專利名稱：ErbB表面受體復(fù)合物作為生物標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及生物標(biāo)記，具體來說，涉及使用ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物，如二聚體或者寡聚體來作為生物標(biāo)記。
背景技術(shù)：
生物標(biāo)記是一種能夠客觀地測量并計(jì)算的特征物，作為正常的生物學(xué)過程、致病過程、或者針對治療介入手段的藥理學(xué)反應(yīng)的指示物，Atkinson等，Clin.Pharmacol.Ther.，6989-95(2001)。生物標(biāo)記在性質(zhì)、測量難易程度、以及與目標(biāo)物生理狀態(tài)的關(guān)系上有很大的不同，例如Frank等，Nature ReviewsDrug Discovery，2566-580(2003)。人們普遍相信，開發(fā)新型有效的生物標(biāo)記既可以顯著減少保健和藥物開發(fā)的成本，又可以大大改善對多種疾病和身體狀況的治療。為此，人們作了大量的努力，旨在利用新技術(shù)來發(fā)現(xiàn)新類型的生物標(biāo)記，例如，Petricoin等，Nature Reviews號Drug Discovery，1683-695(2002)；Sidransky，Nature Reviews Cancer，2210-219(2002)。
細(xì)胞表面膜成分的相互作用在正常生理學(xué)狀態(tài)和疾病狀態(tài)中對于將胞外信號傳送給細(xì)胞起著重要的作用。特別是，許多類型的細(xì)胞表面受體經(jīng)過了二聚化、寡聚化、或簇集作用，這些作用與胞外活動或信號，如配體-受體結(jié)合的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)聯(lián)，形成細(xì)胞的反應(yīng)，例如增殖、增加或減少基因的表達(dá)等等，如George等，Nature Reviews Drug Discovery，1808-820(2002)；Mellado等，Ann.Rev.Immunol.，19397-421(2001)；Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；Yarden，Eur.J.Cancer，37S3-S8(2001)。這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動在疾病如癌癥中的作用已成為人們密切研究的對象，并導(dǎo)致開發(fā)了數(shù)種新藥和候選藥物，例如Herbst和Shin，Cancer，941593-1611(2002)；Yarden和Sliwkowski，Nature Reviews Molecular Cell Biology，2127-137(2001)；McCormick，Trends in Cell Biology，953-56(1999)；Blume-Jensen和Hunter，Nature，411355-365(2001)。
單個(gè)細(xì)胞表面受體的表達(dá)水平已經(jīng)被成功地用作為生物標(biāo)記，例如Slamon等的美國專利4968603(Her2表達(dá))。然而，單獨(dú)的單個(gè)受體表達(dá)水平對疾病狀態(tài)或身體狀況并不總是可靠的指示物，例如Chow等，Clin.Cancer Res.，71957-1962(2001)(EGFR或Her1的表達(dá))。盡管受體二聚化作用在細(xì)胞和疾病過程中起著重要的作用，但受體二聚體的表達(dá)還未被采用作生物標(biāo)記，部分是由于當(dāng)前測量技術(shù)的不方便和缺乏靈敏度，并且無法或不能實(shí)際使用這種技術(shù)來對福爾馬林固定的和/或?qū)τ诜治鰜碚f量太小的患者樣品進(jìn)行測量，例如Price等，Methods in Molecular Biology，218255-267(2003)；Stagljar，Science STKE 2003，pe56(2003)；Koll等，國際專利公開WO 2004/008099；Golemis，editor，Protein-Protein Interactions(Cold Spring HarborLaboratory Press，NewYork，2002)；Sorkin等，Curr.Biol.，101395-1398(2000)；McVey等，J.Biol.Chem.，1714092-14099(2001)；Salim等，J.Biol.Chem.，27715482-15485(2002)；Angers等，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，42409-435(2002)；Szollosi等，Reviews in MolecularBiotechnology，82251-266(2002)；Matko等，Meth.in Enzymol.，278444-462(1997)；Reed-Gitomer的美國專利5192660。
鑒于上述原因，根據(jù)涉及關(guān)鍵胞內(nèi)過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的細(xì)胞表面受體二聚體或復(fù)合物的存在、不存在、和/或特征或比例，在患者樣品中提供了新種類的生物標(biāo)記，其對于診斷、預(yù)后、患者分級以及藥物開發(fā)提供了新式的工具，從而將促進(jìn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有ErbB受體復(fù)合物的生物標(biāo)記，其存在于在患者細(xì)胞或組織樣品，尤其是通過常規(guī)方法如冷凍或固定法所保存的樣品，的細(xì)胞表面膜中。一方面，本發(fā)明包括一種測定疾病狀態(tài)或健康狀況的方法，其中將這類狀況與來自于個(gè)體的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞表面膜中的一種或多種ErbB受體復(fù)合物的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。另一方面，本發(fā)明包括一種測定來自個(gè)體的樣本中癌癥狀態(tài)的方法，其中將樣本中一種或多種ErbB表面受體復(fù)合物的數(shù)量測量值同這種狀況相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明另外還提供了一種預(yù)測ErbB-二聚體作用藥物效果的方法，例如，在癌癥治療中，該方法將藥物反應(yīng)性的ErbB二聚體的數(shù)量和種類與功效或者患者應(yīng)答的可能性相關(guān)聯(lián)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明可以測定患者的疾病狀態(tài)，所述患者患有以一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的異常表達(dá)為特征的疾病，步驟如下(i)測定患者樣品中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物中每種的數(shù)量；(ii)將上述每種數(shù)量與其在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；以及(iii)將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別相對應(yīng)的數(shù)量之差與患者的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。患者樣品可以是固定或者冷凍的；然而優(yōu)選地，患者樣品為采用常規(guī)方法固定的。
在一個(gè)特定的方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)對患者樣品，尤其是固定樣品的測量，來確定癌癥患者的疾病狀態(tài)的方法，其中所述測量是針對ErbB受體復(fù)合物的類型和/或數(shù)量進(jìn)行的，該復(fù)合物在此也被稱為“Her受體復(fù)合物”。這種受體復(fù)合物包括但不限于，一種或多種Her1-Her1同型二聚體、Her2-Her2同型二聚體、Her1-Her2受體二聚體、Her2-Her3受體二聚體、Her1-Her3受體二聚體、Her2-Her4受體二聚體、Her1-PI3K復(fù)合物、Her2-PI3K復(fù)合物、Her3-PI3K復(fù)合物、Her1-SHC復(fù)合物、Her2-SHC復(fù)合物、Her3-SHC復(fù)合物、Her1-IGF-1R受體二聚體、Her2-IGF-1R受體二聚體、Her3-IGF-1R受體二聚體、Her1-PDGFR受體二聚體、Her2-PDGFR受體二聚體、Her3-PDGFR受體二聚體、p95Her2-Her3受體二聚體、p95Her2-Her2受體二聚體、p95Her2-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her2受體二聚體、EGFRvIII-Her3受體二聚體。在其他實(shí)施方式中，這種Her受體復(fù)合物選自由Her1-Her2受體二聚體和Her2-Her3受體二聚體構(gòu)成的組；或者由Her1-Her2受體二聚體、Her2-Her3受體二聚體和Her1-Her3受體二聚體構(gòu)成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括測定包含Her受體和胞內(nèi)適配體分子的復(fù)合物，其中胞內(nèi)適配體分子特別是響應(yīng)于受體的磷酸化作用與Her受體形成復(fù)合物的胞內(nèi)適配體分子。Her受體與胞內(nèi)適配體分子的示范性受體復(fù)合物包括選自由以下物質(zhì)構(gòu)成的組中的復(fù)合物Her1-PI3K復(fù)合物、Her2-PI3K復(fù)合物、Her3-PI3K復(fù)合物、Her1-SHC復(fù)合物、Her2-SHC復(fù)合物、Her3-SHC復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步包括，將包含Her受體和另一種受體酪氨酸激酶的受體異型二聚體與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。Her受體與其他受體酪氨酸激酶的示范性受體復(fù)合物包括選自由以下物質(zhì)構(gòu)成的組中的受體復(fù)合物Her1-IGF-1R受體二聚體、Her2-IGF-1R受體二聚體、Her3-IGF-1R受體二聚體、Her1-PDGFR受體二聚體、Her2-PDGFR受體二聚體、Her3-PDGFR受體二聚體。本發(fā)明進(jìn)一步包括，將包含全長Her受體和截短的Her受體的受體二聚體與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。全長Her受體和截短的Her受體的示范性受體復(fù)合物包括選自由以下物質(zhì)構(gòu)成的組中的受體復(fù)合物p95Her2-Her3受體二聚體、EGFRvIII-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her2受體二聚體、EGFRvIII-Her3受體二聚體。在另一種方式中，這種確定疾病狀態(tài)的方法包括測定用于治療癌癥的二聚體作用藥物的效果，或者患者對該藥物的反應(yīng)，所述二聚體作用藥物作用于如上所述的Her受體復(fù)合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括對疾病狀態(tài)的改進(jìn)測定方法，其中是通過測定患者樣品中Her1-Her3受體復(fù)合物的表達(dá)，以及Her1-Her2和Her2-Her3受體復(fù)合物的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種通過測定在這些患者的細(xì)胞或組織樣品中ErbB細(xì)胞表面膜受體的一種或多種二聚體的數(shù)量，或者細(xì)胞表面膜受體的多個(gè)二聚體的相對數(shù)量，從而確定患者疾病狀態(tài)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，采用了至少兩種試劑，這里稱作試劑對來測量這些二聚體，這兩種試劑對于每種二聚體的不同成分具有特異性一種試劑，這里稱作裂解探針，具有裂解引發(fā)部分，其可以被引發(fā)以在其直接近程內(nèi)裂解敏感鍵；另一種試劑，這里稱作結(jié)合化合物，具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可由所述裂解引發(fā)部分裂解的連接物連接。根據(jù)該實(shí)施方式，這些不同成分無論何時(shí)形成二聚體，都在該裂解引發(fā)部分的有效裂解近程內(nèi)引入可裂解連接物，使得分子標(biāo)簽被釋放。接著將釋放的分子標(biāo)簽從反應(yīng)混和物中分離并定量以測定二聚體的形成。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，參比測定患者樣品中的ErbB受體二聚體；即，ErbB二聚體的數(shù)量是該二聚體中存在的一種成分的測量值與該二聚體的其他成分的總量測量值的比例，無論其是存在于該二聚體中還是以單體的形式存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，典型的測量值包括與特定分子標(biāo)簽相關(guān)的電泳圖譜中鋒值的峰高度或者峰面積。
在這個(gè)方面的特定實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種通過同時(shí)測定來自患者的固定的組織樣品中的多個(gè)Her受體二聚體的數(shù)量，從而測定在該患者中癌癥狀態(tài)的方法。這些二聚體可以利用至少兩種對每種二聚體的不同成分具有特異性的試劑來測定一種試劑，這里稱作裂解探針，具有裂解引發(fā)部分，其可以被引發(fā)以在其直接近程內(nèi)裂解敏感鍵；另一種試劑，這里稱作結(jié)合化合物，具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可由所述裂解引發(fā)部分裂解的連接物連接。根據(jù)該實(shí)施方式，Her受體二聚體無論何時(shí)形成，都在該裂解引發(fā)部分的有效裂解近程內(nèi)引入結(jié)合化合物的可裂解連接物，使得分子標(biāo)簽被釋放。接著將釋放的分子標(biāo)簽從反應(yīng)混合物中分離并定量以測定Her受體二聚體的數(shù)量。在這個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施方式中，測定了多個(gè)Her受體二聚體的相對數(shù)量，并與患者的癌癥狀態(tài)相聯(lián)系。示范性的癌癥包括但不限于，乳腺癌、卵巢癌、以及前列腺癌。示范性的Her受體二聚體包括但不限于，Her1-Her2受體二聚體、Her1-Her3受體二聚體、Her2-Her3受體二聚體、Her2-Her4受體二聚體，以及上面列出的那些。
本發(fā)明提供生物標(biāo)記，包括對患者樣品中ErbB受體復(fù)合物數(shù)量的測定值。特別地，可將ErbB受體復(fù)合物數(shù)量的圖形與患者的疾病狀態(tài)相關(guān)，并且在一些實(shí)施方式中，可將其與預(yù)后、ErbB二聚體作用藥物的功效、以及患者對治療的反應(yīng)可能性相關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明，通過直接測定患者樣品中的ErbB受體復(fù)合物，可以克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，無需培養(yǎng)或以其他方式處理細(xì)胞或組織樣品，例如異種移植，那樣會增加成本和工作量并且會給最終測定讀數(shù)帶來噪聲和可能的假象。本發(fā)明還提供了一種對胞內(nèi)受體的磷酸化，或其他的在樣品制備過程中容易被破壞的修飾物的替代性測量方法。該替代性測量方法是基于對復(fù)合物的測定，例如PI3K或SHC-受體復(fù)合物等等，它取決于對復(fù)合物形成的上述修飾，并且較少地受到樣品制備過程的影響。
附圖簡述

圖1A-1F圖示性說明使用可釋放的分子標(biāo)簽來測定受體二聚體數(shù)量。
圖1G-1H圖示性說明使用可釋放的分子標(biāo)簽來測定固定的組織樣本中細(xì)胞表面受體復(fù)合物。
圖2A-2E圖示性說明本發(fā)明方法的實(shí)施方式，其描繪了多個(gè)受體類型二聚體的相對數(shù)量的圖形。
圖3A-3D圖示性說明將分子標(biāo)簽連接在抗體上的方法。
圖4A-4E說明利用本發(fā)明的方法對SKBR-3和BT-20細(xì)胞裂解物的受體異型二聚體進(jìn)行測定的數(shù)據(jù)。
圖5A-5C說明利用本發(fā)明的方法對人類正常和腫瘤乳腺組織樣品的受體異型二聚體進(jìn)行測定的數(shù)據(jù)。
圖6A和6B說明本發(fā)明用于檢測BT-20細(xì)胞裂解物中同型二聚體和Her1的磷酸化的測定數(shù)據(jù)。
圖7顯示本發(fā)明測定MCF-7和SKBR-3細(xì)胞系的Her2同型二聚體數(shù)量的數(shù)據(jù)。
圖8A-8B顯示本發(fā)明檢測對升高濃度的heregulin(HRG)發(fā)生應(yīng)答的細(xì)胞上Her1和Her3異型二聚體的測定數(shù)據(jù)。
圖9A和9B顯示了在表皮生長因子(EGF)濃度升高的情況下，分別在22Rv1和A549細(xì)胞上的Her1-Her3異型二聚體的數(shù)量增加數(shù)據(jù)。
圖10A-10C顯示了人類乳腺組織的冷凍樣品中IGF-1R和各種Her受體的異型二聚體的表達(dá)數(shù)據(jù)。
圖11A-11D說明用于檢測PI3激酶-Her3受體活化復(fù)合物的測定設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖12A-12D說明用于檢測Shc/Her受體-適配體復(fù)合物的測定設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖13顯示腫瘤細(xì)胞中Her2-Her3異型二聚體和PI3K/Her3復(fù)合物表達(dá)之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。
圖14A-14B顯示從正常乳腺組織樣品和乳腺腫瘤組織樣品中獲得的Her1-Her2和Her2-Her3受體二聚體數(shù)量的測定值。
圖15A-15G表示了在癌細(xì)胞系的固定團(tuán)切片中的Her1-Her1和Her2-Her2同型二聚體以及Her1-Her2和Her2-Her3異型二聚體的測定值。
定義“抗體”是指能與另一個(gè)分子的特定空間和極性結(jié)構(gòu)特異性地結(jié)合，并因此定義為與之互補(bǔ)的免疫球蛋白。抗體可以是單克隆或多克隆的，并能夠用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備，如免疫宿主并采集血清(多克隆)，或通過制備持續(xù)性的雜交細(xì)胞系并收集分泌的蛋白(單克隆)，或通過克隆和表達(dá)核苷酸序列或其誘變型，所述核苷酸序列至少編碼為天然抗體特異性結(jié)合所需的氨基酸序列?？贵w可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各種類型和同種型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可包括Fab、Fv、F(ab’)2、Fab’等等。此外，適當(dāng)時(shí)可以使用免疫球蛋白的聚集體、聚合物和偶聯(lián)物或它們的片段，只要維持了對特定多肽的結(jié)合親和力。免疫測定，包括采用可釋放分子標(biāo)簽(如下所述)的這類測定，中使用的抗體的制造和選擇指導(dǎo)性技術(shù)可以很容易地在教科書和手冊中找到，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1988)；Howard和Bethell，Basic Methods in Antibody Production and Characterization(CRC Press，2001)；Wild主編，The Immunoassay Handbook(Stockton Press，New York，1994)，等等。
“抗體結(jié)合組合物”是指包含一個(gè)或多個(gè)抗體、或其片段的分子或分子復(fù)合物，并且其結(jié)合特異性來自于該抗體或抗體片段?？贵w結(jié)合組合物包括但不限于，(i)抗體對，其中第一個(gè)抗體與靶分子特異性結(jié)合，第二個(gè)抗體與第一個(gè)抗體的恒定區(qū)特異性結(jié)合；生物素化抗體，其通過生物素部分(moiety)特異性結(jié)合于靶分子和鏈親和素蛋白，其中該鏈親和素的蛋白由諸如分子標(biāo)簽或光敏劑等等的部分衍化成；(ii)對靶分子特異并且與聚合物，如葡聚糖偶聯(lián)的抗體，其中該聚合物是由諸如分子標(biāo)簽或光敏劑的部分衍化而成，其直接通過共價(jià)鍵連接或者間接通過鏈親和素-生物素聯(lián)接；(iii)對靶分子特異并與珠、微珠、或其他固相支持物偶聯(lián)的抗體，其中該支持物直接或間接地由諸如分子標(biāo)簽或光敏劑的部分衍化而成，或者是含有后者的聚合物。
“抗原決定簇”，或“表位”是指分子，通常是蛋白質(zhì)分子，表面上的位點(diǎn)，單個(gè)的抗體分子能與該位點(diǎn)結(jié)合；通常蛋白質(zhì)具有幾個(gè)或多個(gè)不同的抗原決定簇并能與不同特異性的多種抗體反應(yīng)。優(yōu)選的抗原決定簇為蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)。
“結(jié)合部分”是指能夠特異性地與分析物結(jié)合、并且分子標(biāo)簽?zāi)軌蛑苯踊蜷g接地附著于其上的任何分子。結(jié)合部分包括但不限于，抗體、抗體結(jié)合組合物、肽、蛋白質(zhì)、核酸，以及分子量達(dá)到1000道爾頓并且由選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組中的原子所構(gòu)成的有機(jī)分子氫、碳、氧、氮、硫和磷。優(yōu)選地，結(jié)合部分為抗體或抗體結(jié)合組合物。
“癌癥”和“癌的”指的是或描述了哺乳動物中典型地以無規(guī)則細(xì)胞生長為特征的生理狀態(tài)。癌癥實(shí)例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病。這些癌癥的特定實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸道癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭部和頸部癌癥。
“復(fù)合物”在這里指的是直接或間接彼此接觸的分子的集合體或聚集體。在一個(gè)方面，“接觸”或者更具體地說，“直接接觸”涉及分子的復(fù)合物，或者涉及特異性或特異的結(jié)合，指的是兩個(gè)或多個(gè)分子足夠接近使得非共價(jià)的吸引作用，如范德華力、氫鍵、離子和疏水相互作用等等，為分子作用力的主導(dǎo)作用。在這個(gè)方面，由于在測定條件下該復(fù)合物在熱力學(xué)上比其組成分子的非聚集或非復(fù)合狀態(tài)更為有利，因此該分子復(fù)合物較穩(wěn)定。這里所使用的“復(fù)合物”通常是指兩種或多種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定聚集體，還被等價(jià)地稱為“蛋白-蛋白復(fù)合物”。最為典型的是，“復(fù)合物”是指兩種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定聚集體。
“二聚體”涉及細(xì)胞表面膜受體，是指兩種或多種相同或不同的膜結(jié)合受體蛋白的復(fù)合物。相同受體的二聚體稱為“同型二聚體”，不同受體的二聚體稱為“異型二聚體”。二聚體通常由兩種彼此接觸的受體組成。二聚體可通過被動的過程，如范德華作用等等，如上在“復(fù)合物”的定義中所述，形成于細(xì)胞表面膜上，或者二聚體也可以通過主動的過程形成，例如通過配體引發(fā)的二聚化作用，共價(jià)連接，與胞內(nèi)成分的相互作用等等，例如Schlessinger，Cell，103211-225(2000)。如這里所使用的術(shù)語“二聚體”應(yīng)理解成指“細(xì)胞表面膜受體二聚體”，除非根據(jù)上下文有其他的理解。
“疾病狀態(tài)”包括但不限于以下的特征染上疾病的可能性，疾病的存在與否，疾病嚴(yán)重性的預(yù)后，以及通過受體復(fù)合物作用的特殊治療試劑引起的患者對治療的反應(yīng)可能性。至于癌癥，“疾病狀態(tài)”進(jìn)一步包括對癌癥前期或癌細(xì)胞或組織的檢測，對病人的選擇，其通過一種或多種受體復(fù)合物，如一種或多種受體二聚體，作用的治療劑的治療后的可能反應(yīng)，以及這種治療劑的改進(jìn)治療效果。在一個(gè)方面，疾病狀態(tài)涉及Her受體復(fù)合物，是指癌癥患者對用Her或ErbB的二聚體作用藥物治療的反應(yīng)可能性。優(yōu)選地，這種癌癥患者為乳腺癌或者卵巢癌患者，而這種Her二聚體作用藥物包括OmnitargTM(2C4)，Herceptin，ZD-1839(Iressa)，以及OSI-774(Tarceva)。
“ErbB受體”或“Her受體”是屬于ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(“Her1”)、ErbB2(“Her2”)、ErbB3(“Her3”)以及ErbB4(“Her4”)受體。ErbB受體通常包含可以連接ErbB配體的胞外區(qū)域；親脂性跨膜區(qū)域；保守胞內(nèi)酪氨酸激酶域；以及帶有幾個(gè)可磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號域。ErbB受體可以是天然序列的ErbB受體或者是其氨基酸序列的變異體。優(yōu)選該ErbB受體為天然序列人類ErbB受體。在一個(gè)方面，ErbB受體包括Her受體的截短形式，包括但不限于，EGFRvIII和p95Her2，在Chu等，Biochem.J.，324855-861(1997)；Xia等，Oncogene，23646-653(2004)；等等中公開。
術(shù)語“ErbB1”，“表皮生長因子受體”和“EGFR”以及“Her1”在這里可以互相替換使用，指天然序列EGFR，例如在Carpenter等，Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987)中公開，包括其變異體(例如，EGFR的缺失突變體，如Humphrey等，PNAS(USA)874207-4211(1990))。erbB1指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的的基因。能結(jié)合EGFR的抗體實(shí)例包括MAb 579(ATCC CRL RB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCCCRL 8509)(參見美國專利No.4943533，Mendelsohn等)以及其變異體，例如嵌合的225(C225)以及重塑的人類抗體225(H225)(參見WO 96/40210，Imclone Systems Inc)。
“Her2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”可以互相替換使用。除非另有說明，這里使用術(shù)語“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“Her2”時(shí)是指人類蛋白質(zhì)。該人類ErbB2基因和ErbB2蛋白質(zhì)例如描述于，Semba等，PNAS(USA)826497-650(1985)和Yamanoto等，Nature 319230-234(1986)(Genebank登錄號X03363)。與Her2特異性結(jié)合的抗體實(shí)例在美國專利5677171；5772997；Fendly等，Cancer Res.，501550-1558(1990)等中公開。
“ErbB3”和“Her3”指受體多肽，例如在美國專利No.5183884和5480968以及Kraus等PNAS(USA)869193-9197(1989)中公開，包括其變異體。能結(jié)合Her3的抗體實(shí)例在美國專利No.5968511中有描述，例如8B8抗體(ATCCHB 12070)。
術(shù)語“ErbB4”和“Her4”這里指受體多肽，例如在歐洲專利申請No.599274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)；以及Plowman等，Nature，366473-475(1993)中所述，包括其變異體，如WO 99/19488中公開的Her4異構(gòu)型。
“胰島素樣生長因子-1受體”或“IGF-1R”指人類受體酪氨酸激酶，其大致與Ulrich等EMBO J.，52503-2512(1986)或Steele-Perkins等，J.Biol.Chem.，26311486-11492(1988)中披露的那些相同。
“分離的”涉及多肽或蛋白質(zhì)，是指基本上從其天然環(huán)境的成分中分離出。優(yōu)選地，分離的多肽或蛋白質(zhì)是一種與其天然環(huán)境成分相比由至少百分之八十重量的相同序列多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的組合物；更優(yōu)選地，該組合物與其天然環(huán)境成分相比由至少百分之九十五重量的相同序列的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成；并且更優(yōu)選地，該組合物與其天然環(huán)境成分相比由至少百分之九十九重量的相同序列的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成。最優(yōu)選地，該分離的多肽或蛋白質(zhì)為同質(zhì)的組合物，通過基于分子量和等電點(diǎn)的二維凝膠電泳的常規(guī)分離之后，其能夠被分辨成單個(gè)的點(diǎn)。通過常規(guī)的二維凝膠電泳來進(jìn)行這種分析的方案對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的，例如，Hames和Rickwood主編，Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach(IRL Press，Oxford，1981)；Scope，Protein Purfication(Springer-Verlag，New York，1982)；Rabilloud主編，Proteome ResearchTwo-Dimensioned Gel Electrophoresis and Identification Methods(Springer-Verlag，Berlin，2000)。
“試劑盒”指的是運(yùn)送用來實(shí)施本發(fā)明方法的材料或試劑的任何輸送系統(tǒng)。就反應(yīng)測定而言，這種輸送系統(tǒng)包括可以從一個(gè)地點(diǎn)到另一個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行儲藏、運(yùn)送或交付反應(yīng)試劑(例如，在適當(dāng)容器中的探針、酶等)和/或支持材料(例如，緩沖液，對實(shí)現(xiàn)測定的書面說明等)的系統(tǒng)。例如，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)裝有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持材料的外包裝(如盒子)。這些內(nèi)容物可以一起或分別地交給預(yù)定的接受者。例如，第一個(gè)容器可含有測定中所用的酶，而第二個(gè)容器包含探針。
“百分比相同的”或類似術(shù)語在此涉及參照序列與另一序列(即“候選”序列)的比對，指在兩個(gè)序列之間的最佳比對中，候選序列與參照序列在許多亞單位位點(diǎn)上相同達(dá)到了指明的百分比，所述亞單位對于多核苷酸的比對來說是核苷酸，對于多肽的比對來說是氨基酸。這里所使用的術(shù)語被比對序列的“最佳比對”是指亞單元之間的最大匹配程度和構(gòu)建比對中所采用差別數(shù)量的最小化。百分相同比可以采用市場上可購得的算法工具來測定，該算法在Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443-453(1970)(Wisconsin Sequence AnalysisPackage“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)中有描述。本領(lǐng)域中用于構(gòu)建比對和計(jì)算百分相同比或其他相似性測量的其他軟件包包括“BestFit”程序，基于Smith和Waterman的算法，Advances in AppliedMathematics，2482-489(1981)(Wisconsin Sequence Analysis Package，Genetics Computer Group，Madison，WI)。換句話說，例如，為獲得具有與參照氨基酸序列至少95％相同氨基酸序列的多肽，該參照序列中有多達(dá)5％的氨基酸殘基可以缺失或被另一氨基酸所取代，或者占參照序列總氨基酸殘基數(shù)目5％的氨基酸可以插入該參照序列中。參照序列的這些變換可能發(fā)生在該參照氨基酸序列的氨基或者羧基端位點(diǎn)處或者那些端點(diǎn)位置之間的任何位置，或者單個(gè)地散布在作為整體的參照序列的殘基中間，或者以較鄰近基團(tuán)的形式散布在該參照序列中。應(yīng)當(dāng)明白，在與本發(fā)明的參照序列進(jìn)行比對時(shí)，候選序列可以為較大多肽或多核苷酸的組分或片段，并且為計(jì)算百分相同比目的進(jìn)行的這種比對涉及相關(guān)的組分或片段。
“磷脂酰肌醇3激酶蛋白”或者等同的“PI3K蛋白”指人類蛋白質(zhì)組中的一種人類胞內(nèi)蛋白，NCBI登錄號NP_852664、NP_852556和NP_852665，以及氨基酸序列基本與之相同的蛋白質(zhì)。
“血小板衍生生長因子受體”或者“PDGFR”指與PDGFRα或PDGFRβ或其變異體基本上相同的人類受體酪氨酸激酶蛋白，在Heldin等，PhysiologicalReviews，791283-1316(1999)中有描述。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括通過測定以下組中的一種或多種二聚體來確定癌癥狀態(tài)，癌癥早期狀態(tài)，纖維化或硬化狀態(tài)PDGFRα同型二聚體、PDGFRβ同型二聚體以及PDGFRα-PDGFRβ異型二聚體。特別地，纖維化狀態(tài)包括肺或腎纖維化，硬化狀態(tài)包括動脈硬化癥。癌癥包括但不限于，乳腺癌、直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及卵巢癌。單獨(dú)涉及“PDGFR”時(shí)應(yīng)理解成指“PDGFRα”或“PDGFRβ”。
“多肽”是指由氨基酸殘基組成的一類化合物，氨基酸殘基通過酰氨鍵去除了一個(gè)氨基酸羧基和另一個(gè)氨基酸氨基之間的水的而化學(xué)連接在一起。多肽是氨基酸殘基的聚合體，它可以含有大量的這種殘基。通常，除了由較少數(shù)量的氨基酸所組成以外，肽與多肽類似。肽有時(shí)被稱作寡肽。多肽和肽之間沒有明確的區(qū)分。為了方便起見，在此公開說明和權(quán)利要求中，術(shù)語“多肽”一般將用于指肽和多肽。氨基酸殘基可以是天然的或合成的。
“蛋白質(zhì)”指多肽，通常由生物細(xì)胞合成，折疊成固定的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的分子量通常在約5,000至約5,000,000或以上，更常見在約5,000至約1,000,000的分子量，并且可包括翻譯后的修飾，如乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰氨化、共價(jià)連接核黃素、共價(jià)連接血紅素部分、共價(jià)連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)連接脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價(jià)連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、法尼基化(farnesylation)、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸化合物、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI錨、羧基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、selenoylation、硫酸化，以及泛醌化，如Wold，F(xiàn).的Post-translational ProteinModificationsPerspectives and Prospects，1-12頁，B.C.Johnson主編，Academic Press，New York，1983。蛋白質(zhì)包括，例如而并非限制，細(xì)胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶、半乳糖苷酶等等，魚精蛋白，組蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-細(xì)胞受體、蛋白多糖等等。
“標(biāo)準(zhǔn)樣品”指代表正?；蚍羌膊顟B(tài)的一種或多種細(xì)胞、異種移植物、或組織樣品，將患者樣品的測量值與其對照以確定受體復(fù)合物的存在是否過量或者在患者樣品中的存在量減少。標(biāo)準(zhǔn)樣品的性質(zhì)對于特定的測定來說是設(shè)計(jì)選擇的問題，可以從患者自己的正常組織中獲得或測得，或者從健康個(gè)體的人群的組織中獲得。優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)樣品中涉及受體復(fù)合物數(shù)量的值是在與被測患者樣品中相應(yīng)值基本上相同的實(shí)驗(yàn)條件下獲得的。標(biāo)準(zhǔn)樣品可以來自與患者樣品同種的組織，或者可以來自不同的組織類型，并且用以獲得該標(biāo)準(zhǔn)樣品組織的人群可以選擇與患者具有相符合的特征，例如年齡、性別、種族等等。典型地，在本發(fā)明的測定中，將患者樣品中受體復(fù)合物的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中相應(yīng)的值相比較，該標(biāo)準(zhǔn)樣品預(yù)先制成表格并提供平均范圍、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，或類似表示方式。
“受體復(fù)合物”指包含至少一種細(xì)胞表面膜受體的復(fù)合物。受體復(fù)合物可包括細(xì)胞表面膜受體的二聚體，或者一種或多種胞內(nèi)蛋白，例如適配體蛋白，其在各種信號通路中形成連接。屬于受體復(fù)合物的一部分的胞內(nèi)蛋白實(shí)例包括但不限于，PI3K蛋白、Grb2蛋白、Grb7蛋白、Shc蛋白以及Sos蛋白、Src蛋白、Cb1蛋白、PLCγ蛋白、Shp2蛋白、GAP蛋白、Nck蛋白、Vav蛋白、以及Crk蛋白。在一個(gè)方面，受體復(fù)合物包括PI3K或者Shc蛋白。
“受體酪氨酸激酶”或者“RTK”指具有胞內(nèi)激酶活性并且選自蛋白質(zhì)RTK家族的人類受體蛋白，如Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；和Blume-Jensen與Hunter(引用見上)中所述。“受體酪氨酸激酶二聚體”指細(xì)胞表面膜中包含兩種受體酪氨酸激酶蛋白的復(fù)合物。在一些方面，受體酪氨酸激酶二聚體可包含兩種共價(jià)連接的受體酪氨酸激酶蛋白。示范性的RTK二聚體列于表I中。特別受到關(guān)注的RTK二聚體有Her受體二聚體和VGEFR二聚體。
“樣品”或“組織樣品”或“患者樣品”或“患者細(xì)胞或組織樣品”或“樣本”都是指從受試者或患者的組織中獲得的相似細(xì)胞集合。組織樣品的來源可以是固體組織，如來自于新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣品或活檢或吸入氣；血液或任何血液成分；體液例如腦脊液、羊水、腹水、或者組織液；或者是來自于受試者懷孕或成長中任何時(shí)期的細(xì)胞。組織樣品可含有與該自然組織非自然混合的化合物，例如防腐劑、抗凝血?jiǎng)⒕彌_液、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素等等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，組織樣品或患者樣品為固定的，特別是常規(guī)的福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。這些樣品典型地用在對固定組織的薄切片形式的受體復(fù)合物測定中，例如3-10μm厚，其中該固定組織設(shè)置在顯微鏡載玻片，或等同物的表面上。這些樣品還典型地經(jīng)過常規(guī)的再水合過程，并且可選擇地，進(jìn)行了抗原修復(fù)過程作為測定試驗(yàn)的一部分或測定實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理過程。
“分離圖像”(separation profile)涉及分子標(biāo)簽的分離，是指表、圖、曲線、柱形圖，或者其他表示信號強(qiáng)度數(shù)據(jù)與有關(guān)分子標(biāo)簽的參數(shù)例如停留時(shí)間、質(zhì)量等之間相對關(guān)系的方法，它提供了測定試驗(yàn)中產(chǎn)生的各種類型分子標(biāo)簽的數(shù)量讀數(shù)或測量值。分離圖像可以是電泳圖譜、色譜圖、電色譜圖、質(zhì)譜圖，或類似的根據(jù)所采用的分離技術(shù)的數(shù)據(jù)圖形表示。涉及分離圖像的“峰”或“帶”或“區(qū)”是指分離化合物所集中的區(qū)域。一個(gè)測定試驗(yàn)可能有多個(gè)分離圖表，例如，當(dāng)不同的分子標(biāo)簽具有獨(dú)特發(fā)射光譜的不同熒光標(biāo)記，并且在多個(gè)波長下采集和記錄數(shù)據(jù)時(shí)。在一個(gè)方面，所釋放的分子標(biāo)簽由于電泳遷移率的差異而形成電泳圖譜從而被分離，其中不同的分子標(biāo)簽對應(yīng)于電泳圖譜上不同的峰。電泳圖譜中對不同或者較少重疊的相鄰峰值的測量值即為“電泳分辨率”，它可被視為相鄰峰值最大值之間的距離除以該峰值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差中較大值的4倍。優(yōu)選地，相鄰峰值的分辨率至少為1.0，更優(yōu)選至少為1.5，最優(yōu)選至少為2.0。在給定的分離和檢測系統(tǒng)中，所需的分辨率可通過選擇多個(gè)分子標(biāo)簽來獲得，這些分子標(biāo)簽成分的電泳遷移率至少有分辨峰數(shù)量的區(qū)別，該數(shù)量依賴于幾個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的因素，包括信號檢測系統(tǒng)，熒光部分的性質(zhì)，標(biāo)簽的擴(kuò)散系數(shù)，篩選基質(zhì)的存在與否，電泳設(shè)備的特性，例如有無通道、分離通道的長度等等。利用分析程序可以分析電泳圖譜，從而與分子標(biāo)簽的存在、不存在或者數(shù)量的數(shù)據(jù)特征相關(guān)聯(lián)，該程序例如在William等人的美國專利公開2003/0170734A1中所披露。
“SHC”(代表“Src同源2/α-膠原蛋白有關(guān)的”)指與Pelicci等在Cell，7093-104(1992)中所述基本相同的、RTK信號通道中的適配體蛋白家族(66，52和46kDalton)中的任何一個(gè)。在一個(gè)方面，SHC指這種適配體蛋白的人類形式。
“信號通道”或者“信號傳導(dǎo)通道”指一系列的分子活動，其開始通常是細(xì)胞表面受體與胞外配體的相互作用或者胞內(nèi)分子與細(xì)胞表面受體的磷酸化位點(diǎn)相結(jié)合，其觸發(fā)了一系列的分子相互作用，其中這一系列的分子相互作用導(dǎo)致了對細(xì)胞核中基因表達(dá)的調(diào)控?！癛as-MAPK通道”指的是一種信號通道，其包括在形成Ras-GTP復(fù)合物之后對MAPK蛋白的磷酸化?！癙I3K-Akt通道”指的是一種信號通道，其包括通過PI3K蛋白對Akt蛋白的磷酸化。
“特異”或“特異性”涉及一個(gè)分子與另一個(gè)分子的結(jié)合，例如對靶分析物或復(fù)合物的結(jié)合化合物或探針，指的是探針與靶之間的識別、接觸并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，同時(shí)該探針與其他分子基本上較少地識別、接觸或形成復(fù)合物。在一個(gè)方面，“特異”涉及第一分子與第二分子相結(jié)合，是指第一分子與反應(yīng)或樣品中的另一分子進(jìn)行識別并形成復(fù)合物的程度，其能與該第二分子形成最大數(shù)目的復(fù)合物。在一個(gè)方面，該最大數(shù)目至少占第一分子所形成全部這種復(fù)合物的50％。一般來說，涉及特異性結(jié)合過程的分子在其表面或空穴中有一些區(qū)域，能在彼此結(jié)合的分子之間產(chǎn)生特異的識別。特異性結(jié)合的實(shí)例包括抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸中形成雙重體或三重體、受體-配體相互作用等等。
“光譜可分辨”涉及多個(gè)熒光標(biāo)記，指該標(biāo)記的熒光發(fā)射波段足夠明顯，即足以不發(fā)生重疊，使得各標(biāo)記物連接的分子標(biāo)簽可以根據(jù)相應(yīng)標(biāo)記物所產(chǎn)生的熒光信號通過標(biāo)準(zhǔn)光電檢測系統(tǒng)來區(qū)分，例如，采用帶通濾波器和光電倍增管等等，如示例性地描述于美國專利No.4230558；4811218等等，或者Wheeless等，21-76頁，in Flow CytometryInstrumentation and Data Analysis(AcademicPress，New York，1985)。
“基本相同”涉及被比對的蛋白質(zhì)或者相關(guān)蛋白質(zhì)家族中的蛋白質(zhì)氨基酸序列，指的是或者一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少百分之五十與另一種蛋白質(zhì)相同，或者一種蛋白質(zhì)是另一種蛋白質(zhì)相同基因的異構(gòu)型或剪接變異體。在一個(gè)方面，基本上相同指一種蛋白質(zhì)，或其氨基酸序列，與另一種蛋白質(zhì)或其氨基酸序列有至少百分之八十相同。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物作為生物有機(jī)體中疾病狀態(tài)或其他生理狀態(tài)，特別是人類癌癥狀態(tài)的生物標(biāo)記的方法。在一個(gè)方面，直接測定來自患者樣品的ErbB受體復(fù)合物；也就是說，進(jìn)行測量而不作培養(yǎng)，形成異種移植物，或采用類似的技術(shù)，這需要額外勞動和費(fèi)用并且可能在測量過程中引入假象和/或噪聲。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，直接在冷凍患者樣品的組織裂解物或者固定的患者樣品的切片上測定一種或多種受體復(fù)合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣品切片中測定一種或多種ErbB受體復(fù)合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種間接測量ErbB受體磷酸化的方法，通過測定其形成依賴于這種翻譯后修飾的復(fù)合物而實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)方面，在同一測定反應(yīng)混合物中同時(shí)測定了多個(gè)ErbB受體復(fù)合物，例如受體二聚體。優(yōu)選地，采用可釋放性地連接著一個(gè)或多個(gè)分子標(biāo)簽的結(jié)合化合物來測定該復(fù)合物，這樣在結(jié)合了復(fù)合物中的蛋白質(zhì)之后，該分子標(biāo)簽可以從反應(yīng)或測定混合物中釋放和分離出來用以檢測和/或定量。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種確定患者疾病狀態(tài)的方法，包括以下步驟測定一種或多種ErbB受體二聚體在患者樣品中每種的數(shù)量；將該每種的數(shù)量與其標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；以及將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的各相應(yīng)數(shù)量之差與患者疾病狀態(tài)的存在或嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，測定步驟包括(i)提供一種或多種結(jié)合化合物，其對一種或多種受體二聚體的每種中的蛋白質(zhì)具有特異性，使得每種結(jié)合化合物具有一種或多種分子標(biāo)簽，分別通過可裂解連接物連接于其上，并且使該一種或多種分子標(biāo)簽連接著具有不同分離特性的不同結(jié)合化合物，這樣通過將分子標(biāo)簽從不同的結(jié)合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨(dú)特峰；(ii)將該結(jié)合化合物與一種或多種復(fù)合物混合，使得結(jié)合化合物特異性地結(jié)合于其相應(yīng)的受體二聚體從而形成可檢測的復(fù)合物；(iii)裂解形成可檢測的復(fù)合物的每種結(jié)合化合物的可裂解連接物，以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽以確定該一種或多種受體二聚體的存在與否或者數(shù)量。
在另一個(gè)方面，測定一種或多種類型的ErbB受體二聚體的數(shù)量的方法包括以下步驟i)向一種或多種類型的受體二聚體的每種提供裂解探針，其對所述一種或多種受體二聚體的每種的第一受體具有特異性，各裂解探針具有有效近程的裂解引發(fā)部分；(ii)提供一種或多種結(jié)合化合物，其對所述一種或多種受體二聚體的每種的第二受體具有特異性，使每種結(jié)合化合物具有一種或多種分子標(biāo)簽，分別通過可裂解連接物連接于其上，并且使所述一種或多種分子標(biāo)簽連接著具有不同分離特性的不同結(jié)合化合物，這樣通過將分子標(biāo)簽從不同的結(jié)合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨(dú)特；(iii)將裂解探針、結(jié)合化合物與所述一種或多種類型的受體二聚體混合，使得裂解探針特異性地結(jié)合于受體二聚體的第一受體，而結(jié)合化合物特異性地結(jié)合于受體二聚體的第二受體，這樣結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解探針裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽以確定該一種或多種類型的受體二聚體的存在與否或者數(shù)量。優(yōu)選地，受體二聚體和第一與第二受體選自表I中列出的受體二聚體。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，從患者獲得生物樣品，其中包含懷疑含有稀少目標(biāo)細(xì)胞的混合細(xì)胞群體。接著通過將該生物樣本與偶聯(lián)生物特異性配體的磁性顆?；旌蟻碇苽錁悠?，所述生物特異性配體能與所述稀少細(xì)胞上不同于或不存在于血細(xì)胞上的抗原特異性反應(yīng)(這里稱為“捕獲抗原”)，這樣可以基本去除其他的樣品成分。使樣品處于磁場中，該磁場可有效地分離磁性顆粒標(biāo)記的細(xì)胞，包括所述稀少的目標(biāo)細(xì)胞，如果其存在于樣本中的話。然后采用對生物標(biāo)記特異的結(jié)合部分所偶聯(lián)的分子標(biāo)簽來分析上述分離的細(xì)胞群體，以確定稀少細(xì)胞的存在與否和/或數(shù)量。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法中使用的磁性顆粒為膠體磁性納米顆粒。優(yōu)選地，該稀少細(xì)胞群體為循環(huán)上皮細(xì)胞，其可以利用上皮特異性捕獲抗原從患者血液中分離，該抗原例如以下文獻(xiàn)中所公開Hayes等，Internation J.of Oncology，211111-1117(2002)；Soria等，Clinical Cancer Research，5971-975(1999)；Ady等，British J.Cancer，90443-448(2004)；其均引入作為參考。特別地，可采用單克隆抗體BerEP4(Dynal A.S.，Oslo，Norway)通過磁性顆粒來捕獲人類表皮細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種確定患者癌癥狀態(tài)的方法，包括以下步驟(i)通過將患者血液樣品與一種或多種抗體組合物接觸來免疫磁分離包含循環(huán)上皮細(xì)胞的患者樣品，每種抗體組合物對捕獲抗原具有特異性并連接著磁性顆粒；(ii)測定患者樣品中一種或多種ErbB受體復(fù)合物每種的數(shù)量；將每種這些數(shù)量與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品中的數(shù)量相比較；并將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的各相應(yīng)數(shù)量之差與患者癌癥狀況的存在性或嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，測量方法包括步驟(i)提供一種或多種結(jié)合化合物，其對一種或多種ErbB受體復(fù)合物的每種中的蛋白質(zhì)具有特異性，使得每種結(jié)合化合物具有一種或多種分子標(biāo)簽，分別通過可裂解連接物連接于其上，并且使該一種或多種分子標(biāo)簽連接著具有不同分離特性的不同結(jié)合化合物，這樣通過將分子標(biāo)簽從不同的結(jié)合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨(dú)特峰；(ii)將該結(jié)合化合物與一種或多種ErbB受體復(fù)合物混合，使得該結(jié)合化合物特異性地結(jié)合于該一種或多種ErbB受體復(fù)合物中的相應(yīng)蛋白從而形成可檢測的復(fù)合物；(iii)裂解形成可檢測的復(fù)合物的每種結(jié)合化合物的可裂解連接物，以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽以確定該一種或多種ErbB受體復(fù)合物的存在與否或者數(shù)量。
在另一個(gè)方面，測定一種或多種ErbB受體復(fù)合物數(shù)量的方法包括以下步驟i)向一種或多種ErbB受體復(fù)合物的每種提供裂解探針，其對所述一種或多種ErbB受體復(fù)合物的每種的第一蛋白具有特異性，各裂解探針具有有效近程的裂解引發(fā)部分；(ii)提供一種或多種結(jié)合化合物，其對所述一種或多種ErbB受體復(fù)合物的每種的第二受體具有特異性，使每種結(jié)合化合物具有一種或多種分子標(biāo)簽，分別通過可裂解連接物連接與其上，并且使所述一種或多種分子標(biāo)簽連接著具有不同分離特性的不同結(jié)合化合物，這樣通過將分子標(biāo)簽從不同的結(jié)合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨(dú)特峰；(iii)將裂解探針、結(jié)合化合物與一種或多復(fù)合物混合，使得裂解探針特異性地結(jié)合ErbB受體復(fù)合物的第一蛋白，而結(jié)合化合物特異性地結(jié)合ErbB受體復(fù)合物的第二蛋白，這樣該結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解探針裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽以確定該一種或多種ErbB受體復(fù)合物的存在與否或者數(shù)量。
示范性受體二聚體生物標(biāo)記和二聚體作用藥物本發(fā)明的生物標(biāo)記包括以下受體的二聚體和寡聚體。
表I.
示范性細(xì)胞表面膜的受體復(fù)合物二聚體 二聚體
投入使用或正在開發(fā)的許多藥物的作用機(jī)理需要抑制ErbB受體二聚體的一種或多種功能，例如受體成分結(jié)合成二聚體結(jié)構(gòu)，或者基于二聚化作用的功能，如酶活性，例如激酶活性，或自體磷酸化。這種藥物在此被稱為“二聚體作用”藥物，或者“ErbB二聚作用”藥物。正在治療或完成治療的患者細(xì)胞中的受體二聚體的數(shù)目、類型、形成、和/或分解與使用特定的ErbB二聚體作用藥物的效果或適用性有關(guān)。下面的ErbB受體二聚體是與所示藥物有關(guān)的生物標(biāo)記。在一個(gè)方面，本發(fā)明為監(jiān)控ErbB二聚體作用藥物對疾病狀態(tài)的效果提供了生物標(biāo)記。
表II.
與細(xì)胞表面膜的二聚體有關(guān)的藥物二聚體藥物
以下文獻(xiàn)中描述了表II中所列的二聚體作用藥物Traxler，Expert Opin.Ther.Targets，7215-234(2002)；Baselga主編，OncologyBiotherapeutics，21-36(2002)；Nam等，Current Drug Targets，4159-179(2003)；Seymour，Current Drug Targets，2117-133(2001)；等等。
表IIIPI3K相關(guān)的受體復(fù)合物二聚體 二聚體
*“XX”指Her2能夠與之形成二聚體的任何受體樣品制備含有分子復(fù)合物的樣品可以廣泛地來自于適用于本發(fā)明的各種來源，從而使受體復(fù)合物的數(shù)量與疾病狀態(tài)或健康狀態(tài)相關(guān)，包括細(xì)胞培養(yǎng)物、動物或植物組織、患者活組織切片等等。優(yōu)選地，樣品為人類患者樣品。可利用常規(guī)的技術(shù)來制備樣品用于本發(fā)明的測定，所用技術(shù)可根據(jù)取得樣品的來源確定。
A.固體組織樣品。對于活檢和醫(yī)學(xué)樣本來說，以下參考文獻(xiàn)中提供了技術(shù)指導(dǎo)Bancroft JD & Stevens A主編，Theory and Practice of HistologicalTechniques(Churchill Livingstone，Edinburgh，1977)；Pearse，Histochemistry.Theory and applied.第四版(Churchill Livingstone，Edinburgh，1980)。
在癌癥狀態(tài)區(qū)域中，可以采用的患者組織樣品實(shí)例包括但不限于，乳腺、前列腺、卵巢、結(jié)腸、肺、子宮內(nèi)膜、胃、唾液腺、或胰腺。所述組織樣品可通過多種方法獲得，包括但不限于，外科切除、抽吸或活組織切片。組織可以是新鮮的或者是冷凍的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的測定是在固定并用石蠟或類似物包埋的組織樣品上實(shí)施的；因此，在該實(shí)施方式中，要進(jìn)行脫去石蠟的步驟。組織樣品可以通過常規(guī)的方法固定(即保存)[參見例如，“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，第3版(1960)，Lee G.Luna，HT(ASCP)主編，The Blakston DivisionMcGraw-Hill Book Company，New York；The Armed Forces Instituteof Pathology Advanced Labotatory Methods in Histology andPathology(1994)Ulreka V.Miked主編，Armed Forces Instituteof Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，固定劑的選擇是根據(jù)被組織染色或作其他分析所用的組織的用途來決定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)明白，固定的時(shí)長取決于組織樣品的尺寸和所使用的固定劑。舉例來說，可用中性緩沖液福爾馬林、布安氏液或多聚甲醛來固定組織樣品。
一般來說，首先固定組織樣品，然后通過遞增系列的乙醇脫水，用石蠟或其他切片介質(zhì)滲透和包埋，使該組織樣品形成切片。或者，可以將組織進(jìn)行切片并固定所獲得的切片。舉例來說，可用常規(guī)的方法在石蠟中包埋和處理該組織樣品(參見例如，“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute ofPathology”，supra)?？墒褂玫氖瀸?shí)例包括但不限于，Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦組織樣品被包埋后，該樣品就可通過顯微切片機(jī)或類似儀器進(jìn)行切片(參見例如，“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，supra)。對于該步驟舉例來說，切片厚度可在約三微米至約十二微米的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，厚度在約5微米至約10微米的范圍內(nèi)。在一個(gè)方面，切片面積可以從約10mm2至約1cm2。一旦切片之后，可通過一些標(biāo)準(zhǔn)的方法將該切片加到載玻片上。載玻片粘合劑的實(shí)例包括但不限于硅烷、凝膠、聚-L-賴氨酸等等。舉例來說，可將該石蠟包埋的組織粘貼到帶正電的載玻片上和/或涂附有聚-L-賴氨酸的載玻片上。
如果使用了石蠟作為包埋材料，該組織切片一般來說要脫去石蠟并與水進(jìn)行再水合。該組織切片可通過幾種常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)方法來脫去石蠟。例如，可采用二甲苯和逐漸遞減系列的乙醇(參見例如，Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute ofPathology”，supra)?；蛘?，可采用市場上可購買到的脫石蠟無機(jī)試劑，如Hemo-De(CMS，Houston Tex.)。
對于哺乳動物的組織培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織或類似來源來說，可以通過常規(guī)的細(xì)胞裂解技術(shù)來制備樣品(例如0.14M NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-Cl(pH8.6)，0.5％Nonidet P-40以及所需的蛋白酶和/或磷酸酶抑制劑)。對于新鮮的哺乳動物組織來說，樣品的制備還可以包括組織解聚步驟，例如破碎、剁碎、研磨、超聲處理等等。
B.細(xì)胞的磁性分離。在一些應(yīng)用中，例如在測定來自于患者血液的稀少轉(zhuǎn)移性細(xì)胞上的二聚體時(shí)，可以在進(jìn)行表面受體二聚體數(shù)量測定之前實(shí)施一個(gè)富集的步驟。可以利用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)和材料來進(jìn)行免疫磁性分離或者富集過程，如以下代表性參考文獻(xiàn)中所公開，引入其作為參考Terstappen等的美國專利6365362；Terstappen等的美國專利5646001；Rohr等的美國專利5998224；Kausch等的美國專利5665582；Kresse等的美國專利6048515；Kausch等的美國專利5508164；Miltenyi等的美國專利5691208；Molday的美國專利4452773；Kronick的美國專利4375407；Radbruch等，Methods in CellBiology，Vol42中第23章，(Academic Press，New York，1994)；Uhlen等，Advances in Biomagnetic Separation(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等，J.Chromatography B，72233-53(1999)；Miltenyi等，Cytometry，11231-238(1990)；Nakamura等，Biotechnol.Prog.，171145-1155(2001)；Moreno等，Urology，58386-392(2001)；Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.，954589-4594(1998)；Zigeuner等，J.Urology，169701-705(2003)；Ghossein等，Seminars in Surgical Oncology，20304-311(2001)。
優(yōu)選用于實(shí)施本發(fā)明的磁性顆粒是性質(zhì)如膠體的顆粒。這種顆粒的特征在于其亞微密級的顆粒尺寸，通常小于約200納米(nm)(0.20微米)，并且其穩(wěn)定性對于溶液中的重力分離能持續(xù)較長時(shí)間。除了許多其他的優(yōu)點(diǎn)之外，該尺寸范圍還使其對于細(xì)胞分析中常用的分析技術(shù)來說基本上不可見。預(yù)計(jì)在90-150nm范圍內(nèi)并且磁質(zhì)量在70-90％之間的顆粒適用于本發(fā)明。適合的磁性顆粒由周圍圍繞著分子的超順磁性材料晶核構(gòu)成，該分子例如通過物理吸附或共價(jià)連接而結(jié)合到磁性核心上并賦予其穩(wěn)定的膠體特性。涂覆材料優(yōu)選的施加量應(yīng)有效地防止生物樣品中的生物大分子與磁性核心之間的非特異性相互作用。這種生物大分子可包括非目標(biāo)細(xì)胞表面上的唾液酸殘基、外源凝集素、糖蛋白以及其他的膜成分。此外，該材料應(yīng)當(dāng)含有盡可能多的磁質(zhì)量/納米顆粒。包括核心的磁性晶體尺寸應(yīng)足夠小使其不含有完整的磁疇。納米顆粒的尺寸足夠小使得其布朗能量超過了其磁矩。結(jié)果，這些膠體磁性顆粒幾乎不出現(xiàn)北極、南極的對齊以及之后的相互吸引/排斥作用，甚至于在適度強(qiáng)大的磁場下也是，這有助于其溶液的穩(wěn)定性。最后，該磁性顆粒應(yīng)當(dāng)可在高磁場梯度的外部場分離器中被分離。該特征有利于樣品處理，并且具有比加載鐵磁性珠或鋼絲絨的較復(fù)雜內(nèi)部梯度柱更經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。具有上述特性的磁性顆?？梢酝ㄟ^美國專利No.4795698、5597531、5698271中所述的基本材料來制備，引入這些專利作為參考。
采用可釋放分子標(biāo)簽的測定試驗(yàn)采用可釋放分子標(biāo)簽來測定二聚體的數(shù)量具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括(1)從測定混合物中分離所釋放的分子標(biāo)簽可以大大降低本底和顯著提高靈敏度；以及(2)使用為簡化分離和檢測過程而特別設(shè)計(jì)的分子標(biāo)簽提供了便利的多元化性能，這樣很容易在同一測定中同時(shí)測得多個(gè)受體復(fù)合物成分。采用了這種標(biāo)簽的測定可具有多種形式并在以下參考文獻(xiàn)中所公開Singh等的美國專利6627400；Singh等的美國專利公開2002/0013126；以及2003/0170915，和Williams等的2002/0146726；和Chan-Hui等的國際專利公開WO2004/011900，所有文獻(xiàn)在此引入作為參考。例如，可采用根據(jù)被分離分子之間的物理、化學(xué)或光學(xué)特性差異來區(qū)分分子的多種分離技術(shù)，所述特性包括但不限于電泳遷移率、分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、荷/質(zhì)比、極性等等。在一個(gè)方面，多個(gè)或一組分子標(biāo)簽在電泳遷移率和光學(xué)檢測特性上有所不同，因而通過電泳來分離。在另一個(gè)方面，多個(gè)或一組分子標(biāo)簽可以在分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性上有所不同，因而通過正相或反相HPLC、離子交換HPLC、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、氣相色譜法等等技術(shù)來分離。
提供成組的分子標(biāo)簽，在其從結(jié)合化合物上釋放之后通過分離技術(shù)分離成不同的帶或峰。鑒定并定量這些峰可提供對受體二聚體種類和數(shù)量的測定值或圖像。一組分子標(biāo)簽可具有不同的化學(xué)性質(zhì)；然而，為方便起見，成組的分子標(biāo)簽通?；瘜W(xué)性質(zhì)相關(guān)。例如，其可以都為肽，或者其可以由相同堿基構(gòu)建區(qū)或單體的不同組合構(gòu)成，或者其可以采用具有不同取代基的相同堿基骨架來合成以賦予不同的分離特性，如下面所詳細(xì)描述。多個(gè)分子標(biāo)簽的數(shù)目根據(jù)一些因素可以有所不同，包括采用的分離模式，分子標(biāo)簽上使用的檢測標(biāo)記物，結(jié)合部分的靈敏度，裂解可裂解連接物的效率等等。在一個(gè)方面，用于測定受體二聚體數(shù)量的多個(gè)分子標(biāo)簽的數(shù)量在2到10的范圍內(nèi)。在其他方面，多個(gè)分子標(biāo)簽的數(shù)量可在2到8，2到6，2到4，或2到3的范圍內(nèi)。
可以在均勻相或非均勻，即多相的測定試驗(yàn)中檢測受體二聚體。在均勻相中，不需要任何步驟來將特異性結(jié)合于靶復(fù)合物的結(jié)合化合物從未結(jié)合的結(jié)合化合物中分離。在優(yōu)選實(shí)施方式中，均勻相采用的試劑對包括(i)具有可釋放分子標(biāo)簽的一種或多種結(jié)合化合物和(ii)能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)的至少一個(gè)裂解探針，該活性物質(zhì)可與分子標(biāo)簽反應(yīng)并在該裂解探針的有效近程內(nèi)釋放分子標(biāo)簽。
受體二聚體還可以通過采用多相形式的測定試驗(yàn)來測定。多相技術(shù)通常涉及分離步驟，其中將具有特異性結(jié)合的結(jié)合化合物的胞內(nèi)復(fù)合物從未結(jié)合的結(jié)合化合物中分離，并且可選擇地從其他樣品成分，如蛋白質(zhì)、膜碎片等中分離出來。可以通過各種方式實(shí)現(xiàn)分離過程，例如采用結(jié)合著固相支持物的試劑，其可以區(qū)分出結(jié)合的復(fù)合物和未結(jié)合的結(jié)合化合物。固相支持物可以是容器壁，例如微滴定孔板的孔、毛細(xì)管、平板、載玻片、微珠，包括磁珠，脂質(zhì)體等等。該固體支持物的主要特征是(1)可以分離結(jié)合的與未結(jié)合的結(jié)合化合物，以及(2)不干擾結(jié)合復(fù)合物的形成，或者在確定受體二聚體時(shí)的其他操作。通常，在固定樣品中，未結(jié)合的結(jié)合化合物通過洗滌可容易地去除掉。
在多相形式中利用分子標(biāo)簽檢測時(shí)，在洗滌之后，可將樣品與溶劑混合，在其中釋放分子標(biāo)簽。根據(jù)可裂解鍵的性質(zhì)和裂解方法，該溶劑中可包括用于裂解的任何附加試劑。在不需要裂解試劑的情況下，該溶劑可以方便地作為分離緩沖液，例如，電泳分離介質(zhì)。例如，通過光敏劑產(chǎn)生的活性物質(zhì)，該可裂解連接物具有光敏感性的或易分解性時(shí)，可以用適當(dāng)波長的光照射該介質(zhì)以將該分子標(biāo)簽釋放到緩沖液中。
無論哪種形式下，如果測定反應(yīng)的條件干擾了所采用的分離技術(shù)，則可能需要在裂解和分離分子標(biāo)簽之前去除或交換該測定反應(yīng)緩沖液。例如，在一些實(shí)施方式中，測定條件包括鹽濃度(例如特異性結(jié)合所需的)，當(dāng)分子標(biāo)簽在電泳遷移率基礎(chǔ)上進(jìn)行分離時(shí)，該鹽濃度其會使分離的性能降低。在該實(shí)施方式中，釋放和分離分子標(biāo)簽之前，要用分離緩沖液或介質(zhì)來替代測定緩沖液。
采用了可釋放分子標(biāo)簽和裂解探針的測定試驗(yàn)根據(jù)被檢測或測定的復(fù)合物可以采取多種不同的形式和構(gòu)造。根據(jù)本公開說明書，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說選擇特定的結(jié)合化合物和裂解探針的數(shù)量和特異性是一種設(shè)計(jì)選擇。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，圖1A和1B圖示性說明了使用可釋放分子標(biāo)簽來測定細(xì)胞表面膜二聚體。將具有分子標(biāo)簽“mT1”和“mT2”的結(jié)合化合物(100)和具有光敏劑“PS”的裂解探針(102)與生物細(xì)胞(104)組合。具有分子標(biāo)簽“mT1”的結(jié)合化合物對細(xì)胞表面受體R1(106)具有特異性，具有分子標(biāo)簽“mT2”的結(jié)合化合物對細(xì)胞表面受體R2(108)具有特異性。細(xì)胞表面受體R1和R2在細(xì)胞表面膜(112)中作為單體，如(106)和(108)，和二聚體(110)存在。將這些測定成份在適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合緩沖液中溫育之后，使得結(jié)合化合物與其相應(yīng)的受體靶之間以及裂解探針與其受體靶之間形成(114)穩(wěn)定的復(fù)合物。如圖所示，優(yōu)選結(jié)合化合物和裂解探針分別包含抗體結(jié)合組分，其使得分子標(biāo)簽和裂解引發(fā)部分特異地靶向膜成分。在一個(gè)方面，這種抗體結(jié)合組分為單克隆抗體。在這些實(shí)施方式中，連接緩沖液可包含常規(guī)ELISA技術(shù)中使用的緩沖液，或類似物。結(jié)合化合物和裂解探針成為穩(wěn)定的復(fù)合物(116)之后，照射(118)該測定混合物以引發(fā)光敏劑(120)產(chǎn)生單線態(tài)氧。單線態(tài)氧迅速地與測定混合物成分反應(yīng)，這樣其用于裂解分子標(biāo)簽的可裂解連接物的有效近程(122)受到空間上的限制，使得只有恰好在該有效近程內(nèi)的分子標(biāo)簽被釋放(124)。如圖所示，只有那些與R1-R2二聚體和裂解探針形成穩(wěn)定復(fù)合物的結(jié)合化合物上的分子標(biāo)簽被釋放。將釋放的分子標(biāo)簽(126)從測定混合物中去除并根據(jù)分離特性分離(128)，這樣在分離圖像(132)中形成獨(dú)特的峰(130)。根據(jù)本發(fā)明，該去除和分離可以是同一步驟。可選擇地，在照射之前可以去掉該結(jié)合緩沖液并用更適合分離的緩沖液，即分離緩沖液代替。例如，結(jié)合緩沖液通常具有的鹽濃度會降低一些分離技術(shù)，例如毛細(xì)管電泳，的用于分離分子標(biāo)簽以形成明顯的峰值的性能。在一些實(shí)施方式中，這種緩沖液的交換可以通過膜過濾實(shí)現(xiàn)。
圖1C說明了一個(gè)參比測定異型二聚體的實(shí)施方式，其中采用了額外的結(jié)合化合物來測定樣品中蛋白(1104)的總量。本發(fā)明的反應(yīng)試劑(1122)包含(i)裂解探針(1108)、第一結(jié)合化合物(1106)和第二結(jié)合化合物(1107)，其中第一結(jié)合化合物(1106)對蛋白(1102)具有特異性，第二結(jié)合化合物(1107)對蛋白(1104)在與裂解探針(1108)特異性不同的抗原決定簇處具有特異性。在結(jié)合反應(yīng)試劑之后，裂解探針(1108)被活化產(chǎn)生活性物質(zhì)，其可以在光敏劑的有效近程內(nèi)裂解該分子標(biāo)簽的可裂解連接物。在該實(shí)施方式中，分子標(biāo)簽從同時(shí)連接著反應(yīng)試劑(1107)和(1108)蛋白(1104)的單體上，以及連接著試劑(1108)并單獨(dú)或同時(shí)連接著試劑(1106)和(1107)的異型二聚體上釋放出來。將釋放的分子標(biāo)簽(1123)分離，使分離圖像(1126)中的峰(1118和1124)與所釋放分子標(biāo)簽的數(shù)量相關(guān)。在該實(shí)施方式中，相關(guān)峰的高度或面積可以反映(i)第一和第二結(jié)合化合物對其相應(yīng)抗原決定簇的親和性差異，和/或(ii)對結(jié)合化合物具有特異性的抗原決定簇的存在與否。無論何時(shí)將結(jié)合化合物用于監(jiān)測蛋白質(zhì)的翻譯后狀態(tài)，如磷酸化狀態(tài)，后一種情況都很重要。
對同型二聚體的測定可以如圖1D中所示。如上所述，測定可包括三種反應(yīng)試劑(1128)裂解探針(1134)、第一結(jié)合化合物(1130)和第二結(jié)合化合物(1132)。第一結(jié)合化合物(1130)和裂解探針(1134)被構(gòu)建成對樣品中以同型二聚體(1136)或單體(1138)形式存在(1140)的蛋白(1138)上相同的抗原決定簇(1135)具有特異性。在能促進(jìn)反應(yīng)試劑和其相應(yīng)靶之間形成穩(wěn)定復(fù)合物的條件下，反應(yīng)試劑(1128)與樣品混合之后，測定混合物中形成了多種復(fù)合物(1142至1150)。由于裂解探針(1134)和結(jié)合化合物(1130)特異于相同的抗原決定簇(1135)，反應(yīng)試劑的四種不同組合(1144至1150)可形成具有同型二聚體的復(fù)合物。在測定混合物中的復(fù)合物中，只有那些(1143)同時(shí)具有裂解探針(1134)和至少一個(gè)結(jié)合化合物的復(fù)合物能夠貢獻(xiàn)出釋放的分子標(biāo)簽(1151)用以分離和檢測(1154)。在該實(shí)施方式中，峰(1153)的大小與測定混合物中同型二聚體的數(shù)量成正比，而峰(1152)的大小與測定混合物中蛋白(1138)的總量成正比，其既有單體形式(1142)又有同型二聚體形式(1146和1148)。圖1E說明類似的測定用于在細(xì)胞表面膜(1161)中形成異型二聚體的細(xì)胞表面受體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，二聚體可以在細(xì)胞或組織的裂解物中測定，或者可以在通過固定過程滲透或去除了細(xì)胞膜的固定樣品中進(jìn)行。在這種情況下，結(jié)合化合物可以對細(xì)胞表面膜受體的胞外或胞內(nèi)區(qū)域具有特異性。
如圖1E和1F中所示，可釋放的分子標(biāo)簽還可以用于同時(shí)檢測或測定細(xì)胞樣品中的多種二聚體和胞內(nèi)復(fù)合物。將細(xì)胞(160)，其可來自于體外培養(yǎng)或者來自于患者組織樣本，裂解(172)以提供可接近的分子復(fù)合物，其連接著細(xì)胞膜和/或膜分子的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)的翻譯后修飾位點(diǎn)，如磷酸化位點(diǎn)。裂解之后，得到的裂解物(174)與包括多個(gè)裂解探針(175)和多個(gè)結(jié)合化合物(177)的測定試劑(176)混合。選擇(178)測定條件使得試劑(176)與其相應(yīng)的靶特異性結(jié)合，這樣經(jīng)過活化后，裂解引發(fā)部分的有效近程(180)內(nèi)的可裂解連接物被裂解，并釋放出(182)分子標(biāo)簽。如上所述，裂解之后，將釋放的分子標(biāo)簽分離(184)并在分離圖像(186)如電泳圖譜中進(jìn)行鑒定，并根據(jù)所測得的分子標(biāo)簽數(shù)和量來獲得樣品細(xì)胞中選定分子復(fù)合物的圖像。
圖1G和1H說明了本發(fā)明測定固定或冷凍的組織樣品中受體復(fù)合物的實(shí)施方式。將固定的組織樣品(1000)，例如福爾馬林固定的石蠟包埋樣品，利用顯微切片機(jī)或類似儀器切割獲得切片(1004)，放置在表面(1006)如顯微載玻片上之后，進(jìn)行脫蠟和再水化以便加入測定試劑。放大圖(1007)表示了部分(1014)顯微載玻片(1006)上的部分(1008)切片(1004)。所示的受體二聚體分子(1018)被包埋在固定樣品的殘余膜結(jié)構(gòu)(1016)中。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，裂解探針和結(jié)合化合物與固定樣品一起溫育，使得它們與其靶分子結(jié)合。例如，裂解探針(1012)(圖中表示為連接著光敏劑(“PS”)的抗體)與第一結(jié)合化合物(1010)(表示為連接著分子標(biāo)簽“mT1”的抗體)特異性地結(jié)合著通用于所有所示二聚體的受體(1011)，第二結(jié)合化合物(1017)(具有“mT2”)特異性地結(jié)合著受體(1015)，以及第三結(jié)合化合物(1019)(具有“mT3”)特異性地結(jié)合著受體(1013)。洗滌以去除未特異性結(jié)合其相應(yīng)靶分子的結(jié)合化合物和裂解探針之后，加入緩沖液(1024)(圖中稱為“照射緩沖液”)。為方便起見，可通過在載玻片(1006)上形成疏水性載體，例如用蠟筆，將緩沖液(1024)包含在切片(1004)或其一部分上。照射光敏劑并釋放分子標(biāo)簽(1026)之后，將當(dāng)前含有釋放的分子標(biāo)簽(1025)的緩沖液轉(zhuǎn)移到分離裝置中，例如毛細(xì)管電泳儀，用以在例如電泳圖譜(1030)中分離(1028)和鑒別所釋放的分子標(biāo)簽。
對直接在組織樣品上進(jìn)行的測定，尤其如圖1G和1H所示，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，其包括測定對樣品中總細(xì)胞數(shù)和/或樣品中特性亞型的細(xì)胞具有代表性的靶細(xì)胞或組織。這種靶組織在此稱為“組織指示物”。優(yōu)選甚至必須進(jìn)行額外的測定，因?yàn)榛颊邩悠?，尤其是腫瘤樣品中的細(xì)胞和組織具有不均勻性，其可能包含正常細(xì)胞的基本片段。例如，圖1H中，受體(1011)的總量值可作為以下兩個(gè)測量值的比例給出分子標(biāo)簽(“mT1”)的峰(1032)面積和與樣品中所有細(xì)胞共有的細(xì)胞或組織成分，如微管蛋白，有關(guān)的分子標(biāo)簽的相應(yīng)峰面積。在一些情況下，樣品中所有細(xì)胞都是上皮細(xì)胞時(shí)，可以采用細(xì)胞角蛋白。因此，基于可釋放分子標(biāo)簽的方法可以包括額外的步驟，即提供特異于標(biāo)準(zhǔn)化蛋白如微管蛋白的結(jié)合化合物(具有獨(dú)特的分子標(biāo)簽)。
圖2A-2E說明了本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，用于描繪多個(gè)受體類型之間的二聚化過程。圖2A概括了該測定試驗(yàn)的基本步驟。用于細(xì)胞表面受體二聚體檢測的細(xì)胞膜(200)與幾組結(jié)合化合物(202)和(204)以及裂解探針(206)混合。膜碎片(200)在其細(xì)胞膜中含有三種不同類型的單體受體分子(“1”、“2”和“3”)，其結(jié)合形成三種不同的異型二聚體1-2、1-3和2-3。三種抗體試劑(202)和(204)與膜碎片(200)結(jié)合，每種抗體試劑對三種受體分子中的一種具有結(jié)合特異性，其中抗體(206)特異于受體分子1，抗體(204)特異于受體分子2，而抗體(202)特異于受體分子3。第一受體分子的抗體共價(jià)偶聯(lián)于光敏劑分子，標(biāo)記為PS。第二和第三受體分子的抗體連接著兩種不同的標(biāo)簽，分別標(biāo)記為T2和T3，通過可被光敏劑部分產(chǎn)生的活性物質(zhì)裂解的連接物連接。
混合之后，使抗體結(jié)合(208)膜表面上的分子。光敏劑被活化(210)，裂解敏化劑分子起作用距離內(nèi)的標(biāo)簽和抗體之間的連接物，從而將標(biāo)簽釋放到測定介質(zhì)中。然后將反應(yīng)中的物質(zhì)分離(212)，例如通過毛細(xì)管電泳，如圖所示。如圖2A底部所示，標(biāo)簽T2和T3被釋放，通過電泳分離將出現(xiàn)兩條與這些標(biāo)簽相應(yīng)的帶。由于設(shè)計(jì)的這些標(biāo)簽具有已知的電泳遷移率，因而每條帶能夠唯一地代表測定中所使用的一種標(biāo)簽。
如圖2A所示，細(xì)胞膜中存在的三種異型二聚體中只有兩種會同時(shí)結(jié)合含光敏劑的抗體和含標(biāo)簽的抗體，因此只有這兩種物質(zhì)會產(chǎn)生釋放的標(biāo)簽。然而，需要多次試驗(yàn)來測定不同二聚體的相對數(shù)量。圖2B中列表提供了五種不同的測定組合。圖2C說明每種測定組合物的結(jié)果。測定I表示全部測定的結(jié)果，如圖2A所示。在測定I I中，沒有連接著光敏劑的受體分子1特異性抗體。該測定沒有產(chǎn)生信號，表明測定I中獲得的T2和T3信號需要光敏試劑。類似地，測定V表明標(biāo)簽信號需要存在膜。測定III和IV表明每種被標(biāo)簽的試劑不需要存在另一種被裂解。合在一起考慮這些結(jié)果時(shí)，可以推導(dǎo)出膜中存在的受體異型二聚體的存在和組合的結(jié)論，如圖2C中所給出，即同時(shí)存在1-2和1-3異型二聚體。而且，通過每種標(biāo)簽的相對信號強(qiáng)度可以估計(jì)出每種異型二聚體的相對豐度。
然而，根據(jù)該測定中使用的試劑組合不能得出2-3異型二聚體存在的結(jié)論。不會獲得表示這種復(fù)合物的信號，無論該復(fù)合物是否存在，因?yàn)闆]有光敏試劑結(jié)合于其上。為了推導(dǎo)出三種單體每種可能的二聚體組合，要么必須使用能夠定位到由單體1，2和/或3構(gòu)成的每種可能的寡聚體上的第四種試劑，要么該試驗(yàn)中使用的三種結(jié)合試劑必須以不同的組合偶聯(lián)到標(biāo)簽和敏化劑分子上。后一種方案如圖2D和2E中所示。圖2D左邊的表格中列出了三種抗體試劑當(dāng)中光敏劑和標(biāo)簽分布的三種可能的組合。第一種組合包括偶聯(lián)到單體1特異性抗體上的光敏劑，其與圖2A-2C所示使用的組合相同，并與圖2C中的二聚體數(shù)量相圖。第二種組合包括偶聯(lián)到單體2特異抗體上的光敏劑，其數(shù)量圖像得到與異型二聚體1-2加異型二聚體2-3相同的數(shù)目。第三種組合包括偶聯(lián)到單體3特異抗體上的光敏劑，其數(shù)量圖像得到與異型二聚體1-3和2-3相同的數(shù)目，如前兩個(gè)組合所獲得?？梢越Y(jié)合這些結(jié)果以得到所有的異型二聚體數(shù)量圖像，如圖2E中所給出。
圖2F說明用于測定含有共有成分受體的受體二聚體的相對數(shù)量優(yōu)選實(shí)施方式。在該測定設(shè)計(jì)中，可根據(jù)該共有成分參比測量兩種不同的受體二聚體(“1-2”(240)和“2-3”(250))，其中每種都含有共有成分“2”。所示的測定設(shè)計(jì)是用于測定包含受體“1”(222)和受體“2”(220)的受體異型二聚體(240)，以及包含受體“2”(220)和受體“3”(224)的受體異型二聚體(250)。該實(shí)施方式的一個(gè)關(guān)鍵特征是裂解探針(227)對異型二聚體對的共有受體具有特異性。特異于受體“2”的結(jié)合化合物(228)提供了與測定中受體“2”總量相關(guān)的信號(234)，而特異于受體“1”的結(jié)合化合物(226)和特異于受體“3”的結(jié)合化合物(230)提供的信號(分別是232和236)分別僅與受體“1”和受體“3”的數(shù)量相關(guān)，所述受體“1”和受體“3”分別存在于與受體“2”形成的異型二聚體中。圖2F的設(shè)計(jì)可以推廣到含有共有成分的兩種以上的受體復(fù)合物中，僅需要加入特異于額外復(fù)合物成分的結(jié)合化合物。
A.結(jié)合化合物如上所述，提供含有多種不同結(jié)合化合物的混合物，其中每種不同的結(jié)合化合物具有一種或多種通過可裂解連接物連接的分子標(biāo)簽。結(jié)合化合物、可裂解連接物以及分子標(biāo)簽的性質(zhì)可以在很大范圍內(nèi)變化。結(jié)合化合物可包含抗體結(jié)合組分、抗體、肽、針對細(xì)胞表面受體的肽或非肽配體、蛋白、寡核苷酸、寡核苷酸類似物如肽核酸，外源凝集素，或者其他的能夠特異性結(jié)合靶蛋白或分子或者與目標(biāo)分析物形成穩(wěn)定復(fù)合物，如蛋白質(zhì)復(fù)合物，的分子實(shí)體。在一個(gè)方面，結(jié)合化合物可用以下通式表示，包含一種或多種連接著結(jié)合部分的分子標(biāo)簽。
B-(L-E)k
其中B為連接部分；L為可裂解連接物；E為分子標(biāo)簽。在均相測定中，可裂解連接物L(fēng)可以為易氧化的連接物，更優(yōu)選是能夠被單線態(tài)氧裂解的連接物。部分“-(L-E)k”表示單個(gè)結(jié)合化合物可具有多個(gè)分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接。在一個(gè)方面，k是大于或等于一的整數(shù)，而在其他實(shí)施方式中，k可以大于幾百，例如100至500，或者k大于幾百并多達(dá)幾千，例如500至5000。通常多個(gè)不同類型的結(jié)合化合物的每個(gè)都具有不同的分子標(biāo)簽E?？闪呀膺B接物，例如易氧化連接物，與分子標(biāo)簽E通過常規(guī)的化學(xué)方法連接到B上。
優(yōu)選地，B為特異性結(jié)合于靶，如靶蛋白的預(yù)定抗原決定簇，如細(xì)胞表面受體，的抗體結(jié)合組合物。這種組合物很容易由市場上可購買的各種抗體制得，其可以是單克隆或者多克隆的，對目標(biāo)蛋白質(zhì)具有特異性。特別地，以下專利中公開了對表皮生長因子受體具有特異性的抗體，引入其作為參考5677171；5772997；5968511；5480968；5811098。美國專利6488390，這里引入作為參考，其公開了對G蛋白偶聯(lián)受體CCR4具有特異性的抗體。美國專利5599681，這里引入作為參考，其公開了對蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)具有特異性的抗體。供應(yīng)商如Cell Signaling Technology(Beverly，MA)；BiosourceInternational(Camarillo，CA)，和Upstate(Charlottesville，VA)，也提供對多種受體具有特異性的單克隆和多克隆抗體。
可裂解連接物L(fēng)，實(shí)質(zhì)上可以是任何化學(xué)連接基團(tuán)，其可以在不降解所釋放分子標(biāo)簽E的結(jié)構(gòu)或影響其檢測特性的條件下發(fā)生裂解。無論何時(shí)將裂解探針用于均相測定，可裂解連接物L(fēng)都會被該裂解探針產(chǎn)生的裂解劑裂解，其中裂解探針在短距離中起作用使得僅在該裂解探針的直接近程中的可裂解連接物會發(fā)生裂解。典型地，這種試劑必須通過反應(yīng)混合物發(fā)生物理或化學(xué)變化才能被活化，使得該試劑產(chǎn)生短暫的活性物質(zhì)擴(kuò)散到可裂解連接物處進(jìn)行裂解作用。在均勻相中，裂解劑優(yōu)選連接著結(jié)合部分，如抗體，其在活化之前使裂解試劑靶向特定的位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于具有可釋放分子標(biāo)簽的結(jié)合化合物的近程內(nèi)。在該實(shí)施方式中，裂解劑在此被稱為“裂解引發(fā)部分”，其將在下面更為詳細(xì)的論述。
在非均勻相中，由于特異性結(jié)合的結(jié)合化合物從未結(jié)合的結(jié)合化合物中分離出來，所以可以更廣泛地選擇使用可裂解連接物和連接試劑?？闪呀膺B接物不僅包括容易與局部作用反應(yīng)物質(zhì)，如過氧化氫、單線態(tài)氧等起反應(yīng)的連接物，也包括對整個(gè)反應(yīng)混合物中的試劑不穩(wěn)定的連接物，例如對堿不穩(wěn)定的連接物、可光裂解的連接物、可由還原反應(yīng)裂解的連接物、由氧化反應(yīng)裂解的連接物、對酸不穩(wěn)定的連接物、可由特異性蛋白酶裂解的肽鍵等等。參考文獻(xiàn)中描述了許多這類連接物，包括Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第二版(John Wiley&Wons，New York，1991)；Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，New York，1996)；以及Still等的美國專利5565324。
在一個(gè)方面，本發(fā)明可以采用市場上可購買的可裂解反應(yīng)物體系。例如，可在抗體結(jié)合組合物與分子標(biāo)簽之間利用雜官能試劑引入二硫鍵連接物，這些試劑如N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、succinimidyloxycarbonyl-α-甲基-α(2-吡啶二硫代)甲苯(SMPT)等等，購自供應(yīng)商如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)。以還原劑處理可以破壞通過這種連接物引入的二硫鍵，所述還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、2-巰基乙醇、硼氫化鈉等等。能有效裂解二硫鍵的還原劑的典型濃度在10到100mM的范圍內(nèi)。利用同雙功能的NHS酯交聯(lián)劑，二琥珀酰亞胺酒石酸酯(DST)(購自Pierce)，其中含有容易被高碘酸鈉裂解的順-二醇(例如15mM高碘酸在生理pH下4小時(shí))，可在抗體結(jié)合組合物與分子標(biāo)簽之間引入對氧化劑不穩(wěn)定的連接物。含有酯化間隔物成分的連接物可以用強(qiáng)親核試劑裂解，例如羥胺，例如0.1N羥胺，pH8.5，37℃下3-6小時(shí)。通過同雙功能的交聯(lián)劑如購自Pierce(Rockford，IL)的乙二醇二(琥珀酸琥珀酰亞胺酯)(EGS)可以引入這種間隔物。例用砜基可引入對堿不穩(wěn)定的連接物?？捎糜谙蚩闪呀膺B接物中引入砜基的同雙功能的交聯(lián)劑包括二[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]砜(BSOCOES)，和4，4-二氟-3，3-二硝基苯砜(DFDNPS)。示范性的裂解的堿性條件包括0.1M磷酸鈉、加入Tris堿調(diào)節(jié)至pH11.6，含有6M尿素、0.1％SDS，以及2mM DTT，37℃下溫育2小時(shí)。可光裂解連接物包括Rothschild等的美國專利5986076中所公開的那些物質(zhì)。
當(dāng)L易被氧化時(shí)，L可以是硫醚或其硒類似物；或含有碳-碳雙鍵的烯烴，其中雙鍵裂解成含氧基團(tuán)，釋放出分子標(biāo)簽E。Singh等的美國專利6627400，Singh等的美國專利公開2002/0013126和2003/0170915，以及Willner等人的美國專利5622929中公開了易氧化連接物的例子，所有文獻(xiàn)在此引入作為參考。
當(dāng)通過氣相色譜法或質(zhì)譜法對多個(gè)分子標(biāo)簽進(jìn)行分離時(shí)，分子標(biāo)簽E，在本發(fā)明中可包含電泳標(biāo)簽，如以下文獻(xiàn)中所描述Zhang等，Bioconjugate Chem.，131002-1012(2002)；Giese，Anal.Chem.，2165-168(1983)；以及美國專利4650750；5360819，5516931，5602273等等。
分子標(biāo)簽E優(yōu)選為對活性物質(zhì)尤其是單線態(tài)氧穩(wěn)定的，并且包含檢測或報(bào)告基團(tuán)的水溶性有機(jī)化合物。另外，E的大小和結(jié)構(gòu)可以在很大范圍內(nèi)變化。在一個(gè)方面，E的分子量在約50至約2500道爾頓范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，在約50至約1500道爾頓。E的優(yōu)選結(jié)構(gòu)在下面有更為詳細(xì)的描述。E可包含檢測基團(tuán)用以產(chǎn)生電化學(xué)、熒光、或顯色信號。在利用質(zhì)量檢測的實(shí)施方式中，E可以不含用于檢測目的的分離部分。優(yōu)選地，檢測基團(tuán)產(chǎn)生熒光信號。
在許多量中選擇分子標(biāo)簽應(yīng)使得每個(gè)對于同一量中的其他成員來說都具有獨(dú)特的分離特性和/或獨(dú)特的光學(xué)特性。在一個(gè)方面，色譜或電泳分離特性是在本領(lǐng)域常規(guī)的一套標(biāo)準(zhǔn)分離條件下的停留時(shí)間，所述條件例如壓力、柱壓、柱類型、移動相、電泳分離介質(zhì)等等。在另一個(gè)方面，光學(xué)特性為熒光特性，例如發(fā)射光譜、熒光壽命、給定波長或波段的熒光強(qiáng)度等等。優(yōu)選地，熒光特性為熒光強(qiáng)度。例如，許多量中的每種分子標(biāo)簽可具有相同的熒光發(fā)光特性，但每種由于獨(dú)特的保持時(shí)間而與其他的相區(qū)別開。另一方面，或者許多量中的兩種或更多種的分子標(biāo)簽可具有相同的遷移率或停留時(shí)間，但它們具有獨(dú)特的熒光特性，例如光譜可分辨的發(fā)射光譜，這樣許多量中的所有成員通過分子分離和熒光測定的組合而可以被區(qū)分開。
優(yōu)選地，釋放的分子標(biāo)簽可通過電泳分離以及檢測基團(tuán)的熒光而測得。在這些實(shí)施方式中，具有基本相同熒光特性的分子標(biāo)簽具有不同的電泳遷移率，這樣在分離條件下電泳圖譜上會形成不同的峰。優(yōu)選地，本發(fā)明的多個(gè)分子標(biāo)簽通過常規(guī)的毛細(xì)管電泳設(shè)備來分離，在存在或不存在常規(guī)的篩選基質(zhì)的情況下進(jìn)行。示范性的毛細(xì)管電泳設(shè)備包括Applied Biosysterms(Foster City，CA)310、3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)P/ACE MDQ型；Amersham Biosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE 1000或4000；SpectruMedix geneticanalysissystem，等等。電泳遷移率與q/M2/3成正比，其中q為分子上的電荷數(shù)，M是分子質(zhì)量。理想地，在測定條件下最接近的電泳標(biāo)記物之間的遷移率之差至少約為0.001，通常為0.002，更通常為至少約0.01，并且可以為0.02以上。優(yōu)選地，在這種常規(guī)設(shè)備中，許多量中的分子標(biāo)簽的電泳遷移率至少有百分之一的差別，更優(yōu)選范圍在至少百分之1至10。通過分析分離圖像可鑒別和定量分子標(biāo)簽，或者更具體地，電泳圖譜和這些值可與樣品中存在的受體二聚體的數(shù)量和種類相關(guān)聯(lián)。例如，在電泳分離過程中或之后，通過記錄被分離化合物的熒光信號和遷移時(shí)間(或遷移距離)，或者通過構(gòu)建分子標(biāo)簽的相對熒光和遷移順序圖(例如作為電泳圖譜)，可檢測或鑒定分子標(biāo)簽。優(yōu)選地，分子標(biāo)簽的存在與否和/或數(shù)量可采用一種或多種標(biāo)準(zhǔn)來測定，如Williams等人的美國專利公開2003/0170734A1中所公開，在此引入作為參考。
還可以將多個(gè)分子標(biāo)簽設(shè)計(jì)成通過基于一種或多種物理特性的色譜法來分離，其中包括但不限于分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性等等，如美國專利公開2003/0235832中所公開的，在此引入作為參考。色譜分離技術(shù)根據(jù)參數(shù)來選擇，例如柱類型、固定相、流動相等等，之后再選擇可在單次操作中分離形成不同峰或帶的多個(gè)分子標(biāo)簽。一些因素決定了應(yīng)選擇哪種HPLC技術(shù)用于本發(fā)明，包括被檢測分子標(biāo)簽的數(shù)目(即所述許多量的大小)，測定中可能生成的每種分子標(biāo)簽的估計(jì)量，合成用于多元測定中的一組候選分子標(biāo)簽的可能性和容易程度，采用的檢測形式，以及HPLC儀器、柱和溶劑的的可獲得性、耐用程度、成本和操作容易程度。一般來說，優(yōu)選那些適合于分析有限數(shù)量樣品并能提供最高分辨率的分離的柱和技術(shù)。對進(jìn)行該選擇的技術(shù)指導(dǎo)可以在以下文獻(xiàn)中找到例如Snyder等，PracticalHPLC Method Development，(Johe Wiley&Sons，New York，1988)；Millner，“High Resolution ChromatographyA PracticalApproach”，Oxford University Press，New York(1999)，Chi-SanWu，“Column Handbook for Size Exclusion Chromatography”，Academic Press，San Diego(1999)以及Oliver，“HPLC ofMacromoleculesA Practical Approach，Oxford UniversityPress”，Oxford，England(1989)。特別地，可采取措施對色譜分離的給定條件，如柱類型，固定相等進(jìn)行系統(tǒng)開發(fā)和優(yōu)化，例如，Haber等，J.Chromatogr.Sci.，38386-392(2000)；Outinen等，Eur.J.Pharm.Sci.，6197-205(1998)；Lewis等，J.Chromatogr.，592183-195和197-208(1992)等等。適用于本發(fā)明的示范性HPLC儀表系統(tǒng)是Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。
在一個(gè)方面，分子標(biāo)簽E為(M，D)，其中M是移動改變部分，D是檢測部分。符號“(M，D)”用于表明M和D部分的順序是這樣的，其中每部分都可以鄰近于可裂解連接物L(fēng)。也就是說，“B-L-(M，D)”表示了結(jié)合化合物的兩種形式中的任何一種“B-L-M-D”或“B-L-D-M”。
檢測部分D可以是熒光標(biāo)記或染料，顯色標(biāo)記或染料，電化學(xué)標(biāo)記等等。優(yōu)選地，D為熒光染料。用于本發(fā)明的示范性熒光染料包括水溶性羅丹明染料、熒光素、4，7-二氯熒光黃、苯并氧雜蒽染料、以及能量轉(zhuǎn)移染料，如以下參考文獻(xiàn)中所公開Handbook of MolecularProbes and Research，第八版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等的美國專利6191278；Lee等的美國專利6372907；Menchen等的美國專利6096723；Lee等的美國專利5945526；Lee等，NucleicAcids Research，252816-2822(1997)；Hobb，Jr.的美國專利4997928；Khanna等的美國專利4318846；等等。優(yōu)選地，D為熒光素或熒光素衍生物。
在圖3A所示的實(shí)施方式中，結(jié)合化合物包含作為結(jié)合部分的生物素化抗體(300)。分子標(biāo)簽通過親和素或鏈親和素橋(306)連接著結(jié)合部分(300)。優(yōu)選地，在操作中，結(jié)合部分(300)首先與靶復(fù)合物反應(yīng)，之后加入(304)親和素或鏈親和素以形成抗體-生物素-親和素復(fù)合物(305)。向該復(fù)合物(305)加入(308)生物素化分子標(biāo)簽(310)以形成結(jié)合化合物(312)。
在圖3B所示的另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合化合物包含由多官能部分(316)衍生的抗體(314)，該多官能部分含有多官能團(tuán)(318)，其能與分子標(biāo)簽前體反應(yīng)(320)得到連接著多個(gè)分子標(biāo)簽(322)的最終結(jié)合化合物。示范性的多官能部分包括氨基葡聚糖以及類似物質(zhì)。
一旦每種結(jié)合化合物通過不同的分子標(biāo)簽分別衍生后，其即與其他的結(jié)合化合物匯合形成多個(gè)結(jié)合化合物。通常，每個(gè)不同種類的結(jié)合化合物以相同的比例存在于組合物中；然而，作為設(shè)計(jì)選擇比例可以改變，使得根據(jù)特定實(shí)施方式或測定的期望或需要，特定結(jié)合化合物的一類或小類以較高或較低的比例存在?？赡苡绊懺撛O(shè)計(jì)選擇的因素包括但不限于，對特定靶的抗體親和性和親和力，靶的相對優(yōu)勢度，分子標(biāo)簽檢測部分的熒光特性等等。
B.產(chǎn)生活性物質(zhì)的裂解引發(fā)部分裂解引發(fā)部分或裂解劑是一種能產(chǎn)生活性物質(zhì)的基團(tuán)，所述活性物質(zhì)能夠裂解可裂解連接物，優(yōu)選通過氧化的方式。優(yōu)選地，該活性物質(zhì)為表現(xiàn)出短時(shí)活性的化學(xué)物質(zhì)，這樣其裂解引發(fā)效果僅僅在其產(chǎn)生位點(diǎn)的近程內(nèi)起作用。要么該活性物質(zhì)本身壽命短，這樣由于超出了其產(chǎn)生近程將不會產(chǎn)生明顯的本底，要么采用能有效清除該活性物質(zhì)的清除劑，使得其不會與其產(chǎn)生位點(diǎn)短距離之外的可裂解連接物反應(yīng)。示例性的活性物質(zhì)包括單線態(tài)氧，過氧化氫，NADH，和氫氧根，苯氧基，超氧化物等等。產(chǎn)生氧化反應(yīng)的活性物質(zhì)的說明性猝滅劑包括聚烯類、類胡蘿卜素、維生素E、維生素C、酪氨酸的氨基酸-吡咯N-偶聯(lián)物，組氨酸、和谷胱甘肽等等，例如Beuther等，Meth.Enzymol.，319226-241(2000)。
在設(shè)計(jì)采用裂解引發(fā)部分和可裂解連接物的測定試驗(yàn)中，一個(gè)重要考慮是當(dāng)結(jié)合于受體復(fù)合物時(shí)它們彼此去除的距離不能太遠(yuǎn)，以至于該由裂解引發(fā)部分產(chǎn)生的活性物質(zhì)不能有效地裂解該可裂解連接物。在一個(gè)方面，可裂解連接物優(yōu)選在所結(jié)合的裂解引發(fā)部分的1000nm之內(nèi)，并優(yōu)選在20-200nm之內(nèi)。更優(yōu)選地，對于生成單線態(tài)氧的光敏劑裂解引發(fā)部分來說，可裂解連接物位于受體復(fù)合物中的光敏劑的大約20-100nm之內(nèi)。裂解引發(fā)部分能夠有效裂解可裂解連接物(即，裂解足夠的分子標(biāo)簽以生成可檢測的信號)的范圍在此稱為其“有效近程”。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)明白，特定敏化劑的有效近程取決于特定測定設(shè)計(jì)的細(xì)節(jié)并可通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來測定和改變。
敏化劑是一種能夠被引導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)中間物或物質(zhì)，通常為單線態(tài)氧的化合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的敏化劑是光敏劑。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的其他敏化劑有通過熱、光、電離輻射，或化學(xué)活化而激活后，將釋放單線態(tài)氧分子的化合物。該類化合物中最熟知的成員包括內(nèi)過氧化物，例如1，4-biscarboxyethy1-1，4-萘內(nèi)過氧化物，9，10-聯(lián)苯蒽-9，10-內(nèi)過氧化物以及5，6，11，12-四苯基萘5，12-內(nèi)過氧化物。這些化合物加熱或直接吸收光從而釋放出單線態(tài)氧。以下文獻(xiàn)中公開了另一些敏化劑Di Mascio等，F(xiàn)EBS Lett.，355287(1994)(過氧化物酶和加氧酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.2585991-5993(1983)(乳過氧物酶)；Pierlot等，Meth.Enzymol.，3193-20(2000)(內(nèi)過氧化物的熱裂解)等等。結(jié)合劑連接到裂解引發(fā)部分的方式可以是直接或間接的，共價(jià)或非共價(jià)的，并可通過公知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)，其在許多文獻(xiàn)中可以獲得。參見例如，“ImmobilizedEnzymes”，Ichiro Chibata，Halsted Press，New York(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，2453059(1970)。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的裂解引發(fā)部分是能產(chǎn)生單線態(tài)氧的光敏劑。這里所使用的“光敏劑”涉及光吸收分子，其在光活化時(shí)將分子氧轉(zhuǎn)換成單線態(tài)氧。光敏劑可由共價(jià)或非共價(jià)的連接物直接或間接地連接到類特異性反應(yīng)物的結(jié)合劑上。對于構(gòu)建這種組合物，尤其是作為結(jié)合劑的抗體的技術(shù)指導(dǎo)可在文獻(xiàn)中獲得，例如在光動力性療法、免疫診斷等等領(lǐng)域。以下是示例性的參考文獻(xiàn)Ullman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，5426-5430(1994)；Strong等，Ann.NewYork Acad.Sci.，745297-320(1994)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10197-252(1993)；Pease等的美國專利5709994；Ullman等的美國專利5340716；Ullman等的美國專利6251581；McCapra的美國專利5516636等等。
已存在大量的光源用以光活化光敏劑以產(chǎn)生單線態(tài)氧。多色和單色光源都可以采用，只要該光源在實(shí)際的持續(xù)時(shí)間內(nèi)有足夠的強(qiáng)度產(chǎn)生足夠的單線態(tài)氧。照射波長取決于光敏劑的性質(zhì)，可裂解連接物的性質(zhì)，照射源的功率，以及其到樣品的距離等等。一般來說，照射時(shí)間可以是小于大約一微秒至長達(dá)10分鐘，通常在大約一毫秒至大約60秒的范圍內(nèi)。照射的強(qiáng)度和波長應(yīng)足夠激發(fā)至少大約0.1％的光敏劑分子，通常至少大約30％的光敏劑分子，優(yōu)選幾乎所有的光敏劑分子。示范性的光源包括，舉例而并非限制性地說，激光器，如氦-氖激光器、氬激光器、YAG激光器、He/Cd激光器、以及紅寶石激光器，光電二極管，汞、鈉和氙蒸汽燈，白熾燈例如鎢和鎢/鹵素，閃光燈等等。舉例來說，采用Bjornson等的國際專利公開WO 03/051669中披露的光活化裝置。簡而言之，光活化裝置是一種安裝在外殼中的發(fā)光二極管(LED)的陣列，其可以同時(shí)照亮96孔板中的所有的板孔。適用于本發(fā)明的LED有高功率GaAIAs IR發(fā)射器，例如由OPTO DIODE CORP.(Newbury Park，CA)生產(chǎn)的OD-880W型。
可用于本發(fā)明的光敏劑實(shí)例應(yīng)具有上述特性，列舉在以下文獻(xiàn)中Singh和Ullman的美國專利5536834；Li等的美國專利5763602；Martin等，Methods Enzymol.，186635-645(1990)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10197-252(1993)；Pease等的美國專利5709994；Ullman等的美國專利5340716；Ullman等的美國專利625l581；McCapra的美國專利5516636；Thetford的歐洲專利公開0484027；Sessler等，SPIE，1426318-329(1991)；Magda等的美國專利5565552，Roelant的美國專利6001673等等。
在一些實(shí)施方式中，如同敏化劑一樣，光敏劑可與固相支持物結(jié)合，共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合到支持物的表面上或者加入支持物主體中。一般來說，與支持物結(jié)合的光敏劑的量必須能獲得所需數(shù)量的單線態(tài)氧。一般來說，光敏劑的數(shù)量根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。
在一個(gè)實(shí)施方式中，將光敏劑加入乳膠顆粒中以形成光敏劑膠珠，例如Pease等的美國專利5709994，Pollner的美國專利6346384，和Pease等的PCT公開WO 01/84157中有所披露?；蛘?，制備光敏劑膠珠可通過乳膠珠上的氯甲基將光敏劑，如玫瑰紅共價(jià)連接到0.5微米的乳膠珠上，從而提供酯連接基團(tuán)，如J.Amer.Chem.Soc.，973741(1975)中所述。這種光敏劑膠珠的使用如圖3所示。如圖1C中所描述的用于異源雙鏈分子的檢測中，試劑(1122)與樣品混合之后形成了復(fù)合物(330)。實(shí)施該反應(yīng)可以在例如常規(guī)的96孔或384孔微滴定板等等中進(jìn)行，其中具有形成板孔的一個(gè)壁，如底部，的過濾膜，使得反應(yīng)試劑能夠通過施加負(fù)壓而去除。如果用于結(jié)合化合物特異性結(jié)合所需的緩沖液不同于單線態(tài)氧生成或分離所需的緩沖液的話，上述技術(shù)可以方便地變換緩沖液。例如，在基于抗體的結(jié)合化合物的情況下，需要高鹽的緩沖液。如果對釋放標(biāo)記采用電泳分離，將該緩沖液換成適用于電泳的、具有較低鹽濃度的緩沖液則可獲得更好的性能。在該實(shí)施方式中，為代替直接將光敏劑連接到結(jié)合化合物如抗體上，裂解探針可包括兩種成分用捕獲部分衍生出的抗體(332)，例如生物素(圖3C中標(biāo)為“bio”)，和光敏劑膠珠(338)，該膠珠的表面用與捕獲部分如親和素或鏈親和素特異性結(jié)合的試劑(334)衍生得到。接著將復(fù)合物(330)通過光敏劑膠珠的捕獲部分，如生物素(336)來捕獲(335)。方便的是，如果選擇過濾膜的孔徑使得光敏劑膠珠(338)不能通過的話，則緩沖液交換還起到去除未結(jié)合的結(jié)合化合物的作用，這樣得到改進(jìn)的信號。如果需要的話，加入適當(dāng)?shù)挠糜诜蛛x的緩沖液之后，照射光敏劑膠珠(338)使得生成(342)單線態(tài)氧并釋放(344)分子標(biāo)簽。然后分離這種釋放的分子標(biāo)簽(346)形成分離圖像(352)，并根據(jù)峰(348)和(350)來參比定量二聚體。光敏劑膠珠可用于均勻或非均勻的測定相中。
優(yōu)選地，當(dāng)檢測分析物，如細(xì)胞表面受體或固定樣品中的抗原時(shí)，裂解探針可包含初級半抗原化抗體和用多個(gè)光敏劑分子衍生得到的次級抗半抗原結(jié)合蛋白。優(yōu)選的初級半抗原化抗體為生物素化抗體，優(yōu)選的次級抗半抗原結(jié)合蛋白可以是抗生物素抗體或鏈親和素。這種初級和次級反應(yīng)物的其他組合是本領(lǐng)域公知的，例如Hauland，Handbookof Fluorescent Probes and Research Reagents，第九版(MolecularProbes，Eugene，OR，2002)。這種反應(yīng)物的示范性組合如圖3E所示。具有可釋放標(biāo)簽(圖中是“mT1”和“mT2”)的結(jié)合化合物(366和368)，以及由生物素(369)衍生的初級抗(368)特異性地結(jié)合于膜(360)中受體二聚體(362)的不同表位上。生物素特異性結(jié)合蛋白(370)，例如鏈親和素，連接到生物素(369)上，將多個(gè)光敏劑(372)引入結(jié)合化合物(366和368)的有效近程內(nèi)。生物素特異性結(jié)合蛋白(370)還可以為抗生物素抗體，并且通過常規(guī)的偶聯(lián)化學(xué)方法，如Hermanson(引用如上)，可將光敏劑通過蛋白質(zhì)上的游離氨基基團(tuán)連接。這種用途的示范性光敏劑有，按Shimadzu等的歐洲專利公開0510688中所披露的方法制備的亞甲基藍(lán)的NHS酯。
測定條件下面對方法、特定條件和材料的大致論述出于示例目的而非限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)明白如何使這里所述的方法適用于其他的應(yīng)用，特別是采用不同樣品、細(xì)胞類型和靶復(fù)合物的應(yīng)用。
在實(shí)施本發(fā)明的方法中，混合測定成分，包括被測樣品、結(jié)合化合物、以及可選擇的裂解探針。一般來說，測定成分可以以任何順序混合。然而在一些應(yīng)用中，加入的順序會有關(guān)系。例如，有人希望監(jiān)測競爭性結(jié)合，例如在定量測定中?；蛘哂腥讼ＭO(jiān)測所組成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。在這些應(yīng)用中，可以分步進(jìn)行反應(yīng)，并且在全部混合物組合好之前，或者在啟動裂解反應(yīng)之前可能需要溫育過程。
每種反應(yīng)試劑的數(shù)量通常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。測定中所用的樣品數(shù)量由存在的靶復(fù)合物的預(yù)測數(shù)量以及用于監(jiān)測測定信號的分離和檢測方法所決定。一般來說，所提供的結(jié)合化合物和裂解探針數(shù)量的摩爾數(shù)應(yīng)相對大于樣品中靶分子的預(yù)計(jì)數(shù)量，通常摩爾數(shù)應(yīng)過量至少1.5倍，更優(yōu)選過量10倍或更多。在特定應(yīng)用中，使用的濃度可較高或較低，根據(jù)結(jié)合劑的親和性和單個(gè)細(xì)胞上存在的靶分子預(yù)計(jì)數(shù)目而定。在測定化學(xué)化合物對形成寡聚細(xì)胞表面復(fù)合物的作用的情況下，該化合物可以在加入探針之前，同時(shí)或之后加入，根據(jù)被監(jiān)測的作用而定。
在用于將探針連接到細(xì)胞表面分子的條件下，混合并溫育測定混合物，通常是在水溶液介質(zhì)中，一般在生理pH(類似培養(yǎng)細(xì)胞的pH)下，通過濃度在大約10至200mM范圍內(nèi)的緩沖液來保持。可采用常見的緩沖液，以及所需的其他常見添加劑，例如鹽類、培養(yǎng)基、穩(wěn)定劑等。通常采用生理和恒定的溫度。溫育溫度的正常范圍在大約4°至70℃，一般在大約15°至45℃，更常見的在25°至37℃。
測定混合物組成并進(jìn)行溫育使探針結(jié)合到細(xì)胞表面分子上之后，處理該混合物以活化裂解劑，從而將裂解劑有效近程內(nèi)的標(biāo)簽從結(jié)合化合物上裂解下來，將相應(yīng)的標(biāo)簽從細(xì)胞表面釋放到溶液中。該處理的性質(zhì)取決于裂解劑的作用機(jī)制。例如，在采用光敏劑作為裂解劑的情況下，裂解活化包括在適用于所使用的特定敏化劑的波長光下照射該混合物。
裂解之后，接著分析樣品以測定被釋放的標(biāo)記身份。在采用多個(gè)結(jié)合化合物的情況下，其檢測之前通常要對所釋放的標(biāo)記進(jìn)行分離。分離和檢測的方法在設(shè)計(jì)用于該測定的標(biāo)記的過程中已確定。優(yōu)選的分離方式是采用電泳法，即根據(jù)其電泳遷移率的已知差異來分離各種標(biāo)記。
如上所述，在一些實(shí)施方式中，如果測定反應(yīng)的條件可能干擾所采用分離技術(shù)，就需要在裂解和分離分子標(biāo)簽之前去除或改變測定反應(yīng)緩沖液。例如，測定條件可包括鹽濃度(例如特異性結(jié)合所需的)，當(dāng)在電泳遷移率基礎(chǔ)上分離分子標(biāo)簽時(shí)其會降低分離性能。因此，可去除這種高鹽緩沖液，例如在裂解分子標(biāo)簽之前，并通過過濾、抽吸、稀釋或其他的手段用另一種適合電泳分離的緩沖液替換。
實(shí)施例實(shí)施例中所使用的材料來源對Her受體具有特異性的抗體、適配體分子、以及標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)可從市場供應(yīng)商處購得，包括Labvision，Cell SignalingTechnology和BD Biosciences。所有細(xì)胞系從ATCC處購得。所有的人類速凍組織樣品購自William Baibridhe Genome Foundation(Seattle，WA)或者Bio Research Support(Boca Raton，F(xiàn)L)，并通過了供應(yīng)商處的Institutional Reseach Board(IRB)認(rèn)可。
以下所使用的分子標(biāo)簽-抗體偶聯(lián)物由分子標(biāo)簽的NHS酯與指示抗體上的游離氨基通過常規(guī)的步驟反應(yīng)而形成。分子標(biāo)簽，以下標(biāo)記為名稱“Pro_N”，在以下參考文獻(xiàn)中有披露Singh等的美國專利公開2003/017915和2002/0013126，引入其作為參考。簡而言之，下面的結(jié)合化合物是由分子標(biāo)簽的NHS酯與抗體的游離氨基通過常規(guī)反應(yīng)形成的分子標(biāo)簽-單克隆抗體偶聯(lián)物。
實(shí)施例1對細(xì)胞裂解物的Her-2異型二聚化和受體磷酸化的分析在該實(shí)施例中，測定了來自于幾個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物中的Her1-Her2和Her2-Her3異型二聚體和磷酸化狀態(tài)，該細(xì)胞系用多種濃度的表皮生長因子(EGF)和heregulin(HRG)進(jìn)行了處理。采用了三種結(jié)合化合物和裂解探針進(jìn)行測量，如下所述。
樣品制備1.血清饑餓的乳腺癌細(xì)胞系在使用前培養(yǎng)過夜。
2.37℃下在培養(yǎng)基中用EGF和/或HRG刺激細(xì)胞系10分鐘。除BT20之外對所有細(xì)胞系(例如MCF-7，T47D，SKBR-3)EGF/HRG的劑量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM，對BT20的最大劑量應(yīng)增大到500nM，因?yàn)橛?00nM的EGF不會達(dá)到飽和。
3.抽吸培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到冰上，并加入裂解緩沖液以裂解原位細(xì)胞。
4.刮取并轉(zhuǎn)移裂解物至微離心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微離心10min。(可選擇進(jìn)行離心)5.收集上清液作為裂解產(chǎn)物，分裝儲存于-80℃待使用。
測定測定設(shè)計(jì)如圖4A中圖解所示，根據(jù)裂解探針(902)和結(jié)合化合物(904)、(906)和(908)的結(jié)合，來參比定量Her2-Her3異型二聚體(900)。將標(biāo)記為“PS”的光敏劑通過親和素-生物素連接物連接到裂解探針(902)上，并用分子標(biāo)簽Pro14、Pro10和Pro11分別標(biāo)記結(jié)合化合物(904)、(906)和(908)。結(jié)合化合物(904)對Her3上的磷酸化位點(diǎn)具有特異性。
總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調(diào)整到30ul。抗體用裂解緩沖液稀釋至10ul。典型地，每個(gè)反應(yīng)中使用相當(dāng)于～5000至15000個(gè)細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。檢測極限為等價(jià)于～1000細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。
步驟反應(yīng)中預(yù)先混合的結(jié)合化合物(即分子標(biāo)簽的或生物素-抗體偶聯(lián)物)的最終濃度Pro4_抗Her-20.1ug/mlPro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml
生物素_抗Her-21-2ug/ml1.向測定的96孔中加入10ul抗體混合物到30ul的裂解物中并室溫下溫育1小時(shí)。
2.加入2ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度2ug/孔)到測定的孔中并溫育45min。
3.加入150ul的PBS與1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室溫下溫育1hr用以阻斷。
4.通過真空吸引器抽空過濾板。將測定反應(yīng)轉(zhuǎn)移到過濾板上并施加負(fù)壓抽空。
5.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
6.加入200ul照射緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
7.加入30ul照射緩沖液并照射20分鐘。
8.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析，采用22cm毛細(xì)管的ABI3100CE儀(注射條件5kV，75sec，30℃；運(yùn)行條件600sec，30℃)。
測定緩沖液如下裂解緩沖液(新制作并在冰上保存)終濃度ul 儲存量1％TritonX-100 1000 10％20mM Tris-HCl(pH7.5) 2001M100mM NaCl 2005M50mM NaF 5001M50mM β-甘油磷酸Na 1000 0.5M1mM Na3VO41000.1M5mM EDTA 1000.5M10ug/ml胃蛋白酶抑制劑1001mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制劑(#1836170) N/AN/A水6500 N/A共計(jì)10ml
洗滌緩沖液(4℃儲存)終濃度ul儲存量1％NP-405010％1xPBS 5010x150mM NaCl 155M5mM EDTA5 0.5M水380 N/A共計(jì)500ml照射緩沖液終濃度ul儲存量0.005xPBS 501xCE標(biāo)準(zhǔn) 3 100x10mM Tris-HCl(pH8.0) 0.1M10pM A160 1nM10pM A315 1nM10pM HABA 1nM水10000 N/A共計(jì)10ml數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的相對熒光單位(RFU)信號按照CE參考標(biāo)準(zhǔn)A315(一種熒光素衍生的脫氧腺苷單磷酸，其已知峰位置與根據(jù)電泳分離的測定中的分子標(biāo)簽相關(guān))而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.從相應(yīng)的分子標(biāo)簽信號中減去“無裂解產(chǎn)物”本底對照的RFU。
3.報(bào)告Her-1或Her-3的異型二聚化程度，作為相應(yīng)的RFU與來自于使用生物素抗-Her-2的測定孔中的Pro4_抗-Her-2RFU的參比。
4.報(bào)告Her-1，2，3的受體磷酸化程度，作為Pro2_PT100抗-磷-Tyr的RFU與來自于使用生物素抗-Her-2的測定孔中的Pro4_抗-Her-2RFU的參比。
測定結(jié)果如圖4B-4H所示，圖4B表示Her1-Her2異型二聚體的數(shù)量隨著EGF濃度的增加而在MCF-7細(xì)胞上增加，而同樣的二聚體的數(shù)量隨著HRG濃度的增加基本上沒有變化。圖4C表示了Her2-Her3異型二聚體上的相反結(jié)果。也就是說，Her2-Her3異型二聚體的數(shù)量隨著HRG濃度的增加而在MCF-7細(xì)胞上增加，而同樣的二聚體的數(shù)量隨著EGF濃度的增加基本上沒有變化。圖4D和4E表示Her1-Her2異型二聚體的數(shù)量隨著EGF濃度的增加而分別在SKBR-3細(xì)胞和BT-20細(xì)胞上增加。
實(shí)施例2對組織裂解物的Her-2異型二聚化和受體磷酸化的分析在該實(shí)施例中，測定了來自于人類乳腺癌樣本的組織裂解物中的Her1-Her2和Her2-Her3異型二聚體和磷酸化狀態(tài)。
樣品制備1.通過切割在冷凍狀態(tài)下機(jī)械破碎速凍組織。
2.將組織轉(zhuǎn)移至微離心管中并加入3x組織體積的裂解緩沖液(附錄I)，然后攪拌以使組織分散在緩沖液中。
3.冰育30min并不時(shí)攪拌混勻。
4. 14000rpm，4℃下離心20min。
5.收集上清液作為裂解產(chǎn)物并使用一小份通過BCA測定實(shí)驗(yàn)(Pierce)來確定總蛋白質(zhì)濃度6.分裝剩余物質(zhì)以儲存于-80℃待使用。
測定設(shè)計(jì)1.總測定體積為40ul。
2.測試裂解物，其成連續(xù)的滴定系列40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31ug的總等價(jià)物，并用裂解緩沖液將體積調(diào)整到30ul。來自該滴定系列的數(shù)據(jù)證實(shí)了二聚化或磷酸化信號的特異性。
3.包含所有稀釋在裂解緩沖液中的eTAg-抗體的通用抗體混合物在以下濃度下使用。
4.將針對每個(gè)受體的單獨(dú)的生物素-抗體分別加入反應(yīng)中。
5.用每個(gè)組織裂解物進(jìn)行三種eTag測定，每種使用不同的對應(yīng)于被測特定受體二聚化的生物素-抗體。
6.測定含有該受體特異性生物素-抗體的不同測定中每種受體的表達(dá)水平。
7.僅在含有生物素-抗Her-2的測定中參比測定二聚化和磷酸化信號。
測定對照用MCF-10A和MCF-7細(xì)胞系分別作為陰性和陽性的定性對照。細(xì)胞系要么未受刺激，要么用100nM EGF或100mM HRG刺激。當(dāng)替換組織樣品時(shí)，包括了裂解緩沖液作為本底對照。
反應(yīng)中預(yù)先混合的抗體的最終濃度通用抗體混合物Pro4_抗Her-20.1ug/mlPro10_抗Her-10.05ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.01ug/ml單獨(dú)的生物素抗體生物素_抗Her-12ug/ml生物素_抗Her-22ug/ml生物素_抗Her-32ug/ml步驟1.向通用抗體混合物中加入生物素抗體以制備抗體反應(yīng)混合物。
2.向測定的96孔中加入10ul通用反應(yīng)混合物到30ul的裂解物中并室溫下溫育1小時(shí)。
3.加入2ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度2ug/孔)到測定的孔中并溫育45min。
4.加入150ul的PBS與1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室溫下溫育1hr用以阻斷。
5.通過真空吸引器抽空過濾板。將測定反應(yīng)轉(zhuǎn)移到過濾板上并施加負(fù)壓抽空。
6.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
7.加入200ul照射緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
8.加入30ul照射緩沖液并照射20分鐘。
9.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析，采用22cm毛細(xì)管的ABI3100毛細(xì)管電泳儀(注射條件5kV，75sec，30℃；運(yùn)行條件600sec，30℃)。
數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的RFU信號按照CE參考標(biāo)準(zhǔn)A315而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.測定RFU的截止值(分別針對二聚化或磷酸化程度)，不計(jì)算其之下的比例，因?yàn)樾盘栔堤投豢煽?。在該截止值之下，被測裂解稀釋液系列中的RFU信號不可滴定?？捎妙A(yù)計(jì)二聚化和磷酸化信號不存在或非常低的一大組正常組織來測定該值。這些值還代表將與腫瘤組織進(jìn)行比較的正常組織上二聚化或磷酸化的基本水平。
3.如果有的話，為了監(jiān)測RFU值高于截止值的正常組織，確定所測Her-1或Her-3異型二聚化或磷酸化峰的單獨(dú)RFU水平和參比讀數(shù)。這些樣品代表異常值，記錄時(shí)其應(yīng)當(dāng)被用作對相應(yīng)腫瘤組織樣品相匹配的供體對照。
4.對所有表現(xiàn)出可滴定RFU信號的腫瘤樣品，采用每個(gè)Her-1、Her-2、Her-3或者組織裂解物滴定系列的磷酸化程度的最低信號作為本底。從高劑量裂解物(如40ug)的分子標(biāo)簽中減去該本底以得到特異RFU信號。如果滴定系列中沒有信號劑量響應(yīng)，則將所有的信號(通常非常低)看作本底并且沒有特異性信號能用作參比分析。
5.報(bào)告Her-1或Her-3的異型二聚化程度，作為相應(yīng)的特異RFU與來自于Pro4_抗-Her-2的特異RFU的參比。如果沒有獲得特異RFU的話，則二聚化程度為陰性。
6.報(bào)告Her-1，2，3的受體磷酸化程度，作為Pro2-抗磷-Tyr的特異性RFU與來自于Pro4-抗Her-2的特異性RFU的參比。如果沒有獲得特異RFU的話，則磷酸化程度為陰性。
圖5A-5C中所示的數(shù)據(jù)代表用本發(fā)明的測定測得的多個(gè)患者的乳腺組織樣品。來自于免疫組織化學(xué)(DAKO Herceptest)的臨床Her-2狀況在10個(gè)腫瘤樣品中有9個(gè)為陰性，表明要么沒檢測到Her-2著色，要么小于10％的腫瘤細(xì)胞著色，或者大于10％的腫瘤細(xì)胞的部分細(xì)胞膜上著色微弱幾乎不可見。本發(fā)明的測定實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定了正常和腫瘤組織上的Her-1、Her-2和Her-3表達(dá)。Her-1與Her-2和Her-2與Her-3的異型二聚化程度僅在腫瘤組織中檢測到，在任何正常組織中都未測得。
實(shí)施例3對細(xì)胞裂解物的Her1或Her2同型二聚化和受體磷酸化的分析樣品制備的操作基本上如實(shí)施例2中所描述。用EGF和TGFα處理細(xì)胞系以引起Her1的同型二聚化。對于不具有配體的Her2的同型二聚化，將過表達(dá)Her2的未受刺激SKBR-3或MDA-MD453細(xì)胞與低水平表達(dá)Her2的未受刺激MCF-7細(xì)胞相比較。
測定設(shè)計(jì)將對受體具有特異性的單克隆抗體分別與分子標(biāo)簽或生物素偶聯(lián)(生物素偶聯(lián)后再通過親和素橋與光敏劑連接)，使得裂解探針和結(jié)合化合物競爭性結(jié)合該實(shí)施例中同樣的表位。使用的另一種結(jié)合化合物包括能識別受體上重疊表位的第二抗體，這樣可生成參比信號作為同型二聚化的測量值。從第二抗體中得到的信號還提供了樣品中受體總量的測量值。受體總量在單獨(dú)的測定孔中測定。受體磷酸化可以和同型二聚化或總受體數(shù)量一起定量測定。
步驟測定體積為40ul，主要步驟類似于實(shí)施例2。對每個(gè)樣品建立兩個(gè)測定孔A和B以便分別定量二聚化程度和受體總量。
對于Her1-Her1同型二聚體的定量測定孔A中的抗體混合物終濃度Pro12_抗Her-10.05-0.1ug/ml
生物素_抗Her-11-2ug/ml測定孔B中的抗體混合物終濃度Pro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/ml對于Her2-Her2同型二聚體的定量測定孔A中的抗體混合物終濃度Pro4_抗Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/ml測定孔B中的抗體混合物終濃度Pro4_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/m1數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的RFU信號按照CE參考標(biāo)準(zhǔn)A315而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.從相應(yīng)的分子標(biāo)簽信號中減去“無裂解產(chǎn)物”本底對照的RFU。
3.報(bào)告Her-1或Her-2的同型二聚化程度，作為測定孔A中相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化RFU與測定孔B中相應(yīng)的總受體數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化RFU的參比。
4.報(bào)告Her-1或Her-2同型二聚體的受體磷酸化程度，作為測定孔B中Pro2_PT100抗磷-Tyr的標(biāo)準(zhǔn)化RFU與來自于同一測定孔B中的總受體數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化RFU的參比。
測定結(jié)果如圖6A-6B和圖7所示，圖6A表示Her1-Her1同型二聚體的數(shù)量隨著EGF濃度的增加而在BT-20細(xì)胞上增加。圖6B表示BT-20細(xì)胞中Her1磷酸化的數(shù)量隨著EGF濃度的增加而增加。通過比較表達(dá)Her2的SKBR-3細(xì)胞中的信號與細(xì)胞表面上Her2表達(dá)水平降低的MCF-7細(xì)胞中的信號，證實(shí)了對Her2-Her2同型二聚體的檢測。如圖7所示的圖表中，用MCF-7細(xì)胞沒有檢測到特異的可滴定Her2-Her2同型二聚體信號，而來自SKBR-3細(xì)胞的Her2-Her2同型二聚體信號清楚地位于來自MCF-7細(xì)胞的信號之上。
實(shí)施例4對細(xì)胞裂解物的Her-1-Her3異型二聚化和受體磷酸化的分析樣品制備如下1.血清饑餓的乳腺癌細(xì)胞系在使用前培養(yǎng)過夜。
2.37℃下在培養(yǎng)基中用HRG刺激細(xì)胞系10分鐘。對于T47D細(xì)胞HRG的劑量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.抽吸培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到冰上，并加入裂解緩沖液以裂解原位細(xì)胞。
4.刮取并轉(zhuǎn)移裂解物至微離心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微離心10min。(可選擇進(jìn)行離心)5.收集上清液作為裂解產(chǎn)物，分裝儲存于-80℃待使用。測定設(shè)計(jì)總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調(diào)整到30ul?？贵w用裂解緩沖液稀釋至5ul。典型地，每個(gè)反應(yīng)中使用相當(dāng)于～5000至15000個(gè)細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。反應(yīng)中預(yù)先混合的抗體的最終濃度Pro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-31-2ug/ml1.向測定的96孔中加入5ul抗體混合物到30ul的裂解物中并室溫下溫育1小時(shí)。
2.加入5ul的鏈親和素衍生的分子剪(molecular scissor)(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育45min。
3.加入150ul的PBS與1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室溫下溫育1hr用以阻斷。
4.通過真空吸引器抽空過濾板。將測定反應(yīng)轉(zhuǎn)移到過濾板上并施加負(fù)壓抽空。
5.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
6.加入200ul照射緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
7.加入30ul照射緩沖液并照射20分鐘。
8.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析，采用22cm毛細(xì)管的ABI3100毛細(xì)管電泳儀(注射條件5kV，425sec，30℃；運(yùn)行條件600sec，30℃)。
數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)eTag受體的RFU信號按照CE參考標(biāo)準(zhǔn)A315而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.從相應(yīng)的eTag受體信號中減去“無裂解產(chǎn)物”本底對照的RFU。
3.報(bào)告異型二聚化程度，作為Her-1衍生的Pro10RFU與來自抗-Her-3的Pro11RFU的參比。
4.報(bào)告Her-1/3受體磷酸化程度，作為來自Pro2_PT100抗-磷-Tyr的RFU與來自于使用生物素抗-Her-3的測定孔中的Pro11_抗-Her-3RFU的參比。
測定結(jié)果如圖8A和8B所示。數(shù)據(jù)表明Her1-Her3異型二聚化程度和二聚體磷酸化都程度隨著HRG濃度的增加而增加。
實(shí)施例5癌細(xì)胞系中Her1-Her3受體二聚體表達(dá)的增加以應(yīng)答表皮生長因子的增加在該實(shí)施例中，測定了來自于癌細(xì)胞系22Rv1和A549的細(xì)胞裂解物中的Her1-Her3異型二聚體，該細(xì)胞系用多種濃度的表皮生長因子(EGF)進(jìn)行了處理。采用了三種結(jié)合化合物和裂解探針進(jìn)行測量，如下所述。
樣品制備1.血清饑餓的乳腺癌細(xì)胞系在使用前培養(yǎng)過夜。
2.37℃下在培養(yǎng)基中用EGF刺激細(xì)胞系10分鐘。向兩個(gè)細(xì)胞系施加的EGF劑量例如在0-100nM之間改變。
3.抽吸培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到冰上，并加入裂解緩沖液以裂解原位細(xì)胞。
4.刮取并轉(zhuǎn)移裂解物至微離心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微離心10min。(可選擇進(jìn)行離心)。測定蛋白質(zhì)濃度。
5.收集上清液作為裂解產(chǎn)物，分裝儲存于-80℃待使用。
測定設(shè)計(jì)基本上與圖4A中所示相同，除了以下不同點(diǎn)之外結(jié)合化合物(904)、(906)和(908)分別用分子標(biāo)簽Pro10、Pro11和Pro2標(biāo)記?？倻y定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調(diào)整到30ul。抗體用裂解緩沖液稀釋至5ul。典型地，每個(gè)反應(yīng)中使用相當(dāng)于～5000至15000個(gè)細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。檢測極限為等價(jià)于～1000細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。步驟反應(yīng)中預(yù)先混合的結(jié)合化合物(即分子標(biāo)簽的或生物素的抗體偶聯(lián)物)的最終濃度Pro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1至0.2ug/ml生物素_抗Her-31-2ug/ml1.向測定的96孔中加入5ul抗體混合物到30ul的裂解物中并室溫下溫育1小時(shí)。
2.加入5ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育45min。
3.加入150ul的PBS與1％的BSA至96孔滴定板(Mi11iporeMAGVN 2250)中并在室溫下溫育1hr用以阻斷。
4.通過真空吸引器抽空過濾板。將測定反應(yīng)轉(zhuǎn)移到過濾板上并施加負(fù)壓抽空。
5.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
6.加入200ul照射緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
7.加入30ul照射緩沖液并照射20分鐘。
8.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析，采用22cm毛細(xì)管的ABI3100CE儀(注射條件5kV，70sec，30℃；運(yùn)行條件425sec，30℃)。
測定緩沖液如下裂解緩沖液(新制作并在冰上保存)終 濃 度ul 儲存量1％ Triton X-1001000 10％20mM Tris-HCl(pH7.5) 5001M100 mM NaCl2005M50 mM NaF5001M50mM β-甘油磷酸Na5001.0M1 mM Na3VO41000.1M5 mM EDTA1000.5M10ug/ml 胃蛋白酶抑制劑100 1mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制劑(#1836170)N/AN/A水7ml N/A共計(jì)10ml
洗滌緩沖液(4℃儲存)1x PBS中0.5％Triton X-100照射緩沖液終 濃 度ul儲存量0.005xPBS50 1xCE標(biāo)準(zhǔn)1(A27，ACLARA Biosciences，Inc.，Mountain View，CA)4 5000xCE 標(biāo)準(zhǔn)2(熒光素)4 5000x水9942 N/A共計(jì)10ml數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的相對熒光單位(RFU)信號按照CE參考標(biāo)準(zhǔn)2而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.從相應(yīng)的分子標(biāo)簽信號中減去“無裂解產(chǎn)物”本底對照的RFU。
3.報(bào)告Her-1的異型二聚化程度，作為相應(yīng)的RFU與來自于使用生物素抗-Her-3的測定孔中的Pro11_抗-Her-3RFU的參比。
4.報(bào)告Her-1，2，3的受體磷酸化程度，作為Pro2_PT100抗-磷-Tyr的RFU與來自于使用生物素抗-Her-3的測定孔中的Pro11_抗-Her-3RFU的參比(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖9A和9B表示Her1-Her3異型二聚體的數(shù)量隨著EGF濃度的增加分別在22Rv1和A549細(xì)胞上增加。
實(shí)施例6乳腺腫瘤組織裂解物中出現(xiàn)的具Her1、Her2和Her3的IGF-1R異型二聚體在該實(shí)施例中，采用了與圖4A中所示基本上相同的測定試驗(yàn)，測定了來自于12個(gè)不同人類乳腺腫瘤組織細(xì)胞中Her1-IGF-1R、Her2-IGF-1R和Her3-IGF-1R二聚體的存在。樣品制備操作如下1.通過切割在冷凍狀態(tài)下機(jī)械破碎速凍組織。
2.將組織轉(zhuǎn)移至微離心管中并加入3x組織體積的裂解緩沖液，然后攪拌以使組織分散在緩沖液中。
3.冰育30min并不時(shí)攪拌混勻。
4. 14000rpm，4℃下離心20min。
5.收集上清液作為裂解產(chǎn)物并使用一小份通過BCA測定實(shí)驗(yàn)(Pierce)來確定總蛋白質(zhì)濃度6.分裝剩余物質(zhì)以儲存于-80℃待使用。
測定試驗(yàn)建立如下1.總測定體積為40ul。
2.測定裂解物，其成連續(xù)的滴定系列40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31ug的總等價(jià)物，并用裂解緩沖液將體積調(diào)整到30ul。來自該滴定系列的數(shù)據(jù)證實(shí)了二聚化的特異性。
3.包含稀釋于裂解緩沖液中的所有結(jié)合化合物和生物素抗體的通用抗體混合物在以下濃度下使用。
反應(yīng)中預(yù)先混合的抗體的最終濃度Pro10_抗Her-20.1ug/mlPro14_抗Her-10.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro7_抗IGF-1R0.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.2ug/ml生物素_抗Her-22ug/ml步驟1.向測定的96孔中加入5ul通用反應(yīng)混合物到30ul的裂解物中并室溫下溫育1小時(shí)。
2.加入5ul的鏈親和素衍生的分子剪，即裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育45min。
3.加入150ul的PBS與1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室溫下溫育1hr用以阻斷。
4.通過真空吸引器抽空過濾板。將測定反應(yīng)轉(zhuǎn)移到過濾板上并施加負(fù)壓抽空。
5.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
6.加入200ul照射緩沖液并施加負(fù)壓抽空。重復(fù)一次。
7.加入30ul照射緩沖液并照射20分鐘。
8.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析，采用(i)CE儀ABI3100，22cm毛細(xì)管，(ii)CE注射條件5kV，70sec，30℃，(iii)CE運(yùn)行條件425sec，30℃。
數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的RFU信號按照CE參考標(biāo)準(zhǔn)1而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.尋找每個(gè)分子標(biāo)簽的可滴定信號。不能滴定的信號假定為非特異性信號并且不能用于數(shù)據(jù)解析。根據(jù)預(yù)計(jì)二聚化信號不存在或非常低的一大組正常組織來測定截止值。這些值還代表了將與腫瘤組織進(jìn)行比較的正常組織上的二聚化基本水平。
3.報(bào)告IGF-1R與Her-1或Her-2或Her-3的異型二聚化程度作為相應(yīng)的RFU。
測定的十二個(gè)乳腺腫瘤中有兩個(gè)表達(dá)了Her1-IGF-1R、Her2-IGF-1R和Her3-IGF-1R異型二聚體，如圖10A-C中所示。各圖面中的線條表明被測受體異型二聚體量和對指示異型二聚體呈陽性的兩個(gè)乳腺腫瘤樣品中所測裂解物的量之間的走向。
實(shí)施例7PI3K/Her-3受體活化復(fù)合物在該實(shí)施例中，測定設(shè)計(jì)如圖11A和11C中所示，用以測定乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中包含Her2、Her3和PI3K的受體復(fù)合物。具有第一分子標(biāo)簽(圖中為“mT1”，以下為“eTag1”)結(jié)合化合物(1106)對Her3受體(1102)的胞外區(qū)域具有特異性，具有第二分子標(biāo)簽(圖中為“mT2”，以下為“eTag2”)結(jié)合化合物(1110)對PI3K蛋白(1100)的p185成分(1111)具有特異性，而連接有光敏劑的裂解探針(1108)對Her3受體(1102)的胞內(nèi)區(qū)域具有特異性，其中“H2”表示Her2受體(1104)，“H3”表示Her3受體(1102)，“p85”和“p110”為PI3激酶(1100)的成分，其通過其p85部分結(jié)合于H3的磷酸化位點(diǎn)(表示為“P”)。這兩個(gè)測定設(shè)計(jì)類似，除了圖11A的設(shè)計(jì)中裂解探針特異于Her3受體，而圖11C的設(shè)計(jì)中裂解探針特異于PI3激酶的p85成分之外。該測定操作如下。
樣品制備1.血清饑餓的乳腺癌細(xì)胞系在使用前培養(yǎng)過夜。
2. 37℃下在培養(yǎng)基中用HRG刺激細(xì)胞系10分鐘。用于MCF-7細(xì)胞的HRG劑量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.抽吸培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到冰上，并加入如上所述的裂解緩沖液以裂解原位細(xì)胞。
4.刮取并轉(zhuǎn)移裂解物至微離心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微離心10min。
5.收集上清液作為裂解產(chǎn)物，分裝儲存于-80℃待使用。裂解緩沖液(新制作并在冰上保存)終濃 度ul儲存量1％ Triton X-1001000 10％20mM Tris-HCl(pH 7.5) 2001M100 mM NaCl200 5M50mM NaF500 1M50 mMβ-甘油磷酸 Na1000 0.5M
1 mMNa3VO41000.1M5 mMEDTA1000.5M10 ug/ml胃蛋白酶抑制劑1001mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制劑(#1836170)N/AN/A水6500 N/A共計(jì)10ml測定設(shè)計(jì)根據(jù)各圖中所示的圖解來參比定量受體復(fù)合物的形成。也就是說，測定讀數(shù)是分子標(biāo)簽eTag2/eTag1的峰值比。
總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調(diào)整到10ul?？贵w用裂解緩沖液稀釋至20ul。典型地，每個(gè)反應(yīng)中使用相當(dāng)于～5000至500000個(gè)細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。
步驟在加入反應(yīng)之前預(yù)先混合的抗體工作濃度為對于在Her-3處具有裂解探針的Her-3/PI3K復(fù)合物(圖11A的設(shè)計(jì))eTag1_抗Her-3為10nM(該測定中eTag1為Pro14)eTag2_抗PI3K為10nM(該測定中eTag2為Pro1)生物素_抗Her-3為20nM通用標(biāo)準(zhǔn)US-1為700nM[所述通用標(biāo)準(zhǔn)US-1為偶聯(lián)著生物素和分子標(biāo)簽Pro8的BSA，其用于使測定中鏈親和素-光敏劑膠珠的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化]。利用常規(guī)技術(shù)例如Hermanson(引用如上)使分子標(biāo)簽前體的NHS-酯與抗體上的游離氨基反應(yīng)，從而使分子標(biāo)簽直接連接到抗體上。
對于在PI3K處具有裂解探針的Her-3/PI3K復(fù)合物(圖11C的設(shè)計(jì))eTag1_抗PI3K為10nM(該測定中eTag1為Pro1)
eTag2_抗Her-3為10nM(該測定中eTag2為Pro14)生物素_抗PI3K為20nM通用標(biāo)準(zhǔn)US-1為700nM9.向測定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗體混合物到10ul的裂解物中并4℃下溫育1小時(shí)。
10.加入10ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育40min。
11.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。
12.加入30ul照射緩沖液并照射。
13.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析。
數(shù)據(jù)分析1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的相對熒光單位(RFU)信號按照其國際通用標(biāo)準(zhǔn)US-1而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化eTag受體信號中減去“無裂解產(chǎn)物”本底對照的RFU。
3.報(bào)告受體復(fù)合物的形成，作為標(biāo)準(zhǔn)化eTag2/eTag1信號的參比(如圖11B和11D所示)。
實(shí)施例8Shc/Her-3受體-適配體相互作用在該實(shí)施例中，測定設(shè)計(jì)如圖12A和12C中所示。圖12A中，Her2受體(1200)和Her3受體(1202)在細(xì)胞表面膜(1204)中形成二聚體，并且所表示的每個(gè)受體都具有磷酸化位點(diǎn)(1209和1210)。Shc蛋白(1206和1208)分別結(jié)合于磷酸化位點(diǎn)(1210)和(1209)上。第一結(jié)合化合物(1214)和裂解探針(1216)對Her2受體(1200)胞外區(qū)域的不同抗原決定簇具有特異性。第二結(jié)合化合物(1212)對Shc蛋白(1206和1208)具有特異性。圖12A和12C的測定設(shè)計(jì)類似，除了圖12A的設(shè)計(jì)中裂解探針特異于Her2受體，而圖12C的設(shè)計(jì)中裂解探針特異于Her3受體之外。因此，在前一種情況中，測定了總的Her2受體，而后一種情況中測定了總的Her3受體。測定操作如下。樣品的制備操作如上(實(shí)施例7)。
測定設(shè)計(jì)根據(jù)各圖中所示的圖解來參比定量受體復(fù)合物的形成。也就是說，圖12B和12D中，測定讀數(shù)是作為HRG濃度的函數(shù)的mT2/mT1峰值比。
總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調(diào)整到10ul?？贵w用裂解緩沖液稀釋至20ul。典型地，每個(gè)反應(yīng)中使用相當(dāng)于～5000至500000個(gè)細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。
步驟在加入反應(yīng)之前預(yù)先混合抗體工作濃度為對于在Her-3處具有裂解探針的Her-3/Shc復(fù)合物(圖12B的設(shè)計(jì))eTag1_抗Her-3為10nM(該測定中eTag1為Pro14)eTag2_抗Shc為10nM(該測定中eTag2為Pro12)eTag3_抗磷-Tyr為10nM(該測定中eTag3為Pro2)生物素_抗Her-3為20nM通用標(biāo)準(zhǔn)US-1為700nM對于在Her-2處具有裂解探針的Her-2/Shc復(fù)合物(圖12A的設(shè)計(jì))eTag1_抗Her-2為10nM(該測定中eTag1為Pro14)eTag2_抗Shc為10nM(該測定中eTag2為Pro12)eTag3_抗磷-Tyr為10nM(該測定中eTag3為Pro2)生物素_抗Her-2為20nM通用標(biāo)準(zhǔn)US-1為700nM1.向測定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗體混合物到10ul的裂解物中并4℃下溫育1小時(shí)。
2.加入10ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育40min。
3.加入200ul洗滌緩沖液并施加負(fù)壓抽空。
4.加入30ul照射緩沖液并照射。
5.轉(zhuǎn)移每個(gè)反應(yīng)中10ul至CE測定板上分析。
數(shù)據(jù)分析
1.使每個(gè)分子標(biāo)簽的相對熒光單位(RFU)信號按照其國際通用標(biāo)準(zhǔn)US-1而標(biāo)準(zhǔn)化。
2.從分子標(biāo)簽相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化信號中減去“無裂解產(chǎn)物”本底對照的RFU。
3.報(bào)告受體復(fù)合物的形成，作為標(biāo)準(zhǔn)化mT2/mT1信號的參比(如圖12B和12D所示)，以及受體磷酸化程度(數(shù)據(jù)未示出)作為mT3/mT1信號。
實(shí)施例9乳腺腫瘤樣品中Her2-Her 3異型二聚體測量值與Her3-PI3K復(fù)合物測量值之間的關(guān)系在該實(shí)施例中，利用上述方法分別測定人類乳腺腫瘤樣品以確定Her2-Her3異型二聚體的數(shù)量和Her3-PI3K復(fù)合物的數(shù)量。圖13表示了從該測定中獲得的數(shù)據(jù)，表明這兩個(gè)測量值有關(guān)聯(lián)。
實(shí)施例10乳腺腫瘤裂解物和正常組織裂解物中Her1-Her2和Her2-Her3異型二聚體的表達(dá)冷凍的人類乳腺腫瘤樣品和正常組織樣品來自WilliamBainbridge Genomic Foundation(Bainbridge Island，WA)。測定形式如圖3E中所示，在32個(gè)腫瘤組織樣品和30個(gè)正常組織樣品中進(jìn)行。腫瘤組織由腫瘤和正常細(xì)胞的混合物構(gòu)成，根據(jù)供應(yīng)商提供組織的病理學(xué)數(shù)據(jù)，正常組織占大約25％至90％以上。樣品制備和實(shí)施測定基本上如實(shí)施例2和6中所描述。報(bào)告的數(shù)據(jù)是根據(jù)峰面積或者從結(jié)合化合物中釋放的分離分子標(biāo)簽的強(qiáng)度，所述結(jié)合化合物特異性地結(jié)合于與裂解探針相對的受體，即相應(yīng)于圖3E中“mT1”的分子標(biāo)簽。不需要標(biāo)準(zhǔn)化根據(jù)樣品中腫瘤細(xì)胞百分?jǐn)?shù)而產(chǎn)生的信號值。
從這些測定中得到的數(shù)據(jù)如圖14A(Her1-Her2異型二聚體測定值)和圖14B(Her2-Her3異型二聚體測定值)中所示，其中空心方塊(□)表示對腫瘤組織的測量值，實(shí)心菱形(◆)表示對正常組織的測量值。數(shù)據(jù)表明，相對于正常組織樣品細(xì)胞中的的表達(dá)，腫瘤組織樣品的基本片斷中的腫瘤細(xì)胞表達(dá)了大量的Her1-Her2異型二聚體和Her2-Her3異型二聚體。
實(shí)施例11福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品中的受體二聚體測定在該實(shí)施例中，測定由球狀細(xì)胞系制成的典型固定組織中是否存在Her受體二聚體。對異型二聚體的測定設(shè)計(jì)與圖4A中所述的基本上相同，除了以下所述的不同點(diǎn)之外。也就是說，采用了四種成分(i)包括偶聯(lián)著裂解引發(fā)部分(該實(shí)施例中是光敏劑衍生的鏈親和素，如圖3E所示)并對二聚體中的一種受體具有特異性的生物素化單克隆抗體的裂解探針，(ii)由第一分子標(biāo)簽衍生出的單克隆抗體，其對受體的特異性相同于裂解探針，(iii)由第二分子標(biāo)簽衍生出的單克隆抗體，其對受體的特異性相反于裂解探針，以及(iv)用第三分子標(biāo)簽衍生出的單克隆抗體，其對胞內(nèi)磷酸化酪氨酸具有特異性。對同型二聚體的測定設(shè)計(jì)基本上與圖1D中所述相同，除了以下所述的不同點(diǎn)之外。
在每種情況下，典型的固定組織制備如下用EGF或者HRG刺激組織培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞，如前面實(shí)施例中所述，之后將其洗滌并刮取。離心所取下的細(xì)胞以形成球狀，然后加入福爾馬林并在4℃下將混合物溫育過夜。用Miles Tissue Tek III Embedding Center在石蠟中包埋該固定球，之后用顯微切片機(jī)(Lecia 2145型)從該球上切下10μm的組織切片。將組織切片放置在帶正電的玻璃顯微載玻片上(通常每片上有多個(gè)組織切片)并在60℃下烘烤1hr。
對載玻片上的組織切片測定如下用EZ-Dewax試劑(Biogenex，San Ramon CA)采取制造商推薦的方法脫去載玻片上組織切片的石蠟。簡而言之，向每個(gè)組織切片中加入500μL EZ-Dewax并在室溫下溫育該切片5min，之后用70％的EtOH洗滌該載玻片。重復(fù)該步驟并最后用去離子水沖洗該載玻片，之后將該載玻片在室溫下水中溫育20min。接著將載玻片浸入pH10的1X Antigen Retrieval溶液(Biogenesis，Brentwood，NH)，之后在微波爐中加熱15min(高功率設(shè)定下5min然后在低功率設(shè)定下10min)。冷卻到室溫后(大約45min)將載玻片放在水中水浴5min，然后干燥。將干燥載玻片上的組織切片用疏水蠟筆圈上從而形成了能夠容納置于組織切片上的試劑的區(qū)域(如圖1H-1I所示)，之后在1X Perm/Wash(BDBiosciences)中洗滌載玻片三遍。向每個(gè)切片加入50-100μL阻斷緩沖液，將該載玻片放在含有去離子水的封閉潮濕盒子中4℃下2hr，之后通過抽吸去掉各切片中的阻斷緩沖液。(阻斷緩沖液為含有蛋白酶抑制劑(Roche)、磷酸酶抑制劑(氟化鈉、釩酸鈉、β-磷酸甘油)和10％鼠血清的1X Perm/Wash溶液)。向各切片加入含有結(jié)合化合物和裂解探針的抗體混合物(每種5μg/mL，除了Her1-Her2測定中生物素-Ab5(抗Her1)為10μg/mL之外)，并將載玻片放置在潮濕的盒子中4℃下過夜。然后用100μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的Perm/Wash洗滌切片三遍，之后加入50μL在1X Perm/Wash溶液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)中的光敏劑。接著將載玻片在黑暗潮濕的盒子中4℃下溫育1-1.5hr，之后在保持載玻片在黑暗中的同時(shí)通過抽吸去除光敏劑。當(dāng)保持在黑暗中時(shí)，接著將載玻片浸入.01X PBS中并冰育1hr。從PBS中取出載玻片，干燥，并向各切片加入40-50μL具有2pM熒光素的0.01X PBS，之后用高功率的激光二極管(GaAIAs IR發(fā)射器，型號OD-880W，OPTO DIODE CORP，Newbury Park，CA)照射1hr。熒光素作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)有助于將電泳圖上峰值與分子標(biāo)簽相關(guān)聯(lián)。照射之后，將包裹著各個(gè)組織切片的溶液用吸球輕柔地混勻并轉(zhuǎn)移到Applied Biosystems(Foster City，CA)3100型毛細(xì)管電泳儀上的CE板上進(jìn)行分析。
圖15A表示了對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468(ATCC登錄號no.HTB-132)的固定球切片中的Her1-Her1同型二聚體和受體磷酸化的分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞系由未受刺激的細(xì)胞或者以100nM EGF刺激的細(xì)胞制備而成。用2μg/mL生物素化的抗Her1單克隆抗體(Labvision)作為裂解探針(用于裂解亞甲藍(lán)衍生的鏈親和素(如上所述)，通過生物素連接)的一抗。用2μg/mL Pro10衍生的抗Her1單克隆抗體來測定同型二聚化的Her1。用0.8μg/mL Pro1衍生的抗Her1單克隆抗體(Labvision)來測定總Her1。反應(yīng)中還包含3.2μg/mL未標(biāo)記的抗體Ab-5。用0.5μg/mL Pro2衍生的單克隆抗體(抗磷酸化Tyr、Cell Signaling)來測定胞內(nèi)磷酸化程度。從固定組織測量獲得的數(shù)據(jù)證實(shí)并符合了在細(xì)胞裂解物的測量中，由于EGF的刺激而造成的Her1-Her1同型二聚體表達(dá)和胞內(nèi)磷酸化的增加。
圖15B表示對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和SKBR-3的固定球切片中的Her2-Her2同型二聚體和受體磷酸化的分析數(shù)據(jù)。所有用作裂解探針或結(jié)合化合物單克隆抗體的使用濃度在5μg/mL。為產(chǎn)生更好的裂解效果，該測定中采用了兩種裂解探針，一種針對Her2的胞外抗原決定簇，一種針對Her2的胞內(nèi)抗原決定簇。從固定組織測得的數(shù)據(jù)證實(shí)，SKBR3細(xì)胞比MCF-7細(xì)胞表達(dá)了較高的Her2-Her2同型二聚體水平。
圖15C表示對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的固定球切片中的Her1-Her2異型二聚體和受體磷酸化的分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞系由未受刺激的細(xì)胞或者以40nM EGF刺激的細(xì)胞制備而成。采用了兩種裂解探針，一種包含抗Her1單克隆抗體(5μg/mL)，另一種包含抗Her1單克隆抗體(10μg/mL)(均來自Labvision)，以便提高分子標(biāo)簽釋放的速率。數(shù)據(jù)表明由于EGF的刺激，在固定組織中檢測到了Her1-Her2異型二聚體表達(dá)。
圖15D表示對乳腺癌細(xì)胞系22Rv1的固定球切片中的Her1-Her2異型二聚體和受體磷酸化的分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞系由未受刺激的細(xì)胞或者以100nM EGF刺激的細(xì)胞制備而成。對固定組織的測量再次證明了用EGF處理后造成Her1-Her2二聚體和Her受體磷酸化的增量調(diào)節(jié)。
圖15E表示對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的固定球切片中的Her2-Her3異型二聚體和受體磷酸化的分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞系由未受刺激的細(xì)胞或者以40nM HRG刺激的細(xì)胞制備而成。在該實(shí)施例中，結(jié)合反應(yīng)和裂解反應(yīng)在含有切片的試管中進(jìn)行，而不是顯微載玻片中。除此之外，該方法與檢測Her1-Her2二聚體的方法基本上相同。該數(shù)據(jù)表明由于HRG的刺激，在固定組織中檢測到了Her2-Her3異型二聚體表達(dá)的增加。
圖15F表示對MCF-7細(xì)胞的固定球切片中的Her2-Her3異型二聚體和PI3K-Her3二聚體的分析數(shù)據(jù)，其中細(xì)胞未受刺激或者受到40nMHRG刺激。該針對PI3K-Her3的測定設(shè)計(jì)基本上如圖11A中所述。在兩種情況下都按照上述固定化方法進(jìn)行，除了都不用抗原修復(fù)試劑處理樣品之外。數(shù)據(jù)表明通過HRG處理，Her2-Her3二聚體增加，但PI3K-Her3二聚體的數(shù)量基本保持不變。
圖15G表示對總PI3K，總Her2-Her3二聚體，以及總Her3的分析數(shù)據(jù)，其均與微管蛋白的數(shù)量相關(guān)。用常規(guī)的夾心式測定法來測定微管蛋白，該方法采用了裂解探針和具有分子標(biāo)簽的結(jié)合化合物。測定微管蛋白用來測試針對代表樣品中總細(xì)胞數(shù)目的靶的標(biāo)準(zhǔn)化二聚體測定的步驟，這在測定具有不同細(xì)胞類型的樣品時(shí)可能需要。數(shù)據(jù)表明PI3K-Her3和Her2-Her3與微管蛋白的比例與直接在PI3K-Her3和Her2-Her3上進(jìn)行的測定的定性相同。
權(quán)利要求
1.一種測定患者疾病狀態(tài)的方法，該患者所患疾病的特征在于一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的異常表達(dá)，該方法包括以下步驟直接測定患者樣品中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物中每種的數(shù)量；將上述每種數(shù)量與其在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；以及將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別相對應(yīng)的數(shù)量之差與患者的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中所述患者樣品是固定的組織樣品、冷凍的組織樣品、或者循環(huán)上皮細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Her1-Her1同型二聚體、Her2-Her2同型二聚體、Her1-Her3受體二聚體、Her2-Her4受體二聚體、Her1-PI3K復(fù)合物、Her2-PI3K復(fù)合物、Her3-PI3K復(fù)合物、Her1-SHC復(fù)合物、Her2-SHC復(fù)合物、Her3-SHC復(fù)合物、Her1-IGF-1R受體二聚體、Her2-IGF-1R受體二聚體、Her3-IGF-1R受體二聚體、Her1-PDGFR受體二聚體、Her2-PDGFR受體二聚體、Her3-PDGFR受體二聚體、p95Her2-Her3受體二聚體、p95Her2-Her2受體二聚體、p95Her2-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her2受體二聚體和EGFRvIII-Her3受體二聚體。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的每一種通過以下步驟確定向所述一種或多種Her復(fù)合物的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種Her復(fù)合物的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的Her復(fù)合物上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述患者樣品中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的存在與否或者數(shù)量。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述患者樣品是所述固定的組織樣品或者所述冷凍的組織樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是所述患者對二聚體作用藥物治療的反應(yīng)。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述癌癥選自以下病癥構(gòu)成的組乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物是具有PDGF受體的一種或多種異型二聚體。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一種或多種異型二聚體選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Her1-PDGFR受體二聚體、Her2-PDGFR受體二聚體和Her3-PDGFR受體二聚體。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述患者樣品是所述固定的組織樣品或者所述冷凍的組織樣品。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述一種或多種異型二聚體通過以下步驟確定向所述一種或多種異型二聚體的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種異型二聚體的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的異型二聚體上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述患者樣品中所述一種或多種異型二聚體的存在與否或者數(shù)量。
12.根據(jù)權(quán)利要求8、9、10或11所述的方法，其中所述疾病是癌癥，或者其中所述疾病與異常纖維化狀況有關(guān)。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述癌癥選自以下病癥構(gòu)成的組乳腺癌、卵巢癌和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者樣品是固定的組織樣品并且其中所述疾病是癌癥，并且其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物是選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組的Her受體二聚體Her1-Her1、Her1-Her3、Her1-Her4、Her2-Her2、Her3-Her4和Her4-Her4。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述一種或多種Her受體二聚體通過以下步驟確定向所述一種或多種Her受體二聚體的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種Her受體二聚體的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的Her受體二聚體上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述固定的組織樣品中所述一種或多種Her受體二聚體的存在與否或者數(shù)量。
16.一種針對一種或多種ErbB-二聚體作用藥物的癌癥治療來選擇患者的方法，該方法包括以下步驟將含有癌細(xì)胞的患者樣品從患者中分離；直接測定患者樣品中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體二聚體中每種的數(shù)量；將上述每種數(shù)量與其在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；以及無論何時(shí)來自所述患者樣品的一種或多種細(xì)胞表面受體二聚體的數(shù)量超出了標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別相應(yīng)的數(shù)量時(shí)，選擇該患者用于一種或多種ErbB二聚體作用藥物的治療。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者樣品是固定的組織樣品、冷凍的組織樣品、或者循環(huán)上皮細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述ErbB細(xì)胞表面受體二聚體含有Her1受體，并且所述二聚體作用藥物選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Cetuximab(Erbitux)，Trastuzumab(Herceptin)，h-R3(TheraCIM)，ABX-EGF，MDX-447，ZD-1839(Iressa)，OSI-774(Tarceva)，PKI 166，GW572016，CI-1033，EKB-569和EMD 72000。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述ErbB細(xì)胞表面受體二聚體選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Her1-Her1、Her1-Her2、Her1-Her3、Her1-Her4。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述ErbB細(xì)胞表面受體二聚體選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Her1-Her1、Her1-Her3、Her1-Her4。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述ErbB細(xì)胞表面受體二聚體是Her1-Her1。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述患者樣品是固定的組織樣品，并且其中所述ErbB二聚體作用藥物選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Cetuximab(Erbitux)，ABX-EGF，MDX-447，ZD-1839(Iressa)，OSI-774(Tarceva)，PKI 166，GW572016，CI-1033，EKB-569和EMD72000。
23.根據(jù)權(quán)利要求16、17、18、19、20、21或22所述的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體二聚體通過以下步驟確定向所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體二聚體的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體二聚體的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的ErbB細(xì)胞表面受體二聚體上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述固定的組織樣品中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體二聚體的存在與否或者數(shù)量。
24.一種測定患者癌癥狀態(tài)的方法，該患者所患癌癥的特征在于一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的異常表達(dá)，該方法包括以下步驟直接測定患者樣品中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物中每種的數(shù)量；將上述每種數(shù)量與其在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；以及將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別相對應(yīng)的數(shù)量之差與患者的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Her1-PI3K復(fù)合物、Her2-PI3K復(fù)合物、Her3-PI3K復(fù)合物、Her1-SHC復(fù)合物、Her2-SHC復(fù)合物、Her3-SHC復(fù)合物、Her1-IGF-1R受體二聚體、Her2-IGF-1R受體二聚體、Her3-IGF-1R受體二聚體、Her1-PDGFR受體二聚體、Her2-PDGFR受體二聚體、Her3-PDGFR受體二聚體、p95Her2-Her3受體二聚體、p95Her2-Her2受體二聚體、p95Her2-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her1受體二聚體、EGFRvIII-Her2受體二聚體和EGFRvIII-Her3受體二聚體。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中所述患者樣品是固定的組織樣品、冷凍的組織樣品、或者循環(huán)上皮細(xì)胞。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的每種通過以下步驟確定向所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述患者樣品中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的存在與否或者數(shù)量。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述患者樣品是所述固定的組織樣品或者所述冷凍的組織樣品。
28.根據(jù)權(quán)利要求24、25、26或27的方法，其中所述癌癥狀態(tài)是所述患者對二聚體作用藥物治療的反應(yīng)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述癌癥選自以下病癥構(gòu)成的組乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。
30.一種確定患者疾病狀態(tài)的方法，該患者所患疾病的特征在于一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的異常表達(dá)，該方法包括以下步驟直接測定患者樣品中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物中每種的數(shù)量；將上述每種數(shù)量與其在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；以及將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別相對應(yīng)的數(shù)量之差與患者的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物通過以下步驟確定向所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的每種、以及一種或多種組織指示物提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物以及一種或多種組織指示物的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的靶上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述患者樣品中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的存在與否或者數(shù)量。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中所述患者樣品是固定的組織樣品、冷凍的組織樣品、或者循環(huán)上皮細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病狀態(tài)是所述患者對二聚體作用藥物治療的反應(yīng)。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥選自以下病癥構(gòu)成的組乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組Her1-Her1同型二聚體、Her2-Her2同型二聚體、Her1-Her3受體二聚體、Her2-Her4受體二聚體、Her1-PI3K復(fù)合物、Her2-PI3K復(fù)合物、Her3-PI3K復(fù)合物、Her1-SHC復(fù)合物、Her2-SHC復(fù)合物、Her3-SHC復(fù)合物、Her1-IGF-1R受體二聚體、Her2-IGF-1R受體二聚體、Her3-IGF-1R受體二聚體、Her1-PDGFR受體二聚體、Her2-PDGFR受體二聚體、Her3-PDGFR受體二聚體、p95Her2-Her2受體二聚體、EGFRvIII-Her1受體二聚體和EGFRvIII-Her3受體二聚體。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物選自由Her1-Her1同型二聚體構(gòu)成的組。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的每種至少有一個(gè)HER2受體并且至少有PI3K或SHC之一。
37.權(quán)利要求31的方法，其中所述癌癥選自以下病癥構(gòu)成的組乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。
38.權(quán)利要求31的方法，其中所述患者樣品是所述固定的組織樣品或者所述冷凍的組織樣品。
39.一種確定患者癌癥狀態(tài)的方法，該患者所患癌癥的特征在于一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的異常表達(dá)，該方法包括以下步驟直接測定患者樣品中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物中每種的數(shù)量；將上述每種數(shù)量與其在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相應(yīng)數(shù)量相比較；將患者樣品中的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)樣品中分別相對應(yīng)的數(shù)量之差與患者的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)；以及其中每種所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物每種包含Her受體和胞內(nèi)適配體分子。
40.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者樣品是固定的組織樣品、冷凍的組織樣品、或者循環(huán)上皮細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物通過以下步驟確定向所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發(fā)部分的裂解探針，以及一種或多種結(jié)合化合物，每種具有一種或多種分子標(biāo)簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結(jié)合化合物的所述分子標(biāo)簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的一種或多種結(jié)合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物特異性結(jié)合于它們相應(yīng)的ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物上，并且所述一種或多種結(jié)合化合物的可裂解連接物處于裂解引發(fā)部分的有效近程內(nèi)，使分子標(biāo)簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標(biāo)簽，從而確定在所述患者樣品中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物的存在與否或者數(shù)量。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述患者樣品是所述固定的組織樣品或者所述冷凍的組織樣品。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述癌癥選自以下病癥構(gòu)成的組乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。
44.根據(jù)權(quán)利要求39、40、41、42或43的方法，其中所述一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體復(fù)合物包括一種或多種選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組的復(fù)合物Her1-PI3K復(fù)合物、Her2-PI3K復(fù)合物、Her3-PI3K復(fù)合物、Her1-SHC復(fù)合物、Her2-SHC復(fù)合物、Her3-SHC復(fù)合物、IGF-1R-PI3K復(fù)合物、IGF-1R-SHC復(fù)合物、PDGFR-PI3K復(fù)合物和PDGFR-SHC復(fù)合物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述癌癥狀態(tài)是所述患者對二聚體作用藥物治療的反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種患者樣品中的新種類的生物標(biāo)記，其包括ErbB細(xì)胞表面膜受體的二聚體。一方面，本發(fā)明包括一種測定疾病狀態(tài)或健康狀況的方法，其中將這類狀況與在患者樣品中，尤其是固定的組織樣品中直接測定的一種或多種ErbB細(xì)胞表面膜受體二聚體的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。另一方面，本發(fā)明包括一種測定來自個(gè)體的樣本中癌癥狀態(tài)的方法，其中將樣本細(xì)胞中一種或多種ErbB細(xì)胞表面受體二聚體的數(shù)量測量值同這種狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，包括癌癥前期狀態(tài)的存在與否、癌狀態(tài)的存在與否、癌癥預(yù)后、或者對治療的反應(yīng)性。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法通過采用成組的具有可釋放的分子標(biāo)簽的結(jié)合化合物來實(shí)現(xiàn)，其對一種或多種類型的受體二聚體的多種成分具有特異性。結(jié)合之后，分子標(biāo)簽被釋放，并從測定混合物中分離用于分析。
文檔編號C12Q3/00GK1836051SQ200480014942
公開日2006年9月20日 申請日期2004年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者P·－Y·陳－惠, H·薩利米－穆薩維, Y·施, S·辛, R·杜亞, A·穆克赫吉, S·皮達(dá)帕蒂 申請人:莫諾格蘭姆生物科技公司