專利名稱：修飾的硫氧還蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能調(diào)控由體內(nèi)的內(nèi)源和/或外源因子導(dǎo)致的異常的細(xì)胞生長和/或細(xì)胞功能的硫氧還蛋白(稱作“TRX”)修飾蛋白，和基本上最小化的肽，編碼修飾的蛋白和基本上最小化的肽的DNA，包含該DNA的重組表達(dá)載體，以該DNA轉(zhuǎn)化的DNA，生產(chǎn)修飾的TRX蛋白和基本上最小化的肽的方法，以及包含修飾的TRX蛋白和/或基本上最小化的肽的藥物或藥物組合物。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白是12kD的小的多功能蛋白，在其活性位點(diǎn)序列-Cys-Gly-Pro-Cys(“細(xì)胞激活的氧化還原調(diào)控”，Ann.Rev.Immunol.1997；15351-369)中具有氧化還原活性的二硫鍵/二巰基。硫氧還蛋白自從大腸桿菌(Escherichia coli)中作為重要的合成脫氧核糖核苷酸的酶，核糖核苷酸還原酶的氫供體而分離之后，其已經(jīng)從各種原核的和真核的生物中分離和鑒定到。成年T細(xì)胞白血病衍生因子(ADF)已首先被本發(fā)明人鑒定為感染HTLV-1的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2受體誘導(dǎo)因子，并且是人硫氧還蛋白。細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白對清除自由基和調(diào)控用于氧化還原的轉(zhuǎn)錄因子例如活化蛋白-1和核因子-κB(“AP-1轉(zhuǎn)錄活性受硫氧還蛋白和Ref-1之間的直接聯(lián)系而調(diào)控”1997；943633-3638)起著重要作用。此外，人硫氧還蛋白控制p38有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和凋亡信號調(diào)控激酶(ASK-1)的信號傳導(dǎo)。
同時(shí)，我們已經(jīng)報(bào)道硫氧還蛋白被釋放到細(xì)胞外并作為細(xì)胞因子或趨化因子，但其作用機(jī)制還不知道。尚未有關(guān)細(xì)胞外TRX被內(nèi)吞到細(xì)胞中和通過修飾TRX活性位點(diǎn)產(chǎn)生比野生型TRX高得多的細(xì)胞內(nèi)吞活性的報(bào)道。
本發(fā)明分析TRX的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控活性和細(xì)胞內(nèi)吞活性，并打算提供基于活性的修飾的TRX和生產(chǎn)修飾的TRX的方法。
附圖簡述

圖1顯示實(shí)施例2的流式細(xì)胞分析的結(jié)果。
圖2顯示實(shí)施例2的流式細(xì)胞分析的結(jié)果。
圖3顯示實(shí)施例2的Western印跡的結(jié)果。
圖4顯示實(shí)施例3的凋亡分析的結(jié)果。
圖5顯示使用閃爍計(jì)數(shù)器測量3H-胸腺嘧啶吸收量的結(jié)果。
圖6顯示實(shí)施例4中增強(qiáng)效果-1對抗癌劑作用的結(jié)果。在圖6中，CDDP(-)和CDDP(+)分別表示3μg/mL順鉑不存在或存在。TRX-WT，TRX-CS和TRX-C35S分別表示野生型硫氧還蛋白，兩個(gè)位置C32S和C35S修飾的硫氧還蛋白，和C35S修飾的硫氧還蛋白。在CDDP(-)，TRX-C35S中死亡的細(xì)胞與4％(TRX-WT)，和3％(TRX-CS)增加大約4倍。在CDDP(+)(3μg/mL)，TRX-C35S中死亡的細(xì)胞(26％)與5％(TRX-WT)或13％(TRX-CS)比較增加大約5或2倍。
圖7顯示實(shí)施例4中增強(qiáng)效果-2對抗癌劑作用的結(jié)果。在圖7中，CDDP，rec(-)和rec(+)分別表示順鉑，重組硫氧還蛋白(C35S-TRX)不存在或存在。右上象限代表雙陽性，其是表示細(xì)胞死亡的區(qū)域(具有抗癌效果的區(qū)域)。例如，當(dāng)用C35S-TRX處理1小時(shí)后，在存在10μg/mL C35S-TRX的CDDP(3μg/mL)的情況下雙陽性細(xì)胞從10％提高2倍到22％。在CDDP(6μg/mL)中，雙陽性細(xì)胞從18％提高4倍到76％。此外，當(dāng)用C35S-TRX處理1小時(shí)后，在存在10μg/mLC35S-TRX的CDDP(3μg/mL)的情況下雙陽性細(xì)胞從7％提高4.7倍到33％。在CDDP(6μg/mL)，雙陽性細(xì)胞從23％提高3倍到70％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人詳細(xì)分析TRX的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控活性和細(xì)胞內(nèi)吞活性，并最后成功鑒定細(xì)胞外的人重組野生型TRX的內(nèi)吞活性。此外，他們成功制備了基于活性的修飾的TRX。就是說，本發(fā)明的主題如下1.包含以下多肽之一的人修飾的硫氧還蛋白(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被化學(xué)修飾的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，優(yōu)選SEQ ID NO2氨基酸序列中除32到35位之外的位置存在一個(gè)或多個(gè)取代，缺失，插入或添加的氨基酸的氨基酸序列，并具有誘導(dǎo)凋亡活性的多肽；和(d)由編碼在SEQ ID NO2氨基酸序列中半胱氨酸被其他的氨基酸取代的修飾的人氧還蛋白的DNA或能夠與其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交的DNA編碼的多肽。
2.根據(jù)第1項(xiàng)的人修飾的硫氧還蛋白，其中所述另外的氨基酸殘基是絲氨酸。
3.由下列任何DNA構(gòu)成并編碼具有誘導(dǎo)凋亡活性的人修飾的硫氧還蛋白的基因(1)編碼多肽的多核苷酸，或該多核苷酸的互補(bǔ)鏈，該多肽具有在氨基酸SEQ ID NO2氨基酸序列中35位半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代，并此外在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位以外，優(yōu)選除32到35位以外的位置存在一種或者多種取代，缺失，插入或增加的氨基酸的氨基酸序列，并具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性；和(2)編碼在SEQ ID NO2氨基酸序列35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的人修飾硫氧還蛋白的DNA，或能夠與上述DNA的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交并編碼具有細(xì)胞凋亡活性的多肽的DNA。
4.以可表達(dá)方式引入第3項(xiàng)的基因的重組表達(dá)載體。
5.用第4項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。
6.用于生產(chǎn)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)第5項(xiàng)的轉(zhuǎn)化子。
7.一種用于生物活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)吞的多肽，包括-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列。
8.包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽在用于生物活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)吞。
9.生產(chǎn)能夠被內(nèi)吞到細(xì)胞中的生物活性物質(zhì)復(fù)合物的方法，該方法包括將生物活性物質(zhì)結(jié)合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
10.能夠被內(nèi)吞到細(xì)胞中的生物活性物質(zhì)復(fù)合物，其中生物活性物質(zhì)結(jié)合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
11.第10項(xiàng)的復(fù)合物，其中包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的35位半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽。
12.第10或11項(xiàng)的復(fù)合物，其中上述生物活性物質(zhì)是蛋白或多肽。
13.生產(chǎn)能夠被內(nèi)吞到細(xì)胞中的多肽復(fù)合物的方法，該方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重組載體的轉(zhuǎn)化子，該重組載體具有編碼復(fù)合物的多肽，復(fù)合物中生物活性多肽已經(jīng)結(jié)合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
14.包含第1或2項(xiàng)的修飾的硫氧還蛋白抗癌劑。
15.包含第1或2項(xiàng)的修飾的硫氧還蛋白抗癌增強(qiáng)劑。
16.包含第1或2項(xiàng)的修飾的硫氧還蛋白和另外的抗癌劑的抗癌劑組合物。
17.治療癌癥的方法，該方法包括給藥第1或2項(xiàng)的修飾的硫氧還蛋白，如果需要，與另外的抗癌劑一起給藥到患癌癥的病人。
18.包含第10到12項(xiàng)任意一項(xiàng)的復(fù)合物，和如果需要，包括藥物可接受的載體，賦形劑或稀釋劑的藥物或藥物組合物。
本發(fā)明將在下文中更詳細(xì)描述。
人硫氧還蛋白(hTRX)這里表示包含SEQ ID NO2代表的105個(gè)氨基酸的多肽。
本發(fā)明的hTRX屬于硫氧還蛋白超家族，和作為示例的是那些在其活性中心具有-Cys-Gly-Pro-Cys-，-Cys-Pro-Tyr-Cys-，-Cys-Pro-His-Cys-，或-Cys-Pro-Pro-Cys-的多肽。其中，活性中心具有-Cys-Gly-Pro-Cys-序列的硫氧還蛋白是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過將35位的半胱氨酸轉(zhuǎn)化為另外的氨基酸制備修飾的TRX而表達(dá)誘導(dǎo)凋亡活性和抑制細(xì)胞生長活性，修飾的TRX有效用作抗癌劑。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案基于以下的發(fā)現(xiàn)，即通過或是將半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)化為另外的氨基酸以進(jìn)行修飾或化學(xué)修飾半胱氨酸殘基(具體是巰基殘基)以制備修飾的TRX使得修飾的TRX的細(xì)胞內(nèi)吞急劇增加，并且第一次顯示促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞效應(yīng)的實(shí)體基于由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸或化學(xué)修飾的半胱氨酸)代表的氨基酸序列。
TRX的上述活性位點(diǎn)C端35位的Cys可以用19個(gè)氨基酸(Gly，Ala，Met，Ser，The，Lys，Arg，His，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Pro，Gly，Asp，Gln，Asn)任一取代，并優(yōu)選用Ser取代。
化學(xué)修飾的半胱氨酸包括那些半胱氨酸的巰基(SH)基團(tuán)被SR(R是任意有機(jī)基團(tuán)，其包括，例如，具有1-18碳原子的直鏈或支鏈烷基，具有2-18碳原子的直鏈或支鏈烯基，具有2-18碳原子的直鏈或支鏈炔基，具有2-18碳原子的直鏈或支鏈烷氧基烷基，具有1-18碳原子的直鏈或支鏈羥烷基，具有1-18碳原子的?；?，具有6-18碳原子的芳基，具有7-18碳原子的芳烷基等，這些基團(tuán)可以用取代基例如鹵原子，羥基，硝基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基，甲氧基，羧基或酯基團(tuán)取代)代表的基團(tuán)取代的化學(xué)修飾。這樣化學(xué)修飾的TRX可以使用公知的方法容易地合成。
本發(fā)明優(yōu)選的修飾的硫氧還蛋白和編碼修飾的硫氧還蛋白的基因顯示于SEQ ID NO11。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明修飾的硫氧還蛋白表達(dá)誘導(dǎo)凋亡活性和抑制細(xì)胞生長活性，并有效用作抗癌劑。
此外，本發(fā)明修飾的硫氧還蛋白能通過與其他的抗癌劑組合而增強(qiáng)抗癌效果。具體地，修飾的硫氧還蛋白通過以小于抗癌有效量的濃度與抗癌劑組合而誘導(dǎo)抗癌效果，增強(qiáng)抗癌劑的效果，并降低副作用。
效果被上述組合增強(qiáng)的抗癌劑包括阿霉素，甲氨蝶呤，紫杉酚，5-氟脲嘧啶，長春堿，長春新堿，絲裂霉素，順鉑，道諾霉素，依托泊甙，泰索帝等。
本發(fā)明修飾的硫氧還蛋白和抗癌劑可以同時(shí)給藥或可以分開給藥。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及治療癌癥的方法，其中給藥修飾的硫氧還蛋白和抗癌劑。
能夠被治療的癌癥不是具體限定的，包括胃癌，結(jié)腸癌，直腸癌，肝癌，膽囊/膽管癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，膀胱癌，宮頸癌等。
包含本發(fā)明的修飾的硫氧還蛋白的抗癌劑的治療有效量為每個(gè)成年癌癥患者每天大約0.01到100mg，當(dāng)用作抗癌增強(qiáng)劑時(shí)治療有效量為大約0.001到10mg。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明修飾的硫氧還蛋白可以基于SEQ ID NO2的人硫氧還蛋白通過公知的基因工程技術(shù)而制備。所述修飾的蛋白在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，優(yōu)選除32到35位之外的位置，具有一個(gè)或多個(gè)取代，缺失，添加或插入的氨基酸，并具有誘導(dǎo)凋亡活性。這樣的突變(取代，缺失，添加和插入)包括人工的突變和天然發(fā)生的突變(如，等位基因)。產(chǎn)生人工突變的方法可以包括，但不限于，定點(diǎn)突變(Nucleic Acids Res.10，6487-6500，1982)等。只要不丟失誘導(dǎo)凋亡活性，突變的氨基酸的數(shù)目不受限制，但優(yōu)選在20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選在15個(gè)氨基酸，再優(yōu)選在10個(gè)氨基酸和最優(yōu)選再5個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括編碼修飾的人硫氧還蛋白的DNA，該蛋白在SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代，或能夠與其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交并編碼具有誘導(dǎo)凋亡活性的多肽的DNA，以及DNA編碼的蛋白具有誘導(dǎo)凋亡活性。
“嚴(yán)格條件”這里指只發(fā)生特異性雜交而沒有非特異性雜交的條件。這樣的條件通常是等同于大約“1×SSC和0.1％ SDS在37℃”的條件，優(yōu)選大約“0.5×SSC和0.1％ SDS在42℃”，和更優(yōu)選“0.2×SSC和0.1％ SDS在65℃”。本發(fā)明的DNA通常與編碼35位被突變的本發(fā)明多肽的DNA(如，SEQ ID NO11描述的DNA)具有高同源性。高同源性指同源性為75％或更多，優(yōu)選90％或更多，更優(yōu)選95％或更多和特別是99％或更多。
本發(fā)明的蛋白可以通過將后面所述的本發(fā)明的基因摻入到表達(dá)載體中并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得。作為載體，有可能合適地選擇并使用那些公知的載體，例如pTrc-HisA等。宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞如哺乳動物細(xì)胞和酵母細(xì)胞，以及原核細(xì)胞如大腸桿菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，藻類和真菌的細(xì)胞，可以使用其中任意的成員。
無需受理論的限制，相信修飾的TRX表達(dá)誘導(dǎo)凋亡活性或抑制細(xì)胞生長活性，因?yàn)楫?dāng)35位Cys被另外的氨基酸例如Ser取代后，修飾的TRX作為TRX的拮抗劑起作用。
此外，據(jù)信在35位Cys被另外的氨基酸例如Ser取代的修飾的TRX以32位Cys結(jié)合到細(xì)胞表面，由于在35位沒有Cys而在35位不結(jié)合到細(xì)胞表面，結(jié)果修飾的TRX被迅速內(nèi)吞到細(xì)胞中。該機(jī)制還得到以下事實(shí)的支持，即所有Ser32修飾的TRX(35位Cys；SEQ IDNO14)，Ser32Ser35修飾的TRX(SEQ ID NO13)和野生型TRX(32和35位Cys；SEQ ID NO2)很少被內(nèi)吞到細(xì)胞中。
就是說，很明顯Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列，尤其是Cys-Gly-Pro-A(A同上)在將生物活性物質(zhì)內(nèi)吞到細(xì)胞中起著引導(dǎo)肽的作用，并且有可能通過四肽結(jié)合到生物活性物質(zhì)將很難內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)內(nèi)吞。
這里的“修飾的TRX”用于表示包含變體和修飾物的術(shù)語。
生物活性物質(zhì)包括被內(nèi)吞而作用的藥物化合物，寡肽，多肽，單糖，二糖或多糖，脂等，優(yōu)選示例藥物化合物，寡肽和多肽(包括糖蛋白)。有可能通過包含上述四肽的合適的序列結(jié)合到引導(dǎo)肽的N或C末端而增強(qiáng)對靶細(xì)胞的選擇性。示例的藥物化合物如生物活性物質(zhì)，抗癌劑，抗病毒劑等。示例的生物活性肽如酶，抗體，激素等。
本發(fā)明的引導(dǎo)肽如果需要可以通過間隔肽結(jié)合到生物活性物質(zhì)。例如，當(dāng)生物活性物質(zhì)是多肽，上述引導(dǎo)肽通過間隔肽結(jié)合到生物活性多肽而形成復(fù)合物，并且有可能通過將編碼復(fù)合物的DNA引入到合適的重組載體中，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌例如大腸桿菌，動物細(xì)胞例如CHO，或酵母，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而制備復(fù)合物。
通過引入細(xì)胞內(nèi)可切除的短鏈肽作為間隔，有可能細(xì)胞內(nèi)引入生物活性物質(zhì)，尤其是生物活性寡肽或多肽。這樣的可切除的肽包括-AYVHDAPVK-，其是人前白介素1β(pro-IL-1β)切割位點(diǎn)被半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1特異性切割的序列，和-GDEVDGVK-，其是人聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)切割位點(diǎn)被半胱氨酸蛋白酶-3和-7等切割的序列。
本發(fā)明最佳實(shí)施方案本發(fā)明參照以下實(shí)施例以更多細(xì)節(jié)進(jìn)行描述，但這些例子僅表示示例的目的，而不是將本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。
重組野生型TRX和修飾的TRX的生產(chǎn)1.大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建通過取代SEQ ID NO1的TRX基因?qū)?yīng)位置的核苷酸，使TRX多肽的32和/或35位半胱氨酸殘基被絲氨酸殘基取代。在32位用絲氨酸殘基取代了半胱氨酸殘基的基因變體(TRX-C32S；SEQ ID NO14)通過將人TRX基因(SEQ ID NO1)插入載體pcDNA3.1的質(zhì)粒DNA作為模板，使用引物5′-GGA TCC GTG AAG CAG ATC GAG AGC AAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-CTT GAT CAT TTT GCA AGG CCC AGA CCA-3′(SEQ ID NO5)以及引物5′-GTC GAC TTA GAC TAA TTC ATTAAT GGT GGC-3′(SEQ ID NO4)和5′-TGG TCT GGG CCT TGCAAA ATG ATC AAG-3′(SEQ ID NO6)的PCR而得到。隨后，擴(kuò)增的兩條DNA片段等量混合，并添加引物5′-GGA TCC GTG AAG CAGATC GAG AGC AAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-GTC GAC TTA GAC TAATTC ATT AAT GGT GGC-3′(SEQ ID NO4)，然后通過PCR擴(kuò)增全長TRX-C32S。PCR以循環(huán)條件95℃ 1分鐘，56℃ 1分鐘退火，和72℃ 2分鐘延伸來進(jìn)行。相似的，在TRX35位用絲氨酸殘基取代半胱氨酸殘基的基因變體(TRX-C35S；SEQ ID NO12)或在TRX的32和35位用絲氨酸殘基取代半胱氨酸殘基的基因變體(TRX-C32S/C35S；SEQID NO13)使用引物5’-CTT GAT CAT TTT GGA AGG CCC ACACCA-3’(SEQ ID NO7)和5’-TGG TGT GGG CCT TCC AAA ATGATC AAG-3’(SEQ ID NO8)或5’-TGG TCT GGG CCT TCC AAA ATGATC AAG-3’(SEQ ID NO9)和5’-CTT GAT CAT TTT GGA AGG CCCAGA CCA-3’(SEQ ID NO10)代替用于制備TRX-C32S基因的引物通過PCR來制備。野生型TRX(TRX-WT)通過用人TRX cDNA(SEQ IDNO1)已經(jīng)被插入到載體pcDNA3.1中的質(zhì)粒DNA作為模板使用引物5′-GGA TCC GTG AAG CAG ATC GAG AGC AAG-3′(SEQ ID NO3)和5′-GTC GAC TTA GAC TAA TTC ATT AAT GGT GGC-3′(SEQ IDNO4)通過PCR擴(kuò)增全長TRX-WT而獲得。通過PCR擴(kuò)增的TRX-WT，TRX-C32S，TRX-C35S或TRX-C32S/C35S的DNA片段被連接到TOPO克隆載體(購自Invitrogen)并隨后引入到E.coli宿主細(xì)胞中。從轉(zhuǎn)化的克隆中收集質(zhì)粒DNA，通過DNA測序鑒定插入的DNA的序列。隨后，質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI切割，得到的片段連接到添加組氨酸標(biāo)記的重組蛋白表達(dá)載體pQE80L(購自Qiagen)，然后轉(zhuǎn)化E.coli宿主細(xì)胞XL-1Blue。
2.產(chǎn)生重組TRX野生型或修飾的TRX的E.coli細(xì)胞的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒DNA pQE80L的E.coli細(xì)胞在預(yù)培養(yǎng)后被接種到3Lterrific broth液體培養(yǎng)基(BRL)(含100μg/mL氨芐青霉素)中，并培養(yǎng)4小時(shí)，該質(zhì)粒中已經(jīng)插入了TRX野生型基因或修飾的TRX基因。隨后，添加IPTG到終濃度1mM，培養(yǎng)物被繼續(xù)培養(yǎng)2到4小時(shí)。
3.重組TRX野生型和修飾的TRX的純化收集的細(xì)胞被懸于含2mM溶菌酶的裂解緩沖液(蛋白酶抑制劑，0.8mM咪唑，2-巰基乙醇)，使用超聲儀破碎。在15,000rpm離心30分鐘后，收集上清，并上樣到用PBS平衡的Ni瓊脂糖柱上(Qiagen提供)(Ni柱已事先替換過PBS)。在上樣后，柱用含20mM咪唑的PBS洗滌，并用含80mM咪唑的PBS洗脫。洗脫的樣品溶液使用PD-10柱替換為PBS溶液。
重組TRX野生型或修飾的TRX內(nèi)吞到培養(yǎng)的細(xì)胞中1.與細(xì)胞結(jié)合的能力終濃度為1μg/ml的熒光標(biāo)記的TRX-WT，TRX-C35S或TRX-C32S/C35S被添加到5×105HTLV-1感染的人T細(xì)胞系A(chǔ)TL2的細(xì)胞中，在4℃孵育30分鐘，然后用緩沖液(0.1％含疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液)洗滌用于流式細(xì)胞技術(shù)。進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)的分析(圖1)。結(jié)果，鑒定到只有TRX-C35S能結(jié)合到細(xì)胞。還鑒定到該結(jié)合被過量共存的TRX-WT所抑制(圖2)。
2.細(xì)胞內(nèi)吞組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，TRX-WT，TRX-C35S或TRX-32S/C35S以終濃度10μg/mL添加到ATL2細(xì)胞中，并在4℃或37℃溫育一小時(shí)。隨后，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后1×107細(xì)胞被懸浮在低滲的緩沖液中，并通過氮?dú)饧?xì)胞勻漿器(購自Pearl)而破裂。在1,000g離心之后，收集上清，并通過在10,000g離心收集上清的胞質(zhì)溶膠級分。胞質(zhì)溶膠級分通過Western印跡法使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和抗-TRX單克隆抗體分析(圖3)。結(jié)果，鑒定在胞質(zhì)溶膠級分只檢測到TRX-C35S。

TRX野生型或修飾的TRX的生物活性1.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性其中已經(jīng)引入TRX-WT，TRX-C35S或TRX-C32S/C35S基因的人T細(xì)胞系Jurkat，在無血清RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)以分析誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖4)。結(jié)果，與已經(jīng)引入TRX-WT或TRX-C32S/C35S的Jurkat細(xì)胞相比較，具有細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)TRX-C35S的Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞凋亡被進(jìn)一步促進(jìn)。
2.抑制細(xì)胞生長的活性5×105人外周血單核細(xì)胞被懸浮在1ml含有10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，然后加入終濃度28ng/ml的pHA和10μg/mL的TRX-WT，TRX-C32S/C35S或TRX-C35S，并進(jìn)行培養(yǎng)。96小時(shí)后，添加3H-胸腺嘧啶核苷并通過閃爍計(jì)數(shù)器測量其吸收量(圖5)。結(jié)果，鑒定與沒有TRX的細(xì)胞相比，具有重組TRX-WT蛋白的細(xì)胞中細(xì)胞增殖能力被增強(qiáng)，而在具有重組TRX-C35S蛋白的細(xì)胞中細(xì)胞增殖被抑制。
1.抗癌劑性能的增強(qiáng)效果1終濃度3μg/mL順鉑(CDDP；順-鉑(II)-二胺二氯化物，Sigma)被加到TRX基因高表達(dá)的細(xì)胞，該細(xì)胞通過引入野生型(WT)TRX，C32S/C35S衍生的(CS)TRX或C35S衍生的-TRX基因到人T細(xì)胞系Jurkat中而建立。在細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，膜聯(lián)蛋白V-FITC和二碘化丙錠(Medical Biological Laboratories CO.，LTD)被結(jié)合到細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析顯示細(xì)胞凋亡的雙陽性的細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果，鑒定高水平表達(dá)C35S-TRX的細(xì)胞系中膜聯(lián)蛋白V-FITC和二碘化丙錠雙陽性的死細(xì)胞的數(shù)量，與表達(dá)WT-TRX或CA-TRX的細(xì)胞系相比大約提高4倍。
2.抗癌劑性能的增強(qiáng)效果2重組C35S-TRX蛋白以濃度10μg/mL添加進(jìn)人T細(xì)胞系Jurkat的培養(yǎng)物中，溫育一個(gè)小時(shí)或三個(gè)小時(shí)然后添加順鉑至終濃度3μg/mL或6μg/mL。在培養(yǎng)24小時(shí)之后膜聯(lián)蛋白V-FITC和二碘化丙錠被結(jié)合到細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析顯示細(xì)胞凋亡的雙陽性細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果，在已經(jīng)預(yù)先添加重組C35S-TRX蛋白的組中，膜聯(lián)蛋白V-FITC和二碘化丙錠雙陽性細(xì)胞的數(shù)量與沒有添加重組蛋白質(zhì)的組相比增加，并在具有3μg/mL順鉑的組增加大約2倍和在具有6μg/mL順鉑的組增加大約4倍。在用C35S-TRX蛋白預(yù)處理3小時(shí)的組比預(yù)處理1小時(shí)的組的效果更高。
如上所述，已經(jīng)描述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解可以進(jìn)行各種變化和改進(jìn)而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)該僅僅由權(quán)利要求確定。
根據(jù)本發(fā)明，有可能穩(wěn)定和大規(guī)模地生產(chǎn)具有高抑制細(xì)胞生長活性的修飾的TRX蛋白并開發(fā)運(yùn)用來源于能夠被快速內(nèi)吞入細(xì)胞中修飾的TRX的肽序列的載體。與修飾的TRX蛋白或來源于修飾的TRX的肽融合的生物活性物質(zhì)(蛋白質(zhì)，脂類，核酸，有機(jī)化合物，無機(jī)化合物)可以被用于各種領(lǐng)域疾病的治療和/或預(yù)防。
序列表<110>獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY)<120>修飾的硫氧還蛋白(Thioredoxin derivatives)<130>SCT053879-47<160>14<170>Patentln version 3.1<210>1<211>318<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(318)<223>
<400>1atg gtg aag cag atc gag agc aag act gct ttt cag gaa gcc ttg gac 48Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Thr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asp1 5 10 15gct gca ggt gat aaa ctt gta gta gtt gac ttc tca gcc acg tgg tgt 96Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys20 25 30ggg cct tgc aaa atg atc aag cct ttc ttt cat tcc ctc tct gaa aag144Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys35 40 45tat tcc aac gtg ata ttc ctt gaa gta gat gtg gat gac tgt cag gat192Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp50 55 60gtt gct tca gag tgt gaa gtc aaa tgc atg cca aca ttc cag ttt ttt240Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe65 70 75 80
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<210>3<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3ggatccgtga agcagatcga gagcaag 27<210>4<211>30<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4gtcgacttag actaattcat taatggtggc 30<210>5<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5cttgatcatt ttgcaaggcc cagacca 27<210>6<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6tggtctgggc cttgcaaaat gatcaag 27<210>7<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7cttgatcatt ttggaaggcc cacacca 27
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<221>misc_feature<222>(103)..(105)<223>nnn stands for any base for coding Lys，Asn，Arg，Ser，Thr，Ile，Met，Glu，Asp，Gly，Ala，Val，Gln，His，Pro，Leu，Tyr，Trp，or Phe.
<220>
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<223>The’Xaa’at location 35 stands for Lys，Asn，Arg，Ser，Thr，Ile，Met，Glu，Asp，Gly，Ala，Val，Gln，His，Pro，Leu，Tyr，Trp，or Phe.
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Ala Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Ser20 25 30ggg cct tgc aaa atg atc aag cct ttc ttt cat tcc ctc tct gaa aag 144Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys35 40 45tat tcc aac gtg ata ttc ctt gaa gta gat gtg gat gac tgt cag gat 192Tyr Ser Asn Val Ile Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp50 55 60gtt gct tca gag tgt gaa gtc aaa tgc atg cca aca ttc cag ttt ttt 240Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe65 70 75 80aag aag gga caa aag gtg ggt gaa ttt tct gga gcc aat aag gaa aag 288Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys85 90 95ctt gaa gcc acc att aat gaa tta gtc taa 318Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Val100 10權(quán)利要求
1.含以下多肽之一的修飾的人硫氧還蛋白a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽；b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被化學(xué)修飾的氨基酸序列的多肽；c)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，優(yōu)選除32到35位之外的位置存在一個(gè)或多個(gè)取代，缺失，插入或添加的氨基酸的氨基酸序列，并具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的多肽；和d)由編碼在SEQ ID NO2氨基酸序列中半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的修飾的人硫氧還蛋白的DNA或能夠與其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交的DNA編碼的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的人硫氧還蛋白，其中所述另外的氨基酸殘基是絲氨酸。
3.含有下列任何DNA并編碼具有誘導(dǎo)凋亡活性的修飾的人硫氧還蛋白的基因(1)編碼多肽的多核苷酸，或該多核苷酸的互補(bǔ)鏈，該多肽具有在SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代，此外在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，優(yōu)選除32到35位之外的位置存在一種或者多種取代，缺失，插入或增加的氨基酸的氨基酸序列，并具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性；和(2)編碼在SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的修飾的人硫氧還蛋白的DNA，或能夠與其上述DNA的互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交并編碼具有細(xì)胞凋亡活性的多肽的DNA。
4.以可表達(dá)方式引入權(quán)利要求3的基因的重組表達(dá)載體。
5.用權(quán)利要求4的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子。
6.用于生產(chǎn)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化子。
7.一種用于生物活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)吞的多肽，其包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列。
8.包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽用于生物活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)吞。
9.生產(chǎn)能夠被內(nèi)吞到細(xì)胞中的生物活性物質(zhì)復(fù)合物的方法，該方法包括將生物活性物質(zhì)結(jié)合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
10.能夠被內(nèi)吞到細(xì)胞中的生物活性物質(zhì)復(fù)合物，其中生物活性物質(zhì)被結(jié)合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
11.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸殘基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽。
12.權(quán)利要求10或11的復(fù)合物，其中上述生物活性物質(zhì)是蛋白或多肽。
13.生產(chǎn)能夠被內(nèi)吞到細(xì)胞中的多肽復(fù)合物的方法，該方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有重組載體的轉(zhuǎn)化子，該重組載體具有編碼復(fù)合物的多肽，復(fù)合物中生物活性多肽已被結(jié)合到包含由-Cys-Gly-Pro-A，-Cys-Pro-Tyr-A-，-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
14.包含權(quán)利要求1或2的修飾的硫氧還蛋白的抗癌劑。
15.包含權(quán)利要求1或2的修飾的硫氧還蛋白的抗癌增強(qiáng)劑。
16.包含權(quán)利要求1或2的修飾的硫氧還蛋白和另外的抗癌劑的抗癌劑組合物。
17.治療癌癥的方法，該方法包括給藥權(quán)利要求1或2的修飾的硫氧還蛋白，如果需要，與另外的抗癌劑一起給藥到患癌癥的病人。
18.藥物或藥物組合物，包含權(quán)利要求10到12任意一項(xiàng)的復(fù)合物，以及如果需要，包含藥物可接受的載體，賦形劑或稀釋劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾的人硫氧還蛋白，其包括以下任何多肽(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中35位半胱氨酸殘基被另外的氨基酸改變或化學(xué)修飾的氨基酸序列的多肽；和(b)具有SEQ ID NO2氨基酸序列中除32和35位之外，優(yōu)選在SEQ ID NO2氨基酸序列中除32到35位之外的位置存在一個(gè)或多個(gè)取代，缺失，插入或添加的氨基酸的氨基酸序列，并具有誘導(dǎo)凋亡活性的多肽。
文檔編號C12N1/19GK1798837SQ200480015060
公開日2006年7月5日 申請日期2004年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者石井保之, 淀井淳司, 中村肇, 近藤則彥 申請人:獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所