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      與stop-1相關(guān)的組合物和方法

      文檔序號(hào):426322閱讀:604來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:與stop-1相關(guān)的組合物和方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及STOP-1多肽,與STOP-1相關(guān)的抗體,核酸分子,拮抗劑,激動(dòng)劑,增效劑以及組合物,以及制備和利用上述物質(zhì)的方法,包括在哺乳動(dòng)物中診斷和治療腫瘤的方法。本發(fā)明還涉及與血管發(fā)生(angiogenesis)和脈管形成(vasculogenesis)有關(guān)的疾病(例如心血管以及腫瘤疾病)的診斷和治療。
      背景技術(shù)
      失控的細(xì)胞生長(zhǎng)是造成各種細(xì)胞類型的許多疾病的原因。例如,癌癥在來(lái)自增生形成腫瘤塊的正常組織的異常或腫瘤性細(xì)胞數(shù)目增多時(shí)發(fā)生。腫瘤細(xì)胞通常入侵相鄰組織,經(jīng)由血管和淋巴管系統(tǒng)擴(kuò)散到局部淋巴結(jié)以及并通過(guò)稱為轉(zhuǎn)移的過(guò)程擴(kuò)散到遠(yuǎn)處部位。在癌性生長(zhǎng)中,細(xì)胞在正常細(xì)胞不能生長(zhǎng)的條件下增殖。癌癥呈現(xiàn)多種形態(tài),特征在于不同程度的侵襲力和侵占性。惡性腫瘤(癌癥)在美國(guó)是造成死亡的第二主要原因,僅次于心臟病(Boring et al.,CA Cancel J.Clin.437(1993))。
      許多研究致力于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增生性紊亂例如癌癥的新治療。盡管有最近的進(jìn)展,仍非常需要鑒定并理解用于調(diào)控細(xì)胞增生的作用,以及開發(fā)可選或更為有效的治療方法以及治療和診斷性藥劑的新的細(xì)胞靶。還需要開發(fā)替代治療劑,以及治療特定細(xì)胞類型和治療異常細(xì)胞增生導(dǎo)致或相關(guān)疾病諸如癌癥等的方法。例如,結(jié)締組織生成是纖維母細(xì)胞的增生,和纖維結(jié)締組織的不成比例的形成,尤其是在癌基質(zhì)中。結(jié)締組織生成是腫瘤入侵和惡性的標(biāo)志。硬纖維瘤和腹部類纖維瘤是小結(jié)節(jié)或相對(duì)大塊且異常堅(jiān)硬的疤痕樣結(jié)締組織,其是纖維母細(xì)胞活躍增生的結(jié)果,最經(jīng)常出現(xiàn)在生育過(guò)子女的婦女的腹部肌肉中;所述纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)周圍的肌肉和筋膜。
      在出生后,脈管形成(內(nèi)皮細(xì)胞形成一級(jí)管狀網(wǎng)絡(luò))和血管生成(新血管從現(xiàn)存的血管生長(zhǎng)或出芽)在腫瘤疾病的病理生理中起重要作用(Semenza,G.L.,(2003)Ann.Rev.Med.5417-28)。脈管形成和血管生成之間的差別并不絕對(duì)而有重疊(Ribatti,D et al.,(2001)Mech.Dev.100157-163)。兩者都需要內(nèi)皮細(xì)胞增殖,遷移,新形成的聚集體的三維重組,以及利用類似的細(xì)胞外基質(zhì)粘附機(jī)制(Ribatti,同上)。利用抗血管生成療法諸如稱為Avasitin的抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體已顯示對(duì)治療癌癥有用。
      在本文中稱為STOP-1或UNQ762的另一種細(xì)胞蛋白在一些腫瘤中過(guò)表達(dá)(例如,WO 01/163318,WO 01/68848,WO 02/00690,WO 02/08284,WO02/16602,WO 02/42487)。已經(jīng)報(bào)道了抗STOP-1多克隆抗體(例如,WO02/42487)。盡管存在關(guān)于將STOP-1靶向治療癌癥以及與血管生成有關(guān)的疾病的一些討論(例如,WO 01/163318,WO 01/68848,WO 02/00690,WO02/08284,WO 02/16602,WO 02/42487,WO O0/71581,WO 02/00690),還需要開發(fā)STOP-1蛋白的生物性質(zhì)來(lái)鑒定可選且更為有效的治療劑與方法,用于診斷和治療失控的細(xì)胞生長(zhǎng)以及由于過(guò)量和不足的血管生成所導(dǎo)致的、與之相關(guān)的或并發(fā)的疾病。
      本發(fā)明通過(guò)提供其中包括關(guān)于STOP-1蛋白的進(jìn)一步知識(shí)的新STOP-1多肽,抗體,核酸分子,組合物以及方法來(lái)針對(duì)這些需要以及其它需要等。除其它內(nèi)容之外,本發(fā)明的公開顯示了STOP-1在多種腫瘤類型的基質(zhì)中過(guò)表達(dá)。本發(fā)明的公開顯示單獨(dú)的STOP-1過(guò)表達(dá)可能是致腫瘤性的。此外,本發(fā)明的公開證實(shí)了STOP-1蛋白可被分泌并且所述分泌是腫瘤生成所需的。此外,本發(fā)明的公開顯示STOP-1的糖基化狀態(tài)影響其是否被分泌,還顯示N-糖基化位點(diǎn)的消除,例如通過(guò)用丙氨酸取代186位(Asn)的氨基酸導(dǎo)致不能分泌。本發(fā)明的公開顯示了STOP-1蛋白之間的二硫鍵可在培養(yǎng)中出現(xiàn)于STOP-1的三螺旋結(jié)構(gòu)域的第55位半胱氨酸處。此外,本發(fā)明的公開顯示STOP-1蛋白可自身形成二聚體,三聚體,和六聚體,并且所述蛋白的C末端足以進(jìn)行寡聚化,而與膠原三螺旋結(jié)構(gòu)域相關(guān)的區(qū)域是不需要的。本發(fā)明的公開還顯示了多種與STOP-1(包括蛋白的C末端區(qū)和N末端區(qū)以及編碼它們的核酸和蛋白)特異性結(jié)合的藥劑。此外,本發(fā)明的公開還顯示STOP-1表達(dá)可通過(guò)過(guò)表達(dá)已知導(dǎo)致小鼠中的乳腺癌WNT信號(hào)途徑中的蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié),例如過(guò)表達(dá)WNT。此外,本發(fā)明的公開顯示STOP-1可通過(guò)與STOP-1在同一腫瘤中共表達(dá)的蛋白酶例如MMP-9裂解。此外,本發(fā)明的公開顯示通過(guò)在蛋白聚糖合成缺陷的細(xì)胞系中表達(dá)多肽來(lái)制備所述STOP-1多肽的方法。本發(fā)明顯示STOP-1與細(xì)胞諸如癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表面結(jié)合。本發(fā)明提供了可抑制STOP-1與細(xì)胞表面相互作用的拮抗劑分子。本發(fā)明提供可增強(qiáng)STOP-1與細(xì)胞表面的結(jié)合的分子。本發(fā)明還涉及STOP-1在血管生成和脈管形成中的作用以及用于治療可通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和脈管形成而得以改善的疾病的方法和組合物。本發(fā)明提供的數(shù)據(jù)等,連同本發(fā)明其它公開的內(nèi)容,教導(dǎo)了新的、更好的和/或可選的利用STOP-1蛋白或其相關(guān)組合物的方法。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明提供了新的治療劑,診斷劑,以及通過(guò)靶向STOP-1的活性、表達(dá)和調(diào)節(jié)來(lái)治療或預(yù)防失控的細(xì)胞增生,包括癌癥和其它疾病的方法。本發(fā)明提供了新的治療劑,診斷劑,以及通過(guò)靶向STOP-1的活性、表達(dá)和調(diào)節(jié)來(lái)治療具有次最佳、過(guò)量或不適當(dāng)?shù)难苌苫蛎}管形成事件的任何醫(yī)學(xué)上的紊亂的方法。
      根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,本發(fā)明提供與人STOP-1寡聚物形式特異性結(jié)合的單克隆抗體。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,本發(fā)明提供與人STOP-1的氨基酸33-53或33-52特異性結(jié)合的單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明包括與人STOP-1的氨基酸94-243特異性結(jié)合的單克隆抗體。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,特異性結(jié)合人STOP-1的殘基94-243或人STOP-1的殘基33-53或33-52的單克隆抗體也識(shí)別寡聚體形式的人STOP-1,諸如三聚體形式。本發(fā)明的抗體可為分離的。應(yīng)理解前述與人STOP-1的殘基33-52或33-53中的殘基特異性結(jié)合的抗體也可與STOP-1或其非-人等同物中的其它殘基結(jié)合。
      另一實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了具有選自下列的抗體的生物學(xué)性質(zhì)的單克隆抗體2003年3月25日保藏的核酸分子V0350-4-S7編碼的S7,2003年3月25日保藏的核酸分子V0350-2b-S4編碼的S4,2003年3月25日保藏的核酸分子V0350-2b-S9編碼的S9,2003年3月25日保藏的核酸分子V0350-4-S16編碼的S16,2003年3月25日保藏的核酸分子V0350-5編碼的F5,和2003年3月28日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801University Blvd.,Manassas,VA20110-2209,USA的雜交瘤細(xì)胞系6B12.1.7產(chǎn)生的6B12,包括保藏的抗體、含有這些抗體的一部分的抗體和其變體。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了與STOP-1特異性結(jié)合的抗體,其中通過(guò)選自上述保藏的抗體的第二單克隆抗體可抑制所述抗體與STOP-1的結(jié)合(例如在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試驗(yàn)中觀察到的)。
      本發(fā)明還涉及具有以下序列的抗體單克隆抗體,包含(a)第一氨基酸序列,所述第一氨基酸序列包含T-I-X1-X2-X3-X4其中X1是S,N或T;其中X2是G,N,S或A;其中X3是Y,S或T;和其中X4是D或W.
      (b)第二氨基酸序列,所述第二氨基酸序列包含X1-X2-I-X3-P-X4-X5-G-X6-T-X7(SEQ ID NO115)其中X1是G或A;其中(1)X2是選自S,T,或A的氨基酸,X3是選自R,W或Y的氨基酸;或(2)X3是選自S,T,或A的氨基酸,X2是選自R,W或Y的氨基酸;其中X4是Y或F;其中X5是G,S,T或A;其中X6是N,Y或A;和其中X7是N,Y或D;和(c)第三氨基酸序列,所述第三氨基酸序列包含序列C-X1-X2-X3-G-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO116)其中X1是A,S或T;
      其中X2是堿性氨基酸;其中X3是任何氨基酸;其中X4是疏水氨基酸;其中X5-X8中任何一個(gè)可為任何氨基酸或可被缺失,X5-X8中至少一個(gè)是芳香氨基酸或疏水氨基酸;其中X9是芳香或疏水氨基酸;其中X10是D或A;和其中X11是Y或V。
      根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,單克隆抗體包含圖34的輕鏈序列。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,單克隆抗體是全長(zhǎng)IgG。
      根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案,第一氨基酸序列的X1是S。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,第一氨基酸序列的X2是G。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,第一氨基酸序列的X3是S。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,第一氨基酸序列是選自TISGSD,TITNSD或TISGSW的序列。
      根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO115的X3是S或A。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO115的X4是Y。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO115的X5是G或A。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQ IDNO115的X6是N或A。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO115是選自以下序列的序列GRISPYGNTN,ATIYPYGGYTY或AWIAPYSGATD。
      根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO116的X1是A。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO116的X2是R。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQID NO116的X4是L或M。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,存在于X5-X8中的芳香族氨基酸是色氨酸殘基。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,X5-X8的一個(gè)氨基酸缺失。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO116的X9是F。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO116的X10是D。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO116的X11是Y。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,SEQ ID NO116是選自以下序列的序列CARVGGLKLLFDY,CARGGGMDGYVMDY或CAREGGLYWVFDY。
      本發(fā)明的抗體可包含(a)第一氨基酸序列,所述第一氨基酸序列包含序列TISGSD;(b)第二氨基酸序列,所述第二氨基酸序列包含序列GRISPYGNTN;和(c)第三氨基酸序列,所述第三氨基酸序列包含CARVGGLKLLFDY,或所述抗體的變體??蛇x,本發(fā)明的抗體可包含(a)第一氨基酸序列,包含序列所述第一氨基酸序列TITNSD;(b)第二氨基酸序列,所述第二氨基酸序列包含序列ATIYPYGGYTY;和(c)第三氨基酸序列,所述第三氨基酸序列包含CARGGGMDGYVMDY;或所述抗體的變體??蛇x,本發(fā)明的抗體可包含(a)第一氨基酸序列,所述第一氨基酸序列包含序列TISGSW;(b)第二氨基酸序列,所述第二氨基酸序列包含序列AWIAPYSGATD;和(c)第三氨基酸序列,所述第三氨基酸序列包含CAREGGLYWVFD;或所述抗體的變體??蛇x,本發(fā)明的抗體可包含(a)第一氨基酸序列,所述第一氨基酸序列包含序列TISNYG;(b)第二氨基酸序列,所述第二氨基酸序列包含序列GRISPSNGSTY;和(c)第三氨基酸序列,所述第三氨基酸序列包含CAKCSVRFAY;或所述抗體的變體??蛇x,本發(fā)明的抗體可包含(a)第一氨基酸序列,所述第一氨基酸序列包含序列TINNYD;(b)第二氨基酸序列,所述第二氨基酸序列包含序列GYISPPSGATY;和(c)第三氨基酸序列,所述第三氨基酸序列包括序列CARMVGMRRGVMDY;或所述抗體的變體.
      另一實(shí)施方案中,上述第一,第二和第三氨基酸序列位于人重鏈中,其中根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng),第一氨基酸序列為重鏈的殘基28-33;根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng),第二氨基酸序列為重鏈的殘基49-58;根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng),第三氨基酸序列為重鏈的殘基92-102。
      另一實(shí)施方案中,本發(fā)明提供單克隆抗體,所述單克隆抗體包含以下序列的氨基酸序列(a)圖27的重鏈序列;(b)圖28的重鏈序列;(c)圖29的重鏈序列;(d)圖30的重鏈序列;(e)圖31的重鏈序列;或(f)圖34的重鏈序列;或其變體。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體還包含(a)圖27的輕鏈序列,(b)圖34的輕鏈序列;或其變體。
      另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體是嵌合或人源化抗體。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體是抗體片段。本發(fā)明另一實(shí)施方案中,所述抗體與選自以下物質(zhì)的藥劑偶聯(lián)基質(zhì)靶向劑,生長(zhǎng)抑制劑,細(xì)胞毒制劑,檢測(cè)試劑,改善抗體生物利用度的藥劑和改善抗體半衰期的藥劑。另一實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體是多特異性抗體,所述抗體對(duì)STOP-1多肽具有結(jié)合特異性,并對(duì)其它任何抗原具有一或多種結(jié)合特異性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述其它抗原是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單位。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,所述細(xì)胞表面蛋白是自然殺傷(NK)細(xì)胞受體。根據(jù)更為優(yōu)選的實(shí)施方案,所述抗體與NK受體的結(jié)合活化所述自然殺傷細(xì)胞。
      本發(fā)明提供STOP-1多肽的變體和修飾。一個(gè)實(shí)施方案中,所述STOP-1多肽變體不能自細(xì)胞分泌。另一實(shí)施方案中,所述變體是非糖基化的人STOP-1多肽。另一實(shí)施方案中,所述變體是在殘基186突變的人STOP-1多肽。本發(fā)明還提供包含不與另一STOP-1通過(guò)二硫鍵結(jié)合的STOP-1的STOP-1變體多肽。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述變體是在殘基55突變的人STOP-1多肽。
      本發(fā)明提供了編碼所述抗體和多肽的核酸分子及其變體,含有所述核酸分子的載體,以及含有本發(fā)明核酸分子的宿主細(xì)胞。
      本發(fā)明包括含有本發(fā)明抗體、多肽或核酸分子的組合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述組合物還包含可藥用載體。另一實(shí)施方案中,所述組合物包含基質(zhì)靶向劑。另一實(shí)施方案中,所述基質(zhì)靶向劑共價(jià)連接于單克隆抗體或多肽。另一實(shí)施方案中,所述基質(zhì)靶向劑識(shí)別腫瘤基質(zhì)細(xì)胞。
      本發(fā)明提供通過(guò)培養(yǎng)包含本發(fā)明的核酸分子的細(xì)胞來(lái)制備本發(fā)明STOP-1多肽或抗-STOP-1抗體的方法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,用于制備STOP-1多肽的方法包含培養(yǎng)包含編碼STOP-1多肽的核酸分子并且蛋白聚糖合成有缺陷的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,所述蛋白聚糖合成有缺陷的細(xì)胞系的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I活性有缺陷。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,所述細(xì)胞系是CHO-psbg細(xì)胞系。
      本發(fā)明提供測(cè)定樣品中STOP-1多肽的存在的方法,包括將可疑含有STOP-1多肽的樣品暴露于抗-STOP-1抗體,并測(cè)定所述抗體與所述樣品的組分的結(jié)合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述抗體是本發(fā)明單克隆抗體。
      本發(fā)明提供診斷或監(jiān)測(cè)患者的細(xì)胞增生性疾病,諸如腫瘤的方法,包括將正常組織中STOP-1的表達(dá)與患者中所檢測(cè)到的STOP-1量進(jìn)行比較的步驟。一個(gè)實(shí)施方案中,STOP-1蛋白可通過(guò)諸如本發(fā)明抗體的藥劑檢出。另一實(shí)施方案中,STOP-1mRNA可通過(guò)諸如與UNQ6762mRNA特異性結(jié)合的核酸分子的藥劑檢出。另一實(shí)施方案中,被檢測(cè)的腫瘤具有大的基質(zhì)分隔區(qū)(compartment)。另一實(shí)施方案中,STOP-1檢測(cè)劑在受試組織的基質(zhì)分隔區(qū)處或其附近給藥。另一實(shí)施方案中,所述方法還包含觀察或檢測(cè)正常組織和受試組織的基質(zhì)分隔區(qū)中的STOP-1蛋白或mRNA的步驟。另一實(shí)施方案中,所述抗體是本發(fā)明的單克隆抗體。
      本發(fā)明提供預(yù)防或治療患者的增生性疾病的方法,包括給予患者本發(fā)明的組合物的步驟,所述組合物的量可有效抑制患者體內(nèi)的細(xì)胞增生。一個(gè)實(shí)施方案中,所述增生性疾病是結(jié)締組織生成。本發(fā)明還提供了預(yù)防或抑制患者中過(guò)表達(dá)STOP-1的腫瘤的生長(zhǎng)的方法,包括給藥所述患者STOP-1拮抗劑,其量可有效抑制患者中的腫瘤生長(zhǎng)。另一實(shí)施方案中,待治療的腫瘤具有基質(zhì)分隔區(qū)。另一實(shí)施方案中,具有基質(zhì)分隔區(qū)的腫瘤選自以下腫瘤硬纖維瘤(desmoid tumor),胰腺癌,肉瘤(例如,血管肉瘤(hemangiosarcoma),橫紋肌肉瘤)和腺癌(乳腺腺癌,結(jié)腸腺癌,胃腸腺癌和卵巢腺癌),肝細(xì)胞癌,乳腺癌,結(jié)腸癌,肺癌,卵巢癌,膠質(zhì)瘤,子宮內(nèi)膜癌和血管癌(vascular cancer)。另一實(shí)施方案中,所述拮抗劑在腫瘤基質(zhì)處或其附近給藥。另一實(shí)施方案中,所述腫瘤是黑素瘤或圓形細(xì)胞腫瘤(roundcell tumor)(例如,惡性纖維組織細(xì)胞瘤(malignant fibrous hystiocytoma)。
      本發(fā)明的拮抗劑是部分或完全阻斷、抑制或中和天然STOP-1多肽的生物活性并與天然STOP-1多肽特異性結(jié)合的任何分子,其中所述拮抗分子(1)與寡聚形式的天然STOP-1多肽結(jié)合,(2)與天然人STOP-1的殘基94-243結(jié)合和/或(3)可被本發(fā)明的單克隆抗體(例如,本發(fā)明保藏的抗體等)抑制(例如,在利用STOP-1和6B12的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述保藏的抗體是6B12抗體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述拮抗劑是多肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,所述拮抗劑是本發(fā)明的抗體。另一實(shí)施方案中,所述拮抗劑抑制的STOP-1多肽是三聚體復(fù)合物的一部分。
      根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,被所述拮抗劑抑制的生物活性是STOP-1與特異性結(jié)合STOP-1的細(xì)胞的相互作用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)另一實(shí)施方案,所述拮抗劑具有選自下列的其它性質(zhì)(1)能夠結(jié)合人STOP-1中與6B12抗體結(jié)合的表位;(2)能夠與人STOP-1的至少殘基33-52中的殘基結(jié)合;或(3)與STOP-16B12的結(jié)合能夠被6B12抗體競(jìng)爭(zhēng)(例如,如在利用STOP-1、所述拮抗劑和6B12抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)中觀察到的)。
      本發(fā)明提供抑制過(guò)表達(dá)STOP-1的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法,包括抑制STOP-1自所述細(xì)胞的分泌的步驟。一個(gè)實(shí)施方案中,分泌通過(guò)抑制STOP-1的糖基化而得以抑制。另一實(shí)施方案中,所述分泌通過(guò)過(guò)表達(dá)不能被所述細(xì)胞分泌的STOP-1蛋白而得以抑制。另一實(shí)施方案中,所述分泌通過(guò)在殘基186突變的STOP-1蛋白而得以抑制。
      本發(fā)明提供防止STOP-1分子間的二硫鍵結(jié)合的方法,包括選自下列的步驟(1)使編碼STOP-1的DNA在殘基半胱氨酸55突變;(2)在天然STOP-1蛋白存在的情況下,表達(dá)在殘基半胱氨酸55突變的STOP-1蛋白;和(3)將殘基半胱氨酸突變的STOP-1蛋白與天然存在的STOP-1蛋白一起保溫。
      本發(fā)明提供切割STOP-1的方法,包括將STOP-1與選自基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)或基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的蛋白酶一起保溫的步驟。另一實(shí)施方案中,所述方法還包含監(jiān)測(cè)產(chǎn)生的STOP-1切割產(chǎn)物的步驟。
      本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及抑制過(guò)表達(dá)STOP-1多肽的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法,其中所述方法包括給藥STOP-1拮抗劑,其中所述拮抗劑特異性結(jié)合STOP-1并可選與選自下列的藥劑之一或其組合偶聯(lián)基質(zhì)靶向劑(stromaltargeting agent),生長(zhǎng)抑制劑或細(xì)胞毒藥劑諸如毒素,包括,例如,美登素類或刺孢霉素,抗生素,放射性同位素或核酸分解酶。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及抑制過(guò)表達(dá)STOP-1多肽的細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法,其中所述方法包括將藥劑給藥腫瘤基質(zhì)細(xì)胞,其中所述藥劑是STOP-1拮抗劑或編碼STOP多肽的核酸分子。所述藥劑可通過(guò)患者或醫(yī)師直接給藥所述基質(zhì)細(xì)胞,或通過(guò)利用將所述藥劑靶向基質(zhì)細(xì)胞的基質(zhì)靶向劑間接給藥所述基質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明提供制品,其包含(a)組合物,其含有經(jīng)修飾的STOP-1多肽,STOP-1多肽變體,STOP-1拮抗劑,STOP-1激動(dòng)劑,STOP-1增效劑或與載體偶聯(lián)的、編碼STOP-1多肽的核酸分子(例如,諸如反義療法或RNAi療法);(b)含有所述組合物的容器;和(c)附于所述容器的標(biāo)簽,或包含在所述容器內(nèi)的包裝插頁(yè),其說(shuō)明所述多肽變體,經(jīng)修飾的多肽或拮抗劑在治療增生性紊亂或與異常血管生成或脈管形成相關(guān)疾病中的用途(例如,包裝插頁(yè))。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,STOP-1拮抗劑或增效劑是本發(fā)明的抗體。
      本發(fā)明提供檢測(cè)STOP-1和STOP-1激動(dòng)劑或拮抗劑的活性的方法。一個(gè)實(shí)施方案中,在體外誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的方法包括將有效誘導(dǎo)所述細(xì)胞遷移的量的STOP-1多肽給藥內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)另一實(shí)施方案,本發(fā)明提供了檢測(cè)STOP-1的候選拮抗劑或激動(dòng)劑的活性的方法,包括用STOP-1處理第一部分內(nèi)皮細(xì)胞(a first endothelial cell),用STOP-1以及所述候選拮抗劑或激動(dòng)劑處理第二部分內(nèi)皮細(xì)胞(a second endothelial cell),比較第一和第二部分內(nèi)皮細(xì)胞的遷移的步驟。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,用于所述遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞是HUVEC細(xì)胞。
      本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物受試者中與過(guò)度、不適當(dāng)或失控的血管生成相關(guān)的疾病或病癥的方法。一個(gè)實(shí)施方案中,所述方法包括將有效治療所述疾病的量的STOP-1拮抗劑給藥所述受試者以治療所述疾病的步驟,其中STOP-1拮抗劑具有選自下列的任何特性(1)結(jié)合6B12抗體所結(jié)合的人STOP-1中的殘基;(2)與人STOP-1中的殘基33-52中的殘基結(jié)合;或(3)其與STOP-1的結(jié)合可被6B12抗體抑制。
      本發(fā)明還涉及治療可從增加的血管生成和脈管形成中獲益的患者,所述治療通過(guò)給藥治療有效量的STOP-1增效劑進(jìn)行,所述STOP-1增效劑是可促進(jìn)STOP-1與細(xì)胞結(jié)合和/或使STOP-1在所述細(xì)胞表面聚集的分子。所述分子可以以有效量給藥以增加血管生成或脈管形成。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述激動(dòng)劑是抗-STOP-1抗體,其使得STOP-1在細(xì)胞表面聚集。
      本發(fā)明還提供了含有寡聚形式STOP-1多肽的激動(dòng)劑,所述寡聚形式的STOP-1含有超過(guò)三個(gè)STOP-1多肽。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述激動(dòng)劑包含六個(gè)STOP-1多肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,STOP-1多肽是用于形成所述激動(dòng)劑的免疫粘附素的一部分。
      本發(fā)明提供鑒定和評(píng)估候選和已知STOP-1拮抗劑,激動(dòng)劑和增效劑的新方法,包括在存在或缺乏所述拮抗劑、激動(dòng)劑或增效劑的條件下觀察或測(cè)定STOP-1與細(xì)胞的結(jié)合的步驟。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。另一實(shí)施方案中,所述細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
      附圖簡(jiǎn)述

      圖1顯示編碼各種物種來(lái)源的STOP-1的氨基酸序列的比對(duì)人(SEQ IDNO1),小鼠(SEQ ID NO3),米魚(rice fish)(SEQ ID NO4),斑馬魚(zebrafish)(SEQ ID NO5)和雞(SEQ ID NO6)。提供了共有序列。箭頭指示信號(hào)序列切割位點(diǎn)。紅色表示在所有物種中保守的殘基。共有序列中的大寫字母指示在所有物種中保守的殘基。共有序列中的小寫字母表示在大多數(shù)物種中保守的殘基。在這些物種中不保守的殘基顯示為“句號(hào)”?!?!”表示I或V?!?”表示L或M?!埃ァ北硎綟或Y?!?”表示B,D,E,N,Q或Z。
      圖2顯示編碼人STOP-1的核酸序列。信號(hào)序列由加框的氨基酸指示。三螺旋結(jié)構(gòu)域(triple helix domain)由下劃線指示。糖基化位點(diǎn)在氨基酸186。
      圖3顯示(A)特定組織類型中人STOP-1 mRNA的存在,和(B)小鼠不同發(fā)育階段的小鼠STOP-1 mRNA。全長(zhǎng)人或小鼠STOP-1DNA經(jīng)放射標(biāo)記用來(lái)檢測(cè)來(lái)自成人或發(fā)育中小鼠胚胎的組織的northern印跡。
      圖4顯示考馬斯藍(lán)染色的人STOP-1蛋白,所述蛋白分別由(A)CHO-DP12或(B)CHO-psgb(ATCC)細(xì)胞產(chǎn)生,并通過(guò)鎳-NTA親和層析純化。載體pRK5用作對(duì)照。
      圖5顯示人組氨酸標(biāo)記的STOP-1蛋白的western印跡,所述蛋白分別存在于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO-psgb細(xì)胞的(A)上清液和(B)細(xì)胞裂解物中。western印跡利用抗-his抗體作為探針來(lái)檢測(cè)。
      圖6顯示利用SF9昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒感染系統(tǒng)表達(dá)的人STOP-1蛋白的寡聚化。STOP-1蛋白和各種缺失變體自SF9細(xì)胞表達(dá),在大小排阻柱上分離,并經(jīng)受光散射分析,例如,(A)S31-K243,(B)E89-K243和(C)L94-K243。單體的預(yù)期分子量顯示在每張圖的左側(cè)角。數(shù)個(gè)峰旁邊的數(shù)字表示該峰中復(fù)合物的平均分子量。
      圖7顯示哺乳動(dòng)物細(xì)胞所表達(dá)的人STOP-1蛋白的寡聚化。人STOP-1蛋白和各種缺失變體自CHO細(xì)胞表達(dá),在大小排阻柱上分離,并經(jīng)受光散射分析,例如,(A)M1-K243和(B)Δ-THD(殘基1-54,94-243,加上組氨酸標(biāo)記)。單體的預(yù)期分子量出現(xiàn)在每張圖的左角。數(shù)個(gè)峰旁邊的數(shù)字表示這些峰內(nèi)復(fù)合物的平均分子量。在非-還原條件下,CHO-psgb細(xì)胞重組表達(dá)的分泌型全長(zhǎng)、his-標(biāo)記的人STOP-1蛋白的western印跡主要作為同源二聚體復(fù)合物(C)存在。所述western印跡可利用抗-his抗體來(lái)檢測(cè)。
      圖8顯示CHO-psgb細(xì)胞的(A)細(xì)胞培養(yǎng)基和(B)全細(xì)胞裂解物的western印跡,所述CHO-psgb細(xì)胞表達(dá)人his-標(biāo)記的STOP-1 WT,Δ-THD,和Δ-Δ-THD STOP-1(殘基1-51,94-243,加上組氨酸標(biāo)記)并經(jīng)受還原或非-還原條件。所述western印跡可利用抗-his抗體來(lái)檢測(cè)。
      圖9顯示CHO-psgb細(xì)胞的(A)細(xì)胞培養(yǎng)基和(B)全細(xì)胞裂解物的western印跡,所述CHO-psgb細(xì)胞表達(dá)his-標(biāo)記的WT,G53A和N186ASTOP-1構(gòu)建體和并經(jīng)受還原或非-還原條件。所述western印跡可利用抗-his抗體來(lái)檢測(cè)。
      圖10顯示CHO-psgb細(xì)胞的(A)細(xì)胞培養(yǎng)基和(B)全細(xì)胞裂解物的western印跡,所述CHO-psgb細(xì)胞表達(dá)his-標(biāo)記的WT,C55A,C93A和C109A STOP-1構(gòu)建體并經(jīng)受還原或非-還原條件。所述western印跡可利用抗-his抗體來(lái)檢測(cè)。
      圖11顯示鼠STOP-1mRNA(mSTOP-1 mRNA)在MMTV-WNT1轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源的乳腺腫瘤中表達(dá),而不在正常乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)。RNA樣品獲自乳腺腫瘤細(xì)胞(標(biāo)記為“T1”-“T7”)或C57Mg小鼠正常乳腺上皮細(xì)胞(標(biāo)記為,“N”),所述RNA用mSTOP-1引物和mRLP19引物進(jìn)行了RT-PCR。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離。
      圖12顯示用(A)人STOP-1或(B)小鼠STOP-1轉(zhuǎn)染后3T3細(xì)胞的增殖。圖12A顯示加入3H-胸苷后12,28和96小時(shí),3T3細(xì)胞中的3H-胸苷摻入量(每分鐘計(jì)數(shù)(cpm))。圖12B顯示加入3H-胸苷后12,28和96小時(shí),3T3細(xì)胞中的3H-胸苷摻入量(每分鐘計(jì)數(shù)(cpm))。對(duì)照單用載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染(puro2和ph1)。
      圖13顯示用編碼人STOP-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行感染后,3T3或293細(xì)胞的增殖。圖13A和B分別是3T3細(xì)胞或293表達(dá)的人STOP-1蛋白的western印跡,所述細(xì)胞由編碼對(duì)照載體(Babe)或人STOP-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。STOP-1用S7-IgG抗體自全細(xì)胞裂解物免疫沉淀。Western印跡利用多克隆抗-人STOP-1抗體作為探針。圖13C顯示細(xì)胞滴度比色測(cè)定法檢出的、感染細(xì)胞群體中觀察到的細(xì)胞增殖水平。
      圖14顯示小鼠STOP-1促進(jìn)異種移植小鼠模型中3T3纖維母細(xì)胞的腫瘤生成。圖14A顯示移植了STS纖維母細(xì)胞的小鼠中的平均腫瘤體積,所述3T3纖維母細(xì)胞單獨(dú)用載體(p2)載體或用編碼小鼠STOP-1或RAS蛋白的DNA轉(zhuǎn)染。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞植入裸小鼠或檢測(cè)其蛋白表達(dá)。圖14B和C分別顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清和裂解物的等分試樣的western印跡。用兔抗-STOP-1多克隆抗體檢測(cè)western印跡?!癟I”指腫瘤發(fā)生率。
      圖15顯示人STOP-1促進(jìn)異種移植小鼠模型中3T3纖維母細(xì)胞的腫瘤生成。圖15顯示植入了3T3纖維母細(xì)胞的小鼠中的平均腫瘤體積,所述3T3纖維母細(xì)胞單獨(dú)用載體或用編碼人STOP-1,RAS蛋白或LP1的DNA轉(zhuǎn)染。
      圖16顯示重組STOP-1蛋白促進(jìn)SK-Mel-31細(xì)胞傷口愈合以及運(yùn)動(dòng)性。SK-Mel-31細(xì)胞用以下物質(zhì)處理(A)NT-無(wú)外源性配體處理,(B)b762-桿狀病毒產(chǎn)生的人STOP-1蛋白,(C)hrEGF-(50ng/ml),(D)hrEGF和b762或(E)CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的人STOP-1蛋白。
      圖17顯示抗-人STOP-1抗體6B12與信號(hào)序列和三螺旋結(jié)構(gòu)域之間的人STOP-1N-末端序列結(jié)合。圖17A圖示了用于圖18B和C的表位定位研究的his-標(biāo)記的人和全長(zhǎng)斑馬魚STOP-1蛋白。圖17B和C分別顯示以抗-his抗體和6B12抗體,對(duì)重組表達(dá)圖17A所示蛋白的細(xì)胞的提取物進(jìn)行檢測(cè)的western印跡。
      圖18顯示數(shù)種對(duì)人STOP-1具有親和力的噬菌體來(lái)源抗體的CDR的氨基酸序列?!癏1,”“H2”和“H3”指VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3。編號(hào)標(biāo)題通常對(duì)應(yīng)根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)的氨基酸位置28-33,49-58和92-102。
      圖19圖示了用于測(cè)定用于競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的S4和S7Fab或IgG的最佳濃度的ELISA實(shí)驗(yàn),所述競(jìng)爭(zhēng)性ELISA用于測(cè)定所述抗體對(duì)STOP-1的親和力?!癝包被的”指包被在微量滴定板上的短型(#94-243)STOP-1?!癋包被的”指包被在微量滴定板上的全長(zhǎng)型人STOP-1。最大結(jié)合的大約90%被認(rèn)為最適合用于競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)。辣根過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)的蛋白G用于檢測(cè)結(jié)合的Fab和IgG。
      圖20圖示了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的結(jié)果,所述競(jìng)爭(zhēng)性ELISA用于測(cè)定S4和S7Fab或IgG的結(jié)合親和力。所述板分別用短型或全長(zhǎng)人STOP-1包被和用短型或全長(zhǎng)STOP-1競(jìng)爭(zhēng)(分別見圖20A和B)。計(jì)算出的結(jié)合親和力表示在括號(hào)中。
      圖21總結(jié)了數(shù)種噬菌體來(lái)源的抗STOP-1抗體的結(jié)合親和力?!癝/S”指ELISA,其中微量滴定板用短型STOP-1包被并用短型STOP-1競(jìng)爭(zhēng)?!癋/S”指ELISA,其中微量滴定板用全長(zhǎng)人STOP-1包被,并用短型人STOP-1競(jìng)爭(zhēng)?!癋/F”指ELISA,其中微量滴定板用全長(zhǎng)STOP-1包被并用全長(zhǎng)STOP-1競(jìng)爭(zhēng)。用于這些研究的噬菌體為S4-Fab噬菌體和S7-F(ab)’2噬菌體。
      圖22圖示了ELISA實(shí)驗(yàn),其中所述板用人STOP-1包被,用S4IgG結(jié)合,然后用S4(Fab)噬菌體,S7(F(ab)’2)噬菌體,S9(Fab)噬菌體,S16(F(ab)’2)噬菌體和F5(F(ab)’2)噬菌體競(jìng)爭(zhēng)。Y軸指未封閉的百分比,所述百分比通過(guò)用S4 IgG封閉的孔的OD450nm值除以沒有S4 IgG的孔的OD450nm值得到。
      圖23顯示用各種蛋白酶在體外切割的桿狀病毒表達(dá)的人STOP-1蛋白的考馬斯藍(lán)染色的凝膠?!癕MP”指基質(zhì)金屬蛋白酶。
      圖24A-D是編碼F(ab)’2噬菌體展示蛋白的Fab的噬?;蚓幋aFab或IgG蛋白的載體的示意圖。圖24A是Fab-噬粒構(gòu)建體的示意圖。所述構(gòu)建體含有堿性磷酸酶啟動(dòng)子,STII信號(hào)序列,VL和CL輕鏈序列,gD標(biāo)記,另一STII信號(hào)序列,重鏈VH和CH1區(qū)和M13細(xì)菌噬菌體pIII外殼蛋白的C-末端部分(cP3)。圖24B是F(ab)’2-噬粒構(gòu)建體的示意圖。所述構(gòu)建體通常含有與Fab-噬粒相同的序列,但前者還含有亮氨酸拉鏈序列(Zip)。圖24C是編碼Fab蛋白的核酸分子的示意圖。圖24D是編碼IgG蛋白的核酸分子的示意圖,所述IgG蛋白包括CH2和CH3序列。
      圖25A-H描述了用于噬菌體展示抗-Her-2 Fab的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖25顯示包含抗-Her-2Fab輕鏈的氨基酸序列(SEQ IDNO86),包含抗-Her-2Fab輕鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO87)和編碼所述氨基酸序列的噬粒的核酸序列(SEQ ID NO88)。
      圖26A-H描述了用于噬菌體展示抗-Her-2F(ab)’2的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖26顯示包含抗-Her-2F(ab)’2輕鏈的氨基酸序列(SEQ IDNO89),包含抗-Her-2F(ab)’2重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO90)和編碼所述氨基酸序列的噬粒的核酸序列(SEQ ID NO91)。
      圖27A-C描述了用于噬菌體展示S4-Fab的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖27顯示包含S4-Fab輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO92),包含S4-Fab重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO93)和編碼所述氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO94)。
      圖28A-C描述了用于噬菌體展示S9 Fab的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖28顯示包含S9-Fab輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO95),包含S9-Fab重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO96)和編碼所述氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO97)。
      圖29A-C描述了用于噬菌體展示S7-F(ab)’2的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖29顯示包含S7-F(ab)’2輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO98),包含S7-F(ab)’2重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO99)和編碼所述氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO100)。
      圖30A-C描述了用于噬菌體展示S16-F(ab)’2的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖30顯示包含S16-F(ab)’2輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO101),包含S16-F(ab)’2重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO102)和編碼所述氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO103)。
      圖31A-C描述了用于噬菌體展示F5-F(ab)’2的氨基酸序列和核酸序列。圖31顯示包含F(xiàn)5-F(ab)’2輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO104),包含F(xiàn)5-F(ab)’2重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO105)和編碼所述氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO106)。
      圖32A-G描述了用于S4-Fab的氨基酸序列和核酸序列。更具體地,圖32顯示包含S4-Fab輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO107),包含S4-Fab重鏈區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO108)和編碼所述氨基酸序列的載體的核酸序列(SEQ ID NO109)。
      圖33A-F描述了IgG蛋白的S4輕鏈序列。更具體地,圖33顯示包含S4輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO110)和編碼所述氨基酸序列的載體的核酸序列(SEQ ID NO111)。
      圖34A-G描述了IgG蛋白的S4重鏈序列。更具體地,圖34顯示包含S4重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO112)和編碼所述氨基酸序列的載體的核酸序列(SEQ ID NO113)。
      圖35顯示氨基酸在來(lái)自Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)的人抗體輕鏈序列中的頻率。
      圖36顯示適宜密碼子組設(shè)計(jì)的一個(gè)示例性實(shí)施方案。
      圖37是用于CDR L1,L2 &amp; L3多樣化的限制性多樣性簡(jiǎn)并物(也稱為“非隨機(jī)”)密碼子組的示例性實(shí)施方案。
      圖38是用于CDR L1,L2 &amp; L3多樣化的限制性多樣性簡(jiǎn)并物(也稱為“非隨機(jī)”)密碼子組的示例性實(shí)施方案。
      圖39是用于CDR L3多樣化的限制性多樣性簡(jiǎn)并物(也稱為“非隨機(jī)”)密碼子組的示例性實(shí)施方案。
      圖40是用于CDR L1,L2 &amp; L3多樣化的限制性多樣性簡(jiǎn)并物(也稱為“非隨機(jī)”)密碼子組的示例性實(shí)施方案。
      圖41顯示用以下物質(zhì)處理的293,HeLa,HT1080或HUVEC細(xì)胞群體的流式細(xì)胞分析(1)抗-HIS抗體,(2)抗-HIS抗體和STOP-1蛋白或(3)抗-flag抗體和STOP-1蛋白,然后用熒光素異硫氰酸酯(FITC)-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠抗體處理。少量不明顯數(shù)量的細(xì)胞結(jié)合抗-flag抗體(即,在293,HeLa和HT1080的圖中的x軸的最左方角落的峰)。x軸表示細(xì)胞數(shù)量(log熒光素信號(hào)強(qiáng)度)。y軸表示標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)射的熒光水平(事件)。
      圖42顯示HT1080細(xì)胞群體的FACS分析,所述細(xì)胞用以下物質(zhì)處理(1)抗-HIS抗體,(2)抗-HIS抗體和STOP-1蛋白,(3)抗-flag抗體和STOP-1蛋白,(3)STOP-1蛋白,(4)STOP-1蛋白和S7抗體或(5)STOP-1和6b12抗體,然后用FITC-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠抗體處理。
      圖43圖示了用bFGF或STOP-1(“762”)或陰性對(duì)照處理后,HT1080細(xì)胞在改良的Boyden趨化小室中的遷移(細(xì)胞數(shù))。
      圖44顯示在存在和缺乏抗-STOP-1抗體(6B12)或抗體對(duì)照(4B7)的條件下,STOP-1與MDA435細(xì)胞的結(jié)合的FACS分析。檢測(cè)抗體(抗-flag M2-FITC抗體)不影響STOP-1結(jié)合。
      圖45圖示了在存在或缺乏重組人TNFα的條件下,(A)在低氧條件下處理8和34小時(shí)或(B)在正常含氧量條件下處理3,8和34小時(shí),STOP-1mRNA表達(dá)改變的倍數(shù)。
      發(fā)明詳述編碼本發(fā)明的STOP-1蛋白的核酸序列包括,例如,SEQ ID NO1和編碼圖1的多肽的核酸分子。
      SEQ ID NO1GGAGAGAGGCGCGCGGGTGAAAGGCGCATTGATGCAGCCTGCGGCGGCCTCGGAGCGCGGCGGAGCCAGACGCTGACCACGTTCCTCTCCTCGGTCTCCTCCGCCTCCAGCTCCGCGCTGCCCGGCAGCCGGGAGCCATGCGACCCCAGGGCCCCGCCGCCTCCCCGCAGCGGCTCCGCGGCCTCCTGCTGCTCCTGCTGCTGCAGCTGCCCGCGCCGTCGAGCGCCTCTGAGATCCCCAAGGGGAAGCAAAAGGCGCAGCTCCGGCAGAGGGAGGTGGTGGACCTGTATAATGGAATGTGCTTACAAGGGCCAGCAGGAGTGCCTGGTCGAGACGGGAGCCCTGGGGCCAATGTTATTCCGGGTACACCTGGGATCCCAGGTCGGGATGGATTCAAAGGAGAAAAGGGGGAATGTCTGAGGGAAAGCTTTGAGGAGTCCTGGACACCCAACTACAAGCAGTGTTCATGGAGTTCATTGAATTATGGCATAGATCTTGGGAAAATTGCGGAGTGTACATTTAC
      AAAGATGCGTTCAAATAGTGCTCTAAGAGTTTTGTTCAGTGGCTCACTTCGGCTAAAATGCAGAAATGCATGCTGTCAGCGTTGGTATTTCACATTCAATGGAGCTGAATGTTCAGGACCTCTTCCCATTGAAGCTATAATTTATTTGGACCAAGGAAGCCCTGAAATGAATTCAACAATTAATATTCATCGCACTTCTTCTGTGGAAGGACTTTGTGAAGGAATTGGTGCTGGATTAGTGGATGTTGCTATCTGGGTTGGCACTTGTTCAGATTACCCAAAAGGAGATGCTTCTACTGGATGGAATTCAGTTTCTCGCATCATTATTGAAGAACTACCAAAATAAATGCTTTAATTTTCATTTGCTACCTCTTTTTTTATTATGCCTTGGAATGGTTCACTTAAATGACATTTTAAATAAGTTTATGTATACATCTGAATGAAAAGCAAAGCTAAATATGTTTACAGACCAAAGTGTGATTTCACACTGTTTTTAAATCTAGCATTATTCATTTTGCTTCAATCAAAAGTGGTTTCAATATTTTTTTTAGTTGGTTAGAATACTTTCTTCATAGTCACATTCTCTCAACCTATAATTTGGAATATTGTTGTGGTCTTTTGTTTTTTCTCTTAGTATAGCATTTTTAAAAAAATATAAAAGCTACCAATCTTTGTACAATTTGTAAATGTTAAGAATTTTTTTTATATCTGTTAAATAAAAATTATTTCCAACA除非另有說(shuō)明,本文術(shù)語(yǔ)″STOP-1,″“STOP-1蛋白,”“STOP-1多肽”(也稱為UNQ762或762)包括天然序列多肽,多肽變體以及天然序列多肽和多肽變體的片段(其在本文進(jìn)一步定義)。STOP-1蛋白可通過(guò)使用本發(fā)明的抗體或通過(guò)重組或合成方法,包括利用保藏的核酸分子,獲自各種物種例如人。STOP-1的寡聚形式包括僅具有殘基94-243的人STOP-1,或其一部分。本發(fā)明的寡聚形式可包括STOP-1的二聚體,三聚體和六聚體。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,STOP-1的寡聚形式是三聚體。
      ″天然序列”多肽或“天然”多肽是具有與源自天然的多肽(例如,抗體)相同的氨基酸序列的多肽?!疤烊恍蛄小倍嚯氖蔷哂信c源自天然的多肽(例如,抗體)相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可分離自自然或可通過(guò)重組或合成方法制備。因此,天然序列多肽可具有天然存在的人多肽,鼠多肽,或任何哺乳動(dòng)物物種來(lái)源的多肽的氨基酸序列?!疤烊恍蛄小盨TOP-1多肽或“天然”STOP-1多肽包含具有與相應(yīng)的源自天然的STOP-1多肽相同的氨基酸序列的多肽。例如,一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,編碼人STOP-1的天然序列的核酸序列可見于SEQ ID NO2和圖2。
      SEQ ID NO2MRPQGPAASPQRLRGLLLLLLLQLPAPSSASEIPKGKQKAQLRQREVVDLYNGMCLQGPAGVPGRDGSPGANVIPGTPGIPGRDGFKGEKGECLRESFEESWTPNYKQCSWSSLNYGIDLGKIAECTFTKMRSNSALRVLFSGSLRLKCRNACCQRWYFTFNGAECSGPLPIEAIIYLDQGSPEMNSTINIHRTSSVEGLCEGIGAGLVDVAIWVGTCSDYPKGDASTGWNSVSRIIIEELPK這樣的STOP-1多肽可分離自自然或通過(guò)重組或合成方法制備。術(shù)語(yǔ)″天然序列”或“天然”STOP-1多肽或蛋白具體包括天然截短或分泌形式的STOP-1蛋白,所述多肽的天然變體形式(例如,旁路拼接形式)和天然等位基因變體。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,本文的天然序列STOP-1多肽是成熟或全長(zhǎng)天然序列多肽,其包含附圖所示的全長(zhǎng)氨基酸序列。
      本文公開的各種STOP-1多肽“信號(hào)肽”的大致位置可見于本說(shuō)明書和/或附圖。也可認(rèn)識(shí)到,一些情況中,從分泌的多肽切割信號(hào)序列不是完全一致的,導(dǎo)致一種以上的分泌種類。這些成熟多肽以及編碼它們的多核苷酸包含在本發(fā)明內(nèi),所述成熟多肽中信號(hào)序列在本文鑒定的信號(hào)序列的C末端邊界任何一側(cè)的不超過(guò)約5個(gè)氨基酸之內(nèi)被切割。
      ″STOP-1多肽變體″的意思是與本文的全長(zhǎng)天然序列STOP-1多肽序列具有至少約80%氨基酸序列同一性的STOP-1多肽,缺乏本文的信號(hào)肽或三螺旋結(jié)構(gòu)域的STOP-1多肽序列,或本文所述全長(zhǎng)STOP-1多肽序列的任何其它片段(諸如僅代表全長(zhǎng)STOP-1多肽的完整編碼序列的一部分的核酸所編碼的那些)。所述STOP-1多肽變體包括,例如STOP-1多肽,其中在全長(zhǎng)天然氨基酸序列的N-或C-末端,一或多個(gè)氨基酸殘基被添加,或缺失。通常,STOP-1多肽變體將與以下序列具有至少約80%氨基酸序列同一性,可選至少約81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%氨基酸序列同一性本文全長(zhǎng)天然序列STOP-1多肽序列,本文的缺乏信號(hào)肽的STOP-1多肽序列,本文所述STOP-1多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)域(具有或不具有信號(hào)肽),或本文全長(zhǎng)STOP-1多肽序列的任何其它具體限定的片段。通常,STOP-1變體多肽的長(zhǎng)度至少約10氨基酸,可選至少約20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600個(gè)氨基酸,或更長(zhǎng)。可選,STOP-1變體多肽與天然STOP-1多肽序列相比將具有不超過(guò)一個(gè)保守氨基酸取代,可選不超過(guò)2,3,4,5,6,7,8,9,或10個(gè)保守氨基酸取代。
      相對(duì)于本文鑒定的STOP-1多肽序列的“氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)(%)”定義為比對(duì)該序列且需要時(shí)導(dǎo)入間隔以達(dá)到最大序列同一性百分?jǐn)?shù)后與候選序列中與特定STOP-1序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù),且任何保守取代都不作為該序列同一性的一部分。以測(cè)定氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)為目的的序列對(duì)比可按本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法完成,例如,使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件,例如BLAST,BLAST-2,ALIGN,或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測(cè)量序列對(duì)比的合適參數(shù),包括在所比較的序列全長(zhǎng)上達(dá)到最大對(duì)位排列所需的任何算法。然而,為本文目的,氨基酸序列同一性%值可通過(guò)使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得,其中下面的表1提供了ALIGN-2程序的全部源代碼。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech,Inc.創(chuàng)作且下面表1所示的源代碼在美國(guó)版權(quán)局,Washington D.C.,20559以用戶文件存檔,以美國(guó)版權(quán)登記號(hào)TXU510087登記。ALIGN-2程序通過(guò)Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California可公開得到或者可從下面表1提供的源代碼編譯。編譯ALIGN-2程序應(yīng)基于UNIX操作系統(tǒng)平臺(tái),優(yōu)選數(shù)字式UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不改變。
      在使用ALIGN-2用于氨基酸序列比較的情況下,給定氨基酸序列A相對(duì)于(to)、和(with)、或者(against)針對(duì)給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(任選可表述為具有或者包含相對(duì)于,和,或者針對(duì)給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是通過(guò)序列對(duì)比程序ALIGN-2在經(jīng)該程序進(jìn)行A和B序列對(duì)比中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù),且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)??深A(yù)料到如果氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等時(shí),A相對(duì)于B的%氨基酸序列同一性不等于B相對(duì)于A的%氨基酸序列同一性。作為使用這一方法的%氨基酸序列同一性算法的實(shí)例,表2和3證明了如何計(jì)算命名為“比較蛋白”的氨基酸序列相對(duì)于命名為“STOP-1”的氨基酸序列的%氨基酸序列同一性,其中″STOP-1″代表目的假想STOP-1多肽的氨基酸序列,″比較蛋白″代表與目的″STOP-1″多肽相對(duì)比的多肽的氨基酸序列,″X,″Y″和″Z″各自代表不同的假想氨基酸殘基。除非另有具體說(shuō)明,本文所用的所有%氨基酸序列同一性值是如前一段所述利用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得的值。
      ″STOP-1變體多核苷酸″或“STOP-1變體核酸序列”意思是核酸分子,其編碼STOP-1多肽,優(yōu)選如本文所述,并與編碼本文所述全長(zhǎng)天然序列STOP-1多肽序列的核苷酸序列具有至少約80%核酸序列同一性的活性STOP-1多肽,本文所述缺乏信號(hào)肽的全長(zhǎng)天然序列STOP-1多肽序列,本文所述STOP-1多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)域(具有或缺乏信號(hào)肽),或本文所述的全長(zhǎng)STOP-1多肽序列的任何其它片段(例如,人STOP-1的殘基94-243)。通常,STOP-1變體多核苷酸將與以下序列具有至少約80%核酸序列同一性,可選至少約81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或99%核酸序列同一性編碼本文全長(zhǎng)天然序列STOP-1多肽序列的核酸序列,本文缺乏信號(hào)肽的全長(zhǎng)天然序列STOP-1多肽序列,本文所述STOP-1多肽的三螺旋結(jié)構(gòu)域(具有或不具有信號(hào)序列),或本文全長(zhǎng)STOP-1多肽序列的任何其它片段。變體不包括天然核苷酸序列。
      通常,STOP-1變體多核苷酸的長(zhǎng)度至少約5核苷酸,可選至少約6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,105,110,115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,165,170,175,180,185,190,195,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690,700,710,720,730,740,750,760,770,780,790,800,810,820,830,840,850,860,870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,或1000個(gè)核苷酸,其中本文術(shù)語(yǔ)“約”指參照核苷酸序列長(zhǎng)度加上或減去參照長(zhǎng)度的10%。
      相對(duì)于本文鑒定的編碼STOP-1的核酸序列的“核酸序列同一性百分?jǐn)?shù)(%)”定義為比對(duì)該序列且需要時(shí)導(dǎo)入間隔以達(dá)到最大序列同一性百分?jǐn)?shù)后候選序列中與編碼目的STOP-1多肽的核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分?jǐn)?shù)。以測(cè)定核酸序列同一性百分?jǐn)?shù)為目的的序列比對(duì)可按本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法完成,例如,使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件,例如BLAST,BLAST-2,ALIGN,ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。然而為本文的目的,%核酸序列同一性值使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2生成,其中ALIGN-2程序的完整源代碼在下面表1中提供。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech,Inc.創(chuàng)作且表1所示的源代碼在美國(guó)版權(quán)局,WashingtonD.C.20559以用戶文件存檔,以美國(guó)版權(quán)登記號(hào)TXU510087登記。ALIGN-2程序通過(guò)Genentech,Inc.,South San Francisco可公開得到,或可從下面表1提供的源代碼編譯。編譯ALIGN-2程序應(yīng)基于在UNIX操作系統(tǒng)平臺(tái)上的使用,優(yōu)選數(shù)字式UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不改變。
      在使用ALIGN-2用于核酸序列比較的情況下,給定核酸序列C相對(duì)于(to),和(with),或者針對(duì)(against)給定核酸序列D的%核酸序列同一性(任選可表述為具有或者包含相對(duì)于,和,或者針對(duì)給定核酸序列D的某一%核酸序列同一性的給定核酸序列C)計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)W/Z其中W是通過(guò)序列對(duì)比程序ALIGN-2在經(jīng)該程序進(jìn)行的C和D序列對(duì)比中評(píng)分為相同匹配的核苷酸數(shù),且其中Z是D中核苷酸的總數(shù)??深A(yù)料到如果核酸序列C的長(zhǎng)度與核酸序列D的長(zhǎng)度不相等時(shí),C相對(duì)于D的%核酸序列同一性不等于D相對(duì)于C的%核酸序列同一性。作為%核酸序列同一性算法的例子,表4和5證明了如何計(jì)算命名為“比較DNA”的核酸序列與命名為“STOP-1-DNA”的核酸序列的%核酸序列同一性,其中″STOP-1-DNA″代表目的假想編碼STOP-1的核酸序列,″比較DN A″代表與目的″STOP-1-DNA″核酸分子相對(duì)比的核酸分子的核苷酸序列,″N,″L″和″V″每個(gè)代表不同的假想核苷酸。除非另有具體說(shuō)明,本文所用的所有%核酸序列同一性值如前一段所述利用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得。
      其它實(shí)施方案中,STOP-1變體多核苷酸是編碼STOP-1多肽、并能夠優(yōu)選在嚴(yán)格雜交和洗滌條件下與編碼本文全長(zhǎng)STOP-1多肽的核苷酸序列雜交的核酸分子。STOP-1變體多肽可以是STOP-1變體多核苷酸編碼的多肽。
      本文術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)編碼區(qū)”在指編碼STOP-1多肽的核酸時(shí),指編碼本發(fā)明的全長(zhǎng)STOP-1多肽的核苷酸序列(其通常顯示在附圖中的起始和終止密碼子之間并包括所述起始和終止密碼子)。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)編碼區(qū)”在指ATCC保藏的核酸時(shí),指cDNA的STOP-1多肽-編碼部分被插入保藏在ATCC的載體中(其通常顯示在附圖中起始和終止密碼子之間并包括所述起始和終止密碼子)。
      當(dāng)用″分離的″來(lái)描述本文的各種多肽時(shí),是指已從天然環(huán)境的組成中鑒定和分離和/或回收的多肽。天然環(huán)境中的污染成分是那些通常將干擾使用多肽進(jìn)行診斷和治療使用的物質(zhì),可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,多肽被純化至(1)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀,達(dá)到足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列至少15個(gè)殘基的程度,或者(2)達(dá)到在非-還原或還原條件下經(jīng)SDS-PAGE電泳使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染證實(shí)為同質(zhì)性的程度。分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽,因?yàn)镾TOP-1多肽自然環(huán)境中的至少一個(gè)組分是不存在的。然而,通常用至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備分離的多肽。
      編碼STOP-1多肽的″分離的″核酸或編碼多肽的其它核酸是從在STOP-1編碼核酸的天然來(lái)源中通常與其結(jié)合的至少一種雜質(zhì)核酸分子中鑒定并分離的核酸分子。分離的編碼多肽的核酸分子不同于其天然形式或組合(setting)。因此分離的編碼多肽的核酸分子區(qū)別于其在天然細(xì)胞中的特定編碼多肽的核酸分子。但是,分離的編碼多肽的核酸分子,包括通常表達(dá)所述多肽的細(xì)胞中所含的編碼多肽的核酸分子,例如,在這樣的細(xì)胞中,所述核酸分子與天然細(xì)胞中的核酸分子所在的染色體位置不同。
      術(shù)語(yǔ)“控制序列”指在特定宿主生物中使可操作連接的編碼序列表達(dá)所需的DNA序列。適于原核生物的控制序列可包括如啟動(dòng)子,任選操縱子序列,和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核生物細(xì)胞利用啟動(dòng)子,聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
      當(dāng)核酸與另一核酸序列發(fā)生功能上的關(guān)系時(shí),核酸即為“可操作地連接”的。例如,如果DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白,則編碼前序列或分泌型前導(dǎo)序列的DNA與編碼多肽的DNA可操作性地連接;如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄,則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接于編碼序列;如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置有利于翻譯,則該核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于編碼序列。一般而言,“可操作地連接于”是指被鄰接的DNA序列是連續(xù)的,并且在例如分泌型前導(dǎo)序列的情況下為鄰接的并處于閱讀相。然而,增強(qiáng)子不必非得是連續(xù)的。連接通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行接合來(lái)完成。若這樣的位點(diǎn)不存在,可依照常規(guī)實(shí)施方法使用合成的寡核苷酸銜接頭或連接體。
      雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格性”是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易測(cè)定的,且一般根據(jù)探針長(zhǎng)度,洗滌溫度,和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。一般來(lái)說(shuō),探針越長(zhǎng)需要的合適退火溫度越高,而探針越短需要的溫度越低。雜交一般依賴于在低于其解鏈溫度的環(huán)境中存在互補(bǔ)鏈時(shí)變性DNA重退火的能力。探針與可雜交序列之間所需的同源性程度越高,可使用的相對(duì)溫度越高。結(jié)果,隨著相對(duì)溫度越高則傾向于使得反應(yīng)條件更嚴(yán)格,而溫度越低則嚴(yán)格程度越低。對(duì)于雜交反應(yīng)更詳細(xì)的情況和解釋參見,Ausubel等,Current Protocolsin Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。
      本文定義的“嚴(yán)格條件”或“高度嚴(yán)格條件”可通過(guò)下列條件確定(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫度洗滌,例如50℃,0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基磺酸鈉;(2)雜交期間采用諸如甲酰胺等變性劑,例如,50%(v/v)甲酰胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液,pH 6.5,含750mM氯化鈉,75mM檸檬酸鈉,42℃,或(3)采用42℃,50%甲酰胺,5x SSC(0.75M NaCl,0.075M檸檬酸鈉),50mM磷酸鈉(pH 6.8),0.1%焦磷酸鈉,5x Denhardt′s溶液,超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml),0.1%SDS,和10%葡聚糖硫酸酯,在42℃的0.2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘,接著在55℃含有EDTA的0.1x SSC中進(jìn)行高度嚴(yán)格洗滌10分鐘。
      “中度嚴(yán)格條件”可按Sambrook等,Molecular CloningA LaboratoryManual,New YorkCold Spring Harbor Press,1989所述確定,且包括使用比上文所述嚴(yán)格程度更低的洗滌溶液和雜交條件(例如,溫度,離子強(qiáng)度和%SDS)。中度嚴(yán)格條件的例子是在含有20%甲酰胺,5x SSC(150mM NaCl,15mM檸檬酸三鈉),50mM磷酸鈉(pH 7.6),5x Denhardt′s溶液,10%葡聚糖硫酸酯,和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA中37℃溫育過(guò)夜,接著在大約37-50℃在1x SSC中洗膜。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何按所需調(diào)節(jié)溫度,離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。
      本文使用的術(shù)語(yǔ)“表位標(biāo)記的”是指含有與“標(biāo)記多肽”融合的STOP-1多肽或抗STOP-1抗體的嵌合多肽。標(biāo)記多肽具有足夠的殘基以提供可對(duì)其產(chǎn)生抗體的表位,而且它足夠短使其不能干擾與它融合的多肽的活性。標(biāo)記多肽還優(yōu)選是相當(dāng)特異的,以便其抗體基本上不與其它表位交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)記多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基且通常在大約8到50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選在大約10到20個(gè)氨基酸殘基之間)。本發(fā)明涉及表位標(biāo)記的多肽和抗體。
      關(guān)于STOP-1的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)上有活性的”、“生物學(xué)活性”以及“生物學(xué)特征”的意思是(1)具有在體內(nèi)或回體(ex vivo)增加至少一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如,3T3)的細(xì)胞增殖的能力;(2)具有特異性結(jié)合STOP-1的能力;和/或(3)具有調(diào)節(jié)STOP-1信號(hào)傳遞或STOP-1活性的能力,除非另有說(shuō)明。
      本文關(guān)于修飾的STOP-1多肽或STOP-1多肽的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)上有活性的”、“生物學(xué)活性”以及“生物學(xué)特征”的意思是(1)具有部分或完全阻斷、抑制或中和天然STOP-1的能力(以拮抗或阻斷方式);(2)具有特異性結(jié)合STOP-1的能力;和/或(3)具有調(diào)節(jié)STOP-1信號(hào)傳遞或STOP-1活性的能力,除非另有說(shuō)明。
      本發(fā)明關(guān)于抗-STOP-1抗體的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)上有活性的”、“生物學(xué)活性”以及“生物學(xué)特征”的意思是(1)具有部分或完全阻斷、抑制或中和天然STOP-1的能力(以拮抗或阻斷方式);(2)具有特異性結(jié)合STOP-1的能力;和/或(3)具有調(diào)節(jié)STOP-1信號(hào)傳遞或STOP-1活性的能力,除非另有說(shuō)明。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的抗體與STOP-1以至少1uM或更低,100nm或更低,50nm或更低,10nm或更低,5nM或更低,1nm或更低的親和力結(jié)合。本文中″抗體可變結(jié)構(gòu)域″指抗體分子的輕鏈和重鏈的部分,其包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDR;即,CDR1,CDR2,和CDR3)以及框架區(qū)(FR)的氨基酸序列。VH指重鏈可變區(qū)。VL指輕鏈可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明所用方法,稱為CDRs和FRs的氨基酸部分根據(jù)Kabat(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))限定??贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號(hào)也根據(jù)Kabat的進(jìn)行。
      本文術(shù)語(yǔ)“密碼子組(codon set)”指一組不同核苷酸三聯(lián)體序列,其用于編碼所需的變體氨基酸。可合成一組寡核苷酸,例如通過(guò)固相合成,其含有代表所述密碼子組所提供的所有可能核苷酸三聯(lián)體組合的序列,并將編碼所需的氨基酸組。密碼子命名的標(biāo)準(zhǔn)形式是IUB碼,其是本領(lǐng)域已知的并在本文中描述。本文的“非-隨機(jī)密碼子組”指編碼部分符合,優(yōu)選完全符合本文所述氨基酸選擇標(biāo)準(zhǔn)的選定氨基酸的密碼子組。合成在特定位置具有選定核苷酸“簡(jiǎn)并性”的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域已知的,例如,TRIM法(Knappek et al.;J.Mol.Biol.(1999),29657-86);Garrard &amp; Henner,Gene(1993),128103)。具有特定密碼子組的這種核苷酸組可利用商品化核酸合成儀來(lái)合成(可得自,例如,Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA),或可購(gòu)得(例如,從Life Technologies,Rockville,MD)。因此,具有特定密碼子組的一組合成的寡核苷酸將通常包括具有不同序列的多種寡核苷酸,所述差異通過(guò)整個(gè)序列中的密碼子組確定。本發(fā)明所用寡核苷酸具有允許與核酸模板可變區(qū)雜交的序列,并也可,但不必要地,包括用于克隆目的的限制酶切位點(diǎn)。
      ″異源DNA″是任何被導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA。所述DNA可來(lái)自多種來(lái)源,包括基因組DNA,cDNA,合成DNA以及其融合或組合。所述DNA包括來(lái)自與宿主或受體細(xì)胞相同的細(xì)胞或細(xì)胞類型的DNA,或者來(lái)自不同細(xì)胞類型例如來(lái)自哺乳動(dòng)物或植物的DNA。所述DNA可選可包括標(biāo)記物或選擇基因,例如抗生素抗性基因,溫度抗性基因等。還涉及編碼包含UNQ多肽以及本發(fā)明的抗體的異源DNA的宿主細(xì)胞以及它們的用途。
      本文術(shù)語(yǔ)“高變位置”指位于輕鏈和重鏈可變區(qū)中氨基酸的位置,當(dāng)比較已知和/或天然存在的抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸序列時(shí),該位置代表一些不同氨基酸。高變位置通常位于CDR區(qū)。在一方面,在已知和/或天然存在的抗體中確定高變位置的能力通過(guò)Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991)提供的數(shù)據(jù)得以提高。網(wǎng)址為http://immuno.bme.nwu.edu的基于因特網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫(kù)提供了人輕鏈和重鏈序列的大量集合與比對(duì),并促進(jìn)這些序列中高變位置的確定。根據(jù)本發(fā)明,如果氨基酸位置具有約2-約11,優(yōu)選約4-約9,更優(yōu)選約5-約7種不同的可能氨基酸殘基變化,所述氨基酸位置就是高變的。在一些實(shí)施方案中,如果氨基酸位置具有至少約2,優(yōu)選至少約4,優(yōu)選至少約6,優(yōu)選至少約8種不同的可能氨基酸殘基變化,所述氨基酸位置就是高變的。
      本文術(shù)語(yǔ)“文庫(kù)”指多種抗體或抗體片段序列(例如,本發(fā)明的多肽),或編碼這些序列的核酸,所述序列在根據(jù)本發(fā)明的方法被導(dǎo)入這些序列中的變體氨基酸組合中不同。
      ″噬菌體展示″是一種技術(shù),變體多肽作為融合蛋白在噬菌體例如絲狀噬菌體顆粒的表面展示為外殼蛋白。噬菌體展示的用途在于大的隨機(jī)化蛋白變體文庫(kù)可迅速并有效地根據(jù)那些與靶分子以高親和力結(jié)合的序列而分類。在噬菌體上展示肽或蛋白文庫(kù)已經(jīng)用于篩選成百萬(wàn)的多肽中具有特定結(jié)合特性的多肽。通過(guò)與絲狀噬菌體的基因III或基因VIII融合,多價(jià)噬菌體展示方法已經(jīng)用于展示小的隨機(jī)肽以及小蛋白。參見Wells和Lowman,Curr.Opin.Struct.Biol.,3355-362(1992)以及其中所引用的文獻(xiàn)。在單價(jià)噬菌體展示,蛋白或肽文庫(kù)與基因III或其一部分融合,并以低水平在野生型基因III蛋白存在的條件下表達(dá),使得噬菌體顆粒展示所述融合蛋白的一個(gè)拷貝或不顯示所述融合蛋白。親和力效果相對(duì)于多價(jià)噬菌體減低,使得分類基于內(nèi)在配體親和力,并使用噬粒載體,所述載體可簡(jiǎn)化DNA操作。參見Lowman和Wells,MethodsA companion to Methods in Enzymology,3205-0216(1991)。
      ″噬粒(噬菌粒)″是質(zhì)粒載體,其具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn),例如,ColE1,和噬菌體基因間區(qū)的拷貝。噬??捎糜谌魏我阎删w,包括絲狀噬菌體和λ形噬菌體。所述質(zhì)粒將通常含有抗生素抗性選擇標(biāo)記??寺∪脒@些載體的DNA片段可作為質(zhì)粒增殖。當(dāng)將產(chǎn)生噬菌體顆粒所必需的所有基因提供給攜帶這些載體的細(xì)胞時(shí),該質(zhì)粒的復(fù)制模式變?yōu)闈L環(huán)復(fù)制以生成所述質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝并包裝噬菌體顆粒。所述噬粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。該術(shù)語(yǔ)包括含有噬菌體外殼蛋白基因或其片段的噬粒,所述噬菌體外殼蛋白基因或其片段連接于異源多肽基因而形成基因融合物,使得所述異源多肽在噬菌體顆粒表面展示。
      術(shù)語(yǔ)″噬菌體載體″指含有異源基因并能夠復(fù)制的噬菌體的雙鏈可復(fù)制形式。所述噬菌體載體具有噬菌體復(fù)制起點(diǎn),其允許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成。所述噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體諸如M13,f1,fd,Pf3噬菌體或其衍生物,或λ噬菌體,諸如λ,21,phi80,phi81,82,424,434等或其衍生物。
      本文中″靶氨基酸″指屬于這樣一組氨基酸的氨基酸,所述氨基酸組都是最常出現(xiàn)于已知和/或天然抗體或抗原結(jié)合片段的特定位置的氨基酸。一些實(shí)施方案中,“最常出現(xiàn)的氨基酸”是見于已知和/或天然抗體或抗原結(jié)合片段的優(yōu)選至少約50%,優(yōu)選至少約70%,優(yōu)選至少約80%,優(yōu)選至少約90%,優(yōu)選所有序列中的特定位置的氨基酸。一些實(shí)施方案中,“最常出現(xiàn)的氨基酸”是見于已知和/或天然抗體或抗原結(jié)合片段的優(yōu)選約50%-約100%,優(yōu)選約60%-約90%,優(yōu)選至少約70%-約85%,優(yōu)選至少約80%-約85%的序列中的特定位置的氨基酸。已知的抗體或抗原結(jié)合片段是其序列在本領(lǐng)域可得的那些,諸如可通過(guò)公眾可得的數(shù)據(jù)庫(kù)可得的那些,所述數(shù)據(jù)庫(kù)諸如Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(“Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991)和/或位于http://immuno.bme.nwu.edu的數(shù)據(jù)庫(kù)。所述氨基酸位置優(yōu)選是CDR區(qū)中的位置。靶氨基酸組指靶向具體位置的靶氨基酸組。優(yōu)選,靶氨基酸不是半胱氨酸殘基。對(duì)于輕鏈CDR1,CDR2,CDR3,和重鏈CDR1和CDR2中的位置,通常靶氨基酸組可包括源序列的特定高變且溶劑可接近位置的優(yōu)選約2-約11,優(yōu)選約4-約9,優(yōu)選約5-約7,優(yōu)選約6個(gè)氨基酸。
      術(shù)語(yǔ)“蛋白聚糖”指這樣的分子,其中至少一個(gè)糖胺聚糖側(cè)鏈與該分子的蛋白核心共價(jià)相連。本發(fā)明的蛋白聚糖合成缺陷的細(xì)胞系是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I缺陷的細(xì)胞系。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,所述細(xì)胞系是CHO-psbg細(xì)胞系。
      術(shù)語(yǔ)″拮抗劑″是部分或完全阻斷、抑制或中和天然STOP-1多肽的生物活性并特異性結(jié)合天然STOP-1多肽的任何分子,其中所述拮抗劑(1)與寡聚形式的天然STOP-1多肽結(jié)合,(2)與天然人STOP-1的殘基94-243結(jié)合和/或(3)可被本發(fā)明的單克隆抗體(例如,本發(fā)明保藏的抗體等)抑制(例如,在利用STOP-1和6B12的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)中觀察到的)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述拮抗劑是多肽。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,6B12抗體可抑制所述拮抗劑與STOP-1的結(jié)合。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,所述拮抗劑與人STOP-1或其非-人STOP-1等價(jià)物的殘基33-52或33-53中的殘基結(jié)合。
      術(shù)語(yǔ)“小分子拮抗劑”指任何分子量為1500道爾頓或更低、并且是本發(fā)明的拮抗劑的分子。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述小分子拮抗劑低于約500道爾頓。
      根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,所述拮抗劑阻斷、抑制或中和表達(dá)天然STOP-1的細(xì)胞中的細(xì)胞增殖。一個(gè)實(shí)施方案中,所述拮抗劑或小分子拮抗劑防止與STOP-1結(jié)合的細(xì)胞的遷移。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述拮抗劑或小分子拮抗劑特異性結(jié)合三聚體形式的STOP-1。適宜的拮抗劑包括抗體,本發(fā)明的天然STOP-1多肽、肽的氨基酸序列變體等。鑒定STOP-1多肽拮抗劑的方法包括將STOP-1多肽與候選拮抗劑分子接觸,并測(cè)定與STOP-1多肽相關(guān)的一或多種生物活性中的可檢測(cè)的改變。
      術(shù)語(yǔ)“增效劑”指增強(qiáng)天然STOP-1多肽的生物活性,并與天然STOP-1多肽特異性結(jié)合的任何分子,其中所述增效劑可與寡聚體形式的天然STOP-1多肽結(jié)合并具有至少一種選自下列的其它活性(1)能與天然人STOP-1的殘基94-243的殘基結(jié)合,(2)能使STOP-1在細(xì)胞上聚集;和(3)可被本發(fā)明的單克隆抗體S7或S4抗體競(jìng)爭(zhēng)(例如,如在利用STOP-1,S7或S4和所述增效劑的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA實(shí)驗(yàn)中觀察到的)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述增效劑促進(jìn)STOP-1與細(xì)胞(例如,HUVEC細(xì)胞,HeLa細(xì)胞,和HT1080細(xì)胞)的結(jié)合。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述激動(dòng)劑與三聚體形式的STOP-1結(jié)合。用于鑒定STOP-1多肽激動(dòng)劑的方法可包含將同STOP-1結(jié)合的細(xì)胞與STOP-1多肽以及候選激動(dòng)劑接觸,檢測(cè)與STOP-1多肽相關(guān)的一或多種生物活性中的可檢測(cè)改變(例如,促進(jìn)STOP-1多肽的結(jié)合,細(xì)胞增殖或細(xì)胞遷移)。
      “正在治療”或″治療″或“緩解”指治病性治療和防病性或預(yù)防性措施,其中目的在于防止或減緩(減輕)靶病理疾病或病癥。需要治療的受試者包括已經(jīng)患有疾病以及有患所述疾病傾向或需要防止所述疾病的受試者。這些術(shù)語(yǔ)表示,如果本文的治病性或防病性用途可緩解、減輕或降低與疾病相關(guān)的癥狀、并發(fā)癥或其它問(wèn)題,或者緩解、減輕或降低發(fā)病幾率以及與疾病相關(guān)的癥狀、并發(fā)癥或其它問(wèn)題的頻率,則所述治病性或防病性用途是成功的。
      如果受試者或哺乳動(dòng)物在根據(jù)本發(fā)明的方法接受治療量的拮抗劑以后,所述患者顯示可觀察到的和/或可檢測(cè)到的以下情形中一或多種的減少或缺乏,則所述受試者或哺乳動(dòng)物的STOP-1多肽表達(dá)型癌癥得以成功治療癌細(xì)胞數(shù)目減少或癌細(xì)胞缺乏;腫瘤體積減?。话┘?xì)胞對(duì)周圍器官的浸潤(rùn)受到抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止),所述浸潤(rùn)包括癌癥擴(kuò)散到軟組織和骨;腫瘤轉(zhuǎn)移抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止);在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng);和/或在一定程度上緩解一或多種與特定癌癥相關(guān)的癥狀;降低的病死率和死亡率,以及改善生活質(zhì)量。在抗-STOP-1-抗體或STOP-1結(jié)合寡肽達(dá)到可阻止現(xiàn)存癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死它們的程度時(shí),所述抗體或寡肽可為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性和/或細(xì)胞毒性的。這些體征或癥狀的減輕也可被患者感知。
      如果受試者或哺乳動(dòng)物根據(jù)本發(fā)明的方法接受治療量的拮抗劑或激動(dòng)劑,所述患者顯示可觀察和/或可測(cè)定的(待填充)和/或與異常血管生成有關(guān)的一或多種癥狀緩解到一定程度;以及生活質(zhì)量的改善,則所述受試者或哺乳動(dòng)物的異常血管生成被成功地“治療”。
      用于評(píng)估成功治療和疾病改善的上述參數(shù)可通過(guò)醫(yī)師熟悉的方法輕易測(cè)定。對(duì)于癌癥治療,可通過(guò)例如評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)間可通過(guò)評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)和/或測(cè)定反應(yīng)率(RR)來(lái)測(cè)定。轉(zhuǎn)移可通過(guò)評(píng)級(jí)實(shí)驗(yàn)以及通過(guò)骨掃描以及鈣水平檢測(cè)以及其它酶來(lái)測(cè)定骨轉(zhuǎn)移來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)移??蛇M(jìn)行CT掃描來(lái)尋找向該區(qū)域內(nèi)骨盆和淋巴結(jié)的擴(kuò)散。胸X-線和通過(guò)已知方法的肝酶水平測(cè)定可分別用于尋找肺和肝轉(zhuǎn)移。其它已知監(jiān)測(cè)所述疾病的方法包括經(jīng)直腸超聲(TRUS)和經(jīng)直腸細(xì)針活檢(TRNB)。
      對(duì)于作為更為局限的癌癥的膀胱癌,測(cè)定疾病進(jìn)展的方法包括通過(guò)膀胱鏡檢查進(jìn)行尿細(xì)胞學(xué)評(píng)估,監(jiān)測(cè)尿血的存在,通過(guò)超聲和靜脈腎盂造影,計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)和磁共振成像(MRI)觀察尿道。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存在可通過(guò)腹部CT,胸x-線或骨骼放射性核素成像來(lái)評(píng)估。
      “慢性”給藥是指與急性方式相對(duì)的以連續(xù)方式施用藥劑,以便在延長(zhǎng)的時(shí)間期限內(nèi)維持起始治療效果(活性)。“間歇性”給藥是指不是連續(xù)無(wú)中斷地進(jìn)行,而是具有周期性特性的治療。
      用于治療、緩解癌癥的癥狀或癌癥診斷治療目的的“哺乳動(dòng)物”是指分類為哺乳動(dòng)物(患者)的任何動(dòng)物,包括人類,馴養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物,以及動(dòng)物園動(dòng)物,競(jìng)技動(dòng)物,或?qū)櫸飫?dòng)物,例如狗,貓,牛,馬,綿羊,豬,山羊,兔等,優(yōu)選的是,該哺乳動(dòng)物是人類。
      與一種或多種其它治療劑“組合”的給藥包括同時(shí)的(同時(shí)進(jìn)行的)和以任何順序連續(xù)的給藥。
      本文使用的“載體”包括對(duì)于以所用劑量和濃度與其接觸的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無(wú)毒的藥用上可接受的載體,賦形劑,或穩(wěn)定劑。通常生理學(xué)上可接受的載體是含水的pH緩沖溶液。生理學(xué)上可接受的載體的例子包括諸如磷酸鹽,檸檬酸鹽,和其它有機(jī)酸在內(nèi)的緩沖液;包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑;低分子量(不超過(guò)10個(gè)殘基)多肽;諸如血清白蛋白,明膠,或免疫球蛋白等蛋白質(zhì);諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體;諸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,精氨酸或賴氨酸等氨基酸;單糖,二糖,和包括葡萄糖,甘露糖,或糊精等其它糖類;諸如EDTA等螯合劑;諸如甘露醇或山梨醇等糖醇;諸如鈉等成鹽反離子;和/或諸如TWEEN_,聚乙二醇(PEG),和PLURONICS_等非離子表面活性劑。
      “固相”或“固體支持物”是指本發(fā)明的抗體、拮抗劑或多肽可粘附或附著的非水性基質(zhì)。本文中固相的實(shí)例包括部分或全部由玻璃(如控制孔徑的玻璃)、多糖(如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些實(shí)例中,根據(jù)上下文的內(nèi)容,固相可包括測(cè)試板的孔;在其它的例子中,它可以是純化柱(如親和層析柱)。該術(shù)語(yǔ)也包括美國(guó)專利4275149中公開的分散顆粒的不連續(xù)固相。
      本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”是指結(jié)合了異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)器功能的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上,免疫粘附素包含氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合,該氨基酸序列具有除抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)以外的所需結(jié)合特異性(即,是“異源性的”)。免疫粘附素分子的粘附素部分一般是至少含有受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)氨基酸序列-諸如天然STOP-1蛋白的一部分。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可從諸如IgG-1,IgG-2,IgG-3,或IgG-4亞型,IgA(包括IgA-1和IgA-2),IgE,IgD或IgM等任何免疫球蛋白獲得。
      “脂質(zhì)體”是由各類脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子載體,能向哺乳動(dòng)物有效運(yùn)送藥物(如STOP-1多肽,STOP-1多肽抗體以及STOP-1結(jié)合寡肽)。通常將脂質(zhì)體成分安排為一種雙層形式,其類似于生物膜的脂質(zhì)排列。
      “小分子”或“小”有機(jī)分子本文定義為具有低于大約500道爾頓的分子量。
      本發(fā)明的多肽、抗體、拮抗劑或組合物是足以進(jìn)行具體所述目的的量?!坝行Я俊笨赏ㄟ^(guò)經(jīng)驗(yàn)以及與所述目的有關(guān)的已知方法測(cè)定。
      術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指本發(fā)明抗體、多肽或拮抗劑的量,所述量可有效“治療”哺乳動(dòng)物(患者)中的疾病或病癥。對(duì)于癌癥,藥物有效量可減少癌細(xì)胞數(shù)量;減小腫瘤體積;抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中;抑制(即減慢到一定程度并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移;在一定程度抑制腫瘤生長(zhǎng);和/或在一定程度上緩解一或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。見本文中“治療”的定義。藥物在達(dá)到可以預(yù)防現(xiàn)存癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)存癌細(xì)胞的程度時(shí),其可為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性和/或細(xì)胞毒性的。
      本發(fā)明多肽,抗體,拮抗劑或組合物的“生長(zhǎng)抑制量”是能夠在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞尤其是腫瘤例如癌細(xì)胞生長(zhǎng)的量。本發(fā)明多肽,抗體,拮抗劑或組合物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的“生長(zhǎng)抑制量”可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)以及已知的方法或本文提供的實(shí)施例測(cè)定。
      本發(fā)明多肽、抗體、拮抗劑或組合物的“細(xì)胞毒性量”指能夠在體外或體內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞具體是腫瘤例如癌細(xì)胞的破壞的量。本發(fā)明的多肽、抗體、拮抗劑或組合物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的“細(xì)胞毒性量”可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定。
      術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣義使用且具體包括,例如,單一抗-STOP-1-單克隆抗體(包括激動(dòng)劑,拮抗劑,和中和抗體),具有多表位特異性的抗-STOP-1抗體組合物,多克隆抗體,單鏈抗-STOP-抗體,和抗-STOP-抗體的片段(見下文),只要它們與天然STOP-1多肽特異性結(jié)合和/或顯示本發(fā)明的生物活性或免疫活性。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,所述抗體與寡聚形式例如三聚體形式的STOP-1結(jié)合。另一實(shí)施方案中,所述抗體在殘基94-243之間特異性結(jié)合人STOP-1。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案,所述抗體特異性結(jié)合STOP-1,所述結(jié)合可被本發(fā)明單克隆抗體(例如,本發(fā)明保藏的抗體等)抑制。術(shù)語(yǔ)抗體的“功能片段或同系物”是具有與其所指的抗體具有共同的定性生物活性的化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中,抗-STOP-1抗體的功能片段或類似物可以是與STOP-1分子特異性結(jié)合的抗體。一個(gè)實(shí)施方案中,所述抗體可以防止或基本上降低STOP-1分子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的能力。術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”(Ig)在本文中與“抗體”互換使用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,本發(fā)明的抗體不與具有氨基酸序列GWNSVSRIIIEELPK的肽結(jié)合。
      “分離的”抗體是指從其天然環(huán)境成份中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成份是可能干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì),且可能包括酶,激素,和其它蛋白型或非蛋白型溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,該抗體可純化成(1)按勞里(Lowry)方法測(cè)定的抗體重量超過(guò)95%,且最優(yōu)選重量超過(guò)99%,(2)其純化程度足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基,或(3)在還原型或非還原型條件下進(jìn)行SDS-PAGE并使用考馬斯藍(lán)或者,優(yōu)選銀染測(cè)定具有同質(zhì)性。該分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體,因?yàn)樵摽贵w天然環(huán)境中的至少一種成份不存在。然而,一般來(lái)說(shuō),分離的抗體由至少一個(gè)純化步驟制備。
      基本四鏈抗體單位是異源四聚體糖蛋白,其由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成(IgM抗體由5個(gè)基本異源四聚體單位以及另一稱為J鏈的多肽組成,因此含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn),而分泌的IgA抗體可聚合以形成多價(jià)集合體,其含有2-5個(gè)基本四-鏈單位以及J鏈)。對(duì)于IgG,所述四-鏈單位通常約150,000道爾頓。每條L鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與H鏈相連,而根據(jù)H鏈同種型,兩條H鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵相互連接。每條H和L鏈也具有規(guī)律間隔的鏈間二硫橋。每條H鏈在N-末端具有可變區(qū)(VH)然后是對(duì)于α和γ鏈中的每一個(gè)而言的三個(gè)恒定區(qū)(CH)和對(duì)于μ和ε同種型而言的四個(gè)CH結(jié)構(gòu)域。每條L鏈在N-末端具有可變區(qū)(VL),在其另一端為恒定區(qū)(CL)。VL與VH比對(duì),CL與重鏈第一恒定區(qū)(CH1)比對(duì)。據(jù)信具體的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成界面。VH和VL的配對(duì)共同形成單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。不同類型抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),見,例如,Basic andClinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(eds.),Appleton &amp; Lange,Norwalk,CT,1994,第71頁(yè)和第6章。
      任何脊椎物種L鏈可基于其恒定區(qū)氨基酸序列分入兩類明顯不同類型中的一種,稱為κ和λ。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)(CH)的氨基酸序列,免疫球蛋白可分成不同類型或同種型。共有五種類型的免疫球蛋白IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,分別具有稱為α,δ,ε,γ,和μ的重鏈。γ和α類型還進(jìn)一步基于CH序列中的相對(duì)較小差異和功能分為亞類,例如人表達(dá)以下亞類IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。
      術(shù)語(yǔ)“可變的”是指可變區(qū)的某些部分在不同抗體之間存在較大序列差異這一事實(shí)。V區(qū)介導(dǎo)抗原結(jié)合并定義針對(duì)其特定抗原的特定抗體的特異性。然而,所述可變性在可變區(qū)的110個(gè)氨基酸內(nèi)不是均勻分布的。而V區(qū)由15-30個(gè)氨基酸組成的稱為框架區(qū)的相對(duì)不可變片段組成,所述框架區(qū)通過(guò)稱為“高變區(qū)”的各9-12個(gè)氨基酸長(zhǎng)的極高可變性的較短區(qū)域分隔。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含4個(gè)FR區(qū),大部分采取β-折疊構(gòu)型,由3個(gè)高變區(qū)相連接,形成環(huán)形連接,在某些情況下形成β-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。各鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR緊密相鄰,并與來(lái)自另一鏈的高變區(qū)一起負(fù)責(zé)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th ed.,Public Health Servicl,National Iustitntes of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合,但表現(xiàn)出各種效應(yīng)子功能,例如,使抗體參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。
      本文使用的術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指抗體上負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即,VL中的大約殘基24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3)和VH中的大約1-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3);在一個(gè)實(shí)施方式中,H1是大約31-35(Kabat等,Sequences ofproteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitute of Health,Bethesda,MD. )和/或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基(即,VL的殘基26-32(L1),50-52(L2)和91-96(L3)和VH的26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196901-917 )。
      本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同源的抗體群體獲得的抗體,即除了少量存在的可能天然發(fā)生的突變外,該群體包含的各個(gè)抗體是相同的。單克隆抗體具有高度特異性,僅針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且,與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反,每種單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了其特異性之外,單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可被合成而不受其它抗體污染。修飾詞“單克隆”不解釋為需通過(guò)任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如,根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過(guò)由Kohler等,Nature,256495(1975)首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備,或者可通過(guò)重組DNA法在細(xì)菌、真核動(dòng)物或植物細(xì)胞中進(jìn)行制備(例如見美國(guó)專利4,816,567)?!皢慰寺】贵w”還可利用例如Clackson等,Nature,352624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222581-597(1991))以及以下實(shí)施例所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。
      本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體,其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自具體物種或?qū)儆诰唧w抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源,但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段,只要它們顯示本發(fā)明的生物學(xué)活性)的相應(yīng)序列相同或同源(見美國(guó)專利4,816,567;Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本發(fā)明的目的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)源化的(primatized)”抗體,其含有來(lái)自非人靈長(zhǎng)類的可變區(qū)抗原結(jié)合序列(例如OldWorld Monkey,猿等),和人恒定區(qū)序列。
      “完整”抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)以及CL和至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域,CH1,CH2和CH3的抗體。所述恒定結(jié)構(gòu)域可為天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選,所述完整抗體具有一或多種效應(yīng)子功能。
      “抗體片段”包含完整抗體的一部分,優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)??贵w片段的例子包括Fab,F(xiàn)ab′,F(xiàn)(ab′)2,和Fv片段;雙抗體(diabodies);線性抗體(Zapata等,Protein Eng.,8(10)1057-1062 );單鏈抗體分子;和從抗體片段形成的多特異性抗體。
      術(shù)語(yǔ)“線性抗體”,是指在Zapata等,Protein Eng.8(10)1057-1062(1995)中描述的抗體。簡(jiǎn)言之,這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1),其與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以具有雙特異性或單特異性。
      木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的稱為“Fab”片段的抗原結(jié)合片段,和殘留的“Fc”片段,F(xiàn)c片段的名稱反映了其容易結(jié)晶的能力。Fab片段由整個(gè)L鏈以及H鏈可變區(qū)(VH),一條重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)組成。每個(gè)Fab片段對(duì)于抗原結(jié)合而言為單價(jià)的,即其具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)胃蛋白酶處理抗體可產(chǎn)生單個(gè)大F(ab′)2片段,其基本對(duì)應(yīng)具有二價(jià)抗原結(jié)合活性并仍然能與抗原交聯(lián)的、由兩個(gè)二硫鍵連接的F(ab’)2片段。Fab’片段區(qū)別于Fab片段之處在于,F(xiàn)ab’在CH1區(qū)的羧基末端多出幾個(gè)殘基,包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有游離巰基的那些Fab’。F(ab’)2抗體片段最初產(chǎn)生為成對(duì)的Fab’片段的形式,在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)是眾所周知的。
      Fc片段包含由二硫鍵連接的兩條H鏈的羧基末端部分??贵w的效應(yīng)子功能通過(guò)Fc區(qū)中的序列確定,該區(qū)也是被一些類型的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)所識(shí)別的部分。
      “Fv”是包含完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小的抗體片段。這個(gè)片段由一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)緊密、非共價(jià)結(jié)合成的二聚體組成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生出6個(gè)高變環(huán)(H和L鏈各3個(gè)環(huán)),其貢獻(xiàn)抗原結(jié)合所需氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特性。但即使單個(gè)可變區(qū)(或僅包含抗原特異性的三個(gè)CDRs的那一半Fv)也能識(shí)別并結(jié)合抗原,只是比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。
      “單鏈Fv”也縮寫成“sFv”或“scFv”,指包含連接成單個(gè)多肽鏈的VH和VL抗體的抗體片段。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個(gè)多肽接頭,它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見Pluckthun inThe Pharmacology of Monodonal Antibodiesvol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck 1995,同上。
      術(shù)語(yǔ)“二價(jià)抗體(diabodies)”是指小分子抗體片段,其通過(guò)構(gòu)建在VH和VL區(qū)之間具有短接頭(約5-10個(gè)殘基)的sFv片段(見前段)制備,使得獲得鏈間而不是鏈內(nèi)V區(qū)配對(duì),產(chǎn)生二價(jià)片段,即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。在EP 404,097;WO 93/11161;和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,906444-6448(1993)中有對(duì)二價(jià)抗體的更詳細(xì)描述。
      非人(例如,嚙齒類)抗體的“人源化”形式是指含有來(lái)自非人抗體最小序列的嵌合抗體。大多數(shù)情況下,人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體),其中來(lái)自受體高變區(qū)的殘基被具有所需抗體特異性、親和性、和能力的來(lái)自諸如小鼠,大鼠,兔或非人靈長(zhǎng)類的非人物種高變區(qū)(供體抗體)的殘基取代。在某些情況下,人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。另外,人源化的抗體可包含在受體抗體或供體抗體中均沒有發(fā)現(xiàn)的殘基??勺鞒鲞@些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體效果。一般來(lái)說(shuō),人源化抗體可包含至少一個(gè),且一般是兩個(gè)可變區(qū)的基本上全部,其中全部或基本上全部的高變環(huán)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán),且全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體優(yōu)選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),一般是人免疫球蛋白的Fc。對(duì)于更詳細(xì)的情況,參見,Jones等,Nature,321522-525(1986);Reichmann等,Nature,332323-329 ;和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2593-596(1992)。
      “物種依賴的抗體,”例如,哺乳動(dòng)物抗-人IgE抗體,是對(duì)來(lái)自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原所具有的結(jié)合親和力高于其對(duì)來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的所述抗原的同系物所具有的結(jié)合親和力的抗體。通常,所述物種依賴的抗體與人抗原“特異性結(jié)合”(即具有的結(jié)合親和力(Kd)值不超過(guò)約1×10-7M,優(yōu)選不超過(guò)約1×10-8,最優(yōu)選不超過(guò)約1×10-9M),但對(duì)來(lái)自第二非人哺乳動(dòng)物物種的同系物的結(jié)合親和力比其對(duì)人抗原的結(jié)合親和力弱至少約50倍,或至少約500倍,或至少約1000倍。所述物種依賴的抗體可以是上述各種類型的抗體中的任何一種,但優(yōu)選是人源化抗體或人抗體。
      “STOP-1結(jié)合寡肽”是與本文所述STOP-1多肽結(jié)合,優(yōu)選特異性結(jié)合的寡肽。STOP-1結(jié)合寡肽可利用已知的寡肽合成法通過(guò)化學(xué)方法合成,或利用重組技術(shù)制備并純化。STOP-1結(jié)合寡肽的長(zhǎng)度通常至少約5個(gè)氨基酸,可選至少約6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,或100個(gè)氨基酸或更長(zhǎng),其中所述寡肽能夠與本文所述STOP-1多肽結(jié)合,優(yōu)選特異性結(jié)合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,STOP-1結(jié)合寡肽與同6B12抗體結(jié)合的區(qū)域或其重疊區(qū)域結(jié)合。STOP-1結(jié)合寡肽可利用已知技術(shù)無(wú)需不適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)而得以鑒定。在這方面,注意到用于篩選寡肽文庫(kù)中能夠與多肽靶特異性結(jié)合的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(見,例如,U.S.專利5,556,762,5,750,373,4,708,871,4,833,092,5,223,409,5,403,484,5,571,689,5,663,143;PCT公開WO 84/03506和WO84/03564;Geysen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,813998-4002(1984);Geysen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82178-182(1985);Geysen et al.,in Syntheticpeptides as Antigens,130-149(1986);Geysen et al.,J.Immunol.Meth.,102259-274(1987);Schoofs et al.,J.Immunol.,140611-616(1988),Cwirla,S.E.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,876378;Lowman,H.B.et al.(1991)Biochemistry,3010832;Clackson,T.et al.(1991)Nature,352624;Marks,J.D.et al.(1991),J.Mol.Biol.,222581;Kang,A.S.et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,888363,和Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2668)。
      本發(fā)明與目的抗原例如腫瘤相關(guān)的多肽抗原靶諸如STOP-1相結(jié)合的多肽、抗體、拮抗劑或組合物與抗原以足夠的親和力結(jié)合抗原,使得多肽、抗體、拮抗劑或組合物可用作靶向表達(dá)所述抗原的細(xì)胞或組織的診斷和/或治療劑,并不與其它蛋白發(fā)生明顯的交叉反應(yīng)的多肽、抗體、拮抗劑或組合物。在所述實(shí)施方案中,所述多肽、抗體、拮抗劑或組合物與“非-靶”蛋白結(jié)合的程度將比所述多肽、抗體、拮抗劑或組合物與其具體靶蛋白結(jié)合的約10%還要低,如利用熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所測(cè)定的。對(duì)于多肽、抗體、拮抗劑或組合物與靶分子的結(jié)合,術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合于”具體多肽或具體多肽靶上的表位的意思是,所述結(jié)合與非特異性反應(yīng)具有可測(cè)定的差異。特異性結(jié)合可例如通過(guò)測(cè)定分子與對(duì)照分子相比較的結(jié)合來(lái)測(cè)定,所述對(duì)照分子通常為結(jié)構(gòu)相似但不具有結(jié)合活性的分子。例如,特異性結(jié)合可通過(guò)與類似于所述靶的對(duì)照分子例如過(guò)量的非標(biāo)記靶競(jìng)爭(zhēng)來(lái)測(cè)定。在這種情況下,如果標(biāo)記的靶與探針的結(jié)合可被過(guò)量的非標(biāo)記靶競(jìng)爭(zhēng)性抑制,則指示特異性結(jié)合。本文術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合于”或“特異于”具體多肽或具體多肽靶上的表位可,例如,通過(guò)對(duì)所述靶的具有Kd至少約10-4M,可選至少約10-5M,可選至少約10-6M,可選至少約10-7M,可選至少約10-8M,可選至少約10-9M,可選至少約10-10M,可選至少約10-11M,可選至少約10-12M,或更高的分子顯示。一個(gè)實(shí)施方案中,術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指所述分子與具體多肽或具體多肽上的表位結(jié)合而基本上不與任何其它多肽或多肽表位(例如,非-STOP-1蛋白)結(jié)合。應(yīng)理解,與人天然STOP-1多肽特異性結(jié)合的抗體也可與非-人天然STOP-1多肽結(jié)合。
      “抑制表達(dá)STOP-1多肽的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)”的多肽、抗體、拮抗劑或組合物或“生長(zhǎng)抑制性”多肽、抗體、拮抗劑或組合物可導(dǎo)致表達(dá)或過(guò)表達(dá)適當(dāng)STOP-1多肽的癌細(xì)胞的可測(cè)定的生長(zhǎng)抑制。與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比,優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性多肽、抗體、拮抗劑或組合物抑制表達(dá)STOP-1的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)超過(guò)20%,優(yōu)選約20%-約50%,和更優(yōu)選超過(guò)50%(例如,約50%-約100%),所述對(duì)照通常是沒有用受試多肽、抗體、拮抗劑或組合物處理的腫瘤細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施方案中,生長(zhǎng)抑制可在細(xì)胞培養(yǎng)中抗體濃度約0.1-30μg/ml或約0.5nM-200nM時(shí)測(cè)定,其中所述生長(zhǎng)抑制在將腫瘤細(xì)胞暴露于所述抗體1-10天后測(cè)定。對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)抑制可以各種方式測(cè)定,諸如在下文實(shí)施例部分所述。如果給藥約1μg/kg-約100mg/kg體重的抗-STOP-1抗體在從給藥所述抗體的約5天到3個(gè)月內(nèi),優(yōu)選約5-30天內(nèi)導(dǎo)致腫瘤大小減小或腫瘤細(xì)胞增殖減少,則所述抗體在體內(nèi)是生長(zhǎng)抑制性的。
      抗體“效應(yīng)子功能”指導(dǎo)致抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的生物活性的那些,并隨抗體同種型不同而改變。抗體效應(yīng)子功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒;Fc受體結(jié)合;抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC);吞噬作用;細(xì)胞表面受體(例如,B細(xì)胞受體)下調(diào);和B細(xì)胞活化。
      “抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”或“ADCC”指一種細(xì)胞毒形式,其中分泌的Ig結(jié)合存在于特定細(xì)胞毒細(xì)胞(如自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞,和巨噬細(xì)胞)上的Fc受體(FcR),使得這些細(xì)胞毒效應(yīng)子細(xì)胞與攜帶抗原的靶細(xì)胞特異性結(jié)合并隨后用細(xì)胞毒素殺死所述靶細(xì)胞。所述抗體“武裝”所述細(xì)胞毒細(xì)胞,并為所述殺傷所絕對(duì)需要的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγR III,而單核細(xì)胞表達(dá)FcγR I、FcγR II和FcγR III。Ravetch和Kinet在Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991),464頁(yè)的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為評(píng)估目的分子的ADCC活性,可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn),如美國(guó)專利5,500,362號(hào)或5,821,337號(hào)中所述。這類試驗(yàn)中有用的效應(yīng)子細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。選擇性地,或附加地,目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評(píng)估,例如采用Clynes等(USA)95652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型。
      “Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然人FcR序列。而且,優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(γ受體),并包括FcγR I、FcγR II和FcγR III亞型的受體,以及這些受體的等位基因變體以及可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγRIIB(“抑制型受體”),二者的氨基酸序列相似,主要區(qū)別在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?;罨褪荏wFcγR IIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見Daёron,Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997)中的綜述).FcRs在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991);Capel et al.,Immunomethods425-34(1994);和de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)中綜述。其它FcR,包括將來(lái)要被確定的,均被包含在本文術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)也包括新生兒受體,F(xiàn)cRn,其負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.117587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24249(1994))。
      “人效應(yīng)子細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞至少表達(dá)FcγR III并執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能??山閷?dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC),自然殺傷(NK)細(xì)胞,單核細(xì)胞,細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)子細(xì)胞可從天然來(lái)源分離,例如從血液中。
      “補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”是指在補(bǔ)體存在時(shí)裂解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化由補(bǔ)體系統(tǒng)第一個(gè)成分(Clq)結(jié)合至與其同源抗原結(jié)合的(適當(dāng)亞型的)抗體來(lái)啟動(dòng)。為評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化,可如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods202163(1996)所述進(jìn)行CDC試驗(yàn)。
      術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性”是指或者描述哺乳動(dòng)物中一般特征在于細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)控的生理學(xué)狀態(tài)。癌癥的例子包括,但不限于,癌,淋巴瘤,母細(xì)胞瘤,肉瘤,白血病或淋巴組織惡性疾病。癌癥的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌),肺癌包括小細(xì)胞肺癌,非小細(xì)胞肺癌,肺腺癌以及肺鱗癌,腹膜癌,肝細(xì)胞癌,胃的或胃癌包括胃腸癌,胰腺癌,神經(jīng)母細(xì)胞瘤,宮頸癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,尿道癌,肝細(xì)胞瘤,乳腺癌,結(jié)腸癌,直腸癌,結(jié)腸直腸癌,子宮內(nèi)膜或子宮癌,唾液腺癌,腎或腎的癌,前列腺癌,外陰癌,甲狀腺癌,肝的癌,肛門癌,陰莖癌,黑素瘤,多發(fā)性骨髓瘤和B-細(xì)胞淋巴瘤,腦,以及頭和頸癌,和相關(guān)轉(zhuǎn)移。
      術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞增生性疾病”和“增生性疾病”指與一定程度的異常細(xì)胞增生相關(guān)的疾病。一個(gè)實(shí)施方案中,所述細(xì)胞增生性疾病是癌。一個(gè)實(shí)施方案中,所述細(xì)胞增生性疾病是結(jié)締組織生成。
      本文使用的“腫瘤”是指不論是惡性還是良性的所有贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,以及所有前癌性和癌性的細(xì)胞和組織。
      本文術(shù)語(yǔ)異常血管生成出現(xiàn)在疾病狀態(tài)中新血管生長(zhǎng)過(guò)度、不足或不適當(dāng)(例如從醫(yī)學(xué)角度不需要的血管生成的位置、時(shí)間或開始)的情況或當(dāng)其導(dǎo)致疾病狀態(tài)時(shí)?!斑^(guò)度,不適當(dāng)或失控的血管生成”出現(xiàn)在疾病狀態(tài)中,其中新血管生長(zhǎng)導(dǎo)致疾病狀態(tài)的加重,例如在癌中,具體是血管化的實(shí)體腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤(包括結(jié)腸、肺癌(具體是小細(xì)胞肺癌)或前列腺癌),由眼部新生血管化導(dǎo)致的疾病,具體是糖尿病性失明,視網(wǎng)膜病,原發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病或年齡誘導(dǎo)的黃斑變性以及紅變(rubeosis);銀屑病,血管母細(xì)胞瘤諸如血管瘤;炎性腎疾病,諸如腎小球腎炎,具體是系膜增生性腎小球腎炎,溶血性尿毒癥綜合征,糖尿病腎病或超敏性腎小球硬化癥;各種炎性疾病,諸如關(guān)節(jié)炎,具體是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,炎性腸病,銀屑病,結(jié)節(jié)病,動(dòng)脈性動(dòng)脈硬化癥以及移植后發(fā)生的疾病,子宮內(nèi)膜異位癥或慢性哮喘,以及超過(guò)70種其它疾病。新血管可為患病組織提供營(yíng)養(yǎng),破壞正常組織,并且在癌癥中,新血管允許腫瘤細(xì)胞逃逸進(jìn)入循環(huán)并在定位其它器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。血管生成不足見于導(dǎo)致疾病狀態(tài)惡化的不足的血管生成,例如在諸如冠狀動(dòng)脈疾病,中風(fēng)以及延遲的傷口愈合等疾病中。此外,潰瘍,中風(fēng)以及心臟病發(fā)作可由通常為自然病愈所需的血管生成的缺失而導(dǎo)致。本發(fā)明涉及治療有患上述疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者。
      其它可作為接受本發(fā)明STOP-1拮抗劑的候選者的患者患有或有可能患纖維脈管組織異常增生,紅斑痤瘡(acne rosacea),獲得性免疫缺陷綜合征,動(dòng)脈阻塞(artery occlusion),異位角膜炎(atopic keratitis),細(xì)菌性潰瘍,白塞病(Bechets disease),血液攜帶的腫瘤(blood borne tumors),頸動(dòng)脈阻塞疾病(carotid obstructive disease),脈絡(luò)膜新生血管化(choroidal neovascularization),慢性炎癥(chronic inflammation),慢性視網(wǎng)膜剝離(chronic retinal detachment),慢性葡萄膜炎(chronic uveitis),慢性玻璃體炎,角膜接觸鏡過(guò)度磨損(contactlens overwear),角膜移植物排斥(corneal graft rejection),角膜新生血管化(corneal neovascularization),角膜移植物新生血管化(corneal graftneovascularization),克隆氏病(Crohn′s disease),伊爾斯病(Eales disease)病,流行性角膜結(jié)膜炎(epidemic keratoconjunctivitis),真菌性潰瘍(fungal ulcers),單純皰疹感染(Herpes simplex infections),帶狀皰疹感染(Herpes zosterinfections),高粘度綜合征(hyperviscosity syndromes),卡波西肉瘤(Kaposi′ssarcoma),白血病(leukemia),脂質(zhì)變性(lipid degeneration),萊姆病(Lyme′sdisease),邊緣角質(zhì)層分離(marginal keratolysis),蠶食性角膜潰瘍(Moorenulcer),分支桿菌感染除外麻風(fēng)病(leprosy),近視(myopia),眼新生血管疾病(ocular neovessel disease),視窩(optic pits),Osler-Weber綜合征(Osler-Weber-Rendu,骨關(guān)節(jié)炎,派杰病(Pagets disease),扁平部睫狀體炎(pars planitis),類天皰瘡(pemphigoid),phylectenulosis,多動(dòng)脈炎(polyarteritis),激光后并發(fā)癥(post-laser complications),原生動(dòng)物感染(protozoan infections),彈性假黃色瘤(pseudoxanthoma elasticum),翼狀胬肉(pterygium),干性角膜炎(keratitis sicca),輻射狀角膜切開術(shù)(radialkeratotomy),視網(wǎng)膜新生血管化(retinal neovascularization),早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity),晶狀體后纖維增生癥(retrolental fibroplasias),結(jié)節(jié)病(sarcoid),鞏膜炎(scleritis),鐮狀細(xì)胞性貧血(sickle cell anemia),Sogrens綜合征,實(shí)體瘤,Stargarts病,Steven′s Johnson病,上邊緣角膜炎(superiorlimbic keratitis),梅毒(syphilis),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus),Terrien′s邊緣變性(marginal degeneration),弓形體病(toxoplasmosis),外傷(trauma),尤文肉瘤(tumors of Ewing sarcoma),神經(jīng)母細(xì)胞瘤(tumors of neuroblastoma),骨肉瘤(tumors of osteosarcoma),視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(tumors of retinoblastoma),橫紋肌肉瘤(tumors of rhabdomyosarcoma),潰瘍性結(jié)腸炎,靜脈阻塞(veinocclusion),維生素A缺乏和Wegeners結(jié)節(jié)病,與糖尿病相關(guān)的不良血管生成,寄生蟲疾病,異常傷口愈合,手術(shù)、損傷或外傷后肥大(hypertrophyfollowing surgery,injury or trauma),毛發(fā)生長(zhǎng)抑制,排卵與黃體形成抑制,植入抑制和子宮內(nèi)胚胎發(fā)育抑制。
      抗-血管生成治療可用于以下疾病的常規(guī)治療移植物排斥,肺的炎癥,腎病綜合征,先兆子癇,心包積液,諸如與心包炎相關(guān)的心包積液,和胸腔積液(pleural effusion),特征為不良脈管通透性的疾病和病癥,例如,與腦腫瘤有關(guān)的水腫,與惡性疾病有關(guān)的腹水,Meigs′綜合征,肺的炎癥,腎病綜合征,心包積液和胸腔積液等。
      其它可用本發(fā)明的組合物治療的血管生成依賴性疾病包括血管纖維瘤(angiofibroma)(易于出血的異常血管),新血管性青光眼(眼內(nèi)血管異常生長(zhǎng)),動(dòng)靜脈畸形(arteriovenous malformations)(動(dòng)脈和靜脈之間異常交通),非聯(lián)合性骨折(nonunion fractures)(不愈合骨折),動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(atherosclerotic plaques)(動(dòng)脈硬化),膿性肉芽腫(pyogenic granuloma)(血管組成的常見皮膚損傷),硬皮癥(結(jié)締組織病的一種形式),血管瘤(血管組成的腫瘤),沙眼(trachoma)(導(dǎo)致第三世界中的失明的主要原因),血友病性關(guān)節(jié)(hemophilic joints),血管粘連和肥厚性疤痕(hypertrophic scars)(異常疤痕形成(abnormal scar formation))。
      由于血管在骨更新和生長(zhǎng)中起重要作用,本發(fā)明的增效劑或激動(dòng)劑可刺激或增加疾病或損傷后的骨和/或軟骨修復(fù),或通過(guò)阻斷炎癥或炎性過(guò)程介導(dǎo)的組織破壞過(guò)程(膠原酶活性,破骨活性等)??捎帽景l(fā)明STOP-1增效劑或激動(dòng)劑治療的骨損傷或疾病包括牙周疾病,其它牙齒修復(fù)過(guò)程,骨質(zhì)疏松以及骨折。
      本發(fā)明的“基質(zhì)靶向劑”是基本上識(shí)別并結(jié)合基質(zhì)組織(與其它組織比較)的藥劑?;|(zhì)組織是器官、腺體或其它結(jié)構(gòu)的結(jié)締組織框架,與執(zhí)行該器官或其部分的特定功能的組織相區(qū)分?;|(zhì)靶向劑(stromal targeting agent)的實(shí)例包括與FAP,束蛋白(fascin),HSP47,mesothelin和前列腺干抗原(prostate stem antigen)特異性結(jié)合的抗體。
      本發(fā)明“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”的多肽、抗體、拮抗劑或組合物導(dǎo)致有活力的細(xì)胞失去活力。所述細(xì)胞表達(dá)STOP-1多肽,優(yōu)選與同一組織類型的正常細(xì)胞相比過(guò)表達(dá)STOP-1多肽。優(yōu)選,所述細(xì)胞是癌細(xì)胞,例如,乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細(xì)胞。體外細(xì)胞死亡可在缺乏補(bǔ)體以及免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下測(cè)定以區(qū)分抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此,細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)可利用熱滅活的血清(即,缺乏補(bǔ)體)并在缺乏免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行。為測(cè)定本發(fā)明的多肽、抗體、拮抗劑或組合物能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,相對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞評(píng)估細(xì)胞膜完整性,所述評(píng)估通過(guò)對(duì)碘化丙啶(PI),臺(tái)盼藍(lán)(見Moore et al.Cytotechnology171-11(1995))或7AAD的攝取進(jìn)行評(píng)價(jià)進(jìn)行。優(yōu)選誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的多肽、抗體、拮抗劑或組合物可在PI攝取試驗(yàn)中誘導(dǎo)BT474細(xì)胞的PI攝取。
      “STOP-1表達(dá)型細(xì)胞”是這樣的細(xì)胞,其在細(xì)胞表面或以分泌的形式表達(dá)內(nèi)源性或轉(zhuǎn)染的STOP-1多肽?!癝TOP-1表達(dá)型癌”是這樣的癌,其包含在細(xì)胞表面具有STOP-1多肽或產(chǎn)生并分泌STOP-1多肽的細(xì)胞。另一實(shí)施方案中,“STOP-1表達(dá)型癌”可選產(chǎn)生并分泌足夠水平的STOP-1多肽,使得本發(fā)明的多肽、抗體、拮抗劑或組合物可與其結(jié)合并相對(duì)于所述癌具有治療效果?!斑^(guò)表達(dá)”STOP-1多肽的癌與同一組織類型的非癌性細(xì)胞相比,前者在其細(xì)胞表面具有或產(chǎn)生并分泌明顯較高水平的STOP-1多肽。所述過(guò)表達(dá)可通過(guò)基因擴(kuò)增或通過(guò)增加的轉(zhuǎn)錄或翻譯導(dǎo)致。STOP-1多肽過(guò)表達(dá)可通過(guò)在診斷或預(yù)后實(shí)驗(yàn)中評(píng)估細(xì)胞表面存在的或細(xì)胞分泌的升高水平的STOP-1蛋白確定(例如,經(jīng)由利用相對(duì)于分離的STOP-1多肽制備的抗-STOP-1抗體的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn),所述分離的STOP-1多肽可利用重組DNA技術(shù)自分離的編碼STOP-1多肽的核酸制備;FACS分析等)??蛇x,或此外,可測(cè)定所述細(xì)胞中編碼STOP-1多肽的核酸或mRNA,例如,經(jīng)由利用對(duì)應(yīng)STOP-1編碼核酸或其互補(bǔ)物的、基于核酸的探針進(jìn)行的熒光原位雜交;(FISH;見WO98/45479,公開于1998年10月),Southern印跡,Northern印跡,或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),諸如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)??赏ㄟ^(guò)測(cè)定生物液體諸如血清中脫落的抗原研究STOP-1多肽過(guò)表達(dá),例如,利用基于抗體的實(shí)驗(yàn)(也見,例如,U.S專利4,933,294,1990年6月12日授權(quán);WO91/05264,1991年4月18日公開;U.S專利5,401,638,1995年3月28日授權(quán);和Sias et al.,J.Immunol.Methods13273-80(1990))。除了上述實(shí)驗(yàn),各種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)于熟練操作者是可得的。例如,可將哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞暴露于抗體,所述抗體可選用可檢測(cè)抗體標(biāo)記,例如,放射性同位素,并可例如通過(guò)外部掃描放射活性或分析得自以前暴露于所述抗體的哺乳動(dòng)物的活檢樣品來(lái)評(píng)估所述抗體與該哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞的結(jié)合。
      本文術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指可檢測(cè)的化合物或組合物,其與所述多肽、抗體、拮抗劑或組合物直接或間接偶聯(lián),使得產(chǎn)生“標(biāo)記的”多肽、抗體、拮抗劑或組合物。所述標(biāo)記自身是可檢測(cè)的(例如放射同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)或,對(duì)于酶標(biāo)記,可催化可檢測(cè)底物化合物或組合物的化學(xué)改變。
      本文術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞毒藥劑″指抑制或防止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射活性同位素(例如,At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32和Lu的放射活性同位素),化療劑例如氨甲蝶呤,阿霉素,長(zhǎng)春花堿(長(zhǎng)春新堿,長(zhǎng)春堿,依托泊苷),多柔比星,美法侖,絲裂霉素C,苯丁酸氮芥,柔紅霉素或其它嵌入劑,酶及其片段諸如核酸分解酶,抗生素,和毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或酶活性毒素,包括其片段和/或變體,以及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌藥劑。其它細(xì)胞毒藥劑在下文描述。殺腫瘤藥劑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的破壞。
      “化療制劑”是在癌的治療中使用的化學(xué)化合物?;熤苿?shí)例包括烷化劑,如噻替哌(thiotepa)和CYTOXANTM環(huán)磷酰胺(cyclosphamide);烷基磺酸酯如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶如芐替哌(bezodepa),卡波醌(carboquone),美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);氮丙啶(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine),三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine),三亞乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide),三亞乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine);多聚乙酰(acetogenins)(具體是bullatacin和bullatacinone);喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin),卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物);cryptophycins(具體是cryptophycin 1和cryptophycin 8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物,KW-2189和CB1-TM1);eleutherobin;pancratistatin;sarcodictyin;spongistatin;氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥,萘氮芥,膽磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),異環(huán)磷酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine),鹽酸氧氮芥;美法侖,新氮芥(novembichin),膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine),松龍苯芥(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide),尿嘧啶氮芥;亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin),福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);抗生素諸如enediyne抗生素(例如刺孢霉素(calicheamicin),具體是刺孢霉素γ1和刺孢霉素ω1(見,例如,Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33183-186(1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin),包括蒽環(huán)類抗生素A;二膦酸鹽(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate);esperamicin;以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團(tuán)和相關(guān)色素蛋白enediyne抗生素生色團(tuán)),aclacinomysins,放射菌素(actinomycin),authramycin,氮絲氨酸(azaserine),博萊霉素(bleomycin),放線菌素C(cactinomycin),carabicin,去甲柔紅霉素(carminomycin),嗜癌霉素(carzinophilin),chromomycinis,更生霉素(dactinomycin),柔紅霉素,地托比星(detorubicin),6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸,ADRIAMYCIN_多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代-多柔比星,氰基嗎啉代-多柔比星,2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊達(dá)比星(idarubicin),發(fā)波霉素(marcellomycin),絲裂霉素諸如絲裂霉素C,霉酚酸,諾加霉素(nogalamycin),橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin),potfiromycin,嘌呤霉素,三鐵阿霉素(quelamycin),羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素;鏈脲霉素(streptozocin),殺結(jié)核菌素,烏苯美司(ubenimex),凈司他丁(zinostatin),佐柔比星(zorubicin);抗代謝藥如氨甲蝶呤,5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin),氨甲蝶呤,丁蝶翼素(pteropterin),三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物例如氟達(dá)拉濱(fludarabine),6-巰基嘌呤,硫咪嘌呤,硫鳥嘌呤;嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-氮尿苷,卡莫氟(carmofur),阿糖胞苷,雙脫氧尿苷,去氧氟尿苷(doxifluridine),依諾他濱(enocitabine),氟尿苷;雄激素類如卡普睪酮(calusterone),丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate),環(huán)硫雄醇(epitiostanol),美雄氨(mepitiostane),睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide),鄰氯苯對(duì)氯苯二氯乙烷(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑如frolinic acid;醋葡內(nèi)酯;醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);defofamine;秋水仙胺;地吖醌(diaziquone);elfornithine;elliptinium acetate;epothilone;依托格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥基脲;香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登素類(maytansinoids)諸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(mopidanmol);nitraerine;噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼樹酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK_多糖復(fù)合體(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌;2,2′,2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);單端孢霉烯(trichothecene)(具體是T-2毒素,verracurin A,桿孢菌素(roridin)A和anguidine);烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春堿酰胺;達(dá)卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥;二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);溴丙哌嗪(pipobroman);gacytosine;阿拉伯糖苷(“Ara-C”);環(huán)磷酰胺;三胺硫磷(thiotepa);紫杉烷(taxoid),如TAXOL_紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,NJ),ABRAXANETM無(wú)克列莫佛(Cremophor-free),紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒配制劑(albumin-engineered nanoparticleformulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois),和TAXOTERE_doxetaxel(Rh_ne-Poulenc Rorer,Antony,F(xiàn)rance);chloranbucil;GEMZAR_吉西他濱(gemcitabine);6-硫代鳥嘌呤;巰基嘌呤;氨甲蝶呤;鉑類似物如順鉑和卡鉑;長(zhǎng)春花堿;鉑;鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺;米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng)春新堿;NAVELBINE_長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine);novantrone;替尼泊甙(teniposide);依達(dá)曲沙(edatrexate);柔紅霉素;氨基蝶呤;xeloda;伊拜膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);維甲酸類(retinoids)諸如維甲酸;capecitabine;以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽,酸或衍生物。
      此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素制劑,如抗雌激素制劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)物(SERM),包括,例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX_他莫昔芬),雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬(droloxifene),4-羥基他莫昔芬,曲沃昔芬(trioxfene),keoxifene,LY117018,奧那司酮(onapristone),和FARESTON·托瑞米芬(FARESTON·toremifene);抑制芳香酶的芳香酶抑制物,該酶調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素生成,諸如,例如4(5)-咪唑,氨魯米特(aminoglutethimide),MEGASE_醋酸甲地孕酮(megestrol acetate),AROMASIN_依西美坦(exemestane),formestanie,法倔唑(fadrozole),RIVISOR_伏氯唑(vorozole),F(xiàn)EMARA_來(lái)曲唑(letrozole),和ARIMIDEX_阿那曲唑(anastrozole);和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide),尼魯米特(nilutamide),比卡魯胺(bicalutamide),亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊烷核苷胞嘧啶類似物);反義寡核苷酸,具體是抑制異常細(xì)胞增生所涉及的信號(hào)途徑中的基因表達(dá)的那些反義寡核苷酸,諸如,例如,PKC-α,Ralf和H-Ras;核酶諸如VEGF表達(dá)抑制劑(例如,ANGIOZYME_核酶)和HER2表達(dá)抑制劑;疫苗諸如基因治療疫苗,例如,ALLOVECTIN_疫苗,LEUVECTIN_疫苗,和VAXID_疫苗;PROLEUKIN_rIL-2;LURTOTECAN_拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制物;ABARELIX_rmRH;和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。
      本文所用″生長(zhǎng)抑制劑″,是指在體外或體內(nèi)抑制細(xì)胞特別是表達(dá)STOP-1的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此,生長(zhǎng)抑制劑是顯著降低S期的STOP-1-表達(dá)型細(xì)胞百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程的試劑(在S期之外的環(huán)節(jié)),譬如,誘導(dǎo)G1期停滯和M-期停滯的試劑。傳統(tǒng)的M-期阻斷劑包括長(zhǎng)春花堿(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)、紫杉烷(taxane)和拓?fù)涿窱I抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊苷和博萊霉素。那些使G1期停滯的試劑也涉及S-期停滯,例如,DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。進(jìn)一步的信息可在下列文獻(xiàn)中找到The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel編輯,第一章,題目為″Cell cycle regulation,oncogens,and antineoplastic drugs″by Murakami等(WB SaundersPhiladelphia,1995),特別是第13頁(yè)。紫杉烷(taxanes)、紫杉醇(paclitaxel)和紫杉萜(docetaxel)都是來(lái)自紫杉的抗癌藥物。紫杉萜(TAXOTERE_,Rhone-Poulenc Rorer),來(lái)自歐洲紫杉,是紫杉醇(TAXOL_,Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。紫杉醇和紫杉萜促進(jìn)微管自微管蛋白二聚體的聚集,并通過(guò)防止去聚合化來(lái)穩(wěn)定微管,所述去聚合化導(dǎo)致細(xì)胞中的有絲分裂被抑制。
      ″阿霉素″是蒽環(huán)霉素類抗生素。阿霉素的化學(xué)全名為(8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-α-L-來(lái)蘇-吡喃糖苷基)氧代]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥-8-(羥乙酰)-甲氧基-5,12-naphthacenedine。
      所用的術(shù)語(yǔ)“包裝插頁(yè)”是指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中,含有與這些治療產(chǎn)品的使用有關(guān)的適應(yīng)癥,用法,劑量,給藥,禁忌和/或警示等的信息的說(shuō)明書。
      表1<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/***C-C從12增加到15*Z是EQ均值*B是ND的均值*match with stop is_M;stop-stop=0;J(joker)match=0*/#define_M-8/*value of a match with a stop*/int_day[26][26]={/* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*//*A*/ {2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0,_M,1,0,-2,1,1,0,0,-6,0,-3,0},/*B*/ {0,3,-4,3,2,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1},/*C*/ {2,_4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5},/*D*/ {0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2,0,0,-4,-3,2,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2},/*E*/ {0,2,-5,3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3},/*F*/ {-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2,1,0,-5,2,0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5},/*G*/ {1,0,-3,1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0,_M,-1,-1,-3,1,0,0,-1,-7,0,-5,0},/*H*/ {1,1,-3,1,1,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2,2,_M,0,3,2,-1,-1,0,-2,-3,0,0,2},/*I*/ {1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2,5,0,-2,2,2,-2,_M,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2},/*J*/ {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},/*K*/ {1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1,_M,-1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0},/*L*/ {2,-3,-6,_4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2},/*M*/ {1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4,6,-2,_M,-2,-1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1},/*N*/ {0,2,-4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2,2,_M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1},/*O*/ {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M},/*P*/ {1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-1,_M,6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0},/*Q*/ {0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M,0,4,1,-1,-1,0,-2,-5,0,-4,3},/*R*/ {2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,-3,0,0,_M,0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4,0},/*S*/ {1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M,1,-1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0},/*T*/ {1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0,_M,0,-1,-1,1,3,0,0,-5,0,-3,0},/*U*/ {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},/*V*/ {0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-1,-2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2},/*W*/ {-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6},/*X*/ {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},/*Y*/ {3,-3,0-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-1,-2-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4},/*Z*/ {0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,-1,1,_M,0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4}};/**/#include<stdio.h>#include<ctype.h>#define MAXJMP 16/*maxjumps in a diag*/#define MAXGAP 24/*don′t continue to penalize gaps larger than this*/#define JMPS 1024/*max jmps in an path*/#define MX 4/*save if there′s at least MX-1 bases since last jmp*/#define DMAT 3/*value of matching bases*/#define DMIS 0/*penalty for mismatched bases*/#define DINS0 8/*penalty for a gap*/#define DINS1 1/*penalty per base*/#define PINS0 8/*penalty for a gap*/#define PINS14 /*penalty per residue*/structjmp{ shortn[MAXJMP];/*size of jmp(neg for dely)*/ unsigned short x[MAXJMP];/*base no.of jmp in seq x*/}; /*limits seqto 2^16-1*/struct diag{ int score;/*score at last jmp*/ long offset;/*offset of prev block*/ shortijmp;/*currentjmp index*/ structjmp jp;/*list of jmps*/};struct path{ int spc;/*number of leading spaces*/ short n[JMPS];/*size of jmp(gap)*/ int x[JMPS];/*loc of jmp(last elem before gap)*/};char*ofile;/*output file name*/char*namex[2];/*seq namesgetseqs()*/char*prog;/*prog name for err msgs*/char*seqx[2];/*seqsgetseqs()*/int dmax;/*bestdiagnw()*/int dmax0;/*final diag*/int dna;/*set if dnamain()*/int endgaps;/*set if penalixing end gaps*/iht gapx,gapy;/*total gaps in seqs*/iht len0,len1;/*seqlens*/int ngapx,ngapy;/*total size of gaps*/int smax;/*max scorenw()*/int *xbm;/*bitmap for matching*/longoffset;/*current offset in jmp file*/struct diag*dx;/*holds diagonals*/struct pathpp[2];/*holds path for seqs*/char*calloc(),*malloc(),*index(),*strcpy();char*getseq(),*g_calloc();/*Needleman-Wunsch alignment program * *usageprogs filel file2 *where filel and file2 are two dna or two protein sequences. *The sequences can be in upper-or lower-case an may contain ambiguity *Any lines beginning with′;′,′>′or′<′are ignored *Max file length is 65535(limited by unsigned short x in thejmp struct) *A sequence with 1/3 or more ofits elements ACGTU is assumed to be DNA *Output is in the file″align.out″ * *The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback. *Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */#include″nw.h″#include″day.h″static _dbval[26]={1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0};static _pbval[26]={1,2|(1<<(′D′-′A′))|(1<<(′N′-′A′)),4,8,16,32,64,128,256,0xFFFFFFF,1<<10,1<<11,1<<12,1<<13,1<<14,1<<15,1<<16,1<<17,1<<18,1<<19,1<<20,1<<21,1<<22,1<<23,1<<24,1<<25|(1<<(′E′-′A′))|(1<<(′Q-′A′))};main(ac,av)mainint ac;char*av<paragraph id="d252"></paragraph>{prog=av
      ;if(ac!=3){fprintf(stderr,″usage%s file1 file2\n″,prog);fprintf(stderr,″where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″);fprintf(stderr,″The sequences can be in upper-or lower-case\n″);fprintf(stderr,″Any lines beginning with′;′or′<′are ignored\n″);fprintf(stderr,″Output is in the file\″align.out\″\n″);exit(1);}namex
      =av[1];namex
      =av[2];seqx
      =getseq(namex
      ,&amp;len0);seqx[1]=getseq(namex[1],&amp;len1);xbm=(dna)?_dbval_pbval;endgaps=0;/*1 to penalize endgaps*/ofile=″align.out″;/*output file*/nw(); /*fill in the matrix,get the possible jmps*/readjmps();/*get the actual jmps*/print(); /*print stats,alignment*/cleanup(0);/*unlink any tmp files*/}/*do the alignment,retum best scoremain() *dnavalues in Fitch and Smith,PNAS,80,1382-1386,1983 *proPAM 250 values *When scores are equal,we prefer mismatches to any gap,prefer *a new gap to extending an ongoing gap,and prefer a gap in seqx *to a gap in seq y */nw()nw{char*px,*Py;/*seqs and ptrs*/int *ndely,*dely;/*keep track ofdely*/int ndelx,delx;/*keep track of delx*/int *tmp; /*for swapping row0,row1*/int mis;/*score for each type*/int ins0,ins1; /*insertion penalties*/register id;/*diagonal index*/register ij;/*jmpindex*/register *col0,*col1;/*score for curr,last row*/register xx,yy; /*index into seqs*/dx=(struct diag*)g_calloc(″to get diags″,len0+len1+1,sizeof(structdiag));ndely=(int*)g_calloc(″to get ndely″,len1+1,sizeof(int);dely=(int*)g_calloc(″to get dely″,len1+1,sizeof(int));col0=(int*)g_calloc(″to get col0″,len1+1,sizeof(int));col1=(int*)g_calloc(″to get col1″,len1+1,sizeof(int));ins0=(dna)?DINS0PINS0;ins1=(dn)?DINS1PINS1;smax=-10000;if(endgaps){for(col0
      =dely
      =-ins0,yy=1;yy<=len1;yy++{col0[yy]=dely[yy]=col0[yy-1]-ins1;ndely[yy]=y(tǒng)y;}col0
      =0;/*Waterman Bull Math Biol 84*/}elsefor(yy=1;yy<=len1;yy++) dely[yy]=-ins0;/*fill in match matrix*/for(px=seqx
      ,xx=1;xx<=len0;px++,xx++){/*initialize first entry in col */if(endgaps){if(xx=1) col1
      =delx=-(ins0+ins1);else col1
      =delx=col0
      -ins1;ndelx=xx;}else{ col1
      =0; delx=-ins0; ndelx=0;} ...nwfor(py=seqx[1],yy=1;yy<=len1;py++,yy++){mis=col0[yy-1];if(dna) mis+=(xbm[*px-′A′]&amp;xbm[*py-′A′])?DMATDMIS;else mis+=_day[*px-′A′][*py-′A′];/*update penalty for del in x seq; *favor new del over ongong del *ignore MAXGAP if weighting endgaps*/if(endgaps‖ndely[yy]<MAXGAP){if(col0[yy]-ins0>=dely[yy]){dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);ndely[yy]=1;}else{dely[yy]=ins1;ndely[yy]++;}}else{ if(col0[yy]-(ins0+ins1)>=dely[yy]){dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);ndely[yy]=1; }elsendely[yy]++; }/*update penalty for del in y seq; *favor new del over ongong del */if(endgaps‖ndelx<MAXGAP){if(col1[yy-1]-ins0>=delx){delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1);ndelx=1;}else{delx-=ins1;ndelx++;}}else{if(coll[yy-1]-(ins0+ins1)>=delx){ delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1); ndelx=1; }else ndelx++;}/*pick the maximum score;we′re favoring *mis over any del and delx over dely */ ...nwid=xx-yy+len1-1;if(mis>=delx&amp;&amp;mis>=dely[yy]) col1[yy]=mis;else if(delx>=dely[yy]){ col1[yy]=delx; ij=dx[id].ijmp; if(dx[id].jp.n
      &amp;&amp;(!dna‖(ndelx>=MAXJMP &amp;&amp;xx>dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis>dx[id].score+DINS0)){dx[id].ijmp++;if(++ij>=MAXJMP){ writejmps(id); ij=dx[id].ijmp=0; dx[id].offset=offset; offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset);}}dx[id]jp.n[ij]=ndelx;dx[id].jp.x[ij]=xx; dx[id].score=delx;}else{col1[yy]=dely[yy];ij=dx[id].ijmp;if(dx[id]jp.n
      &amp;&amp;(!dna‖(ndely[yy]>=MAXJMP &amp;&amp;xx>dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis>dx[id].score+DINS0)){dx[id].ijmp++;if(++ij>=MAXJMP){ writejmps(id); ij=dx[id].ijmp=0; dx[id].offset=offset; offset+=sizeof(structjmp)+sizeof(offset); } } dx[id]jp.n[ij]=-ndely[yy]; dx[id]jp.x[ij]=xx; dx[id].score=dely[yy];}if(xx=len0 &amp;&amp; yy<len1){ /*lastcol*/if(endgaps) col1[yy]=ins0+ins1*(len1-yy);if(col1[yy]>smax){ smax=col1[yy]; dmax=id;} }}if(endgaps &amp;&amp; xx<len0) col1[yy-1]=ins0+ins1*(len0-xx);if(col1[yy-1]>smax){ smax=col1[yy-1]; dmax=id;}tmp=col0;col0=col1;col1=tmp; } (void)free(char*)ndely); (void)free((char*)dely); (void)free(char*)col0);(void)free((char*)col1); }/* * *print()-only routine visible outside this module * *static *getmat()-trace back best path,count matchesprint() *pr_align()-print alignment of described in array p<paragraph id="d253"></paragraph>print() *dunpblock()-dump a block of lines with numbers,starspr_align() *nums()-put out a number linedumpblock() *putline()-put out a line(name,[num],seq,[num])dumpblock() *stars()--put a line of starsdumpblock() *stripname()-strip any path and prefix from a sepname */#include″nw.h″#define SPC 3#define P_LINE 256/*maximum output line*/#define P_SPC 3 /*space between name or num and seq*/extern _day[26][26];int olen; /*set output line length*/FILE *fx/*output file*/print() print{ int lx,ly,firstgap,lastgap;/*overlap*/ if((fx=fopen(ofile,″w″))=0){ fprintf(stderr,″%scan′t write%s\n″,prog,ofile); cleanup(1);}fprintf(fx,″<first sequence%s (length=%d)\n″,namex
      ,len0);fprintf(fx,″<second sequence%s(length=%d)\n″,namex[1],len1);olen=60;lx=len0;ly=len1;firstgap=lastgap=0;if(dmax<len1-1){/*leading gap inx*/ pp
      .spc=firstgap=len1-dmax-1;ly=pp
      .spc;}else if(dmax>len1-1){/*leading gap iny*/ pp[1].spc=firstgap=dmax-(len1-1); lx=pp[1].spc;}if(dmax0<len0-1){/*trailing gap in x */lastgap=len0-dmax0-1;lx=lastgap;}else if(dmax0>len0-1){/*trailing gap in y*/lastgap=dmax0-(len0-1);ly=1astgap;}getmat(lx,ly,firstgap,lastgap);pr_align();}/* *trace back the best path,count matches */staticgetmat(lx,ly,firstgap,lastgap) getmat int lx,ly; /*″core″(minus endgaps)*/ int firstgap,lastgap;/*leading trailing overlap*/{ int nm,i0,i1,siz0,siz1; char outx[32]; double pct; register n0,n1;register char *p0,*p1;/*get total matches,score */i0=i1=siz0=siz1=0;p0=seqx
      +pp[1].spc;p1=seqx[1]+pp
      .spc;n0=pp[1].spc+1;n1=pp
      .spc+1;nm=0;while(*p0&amp;&amp;*p1){ if(siz0){p1++;n1++;siz0-;}else if(siz1){p0++;n0++;siz1-;}else{if(xbm[*p0-′A′]&amp;xbm[*p1-′A′]) nm++;if(n0++=pp
      .x[i0]) siz0=pp
      .n[i0++];if(n1++=pp[1].x[i1])siz1=pp[1].n[i1++]; p0++; p1++;}}/*pct homology * if penalizing endgaps,base is the shorter seq *else,knock off overhangs and take shorter core */if(endgaps)lx=(len0<len1)?len0len1;elselx=(lx<ly)?lxly;pct=100.*(double)nm/(double)lx;fprintf(fx,″\n″);fprintf(fx″<%d match%s in an overlap of%d%.2f percent similarity\n″,nm,(nm=1)?″″″e(cuò)s″,lx,pct);fprintf(fx,″<gaps in first sequence%d″,gapx);...getmatif(gapx){(void)sprintf(outx,″(%d%s%s)″, ngapx,(dna)?″base″″residue″,(ngapx=1)?″″″s″);fprintf(fx″%s″,outx);fprintf(fx,″,gaps in second sequence%d″,gapy);if(gapy){(void)sprintf(outx,″(%d%s%s)″,ngapy,(dna)?″base″″residue″,(ngapy=1)?″″″s″);fprintf(fx,″%s″,outx);}if(dna) fprintf(fx, ″\n<score%d(match=%d,mismatch=%d,gap penalty=%d+%d per base)\n″, smax,DMAT,DMIS,DINS0,DINS1);else fprintf(fx, ″\n<score%d(Dayhoff PAM 250matrix,gap penalty=%d+d per residue)\n″, smax,PINS0,PINS1);if(endgaps) fprintf(fx, ″<endgaps penalized,left endgap%d%s%s,right endgap%d%s%s \n″, firstgap,(dna)?″base″″residue″,(firstgap=1)?″″″s″, lastgap,(dna)?″base″″residue″,(lastgap=1)?″″″s″);else fprintf(fx,″<endgaps not penalized\n″);} static nm; /*matches in core-for checking*/ static lmax/*lengths of stripped file names*/ static ij[2]; /*jmp index for a path*/ static nc[2]; /*number at start of current line*/ static ni[2]; /*current elem number-for gapping*/ static siz[2]; static char *ps[2]; /*ptr to current element*/ static char *po[2]; /*ptr to next output char slot*/static char out[2][P_LINE];/*output line*/static char star[P_LINE]; /*set by stars()*//* *print alignment of described in struct path pp<paragraph id="d254"></paragraph> */staticpr_align() pr_align{intnn;/*char count*/intmore;register i;for(i=0,lmax=0;i<2;i++){nn=stripname(namex[i]);if(nn>lmax)lmax=nn;nc[i]=1;ni[i]=1;siz[i]=ij[i]=0;ps[i]=seqx[i]; po[i]=out[i]; }for(nn=nm=0,more=1;more;){ ...pr_align for(i=more=0;i<2;i++){ /* *do we have more of this sequence? */if(!*ps[i]) continue;more++;if(pp[i].spc){/*leading space*/ *po[i]++=″; pp[i].spc-;}else if(six[i]){/*in a gap*/ *po[i]++=′-′; siz[i]-;}else{ /*we′re putting a seq element */*po[i]=*ps[i];if(islower(*ps[i])) *ps[i]=toupper(*ps[i]);po[i]++;ps[i]++;/* *are we at next gap for this seq? */if(ni[i]=pp[i].x[ij[i]]){ /**we need to merge all gaps*at this location*/siz[i]=pp[i].n[ij[i]++];while(ni[i]=pp[i].x[ij[i]])siz[i]+=pp[i].n[ij[i]++]; } ni[i]++;} } if(++nn=olen‖!more&amp;&amp;nn){ dumpblock(); for(i=0;i<2;i++) po[i]=out[i]; nn=0; } }}/* *dump a block of lines,including numbers,starspr_align() */staticdumpblock() dumpblock{ registr i; for(i=0;i<2;i++)*po[i]-=\0′;...dumpblock(void)putc(′\n′,fx); for(i=0;i<2;i++){if(*out[i]&amp;&amp;(*out[i]?。健濉?(po[i])!=″)){if(i=0)nums(i);if(i=0 &amp;&amp; *out[1])stars();putline(i);if(i=0 &amp;&amp; * out[1])fprintf(fx,star);i(i=1) nums(i);} }}/* *put out a nmnber linedumpblock() */staticncums(ix) nums int ix;/*index in out<paragraph id="d255"></paragraph>holding seq line*/{char nline[P_LINE];register i,j;register char *pn,*px,*py;for(pn=nline,i=0;i<lmax+P_SPC;i++,pn++)*pn=″;for(i=nc[ix],py=out[ix];*py;py++,pn++){ if(*py=″‖*py=′-′) *pn=″; else{ if(i%10=0‖(i=1 &amp;&amp; nc[ix]?。?)){ j=(i<0)?-ii; for(px=pn;j;j/=10,px-) *px=j(luò)%10+′0′; if(i<0) *px=′-′;}else *pn=″; i++;}}*pn=′\0′;nc[ix]=i;for(pn=nline;*pn;pn++)(void)putc(*pn,fx);(void)putc(′\n′,fx);}/* *put out a line(name,[num],seq,[num])dumpblock() */staticputline(ix) putline int ix; { ...putlineinti;register char *px;for(px=namex[ix],i=0;*px &amp;&amp; *px?。健洹?;px++,i++) (void)putc(*px,fx);for(;i<lmax+P_SPC;i++) (void)putc(″,fx); /*these count from 1*ni<paragraph id="d256"></paragraph>is curremt element(from 1)*nc<paragraph id="d257"></paragraph>is number at start of current line*/ for(px=out[ix];*px;px++)(void)putc(*px&amp;0x7F,fx); (void)putc(′\n′,fx);}/* *ut a line of stars(seqs always in out
      ,out[1])dumpblock() */staticstars() stars{int i;register char *p0,*p1,cx,*px;if(!*out
      ‖(out
      =″&amp;&amp;*(po
      )=″)‖ !*out[1]‖(*out[1]=″&amp;&amp;*(po[1])=″)) return;px=star;for(i=lmax+P_SPC;i;i-)*px++=″;for(p0=out
      ,p1=out[1];*p0 &amp;&amp; *p1;p0++,p1++){if(isalpha(*p0)&amp;&amp; isalpha(*p1)){if(xbm[*p0-′A′]&amp;xbm[*p1-′A′]){cx=′*′nm++;}else if(!dna &amp;&amp;_day[*p0-′A′][*p1-′A′]>0)cx=′.′;elsecx=″;}elsecx=″;*px++=cx; } *px++=′\n′; *px=′\0′;}/* *strip path or prefix from pn,return lenpr_align() */staticstripname(pn) stripname char*pn; /*file name(may be path)*/{ register char *px,*py; py=0; for (px=pn;*px;px++) if(*px=′/′) py=px+1;if(py) (void)strcpy(pn,py);return(strlen(pn));} /* *cleanup()-cleanup any tmp file *getseq()-read in seq,set dna,len,maxlen *g_calloc()-calloc()with error checkin *readjmps()-get the good jmps,from tmp file if necessary *writejmps()-write a filled array of jmps to a tmp filenw() */#include″nw.h″#include<sys/file.h>char *jname=″/tmp/homgXXXXXX″;/*tmp file forjmps*/FILE *fj;int cleanup();/*cleanup tmp file*/longlseek();/* *remove any tmp file if we blow */cleanup(i) cleanupint i;{if(fj) (void)unlink(jname);exit(i); } /* *read,return ptr to seq,set dna,len,maxlen *skip lines starting with′;′,′′ *seq in upper or lower case */ char * getseq(file,len) getseq char *file;/*file name*/int*len; /*seq len*/{char line ,*pseq;register char *px,*py;int natgc,tlen;FILE *fp;if((fp=fopen(file,″r″))=0){fprintf(stderr,″%scan′t read %s\n″,prog,file;exit(1);}tlen=natgc=0;while(fgets(line,1024,fp)){ if(*line=′;′‖*line=′′) continue; for(px=line;*px ?。健鋅n′;px++) if(isupper(*px)‖islower(*px)) tlen++;}if(pseq=malloc((unsigned)(tlen+6)))=0){fprintf(stderr,″%smalloc()failed to get %d bytes for %s\n″,prog,tlen+6,file);exit(1);}pseq
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      .n[i0]=siz;pp
      .x[i0]=xx;gapx++;ngapx+=siz;/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/siz=(siz<MAXGAP‖endgaps)?sizMAXGAP;i0++; } } else break;}/*reverse the order of jmps */ for(j=0,i0-;j<i0;j++,i0-){ i=pp
      .n[j];pp
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      表2STOP-1XXXXXXXXXXXXXXX(長(zhǎng)度=15個(gè)氨基酸)比對(duì)蛋白(Comparison Protein)XXXXXYYYYYYY(長(zhǎng)度=12個(gè)氨基酸)%氨基酸序列同一性=(ALIGN-2確定的兩個(gè)多肽序列之間相同匹配的(identically matching)氨基酸殘基數(shù))÷(STOP-1多肽的氨基酸殘基總數(shù))=5÷15=33.3%表3STOP-1 XXXXXXXXXX(長(zhǎng)度=10個(gè)氨基酸)比對(duì)蛋白XXXXXYYYYYYZZYZ(長(zhǎng)度=15個(gè)氨基酸)%氨基酸序列同一性=(ALIGN-2確定的兩個(gè)多肽序列之間相同匹配的氨基酸殘基數(shù))÷(STOP-1多肽的氨基酸殘基總數(shù))=5÷10=50%表4STOP-1-DNA NNNNNNNNNNNNNN(長(zhǎng)度=14個(gè)核苷酸)比對(duì)DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (長(zhǎng)度=16個(gè)核苷酸)%核酸序列同一性=(ALIGN-2確定的兩個(gè)核酸序列之間相同匹配的核苷酸數(shù))÷(PRO-DNA核酸序列的核苷酸總數(shù))=6÷14=429%表5STOP-1-DNA NNNNN NNNNN NN(長(zhǎng)度=12個(gè)核苷酸)
      比對(duì)DNA NNNN LLLVV (長(zhǎng)度=9個(gè)核苷酸)%核酸序列同一性=(ALIGN-2確定的兩個(gè)核酸序列之間相同匹配的核苷酸數(shù))÷(PRO-DNA核酸序列的核苷酸總數(shù))=4÷12=33.3%本發(fā)明組合物和方法STOP-1多肽變體除了本文所述的全長(zhǎng)天然序列的STOP-1多肽,還可以制備STOP-1多肽變體。可通過(guò)將合適的核苷酸變化引入STOP-1DNA,和/或通過(guò)合成所需的STOP-1多肽來(lái)制備STOP-1多肽變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解,氨基酸變化會(huì)改變STOP-1多肽的翻譯后加工過(guò)程,如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置,或改變膜的錨定性質(zhì)。
      使天然全長(zhǎng)序列的STOP-1多肽或本文所述的STOP-1多肽的多個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生變異,可以例如,使用如美國(guó)專利5,364,934所記載的進(jìn)行保守和非保守突變的任何技術(shù)和指南。所述變異可以是編碼STOP-1多肽的一或多個(gè)密碼子的取代、缺失或插入,其導(dǎo)致STOP-1多肽與天然序列的STOP-1多肽相比在氨基酸序列上的改變。該變異任選通過(guò)用任何其他氨基酸取代所述STOP-1多肽一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸。據(jù)發(fā)現(xiàn),通過(guò)比較STOP-1多肽和同源的已知蛋白質(zhì)分子的序列,并使在高同源性區(qū)域變化的氨基酸序列數(shù)最少,可指導(dǎo)確定插入、取代或缺失哪個(gè)氨基酸殘基而不負(fù)面影響所需活性。氨基酸取代可以是將一個(gè)氨基酸取代為其他具有類似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸(如用絲氨酸取代亮氨酸),即保守氨基酸取代的結(jié)果。插入或缺失可任選在約1到5個(gè)氨基酸的范圍??赏ㄟ^(guò)在序列中系統(tǒng)地插入、缺失或取代氨基酸來(lái)確定可允許的變異,并測(cè)試所得變體的由全長(zhǎng)或成熟的天然序列表現(xiàn)出的活性。
      具體實(shí)施方案中,感興趣的保守取代見表6標(biāo)題“優(yōu)選取代”下所示。如果所述取代導(dǎo)致生物活性改變,那么會(huì)引入更多的實(shí)質(zhì)性改變并篩選出產(chǎn)物,所需實(shí)質(zhì)性改變?cè)诒?中列為舉例取代,或如下面參考氨基酸分類進(jìn)一步描述的突變。
      表6

      對(duì)STOP-1多肽的功能或免疫特性的基本修飾是通過(guò)選擇取代來(lái)實(shí)現(xiàn)的,所述取代在它們保持如下的效應(yīng)上顯著不同(a)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu),例如,作為折疊或螺旋構(gòu)象,(b)靶位分子的電荷或疏水性,或(c)側(cè)鏈的大小。天然出現(xiàn)的殘基根據(jù)共同的側(cè)鏈性質(zhì)被分為幾組(1)疏水性正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile;(2)中性親水性cys,ser,thr;
      (3)酸性asp,glu;(4)堿性asn,gln,his,lys,arg;(5)影響鏈的走向的殘基gly,pro;及(6)芳香族trp,tyr,phe。
      非保守取代會(huì)著重將這些分類之一的成員取代為另一分類的成員。這些被取代的殘基也能夠被引入保守取代位點(diǎn)或,更優(yōu)選,引入到剩余的(非保守)位點(diǎn)。
      可用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行所述變異,所述方法如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變,丙氨酸掃描,及PCR誘變。可在被克隆的DNA上進(jìn)行定點(diǎn)誘變[Carter等,Nucl.Acids Res.,134331(1986);Zoller等,Nucl.Acids Res.,106487(1987)]、盒式誘變[Wells等,Gene,34315(1985)]、限制性選擇誘變[Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317415(1986)]或用其他已知技術(shù)來(lái)制備STOP-1變體DNA。
      掃描式氨基酸分析也可用來(lái)沿毗鄰序列鑒定一或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的掃描用氨基酸(scanning amino acid)是相對(duì)小的中性氨基酸。這些氨基酸包括丙氨酸,甘氨酸,絲氨酸和半胱氨酸。其中,丙氨酸通常是優(yōu)選的掃描用氨基酸,因?yàn)樗?碳以外沒有側(cè)鏈,并且不太可能改變變體的主鏈構(gòu)象[Cunningham and Wells,Science,2441081-1085(1989)]。通常丙氨酸也是優(yōu)選的,因?yàn)樗亲畛R姷陌被帷A硗?,通常丙氨酸既在隱蔽位置也在暴露位置被發(fā)現(xiàn)[Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman &amp; Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,1501(1976)]。如果丙氨酸取代不產(chǎn)生足夠量的變體,可使用等構(gòu)(isoteric)氨基酸。
      對(duì)STOP-1多肽的修飾本發(fā)明范圍包括對(duì)STOP-1多肽的共價(jià)修飾。一種共價(jià)修飾包括使STOP-1多肽的靶向氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑(derivatizing agent)反應(yīng),該有機(jī)衍生劑能夠與STOP-1多肽的被選側(cè)鏈或N-或C-末端殘基發(fā)生反應(yīng)。用雙功能劑進(jìn)行衍生,例如,可用于使STOP-1多肽與不溶于水的支持基質(zhì)或表面交聯(lián),以用于抗STOP-1的抗體的純化方法,并反之亦然。常用的交聯(lián)劑包括,例如,1,1-雙(重氮-乙?;?-2-苯乙烷,戊二醛,N-羥基琥珀酰亞胺酯,例如,與4-重氮水楊酸形成的酯,同基雙功能(homobifunctional)亞氨酸酯,包括雙琥珀酰亞胺酯如3,3′-二硫雙(琥珀酰亞胺丙酸酯),雙功能馬來(lái)酰亞胺如雙-N-馬來(lái)酰亞胺-1,8-辛烷和制劑如甲基-3-[(p-重氮苯基)二硫]propioimidate(methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidate )。
      其他修飾包括,谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?;鶜埢謩e脫酰胺為谷氨?;吞於滨;鶜埢?,脯氨酸和賴氨酸的羥基化,絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基基團(tuán)的磷酸化,賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基基團(tuán)的甲基化[T.E.CreightonProteinStructure and Molecular PropertiesW.H.Freeman&amp; Co.,San Francisco,pp.79-86(1983),N-末端胺的乙?;?,和任何C-末端羧基基團(tuán)的酰胺化。
      在本發(fā)明范圍內(nèi)包括的對(duì)STOP-1多肽的另一種類的共價(jià)修飾包括改變多肽的天然糖基化模式?!案淖兲烊惶腔J健痹谶@里指缺失在天然序列的STOP-1多肽中發(fā)現(xiàn)的一或多個(gè)碳水化合物部分(moiety)(通過(guò)化學(xué)和/或酶手段或者去除潛在的(underlying)糖基化位點(diǎn),或使糖基化缺失),和/或添加一或多個(gè)在天然序列的STOP-1多肽中不存在的糖基化位點(diǎn)。另外,此術(shù)語(yǔ)包括在天然蛋白的糖基化中的定性改變,其涉及存在的多種碳水化合物部分的屬性和比例的改變。
      向STOP-1多肽添加糖基化位點(diǎn)可以通過(guò)改變氨基酸序列來(lái)完成。進(jìn)行該改變可以通過(guò)例如,向天然序列的STOP-1多肽加入一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基,或用一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基取代(對(duì)于O連接的糖基化位點(diǎn))來(lái)進(jìn)行。通過(guò)在DNA水平上改變,特別通過(guò)使編碼STOP-1多肽的DNA在預(yù)先選擇的堿基突變,從而任選改變所述STOP-1的氨基酸序列,會(huì)產(chǎn)生會(huì)翻譯為所需的氨基酸的密碼子。
      增加STOP-1多肽上碳水化合物部分?jǐn)?shù)量的另一種方式是通過(guò)糖苷與多肽的化學(xué)或酶偶聯(lián)。在本領(lǐng)域描述了所述方法,例如,WO 87/05330,公開于1987年9月11日,和Aplin and Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)。
      可以用化學(xué)方法或酶法,或通過(guò)突變?nèi)〈幋a作為糖基化的靶點(diǎn)的氨基酸殘基的密碼子,來(lái)去除在STOP-1多肽上存在的碳水化合物部分?;瘜W(xué)去糖基化(deglycosylation)的技術(shù)在本領(lǐng)域已知并描述于,例如,Hakimuddin,等,Arch.Biochem.Biophys.,25952(1987)和Edge等,Anal.Biochem.,118131(1981)??梢酝ㄟ^(guò)使用多種內(nèi)糖苷酶和外糖苷酶來(lái)酶裂解多肽上的碳水化合物部分,如Thotakura等,Meth.Enzymo1.,138350(1987)所述。
      STOP-1多肽的另一種共價(jià)修飾包括使STOP-1多肽與多種非蛋白質(zhì)性(nonproteinaceous)聚合物之一連接,所述聚合物例如聚乙二醇(PEG),聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylene),連接方式如美國(guó)專利4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337所述。
      本發(fā)明的STOP-1多肽也可以形成嵌合分子的方式被修飾,該嵌合分子包含與另一個(gè)異種的多肽或氨基酸序列融合的STOP-1多肽。
      一個(gè)實(shí)施方案中,此嵌合分子包含STOP-1多肽與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合物,該蛋白質(zhì)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域靶向STOP-1多肽,以傳遞到多個(gè)組織,并更特別穿過(guò)血腦屏障,所用的結(jié)構(gòu)域例如,人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Schwarze等,1999,Science 2851569-72)。
      另一個(gè)實(shí)施方案中,此嵌合分子包含STOP-1多肽與提供了與抗-標(biāo)記抗體可選擇性結(jié)合的抗原決定簇的標(biāo)記多肽的融合物。所述抗原決定簇標(biāo)記通常位于STOP-1多肽的氨基末端或羧基末端。所述STOP-1多肽的抗原決定簇-標(biāo)記形式的存在可用抗該標(biāo)記多肽的抗體來(lái)檢測(cè)。而且,提供了此抗原決定簇標(biāo)記使所述STOP-1多肽易于用抗-標(biāo)記的抗體或其他種類結(jié)合此抗原決定簇標(biāo)記的的親和性基質(zhì)通過(guò)親和純化來(lái)純化。多種標(biāo)記多肽及分別針對(duì)它們的抗體在本領(lǐng)域公知。實(shí)例包括聚組氨酸(poly-His)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-His-gly)標(biāo)記;流感HA標(biāo)記多肽及其抗體12CA5[Field等,Mol.Cell.Biol.,82159-2165(1988)];c-myc標(biāo)記及其抗體8F9,3C7,6E10,G4,B7和9E10[Evan等,Molecular and Cellular Biology,53610-3616(1985)];及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)記及其抗體[Paborsky等,Protein Engineering,3(6)547-553(1990)]。其他標(biāo)記多肽包括Flag-肽[Hopp等,BioTechnology,61204-1210(1988)];KT3抗原決定簇肽[Martin等,Science,255192-194(1992)];α-微管蛋白抗原決定簇肽[Skinner等,J.Biol.Chem.,26615163-15166(1991)];和T7基因10蛋白肽標(biāo)記[Lutz-Freyermuth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,876393-6397(1990)]。
      另一個(gè)實(shí)施方案中,此嵌合分子能包含STOP-1多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合物。對(duì)于嵌合分子的二價(jià)形式(也稱為“免疫粘附素”),此融合可以針對(duì)IgG分子的Fc區(qū)。本發(fā)明的Ig融合物包括多肽,其包含大致或僅僅人STOP-1的殘基94-243、殘基33-53或殘基33-52來(lái)代替在Ig分子內(nèi)的至少一個(gè)可變區(qū)。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū),或鉸鏈區(qū)、CH1區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。免疫球蛋白融合物的制備也見1995年6月27日授權(quán)的美國(guó)專利5,428,130。
      STOP-1多肽的制備如下描述主要涉及STOP-1多肽的制備,該制備是通過(guò)培養(yǎng)用包含編碼STOP-1多肽的核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行的。它當(dāng)然包括可用其他本領(lǐng)域已知方法來(lái)制備STOP-1多肽。例如,STOP-1多肽序列,或其部分,可通過(guò)直接肽合成用固相技術(shù)來(lái)制備。見例如,Stewart等,Solid-PhasePeptide Synthesis(W.H.Freeman Co.San Francisco,CA,1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,852149-2154(1963)。體外蛋白質(zhì)合成可以用手工技術(shù)或通過(guò)自動(dòng)化來(lái)進(jìn)行??捎美?,用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(FosterCity,CA)根據(jù)生產(chǎn)廠家說(shuō)明書來(lái)完成自動(dòng)合成。STOP-1多肽的多個(gè)部分可用化學(xué)方法分開合成并用化學(xué)或酶方法組合來(lái)制備全長(zhǎng)的STOP-1多肽。
      宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化將宿主細(xì)胞用本文所述用于制備STOP-1多肽的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化,并培養(yǎng)在適當(dāng)改進(jìn)的常用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,來(lái)誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。熟練技術(shù)人員無(wú)需繁冗試驗(yàn)就能選擇培養(yǎng)條件,如培養(yǎng)基、溫度、pH等。通常,使細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生率達(dá)到最大的原理、方案和操作技術(shù)可見Mammalian Cell BiotechnologyAPracticalApproach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)和Sambrook等,見上文。
      轉(zhuǎn)染方法對(duì)于一般技術(shù)人員公知,例如,CaPO4處理法和電穿孔法。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞,使用對(duì)該細(xì)胞合適的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用氯化鈣的鈣處理法,如Sambrook等所述(見上文),或電穿孔,常用于原核細(xì)胞或其他包含堅(jiān)固的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞??捎酶┩寥罈U菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染來(lái)轉(zhuǎn)化某些植物細(xì)胞,如Shaw等,Gene,23315(1983)和WO 89/05859(公開于1989年6月29日)所述。對(duì)于無(wú)此細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,可用Graham和van der Eb,Virology,52456-457(1978)的磷酸鈣沉淀方法。美國(guó)專利4,399,216已經(jīng)描述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面。轉(zhuǎn)化入酵母通常根據(jù)Van Solingen等,J.Bact.,130946(1977)和Hsiao等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),763829(1979)的方法來(lái)進(jìn)行。然而,也可使用其他將DNA引入細(xì)胞的方法,如核顯微注射法、電穿孔法、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合法、或聚陽(yáng)離子法,所述聚陽(yáng)離子如1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)或聚鳥氨酸(polyornithine)。轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種技術(shù)見Keown等,Methods in Enzymology,185527-537(1990)和Mansour等,Nature,336348-352(1988)。
      克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的合適宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母、或高等真核生物細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌,如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性有機(jī)體(organism),例如,腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如大腸桿菌(E.coli)。多種大腸桿菌菌株為公眾可得,如大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC 31,446);大腸桿菌X1776(ATCC 31,537);大腸桿菌菌株W3110(ATCC 27,325);和K5772(ATCC 53,635)。其他合適的原核宿主細(xì)胞包括腸桿菌科如埃希氏菌屬(Escherichia),例如,大腸桿菌,腸桿菌屬(Enterobacter),歐文菌屬(Erwinia),克雷白菌屬(Klebsiella),變形菌屬(Proteus),沙門菌屬(Salmonella),例如,鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium),沙雷菌屬(Serratia),例如,粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans),和志賀菌屬(Shigella),及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如,1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P),假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠菌假單胞菌(P.aeruginosa),及鏈霉菌(Streptomyces)。這些實(shí)例是為了說(shuō)明而不是為了限制。菌株W3110是一個(gè)特別優(yōu)選的宿主或親代宿主,因?yàn)樗浅R姷挠糜谥亟MDNA產(chǎn)物發(fā)酵的宿主菌株。優(yōu)選,該宿主細(xì)胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如,可修飾菌株W3110來(lái)進(jìn)行編碼宿主內(nèi)生的蛋白的基因的遺傳突變,這些宿主的實(shí)例包括大腸桿菌W3110菌株1A2,它具有完整基因型tonA;大腸桿菌W3110菌株9E4,它具有完整基因型tonA ptr3;大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244),它具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT kanr;大腸桿菌W3110菌株37D6,它具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr;大腸桿菌W3110菌株40B4,它是帶有非-卡那霉素抗性的degP缺失突變的菌株37D6;以及具有突變的周質(zhì)(periplasmic)蛋白酶的大腸桿菌菌株,其公開于1990年8月7日授權(quán)的美國(guó)專利4,946,783。或者,體外克隆方法例如,PCR或其他核酸聚合酶反應(yīng)都是合適的。
      除了原核生物,真核微生物如絲狀真菌或酵母是編碼STOP-1多肽的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等的真核生物宿主微生物。其他的包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach and Nurse,Nature,290140 ;EP 139,383,公開于1985年5月2日);克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國(guó)專利4,943,529;Fleer等,Bio/Technology,9968-975(1991))如,例如,乳克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C,CBS683,CBS4574;Louvencourt等,J.Bacteriol.,737 ),脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424),保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045),威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178),K.waltii(ATCC 56,500),果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906;Van den Berg等,Bio/Technology,8135(1990)),耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus);西洋蓍霉(yarrowia)(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070;Sreekrishna等,J.Basic Microbiol.,28265-278 );念珠菌屬(Candida);Trichodermareesia(EP 244,234);粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)(Case等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,765259-5263 );許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538,公開于1990年10月31日);和絲狀真菌,例如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、Tolypocladium(WO 91/00357,公開于1991年1月10日),以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,112284-289 ;Tilburn等,Gene,26205-221 ;Yelton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,811470-1474 )和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes,EMBO)J.,4475-479 )。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母在這里是合適的,包括但不限于能夠于甲醇中生長(zhǎng)的酵母,其選自如下屬漢遜酵母屬(Hansenula),念珠菌屬,克勒克酵母屬(Kloeckera),畢赤酵母屬(Pichia),糖酵母(Saccharomyces),球擬酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Rhodotorula)。作為此類酵母的舉例的具體種的列表可見C.Anthony,The Biochemistry ofMethylotrophs,269(1982)。
      編碼糖基化STOP-1多肽的核酸表達(dá)的合適宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括昆蟲細(xì)胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9,以及植物細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)和COS細(xì)胞。更具體的實(shí)例包括用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7,ATCCCRL 1651);人胚胎腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或經(jīng)過(guò)再克隆后在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞,Graham等,J.Gen.Virol.,3659(1977));中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,774216(1980));小鼠足細(xì)胞(sertoli cells)(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23243-251(1980));人肺細(xì)胞(W138,ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞(Hep G2,HB 8065);和小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)。選擇合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)。
      選擇并使用復(fù)制型載體編碼本發(fā)明多肽或抗體的核酸(例如,cDNA或基因組DNA)可插入復(fù)制型載體用于克隆(擴(kuò)增DNA)或表達(dá)。多種載體為公眾可得。所述載體能夠例如,為質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?;蚴删w的形式。合適的核酸序列可通過(guò)多種方法插入載體。通常,用本領(lǐng)域已知技術(shù)將DNA插入一或多個(gè)合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。載體組分通常包括但不限于一或多個(gè)信號(hào)序列(如果該序列要被分泌),復(fù)制起點(diǎn),一或多個(gè)標(biāo)記基因,增強(qiáng)子元件,啟動(dòng)子,及轉(zhuǎn)錄終止序列。構(gòu)建包含一或多個(gè)這些組分的合適載體使用了本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。
      本發(fā)明的多肽或抗體不僅可直接重組制備,而且可作為與異源多肽的融合多肽來(lái)重組制備,所述異源多肽可為信號(hào)序列或其他在成熟蛋白或多肽的N-末端上具有特異性裂解位點(diǎn)的多肽。通常,所述信號(hào)序列可以是所述載體的組分,或可能是插入所述載體的編碼多肽或抗體的DNA的一部分。該信號(hào)序列可以是真核生物的信號(hào)序列,其選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或熱穩(wěn)定性腸毒素II前導(dǎo)序列(leader)。為了進(jìn)行酵母分泌,信號(hào)序列可以是,例如,酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列,α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母的α-因子前導(dǎo)序列,后者見美國(guó)專利5,010,182所述),或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列,白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP 362,179,公開于1990年4月4日),或WO 90/13646描述的信號(hào)(公開于1990年11月15日)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)中,哺乳動(dòng)物信號(hào)序列如來(lái)自相同或相關(guān)種類的分泌多肽的信號(hào)序列,以及病毒的分泌前導(dǎo)序列,可用于指導(dǎo)蛋白的分泌。
      表達(dá)載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。這樣的序列在各種細(xì)菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌,2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母,多種病毒起點(diǎn)(SV40,多形瘤病毒(Polyoma),腺病毒,VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。
      表達(dá)載體和克隆載體通常包含選擇基因,也稱選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素,新霉素,氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性,(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷,或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物,例如為芽孢桿菌(Bacilli)編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。
      對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞合適的選擇標(biāo)記的例子,是那些可鑒定處于感受態(tài)能攝取編碼多肽或抗體如DHFR或胸苷激酶的核酸的細(xì)胞的標(biāo)記。使用野生型DHFR時(shí),合適的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系,其制備和繁殖如Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,774216(1980)所述。適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因。Stinchcomb等,Nature,28239(1979);Kingsman等,Gene,7141(1979);Tschemper等,Gene,10157(1980)。trp1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)記(Jones,Genetics,8512(1977))。
      表達(dá)載體和克隆載體通常包含與編碼本發(fā)明多肽或抗體的核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子,來(lái)指導(dǎo)mRNA合成。已知被多種潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等,Nature,275615(1978);Goeddel等,Nature,281544(1979)),堿性磷酸酶,色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel,Nuclears Res.,84057(1980);EP36,776),和雜合(hybrid)啟動(dòng)子,如tac啟動(dòng)子(deBoer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8021-25(1983))。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子也將包含與編碼本發(fā)明多肽或抗體的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
      適用于酵母宿主的合適的啟動(dòng)子序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子(Hitzeman等,J.Bio1.Chem.,2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等,J.Adv.Enzyme Reg.,7149(1968);Holland,Biochemistry,174900(1978))的啟動(dòng)子,所述其它糖酵解酶如烯醇化酶,甘油醛-3-磷酸脫氫酶,己糖激酶,丙酮酸脫羧酶,磷酸果糖激酶,葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶,3-磷酸甘油變位酶,丙酮酸激酶,磷酸丙糖異構(gòu)酶,磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
      其它作為另具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的酵母啟動(dòng)子,是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶,以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進(jìn)一步描述了適用于酵母表達(dá)的合適載體和啟動(dòng)子。
      在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中,從載體轉(zhuǎn)錄核酸受如下控制,例如來(lái)自病毒的基因組的啟動(dòng)子,所述病毒如多形瘤病毒、雞痘病毒(fowlpox virus)(1989年7月5日公開的UK 2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒,及猿猴病毒40(SV40);受異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子控制,例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等,及受熱休克啟動(dòng)子控制,前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
      編碼本發(fā)明多肽或抗體的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體中來(lái)增加。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件,通常約為10到300bp,其作用于啟動(dòng)子來(lái)使轉(zhuǎn)錄增加。目前已知很多哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。但通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270),巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子,在復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子,和腺病毒增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以剪接插入載體中編碼本發(fā)明多肽或抗體的序列的5’或3’側(cè),但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’側(cè)。
      用于真核宿主細(xì)胞(酵母,真菌,昆蟲,植物,動(dòng)物,人,或來(lái)自其他多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體,也將包含對(duì)轉(zhuǎn)錄終止和mRNA穩(wěn)定所必需的序列。這些序列通常來(lái)自真核細(xì)胞或病毒的DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼多肽或抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中的聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
      其他適于在重組脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成本發(fā)明多肽或抗體的合適方法、載體和宿主細(xì)胞,見Gething等,Nature,293620-625(1981);Mantei等,Nature,28140-46(1979);EP 117,060;和EP 117,058所述。
      對(duì)基因擴(kuò)增/表達(dá)的檢測(cè)可在樣本中直接測(cè)量基因的擴(kuò)增和/或表達(dá),例如通過(guò)常用的Southern印跡、Northern印跡來(lái)定量mRNA轉(zhuǎn)錄(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,775201-5205(1980))、斑點(diǎn)印跡(DNA分析)、或根據(jù)本文提供的序列用適當(dāng)標(biāo)記的探針作原位雜交。或者,可使用識(shí)別特異性雙螺旋的多種抗體,所述雙螺旋包括DNA雙鏈體(deplux),RNA雙鏈體,和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體??蓸?biāo)記所述抗體,并且在雙鏈體結(jié)合到表面的位置進(jìn)行測(cè)定,一旦在表面形成雙鏈體,就能夠檢測(cè)到與雙鏈體結(jié)合的抗體的存在。
      或者,基因表達(dá)可用免疫方法來(lái)測(cè)量,如細(xì)胞或組織切片的免疫組化染色,和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測(cè)定,來(lái)直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)??捎糜诿庖呓M化染色和/或樣本液體分析的抗體,可以是單克隆的或是多克隆的,且可在任何哺乳動(dòng)物中制備或合成(例如,本發(fā)明的單克隆抗體)。可方便地制備如下抗體,所述抗體抗天然序列STOP-1多肽,或抗根據(jù)本文提供的DNA序列合成的肽,或抗與編碼STOP-1多肽的DNA和編碼特定的抗體的抗原決定簇的DNA融合的外源序列。
      STOP-1多肽的純化可從培養(yǎng)基或從宿主細(xì)胞裂解物回收多種形式的STOP-1多肽。如果STOP-1多肽是膜接合型,可用合適的洗滌劑溶液(例如TRITON-XTM100)或通過(guò)酶裂解使它從膜上釋放??捎枚喾N物理或化學(xué)方式來(lái)使用于編碼STOP-1多肽的核酸的表達(dá)的細(xì)胞破裂,所述方式如凍融循環(huán),超聲處理,機(jī)械破裂,或通過(guò)細(xì)胞裂解制劑。一個(gè)實(shí)施方案中,理想的是從重組細(xì)胞蛋白或多肽中純化出STOP-1多肽。如下方法是合適的純化方法的實(shí)例在離子交換柱上分級(jí)分離;乙醇沉淀;反相HPLC;在硅石(silica))上或在陽(yáng)離子交換樹脂如DEAE上層析;層析聚焦;SDS-PAGE;硫酸銨沉淀;凝膠過(guò)濾,例如使用Sephadex G-75;除去污染物如IgG的蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱;和金屬螯合柱以與抗原決定簇-標(biāo)記形式的STOP-1多肽結(jié)合。可使用多種蛋白質(zhì)純化方法,這些方法在本領(lǐng)域已知,并描述于例如,Deutscher,Methodsin Enzymology,182(1990);Scopes,Protein PurificationPrinciples and Practice(Springer-VerlagNew York,1982)中。選擇出來(lái)的一或多步純化步驟依賴于,例如,所用的制備方法的性質(zhì)以及所制備的具體STOP-1多肽。一個(gè)實(shí)施方案中,STOP-1多肽是用本發(fā)明抗體通過(guò)親和層析來(lái)純化的。
      測(cè)定對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用本發(fā)明拮抗劑的抑制活性可用如下實(shí)施例13-14的測(cè)定方法和其他本領(lǐng)域已知的測(cè)定方法來(lái)測(cè)量。
      腫瘤和癌癥的動(dòng)物模型(例如,乳腺癌,結(jié)腸癌,前列腺癌,肺癌等)包括非重組的和重組的(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物。非重組動(dòng)物模型包括,例如嚙齒類動(dòng)物的模型,如鼠模型。制備這些模型可以通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將腫瘤細(xì)胞引入同系小鼠來(lái)生成,所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內(nèi)植入、在腎小囊下植入、或常位針植入(orthopin implantation),例如植入結(jié)腸組織的結(jié)腸癌細(xì)胞。見例如,1997年9月18日公開的PCT申請(qǐng),其
      發(fā)明者海迪·阿克利, 阿維·阿什克納齊, 戴維·埃伯哈德, 格雷特切恩·弗朗茨, 多蘿西·弗倫奇, 杰曼·富, 喬-安妮·杭戈, 李卿瑋, 斯科特·馬斯特斯, 羅伯特·皮蒂, 赫爾加·拉布, 莉莉亞那·索羅西紐, 伊夫格尼·瓦福洛米夫, 貝尼·沃爾夫 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司
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