專利名稱：無莢膜的多殺巴斯德氏菌hyaE缺失型突變株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及無莢膜的多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)突變株以及包含所述突變株的疫苗。
發(fā)明的技術背景多殺巴斯德氏菌(P.multocida)與許多疾病有關，包括小牛和周歲幼畜的腦膜炎、羔羊淋巴腺炎、馬和驢的敗血癥、牛敗血性巴斯德氏菌病(出血性敗血癥，長須病)、豬巴斯德氏菌病、豬巴斯德氏菌敗血癥、肺炎和禽霍亂。
現(xiàn)有技術中需要能夠用來提供有效對抗多殺巴斯德氏菌所致疾病的保護性免疫力的疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方式是提供一種分離的A血清型多殺巴斯德氏菌(P.multocida)，其包含hyaE基因的全部缺失或部分缺失。上述缺失使細菌的毒性減弱。
本發(fā)明的另外一個實施方式是提供一種能夠誘導產(chǎn)生抗野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的疫苗。所述疫苗包含含有hyaE基因全部缺失或部分缺失的A血清型多殺巴斯德氏菌，和藥學上可接受的載體。所述缺失突變減弱了細菌的毒性。
本發(fā)明的其它實施方式是提供適用于哺乳動物(包括家畜、有蹄動物和寵物)或鳥類(尤其是家禽)的飼料，其中所述飼料包含含有hyaE基因全部缺失或部分缺失的A血清型多殺巴斯德氏菌。所述突變減弱了細菌的毒性。
本發(fā)明的另外一種實施方式是提供了一種誘導產(chǎn)生抗野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的方法。將A血清型多殺巴斯德氏菌施用給動物受試者，如哺乳動物(包括家畜、有蹄動物和寵物)或者鳥類(包括家禽)。上述細菌包含hyaE基因的全部缺失或部分缺失，所述缺失減弱了細菌的毒性。所述細菌由此可以向動物受試者提供抗野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力。
因此，本發(fā)明提供了用于誘導產(chǎn)生抗多殺巴斯德氏菌所致疾病的保護性免疫力的工具和方法。


附圖1描述了hyaE缺失突變株的構建過程。附圖1A是預期缺失的示意圖。附圖1B是包含有缺失的hyaE插入片段的質粒。
發(fā)明詳述可以將無莢的A血清型多殺巴斯德氏菌hyaE缺失突變株施用給哺乳動物(包括家畜、有蹄動物和寵物)和鳥類(包括家禽)，以提供抗野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力，如預防或降低家畜、有蹄動物和寵物所患疾病(如出現(xiàn)性敗血癥或肺炎)的嚴重程度，以及預防或降低鳥類(尤其是家禽)所患禽霍亂的嚴重程度。術語“無莢膜突變株”、“無莢膜細菌”和“突變細菌”在本說明書中可以互換使用。
無莢膜的A血清型多殺巴斯德氏菌hyaE缺失突變株通過對位于莢膜生物合成基因座內(nèi)的hyaE基因進行誘變，可以產(chǎn)生出無莢膜的A血清型(如血清型A1、A3、A4)多殺巴斯德氏菌hyaE缺失突變株。在A血清型細菌內(nèi)，位于莢膜生物合成基因座內(nèi)的基因是公知的，并且已經(jīng)進行了完整的測序。Chung等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.166(2)，289-96，1998。A1血清型基因座包含位于1區(qū)的四個開放閱讀框(ORFs)(hexA、hexB、hexC和hexD)、位于2區(qū)的五個ORFs(hyaA、hyaB、hyaC、hyaD和hyaE)，以及位于3區(qū)的兩個ORFs(phyA和phyB)。
在某些實施方式中，所述突變細菌不包含任何抗生素抗性基因或外源DNA，這使它們在環(huán)境和生態(tài)學上更具吸引力。實施例1描述了一種產(chǎn)生缺失突變株的方法，但是還可以應用現(xiàn)有技術中已知的任何其它方法來產(chǎn)生缺失突變株。在實施例1中還公開了用于確認突變株具有無莢膜表型的簡單測試方法。
帶有任意的hyaE基因全部缺失或部分缺失的多殺巴斯德氏菌均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，只要這種缺失能夠使細菌減毒即可。在其中一個實施方式中，缺失突變導致了hyaE蛋白第239-359位氨基酸的缺失(也就是在所編碼的hyaE蛋白中不存在239-359位氨基酸)。在另外一個實施方式中，突變的hyaE開放閱讀框包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的序列。
如果在將易感靶物種暴露于所述突變細菌后，殺死半數(shù)易感靶物種所需的野生型多殺巴斯德氏菌的劑量提高(也就是LD50值提高)，和/或在將靶物種暴露于突變細菌后，與暴露于野生型細菌相比降低了病理損害(例如肺炎)，和/或在將靶物種暴露于突變細菌后，與暴露于野生型細菌相比降低了多殺巴斯德氏菌所存在的粘膜表面上的共生集落化，則上述突變細菌就是減毒的。
可以通過本領域已知的各種方法來評估毒性是否減弱。例如，對于敗血性疾病來說(例如禽霍亂)，可以通過鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑，將易感物種暴露于野生型有機體下，然后比較野生型和突變型生物體之間導致疾病時所需的劑量。對于肺炎性疾病，人們可以通過鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或肺內(nèi)途徑使易感動物暴露于野生型生物體，然后比較分別暴露于突變型和野生型生物體的動物所表現(xiàn)出的臨床癥狀和病理損害的嚴重程度。對于粘膜集群，可以通過口服、鼻內(nèi)或扁桃體內(nèi)途徑使動物分別暴露于野生型生物體，然后比較在暴露之后以一定的間隔從鼻腔粘液或扁桃體沖洗標本中回收到的生物體的量。
疫苗制備包含突變細菌的疫苗可以單獨施用，或者作為多價疫苗的一種組分而施用，也就是與其它疫苗組合施用。存在于疫苗配方中的突變細菌可以是活的或是死的；活的或死的細菌可以是凍干的，并且可選地是重構的，這在本領域中是已知的。疫苗可以方便地在試劑盒中提供，試劑盒中還可以包含合適的標記和將疫苗施用給動物受試者(例如家畜、有蹄動物、寵物)或鳥類(如家禽)的說明。
包含無莢膜突變株的疫苗還可以包含藥學和獸醫(yī)學上可接受的載體。這樣的載體對于本領域技術人員來說是公知的，這樣的載體包括但不限于大的代謝緩慢的高分子，如蛋白質、多糖、多聚乳酸、多聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚體和無活性的病毒顆粒。藥學和獸醫(yī)學上可接受的鹽也可以用于疫苗，例如礦物鹽如氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽或硫酸鹽，以及有機酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。疫苗中還可以包含液體，如水、鹽水、甘油和乙醇，以及如濕潤劑、乳化劑或pH緩沖試劑等物質。也可以將脂質體用作突變細菌的載體。參見美國專利5,422,120、WO95/13796、WO91/14445或EP524,968B1。
如果需要，也可以向疫苗中加入佐劑。有用的佐劑包括但不限于，表面活性劑(如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化銨、N，N-二(十八烷基)-n’-N-雙(2-羥基乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基甘油和聚丙二醇與環(huán)氧乙烷多羥基共聚物(pluronic polyol)；聚陰離子(如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸、carbopol)，肽(例如胞壁?；?、二甲基甘氨酸、吞噬細胞增強素(tuftsin))，油乳劑，明礬和它們的混合物。
治療哺乳動物，尤其是家畜、有蹄動物和寵物“哺乳動物”包括單孔類動物(如鴨嘴獸)、有袋動物(如袋鼠)和胎盤哺乳動物，胎盤哺乳動物包括家畜(用于提供食物、奶或纖維的家養(yǎng)動物，如豬、羊、牛和馬)，和寵物(如狗、貓)?！坝刑銊游铩卑ǖ幌抻?，牛(牛科動物)、水牛、野牛、綿羊、豬、鹿、大象和牦牛。上述各類動物均包括成年動物和處于發(fā)育期的動物(如小牛、小豬、小羊等)。本發(fā)明的細菌可以施用給成年哺乳動物，或者可以施用給處于發(fā)育期的哺乳動物，優(yōu)選家畜、有蹄動物或寵物。
給哺乳動物(如家畜、有蹄動物或寵物)施用本發(fā)明細菌的一種簡便方法是口服施用(如摻入飼料或飲用水或餌料中)。將細菌摻入飼料中與飼料一起混合或者將細菌包裹到飼料的表面均是特別方便的。典型的，給予大型動物(如家畜/有蹄動物如牛)的劑量大約是106、5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109、或1010cfu；如果是將細菌包裹到飼料的表面，則劑量大約是108、5×108、109、5×109cfu。也可以給予大約106到大約108、大約2×106到大約3×108、大約2.4×106到大約2.6×108、大約104到大約106cfu或大約104到大約109cfu的劑量?？梢葬槍π⌒图倚?有蹄動物調整劑量，如羊(例如大約104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108cfu)。類似的，針對寵物可以容易地推導出類似的給藥方案。
盡管由于便于投遞而優(yōu)選口服施用途徑，但是也可以使用其它的接種途徑。這樣的途徑包括但不限于，皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)等?？梢詫⒈景l(fā)明的細菌植入耳內(nèi)。也可以通過氣霧劑、滴眼接種或劃痕的形式施用細菌。
治療鳥類“鳥類”包括野生鳥(如獵鳥)和家養(yǎng)鳥(如家禽或寵物)，同時包括成年鳥和處于發(fā)育期的鳥(如小鳥、小雞、幼禽等)。“家離”或“家禽鳥類”包括保留、收獲或飼養(yǎng)以得到肉或蛋的所有鳥類，包括雞、火雞、鴕鳥、斗雞、乳鴿(squab)、珍珠雞(guineafowl)、稚雞、鵪鶉、鴨子、鵝和鴯鹋。
可以通過任何已知的或標準的技術給鳥類施用本發(fā)明的細菌，這樣的技術包括經(jīng)粘膜或肌內(nèi)注射。在孵化場，可以使用如卵內(nèi)接種、噴霧接種或皮下接種技術來施用細菌。在農(nóng)場，可以使用如劃痕、噴霧接種、滴眼接種、飲水接種、飼喂接種、翅翼接種、皮下接種和肌內(nèi)接種技術來施用細菌。
有效劑量取決于鳥的大小。劑量的范圍可以是例如從大約102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、109到5×109cfu，并可發(fā)生變化。
本說明書中所記載的所有專利和專利申請均全文引入本申請。上述描述在一般意義上闡述了本發(fā)明。參考下面的特定實施例，將會更加完整地理解本發(fā)明，但是提供這些實施例的目的僅是為了闡述本發(fā)明，不構成對本發(fā)明的限制。
實施例1無莢膜的hyaE缺失的多殺巴斯德氏菌突變株的產(chǎn)生通過對阻遏莢膜構建模塊N-乙?；?D-葡萄糖胺合成的hyaE基因的編碼區(qū)域進行缺失，制備出1059(鳥，血清型A3)和1062(牛，血清型A3)菌株的多殺巴斯德氏菌突變體。通過PCR擴增得到1059和1062 hyaE基因的編碼區(qū)(分別為SEQ ID NO5和6)，所使用的正向引物是5’-ATGAAAAAGGTTAATATCATTGG-3’(SEQ ID NO1)，反向引物是5’-TTAACCTTGCTTGAATCGTTTACC-3’(SEQ ID NO2)。所有的引物均是由IntegratedDNA Technologies，Inc.，Coralville，IA利用寡核苷酸合成儀(AppliedBiosystems Inc.)合成的。實施PCR反應使用的是GeneAmp LX PCR試劑盒(PEApplied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，使用的儀器是Perkin Elmer GeneAmp9600熱循環(huán)儀。反應條件是30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃30秒，48℃45秒和72℃60秒。
由上述PCR反應所產(chǎn)生的兩個hyaE片段均由各自的起始Met密碼子開始，在各自的終止密碼子處結束。將上述PCR片段連接到pCR2.1(InvitrogenInc.，LaJolla，CA)中，然后電穿孔到E.coli株系DH11S(LifeTechnologies，Rockville，MD)中，從而產(chǎn)生質粒pCR2.1hyaE1059和pCR2.1hyaE1062。通過堿性SDS方法分離上述兩種質粒構建體，然后使用標準方法通過CsCl離心使之純化。使用購買自PE Applied Biosystems公司的DyeTerminator Chemistry試劑盒，對上述兩個hyaE基因的兩條鏈進行測序。將樣品在ABI Prism 377D NA測序儀上由Nucleic Acids Facility，Iowa StateUnivers ty，Ames，IA運行。
每一菌株的hyaE結構基因的長度為1869bp。由于序列差異(主要在編碼區(qū)的3’末端序列存在)，因此分別為每一株系構建了獨特的hyaE置換質粒，以用來構建兩個多殺巴斯德氏菌突變株。使用缺失引物5’-AAAGATATCTTGGTTTACTTCAATAATTTC-3’(SEQ ID NO3)和5’-AAAGATATCACTGCATCTGTTCAATCAACGAGC-3’(SEQ ID NO4)，通過PCR獲得了質粒pCR2.1hyaE1059和pCR2.1 hyaE1062中包含的各hyaE基因的精確缺失。缺失引物退火到克隆的基因上，兩者之間的距離大約是300bp，但兩個引物分別向外延伸，朝向質粒載體一方，而不是向內(nèi)延伸。上述PCR反應擴增出完整的克隆載體和所插入基因的兩個末端，而沒有擴增大約300bp的“缺失片段”。擴增產(chǎn)物是線性的，兩端為hyaE基因的兩個末端片段，中間為質粒載體。引物在各自的5’末端分別包含EcoRV位點(GATATC)。因此線性擴增產(chǎn)物的末端同樣包含EcoRV位點。參見附圖1A和1B。
將所得到的PCR片段用EcoRV限制性內(nèi)切酶進行酶切，以去除各自末端的特定序列。然后將上述片段進行連接，從而產(chǎn)生切除了715到1082位核苷酸的閱讀框內(nèi)缺失體。將具有8個堿基對的SmaI接頭(5’-CCCCGGGG-3’)插入到多殺巴斯德氏菌1062的EcoRV缺失位點，以確保使所產(chǎn)生的突變具有無莢膜表型。沒有將這種DNA插入到多殺巴斯德氏菌1059hyaE插入片段的缺失位點上。
1059和1062突變hyaE片段的核苷酸序列分別如SEQ ID NO7和8所示。在1059和1062中，hyaE蛋白的239到359位氨基酸被缺失。此外，在上述兩個菌株中，原來位于360位的亮氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。株?062在缺失位點處添加了8個額外的氨基酸，這8個氨基酸(Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly；SEQ ID NO9)恰位于位點360的上游。
將突變后的hyaE片段亞克隆到質粒pBCSK(Strategene Inc.)的多克隆位點內(nèi)的EcoRI位點處，之后將Tn903卡那霉素抗性因子插入到鄰近的BamHI位點，從而分別產(chǎn)生出pBCSKΔhyaEkanr1059和pBCSKΔhyaEkanr1062。置換質粒的構建過程如下，將利用BssH2產(chǎn)生的1059和1062ΔhyaEkanr片段與1.2kb的溫敏性pBB192的1.2kb溫度敏感性復制起點相連接，其中所述復制起點是由pBCSK(Stratagene，Inc.)的BssH2位點切出的。參見美國專利5,840,556。因為ColE1起點在多殺巴斯德氏菌中無活性，因此只有產(chǎn)生質粒p192oriΔhyaEkanr1059或p192oriΔhyaEkanr1062的連接產(chǎn)物才能夠在宿主中復制。
通過電穿孔將置換質粒導入合適的多殺巴斯德氏菌株中。首先使細胞在Columbia肉湯培養(yǎng)基上生長，然后按照如下步驟準備用于電穿孔。在5000xg下離心15分鐘，得到細胞團，然后在0℃用100ml 272mM的蔗糖溶液洗滌一次。將細胞團在冰浴中重懸浮(細菌沉淀272mM蔗糖溶液的比例是1∶3)。將感受態(tài)細菌(100μl)置于0.1cm的電穿孔杯(Bio-Rad)中與200ng質粒DNA混合，其中所述質粒DNA既可以是未甲基化的，也可以是在體外用HhaI進行了甲基化的。在加入DNA后，立即將細胞進行電穿孔(Gene pulser，Bio-Rad)，所使用的條件是18,000V/cm，800歐姆(ohm)和25mFd，時間常數(shù)為11到15msec。
向已經(jīng)進行了電穿孔的細胞中加入Columbia肉湯培養(yǎng)基(1ml，0℃)，然后在25℃溫育上述重懸浮物大約25分鐘。使細胞在30℃恢復2小時，然后鋪到含有50μg/ml卡那霉素的Columbia瓊脂培養(yǎng)板上。在30℃溫育24小時后觀察到菌落。使轉化細胞在包含卡那霉素的肉湯培養(yǎng)基中于30℃生長過夜。然后將細胞鋪到含有50μg/ml卡那霉素的右旋糖淀粉瓊脂培養(yǎng)板上，并在3℃使之生長24小時。
在不適宜質粒復制的溫度下含有整合質粒的細胞能夠在抗生素選擇中存活，因為置換質粒的整合會引起無莢膜表型，因此可以鑒定出這些整合了質粒的細胞。區(qū)分生長在右旋糖淀粉瓊脂培養(yǎng)板上的菌株1059和1062的有莢膜和無莢膜多殺巴斯德氏菌落是很容易的。兩個株系的野生型有莢膜菌落均含有透明質酸，其是莢膜的主要組成成分，它使菌落看上去比較粘滑；當在斜向透射燈下觀察時，這些菌落顯示出類似珍珠的彩虹色。相比之下，無莢膜的單交換突變株不是粘滑的，也不具有彩虹色。
將單交換突變株轉移到?jīng)]有添加抗生素的5ml Columbia肉湯培養(yǎng)基中，并在30℃溫育過夜，使質粒從染色體上分離下來。然后轉移到不含抗生素的右旋糖-淀粉瓊脂培養(yǎng)板上，在38℃培養(yǎng)12小時。鑒定雙交換突變株的起始測試包括將表現(xiàn)為無莢膜的菌落細胞陳列影印鋪板到右旋糖淀粉瓊脂培養(yǎng)板上，其分別是含有抗生素的或不含有抗生素的，然后在38℃培養(yǎng)細胞。使用hyaE正向和反向引物對不能在抗生素培養(yǎng)板上生長的無莢膜菌落進行PCR分析。使用瓊脂糖凝膠電泳比較上述PCR產(chǎn)物與野生型親本的PCR產(chǎn)物之間的大小。
同時還對疑似多殺巴斯德氏1059和1062hyaE缺失突變株進行了測試，以確定它是否具有卡那霉素抗性基因。具有“純粹“hyaE缺失的推定突變株不具備抗生素抗性序列。另外還使用圓盤擴散酶聯(lián)分析(Kirby-Bauer test，Bauer等，Am.J.Clin.Path.45，493-96，1966)和墨汁染色分析(Indian ink stainingassay，Collins和Lyne，MICROBIOLOGICAL METHODS，Butterworths，Boston，Mass.，1976，110頁)來進一步確認上述兩個hyaE突變株具有無莢膜表型。
實施例2使用1059ΔhyaE多殺巴斯德氏菌菌株接種火雞幼禽使用三周齡的寬-胸白色火雞幼禽評估上述1059ΔhyaE多殺巴斯德氏菌菌株的減毒。每組四只幼禽，將懸浮在胰胨培養(yǎng)液中(0.1ml)的野生型或無莢膜突變株培養(yǎng)物指數(shù)生長期培養(yǎng)物的10倍系列稀釋液對各組進行肌內(nèi)注射。在攻擊后對幼禽觀察7天。
對于注射了野生型菌株的幼禽，其LD50值(也就是殺死半數(shù)幼禽所需的細菌量)小于103，而對于注射了hyaE突變株的幼禽，其LD50值超過107。
實施例3用1062ΔhyaE多殺巴斯德氏菌菌株接種小公牛(steer calves)將六只Holstein小公牛(體重大約是500磅)暴露于1062ΔhyaE多殺巴斯德氏無莢膜突變株。上述菌株是通過在頸部進行皮下注射(108cfu)或通過表面包裹飼料(109cfu)而施用的。
對上述暴露均沒有觀察到副作用。對于試驗的剩余組，粘膜接種物在上顎扁桃腺部位發(fā)生定居(5周)。用毒性親本株系進行氣管內(nèi)攻擊試驗(總劑量為1010cfu，共15ml)，在對照小公牛中產(chǎn)生了短暫的發(fā)熱現(xiàn)象(1-2天)，但在攻擊10天后，在對照或接種小公牛中觀察到輕微的肺部炎性變化或沒有變化。
序列表<110>Biotechnology Research Development CorporationThe United States of America，as Represented by the Department ofAgriculture<120>無莢膜的多殺巴斯德氏菌hyaE缺失突變株<130>000295.00018<150>US60/＿＿,＿＿(代理案卷號000295.00015)<151>2003-07-02<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>23<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<400>1atgaaaaagg ttaatatcat tgg 23<210>2<211>24<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<400>2ttaaccttgc ttgaatcgtt tacc 24<210>3<211>30<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<400>3aaagatatc ttggtttactt caataatttc 30<210>4<211>33<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<400>4aaagatatca ctgcatctgt tcaatcaacg agc33<210>5<211>1870<212>DNA
<213>多殺巴斯德氏菌<400>5tatgaaaaag gttattatca ttggacataa acagtctaac tatcaagatg ttgaaaaggt 60ttttcaatgt tatgggatga atcccccgct tccatcaaaa cgtgaaaaaa tgtcccccat 120cgaaattggc catgtgctta ataaagtatt accaagtctt gagcacacac ctaaaaatgt 180atctttactt tctaataaga aaagcaaaat aaaaaaaggg aattcagcca aaaataaatc 240tcataagcac gctaaaacga acacaataca aacgacttcg agcatctggg ataacttatc 300tctcgatttg atgctcgcga atatcgagca aaatttttgg ggatggtctg atcctaatgc 360aattcaaata ttagattatt gggctaacct tgacccaaac attcatttcg tctttgttta 420tgataagcca gaaaatttat tccaatatca tagcttagaa gaggctctca aattagataa 480acacaccgta caagaaaaat ttgaagagtg gcaaacctac aatgaaaaaa tcctaactta 540ctttaataaa tataaagatc gtagtgtatt actgaataca caacaactcc aaaatactaa 600aaaaacatca ctgtctgaaa tttataaaca tatttctgca cctgatgcat tagtcaaaaa 660actgaatgaa ccttctctaa ataaagagat ggaaattatt gaagtaaacc aagatttatc 720tcaccaagaa gaatgtccac tgtctaactt tattgttagc caaattataa aaaattctcc 780tactgttacg caggtatatg aagaattaca gtcgcatgct gatctgcctt atatttcaga 840acaaaaatta gtaaatgatg ccgattttgc tctccttgca tggaaagata tgattcaaaa 900acaagtcgat gcaaatcaat atcaacatga aaaagaatta gaacttagca caataaaaga 960acgtcaatta gaggtcacag agaaatatca attgacggaa caaaaactgt cagaaacaca1020aaaagaaatc gaacaaatta aagatgaaaa tagaaaagta aaatctgaaa aagcaaaact1080cactgcatct gttcaatcaa cgagcaaaat actttctgag aaagaaaaag agatttcttg1140cataaaaagt gaaaatacaa agattaaaga agaaaaaatt aaaattgatg aagcatacca1200cttaaccaag aaaaccttgt cggataaaga aaaagccctc aaaacgcatc aagatgaaat1260tgaagcgctc aagataattt ttaatgaaaa tatttccgta caagaagata tgcaagaaaa1320atttcaggaa accaataaaa gaaaacaaga acttgaacaa gagctaaaag ccatatcgga1380taagaaagca ttattagaaa cagaaaacag ccaaaaaacc caagtatctg agtctttaga1440aaatgaaaat aaagtgttat tagctcaact ccaactcatt caagaagaat tagaaaaact1500ttatattgac aatcaagtat taaaagctaa accacgcctt tacggtgcag ctgatcgcat1560aaaaaaccaa ttaacttatc gactaggtta caaaatacaa agacatggaa gaagtctatt1620tggtctcatt tttcttcctt tcatcttatt tttcacctat ctgggcttta aaagagagat1680gaaaaagtac gaatggaata ccctcccacc aattcacgag tatgaagacg cgcataaagc1740aaaccgcatt aaaagccatt tatcttataa attgggtgtc atctttttac aagaaatcaa1800aaatccgttt aagtggctta ctctccctta caaactgatt aaagaaggta aacgattcaa1860gcaaggttaa 1870<210>6<211>1870<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<400>6tatgaaaaag gttattatca ttggacataa acagtctaac tatcaagatg ttgaaaaggt 60ttttcaatgt tatgggatga atcccccgct tccatcaaaa cgtgaaaaaa tgtcccccat120cgaaattggc catgtgctta ataaagtatt accaagcctt gagcacacac ctaaaaatgt180atctttactt tctaataaga aaagcaaaat aaaaaaaggg aattcagcca aaaataaatc240tcataagcac gctaaaacga acacaataca aacgacttcg agcatctggg ataacttatc300tctcgatttg atgctcgcga atatcgagcg aaatttttgg ggatggtctg atcctaatgc360aattcaaata ttagattatt gggctaacct cgacccaaac attcatttcg tctttgttta420tgataagcca gaaaatttat tccaatatca tagcttagaa gaggctctca aattagataa480acacaccgta caagaaaaat ttgaagagtg gcaaacctac aatgaaaaaa tcctaactta540ctttaataaa tataaagatc gtagtgtatt actgaataca caacaactcc aaaatactaa600
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<223>插入氨基酸<400>9Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly1 權利要求
1.一種分離的A血清型多殺巴斯德氏細菌(P.multocide)，其包含hyaE基因的全部缺失或部分缺失，其中所述缺失減弱了該細菌的毒性。
2.權利要求1所述的細菌，其不含抗生素抗性基因。
3.權利要求1所述的細菌，其不含外源DNA。
4.權利要求1所述的細菌，其是A3血清型。
5.權利要求1所述的細菌，其是A1血清型。
6.權利要求1所述的細菌，其是A4血清型。
7.權利要求1所述的細菌，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
8.權利要求1所述的細菌，其包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
9.權利要求1所述的細菌，其包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
10.權利要求1所述的細菌，其是活的。
11.權利要求1所述的細菌，其是凍干的。
12.權利要求1所述的細菌，其是死亡的。
13.一種用于誘導針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的疫苗，包含權利要求1所述的細菌；和藥學上可接受的載體。
14.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌不含抗生素抗性基因。
15.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌不含外源DNA。
16.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌是A3血清型。
17.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌是A1血清型。
18.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌是A4血清型。
19.權利要求13的疫苗，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
20.權利要求13的疫苗，其中所述細菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
21.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
22.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌是活的。
23.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌是凍干的。
24.權利要求13所述的疫苗，其中所述細菌是死亡的。
25.權利要求13所述的疫苗，其包裝中帶有將所述疫苗施用給有蹄動物，以提供針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的施用說明書。
26.權利要求13所述的疫苗，其包裝中帶有將所述疫苗施用給鳥類，以提供針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的施用說明書。
27.一種適用于有蹄動物、包含權利要求1所述細菌的飼料。
28.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌不含抗生素抗性基因。
29.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌不含外源DNA。
30.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌是A3血清型。
31.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌是A1血清型。
32.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌是A4血清型。
33.權利要求27所述的飼料，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
34.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
35.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
36.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌是活的。
37.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌是凍干的。
38.權利要求27所述的飼料，其中所述細菌是死亡的。
39.權利要求27所述的飼料，其包裝中帶有將所述飼料施用給有蹄動物，以提供針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的施用說明書。
40.一種適用于鳥類、包含權利要求1所述細菌的飼料。
41.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌不含抗生素抗性基因。
42.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌不含外源DNA。
43.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌是A3血清型。
44.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌是A1血清型。
45.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌是A4血清型。
46.權利要求40所述的飼料，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
47.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
48.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
49.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌是活的。
50.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌是凍干的。
51.權利要求40所述的飼料，其中所述細菌是死亡的。
52.權利要求40所述的飼料，其包裝中帶有將所述飼料施用給鳥類，以提供針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的施用說明書。
53.一種誘導針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力的方法，該方法包括如下步驟將權利要求1所述的細菌施用給有蹄動物或鳥類，由此由所述細菌為所述有蹄動物或鳥類提供針對野生型多殺巴斯德氏菌的保護性免疫力。
54.權利要求53所述的方法，其中所述細菌不含抗生素抗性基因。
55.權利要求53所述的方法，其中所述細菌不含外源DNA。
56.權利要求53所述的方法，其中所述細菌是A3血清型。
57.權利要求53所述的方法，其中所述細菌是A1血清型。
58.權利要求53所述的方法，其中所述細菌是A4血清型。
59.權利要求53所述的方法，其中hyaE蛋白的239-359位氨基酸被缺失。
60.權利要求53所述的方法，其中所述細菌包含SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
61.權利要求53所述的方法，其中所述細菌包含SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
62.權利要求53所述的方法，其中所述細菌是活的。
63.權利要求53所述的方法，其中所述細菌是凍干的。
64.權利要求53所述的方法，其中所述細菌是死亡的。
65.權利要求53所述的方法，其中將所述細菌施用給有蹄動物。
66.權利要求65所述的方法，其中所述有蹄動物是?？苿游?。
67.權利要求53所述的方法，其中將所述細菌施用給鳥類。
68.權利要求53所述的方法，其中將所述細菌施用給鳥類，并且所述鳥類是家禽。
69.權利要求53所述的方法，其中將所述細菌施用給鳥類，并且所述鳥類選自如下的家禽雞、火雞、鴕鳥、斗雞、乳鴿、珍珠雞、稚雞、鵪鶉、鴨子、鵝和鴯鹋。
70.權利要求53所述的方法，其中將所述細菌施用給鳥類，并且所述鳥類是雞。
71.權利要求53所述的方法，其中將所述細菌施用給鳥類，并且所述鳥類是火雞。
72.權利要求53所述的方法，其中經(jīng)皮下給予所述細菌。
73.權利要求53所述的方法，其中經(jīng)肌內(nèi)給予所述細菌。
74.權利要求53所述的方法，其中經(jīng)口服給予所述細菌。
75.權利要求53所述的方法，其中通過包裹到飼料表面而給予所述細菌。
76.權利要求53所述的方法，其中經(jīng)鼻內(nèi)給予所述細菌。
77.權利要求53所述的方法，其中所述細菌的施用劑量在大約104和大約109cfu之間。
78.權利要求53所述的方法，其中所述劑量在大約104和大約106cfu之間。
全文摘要
一種無莢膜的多殺巴斯德氏菌hyaE缺失型突變株，可以將其施用給哺乳動物，尤其是有蹄動物，或者鳥類，以提供對野生型多殺巴斯德氏菌(P.multocida)的保護性免疫，例如預防或降低哺乳動物尤其是家畜、有蹄動物和寵物出血性敗血癥或肺炎的嚴重程度，或者預防或降低鳥類尤其是家禽患有禽霍亂的嚴重程度。
文檔編號C12N1/20GK1798574SQ200480015249
公開日2006年7月5日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權日2003年7月2日
發(fā)明者R·E·布里戈斯, F·M·塔圖姆 申請人:生物技術研究與發(fā)展公司, (由農(nóng)業(yè)部代表的)美利堅合眾國