。盡管載體和雙特異性(多特異性)分子能通過(guò)在少量體積的相同溶液中混合而開始接觸，但靶細(xì)胞和復(fù)合物不必在少量體積中開始接觸，例如，在復(fù)合體被給予寄主(如，人)的情形中，復(fù)合體通過(guò)血流到達(dá)靶細(xì)胞，它選擇性地結(jié)合到靶細(xì)胞上并進(jìn)入其內(nèi)。載體和雙特異性(多特異性)分子的接觸優(yōu)選在靶細(xì)胞與載體和雙特異性(多特異性)分子的復(fù)合物接觸之前進(jìn)行。
“轉(zhuǎn)基因”指的是基因，其能在與包含該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體接觸的細(xì)胞中被表達(dá)，并且其表達(dá)對(duì)細(xì)胞是其一部分的細(xì)胞或組織、器官、器官系統(tǒng)、有機(jī)體或細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)說(shuō)具有所期望的預(yù)防或治療效益。因此，轉(zhuǎn)基因可以是治療性基因，如目標(biāo)治療性基因。治療性基因可以是在RNA或蛋白水平發(fā)揮其效應(yīng)的基因。例如，被治療性基因編碼的蛋白能被應(yīng)用于遺傳病的治療，如使用編碼囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子編碼的cDNA來(lái)治療囊性纖維化。
此外，治療性基因能在RNA水平上發(fā)揮其效應(yīng)，例如，通過(guò)編碼反義信息或核酶，本領(lǐng)域公知的siRNA，可選擇的RNA剪接受體或供體，影響剪接或3’加工(如多聚腺苷酸化)的蛋白，或影響細(xì)胞內(nèi)(也就是，此處的基因表達(dá)被廣泛認(rèn)為包括從轉(zhuǎn)錄起始到經(jīng)過(guò)加工的蛋白產(chǎn)生的所有步驟)另一基因表達(dá)水平的蛋白，或許除其它途徑之外，通過(guò)介導(dǎo)mRNA積累率的改變，mRNA轉(zhuǎn)移的改變，和/或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的改變。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，表達(dá)載體任選地包括一種或多種編碼目標(biāo)治療性分子連同本發(fā)明所述的CD8多肽的轉(zhuǎn)基因。能被本發(fā)明治療的疾病包括，但不限于，普遍的遺傳病如苯丙酮酸尿癥(苯基丙氨酸-L-單氧酶)，囊性纖維化(囊性纖維化傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子)(cystic fibrosis conductance regulator)，鳥氨酸caramyl transferase缺乏(OTC)，血友病(因子X(jué)I缺乏，因子VIII缺乏)，家族黑蒙性白癡(N-乙酰氨基己糖苷酶A)和其它脂質(zhì)積累病，等。此外，能使用編碼促紅細(xì)胞生成素(EPO)的基因。EPO是一種產(chǎn)生于胎兒肝臟和成人腎臟內(nèi)的糖蛋白激素，其作用于骨髓和其它造血組織內(nèi)的祖細(xì)胞來(lái)刺激紅細(xì)胞的形成。編碼人和其它哺乳動(dòng)物EPO的基因已被克隆，測(cè)序和表達(dá)，并在種間在編碼區(qū)域顯示出高度的序列同源性。Wen et al.(1993)Blood 821507-1516。編碼天然的人EPO的基因序列，以及獲得它的方法，已被描述于美國(guó)專利號(hào)4,954,437和4,703,008中，在本發(fā)明中一并全文結(jié)合作為參考。使用EPO的基因治療方法披露于美國(guó)專利號(hào)6,610,290中，其在本發(fā)明中明白地引入做為參考。
可選擇地，可使用編碼溶酶體酶酸性α-葡萄糖苷酶(lysosomal enzymeacid alpha-glucosidase)(GAA)的核苷酸序列。GAA的功能是切割溶酶體糖原的α-1，4和α-1，6連接鍵來(lái)釋放單糖。編碼人GAA基因的序列，以及獲得它的方法先前已被描述(GenBank登錄號(hào)M34424和Y00893；Martiniuk etal.(1990)DNA Cell Biol.985-94；Martiniuk et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839641-9644；Hoefsloot et al.(1988)Eur.Mol.Biol.Organ.71697-1704)，其在本發(fā)明中明白地引入做為參考。
通過(guò)本發(fā)明披露的方法和組合物能治療的優(yōu)選疾病列于下表中。提供登錄號(hào)的序列在本發(fā)明中明白地引入作為參考。
表1

如果免疫調(diào)節(jié)的CD8分子被包含于一載體內(nèi)的基因所編碼，該載體與包含和表達(dá)治療轉(zhuǎn)基因的載體是分開的，則包含CD8分子的載體能在細(xì)胞與包含和表達(dá)基因的載體接觸之前、同時(shí)、或之后開始與細(xì)胞接觸，只要使用相似或相同類型的載體，并且接觸效果的時(shí)間選擇足夠抑制對(duì)與細(xì)胞接觸的載體的免疫應(yīng)答。
“靶細(xì)胞”可以作為單一個(gè)體存在，或者可以是一個(gè)大的細(xì)胞集合體的一部分。這個(gè)“大的細(xì)胞集合體”可包括，例如，細(xì)胞培養(yǎng)物(混合的或純的)、組織(如，上皮或其它組織)、器官(如，心、肺、肝、膽囊、膀胱、眼或其它器官)、器官系統(tǒng)(如，循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)或其它器官系統(tǒng))、或有機(jī)體(如，鳥、哺乳動(dòng)物、特別是人、等等)。優(yōu)選，作為目標(biāo)的器官/組織/細(xì)胞是循環(huán)系統(tǒng)(如，包括，但不限于心、血管、和血液)，呼吸系統(tǒng)(如，鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺、等等)，腸胃系統(tǒng)(如，包括嘴、咽、食道、胃、腸、唾液腺、胰腺、肝、膽囊、和其它的)，泌尿系統(tǒng)(例如，像腎、輸尿管、膀胱、尿道、等等)，神經(jīng)系統(tǒng)(如，包括，但不限于，腦和脊髓、及特殊感覺(jué)器官，如眼)和皮膚系統(tǒng)(如，皮膚)。甚至更優(yōu)選，細(xì)胞選自由心、血管、肺、肝、膽囊、膀胱、眼細(xì)胞和干細(xì)胞組成的細(xì)胞。培養(yǎng)和使用干細(xì)胞的方法已被更詳細(xì)披露于美國(guó)專利號(hào)5,672,346，6,143,292和6,534,052中，其在本發(fā)明中結(jié)合作為參考。
在一些具體實(shí)例中，與表達(dá)載體如病毒載體或質(zhì)粒接觸的靶細(xì)胞不同于其它細(xì)胞之處在于被接觸的靶細(xì)胞包括能被表達(dá)載體靶向的特定的細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)?！疤囟ǖ募?xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)”指的是存在于細(xì)胞表面的，載體，如，腺病毒載體，能與之相互作用以粘附到細(xì)胞上，從而進(jìn)入該細(xì)胞的任何位點(diǎn)(如，分子或分子的聯(lián)合)。因此，特定的細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)包括細(xì)胞表面受體并且，優(yōu)選，是蛋白(包括修飾的蛋白)，碳水化合物、糖蛋白、蛋白多糖、脂類、粘蛋白分子或黏蛋白等等。潛在的細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)的例子包括，但不限于肝磷脂和發(fā)現(xiàn)于粘多糖上的硫酸軟骨素部分，發(fā)現(xiàn)于粘蛋白上的唾液酸部分，糖蛋白以及神經(jīng)節(jié)苷脂，主要的組織相容性復(fù)合體I(MHC I)糖蛋白，發(fā)現(xiàn)于膜糖蛋白內(nèi)的普通碳水化合物分子，包括甘露糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺、海藻糖、和半乳糖；糖蛋白，如ICAM-1、VCAM、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、和整聯(lián)蛋白分子；以及存在于癌細(xì)胞上的腫瘤-特異性抗原，例如，MUC-1腫瘤特異性抗原決定簇。然而，將表達(dá)載體如腺病毒靶向細(xì)胞不限于任何特定的細(xì)胞作用(也就是，與給定的細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)作用)機(jī)制。
如本發(fā)明中使用的并在下面進(jìn)一步定義的，“多聚核苷酸”或“核酸”可以指DNA或RNA，或包含脫氧和核糖核苷酸的分子。核酸包括基因組DNA、cDNA和包括有義和反義核酸的寡核苷酸。這樣的核酸也可包括在磷酸核糖骨架上的修飾以提高這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。
核酸可以是雙鏈的、單鏈的、或包含雙鏈或單鏈序列的部分。正如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員將理解的那樣，單鏈(“Watson”)的描述也定義了另一鏈(“Crick”)的序列；因此在圖2、4和6中描述的序列也包括該序列的互補(bǔ)鏈。術(shù)語(yǔ)“重組核酸”在本發(fā)明中指的是最初在體外，通常，通過(guò)核酸內(nèi)切酶操作以一種非正常存在于自然界中的形式形成的核酸。因此，線形的分離的核酸，或通過(guò)連接非正常結(jié)合的DNA分子而形成于體外的表達(dá)載體，為本發(fā)明的目的這兩者都被認(rèn)為是重組的?？梢岳斫?，一旦形成重組核酸，再引入寄主細(xì)胞或有機(jī)體，那么它可以非重組地復(fù)制，也就是，使用寄主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制，而非體外或染色體外操作；然而，這樣的核酸，一旦重組產(chǎn)生，盡管隨后非重組地復(fù)制，那么對(duì)本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)仍然被認(rèn)為是重組的。
術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”能在本申請(qǐng)中被互換使用，指的是至少兩個(gè)共價(jià)連接的氨基酸，其包括蛋白，多肽，寡肽和肽。蛋白可由自然發(fā)生的氨基酸和肽鍵，或合成的模擬肽結(jié)構(gòu)組成。因此用于本發(fā)明的“氨基酸”或“肽殘基”既指自然發(fā)生的又指合成的氨基酸。例如，同型苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被認(rèn)為是為本發(fā)明目的的氨基酸。“氨基酸”還包括亞氨基酸殘基如脯氨酸和羥基脯氨酸。側(cè)鏈可以是(R)或(S)構(gòu)象。在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，氨基酸是(S)或L構(gòu)象。如果使用非自然發(fā)生的側(cè)鏈，那么可以使用非氨基酸取代，例如為防止或延緩體內(nèi)降解。為產(chǎn)生變異的蛋白和肽以靶向或作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)的天然氨基酸序列的改變，例如，能通過(guò)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員公知的各種方法來(lái)進(jìn)行。變異的肽指的是與指定的肽實(shí)質(zhì)上同源，但其具有與所述的肽不同的氨基酸序列的肽。同源性的程度(即，同一性百分比)，例如，能通過(guò)使用為這種比較而加以優(yōu)化的計(jì)算機(jī)程序(如，使用Devereux et al描述的GAP計(jì)算機(jī)程序，6.0版本或更高版本(Nucleic AcidsRes.，12，387(1984)，并能從University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)處自由獲得)比較序列信息來(lái)測(cè)定。變異的蛋白和/或肽的活性能使用其它本領(lǐng)域那些技術(shù)人員公知的其它方法來(lái)測(cè)定。
在變異的蛋白(肽)和參考蛋白(肽)之間不相同的氨基酸殘基方面，變異的蛋白(肽)優(yōu)選包括保守的氨基酸取代，也就是指定的氨基酸被相似尺寸、電荷密度、疏水性/親水性、和/或構(gòu)象的另一氨基酸取代(如Val取代Phe)。變異的位點(diǎn)特異性突變能通過(guò)向表達(dá)載體內(nèi)連接包含修飾位點(diǎn)的合成的寡核苷酸而被導(dǎo)入?？蛇x擇地，能使用針對(duì)寡核苷酸的位點(diǎn)特異性突變程序，如Walder et al.，Gene，42133(1986)；Bauer et al.，Gene，3773(1985)；Craik，Biotechniques，January 1995，pp.12-19；和美國(guó)專利號(hào)4,518,584和4,737,462.中披露的那些。
免疫調(diào)節(jié)分子在本說(shuō)明書的內(nèi)容中，“免疫調(diào)節(jié)分子”是調(diào)節(jié)，也就是以抗原特異性方式，增加或減少直接針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞和/或體液的寄主免疫應(yīng)答的多肽分子，優(yōu)選是減少寄主免疫應(yīng)答的多肽分子。一般來(lái)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，免疫調(diào)節(jié)分子將與靶細(xì)胞表面膜相關(guān)聯(lián)，如在從本發(fā)明所述的載體中表達(dá)后，插入到細(xì)胞表面膜內(nèi)或共價(jià)或非共價(jià)連接到其上。
在優(yōu)選的具體實(shí)例中，免疫調(diào)節(jié)分子包含CD8蛋白的全部或功能部分，甚至更優(yōu)選為CD8α鏈的全部或功能部分。對(duì)于人CD8的編碼序列來(lái)說(shuō)，見(jiàn)Leahy，F(xiàn)aseb J.917-25(1995)；Leahy et al.，Cell 681145-62(1992)；Nakayama et al.，Immunogenetics 30393-7(1989)。關(guān)于CD8蛋白和多肽的“功能部分”指的是保持本發(fā)明中所述的否定活性的CD8α-鏈的部分，更特別的，保持CD8α-鏈的HLA-結(jié)合活性的部分，特定地，CD8α-鏈的胞外區(qū)域內(nèi)的Ig-樣區(qū)域。典型的變異CD8多肽描述于Gao和Jakobsen，ImmunologyToday 21630-636(2000)，在此引入作為參考。在一些具體實(shí)例中，使用了全長(zhǎng)CD8α-鏈。然而，在一些具體實(shí)例中其細(xì)胞質(zhì)區(qū)域被缺失。優(yōu)選，保留了跨膜區(qū)域和細(xì)胞外區(qū)域。
正如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員所理解的那樣，CD8α-鏈的跨膜區(qū)域能與其它分子的跨膜區(qū)域互換，如果必要的話，修飾細(xì)胞外區(qū)域與靶細(xì)胞表面之間的連接。在這個(gè)具體實(shí)例中，編碼CD8α-鏈的細(xì)胞外區(qū)域的核酸被可操作地連接到編碼跨膜區(qū)域的核酸上。本發(fā)明中可使用任何跨膜蛋白的跨膜區(qū)域?？蛇x擇地，發(fā)現(xiàn)于跨膜蛋白內(nèi)的未知的跨膜。在這個(gè)具體實(shí)例中“合成的跨膜區(qū)域”包括大約20-25個(gè)疏水氨基酸，其后跟隨至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)帶電氨基酸。在一些具體實(shí)例中，CD8細(xì)胞外區(qū)域通過(guò)本領(lǐng)域傳統(tǒng)的技術(shù)被連接到靶細(xì)胞膜上。優(yōu)選的CD8α-鏈序列列于圖1，并包括編碼來(lái)自包括人、小鼠、大鼠、猩猩、蜘蛛猿、豚鼠、牛、鬃毛棉鼠(Hispid cotton rat)、家豬和貓的種的全長(zhǎng)CD8α-鏈的氨基酸序列或核苷酸序列的全長(zhǎng)序列。
在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，CD8α-鏈不是融合蛋白，而是截短的蛋白，其內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域被刪除。如圖2所描述，人CD8α-鏈基因表達(dá)一個(gè)235個(gè)氨基酸的蛋白。該蛋白被認(rèn)為能分成下面幾個(gè)區(qū)域(起始于該多肽的氨基末端結(jié)束于該多肽的羧基末端)信號(hào)肽(氨基酸1-21)；免疫球蛋白(Ig)-樣區(qū)域(大約氨基酸22-136)；最接近膜的莖區(qū)域(氨基酸137-181)；跨膜區(qū)域(氨基酸183-210)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(氨基酸211-235)。編碼這些不同區(qū)域的編碼序列的核苷酸包括編碼信號(hào)肽的1-63，編碼細(xì)胞外區(qū)域的64-546，編碼細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的大約547-621和編碼細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的大約622-708。此外，小鼠序列能被分成如下區(qū)域。該多肽能被分成包括氨基酸1-27的信號(hào)序列，包括大約氨基酸28-194的細(xì)胞外區(qū)域，包括大約氨基酸195-222的跨膜區(qū)域和包括大約氨基酸223-310的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。類似地，編碼這些區(qū)域的編碼序列的核苷酸包括編碼信號(hào)肽的核酸1-81，編碼細(xì)胞外區(qū)域的大約82-582，編碼跨膜區(qū)域的大約583-666和編碼細(xì)胞外區(qū)域的大約667-923。
在一些具體實(shí)例中編碼全長(zhǎng)蛋白的核酸序列被包含于基因送遞載體內(nèi)。在其它的具體實(shí)例中，編碼細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的核酸未被包含于基因送遞裝置內(nèi)的多核苷酸內(nèi)，結(jié)果導(dǎo)致膜錨定蛋白缺乏細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。在其它種內(nèi)，相應(yīng)的區(qū)域也能被識(shí)別，包括在優(yōu)選的具體實(shí)例中是小鼠。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也將會(huì)理解與先前提及的多肽具實(shí)質(zhì)上同源的免疫調(diào)節(jié)分子在本發(fā)明中也有用。因此，例如，也被“CD8多肽”包含的是與被圖2中所示的核苷酸編碼的多肽具有至少大約80％序列一致性，通常至少大約85％序列一致性，優(yōu)選至少大約90％序列一致性，更優(yōu)選大約95％序列一致性和最優(yōu)選至少大約98％序列一致性的同源多肽。
“編碼CD8的核酸分子”，及其語(yǔ)法上的等同物指的圖2中所示的人CD8的核苷酸序列，以及與圖2中所示的核苷酸具有至少大約80％序列一致性，通常至少大約85％序列一致性，優(yōu)選至少大約90％序列一致性，更優(yōu)選大約95％序列一致性和最優(yōu)選至少大約98％序列一致性的核苷酸序列，其編碼具有圖2中所示序列的多肽，如列于圖1。
如先前所提及的，可以使用許多不同的程序來(lái)鑒定一蛋白或核酸是否與已知的序列具有序列一致性或相似性。序列一致性和/或相似性能使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)測(cè)定，包括，但不限于，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部序列一致性運(yùn)算法則(algorithm)，通過(guò)Needleman&Wunsch J.Mol.Biol.48443(1970)的序列一致性比對(duì)運(yùn)算法則，通過(guò)Pearson & Lipman的尋找相似性方法PNAS USA 852444(1988)，通過(guò)這些運(yùn)算法則的計(jì)算機(jī)運(yùn)行(在Wisconsin Genetics Software Package中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，WI)，Devereux et al.，Nucl.Acid Res.12387-395(1984)中描述的Best Fit序列程序，優(yōu)選使用默認(rèn)設(shè)置，或通過(guò)檢查。優(yōu)選，一致性百分比通過(guò)基于下列參數(shù)的FastDB來(lái)計(jì)算錯(cuò)配罰分(mismatch penalty)1；間隙罰分(gap penalty)1；間隙大小罰分(gap size penalty)0.33；和連接罰分(joining penalty)30，“序列比較和分析的現(xiàn)行方法，”大分子測(cè)序和合成，選擇的方法和應(yīng)用，pp 127-149(1988)，Alan R.Liss，Inc。
一個(gè)有用的運(yùn)算法則的例子是PILEUP。PILEUP使用漸進(jìn)的、成對(duì)的比對(duì)從一組相關(guān)的序列產(chǎn)生了多個(gè)序列比對(duì)。它也能繪制用于產(chǎn)生比對(duì)的顯示聚類關(guān)系的樹。PILEUP使用Feng&Doolittle，J.Mol.Evol.35351-360(1987)的漸進(jìn)比對(duì)方法的簡(jiǎn)化，該方法與Higgins&Sharp CABIOS 5151-153(1989)描述的方法相似。有用的PILEUP參數(shù)包括默認(rèn)的間隙權(quán)重(defaultgap weight)3.00默認(rèn)的間隙長(zhǎng)度權(quán)重(default gap lenth weight)0.10，和加權(quán)的末端間隙(weighted end gaps)。
有用的運(yùn)算法則的另一實(shí)施例是BLAST運(yùn)算法則，描述于Altschul etal.，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)and Karlin et al.，PNAS USA 905873-5787(1993)。特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其能從Altschul et al.，Methods in Enzymology，266460-480(1996)；http∥blast.wustl/edu/blast/README.html]獲得。WU-BLAST-2使用幾個(gè)檢索參數(shù)，其中的大多數(shù)被設(shè)置成默認(rèn)值。其可調(diào)節(jié)參數(shù)被設(shè)置成下列數(shù)值重疊跨度(overlap span)＝1，重疊分?jǐn)?shù)(overlap fraction)＝0.125，詞閾值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2參數(shù)是動(dòng)態(tài)值，并取決于特定序列的組成和針對(duì)被檢索的目標(biāo)序列的特定數(shù)據(jù)庫(kù)的組成通過(guò)程序自身來(lái)建立的，然而，該數(shù)值能被調(diào)整以提高其敏感性。
另一有用的運(yùn)算法則是被Altschul et al.Nucleic Acids Res.253389-3402報(bào)道的間隙BLAST(gapped BLAST)。間隙BLAST使用BLOSUM-62取代記分；閾值T參數(shù)設(shè)置為9，雙重碰撞(two-hit)方法來(lái)引發(fā)無(wú)間隙的延伸；電荷間隙長(zhǎng)度(charges gap length)為k值的代價(jià)為10+k；Xu設(shè)置為16，和Xg在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索階段設(shè)置為40，運(yùn)算法則的輸出階段設(shè)置為67。間隙運(yùn)算法則被相應(yīng)于～22比特的分?jǐn)?shù)觸發(fā)。
A％的氨基酸或核酸序列一致性值是通過(guò)配對(duì)的相同的殘基數(shù)除以比對(duì)區(qū)域中“較長(zhǎng)”序列的殘基總數(shù)而測(cè)定。該“較長(zhǎng)”序列是在比對(duì)區(qū)域中具有最實(shí)際的殘基的序列(通過(guò)WU-Blast-2引入使對(duì)準(zhǔn)記分最大化的間隙被忽略)。
比對(duì)可以包括在被比對(duì)的序列內(nèi)引入間隙。此外，對(duì)于包含比圖11所示的核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列更多或更少氨基酸的序列來(lái)說(shuō)，可以理解在一個(gè)具體實(shí)施例中序列一致性百分比將基于相對(duì)于氨基酸的總數(shù)量的相同的氨基酸數(shù)量來(lái)測(cè)定。因此，在一具體實(shí)例中，例如，比圖11中的核苷酸編碼的多肽更短的序列的序列一致性，如下論述，將使用更短序列內(nèi)的氨基酸的數(shù)量來(lái)測(cè)定。在百分比一致性的計(jì)算中相對(duì)權(quán)重未被賦予給序列變異的不同表現(xiàn)，如插入、缺失、取代，等。
在一具體實(shí)例中，只有一致性被正記分，并且序列變異的所有形式包括間隙被指定為值“0”，其避免了對(duì)下述的用于序列相似性計(jì)算的加權(quán)數(shù)值范圍或參數(shù)的需要。序列一致性百分比能通過(guò)，例如，配對(duì)的相同殘基的數(shù)量除以比對(duì)的區(qū)域內(nèi)“較短”序列的殘基的總數(shù)量并乘以100來(lái)計(jì)算?！拜^長(zhǎng)”序列是在比對(duì)區(qū)域內(nèi)具有最實(shí)際殘基的序列。
與圖2內(nèi)的核苷酸編碼的多肽具有不到100％序列一致性的CD8一般將產(chǎn)生于來(lái)自除人之外的物種的天然CD8核苷酸序列以及人或非人來(lái)源的天然CD8核苷酸序列的變異體。在這點(diǎn)上，值得注意的是很多技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并可被常規(guī)應(yīng)用以產(chǎn)生天然CD8序列的核苷酸序列變異體并分析那些變異體的多肽產(chǎn)物以確定至少一種與天然CD8多肽正常相關(guān)的活性的存在。在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，CD8α-鏈來(lái)自人，但如圖1所示，來(lái)自大鼠、小鼠和靈長(zhǎng)類的CD8-鏈?zhǔn)枪牟⒖杀挥糜诒景l(fā)明。
具有CD8活性的多肽可以比描述于圖2中的核苷酸編碼的多肽更短或更長(zhǎng)。因此，在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，包含于CD8多肽的定義是被圖2的核苷酸序列編碼的多肽的部分或片段。在本發(fā)明一具體實(shí)例中，被圖2的核苷酸編碼的多肽的片段被認(rèn)為是CD8多肽，如果a)他們至少具有所指示的序列一致性；和b)優(yōu)選具有上述的自然發(fā)生的CD8的生物活性。
此外，如下面更全面概括的，CD8α-鏈能被制成比圖2的核苷酸編碼的多肽更長(zhǎng)；例如，通過(guò)添加其它融合序列，或闡明額外的編碼和非編碼序列。
CD8多肽優(yōu)選是重組的?！爸亟M多肽”是使用重組技術(shù)制備的多肽，也就是說(shuō)，通過(guò)下述的重組核酸的表達(dá)。在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，本發(fā)明的CD8通過(guò)表達(dá)圖2中所示的核酸序列，或其片段來(lái)制備。重組多肽至少在一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)方面不同于自然發(fā)生的蛋白。例如，該多肽能從野生型寄主內(nèi)與其正常相關(guān)的一些或全部蛋白和化合物中被分離或純化出來(lái)，并因此能被實(shí)質(zhì)上純化。例如，一種分離的多肽與其自然狀態(tài)下正常相關(guān)的至少一些物質(zhì)不共存，優(yōu)選組成給定樣品的總蛋白重量的至少大約0.5％，更優(yōu)選至少大約5％。一種實(shí)質(zhì)上純化的多肽包括總多肽重量的至少大約75％，優(yōu)選至少大約80％，特別優(yōu)選至少大約90％。該定義包含從在不同有機(jī)體或寄主細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)有機(jī)體生產(chǎn)CD8多肽。
可選擇地，該多肽可通過(guò)使用誘導(dǎo)啟動(dòng)子或高表達(dá)啟動(dòng)子，以比正常所見(jiàn)顯著更高的濃度被制備，致使該多肽以提高的濃度水平被制備?？蛇x擇地，該多肽可以是非正常發(fā)現(xiàn)于自然界中的形式，如下面評(píng)述的，氨基酸取代、插入和缺失的加入。
在一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供了核酸CD8的變異體。這些變異體屬于三類中的一個(gè)或多個(gè)取代的、插入的、或缺失的變異體。這些變異體通常通過(guò)圖2核苷酸的核苷酸位點(diǎn)特異性突變來(lái)制備，使用盒式或PCR突變或其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)，來(lái)制備編碼變異體的DNA，包括基因治療載體內(nèi)的變異體和其后表達(dá)DNA。氨基酸序列變異體以該變異事前確定的性質(zhì)為特征，這一特點(diǎn)使他們與CD8氨基酸序列的自然發(fā)生的等位基因或種間變異區(qū)別開。變異體典型地展現(xiàn)出與自然發(fā)生的類似物相同的定量上的生物學(xué)活性，盡管具有將在下面被全面概括的修飾的性質(zhì)的變異體也能被選擇。
雖然引入序列變異的位點(diǎn)或區(qū)域事先被確定，但該突變本身不需要被事先確定。例如，為了優(yōu)化一指定位點(diǎn)上突變的性能，在靶密碼子或區(qū)域可進(jìn)行隨機(jī)突變，并篩選表達(dá)的突變體以獲得最佳的期望的活性。在一具有已知序列的DNA中事先確定的位點(diǎn)上進(jìn)行取代突變的技術(shù)已是公知的，例如M13引物突變和PCR突變。另一個(gè)制備突變體技術(shù)的實(shí)例是基因改組(shuffling)，其中允許重組核苷酸序列相似變體的片段來(lái)產(chǎn)生新的變體組合。這些技術(shù)的實(shí)例被發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利號(hào)5,605,703；5,811,238；5,873,458；5,830,696；5,939,250；5,763,239；5,965,408；和5,945,325中，他們的每一個(gè)在本發(fā)明中全文結(jié)合作為參考。
氨基酸取代典型地是單個(gè)殘基取代；插入通常屬于大約1-20個(gè)氨基酸范圍的，盡管較大的插入也是被允許的。缺失的范圍從1到大約20個(gè)殘基，盡管在一些情形中缺失可以是更大的并可以包括細(xì)胞質(zhì)區(qū)域或其片段。
取代、缺失、插入或他們的任一組合都可被用于獲得最終的衍生物。通常對(duì)幾個(gè)氨基酸進(jìn)行這些變化以使得該分子的變化最小。然而，在某些情況下更大的變化也是被允許的。當(dāng)期望獲得CD8性質(zhì)的小變化，取代將根據(jù)下面的圖表來(lái)進(jìn)行
圖表1

功能或免疫原性實(shí)質(zhì)上的改變可通過(guò)選擇比圖表1所示的那些更不保守的取代來(lái)進(jìn)行。例如，可進(jìn)行這樣的取代，其實(shí)質(zhì)上更顯著影響改變的區(qū)域內(nèi)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)；目標(biāo)位點(diǎn)上分子的電荷或疏水性；或側(cè)鏈的大小。通常被期望產(chǎn)生多肽的性質(zhì)上最大變化的取代是那些其內(nèi)(a)親水殘基，如絲氨?；蛱K氨?；皇杷畾埢〈蛉〈杷畾埢?，如亮氨酰基、異亮氨酰基、苯丙氨酰基、纈氨酰基或丙氨?；?b)半胱氨酸或脯氨酸被其它任何殘基取代或取代其它任何殘基；(c)具有電正性側(cè)鏈的殘基，如賴氨酰基、精氨?；蚪M氨?；浑娯?fù)性殘基取代或取代電負(fù)性殘基，如，谷氨?；蛱於０被换?d)具有大側(cè)鏈的殘基，如苯基丙氨酸，被不具有側(cè)鏈的殘基取代或取代不具有側(cè)鏈的殘基，如甘氨酸。
盡管突變體因?yàn)樾枰贿x擇改變CD8的特性，但這些突變體典型地表現(xiàn)出與自然發(fā)生的類似物相同性質(zhì)的生物活性，并將引起相同的免疫應(yīng)答?？蛇x擇地，突變體可被設(shè)計(jì)致使蛋白的生物活性被改變。
包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽共價(jià)修飾的一種類型包括改變?cè)摱嚯奶烊惶腔哪Ｊ健！案淖兲烊惶腔哪Ｊ健睘楸景l(fā)明目的指的是刪除一個(gè)或多個(gè)發(fā)現(xiàn)于天然序列CD8多肽內(nèi)的碳水化合物部分，和/或增加一個(gè)或多個(gè)天然多肽序列中不存在的糖基化位點(diǎn)。
向多肽上添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變其氨基酸序列來(lái)完成。這一改變，例如，可通過(guò)向天然氨基酸多肽添加、或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(對(duì)O-連接的糖基化位點(diǎn)而言)來(lái)進(jìn)行。氨基酸序列可任選地通過(guò)在DNA水平的改變而被改變，特別是通過(guò)在事先選擇的堿基處突變編碼多肽的DNA致使產(chǎn)生的密碼子翻譯成期望的氨基酸。
存在于多肽上的碳水化合物部分的去除可通過(guò)為充當(dāng)糖基化目標(biāo)的氨基酸殘基編碼的密碼子的突變?nèi)〈鷣?lái)實(shí)現(xiàn)。
一旦從其自然來(lái)源分離，如，包含于質(zhì)粒或其它載體或作為線性的核酸片段從那里切除，重組的核酸可被進(jìn)一步用作探針來(lái)識(shí)別和分離其它核酸。它也能被用作“前體”核酸來(lái)制備修飾的或變異的核酸和蛋白。它也能被連接到載體或其它送遞載體來(lái)治療本發(fā)明中所述的靶細(xì)胞。
基因治療表達(dá)載體在本發(fā)明內(nèi)容中，任何合適的基因治療表達(dá)載體都能被使用?！拜d體”正如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員所理解的術(shù)語(yǔ)那樣，是一種用于基因轉(zhuǎn)移的載體。根據(jù)本發(fā)明的載體包括，但不限于，質(zhì)粒、噬菌體、病毒、脂質(zhì)體，等等。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體優(yōu)選包括額外的序列和突變。特別地，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體包括包含編碼免疫調(diào)節(jié)分子，特別是本發(fā)明中定義的CD8α-鏈，的轉(zhuǎn)基因的核酸，任選地進(jìn)一步包含至少一個(gè)編碼目標(biāo)治療性分子的另外的轉(zhuǎn)基因。核酸可包含全部或部分合成制備的編碼或其它遺傳序列或基因組或互補(bǔ)DNA(cDNA)序列，并能以DNA或RNA的形式被提供。
轉(zhuǎn)基因和/或編碼免疫調(diào)節(jié)的和/或治療性分子的基因能被轉(zhuǎn)移至病毒載體或從病毒載體移除，或轉(zhuǎn)移入桿狀病毒或合適的原核或真核表達(dá)載體用于表達(dá)mRNA并產(chǎn)生蛋白質(zhì)，以及用于其它生化性質(zhì)的評(píng)價(jià)。
在根據(jù)本發(fā)明的載體(包括重組腺病毒載體和轉(zhuǎn)移載體)的生產(chǎn)方面，這些載體能使用標(biāo)準(zhǔn)的分子和遺傳技術(shù)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些來(lái)構(gòu)建。包含病毒體或病毒粒子(如，重組腺病毒載體)的載體能使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞系內(nèi)的病毒載體來(lái)制備。類似地，包含一個(gè)或多個(gè)嵌合外殼蛋白的粒子能在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中被制備，如目前被用于腺病毒載體的那些。如果期望的話，這些得到的粒子能靶向特定的細(xì)胞。
能使用任何合適的表達(dá)載體(如，描述于in Pouwels et al.，CloningvectorsA Laboratory Manual(Elsevior，N.Y.1985)和相應(yīng)的合適的寄主細(xì)胞在寄主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)重組多肽或蛋白。表達(dá)寄主細(xì)胞包括，但不限于，在埃希氏菌屬、桿菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬之內(nèi)的細(xì)菌種，哺乳動(dòng)物或昆蟲寄主細(xì)胞系統(tǒng)，包括桿狀病毒系統(tǒng)(如，Luckow et al.，Bio/Technology，6，47(1988))中描述)，和建立的細(xì)胞系，例如COS-7，C127，3T3，CHO，HeLa，BHK，等等。一個(gè)用于制備根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白(肽)的特別優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，其中使用了粉夜蛾屬(Trichoplusia)ni，Tn 5B 1-4昆蟲細(xì)胞，或其它合適的昆蟲細(xì)胞，來(lái)生產(chǎn)高水平重組蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員當(dāng)然意識(shí)到表達(dá)寄主的選擇對(duì)生產(chǎn)的肽的類型來(lái)說(shuō)具有影響(ramification)。例如，在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如，COS-7細(xì)胞)內(nèi)生產(chǎn)的肽的糖基化將不同于在細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌內(nèi)生產(chǎn)的肽的糖基化。
在一優(yōu)選的具體實(shí)例中，蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，并包括逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是任何能結(jié)合哺乳動(dòng)物RNA聚合酶并起始蛋白編碼序列下游(3’)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，該起始區(qū)域通常被置于接近編碼序列的5’端，和一個(gè)TATA盒，使用位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游的25-30個(gè)堿基對(duì)。該TATA盒被認(rèn)為指導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點(diǎn)開始RNA合成。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子還包括一個(gè)上游啟動(dòng)子元件(增強(qiáng)子元件)，典型地位于TATA盒的上游100-200堿基對(duì)內(nèi)。上游啟動(dòng)子元件決定轉(zhuǎn)錄被起始的速率并還能作用于任一方向。特定用作哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子是來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒基因的啟動(dòng)子，因?yàn)椴《净蛲ǔ８弑磉_(dá)并具有廣泛的寄主范圍。實(shí)例包括SV40早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、單純皰疹病毒啟動(dòng)子，和CMV啟動(dòng)子。
典型地，被哺乳動(dòng)物細(xì)胞識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3’的調(diào)節(jié)區(qū)域并因此，與啟動(dòng)子元件一起，位于編碼序列側(cè)面。成熟mRNA的3’末端通過(guò)位點(diǎn)特異性翻譯后切割以及多聚腺苷酸化形成。轉(zhuǎn)錄終止子的例子和多聚腺苷酸化信號(hào)包括來(lái)源于SV40的那些。
向哺乳動(dòng)物寄主，以及其它寄主中導(dǎo)入外源核酸的方法是本領(lǐng)域公知的，并且隨著所使用的寄主細(xì)胞而不同。這些技術(shù)包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、長(zhǎng)鏈烴介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒感染、多核苷酸在脂質(zhì)體內(nèi)的包裝、和向核內(nèi)直接顯微注射DNA。
蛋白也可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)被制成融合蛋白。因此，例如蛋白也可被制成融合蛋白以提高表達(dá)，或出于其它原因。例如，當(dāng)?shù)鞍资请牡臅r(shí)候，編碼該肽的核酸可被連接到其它核酸用于表達(dá)目的。
為檢驗(yàn)CD8，該蛋白在表達(dá)后被純化或分離。根據(jù)樣品中存在什么樣的其它成分，能以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式來(lái)分離或純化蛋白。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括電泳的、分子的、免疫的和色譜的技術(shù)，包括離子交換、疏水的、親合的、和反相HPLC層析，以及層析聚焦。例如，能使用標(biāo)準(zhǔn)的抗-CD8抗體柱來(lái)純化CD8蛋白。與蛋白濃度相關(guān)的超濾和滲濾技術(shù)也是有用的。對(duì)于合適的純化技術(shù)的普遍指導(dǎo)，見(jiàn)Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982)。所需的純化程度將根據(jù)CD8蛋白的使用而不同。在一些例子中無(wú)需純化。在一些例子中在細(xì)胞表面檢測(cè)CD8表達(dá)，例如通過(guò)抗體結(jié)合和通過(guò)熒光或熒光激活的細(xì)胞分類術(shù)(FACS)檢測(cè)。
編碼CD8的核酸分子以及任何來(lái)源于CD8核酸分子的編碼或非編碼鏈的核酸分子能以多種本領(lǐng)域公知的和常規(guī)使用的方式與靶中的細(xì)胞接觸，其中該接觸可以是回體或體內(nèi)。
病毒吸附，侵入和基因表達(dá)可通過(guò)使用包含插入目標(biāo)的腺病毒載體產(chǎn)生表達(dá)如β-半乳糖糖苷酶的感興趣蛋白或RNA和標(biāo)記基因的重組病毒作初始評(píng)估。在感染了含有β-半乳糖糖苷酶基因(Ad-LacZ)的腺病毒的細(xì)胞中的β-半乳糖糖苷酶表達(dá)可在早達(dá)細(xì)胞加入Ad-Gluc后兩小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到。該程序提供了一種迅速有效的重組病毒的細(xì)胞侵入和基因表達(dá)的分析手段，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)手段就容易實(shí)施。
使用本發(fā)明編碼蛋白的核酸，可制備多種表達(dá)載體。表達(dá)載體可以是自我復(fù)制的染色體外載體或整合進(jìn)宿主基因組的載體。通常地，這些表達(dá)載體包括可操作地連接至編碼蛋白的核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸。術(shù)語(yǔ)“控制序列”涉及在特定宿主機(jī)體內(nèi)對(duì)可操作地連接的編碼序列的表達(dá)必需的DNA序列。適合原核生物的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子，任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子，多聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
核酸與另一個(gè)核酸序列處于功能性關(guān)系時(shí)是“可操作地連接”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)的DNA如果作為參與多肽分泌的前蛋白而表達(dá)，則與多肽的DNA可操作地連接；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響了序列的轉(zhuǎn)錄，則與編碼序列可操作地連接；或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果處于有利于翻譯的位置，則與編碼序列可操作地連接。作為另一個(gè)例子，可操作地連接涉及連接DNA序列以使其相鄰，并且在分泌前導(dǎo)的情況中，相鄰并且在閱讀相中。然而，增強(qiáng)子不一定是相鄰的。連接通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)的連接完成。如果這樣的位點(diǎn)不存在，根據(jù)常規(guī)慣例使用合成的寡核苷酸銜接物或接頭。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸通常適合于用于表達(dá)CD8的宿主細(xì)胞；例如，人轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列優(yōu)選用于在人細(xì)胞中表達(dá)CD8。用于各種類型宿主細(xì)胞的多種類型的合適表達(dá)載體和合適的調(diào)控序列是本領(lǐng)域已知的。
一般而言，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可包括，但是不限于，啟動(dòng)子序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，和增強(qiáng)子或激活子序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。
啟動(dòng)子序列編碼組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可是天然存在的啟動(dòng)子或雜交的啟動(dòng)子。結(jié)合多于一個(gè)啟動(dòng)子的元件的雜交啟動(dòng)子也是本領(lǐng)域公知的，在本發(fā)明中是有用的。
另外，表達(dá)載體可包括附加元件。例如，表達(dá)載體可有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，因而使其在兩種機(jī)體內(nèi)維持，例如在用于表達(dá)的哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞與用于克隆和擴(kuò)增的原核宿主。此外，對(duì)于整合表達(dá)載體，表達(dá)載體含有至少一個(gè)與宿主細(xì)胞基因組同源的序列，優(yōu)選與表達(dá)構(gòu)建體側(cè)鄰的兩個(gè)同源序列。整合載體可通過(guò)選擇在載體中包含合適的同源序列而定位于宿主細(xì)胞中的特異位點(diǎn)。用于整合載體的構(gòu)建物是本領(lǐng)域公知的。
在另一實(shí)施方案中，表達(dá)載體可包含便于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞篩選的選擇性標(biāo)記基因。選擇性基因是本領(lǐng)域公知的且會(huì)隨使用的宿主細(xì)胞而不同。
優(yōu)選地，載體是病毒載體，比如腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，皰疹病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及其它載體等。最優(yōu)選地，病毒載體是腺病毒載體。腺病毒載體可來(lái)源于任何腺病毒?！跋俨《尽笔窍俨《究频娜魏尾《?，期望是哺乳動(dòng)物腺病毒屬(如哺乳動(dòng)物腺病毒)或禽腺病毒屬(如禽腺病毒)。腺病毒可以是任何血清型。作為腺病毒來(lái)源使用的腺病毒原液可從腺病毒血清型1-47擴(kuò)增，其通常從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)獲得，或從由任何其它來(lái)源獲得的任何其它腺病毒血清型擴(kuò)增。例如，腺病毒可是亞群A(如血清型12，18和31)，亞群B(如血清型3，7，11，14，16，21，34和35)，亞群C(如血清型1，2，5和6)，亞群D(如血清型8，9，10，13，15，17，19，20，22-30，32，33，36-39和42-47)，亞群E(血清型4)，亞群F(血清型40和41)或任何其它腺病毒血清型。然而，優(yōu)選的腺病毒是血清型2，5或9。期望地，腺病毒包含相同血清型的外殼蛋白(如五鄰體基元，六鄰體和/或尾絲)。然而，也是優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)外殼蛋白在某種意義上可是嵌合的，例如所有或部分特定外殼蛋白可來(lái)自另一血清型。
雖然病毒載體，優(yōu)選腺病毒載體，可以是具有復(fù)制能力的，優(yōu)選病毒載體是復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制缺陷型。例如，優(yōu)選是腺病毒載體的載體，包含具有至少一個(gè)使病毒復(fù)制缺陷的修飾的基因組。病毒基因組的修飾包括，但不限于，DNA片段的缺失，DNA片段的插入，DNA片段的重排，DNA片段的替換或DNA損傷的引入。DNA片段可小到一個(gè)核苷酸，或大到36千堿基對(duì)，即腺病毒基因組的大致大小，或38千堿基對(duì)，其為腺病毒病毒體可包裝的最大量。
病毒，特別是腺病毒基因組的優(yōu)選修飾，除了使病毒復(fù)制缺陷的修飾外，還包括如這里所述的編碼免疫調(diào)節(jié)分子的轉(zhuǎn)基因的插入，和附加優(yōu)選地，至少一個(gè)編碼目標(biāo)治療性分子的轉(zhuǎn)基因。病毒，例如腺病毒，也優(yōu)選共合體，即病毒，如腺病毒基因組序列與其它序列，比如質(zhì)粒，噬菌體或其它病毒的連接。
就腺病毒載體而言(特別是復(fù)制缺陷型腺病毒載體)，這樣的載體可包括完整的衣殼(即包含病毒基因組，如腺病毒基因組)或空衣殼(即其中缺少病毒基因組或被降解，如通過(guò)被物理或化學(xué)的方法)。優(yōu)選地，病毒載體包括完整的衣殼，即作為攜帶編碼免疫調(diào)節(jié)分子的轉(zhuǎn)基因的工具，任選地和優(yōu)選地，至少一種編碼抑制手段的轉(zhuǎn)基因?？蛇x地，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因可插入腺病毒衣殼外的細(xì)胞中。
從優(yōu)選或期望將病毒，比如腺病毒靶向特定細(xì)胞上來(lái)說(shuō)，病毒在轉(zhuǎn)移入質(zhì)粒DNA的細(xì)胞中而言基本上是作為內(nèi)含體溶解(endosomolytic)劑使用，其含有標(biāo)記基因且被與細(xì)胞結(jié)合配體，比如運(yùn)鐵蛋白共價(jià)連接的多聚賴氨酸復(fù)合和濃縮(Cotton等，PNAS(USA)，89，6094-6098(1992)；和Curiel等，PNAS(USA)，88，8850-8854(1991))。已證明轉(zhuǎn)鐵蛋白-多聚賴氨酸/DNA復(fù)合體和腺病毒的偶聯(lián)(例如通過(guò)腺病毒導(dǎo)向的抗體的方式，用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，或通過(guò)生物素/鏈霉親和素橋接)充分地增強(qiáng)了基因的轉(zhuǎn)移(Wagner等，PNAS(USA)，89，6099-6103(1992))。
可選地，一個(gè)或多個(gè)病毒外殼蛋白，比如腺病毒尾絲，可被修飾，例如通過(guò)加入細(xì)胞-表面受體的配體序列或允許結(jié)合雙特異抗體(即一個(gè)末端具有尾絲特異性和另一個(gè)末端具有細(xì)胞-表面受體特異性的分子)的序列(PCT國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O95/26412(’412申請(qǐng))和Watkin等，″TargetingAdenovirus-Mediated Gene Delivery with Recombinant Antibodies，″摘要.No.336)。在兩個(gè)例子中，消除了典型尾絲/細(xì)胞-表面受體的相互作用，因此病毒，比如腺病毒，通過(guò)它的尾絲再次定向新的細(xì)胞-表面受體。
可選地，能夠特異性結(jié)合指定細(xì)胞類型的靶向元件，可與高親和結(jié)合對(duì)的第一個(gè)分子偶聯(lián)并引入宿主細(xì)胞(PCT國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O95/31566)。然后，與高親和結(jié)合對(duì)的第二個(gè)分子偶聯(lián)的基因送遞載體被給予宿主細(xì)胞，其中第二個(gè)分子能夠特異性結(jié)合第一個(gè)分子，這樣基因送遞載體靶向于指定細(xì)胞類型。
沿同一思路，既然以它們的核酸序列形式(即RNA或DNA)轉(zhuǎn)移病毒，質(zhì)粒和噬菌體的方法(如電穿孔，轉(zhuǎn)化，三親接合的偶聯(lián)，(共)轉(zhuǎn)染，(共)感染，膜融合，使用微粒，用磷酸鈣-DNA沉淀孵育，直接顯微注射等)是可得的，在沒(méi)有任何相關(guān)蛋白比如衣殼蛋白和任何包膜脂質(zhì)時(shí)，載體同樣地可包含RNA或DNA。
類似地，由于脂質(zhì)體通過(guò)與細(xì)胞膜融合影響細(xì)胞侵入，載體可包含帶有編碼外殼蛋白的組成型核酸的脂質(zhì)體。這種脂質(zhì)體可從例如LifeTechnologies，Bethesda，Md.購(gòu)買獲得，并可按照生產(chǎn)商的介紹使用。此外，脂質(zhì)體可用于影響基因送遞，并可使用具有增加的轉(zhuǎn)移容量和/或降低的體內(nèi)毒性的脂質(zhì)體?？扇苄郧逗贤鈿さ鞍?如此處描述的方法生產(chǎn))可按照生產(chǎn)商的說(shuō)明在脂質(zhì)體制備后，或者在脂質(zhì)體制備過(guò)程中，加到脂質(zhì)體中。
根據(jù)本發(fā)明的載體不限于本發(fā)明方法中使用的那些，也包括基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建中使用的中間型載體(如“轉(zhuǎn)移載體”)。
用于體內(nèi)送遞一種或多種核酸序列的優(yōu)選方法之一涉及使用腺病毒表達(dá)載體?！跋俨《颈磉_(dá)載體”表示包括含有足以(a)支持構(gòu)建物的包裝(b)在有義或反義方向上表達(dá)已克隆于其內(nèi)的多核苷酸的腺病毒序列的那些構(gòu)建物。當(dāng)然，在反義構(gòu)建物的情況下，表達(dá)不需要合成基因產(chǎn)物。
表達(dá)載體包括腺病毒的遺傳工程形式。對(duì)36kb，線性，雙鏈DNA病毒腺病毒遺傳結(jié)構(gòu)的了解，允許用最長(zhǎng)7kb的外源序列替換大片段腺病毒的DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，宿主細(xì)胞的腺病毒感染不會(huì)導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA以不具有潛在遺傳毒性的游離方式復(fù)制。而且，腺病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，大量擴(kuò)增后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因組重排。腺病毒可感染事實(shí)上所有的上皮細(xì)胞而不考慮它們的細(xì)胞周期階段。到目前為止，腺病毒感染似乎只與緩和的疾病比如人類急性呼吸疾病相關(guān)。
腺病毒特別適合用作基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗兄械却笮〉幕?，易于操作，高滴度，寬的靶?xì)胞范圍和高感染性。病毒基因組的兩個(gè)末端都含有100-200bp的反向重復(fù)序列(ITRs)，其中cis元件對(duì)病毒的DNA復(fù)制和包裝是必要的?；蚪M的早期(E)區(qū)和晚期(L)區(qū)含有以病毒DNA復(fù)制的起始劃分的不同轉(zhuǎn)錄單元。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)病毒基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控幾個(gè)細(xì)胞基因的蛋白。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致了病毒DNA復(fù)制蛋白的合成。這些蛋白涉及DNA復(fù)制，晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞的關(guān)閉(shut-off)(Renan，1990)。晚期基因的產(chǎn)物，包括大部分病毒衣殼蛋白，僅在由主要晚期啟動(dòng)子(MLP)引起的單個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄子的有效加工后才被表達(dá)。MLP(位于16.8mu)在感染晚期階段尤其有效，而且所有由該啟動(dòng)子引起的mRNA′s擁有使它們作為優(yōu)先翻譯mRNA′s的5′-三聯(lián)前導(dǎo)(TPL)序列。
在通常體系中，重組腺病毒通過(guò)穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生。由于兩個(gè)前病毒載體之間存在重組的可能性，野生型腺病毒可通過(guò)這一過(guò)程產(chǎn)生。因此，從一個(gè)單個(gè)噬菌斑中分離出病毒的單克隆并檢測(cè)它的基因組結(jié)構(gòu)是非常重要的。
復(fù)制缺陷型腺病毒載體的產(chǎn)生和繁殖依賴于獨(dú)特的輔助細(xì)胞系。實(shí)際上，腺病毒可包裝約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等1987)，提供容量約為額外2kB的DNA。結(jié)合E1和E3區(qū)中可取代的約5.5kB的DNA，通常腺病毒載體的最大容量低于7.5kB或約載體全長(zhǎng)的15％。載體的骨架中保留了大于80％的腺病毒基因組，它們是載體產(chǎn)生細(xì)胞毒性的根源。而且，E1-缺失的病毒的復(fù)制缺陷是不完全的。例如已觀察到通?？傻玫妮d體在高感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection)(MOI)時(shí)出現(xiàn)了病毒基因表達(dá)的滲漏(Mulligan，1993)。
輔助細(xì)胞系可來(lái)源于人細(xì)胞比如人胚腎細(xì)胞，肌細(xì)胞，造血細(xì)胞，或其它人胚間充質(zhì)或上皮細(xì)胞?？蛇x地，輔助細(xì)胞可來(lái)源于其它與人腺病毒相容的哺乳動(dòng)物物種的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括，比如Vero細(xì)胞或其它猴胚間充質(zhì)或上皮細(xì)胞。如上所述，通常優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。
最近，Racher等(1995)公開了培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改進(jìn)方法。在一種模式中，通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞接種到1升含有100-200ml培養(yǎng)基的硅化旋轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge，UK)中培養(yǎng)天然的細(xì)胞集合物。以40rpm攪拌后，細(xì)胞的活力用臺(tái)盼藍(lán)作估計(jì)。在另一方法中，使用了Fibra-Cel微載體(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/l)，如下所述。將重懸于5ml培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種體加到250ml的Erlenmeyer瓶中的載體(50ml)上，保持靜止并偶爾振蕩1-4h。然后用50ml新鮮培養(yǎng)基替換，并開始搖動(dòng)。為了生產(chǎn)病毒，讓細(xì)胞長(zhǎng)到約80％滿板，此后換培養(yǎng)基(至終體積的25％)和以0.05的MOI加入腺病毒。培養(yǎng)物靜置過(guò)夜，接著體積增加到100％，再開始搖動(dòng)72h。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒是本領(lǐng)域已知的“無(wú)活力”腺病毒?！盁o(wú)活力”腺病毒載體是最近研制的用于腺病毒基因送遞的體系。腺病毒復(fù)制需要輔助病毒和表達(dá)E1a和Cre的專門人類293細(xì)胞系，這是在天然環(huán)境中沒(méi)有的條件。在目前為止最有效的體系中，使用具有與噬菌體P1 loxP位點(diǎn)側(cè)鄰(″floxed″)側(cè)鄰的包裝信號(hào)的E1-缺失的輔助病毒。表達(dá)Cre重組酶的輔助細(xì)胞被無(wú)活力病毒和具有floxed包裝信號(hào)的輔助病毒共同感染后應(yīng)該只產(chǎn)生無(wú)活力rAV，因?yàn)榘b信號(hào)從輔助病毒的DNA中缺失了。然而，如果使用基于293的輔助細(xì)胞，輔助病毒DNA可與整合進(jìn)輔助細(xì)胞DNA的Ad5DNA發(fā)生重組。結(jié)果恢復(fù)了野生型包裝信號(hào)和E1區(qū)。因而，如果使用了E1-缺失的輔助病毒，基于293(或911)的輔助細(xì)胞的無(wú)活力rAV生產(chǎn)也可能導(dǎo)致產(chǎn)生RCA。
該載體喪失了所有的病毒基因。因而，載體是非免疫原性的，如果需要可反復(fù)使用?！盁o(wú)活力”腺病毒載體也含有36kb用于容納轉(zhuǎn)基因的空間，因而允許向細(xì)胞中共送遞大量基因。特異性序列基元，比如RGD基序可插入腺病毒載體的H-I環(huán)中以增強(qiáng)它的感染力。通過(guò)將特異性轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因的片段克隆進(jìn)任何如這里所述的和本領(lǐng)域已知的腺病毒載體中，構(gòu)建了腺病毒重組體。腺病毒重組體可以非入侵的模式作為免疫試劑用于轉(zhuǎn)導(dǎo)脊椎動(dòng)物的表皮細(xì)胞。
“無(wú)活力”腺病毒的使用對(duì)插入大片段異源DNA特別有利(見(jiàn)綜述，Yeh.和Perricaudet，F(xiàn)ASEB J.11615(1997))，此處引用作為參考。此外，無(wú)活力腺病毒載體及其制造和使用它們的方法在U.S.專利號(hào)6,156,497和6,228,646中有更詳細(xì)的描述，此處都專門引用作為參考。
除了需要腺病毒載體是復(fù)制缺陷型或至少條件缺陷型外，腺病毒的性質(zhì)對(duì)本發(fā)明的成功實(shí)施不是關(guān)鍵的。腺病毒可是已知的42種不同的血清型或亞群A-F中的一種。為了獲得用于本發(fā)明的條件復(fù)制缺陷型腺病毒載體，亞群C的腺病毒5型被作為優(yōu)選起始材料，這是由于腺病毒5型是人類腺病毒，其大量生化和遺傳信息已知，而且史上已用于使用腺病毒作為載體的大部分構(gòu)建方法中。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺陷型，并沒(méi)有腺病毒E1區(qū)。因而，最方便在除去E1-編碼序列的位置中引入編碼免疫調(diào)節(jié)分子和/或附加的目標(biāo)治療性蛋白的轉(zhuǎn)基因。然而，表達(dá)構(gòu)建物在腺病毒序列中的插入位置對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵的。目標(biāo)轉(zhuǎn)基因也可如Karlsson等(1986)所述插入，以代替E3置換載體的缺失的E3區(qū)中，或者插入由輔助細(xì)胞系或輔助病毒互補(bǔ)E4缺陷的E4區(qū)中。
腺病毒易于生長(zhǎng)和操作，在體外和體內(nèi)都有廣泛的宿主范圍。該組病毒可以高滴度獲得，如每毫升109-1011噬菌斑形成單位，而且它們是高感染性的。腺病毒的細(xì)胞周期不需要整合到宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒載體送遞的外源基因是游離型的，因此對(duì)宿主細(xì)胞的遺傳毒性低。在用野生型腺病毒接種疫苗的研究中沒(méi)有報(bào)道過(guò)副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，表明了它們的安全性和作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體的治療潛力。
腺病毒載體已被用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗研制(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，動(dòng)物研究表明重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。向不同組織給予重組腺病毒的研究包括氣管滴注(Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeld et al.，1992)，，肌肉注射(Ragot等.，1993)，外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)和腦內(nèi)趨實(shí)體(stereotactic)接種(Le Gal La Salle等，1993)。
因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，這里使用的表達(dá)載體是腺病毒載體。合適的腺病毒載體包括人腺病毒比如Ad2或Ad5的修飾，其中對(duì)病毒在體內(nèi)復(fù)制所需的遺傳元件已被除去；如E1區(qū)，和編碼插入到腺病毒基因組中的目標(biāo)外源基因的表達(dá)盒。
此外，如上所述，優(yōu)選的表達(dá)載體系統(tǒng)是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，比如PCT/US97/01019和PCT/US97/01048中所一般描述，它們此處都專門引用作為參考。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是單鏈RNA病毒組，其特征是在感染細(xì)胞內(nèi)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程將它們的RNA轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA的能力(Coffin，1990)。產(chǎn)生的DNA然后作為前病毒穩(wěn)定地整合進(jìn)細(xì)胞染色體中，指導(dǎo)病毒蛋白的合成。整合導(dǎo)致了病毒基因組序列在受體細(xì)胞及其子代中的維持。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有三個(gè)基因，gag，pol和env，分別編碼衣殼蛋白，聚合酶和包膜成分。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列含有將基因組包裝進(jìn)病毒體的信號(hào)。兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列位于病毒基因組的5′和3′末端。它們含有強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列并且對(duì)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因中也是需要的(Coffin，1990)。
為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸被插入病毒基因組中，取代某些病毒序列以生產(chǎn)復(fù)制缺陷型病毒。為了生產(chǎn)病毒體，構(gòu)建了含有g(shù)ag，pol和env基因但是沒(méi)有LTR和包裝組份的包裝細(xì)胞系(Mann等，1983)。當(dāng)含有cDNA的重組質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起共同引入這一細(xì)胞系時(shí)(例如通過(guò)磷酸鈣沉淀)，包裝序列允許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄子包裝進(jìn)病毒體中，其然后被分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染廣泛的細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞的分裂(Paskind等，1975)。
最近研制了一種設(shè)計(jì)來(lái)使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特異靶向的新方法，是基于通過(guò)化學(xué)添加乳糖殘基至病毒包膜而對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行化學(xué)修飾。這種修飾能夠允許通過(guò)唾液酸糖蛋白受體特異性感染肝細(xì)胞。
一種不同的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向的方法被設(shè)計(jì)，其中使用抗逆轉(zhuǎn)錄包膜蛋白和抗特異性細(xì)胞受體的生物素化的抗體。該抗體使用鏈霉親和素通過(guò)生物素組分偶聯(lián)(Roux等，1989)。使用抗主要組織相容性復(fù)合體I類和II類抗原的抗體，它們用嗜親性病毒在體外證明了攜帶那些表面抗原的多種人細(xì)胞的感染(Roux等，1989)。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括LNL6，LXSN和LNCX(見(jiàn)Byun等，Gene Ther.3(9)780-8(1996綜述)。
AAV(Ridgeway，1988；Hermonat和Muzycska，1984)是一種細(xì)小病毒，由于腺病毒原液的污染而被發(fā)現(xiàn)。它是一種與任何疾病無(wú)關(guān)普遍存在的病毒(85％的美國(guó)人群中存在它的抗體)。它也可歸為依賴病毒屬，因?yàn)樗膹?fù)制依賴輔助病毒的存在，比如腺病毒。已分離五種血清型，其中AAV-2的特征研究得最清楚。AAV具有單鏈線狀DNA，其被衣殼蛋白VP1，VP2和VP3包裹形成了直徑為20-24nm的二十面的病毒體(Muzyczka和McLaughlin，1988)。
AAV的DNA約為4.7kb長(zhǎng)。它含有兩個(gè)開放閱讀框架，側(cè)翼是兩個(gè)ITR。AAV基因組有兩個(gè)主要的基因rep和cap。rep基因編碼負(fù)責(zé)病毒復(fù)制的蛋白，而cap編碼衣殼蛋白VP1-3。每個(gè)ITR形成T形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些重復(fù)序列是AAV染色體整合唯一必要的cis組分。因此，AAV可作為載體，其除去了所有的病毒編碼序列且被基因送遞盒取代。已鑒定了三個(gè)病毒啟動(dòng)子，根據(jù)它們的作圖位置命名為p5，p19和p40。p5和p19的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致了rep蛋白的產(chǎn)生，p40的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致了衣殼蛋白的產(chǎn)生(Hermonat和Muzyczka，1984)。
AAV由于它的安全性，也是送遞載體的良好選擇。它存在一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的拯救(rescue)機(jī)制為了活動(dòng)化(mobilize)rAAV，不僅需要野生型腺病毒，而且也需要AAV基因。同樣，AAV是非致病性的，并不與任何疾病相關(guān)。除去了病毒編碼序列將針對(duì)病毒基因表達(dá)的免疫應(yīng)答減到最小，因此rAAV不會(huì)引起炎癥反應(yīng)。美國(guó)專利號(hào)6,531,456公開了其它的AAV相關(guān)內(nèi)容，此處專門引用作為參考。
其它病毒載體也可作為用于本發(fā)明向宿主細(xì)胞送遞免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)載體使用。可使用來(lái)源于病毒的載體，比如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Coupar等，1988)，慢病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒和皰疹病毒。它們?yōu)槎喾N哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供幾個(gè)有利的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
表達(dá)載體的送遞為了影響免疫調(diào)節(jié)分子(如CD8α-鏈)和/或附加治療性蛋白的表達(dá)，表達(dá)載體必須送遞到細(xì)胞內(nèi)。這種送遞可在體外完成，如用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)室程序，或在體內(nèi)或回體，如某些疾病狀態(tài)的治療中。如上所述，送遞的一個(gè)優(yōu)選機(jī)制是通過(guò)感染，其中核酸被包裹進(jìn)重組病毒顆粒中。
一旦表達(dá)載體已送遞到細(xì)胞中，編碼期望寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸會(huì)在不同的位置定位并且表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，編碼構(gòu)建體的核酸可穩(wěn)定地整合進(jìn)細(xì)胞的基因組中。這種整合可通過(guò)同源重組(基因取代)特異性定位和定向，或者整合入隨機(jī)、非特異性位置(基因增強(qiáng))。在進(jìn)一步和優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸可作為分離的，游離型DNA片段在細(xì)胞中穩(wěn)定地維持。這些核酸片段或“游離體”編碼足以允許不依賴或同步于宿主細(xì)胞周期的維持和復(fù)制的序列。如何將表達(dá)構(gòu)建體送遞給細(xì)胞以及核酸保留在細(xì)胞中的何處取決于使用表達(dá)載體的類型。
在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，表達(dá)載體可僅由裸露重組DNA或質(zhì)粒組成。載體的轉(zhuǎn)移可通過(guò)上述提到的任何物理或化學(xué)的滲透細(xì)胞膜的方法來(lái)完成。這特別適用于體外轉(zhuǎn)移，但是也可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)移。Dubensky等(1984)成功地將多瘤病毒DNA以磷酸鈣沉淀物的形式注射到成年和新生小鼠的肝臟和脾臟中，證明了活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Reshef(1986)也證明了腹膜內(nèi)直接注射磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒導(dǎo)致了感染性基因的表達(dá)?？梢韵胂缶幋a目標(biāo)基因的DNA也可在體內(nèi)以類似方式轉(zhuǎn)移和表達(dá)基因產(chǎn)物。
本發(fā)明中用于將裸露DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的另一實(shí)施方案可涉及質(zhì)粒轟擊。這一方法依賴于讓DNA包裹的微粒加速到高速度以使它們穿過(guò)細(xì)胞膜并且沒(méi)有被破壞地進(jìn)入細(xì)胞的能力(Klein等，1987)。已經(jīng)研制了一些用于加速小粒子的裝置。一個(gè)這樣的裝置依賴于高壓放電以產(chǎn)生電流，其隨后提供動(dòng)力(Yang等，1990)。使用的微粒通常由生物學(xué)惰性物質(zhì)比如鎢或金珠組成。
挑選的器官包括大鼠和小鼠的肝臟、皮膚和肌肉組織，其已用于體內(nèi)轟擊(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。這可能需要手術(shù)暴露組織或細(xì)胞，以消除基因槍和靶器官之間的任何障礙組織，即回體的處理。此外，編碼特定基因的DNA可通過(guò)這種方法送遞，也被本發(fā)明引用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移引入靶細(xì)胞中。在這方面，許多基于脂質(zhì)體的試劑是本領(lǐng)域公知的，可購(gòu)買獲得，可在將核酸分子引入靶細(xì)胞時(shí)常規(guī)使用。本發(fā)明的某些實(shí)施方案使用了陽(yáng)離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)移載體，比如Lipofectamine或Lipofectin(LifeTechnologies)，溶于陽(yáng)離子膽固醇衍生物(DC膽固醇)中的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)(Sioud等，J.Mol.Biol.242831-835(1991))，DOSPADOPE，DOTAP，DMRIE膽固醇，DDABDOPE等等。生產(chǎn)脂質(zhì)體包封的核酸是本領(lǐng)域公知的，典型的涉及脂質(zhì)和核酸以比例約為1∶1結(jié)合。
本發(fā)明的用途如上詳述，這里描述和實(shí)施的方法和組合物具有預(yù)防針對(duì)用于如基因治療程序中的表達(dá)載體的宿主免疫應(yīng)答的通用性。就是說(shuō)，大部分基因治療程序遇到的普遍問(wèn)題是針對(duì)載體相關(guān)抗原的宿主免疫應(yīng)答。然而，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在基因治療載體中引入編碼主題(subject)CD8多肽的核酸克服了這個(gè)問(wèn)題。就是說(shuō)，使用包含編碼目標(biāo)治療性分子以及CD8多肽的核酸序列的嵌合載體。結(jié)果是CD8多肽和載體相關(guān)抗原在細(xì)胞表面上共同表達(dá)，從而有效和特異地抑制了針對(duì)載體相關(guān)抗原，比如腺病毒載體中病毒外殼蛋白的宿主免疫應(yīng)答。就是說(shuō)，當(dāng)病毒蛋白和CD8在同一細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，CD8使感染的細(xì)胞抑制了宿主免疫應(yīng)答，從而延長(zhǎng)了使用基因治療載體治療的時(shí)間。
沒(méi)有被理論所束縛，我們認(rèn)為CD8在靶細(xì)胞上的表達(dá)賦予了靶細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的“否決效應(yīng)”的能力。就是說(shuō)，如上所述，當(dāng)表達(dá)CD8的細(xì)胞和宿主T細(xì)胞接觸時(shí)，T細(xì)胞被下調(diào)或者殺死。因此，“否決效應(yīng)”或“傳統(tǒng)否決”是指靶細(xì)胞下調(diào)針對(duì)靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的能力。我們認(rèn)為CD8分子對(duì)否決效應(yīng)的誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)移是必要的?！胺駴Q效應(yīng)的轉(zhuǎn)移”是指否決效應(yīng)向正常不會(huì)誘導(dǎo)否決效應(yīng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。就是說(shuō)，通過(guò)CD8誘導(dǎo)的或增加的表達(dá)賦予了靶細(xì)胞減少或降低調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞應(yīng)答的能力。
因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了通過(guò)誘導(dǎo)否決效應(yīng)減少針對(duì)基因治療送遞載體和/或靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的用途。這導(dǎo)致了那些識(shí)別靶細(xì)胞的T細(xì)胞的下調(diào)和缺失(deletion)。同樣地，這導(dǎo)致了體液免疫應(yīng)答的減少。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可用于體外。這樣的載體在病毒清除和維持的研究中以及評(píng)價(jià)規(guī)避免疫應(yīng)答手段的效率的方法中可作為研究工具。類似地，表達(dá)載體，優(yōu)選重組表達(dá)載體，特別是病毒或腺病毒載體，其包含轉(zhuǎn)基因和至少一個(gè)編碼免疫調(diào)節(jié)分子的基因，可在體內(nèi)使用。
體內(nèi)傳送包括，但是不限于向器官內(nèi)直接注射，經(jīng)導(dǎo)管或經(jīng)其它灌注手段。核酸可用在接近靶器官的位置血管給藥或系統(tǒng)給藥。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)知道每種送遞模式的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，直接注射會(huì)產(chǎn)生最大滴度的核酸，但是核酸在靶中的分布可能是不均勻的。在接近靶點(diǎn)處導(dǎo)入核酸通常會(huì)導(dǎo)致與器官的細(xì)胞有更多的接觸，但是系統(tǒng)給藥通常更簡(jiǎn)單些。
特別地，表達(dá)載體，比如本發(fā)明的重組腺病毒載體，通過(guò)向細(xì)胞送遞正確的DNA，比如編碼功能缺少或損害的DNA，可用于治療許多疾病中任何一種?？芍委煹募膊“?，例如癌癥，如黑色素瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤，囊性纖維化，遺傳紊亂和病原感染，包括HIV感染。
共同未決的U.S.專利申請(qǐng)?zhí)朜o.XX中描述了特異性抑制同種免疫和自體免疫應(yīng)答的主題組合物和方法的用途，它的內(nèi)容在此全文應(yīng)用作為參考。本發(fā)明方法和組合物的其它應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
組合物和表達(dá)載體給藥的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道許多合適的給動(dòng)物施用本發(fā)明的表達(dá)載體(特別是腺病毒載體)和抑制免疫應(yīng)答的手段的方法(見(jiàn)例如Rosenfeld等，Science，252，431-434(1991)；Jaffe等，Clin.Res.，39(2)，302A(1991)；Rosenfeld等，Clin.Res.，39(2)，311A(1991)；Berkner，BioTechniques，6，616-629(1988))是可得的，而且雖然給藥可使用多于一種路線，但是某一路線可能比另一種路線提供更直接和更有效的反應(yīng)。用于施用表達(dá)載體和/或抑制免疫應(yīng)答的手段的藥學(xué)可接受的賦形劑也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且容易獲得。賦形劑的選擇部分取決于施用表達(dá)載體所使用的特定方法和抑制免疫應(yīng)答的手段。因此，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含在合適載體中僅編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白(如CD8α-鏈)或還結(jié)合了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體，用于本發(fā)明的合適制劑有很多種。特別地，本發(fā)明提供了包含含有編碼CD8α-鏈(或其功能性片段)的基因的表達(dá)載體及其載體的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體還包括編碼目標(biāo)治療性分子或蛋白的轉(zhuǎn)基因。這樣的組合物還可包括其它活性成分，比如治療或預(yù)防劑和/或免疫抑制劑是本領(lǐng)域公知的。下面的方法和賦形劑只是例證，而無(wú)意限制。
適合口服給藥的制劑可由下列組成(a)液體溶液，比如溶解在如水，鹽或橘子汁的溶劑中的有效劑量的化合物；(b)膠囊，袋劑或片劑，每個(gè)含有預(yù)定量的活性成份，如固相的或顆粒的；(c)合適液體中的懸浮液；和(d)合適的乳劑。片劑形式可包括一種或多種乳糖，甘露醇，玉米淀粉，土豆淀粉，微晶纖維素，阿拉伯樹膠，明膠，膠狀二氧化硅，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，滑石，硬脂酸鎂，硬脂酸和其他賦形劑，著色劑，稀釋劑，緩沖劑，濕潤(rùn)劑，防腐劑，調(diào)味劑以及藥學(xué)上相容的賦形劑。錠劑形式可在調(diào)味劑，通常是蔗糖和阿拉伯膠或西黃芪樹膠中包含活性成份，以及在惰性基質(zhì)，比如明膠和甘油，乳劑，凝膠中包含活性成分的軟錠劑，和除了含有活性成分之外還含有本領(lǐng)域公知的賦形劑。
氣霧劑制劑可用于吸入給藥。這些氣霧劑制劑可置于加壓的可接受的推進(jìn)劑中，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮?dú)獾?。它們也可制成用于無(wú)壓力制劑的藥物，如在霧化器或噴霧器中。
適于腸胃外給藥的制劑包括含水的和不含水的、等滲無(wú)菌注射溶液，其可含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和給制劑提供與針對(duì)的受體血液等壓的溶質(zhì)，以及含水的和不含水的無(wú)菌懸液，其可包含懸浮劑，增溶劑，增厚劑，穩(wěn)定劑和防腐劑。制劑可裝在單劑量或多劑量的密封容器中，如安瓿和小瓶，也可在凍干(冷凍干燥)條件下貯存，使用前只需要加入無(wú)菌的液體賦形劑，例如水就可馬上用于注射。臨時(shí)注射液和懸液可由先前所述種類的無(wú)菌粉末，顆粒和片劑制備。此外，栓劑可用多種基質(zhì)，比如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)制備。適于陰道給藥的制劑可以是含有除了活性成分之外還有本領(lǐng)域認(rèn)為適宜的載體的陰道栓，棉塞，霜?jiǎng)z劑，糊劑，泡劑或噴霧劑。
本發(fā)明中給予動(dòng)物，特別是人的劑量隨著目的治療性轉(zhuǎn)基因，載體來(lái)源和/或免疫調(diào)節(jié)分子的性質(zhì)，使用的組合物，給藥的方法和特定的位點(diǎn)以及治療的生物而有所不同。然而，優(yōu)選使用相應(yīng)于載體(如根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體)的有效劑量。“有效劑量”是指足以在宿主中產(chǎn)生期望效應(yīng)的劑量，其可使用本領(lǐng)域公知的幾個(gè)終點(diǎn)來(lái)監(jiān)測(cè)。例如，一種期望效應(yīng)是核酸向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移可通過(guò)多種手段，包括但不限于，治療效應(yīng)(如一些與疾病，病癥，紊亂或治療的綜合癥相關(guān)的癥狀的緩和)，或通過(guò)證明轉(zhuǎn)移的基因或編碼序列或其在宿主內(nèi)的表達(dá)(如使用多聚酶鏈反應(yīng)，Northern或Southern雜交或轉(zhuǎn)錄分析或以檢測(cè)宿主細(xì)胞內(nèi)核酸，或使用免疫印跡分析，抗體介導(dǎo)的檢測(cè)，或檢測(cè)轉(zhuǎn)移核酸編碼的蛋白或多肽或由轉(zhuǎn)移引起的水平或功能上的影響的詳細(xì)分析)來(lái)監(jiān)測(cè)。所述的方法不是囊括一切的方法，其它適于特殊應(yīng)用的方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)當(dāng)指出宿主對(duì)引入載體，如病毒載體，特別是腺病毒載體和編碼抑制免疫應(yīng)答的手段的載體的反應(yīng)可依賴于施用病毒的劑量，送遞的位點(diǎn)以及載體與轉(zhuǎn)基因和抑制免疫應(yīng)答的手段的遺傳組成而變化。
一般而言，為了確保本發(fā)明載體的有效轉(zhuǎn)移，優(yōu)選每個(gè)細(xì)胞接觸約1-5000拷貝的本發(fā)明載體，基于根據(jù)給藥途徑確定待接觸的細(xì)胞大致數(shù)量，更優(yōu)選約3-300pfu進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞。然而，這只是一個(gè)總的指導(dǎo)方針，并不排除根據(jù)特殊應(yīng)用，在體外或體內(nèi)使用更高或更低的劑量。同樣地，抑制免疫應(yīng)答的手段的劑量，如果是以包含蛋白的組合物形式，應(yīng)該足以抑制包含轉(zhuǎn)基因的重組載體引起的免疫應(yīng)答。例如，實(shí)際劑量和時(shí)間安排可依賴于組合物的服用是否結(jié)合其它藥物組合物，或依藥學(xué)動(dòng)力，藥物傾向和代謝的個(gè)體差異而變化。同樣地，體外應(yīng)用的劑量可依賴于靶向細(xì)胞的特殊類型或載體轉(zhuǎn)移的手段而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)特定情況的需要，容易做任何必要的調(diào)整。
雖然參考優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了描述，但是在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道形式和細(xì)節(jié)上的變化。這里提到的每個(gè)專利，出版物和其它參考文獻(xiàn)都全文專門引用作為參考。
實(shí)施例1否決效應(yīng)——用載體進(jìn)行的研究a)用質(zhì)粒表達(dá)載體人工改造成纖維細(xì)胞以作為否決細(xì)胞成纖維細(xì)胞經(jīng)人工改造在其表面表達(dá)人或小鼠CD8鏈。用pCMVhCD8質(zhì)?；騪CMVmCD8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，在質(zhì)粒中CD8α-鏈的表達(dá)受CMV立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(Invitrogen)的驅(qū)動(dòng)。當(dāng)CD8-鏈轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞(H-2b)被加到混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(BALB/c；H-2d抗-C57BL/6；H-2b)中后，僅表達(dá)CD8-鏈的細(xì)胞系抑制CTL應(yīng)答。如圖3A和B所示，表達(dá)小鼠或人CD8-鏈的MC57T成纖維細(xì)胞的加入完全抑制了CTL的誘導(dǎo)。相反，非轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的加入不會(huì)影響T-淋巴細(xì)胞的激活。除了確定了CD8α-鏈的抑制功能外，這些實(shí)驗(yàn)也證明了小鼠T-淋巴細(xì)胞能夠被人CD8α-鏈否決。因此，小鼠模型對(duì)檢測(cè)設(shè)計(jì)用于臨床用途的否決是有用的。
人工改造的否決細(xì)胞在體內(nèi)的功能實(shí)驗(yàn)中確定了人工改造的否決是否在動(dòng)物體內(nèi)起作用。被轉(zhuǎn)染以表達(dá)CD8α-鏈的C57BL/6(H-2b)-來(lái)源的成纖維細(xì)胞被注射到Balb/c(H-2d)小鼠中。對(duì)照動(dòng)物用非轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞注射。8-40天后收集脾臟細(xì)胞，并引入MLC培養(yǎng)物中C57BL/6(H-2b)脾細(xì)胞作為刺激物細(xì)胞。5天后，收集培養(yǎng)基，檢測(cè)它們裂解EL4(C57BL/6，H-2b)靶細(xì)胞的能力。在注射了表達(dá)CD8-鏈的成纖維細(xì)胞的動(dòng)物體內(nèi)，抗-H-2bCTL應(yīng)答的誘導(dǎo)完全被抑制了(圖4)。抗-H-2bT細(xì)胞的抑制是高度特異性的。來(lái)自這些小鼠的T細(xì)胞對(duì)第三類H-2k異種-MHC(allo-MHC)分子仍產(chǎn)生應(yīng)答。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，與傳統(tǒng)否決細(xì)胞類似，人工改造的否決細(xì)胞在體內(nèi)特異性抑制免疫應(yīng)答，以及非經(jīng)典否決細(xì)胞能夠被人工改造成否決細(xì)胞。換句話說(shuō)，人工改造的細(xì)胞使動(dòng)物對(duì)這些細(xì)胞攜帶的抗原負(fù)免疫(negatively immunize)。
檢測(cè)了CD8-鏈的表達(dá)是否干擾完全活化的T細(xì)胞的功能。為了此目的，用完全活化的CTL檢測(cè)表達(dá)CD8α-鏈的靶細(xì)胞對(duì)裂解的易感性。為此研究，選擇了兩種不同的T細(xì)胞群MLC中激活的同種異體反應(yīng)性CTL，和活化的肽特異性CTL。如圖5所示，表達(dá)CD8α-鏈的靶細(xì)胞被同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞群體有效地裂解，但是不能被抗原特異性T細(xì)胞裂解。這些結(jié)果表明人工改造的否決甚至能夠干預(yù)正在進(jìn)行的抗原特異性免疫應(yīng)答，比如自身免疫應(yīng)答中的那些。
b)用病毒轉(zhuǎn)移載體人工改造成纖維細(xì)胞作為否決細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)移載體m-CD8的否決功能研制了攜帶鼠CD8α-鏈的復(fù)制缺陷型載體腺病毒轉(zhuǎn)移載體(mAdCD8α)。用mAdCDB否決轉(zhuǎn)移載體感染的小鼠成纖維細(xì)胞(MC57)在第二天高水平地表達(dá)小鼠CD8α-鏈。在這些快速增殖的細(xì)胞內(nèi)，小鼠CD8α-鏈的表達(dá)到第5天時(shí)顯著減少。mAdCD8也感染其它小鼠細(xì)胞系，比如EL4，雖然效率低些(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
在后面的實(shí)驗(yàn)中，mAdCD8α-感染的MC57成纖維細(xì)胞(H-2b)被加到Balb/C(H-2d)抗-C57B1/6(H-2b)MLC中。5天后，收獲培養(yǎng)物，檢測(cè)抗-H-2bCTL的存在。加入了感染的成纖維細(xì)胞的MLC中，不再含有抗-H-2bCTL(圖12)。這些實(shí)驗(yàn)確定了否決轉(zhuǎn)移載體介導(dǎo)免疫抑制的能力。
此外，生成了人CD8-型的腺病毒載體。還生成了表達(dá)小鼠CD8α-鏈的腺病毒伴隨病毒。證實(shí)了這些病毒誘導(dǎo)各CD8鏈的表達(dá)。表達(dá)小鼠或人CD8α-鏈的腺病毒否決載體介導(dǎo)了殺傷T細(xì)胞的誘導(dǎo)的完全抑制(見(jiàn)圖7)。
用mAdCD8否決轉(zhuǎn)移載體負(fù)免疫設(shè)計(jì)了兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)以確定mAdCD8是否在體內(nèi)抑制免疫應(yīng)答。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用等同劑量的mAdCD8否決轉(zhuǎn)移載體或者相似的編碼小鼠CD8α-鏈以代替β-半乳糖苷酶的腺病毒對(duì)照載體(Adβgal)感染C57B1/6小鼠。免疫七天后，殺死動(dòng)物。它們脾細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞懸液在Adβgal病毒存在的情況下培養(yǎng)五天。然后收集培養(yǎng)物，評(píng)估它們的增殖能力。如圖7所示，從Adβgal免疫的小鼠收集的T細(xì)胞在有Adβgal時(shí)大量增殖，證明了高增殖性CD4+細(xì)胞的存在。相反，從mAdCD8-注射的動(dòng)物收集的T細(xì)胞沒(méi)有得到擴(kuò)增。
在第二個(gè)步驟中，我們測(cè)試這些培養(yǎng)物中是否含有功能性CD8+CTL以檢測(cè)它們裂解Adβgal-感染的靶細(xì)胞(EL4，H-2b)的能力。僅在建立自注射了Adβgal的小鼠的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了CTL(圖8)。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明AdCD8α不誘導(dǎo)針對(duì)腺病毒抗原的應(yīng)答可能是因?yàn)镃D8α-鏈的表達(dá)。然而，AdCD8α不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答也可能是由于其它原因。AdCD8以某些未確定的方式是無(wú)功能的，或者小鼠可能只能與沒(méi)有在mAdCD8中發(fā)現(xiàn)的β-半乳糖苷酶反應(yīng)。
為了測(cè)試不同結(jié)論的正確性，C57Bl/6小鼠用mAdCD8或Adβgal注射一次后，7天后用Adβgal作第二次灌注。七天后殺死小鼠，建立Adβgal存在的情況下培養(yǎng)五天的脾細(xì)胞培養(yǎng)物。檢測(cè)應(yīng)答T細(xì)胞裂解Adβgal-感染的靶細(xì)胞的能力(圖8)。確實(shí)，兩次暴露于Adβgal中導(dǎo)致了免疫應(yīng)答的提高。這些研究也表明了在注射AdCD8后，小鼠不再對(duì)Adβgal應(yīng)答，并且Adβgal主要、雖然并非專門誘導(dǎo)針對(duì)兩種載體中均具有的腺病毒蛋白的CTL應(yīng)答。這組實(shí)驗(yàn)有力地暗示了生產(chǎn)能負(fù)免疫(negafively immunize)針對(duì)載體所攜帶基因的應(yīng)答的基因治療病毒載體是可能的。
通過(guò)否決抑制CD4+T淋巴細(xì)胞為了檢測(cè)否決轉(zhuǎn)移載體能否用于抑制誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞，建立了下面的實(shí)驗(yàn)體系。轉(zhuǎn)化C57B1/6-來(lái)源的成纖維細(xì)胞刺激物以表達(dá)同種異體MHCII類分子(H-2Ek)和免疫刺激性CD80。用mAdCD8或者Adβgal轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些非照射以保存它們?nèi)看碳つ芰Φ穆僭鲋吵衫w維細(xì)胞，然后加到未選擇的C57B1/6脾細(xì)胞中。4天后，收集培養(yǎng)物，用表面免疫熒光分析活化的即blasting，CD4+T淋巴細(xì)胞存在(圖9)。我們發(fā)現(xiàn)與正?；駻dβgal-轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激物細(xì)胞一起培養(yǎng)的未選擇的C57B1/6脾細(xì)胞中有大量的CD4+T淋巴母細(xì)胞。相反，加入mAdCD8-感染的刺激物的培養(yǎng)物中，只檢測(cè)到少量的CD4+T淋巴母細(xì)胞。這些研究證實(shí)了否決抑制了CD4+T淋巴細(xì)胞，而且此外病毒否決轉(zhuǎn)移載體可用于此目的。
用不同病毒構(gòu)建體感染后小鼠和人CD8α-鏈的表面表達(dá)染色程序mAdCD8在改良的IMDM中mAdCD8以約104的感染復(fù)數(shù)模擬感染或感染MC57T 3天。收獲感染的細(xì)胞，用FITC直接標(biāo)記的抗小鼠CD8α-鏈抗體(Pharmingen)用于CD8α-鏈的表面表達(dá)的染色。表面熒光的強(qiáng)度在熒光激活細(xì)胞分析儀(FACScan，Beckton-Dickinson)上測(cè)量(圖10)。
從Balb/c小鼠股骨腔中收獲骨髓細(xì)胞。在改良的IMDM中用表達(dá)β-半乳糖苷酶的腺病毒對(duì)照載體(AdLacZ)或mAdCD8以104的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞3天。收獲感染的細(xì)胞，用FITC直接標(biāo)記的抗小鼠CD8α-鏈抗體用于CD8α-鏈的表面表達(dá)的染色。測(cè)量表面熒光的強(qiáng)度(圖10C)。此外，確定了幾種細(xì)胞類型，包括CD34+骨髓細(xì)胞，即干細(xì)胞庫(kù)內(nèi)的細(xì)胞被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)(表2)。

hAdCD8模擬感染MC57T。hAdCD8的病毒滴度是未知的。用100μl病毒原液感染3×105個(gè)細(xì)胞3天。收獲感染的細(xì)胞，用FITC直接標(biāo)記的抗人CD8α-鏈抗體(Pharmingen)用于CD8α-鏈的表面表達(dá)的染色。表面熒光的強(qiáng)度在熒光激活細(xì)胞分析儀上測(cè)量(FACScan，Beckton-Dickinson)(圖10)。
基于AAV的否決載體使用Strategene/Avigen體系平行生產(chǎn)基于AAV-否決載體。在這些構(gòu)建體中，人和小鼠的CD8α-鏈?zhǔn)芟嗤腃MV中間(intermediate)早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的驅(qū)動(dòng)。兩種病毒，mAAVCD8和hAAVCD8在HEK 293包裝細(xì)胞系中包裝。使用的體系不需要輔助病毒。mAAVCD8和hAAVCD8有效感染小鼠成纖維細(xì)胞(MC57T)，分別驅(qū)動(dòng)小鼠或人CD8α-鏈的高水平表達(dá)。熒光的強(qiáng)度在熒光激活細(xì)胞分析儀上測(cè)量(圖10D)。有趣的是在轉(zhuǎn)導(dǎo)后36小時(shí)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了CD8α-鏈的高水平表達(dá)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與其他人的觀測(cè)結(jié)果形成了對(duì)比。他們發(fā)現(xiàn)AAV-驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)需要幾天時(shí)間才達(dá)到顯著水平(PHSchmelck，PrimeBiotech)。用AAV否決載體進(jìn)行的其它研究再次說(shuō)明了我們先前的發(fā)現(xiàn)，即它們可用于抑制免疫應(yīng)答。這里使用了標(biāo)準(zhǔn)的MCL程序(圖6)。
實(shí)施例2體外抑制研究—混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物收集來(lái)自Balb/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠的脾細(xì)胞。制備單細(xì)胞懸液。C57BL/6脾細(xì)胞用3,000拉德(Mark1銫輻射器)照射。每孔4×106Balb/c脾細(xì)胞(應(yīng)答子/效應(yīng)子細(xì)胞)與每孔4×106經(jīng)照射的C57BL/6脾細(xì)胞(刺激子細(xì)胞)在24孔平板(TPP，Midwest Scientific，Inc.)中共培養(yǎng)，其含有含10％胎牛血清(FCS)(Sigma)，HEPES，青霉素G，硫酸鏈霉素，硫酸慶大霉素，L-谷氨酰胺，2-巰基乙醇，非必需氨基酸(Sigma)，丙酮酸鈉和碳酸氫鈉的IMDM(Sigma)(改良的IMDM)。在CO2孵育箱(Forma Scientific)培養(yǎng)5天后，完整收獲培養(yǎng)物，檢測(cè)裂解C57BL/6-來(lái)源的靶細(xì)胞(H-2b)的能力。
在這些培養(yǎng)基中的一些中，加入4×105個(gè)已用12,000拉德照射的MC57T成纖維細(xì)胞(H-2d)。在抑制培養(yǎng)物中，包含4×105個(gè)已用mAdCD8以約104的感染復(fù)數(shù)感染1-2天的MC57T細(xì)胞。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷分析計(jì)算從混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中收集的細(xì)胞用于胚細(xì)胞數(shù)，作為活化的T淋巴細(xì)胞的指示。這些效應(yīng)子細(xì)胞加到U形-底的96孔平板的單孔中。每孔效應(yīng)子數(shù)目用3倍滴定步驟測(cè)得，從每孔3×106or 1×105個(gè)效應(yīng)子細(xì)胞開始。每孔1×104個(gè)EL4(H-2b)，MC57T(H-2b)或P815(H-2d)靶細(xì)胞被加到這些效應(yīng)子細(xì)胞中。靶細(xì)胞先前已用51Cr(Na-Chromate，Perkin-Elmer)標(biāo)記。1×106個(gè)靶細(xì)胞與100μCi在約為500μl體積的改良IMDM中孵育90分鐘。然后，用改良IMDM多次清洗以除去未結(jié)合的51Cr。
效應(yīng)子細(xì)胞和靶細(xì)胞以總體積200μl在CO2孵育箱孵育4小時(shí)。然后，平板用離心機(jī)(Centra CJ35R，International Equipment Company)以1,500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘。從每孔除去100ml培養(yǎng)基，靶細(xì)胞釋放的51Cr量用Model4000γ計(jì)數(shù)器(Beckman Instruments)計(jì)算。設(shè)立對(duì)照培養(yǎng)基，其中不加入效應(yīng)子細(xì)胞以確定背景釋放值。測(cè)定孔中結(jié)合入靶細(xì)胞的總51Cr，其中用1％(w/v)Triton×100溶液(Sigma)替代效應(yīng)子細(xì)胞。
特異性裂解量測(cè)定為in％＝(特異性釋放值-背景釋放值)/(總釋放值-背景釋放值)×100mAdCD8的體外活性建立混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(Balb/c抗-C57BL/6)。向這些培養(yǎng)物中加入已用12,000拉德照射和用mAdCD8感染的MC57T成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)5天后，收獲培養(yǎng)物，以不同效應(yīng)子/靶細(xì)胞(E/T)比率測(cè)試它們裂解EL4(H-2b)靶細(xì)胞的能力(見(jiàn)圖4)。
正如所見(jiàn)到的，即使在混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中，表達(dá)CD8的細(xì)胞抑制了裂解性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)。
mAdCD8和hAdCD8的生產(chǎn)借助Biogene的AdEasyTM系統(tǒng)生產(chǎn)兩種腺病毒載體。這里小鼠和人CD8α-鏈cDNA摻入轉(zhuǎn)移載體(步驟1)。在BJ5183EC細(xì)菌中完成用Ad5ΔE1/ΔE3載體重組(步驟2)。然后重組載體轉(zhuǎn)移到含有可互補(bǔ)重組腺病毒缺失的這一必需區(qū)域的E1A和E1B腺病毒5病毒基因的QBI-HEK 293A細(xì)胞中。因此在這些細(xì)胞中生產(chǎn)的hAdCD8和mAdCD8是復(fù)制缺陷型的。
作為表達(dá)細(xì)菌LacZ基因(β-半乳糖苷酶)的對(duì)照載體，Qbiogene提供了QBI-Infect+病毒粒子(Ad5.CMVLacZΔE1/ΔE3)。使用小鼠的CD8α-鏈序列。
該序列與發(fā)表的小鼠序列類似蛋白序列真實(shí)序列MASPLTRFLSLNLLLMGESIILGSGEAKPQAPELRIFPKKMDAELGQKVDLVCEVLGSVSQGCSWLFQNSSSKLPQPTFVVYMASSHNKITWDEKLNSSKLFSAVRDTNNKYVLTLNKFSKENEGYYFCSVISNSVMYFSSVVPVLQKVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLD FACDIYIWAPLAGICVAPLL SLIITLICYH RSRKRVCKCPRPLVRQEGKP RPSEKIV所使用的人的CD8α-鏈序列。該序列如所示與發(fā)表的人序列相比有一個(gè)沉默突變真實(shí)序列MALPVTALLL PLALLLHAAR PSQFRVSPLDRTWNLGWTVELKCQVLLSNP TSGCSWLFQP RGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFS GKRLGDTFVL TLSDFRRENEGYYFCSALSN SIMYFSHFVPVFLPAKPTTT PAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGG AGNRRRVCKCPRPVVKSGDK PSLARYVpAAV-mCD8和pAAV-hCD8的生產(chǎn)借助Stratagene的AAV Helper-Free系統(tǒng)生產(chǎn)這些載體。該系統(tǒng)是通過(guò)將小鼠和人的序列插進(jìn)pAAV-MCS克隆載體中而工作的。然后該質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒(含有必要的腺病毒蛋白)和pAAV-RC載體(含有衣殼基因)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞以生產(chǎn)重組AAV粒子。
實(shí)施例3動(dòng)物模型中的人工改造的否決我們研究了動(dòng)物如何應(yīng)答大劑量的mAdCD8注射。在第一組實(shí)驗(yàn)中，用等同劑量的mAdCD8或者編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒對(duì)照載體(AdLacZ)靜脈內(nèi)注射Balb/c小鼠(每組兩只小鼠)。七天后，殺死動(dòng)物。它們的脾細(xì)胞在AdLacZ存在的情況下培養(yǎng)五天。然后測(cè)試它們裂解AdLacZ-感染的靶細(xì)胞(P815，Balb/c-來(lái)源的)能力。如圖13所示，具有特異性裂解能力的CTL可以用AdLacZ免疫的Balb/c小鼠中增殖，但是在接受mAdCD8的小鼠中沒(méi)有增殖。這個(gè)結(jié)果表明由于CD8α-鏈的表達(dá)，AdCD8α不誘導(dǎo)針對(duì)腺病毒抗原的免疫應(yīng)答。
在第二個(gè)步驟中，C57B1/6小鼠用等同劑量的mAdCD8(2只小鼠)或AdLacZ(2只小鼠)免疫。免疫七天后，每組殺死一只動(dòng)物。它們的脾細(xì)胞在AdLacZ存在下在細(xì)胞懸液中培養(yǎng)五天。然后檢測(cè)它們特異性裂解AdLacZ-感染的靶細(xì)胞(EL-4，C57B1/6-來(lái)源的)能力。再一次地，雖然注射AdLacZ以低頻率誘導(dǎo)了特異性殺傷細(xì)胞的發(fā)生，但是mAdCD8卻沒(méi)有做到這一點(diǎn)(圖14)。
在這一實(shí)驗(yàn)的第二個(gè)階段，已接受mAdCD8或AdLacZ的剩余C57BL/6小鼠在它們第一次注射病毒7天后，接受第二次劑量的AdLacZ。七天后，殺死小鼠，在AdLacZ存在下建立培養(yǎng)五天的脾細(xì)胞培養(yǎng)物。再次檢測(cè)應(yīng)答T細(xì)胞裂解AdLacZ-感染的EL4-靶細(xì)胞的能力(圖8)。確實(shí)，兩次暴露于AdLacZ中導(dǎo)致了免疫應(yīng)答有所提高。然而，先前接受了mAdCD8的小鼠仍舊沒(méi)有應(yīng)答。這些實(shí)驗(yàn)表明AdCD8不僅沒(méi)有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，反而防止了針對(duì)它的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。因而，mAdCD8規(guī)避了免疫系統(tǒng)。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，包含a)編碼CD8α-鏈的第一核酸，所述第一核酸可操作地連接至編碼跨膜多肽的核酸；和b)包含目標(biāo)治療性基因的第二核酸；和c)至少第一轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件，所述元件用于指導(dǎo)所述第一和第二核酸的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述編碼CD8α-鏈的核酸與如圖1所列編碼人CD8α-鏈的核酸(SEQ ID NO)有大于80％的序列同一性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述編碼CD8α-鏈的核酸與如圖1所列編碼小鼠、大鼠或豬的CD8α-鏈的核酸(SEQ ID NOS)有大于80％的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的多核苷酸，其中所述編碼CD8α-鏈的核酸包括如圖1所列的小鼠、大鼠或豬的CD8α-鏈(SEQ ID NOS)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述CD8α-鏈包括選自圖1 SEQID NO所示序列的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述CD8α-鏈缺少野生型CD8α-鏈的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述目標(biāo)治療性基因選自血紅蛋白-β，GATA-結(jié)合蛋白，δ-氨基乙酰丙酸合酶，葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶，凝血因子VIII，凝血因子X(jué)I，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)控子，鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶，α-L-艾杜糖醛酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，β-葡萄糖苷酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶，酸性α-葡萄糖苷酶，hexamidase A，苯丙氨酸羥化酶，IV型膠原，α5，布盧姆氏綜合癥基因產(chǎn)物或低密度脂蛋白受體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述載體選自重組腺病毒，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，重組腺伴隨病毒或重組皰疹病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的多核苷酸，其中所述載體是復(fù)制缺陷型。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，4，5，6或7任一項(xiàng)的多核苷酸的組合物，還進(jìn)一步包括脂質(zhì)體。
12.降低針對(duì)來(lái)自基因治療送遞體系的抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括a)使細(xì)胞和所述基因治療送遞體系接觸，其中所述基因治療送遞體系包括i)編碼CD8α-鏈的第一核酸，所述第一核酸與編碼跨膜多肽的核酸可操作地連接；和ii)包含目標(biāo)治療性基因的第二核酸；和iii)用于指導(dǎo)所述第一和第二核酸表達(dá)的至少第一轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件，從而表達(dá)所述第一和第二核酸，所表達(dá)的CD8α-鏈與所述細(xì)胞的細(xì)胞膜相結(jié)合，并且針對(duì)所述細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答與針對(duì)沒(méi)有CD8α-鏈編碼核酸的細(xì)胞的免疫應(yīng)答相比降低。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述基因治療送遞體系選自病毒表達(dá)載體，質(zhì)?；蚵懵兜暮怂岜磉_(dá)載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述病毒表達(dá)載體選自重組腺病毒，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，重組腺伴隨病毒或重組皰疹病毒。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述目標(biāo)治療性基因選自血紅蛋白-β，GATA-結(jié)合蛋白，δ-氨基乙酰丙酸合酶，葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶，凝血因子VIII，凝血因子X(jué)I，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)控子，鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶，α-L-艾杜糖醛酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，β-葡萄糖苷酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷神經(jīng)酰胺酶，酸性α-葡萄糖苷酶，hexamidase A，苯丙氨酸羥化酶，IV型膠原，α5，布盧姆氏綜合癥基因產(chǎn)物或低密度脂蛋白受體。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述編碼CD8α-鏈的核酸包括如圖11所列的序列(SEQ ID NO)。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述編碼CD8α-鏈的核酸編碼具有如圖10所列序列(SEQ ID NO)的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供用于特異性抑制針對(duì)表達(dá)載體以及用該載體轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞的寄主免疫應(yīng)答的組合物和方法。特別描述了特異性抑制針對(duì)基于使用CD8α－鏈的載體相關(guān)抗原和靶細(xì)胞相關(guān)抗原的寄主免疫應(yīng)答的體液和細(xì)胞成分的方法。
文檔編號(hào)C12N15/67GK1791679SQ200480013970
公開日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月19日
發(fā)明者齊巖, 張祥華, 葆拉·J·科尼格斯伯格 申請(qǐng)人:伊索格尼斯股份有限公司