專利名稱：Sars病毒抗原的細(xì)胞表面表達(dá)載體和用該載體轉(zhuǎn)化的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在微生物表面表達(dá)SARS抗原的載體，由該載體轉(zhuǎn)化的微生物，以及用于預(yù)防SARS的疫苗，該疫苗包括轉(zhuǎn)化的微生物或其提取物以及純化的物質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種表面表達(dá)載體，其包括一種編碼誘導(dǎo)SARS的冠狀病毒的抗原蛋白的基因，以及一種或兩種或多種編碼微生物表面錨定序列(anchoring motif)的聚-γ-谷氨酸合成酶復(fù)合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，還涉及被該載體轉(zhuǎn)化的微生物以及包括該轉(zhuǎn)化微生物作為有效成分的SARS疫苗。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸性綜合征(SARS)是一種新型的流行性疾病，自從2002年11月在中國廣東省首次開始爆發(fā)，其已遍布全球，包括香港、新加坡、加拿大(多倫多)等地區(qū)。該流行病表現(xiàn)出呼吸性癥狀，如發(fā)燒38℃或更高、咳嗽、呼吸困難、非典型性肺炎。SARS的作用物就是變異性致病冠狀病毒。
通常，冠狀病毒家族成員是具有(+)RNA的很大的RNA病毒。染色體由約29,000至31,000堿基對組成，顯微鏡下可觀察到該病毒呈冠狀。能引起人類上呼吸道疾病，引起動(dòng)物的呼吸系統(tǒng)、肝臟、神經(jīng)和腸道疾病。自然界中存在三組冠狀病毒，其中組I和組II感染哺乳動(dòng)物，組III感染鳥類。
已知的冠狀病毒有時(shí)會引起免疫體系能力較弱的人類發(fā)生與肺部有關(guān)的疾病，或引起動(dòng)物如狗、貓、豬、鼠、鳥等的嚴(yán)重疾病。冠狀病毒突變率很高，重組率高達(dá)約25％。推測這些特點(diǎn)導(dǎo)致原始冠狀病毒發(fā)生變異，而形成新型的突變的冠狀病毒(SARS冠狀病毒)，該病毒從動(dòng)物傳播至人類。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計(jì)，自2002年11月起，31個(gè)國家中有7,447名SARS疑似患者，其中有551名死亡。2003年的SARS感染危險(xiǎn)區(qū)域包括中國的北京、廣東、香港、內(nèi)蒙古、山西和天津，新加坡、加拿大的多倫多、臺灣、蒙古的烏蘭巴托、菲律賓等。然而，還有傳播到全世界的風(fēng)險(xiǎn)。
自從2002開始爆發(fā)以來，關(guān)于SARS冠狀病毒，德國熱帶醫(yī)學(xué)的研究所首先對SARS病毒的核苷酸序列進(jìn)行破譯。該研究小組通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))破譯了一部分基因的核苷酸序列。破譯結(jié)果提供給了一家德國生物工程公司Artus GmbH，用來開發(fā)檢測SARS病毒感染的試劑盒。該試劑盒通過將SARS疑似患者體內(nèi)的病毒基因擴(kuò)增來檢測出SARS的感染。
之后，到目前SARS病毒的全基因組已被破譯，已完全分析了超過12個(gè)分離出的毒株的序列。首先被分離出的Urbani株[取自死于SARS的WHO代表團(tuán)醫(yī)生的名字，SARS-Cov株(Rota，PA，Science 1085952，2003；GenBankAccession AY278741)]的全部序列是美國CDC研究小組破譯的。加拿大大不列顛哥倫比亞癌癥研究中心(Canada British Columbia Cancer search center)小組分析了2003年4月12日從加拿大多倫多一名患者體內(nèi)分離出的SARSTor2病毒株的全部序列(Marra，M.A.，Science 1085953，2003；GenBankAccession 274119)。
盡管這兩個(gè)研究小組分析了不同地區(qū)SARS感染者體內(nèi)分離出的冠狀病毒，但這兩種病毒顯示出的區(qū)別僅是15個(gè)堿基對的不同。這暗示了SARS是從同一病毒被誘導(dǎo)產(chǎn)生的。還有，根據(jù)SARS冠狀病毒的基因分析結(jié)果，可以看出SARS冠狀病毒的蛋白質(zhì)組成與現(xiàn)存冠狀病毒的蛋白質(zhì)組成相同，但基因組以及基因組編碼的氨基酸同源性卻很低。鼠肝炎病毒和火雞支氣管病毒都與SARS冠狀病毒有相似性。但是，分子分類學(xué)分析提供了SARS冠狀病毒與其它冠狀病毒的相關(guān)性，結(jié)果說明SARS冠狀病毒與現(xiàn)存的組不同。
目前，SARS冠狀病毒的鑒定始于PCR，抗體檢測的陽性結(jié)果是由ELISA或IFA所確定的。病毒的分離是通過對PCR鑒定的患者進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)檢測，以確定SARS冠狀病毒的感染。
目前還沒有治療SARS的基本方法，只有輔助治療。對SARS冠狀病毒這種新的流行病的作用物的研究才剛剛起步，還沒有開發(fā)出預(yù)防SARS的疫苗。世界各地已開始了開發(fā)預(yù)防SARS的疫苗的多方面研究。
在微生物的細(xì)胞表面上附著并表達(dá)所需蛋白的技術(shù)被稱作細(xì)胞表面展示技術(shù)(cell surface display technology)。細(xì)胞表面展示技術(shù)采用微生物如細(xì)菌或酵母菌的表面蛋白作為表面錨定序列而在表面上表達(dá)外源蛋白，這種技術(shù)的應(yīng)用范圍包括重組活疫苗的制備、肽/抗體庫的構(gòu)建以及篩選、全細(xì)胞的吸附、全細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化催化劑等。該技術(shù)的應(yīng)用范圍由細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)所決定。因此，細(xì)胞表面展示技術(shù)具有巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。
對于連續(xù)的細(xì)胞表面展示技術(shù)，表面錨定序列是至關(guān)重要的。本技術(shù)的核心是選擇并開發(fā)出能在細(xì)胞表面有效表達(dá)外源蛋白的結(jié)構(gòu)。
因此，為了選擇表面錨定序列，應(yīng)考慮以下特征(1)它應(yīng)該具有分泌信號來幫助外源蛋白通過細(xì)胞內(nèi)膜，從而使外源蛋白能轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面上。(2)它應(yīng)具有靶信號來幫助外源蛋白穩(wěn)定地固定到細(xì)胞外膜的表面上。(3)它可在細(xì)胞表面上大量地被表達(dá)，而不影響細(xì)胞的生長。(4)它與蛋白的大小無關(guān)，且能表達(dá)外源蛋白而不會改變蛋白的三維結(jié)構(gòu)。然而，還沒有開發(fā)出滿足上述條件的表面錨定序列。
已知的和目前使用的表面錨定序列通常分為四種類型的細(xì)胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、表面器官蛋白如鞭毛蛋白。在革蘭氏陰性菌中，已經(jīng)使用了細(xì)胞外膜蛋白，諸如LamB、PhoE(Charbit et al.，J.Immunol.，1391658，1987；Agterberg et al.，Vaccine，885，1990)、OmpA等。采用的脂蛋白有諸如TraT(Felici et al.，J.Mol.Biol.，222301，1991)、PAL(與脂蛋白有關(guān)的肽聚糖)(Fuchsetal.，Bio/Technology，91369，1991)以及Lpp(Francisco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713，1992)。作為表面錨定序列來表達(dá)外源蛋白的有黏著在1型菌毛上的菌毛蛋白(fimbriae protein)，如FimA或FimH(Hedegaard etal.，Gene，85115，1989)，以及菌毛蛋白(pili protein)如PapA pilu亞單位。此外，還有報(bào)道能作為表面錨定序列的包括冰核蛋白(ice nucleation protein)(Jungetal.，Nat.Biotechnol.，16576，1998；Jung et al.，Enzyme Microb.Technol.，22348，1998；Lee etal.，Nat.Biotechnol.，18645，2000)，Klebsiela oxytoca的支鏈淀粉酶(Komacker et al.，Mol.Microl.，41101，1990)、Neiseria的IgA蛋白酶(Klauser et al.，EMBO J.，91991，1990)、附著在大腸桿菌上的AIDA-1、志賀菌屬的VirG蛋白，以及Lpp和OmpA的融合蛋白。據(jù)報(bào)道，在使用革蘭氏陽性菌的情況下，可利用金黃色葡萄球菌中的蛋白A和FnBPB蛋白為表面錨定序列、利用乳酸菌的表面殼蛋白進(jìn)行表面表達(dá)、利用革蘭氏陽性菌的表面蛋白如化膿性葡萄球菌遺傳因子(Staphylococcus pyogenes)的M6蛋白(Medaglini，D et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，926868，1995)、炭疽熱細(xì)菌的S-層蛋白EA1、枯草芽孢桿菌CotB等作為錨定序列能有效表達(dá)瘧疾抗原。
本發(fā)明人開發(fā)了一種能在微生物細(xì)胞表面上有效表達(dá)外源蛋白的新型載體，該載體使用桿菌屬菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶復(fù)合物基因(pgsBCA)作為新型表面錨定序列，還開發(fā)了一種在被該載體轉(zhuǎn)化的微生物表面上大量表達(dá)外源蛋白的方法(韓國專利申請?zhí)?0-2001-48373)。
研究人員已開始從事利用上述表面錨定序列通過基因工程方法在適于進(jìn)行大量生產(chǎn)的細(xì)菌體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)致病性抗原或抗原決定部位的研究。尤其是，已有報(bào)道，與減毒致病菌或病毒疫苗相比，口服表面上表達(dá)外源免疫原的非致病活菌后，能誘導(dǎo)更持久、更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)歸功于細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的佐劑作用，從而增加了表面上表達(dá)的外源蛋白的抗原性以及活體對活菌產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。利用該表面表達(dá)體系開發(fā)非致病性細(xì)菌的重組活疫苗已引起了人們的注意。
因此，本發(fā)明人成功地通過選擇基因并對非致病性微生物表面上的蛋白質(zhì)分析，來大量表達(dá)SARS冠狀病毒抗原，其中，食品安全得以保障，如通過源于桿菌菌株的聚-γ-谷氨酸合成復(fù)合物基因(pgsBCA)作為表面錨定序列而轉(zhuǎn)化的乳酸菌，并開發(fā)了經(jīng)濟(jì)且穩(wěn)定的疫苗，通過口服微生物來誘導(dǎo)血液中產(chǎn)生SARS冠狀病毒的抗體和粘膜免疫。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種通過利用微生物表面表達(dá)體系來表達(dá)SARS冠狀病毒抗原的載體，以及被載體轉(zhuǎn)化的微生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種在表面表達(dá)SARS冠狀病毒抗原的轉(zhuǎn)化的微生物，用于預(yù)防SARS的疫苗，該疫苗包括從微生物中提取的SARS冠狀病毒抗原或從微生物中純化的SARS冠狀病毒抗原作為有效成分。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的表面表達(dá)載體包括一種或兩種或多種編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復(fù)合物的pgsB，pgsC和pgsA基因以及一種編碼SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的基因。
根據(jù)本發(fā)明，任何編碼SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白的基因都可用作表面抗原蛋白基因?？蓡为?dú)使用SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白基因或其兩種或多種復(fù)合物。編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復(fù)合物的基因優(yōu)選包括pgsA。刺突抗原蛋白可以是SARS SA，SARS SB，SARS SC，SARS SD或SARS SBC，核殼抗原蛋白可以是SARS NA，SARS NB或SARS N。
本發(fā)明提供了一種被表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物以及制備SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)所述微生物。
本發(fā)明適用的微生物可以是對生物體無毒的任何微生物或減毒微生物。例如，所述微生物適宜地選自革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌(E.coli)，傷寒桿菌(Salmonella typhi)，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)，志賀菌(Shigella)等，或革蘭氏陽性菌，如芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和鏈球菌(Streptococcus)等。尤其優(yōu)選的是可食用微生物，如乳酸菌。
本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防SARS的疫苗，其包括表面上表達(dá)抗原蛋白的微生物、從已破碎的該微生物細(xì)胞膜組成中提取的粗提物、或從微生物中純化的抗原蛋白作為有效成分。
本發(fā)明的疫苗可以作為藥物應(yīng)用以預(yù)防由SARS冠狀病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的SARS(嚴(yán)重急性呼吸綜合征)。
本發(fā)明的疫苗可口服服用，或存在于食品中，或皮下或腹膜內(nèi)注射或經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用。
至今，SARS冠狀病毒的感染已知由傳染性飛沫感染呼吸器官所導(dǎo)致，推測在呼吸器官的粘膜表面發(fā)生。因此，通過粘膜免疫來預(yù)防感染是非常重要的。由于在表面上表達(dá)SARS冠狀病毒抗原的微生物能更有效地在粘膜上誘導(dǎo)抗體的形成，因此通過口服或鼻內(nèi)途徑施用轉(zhuǎn)化的微生物得到的疫苗比胃腸外施用的疫苗在預(yù)防SARS冠狀病毒方面更有效。


通過結(jié)合下述附圖進(jìn)行詳細(xì)說明，從而對本發(fā)明的進(jìn)一步目的以及優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行更充分的了解。
圖1為根據(jù)Kyte-Doolittle方法的親水圖、Jameson-wolf方法的抗原性指數(shù)和Emini方法的表面可能性圖所顯示出的豬的傳染性胃腸炎病毒的4種抗原位點(diǎn)(A，B，C，D)與SARS冠狀病毒的刺突蛋白之間的關(guān)系。
圖2為根據(jù)Kyte-Doolittle方法的親水圖，Jameson-wolf方法的抗原性指數(shù)和Emini方法的表面可能性圖所顯示出的豬的傳染性胃腸炎病毒的核殼蛋白與SARS冠狀病毒的核殼蛋白之間的關(guān)系。
圖3A是本發(fā)明的包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌為宿主的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA的基因圖，圖3B是本發(fā)明的pHCE2LBpgsA-SARS SC的基因圖，圖3C是本發(fā)明的pHCE2LBpgsA-SARS SBC的基因圖。
圖4A是本發(fā)明的載體pHCE2LBpgsA-SARS NB的基因圖，圖4B是本發(fā)明的pHCE2LBpgsA-SARS N的基因圖。
圖5A、5B和5C通過Western免疫印跡顯示pgsA的特異性抗體與融合蛋白間的特異性結(jié)合，來鑒定乳酸菌中與細(xì)胞外膜蛋白pgsA融合的SARSSA、SARS SC和SARS SBC抗原的表達(dá)。
圖6A和6B采用乳酸菌細(xì)胞的蛋白片段作為pgsA的特異性抗體進(jìn)行Western免疫印跡，來識別與乳酸菌中細(xì)胞外膜蛋白pgsA融合的SARS SA和SARS SBC抗原的表面表達(dá)，圖6C為通過FACS掃描檢測乳酸菌中的SARS SBC抗原的表面表達(dá)。
圖7A和7B采用乳酸菌細(xì)胞的蛋白片段作為pgsA的特異性抗體進(jìn)行Western免疫印跡，來識別與乳酸菌中細(xì)胞外膜蛋白pgsA融合的SARS NB和SARS N抗原的表面表達(dá)。
圖8為本發(fā)明的分別用進(jìn)行表面表達(dá)的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測)鑒定出該轉(zhuǎn)化菌株具有抗原部分的表面表達(dá)，該轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)口服和鼻內(nèi)給藥后，在小鼠血清中所測得的SARS SA和SARS SC抗原的IgG抗體值。
圖9為本發(fā)明的分別用進(jìn)行表面表達(dá)的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA鑒定出該轉(zhuǎn)化菌株具有抗原部分的表面表達(dá)，該轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)口服和鼻內(nèi)給藥后，在小鼠的洗腸液和支氣管和肺泡的洗液中所測得的SARS SA和SARS SC抗原的IgA抗體值。
圖10為本發(fā)明的分別用進(jìn)行表面表達(dá)的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA鑒定出該轉(zhuǎn)化菌株具有抗原部分的表面表達(dá)，該轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)口服和鼻內(nèi)給藥后，所測定的小鼠血清中SARS NB抗原部分的IgG抗體值。
圖11為本發(fā)明的分別用進(jìn)行表面表達(dá)的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB載體轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌菌株，并且通過ELISA鑒定出該轉(zhuǎn)化菌株具有抗原部分的表面表達(dá)，該轉(zhuǎn)化菌株經(jīng)口服和鼻內(nèi)給藥后，在小鼠的洗腸液和支氣管和肺泡的洗液中所測得的SARS NB抗原的IgA抗體值。
最佳實(shí)施方式通過下述實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。對于本領(lǐng)與普通技術(shù)人員而言，顯而易見，這些實(shí)施例僅用于對本發(fā)明進(jìn)行具體解釋說明，而本發(fā)明的范圍并不局限于此。
尤其是，盡管下述實(shí)施例采用了SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點(diǎn)基因以及核殼蛋白的抗原位點(diǎn)基因，但任何抗原蛋白基因都可單獨(dú)使用或作為兩種或多種的復(fù)合物使用。
在下述實(shí)施例中，所采用的與聚-γ-谷氨酸的合成有關(guān)的細(xì)胞外膜蛋白的基因pgsBCA是從枯草芽孢桿菌chungkookjang變種(KCTC 0697BP)所獲得。然而，根據(jù)本發(fā)明，基因包括利用pgsBCA制備的載體，其中pgsBCA是從產(chǎn)生poly-γ-谷氨酸的所有桿菌屬菌株或被這些載體轉(zhuǎn)化的微生物中獲得的。例如，采用來源于其它菌株且與枯草芽孢桿菌chungkookjang變種中存在的pgsBCA基因序列有80％或更高同源性的pgsBCA基因制備用于疫苗的載體，以及載體使用的技術(shù)方案也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
以下實(shí)施例中，僅基因pgsBCA的pgsA用于構(gòu)建表面表達(dá)載體。然而，可以從間接實(shí)施例推斷出，使用部分基因pgsBCA或者全部基因pgsBCA來構(gòu)建疫苗用載體都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在以下實(shí)施例中，革蘭氏陰性菌傷寒桿菌和革蘭氏陽性菌乳酸菌被用作載體的宿主。然而，任何一種通過本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌都能獲得相同結(jié)果，這對于本領(lǐng)與技術(shù)人員而言是顯而易見的。
此外，在下述實(shí)施例中，僅用本發(fā)明的疫苗用載體所轉(zhuǎn)化的微生物作為活疫苗來施用到活體中。然而，根據(jù)與疫苗技術(shù)領(lǐng)域相關(guān)的知識，當(dāng)將從微生物提取的粗提物表達(dá)蛋白(SARS冠狀病毒的抗原蛋白)或純化的表達(dá)蛋白用于活體中，很自然能獲得相同或相近的結(jié)果。
實(shí)施例1SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點(diǎn)基因的合成SARS冠狀病毒的刺突蛋白是一種由1256個(gè)氨基酸構(gòu)成的糖蛋白。在其它已進(jìn)行大量檢測的冠狀病毒中，刺突蛋白大多嵌入到覆蓋在病毒顆粒表面上的包膜蛋白中，而具有暴露在外面的結(jié)構(gòu)。暴露位點(diǎn)和抗原位點(diǎn)已作為誘導(dǎo)病毒感染與預(yù)防感染的疫苗的靶抗原而被深入地研究。
因此，為了從SARS冠狀病毒的刺突蛋白的1256個(gè)氨基酸中選擇出能表現(xiàn)抗原性的位點(diǎn)，對其它已經(jīng)研究了抗原性并合成了豬傳染性胃腸炎(TGE)冠狀病毒的刺突蛋白進(jìn)行蛋白比較分析和結(jié)構(gòu)比較分析，從而選擇抗原位點(diǎn)。具體而言，已知豬傳染性胃腸炎病毒的刺突蛋白的抗原位點(diǎn)為4個(gè)位點(diǎn)(A，B，C，D)(Enjuanes，L.，Virology，183225，1991)。根據(jù)Kyte-Doolittle方法的親水圖，Jameson-wolf方法的抗原性指數(shù)和Emini方法的表面可能性圖，分析這些位點(diǎn)和SARS冠狀病毒的刺突蛋白的關(guān)系，從SARS冠狀病毒Tor2分離物的刺突蛋白的序列中選擇出SARS SA，SARS SB，SARS SC和SARS SD(圖1)。
首先，基于SARS冠狀病毒Tor2分離物的刺突蛋白的序列(21492-25259個(gè)堿基對，1255個(gè)氨基酸)，其中全部序列都已被鑒定出，2至114氨基酸位點(diǎn)有望成為所選擇的抗原位點(diǎn)，稱其為SARS SA，選擇的375至470氨基酸，稱其為SARS SB，選擇的510至596氨基酸，稱其為SARS SC，選擇的1117至1197氨基酸，稱其為SARS SD。在這些抗原位點(diǎn)中，對SARS SA和SARS SC位點(diǎn)進(jìn)行了合成。
為了合成SARS SA的113個(gè)氨基酸長度對應(yīng)的基因，用SEQ ID NOs1至8為引物進(jìn)行PCR，得到含有339bp的擴(kuò)增的SARS SA基因。
SEQ ID NO15′-ggatcctttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccg-3′SEQ ID NO25′-tgagtgtaattaggagcttgaacatcatcaaaagtggtacaacggtcaaggtc-3′SEQ ID NO35′-aattacactcaacatacttcatctatgcgtggggtttactatcctgatgaaatttttc-3′
SEQ ID NO45′-aaaatggaagaaataaatcctgagttaaataaagagtgtctgaacgaaaaattt-3′SEQ ID NO55′-cttccattttattctaatgttactgggtttcatactattaatcatacgtttggcaac-3′SEQ ID NO65′-ggcagcaaaataaataccatccttaaaaggaatgacagggttgccaaacgtatg-5′SEQ ID NO75′-atttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttgg-3′SEQ ID NO85′-ggtaccaagcttattacacagactgtgacttgttgttcatggtagaaccaaaaaccc-3′為了合成SARS SC的87個(gè)氨基酸長度所對應(yīng)的基因，用SEQ ID NOs9至14位引物進(jìn)行PCR，得到含261bp的擴(kuò)增的SARS SC基因。
SEQ ID NO95′-ggatccgtttgtggtccaaaattatctactgaccttattaagaaccagtgtgtcaat-3′SEQ ID NO105′-gaagaaggagttaacacaccagtaccagtgagaccattaaaattaaaattgacacact-3′SEQ ID NO115′-aactccttcttcaaagcgttttcaaccatttcaacaatttggccgtgatgtttctga-3′SEQ ID NO125′-ctaaaatttcagatgttttaggatcacgaacagaatcagtgaaatcagaaacat-3′SEQ ID NO135′-ctgaaattttagacatttcaccttgtgcttttgggggtgtaagtgtaattaca-3′SEQ ID NO145′-ggtaccaagcttattaaacagcaacttcagatgaagcatttgtaccaggtgtaattac-3′此外，通過合成獲得抗原位點(diǎn)基因，采用來自加拿大邁克爾史密斯基因?qū)W中心(Canada′s Michael Smith Genome Science Center)的SARS刺突cDNA克隆體(SARS冠狀病毒TOR2)為模板，以SEQ ID NOs15和16為引物，通過PCR擴(kuò)增得到編碼264至596氨基酸的含966bp的基因，將其命名為SARSSBC[該基因包括能產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵位點(diǎn)(PNAS，1012536，2004)]。
SEQ ID NO15(SBC正義)5′-cgcggatccctcaagtatgatgaaaat-3′SEQ ID NO16(SBC反義)5′-cggggtaccttaaacagcaacttcaga-3′實(shí)施例2SARS冠狀病毒的核殼蛋白的抗原位點(diǎn)基因的合成SARS冠狀病毒的核殼蛋白是一種由422個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)其它冠狀病毒的核殼蛋白都可作為抗原。這些抗原位點(diǎn)已經(jīng)被深入研究，以用作預(yù)防冠狀病毒感染的疫苗的靶向抗原。
因此，通過與豬傳染性胃腸炎(TGE)的冠狀病毒的核殼蛋白進(jìn)行蛋白比較分析，選擇SARS冠狀病毒的核殼蛋白的氨基酸中能表現(xiàn)出抗原性的位點(diǎn)，并進(jìn)行合成。
具體而言，根據(jù)Kyte-Doolittle方法的親水圖，Jameson-wolf方法的抗原性指數(shù)和Emini方法的表面可能性圖，分析豬傳染性胃腸炎病毒的核殼蛋白和SARS冠狀病毒的核殼蛋白之間的關(guān)系，從SARS冠狀病毒Tor2分離物的核殼蛋白的序列中選擇出SARS NA和SARS NB(圖2)。
首先，基于SARS冠狀病毒Tor2分離物的核殼蛋白序列(28120-29388個(gè)堿基對，422個(gè)氨基酸)，其中全部序列都已被鑒定出，2至157氨基酸位點(diǎn)有望成為所選擇的抗原位點(diǎn)，稱其為SARS NA，選擇的163至305氨基酸位點(diǎn)，稱其為SARS NB。本發(fā)明合成了SARS NB位點(diǎn)的基因。
為了合成SARS NB的143個(gè)氨基酸長度所對應(yīng)的基因，用SEQ IDNOs17至26為引物進(jìn)行PCR，得到含有429bp的擴(kuò)增的SARS NB基因。
SEQ ID NO175′-ggatcccctcaaggtacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggtagccgtgg-3′SEQ ID NO185′-accacgactacgtgatgaagaacgagaagaggcttgactgccgccacggctacc-3′SEQ ID NO195′-cacgtagtcgtggtaattcacgtaattcaactcctggcagcagtcgtggtaat-3′SEQ ID NO205′-gcgagggcagtttcaccaccaccgctagccatacgagcaggagaattaccacga-3′SEQ ID NO215′-gaaactgccctcgcacttttgctgcttgaccgtttgaaccagcttgagagcaa-3′SEQ ID NO225′-tagtgacagtttgaccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaa-3′SEQ ID NO235′-caaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgtcaaaaacgt-3′SEQ ID NO245′-ggaccacgacgcccaaatgcttgagtgacgttgtactgttttgtggcagtacgtttttg-3′SEQ ID NO255′-gggcgtcgtggtccagaacaaacccaaggtaatttcggggaccaagaccttatccgt-3′SEQ ID NO265′-ggtaccaagcttattaaatttgcggccaatgtttgtaatcagtaccttgacggataagg-3′此外，通過合成獲得抗原位點(diǎn)基因，采用來自加拿大邁克爾史密斯基因?qū)W中心的SARS核殼cDNA克隆體(SARS冠狀病毒TOR2)為模板，以SEQ IDNOs27和28為引物，通過PCR擴(kuò)增得到編碼2至305位氨基酸的912bp的基因，將其命名為SARS N。
SEQ ID NO27(N sense)5′-cgcggatcctctgataatggtccgcaa-3′SEQ ID NO28(N anti-sense)5′-cggggtaccttaaatttgcggccaatgttt-3′實(shí)施例3表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC的構(gòu)建以革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌為宿主，利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構(gòu)建能表面表達(dá)SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點(diǎn)SARS SA和SC的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC。
首先，用BamHI和KpnI消化pHCE2LBpgsA-HPVL1(KCTC 10349BP)，以將SARS冠狀病毒的刺突蛋白中的抗原位點(diǎn)SARS SA和SARS SC導(dǎo)入到能在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的宿主中表達(dá)人乳突瘤病毒的L1抗原的表面表達(dá)載體上(一種載體，其含有高表達(dá)啟動(dòng)子HCE啟動(dòng)子、參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白的基因(pgsBCA)中的pgsA，以及常用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的載體pAT中的HPV L1。)。
用限制酶BamHI和KpnI消化實(shí)施例1中合成的SARS SA和SARS SC抗原基因，然后連接到已制備的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA上的參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白的基因pgsA的C末端上，根據(jù)翻譯密碼子制備載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC(圖3A和3B)。用制備得到的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC質(zhì)粒的存在。
實(shí)施例4表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsASARS SBC的構(gòu)建利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構(gòu)建能表面表達(dá)SARS冠狀病毒的刺突蛋白的抗原位點(diǎn)SARS SBC的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SBC。
首先，按照實(shí)施例3中的方法，制備表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA。根據(jù)實(shí)施例1所描述的方法，以SARS冠狀病毒的SARS刺突cDNA克隆體為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼264-596氨基酸位點(diǎn)的基因，得到含996bp的SARSSBC基因。然后將SARS SBC基因嵌入到表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA中，制備pHCE2LBpgsA-SARS SBC(圖3C)。用制備的pHCE2LBpgsA-SARSSBC轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS SBC質(zhì)粒的存在。
實(shí)施例5表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsASARS NB的構(gòu)建利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構(gòu)建能表面表達(dá)SARS冠狀病毒的核殼蛋白的抗原位點(diǎn)SARS NB的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS NB。
首先，按照實(shí)施例3中的方法，制備表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA。用限制酶BamHI和KpnI消化實(shí)施例2中合成的SARS NB抗原基因，然后連接到已制備的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA上的參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白的基因pgsA的C末端上，根據(jù)翻譯密碼子制備載體pHCE2LBpgsA-SARS NB(圖4A)。再用制備得到的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS NB轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS NB質(zhì)粒的存在。
實(shí)施例6表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS N的構(gòu)建利用源于桿菌屬菌株、并參與合成聚-γ-谷氨酸的細(xì)胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA來構(gòu)建能表面表達(dá)SARS冠狀病毒的核殼蛋白的抗原位點(diǎn)SARS N的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS N。
首先，按照實(shí)施例3中的方法，制備表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA。根據(jù)實(shí)施例2所描述的方法，以SARS冠狀病毒的SARS核殼cDNA克隆體為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼2-305氨基酸位點(diǎn)的基因，得到含912bp的SARS N基因。然后將SARS N基因嵌入到表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA上，制備pHCE2LBpgsA-SARS N(圖4B)。用制備的pHCE2LBpgsA-SARS N轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性菌乳酸菌，檢測乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS N質(zhì)粒的存在。
實(shí)施例7乳酸菌上的SARS病毒刺突抗原蛋白的表面表達(dá)的確定用表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉(zhuǎn)化乳酸菌，檢測各抗原蛋白的表達(dá)。用pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌，轉(zhuǎn)化的菌株在MRS培養(yǎng)基(乳酸菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中培養(yǎng)至靜止期，37℃下進(jìn)行擴(kuò)增，誘導(dǎo)與基因pgsA合成的聚-γ-谷氨酸的C末端融合的SARS病毒刺突抗原的抗原位點(diǎn)的表達(dá)。
通過Western免疫印跡法，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和pgsA的特異性抗體檢測各刺突抗原的表達(dá)。對已被誘導(dǎo)表達(dá)的酪乳酸桿菌的全細(xì)胞進(jìn)行變性，得到相同細(xì)胞濃度的蛋白來制備樣本。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析這些蛋白，并將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(聚二氟偏二乙烯膜，Bio-Rad)上。將其上帶有蛋白的PVDF膜放在封閉緩沖液(50mM TrisHCl，5％脫脂乳，pH 8.0)中，振搖1個(gè)小時(shí)進(jìn)行封閉，與pgsA的兔源多克隆一級抗體反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，其中該抗體已用封閉緩沖液稀釋1000倍。
反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液清洗膜，再與兔的結(jié)合生物素的二級抗體反應(yīng)4小時(shí)，其中該二級抗體已用封閉緩沖液稀釋了1000倍。反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液清洗膜，再與抗生物素蛋白-生物素試劑反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，然后再清洗。用H2O2和DAB溶液處理清洗后的膜，將其用作底物，用著色劑確定pgsA的特異性抗體和融合蛋白之間的特異性結(jié)合(圖5)。圖5A中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2，3和4是被pHCE2LBpgsA-SARS SA轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌。圖5B中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2，3，4，5和6是被pHCE2LBpgsA-SARS SC/轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌。圖5C中，泳道1是未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2是被pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌。
如圖5所示，在所有乳酸菌的細(xì)胞中檢測到特異性融合蛋白[約54kDa的pgsA-SARS SA(圖5A)，約51kDa的pgsA-SARS SC(圖5B)和約78kDa的pgsA-SARS SBC(圖5C)]。
為了確定經(jīng)pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARSSBC表面表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的乳酸菌的表面上是否與pgsA一起表達(dá)了各抗原蛋白，通過超高速離心機(jī)將各載體轉(zhuǎn)化的乳酸菌破碎成細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，通過Western blot法，使用pgsA的特異性抗體檢測各融合蛋白的位置。
具體而言，收集由上述方法誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)表面表達(dá)的乳酸菌，配置成與未轉(zhuǎn)化的乳酸菌相同的細(xì)胞濃度。用TES緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)清洗細(xì)胞數(shù)次，將細(xì)胞懸浮于含5mg/ml溶菌酶、1mM PMSF和1mM EDTA的蒸餾水中，在-60℃下冷凍，室溫下解凍幾次，用DNase(0.5mg/mQ)和RNase(0.5mg/m)處理，然后進(jìn)行超聲處理使細(xì)胞破碎。然后，在4℃、10,000Xg下對細(xì)胞溶解物離心20分鐘，使未溶解的乳酸菌細(xì)胞(顆粒；全細(xì)胞部分)和細(xì)胞碎片(上清液)分離開。在4℃、21,000Xg下對分離出的細(xì)胞碎片離心1個(gè)小時(shí)，得到上清液(溶解部分)，上清液中含有乳酸菌和顆粒的細(xì)胞質(zhì)蛋白。所得顆粒懸浮于含1％SDS的TE溶液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH 7.4)中，得到乳酸菌的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)(細(xì)胞壁部分)。
利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和pgsA抗原的抗體，對上述各部分進(jìn)行Western免疫印跡分析，以確定各乳酸菌部分中與細(xì)胞壁上pgsA融合的SARS病毒的刺突抗原(圖6)。在圖6A中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS SA轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌的全細(xì)胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS SA轉(zhuǎn)化的菌株的溶解部分和細(xì)胞壁部分。在圖6B中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌的全細(xì)胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS SBC轉(zhuǎn)化的菌株的溶解部分和細(xì)胞壁部分。
如圖6所示，在乳酸菌的全細(xì)胞和細(xì)胞壁部分識別出了與pgsA融合的約54kDa的SARS SA蛋白以及與pgsA融合的約78kDa的SARS SBC蛋白。從這些結(jié)果可以看出，與pgsA融合的各個(gè)SARS抗原蛋白被表達(dá)并被pgsA遷移到乳酸菌表面上。
通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)流式細(xì)胞術(shù)可以鑒定出，SARS病毒的刺突抗原的抗原部分通過與聚-γ-谷氨酸合成蛋白pgsA的C末端融合，而在乳酸菌的表面上表達(dá)。
進(jìn)行免疫熒光染色，收集相同細(xì)胞濃度的誘導(dǎo)表達(dá)的乳酸菌。用緩沖液(PBS緩沖液，pH 7.4)洗滌細(xì)胞數(shù)次，再將細(xì)胞懸浮于含有1％牛血清白蛋白的1ml緩沖液中，與鼠源的SARS病毒刺突抗原的多克隆一級抗體在4℃反應(yīng)12個(gè)小時(shí)，其中該抗體被稀釋1000倍。反應(yīng)完成后，用緩沖液清洗細(xì)胞數(shù)次，將細(xì)胞懸浮于含有1％的牛血清白蛋白的0.1ml緩沖液中，與結(jié)合生物素的二級抗體在4℃反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，其中該抗體被稀釋1000倍。反應(yīng)完成后，用緩沖液清洗細(xì)胞數(shù)次，將細(xì)胞懸浮于含有1％的牛血清白蛋白的0.1ml緩沖液中，與生物素特異性的鏈霉親和素-R-藻紅蛋白染色試劑結(jié)合，其中該染色試劑被稀釋1000倍。
反應(yīng)完成后，清洗乳酸菌數(shù)次，用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測?？梢钥闯?，與未轉(zhuǎn)化的乳酸菌不同，SARS病毒的SBC刺突抗原蛋白在乳酸菌表面上被表達(dá)(圖6C)。在圖6C中，灰色部分源于未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，而白色部分源于pHCE2LBpgsA-SARS SBC/轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌。如圖6C所示，可清晰地看出，在由pHCE2LBpgsA-SARS SBC載體轉(zhuǎn)化的乳酸菌上，表面表達(dá)出了SBC刺突抗原蛋白，而在未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌中并未觀察到熒光表達(dá)。
實(shí)施例8乳酸菌上的SARS病毒核殼抗原蛋白的表面表達(dá)的確定用表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N轉(zhuǎn)化乳酸菌，并檢測各抗原蛋白的表達(dá)。
用pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N分別轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌，轉(zhuǎn)化的菌株在MRS培養(yǎng)基(乳酸菌MRS，Becton Dickinson andCompany Sparks，USA)中培養(yǎng)至靜止期，37℃下進(jìn)行擴(kuò)增，誘導(dǎo)分別與基因pgsA合成的聚-γ-谷氨酸的C末端融合的SARS病毒核殼抗原的抗原位點(diǎn)的表達(dá)。
為了確定經(jīng)pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N表面表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的乳酸菌的表面上是否與pgsA一起表達(dá)了各抗原蛋白，用實(shí)施例7相同的方法，通過超高速離心機(jī)將各載體轉(zhuǎn)化的乳酸菌破碎成細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)，通過Western blot法，使用pgsA的特異性抗體檢測各融合蛋白的位置。
結(jié)果是，利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和pgsA抗原的抗體，對上述各部分進(jìn)行Western免疫印跡分析，以確定各乳酸菌部分存在著與細(xì)胞壁上pgsA融合的SARS病毒的核殼抗原(圖7)。在圖7A中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS NB轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌的全細(xì)胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS NB轉(zhuǎn)化的菌株的溶解部分和細(xì)胞壁部分。在圖7B中，泳道1為未轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS N轉(zhuǎn)化的酪乳酸桿菌的全細(xì)胞，泳道3和泳道4分別是由pHCE2LBpgsA-SARS N轉(zhuǎn)化的菌株的溶解部分和細(xì)胞壁部分。
如圖7所示，從乳酸菌的全細(xì)胞和細(xì)胞壁部分中識別出了與pgsA融合的約57kDa的SARS NB蛋白以及與pgsA融合的約75kDa的SARS N蛋白。從這些結(jié)果可以看出，表達(dá)了與pgsA融合的各個(gè)SARS抗原蛋白，并且被pgsA遷移到了乳酸菌表面上。
實(shí)施例9具有表面表達(dá)SARS病毒的刺突抗原和核殼抗原蛋白的乳酸菌疫苗效果的分析用前述實(shí)施例中制備出的表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性菌酪乳酸桿菌，誘導(dǎo)酪乳酸桿菌表面上的抗原的表達(dá)。用小鼠模型檢測與涉及聚-γ-谷氨酸合成的細(xì)胞外膜蛋白pgsA相融合的SARS病毒刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的抗原性。
具體而言，根據(jù)本發(fā)明，用表面表達(dá)載體pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB轉(zhuǎn)化酪乳酸桿菌。收集細(xì)胞，得到相同的細(xì)胞濃度，用緩沖液(PBS緩沖液，pH 7.4)清洗細(xì)胞數(shù)次。給4-6周BALB/c小鼠每日3次隔日口服5X109具有表面表達(dá)的抗原的乳酸菌，一周后隔日服用每日3次，兩周后隔日服用每日3次，4周后隔日服用每日3次。給小鼠每日3次隔日通過鼻內(nèi)給予1×109具有表面表達(dá)的抗原的乳酸菌，一周后隔日每日3次給藥，兩周后每兩日給藥每日2次，4周后每兩日給藥每日2次。口服和鼻內(nèi)給藥后，每兩周取各小鼠的血清①，用ELISA檢測血清中的刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的IgG抗體值，并檢測②清洗各小鼠腸道的懸浮液和清洗各小鼠支氣管和肺泡的懸浮液中的刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的IgA抗體值。
每組分有10只BALB/c小鼠(4-6周)。將分別表達(dá)SARS SA和SARS SC的乳酸菌的混合物分為一組，表達(dá)SARS NB的乳酸菌分為一組，分別表達(dá)SARS SA、SARS SC和SARS NB的乳酸菌混合物分為一組。將這三組分成口服給藥組和鼻內(nèi)給藥組，包括對照組共8個(gè)組。
圖8示出小鼠血清中SARS病毒的刺突抗原蛋白SARS SA和SARS SC抗原的IgG抗體值。圖9是在清洗小鼠腸道的懸浮液和清洗小鼠支氣管和肺泡的懸浮液中，用ELISA檢測到的刺突抗原蛋白SARS SA和SARS SC抗原的IgA抗體值，其中A是口服組的IgA抗體值，B是鼻內(nèi)給藥組的IgA抗體值。
圖10示出小鼠血清中SARS病毒的核殼抗原蛋白SARS NB抗原的IgG抗體值。圖11是在清洗小鼠腸道的懸浮液和清洗小鼠支氣管和肺泡的懸浮液中，用ELISA檢測到的SARS病毒核殼抗原蛋白SARS NB抗原的IgA抗體值，其中A是口服組的IgA抗體值，B是鼻內(nèi)給藥組的IgA抗體值。
如圖8至圖11所示，可以看出，與對照組相比，單獨(dú)施用或聯(lián)合施用pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB轉(zhuǎn)化的乳酸菌的BALB/c小鼠的血清、腸洗液和支氣管-肺泡洗液中，SARS病毒的刺突抗原蛋白和核殼抗原蛋白的IgG抗體值和IgA抗體值明顯高。
因此，根據(jù)本發(fā)明，含有表面表達(dá)SARS病毒的刺突和核殼抗原蛋白的抗原部分的微生物能有效用作活疫苗。
雖然本發(fā)明參照具體示例性實(shí)施方式進(jìn)行說明與描述，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施方式，而由權(quán)利要求限定?？梢岳斫猓绢I(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的范圍和精神而改變或調(diào)整實(shí)施方式。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明，在表面上能表達(dá)誘導(dǎo)SARS的冠狀病毒的抗原蛋白的轉(zhuǎn)化的微生物，以及從微生物中提取和純化的抗原蛋白可有效用作預(yù)防和治療SARS的疫苗。尤其是，本發(fā)明使得采用表達(dá)SARS冠狀病毒抗原的重組菌株來經(jīng)濟(jì)地制備口服疫苗成為可能。
序列表<110>生物領(lǐng)先公司M.D.實(shí)驗(yàn)室生物領(lǐng)先日本公司韓國生命工學(xué)研究院<120>SARS病毒抗原的細(xì)胞表面表達(dá)載體和用該載體轉(zhuǎn)化的微生物<130>PCF052440C<150>KR10-2003-0035993<151>2003-06-04<160>28<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
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aattacactc aacatacttc atctatgcgt ggggtttact atcctgatga aatttttc58<210>4<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>13ctgaaatttt agacatttca ccttgtgctt ttgggggtgt aagtgtaatt aca 53<210>14<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>14ggtaccaagc ttattaaaca gcaacttcag atgaagcatt tgtaccaggt gtaattac58<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(SBC sense)<400>15cgcggatccc tcaagtatga tgaaaat 27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(SBC anti-sense)<400>16cggggtacct taaacagcaa cttcaga 27<210>17<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>17ggatcccctc aaggtacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggtag ccgtgg 56<210>18<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>18accacgacta cgtgatgaag aacgagaaga ggcttgactg ccgccacggc tacc54<210>19<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>19cacgtagtcg tggtaattca cgtaattcaa ctcctggcag cagtcgtggt aat 53<210>20<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>20
gcgagggcag tttcaccacc accgctagcc atacgagcag gagaattacc acga54<210>21<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>21gaaactgccc tcgcactttt gctgcttgac cgtttgaacc agcttgagag caa 53<210>22<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>22tagtgacagt ttgaccttgt tgttgttggc ctttaccaga aactttgctc tcaa54<210>23<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>23caaactgtca ctaagaaatc tgctgctgag gcatctaaaa agcctcgtca aaaacgt 57<210>24<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>24ggaccacgac gcccaaatgc ttgagtgacg ttgtactgtt ttgtggcagt acgtttttg 59
<210>25<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>25gggcgtcgtg gtccagaaca aacccaaggt aatttcgggg accaagacct tatccgt 57<210>26<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>26ggtaccaagc ttattaaatt tgcggccaat gtttgtaatc agtaccttga cggataagg 59<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(N sense)<400>27cgcggatcct ctgataatgg tccgcaa 27<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(N anti-sense)<400>28cggggtacct taaatttgcg gccaatgttt 30
權(quán)利要求
1.一種表面表達(dá)載體，其包括編碼聚-γ-谷氨酸合成酶復(fù)合物的pgsB、pgsC和pgsA基因中的任意一種或兩種或多種，以及一種編碼SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面表達(dá)載體，其中所述的刺突抗原蛋白為SARS SA、SARS SB、SARS SC、SARS SD或SARS SBC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表面表達(dá)載體，其中所述的核殼抗原蛋白為SARS NA、SARS NB或SARS N。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表面表達(dá)載體，其中所述的載體為pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC或pHCE2LBpgsA-SARS SBC。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表面表達(dá)載體，其中所述的載體為pHCE2LBpgsA-SARS NB或pHCE2LBpgsA-SARS N。
6.一種被權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其中所述的微生物選自下述微生物的組中大腸桿菌、傷寒桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、牛分枝桿菌、志賀菌、芽孢桿菌屬、乳酸菌、葡萄球菌、李斯特氏菌和鏈球菌。
8.一種制備SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求6的微生物。
9.一種預(yù)防SARS病毒的疫苗，其包括以權(quán)利要求8的方法所制備的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白作為有效成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述的抗原蛋白為微生物表面的表達(dá)形式、粗提形式或純化形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗通過口服施用或存在于食物中。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗用于皮下或腹膜內(nèi)注射。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗用于鼻內(nèi)給藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的微生物為乳酸菌。
15.權(quán)利要求14所述方法制備的乳酸菌，該乳酸菌表面上表達(dá)SARS冠狀病毒的刺突抗原蛋白或核殼抗原蛋白。
16.一種用于預(yù)防SARS的疫苗，其包括權(quán)利要求15的乳酸菌、從所述乳酸菌中提取的抗原蛋白、或從所述乳酸菌中純化的抗原蛋白作為有效成分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗通過口服施用或存在于食物中。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗用于皮下或腹膜內(nèi)注射。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗用于鼻內(nèi)給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SARS冠狀病毒抗原的表面表達(dá)載體，該載體包括一種編碼誘導(dǎo)SARS的冠狀病毒的抗原的基因，以及一種或兩種或多種編碼聚－γ－谷氨酸合成酶復(fù)合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，還涉及被表面表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物以及包括該微生物的SARS疫苗。本發(fā)明使得采用表達(dá)SARS冠狀病毒抗原的重組菌株來經(jīng)濟(jì)地制備預(yù)防和治療SARS的疫苗成為可能。
文檔編號C12N9/00GK1798844SQ200480015275
公開日2006年7月5日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月4日
發(fā)明者成文喜, 金哲仲, 鄭昌敏, 洪承杓, 李宗洙, 催在哲, 金光, 黑田俊一, 夫夏玲 申請人:生物領(lǐng)先公司, M.D.實(shí)驗(yàn)室, 生物領(lǐng)先日本公司, 韓國生命工學(xué)研究院