專(zhuān)利名稱(chēng)：：耐熱化α－葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及熱穩(wěn)定的α-葡聚糖磷酸化酶和編碼所述熱穩(wěn)定α-葡聚糖磷酸化酶的基因。另外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)熱穩(wěn)定α-葡聚糖磷酸化酶的方法。
背景技術(shù)：
：α-葡聚糖磷酸化酶(以下也稱(chēng)GP)是例如用于合成葡萄糖-1-磷酸(以下也稱(chēng)G-1-P)和合成葡聚糖的一種酶。G-1-P例如用作醫(yī)用抗菌藥、抗腫瘤藥(作為鉑絡(luò)合物)、治療心臟病的藥物(作為胺鹽)或葡聚糖合成的底物。GP廣泛分布于植物，例如分布在馬鈴薯的塊莖；動(dòng)物，例如兔肌肉；和微生物如酵母中。其中，植物來(lái)源的GP是有用的，因?yàn)樗ǔ＞哂泻铣筛叻肿恿科暇厶堑哪芰?。多種GP可用于生產(chǎn)G-1-P或葡聚糖，其中，馬鈴薯來(lái)源的GP用于很多情況中，因?yàn)槿菀撰@得較大量的該酶。在使用GP工業(yè)生產(chǎn)G-1-P或葡聚糖中，有必要基本去除緣于GP污染的其它酶活性，尤其是磷酸酶活性和淀粉酶活性。當(dāng)大量生產(chǎn)GP時(shí)，大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(Bacillussubtilis)是表達(dá)GP基因的理想宿主。然而，如圖4和圖5所示，大腸桿菌具有淀粉酶活性和磷酸酶活性，而枯草桿菌具有淀粉酶活性。然而，如圖4和圖5所示，由這些宿主表達(dá)的酶不能被55℃熱處理滅活，但幾乎能被60℃熱處理完全滅活。因此，希望得到具有抗熱性的植物來(lái)源GP，其活性甚至在60℃熱處理后也不喪失。作為參考，熱處理前后多種細(xì)菌(大腸桿菌TG-1株、大腸桿菌BL21株和枯草桿菌ANA-1株)的細(xì)胞提取物中淀粉酶和磷酸酶活性的具體數(shù)值在下表1中給出。(表1)然而，能合成高分子量葡聚糖并具有耐熱性的植物來(lái)源GP，尤其是在高溫(如60℃-75℃)下能維持足夠活性的GP仍然未知。對(duì)于來(lái)源于植物以外生物的GP，已經(jīng)報(bào)道由極度嗜熱細(xì)菌(水生棲熱菌、Thermococcuslitoralis、Aquifexaeolicus等)表達(dá)的、具有高度耐熱性的GP。然而，因?yàn)橐陨线@些GP來(lái)源于植物以外的生物，它們不能合成高分子量葡聚糖，因此有用性較差。根據(jù)氨基酸序列的同源性(見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)GP被分成兩類(lèi)。與馬鈴薯來(lái)源GP具有30％或更高一致性的GP歸為A類(lèi)GP，而與馬鈴薯來(lái)源GP具有低于30％一致性并與水生棲熱菌的GP具有30％或更高一致性的GP歸為B類(lèi)GP。與使用屬于A類(lèi)GP的馬鈴薯來(lái)源GP生產(chǎn)的葡聚糖相比，使用屬于B類(lèi)的Thermus來(lái)源的GP生產(chǎn)的葡聚糖具有較低的分子量。因此，存在不能使用Thermus來(lái)源的GP獲得高分子量葡聚糖的問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，需要對(duì)工業(yè)應(yīng)用有利且具有高度耐熱性的植物來(lái)源GP。已經(jīng)嘗試使一般酶具有更高耐熱性的理論方法，如脯氨酸理論和基于酶立體結(jié)構(gòu)信息的氨基酸替換，但并非都是成功的。因此，當(dāng)前使用基于隨機(jī)突變的方法，或使用隨機(jī)突變和理論方法組合的方法。然而，在任何這些方法中，每種蛋白必須通過(guò)試錯(cuò)法來(lái)表征。對(duì)于GP以外的其它酶，已經(jīng)報(bào)道一旦確定參與提高酶耐熱性的具體氨基酸位置，通過(guò)用其它氨基酸替換具體氨基酸殘基，可以使酶具有耐熱性(例如見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3-5)。已經(jīng)報(bào)道具有更高耐熱性GP的實(shí)例，如大腸桿菌麥芽糊精磷酸化酶(見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。在此文獻(xiàn)中，公開(kāi)了熱穩(wěn)定大腸桿菌麥芽糊精磷酸化酶。麥芽糊精磷酸化酶是一種GP。在這種耐熱化GP中，第133位天冬酰胺被丙氨酸替換。133位的這個(gè)天冬酰胺位于活性位點(diǎn)，并且是吡哆醛-5’-磷酸的結(jié)合位點(diǎn)，吡哆醛-5’-磷酸是所述酶反應(yīng)必需的輔酶。在這種耐熱化GP中，與天然GP比較，耐熱性提高了約15℃，且最適反應(yīng)溫度從約45℃提高到約60℃，而所述GP在約67℃變性。然而，與Thermus來(lái)源的GP相似，這種大腸桿菌GP沒(méi)有合成高分子量葡聚糖的能力。另外，在此文獻(xiàn)中描述的耐熱化GP在最適溫度下的酶活性低于在最適溫度下天然GP的酶活性。也就是說(shuō)，由于突變，其合成葡聚糖的能力降低。因此，該文獻(xiàn)教導(dǎo)133位替換不是優(yōu)選的，至少?gòu)钠暇厶呛铣赡芰Φ挠^點(diǎn)看如此。通常酶蛋白不穩(wěn)定，并且對(duì)物理因素如pH、溫度等以及蛋白酶敏感，因此容易降解。其中，也有酶在高度純化時(shí)變得更不穩(wěn)定，并因此容易降解。因此，酶必須在盡可能低的溫度下制備，并且必須現(xiàn)用現(xiàn)制備。通過(guò)冷凍保存可以抑制酶降解。然而有些情況下蛋白質(zhì)在融化過(guò)程中降解，因此當(dāng)冷凍保存并隨后融化酶時(shí)很難操作。一般來(lái)說(shuō)，酶降解時(shí)立體結(jié)構(gòu)改變，并且酶的性質(zhì)如最適pH、pH穩(wěn)定性、反應(yīng)速率、底物親和力等也相似的改變。偶爾所述酶活性被降低或滅活。這樣，酶蛋白降解大大影響酶反應(yīng)。因此，對(duì)于使用酶的工業(yè)，希望使用具有盡可能出色穩(wěn)定性的酶。已經(jīng)知道天然馬鈴薯L型GP也容易降解，甚至當(dāng)純化GP冷藏保存時(shí)，也從純化點(diǎn)逐漸降解。當(dāng)可以抑制GP蛋白降解時(shí)，就可以制備大量GP并長(zhǎng)期保存，從而增加生產(chǎn)效率，這對(duì)酶的保存和使用都是顯著的優(yōu)點(diǎn)。因此，也優(yōu)選提供能長(zhǎng)期保存而不降解的GP。(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)TakeshiTakaha，etel.，″StructureandPropertiesofThermusaqatiousα-GlucanPhosphorylaseExpressedinEscherichiacoli″，J.Appl.Glycosi.，2001，Vol.48，No.1，pp.71-78(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)RichardGrieβler，etal.，″MechanismofthermaldenaturationofmaltodextrinphosphorylasefromRscheriohiacoli″，Biochem.J.，2000，346，pp.255-263(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)MartinLehmannandMarkusWyss，″Engineeringproteinsforthermostabilitytheuseofsequencealignmentsversusrationaldesignanddireotedevolution″，CurrentOpinioninBiotechnology，2001，12，pp.371-375(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)M.Lehmann，etal.，″Theconsensusconceptforthermostabilityengineeringofproteins″，BiochemicaBiophysicaActa，2000，1543，pp.408-415(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)JunichiMiyazaki，etal.，″AncestralResiduesStabilizing3-IsopropylmalateDehydrogenaseofanExtremeThermophileExperimentalEvidenceSupportingtheThermophilicCommonAncestorHypothesis″，J.Biochem，2001，129，pp.777-782
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明待解決問(wèn)題本發(fā)明意圖解決前述問(wèn)題，并且本發(fā)明的目的是提供比常規(guī)α-葡聚糖磷酸化酶具有更好耐熱性的植物來(lái)源α-葡聚糖磷酸化酶。更具體的，本發(fā)明的目的是提供除了具有耐熱性以外還具有出色保存穩(wěn)定性的植物來(lái)源α-葡聚糖磷酸化酶。解決問(wèn)題的方式作為解決上述問(wèn)題的勤奮研究結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在植物來(lái)源GP的氨基酸序列中的特定位置替換氨基酸殘基，可以獲得耐熱化植物來(lái)源GP?；谶@些發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。為了解決前述問(wèn)題，發(fā)明人繼續(xù)深入研究，結(jié)果最終發(fā)現(xiàn)通過(guò)在植物來(lái)源GP的氨基酸序列中的特定位置替換氨基酸殘基，作出了前述發(fā)現(xiàn)，并在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶是通過(guò)修飾天然α-葡聚糖磷酸化酶而獲得的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，并且耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以在以下位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置；或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；或?qū)?yīng)所述基序序列3L中第7位的位置；或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以與選自下組的氨基酸序列具有至少50％一致性SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一種核酸分子編碼，所述核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼選自下組的氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并可以在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并可以在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以選自SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以來(lái)源于馬鈴薯或擬南芥(Arabidopsisthaliana)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的α-葡聚糖磷酸化酶可以在選自下組的至少兩個(gè)位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的α-葡聚糖磷酸化酶可以在以下位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置上的氨基酸殘基可以選自I、L和V。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置上的氨基酸殘基可以選自I和L。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位位置上的氨基酸殘基可以選自A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V和Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位位置上的氨基酸殘基可以選自C、G、S和V。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置上的氨基酸殘基可以選自C、I、L、V和W。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置上的氨基酸殘基可以選自C、I、L和V。在一個(gè)實(shí)施方案中，在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性可以是加熱前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的30％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中65℃加熱2分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，與天然α-葡聚糖磷酸化酶相比較，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以具有更高的保存穩(wěn)定性。本發(fā)明的方法是生產(chǎn)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的方法，包括修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的第一種核酸分子，以獲得含修飾堿基序列的第二種核酸分子；制備含所述第二種核酸分子的表達(dá)載體；將所述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，以表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶；和回收所表達(dá)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以在以下位置具有與所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；或?qū)?yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶可以是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并可在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶可以是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并可在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶可以來(lái)源于馬鈴薯或擬南芥。本發(fā)明的核酸分子包含編碼所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列。本發(fā)明的載體包含所述核酸分子。本發(fā)明的細(xì)胞包含所述核酸分子。本發(fā)明合成葡聚糖的方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑，和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)可以在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明合成葡聚糖的另一種方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、引發(fā)劑和葡萄糖-1-磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)可以在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)可以在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶是通過(guò)修飾植物來(lái)源的天然α-葡聚糖磷酸化酶而獲得的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量為600kDa或更高的直鏈淀粉。根據(jù)本發(fā)明另一種耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶是通過(guò)修飾天然α-葡聚糖磷酸化酶而獲得的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置；并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；或?qū)?yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以與選自下組的氨基酸序列具有至少50％一致性SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一種核酸分子編碼，所述核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼選自下組的氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿基序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27和SEQIDNO29在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是L型α-葡聚糖磷酸化酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是H型α-葡聚糖磷酸化酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列選自SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于馬鈴薯或擬南芥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少兩個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述F39位置的氨基酸殘基選自異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述F39位置的氨基酸殘基是異亮氨酸或亮氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述N135位置的氨基酸殘基選自丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述N135位置的氨基酸殘基是半胱氨酸、甘氨酸、絲氨酸或纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述T706位置的氨基酸殘基選自半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和色氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)所述T706位置的氨基酸殘基是半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的30％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中65℃加熱2分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的方法包括修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶堿基序列的第一種核酸分子，以獲得含修飾堿基序列的第二種核酸分子；制備含所述第二種核酸分子的表達(dá)載體；將所述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，以表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，和回收所表達(dá)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置、對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置，并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基在以下位置與所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶不同對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；或?qū)?yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶是H型α-葡聚糖磷酸化酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于馬鈴薯或擬南芥。本發(fā)明的核酸分子包含編碼所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列。本發(fā)明的載體包含所述核酸分子。本發(fā)明的細(xì)胞包含所述核酸分子。本發(fā)明合成葡聚糖的方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑，無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)可以在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明合成葡聚糖的一種方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)，所述反應(yīng)液中含有耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、引發(fā)劑和葡萄糖-1-磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)可以在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，所述反應(yīng)液中含有所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)可以在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶是通過(guò)修飾植物來(lái)源天然α-葡聚糖磷酸化酶而獲得的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置、對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置、和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置，其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量為600kDa或更高的直鏈淀粉。本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，獲得了在高溫(如60℃或更高)下具有極佳耐熱性的植物來(lái)源GP酶。根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，合成葡聚糖的反應(yīng)可以在高溫條件(如60℃或更高)下進(jìn)行，在此條件下天然GP酶不能反應(yīng)。要求保護(hù)的本發(fā)明獲得這樣的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)編碼本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的基因(如通過(guò)提高馬鈴薯來(lái)源GP的耐熱性而獲得的、編碼具有更高耐熱性GP的基因，)在嗜中溫性細(xì)菌宿主如大腸桿菌中高度表達(dá)時(shí)，來(lái)源于所述宿主細(xì)菌的污染酶根據(jù)本發(fā)明可通過(guò)加熱所述細(xì)菌細(xì)胞提取物而簡(jiǎn)便除去，所述細(xì)胞提取物中含有在60℃具有更高耐熱性的酶。具體的，在工業(yè)應(yīng)用GP酶時(shí)淀粉酶活性和磷酸酶活性引起很大問(wèn)題，通過(guò)熱處理可以大大降低這些酶活性。因此，本發(fā)明的所述方法在酶純化方面具有優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的方法不僅在馬鈴薯來(lái)源GP和擬南芥來(lái)源GP上有效，而且也能適用于提高與馬鈴薯來(lái)源GP或擬南芥來(lái)源GP的氨基酸序列表現(xiàn)出高度同源的其它A類(lèi)GP的耐熱性。因此，可以獲得耐熱化的其它生物來(lái)源的GP，所述GP在選自下組的至少一個(gè)位置具有與天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置?？梢垣@得耐熱化的其它生物來(lái)源GP，所述GP在選自下組的至少一個(gè)位置具有與天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。根據(jù)本發(fā)明，也提供同時(shí)具有更高保存穩(wěn)定性和更高耐熱性的GP。圖1A圖1A表示來(lái)源于多種植物的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列，使用GENETYX-WinVer.4.0的多重匹配對(duì)它們進(jìn)行匹配。圖1B圖1B是圖1A的續(xù)圖。標(biāo)出了基序序列1和2的位置。圖1C圖1C是圖1B的續(xù)圖。圖1D圖1D是圖1C的續(xù)圖。圖1E圖1E是圖1D的續(xù)圖。圖1F圖1F是圖1E的續(xù)圖。圖1G圖1G是圖1F的續(xù)圖。圖1H圖1H是圖1G的續(xù)圖。圖1I圖1I是圖1H的續(xù)圖。圖2圖2是質(zhì)粒中α-葡聚糖磷酸化酶基因插入位點(diǎn)的示意圖。圖3圖3表示當(dāng)多種耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在60℃下30分鐘或在65℃下2分鐘時(shí)剩余的酶活性(％)。圖4圖4表示多種細(xì)菌(大腸桿菌TG-1和大腸桿菌BL21)在50℃、55℃、60℃或65℃加熱30分鐘后磷酸酶的剩余酶活性(％)。圖5圖5表示多種細(xì)菌(大腸桿菌TG-1、大腸桿菌BL21和枯草桿菌ANA-1)在50℃、55℃、60℃或65℃加熱30分鐘后淀粉酶的剩余酶活性(％)。圖6圖6表示耐熱化GP酶(三重突變體(F39L+N135S+T706I))和天然馬鈴薯L型GP酶的比活性隨時(shí)間的變化。圖7圖7表示耐熱化GP酶(三重突變體(F39L+N135S+T706I))和天然馬鈴薯L型GP酶在37℃、50℃、55℃或60℃保溫18小時(shí)時(shí)合成的直鏈淀粉量。圖8圖8表示60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘后，天然馬鈴薯L型GP和在F39處具有多種替換的GP的剩余活性。圖9圖9表示60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘后，天然馬鈴薯L型GP和在N135處具有多種替換的GP的剩余活性。圖10圖10表示60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘后，天然馬鈴薯L型GP和在T706處具有多種替換的GP的剩余活性。圖11圖11表示58℃保溫10分鐘、60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘后，天然馬鈴薯H型GP和三重突變(Y36L+N133S+T628I)型馬鈴薯H型GP的剩余活性。圖12圖12表示58℃保溫10分鐘、60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘后，天然擬南芥H型GP和三重突變(Y40L+N136S+N631I)型擬南芥H型GP的剩余酶活性。圖13圖13是聚丙烯酰胺凝膠電泳照片，表示天然馬鈴薯L型GP和7種耐熱化GP在純化后即時(shí)的分子量和在4℃保存5個(gè)月后的分子量。泳道1表示天然馬鈴薯L型(野生型)GP，泳道2表示F39LGP，泳道3表示N135SGP，泳道4表示T706IGP，泳道5表示F39L+N135SGP，泳道6表示F39L+T706IGP，泳道7表示N135S+T706IGP，泳道8表示F39L+N135S+T706IGP。本發(fā)明最佳實(shí)施方式本發(fā)明將在下面解釋。應(yīng)該理解，在整篇本說(shuō)明書(shū)，用于本說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域正常使用的意思，除非另外具體說(shuō)明。(1.α-葡聚糖磷酸化酶)本說(shuō)明書(shū)中，除非另外具體說(shuō)明，“α-葡聚糖磷酸化酶”和“GP”可互換使用，表示具有α-葡聚糖磷酸化酶活性的酶。α-葡聚糖磷酸化酶歸類(lèi)于EC2.4.1.1。α-葡聚糖磷酸化酶活性表示催化從無(wú)機(jī)磷酸和α-1，4-葡聚糖制備葡萄糖-1-磷酸和α-1，4-葡聚糖部分降解產(chǎn)物的反應(yīng)或其逆反應(yīng)的活性。α-葡聚糖磷酸化酶在有些情況下稱(chēng)為磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶等。α-葡聚糖磷酸化酶也可催化α-1，4-葡聚糖的合成反應(yīng)，它是磷酸解的逆反應(yīng)。任意特定反應(yīng)的方向依賴(lài)于底物的量。在體內(nèi)，由于無(wú)機(jī)磷酸的量大，葡聚糖磷酸化酶反應(yīng)向磷酸解方向進(jìn)行。當(dāng)無(wú)機(jī)磷酸量少時(shí)，反應(yīng)向合成α-1，4-葡聚糖方向進(jìn)行。好像所有已知α-葡聚糖磷酸化酶的活化都需要吡哆醛-5’-磷酸，并具有相似的催化機(jī)理。盡管不同來(lái)源酶的底物偏向性和調(diào)節(jié)形式不同，所有α-葡聚糖磷酸化酶都屬于包括很多α-葡聚糖磷酸化酶的大組。這個(gè)大組包括來(lái)源于細(xì)菌、酵母和動(dòng)物的糖原磷酸化酶、來(lái)源于植物的淀粉磷酸化酶和來(lái)源于細(xì)菌的麥芽糊精磷酸化酶。已經(jīng)報(bào)道，α-葡聚糖磷酸化酶的葡聚糖合成反應(yīng)的最小引發(fā)分子是麥芽四糖。也已經(jīng)報(bào)道葡聚糖降解反應(yīng)的最小有效底物是麥芽戊糖。通常，認(rèn)為這些是α-葡聚糖磷酸化酶的共同特征。然而，近些年，已經(jīng)報(bào)道來(lái)自嗜熱棲熱菌的α-葡聚糖磷酸化酶和來(lái)自Thermococcuslitoralis的α-葡聚糖磷酸化酶具有不同于其它α-葡聚糖磷酸化酶的底物特異性。對(duì)于這些α-葡聚糖磷酸化酶，葡聚糖合成的最小引發(fā)劑是麥芽三糖，而葡聚糖降解的最小底物是麥芽四糖。α-葡聚糖磷酸化酶被認(rèn)為廣泛存在于能儲(chǔ)存淀粉或糖原的多種植物、動(dòng)物和細(xì)菌中。產(chǎn)生α-葡聚糖磷酸化酶的植物的實(shí)例包括根和塊莖作物如馬鈴薯(也稱(chēng)愛(ài)爾蘭馬鈴薯)、甘薯、薯蕷、芋和木薯；蔬菜如甘藍(lán)和菠菜；谷物如玉米、水稻、小麥、大麥、黑麥和粟；豆類(lèi)如蠶豆、豌豆、大豆、赤豆和雜色菜豆(mottledkidneybean)；實(shí)驗(yàn)植物如擬南芥；柑桔雜交栽培種，藻類(lèi)等。產(chǎn)生α-葡聚糖磷酸化酶的植物不限于以上實(shí)例。用于本發(fā)明方法的第一種α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選是天然α-葡聚糖磷酸化酶并來(lái)源于植物。通常，來(lái)源于植物的天然α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成高分子量的直鏈淀粉。然而，這些α-葡聚糖磷酸化酶的耐熱性較低。因此它們不能在高溫下(如約60℃或更高)催化反應(yīng)。因此，當(dāng)在植物(如馬鈴薯)來(lái)源GP的最適反應(yīng)溫度，即約30℃到約40℃進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)多種微生物污染或所述葡聚糖老化的問(wèn)題，并且葡聚糖或G-1-P不能被有效產(chǎn)生。根據(jù)對(duì)糖原的親和力，植物α-葡聚糖磷酸化酶分成L型和H型。L型α-葡聚糖磷酸化酶表示對(duì)糖原具有低親和力的α-葡聚糖磷酸化酶。通常，L型α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)先選擇麥芽糊精、直鏈淀粉和支鏈淀粉而不是糖原作為底物(HiroyukiMori，etal.，“AChimericα-glucanphosphorylaseofPlantTypeLandHIsozyme”，TheJournalofBiologicalChemistry，1993，vol.268，No.8，pp.5574-5581)。H型α-葡聚糖磷酸化酶表示對(duì)糖原具有高親和力的α-葡聚糖磷酸化酶。通常，H型α-葡聚糖磷酸化酶對(duì)多種葡聚糖包括糖原具有極高親和力。例如，根據(jù)ToshioFukui，etal.，BiochemistryofVitaminB6，1987，pp.267-276，馬鈴薯葉來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶對(duì)糖原的Km(米氏常數(shù))是1.4×10-3(M)，而馬鈴薯葉來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶產(chǎn)生糖原的Km是4×10-6(M)。此外，馬鈴薯塊莖來(lái)源α-葡聚糖磷酸化酶的主要組分產(chǎn)生糖原的Km是2.4×10-3(M)，被分類(lèi)為L(zhǎng)型。次要組分α-葡聚糖磷酸化酶產(chǎn)生糖原的Km是1×10-6(M)，被分類(lèi)為H型。本領(lǐng)域已知，米氏常數(shù)是由酶促反應(yīng)初始速率對(duì)底物濃度依賴(lài)性確定的動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一。米氏常數(shù)是當(dāng)初始速率是最大速率Vmax的1/2時(shí)的底物濃度。米氏常數(shù)具有濃度單位。米氏常數(shù)隨酶的具體測(cè)定條件而改變。該常數(shù)是表示酶對(duì)底物親和力的量度。當(dāng)米氏常數(shù)變小時(shí)，對(duì)底物的親和力變大。例如，L型α-葡聚糖磷酸化酶和H型α-葡聚糖磷酸化酶在特征方面具有以下不同。(表2)在一個(gè)具體實(shí)施方案中，進(jìn)一步優(yōu)選的是，用于本發(fā)明方法的α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶。馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶比馬鈴薯H型α-葡聚糖磷酸化酶更長(zhǎng)，并包含H型中沒(méi)有的78個(gè)殘基的氨基酸序列，該序列插入所述多肽鏈的中心區(qū)。因此，舉例來(lái)說(shuō)，馬鈴薯葉來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶亞基的分子量約為104,000Da，而馬鈴薯葉來(lái)源H型α-葡聚糖磷酸化酶亞基的分子量約是94,000Da。馬鈴薯塊莖來(lái)源α-葡聚糖磷酸化酶主要組分亞基的分子量約是104,000Da，而馬鈴薯塊莖來(lái)源α-葡聚糖磷酸化酶次要組分亞基的分子量約是94,000Da。特定α-葡聚糖磷酸化酶是L型還是H型可通過(guò)是否存在與78殘基的該氨基酸序列的同源區(qū)域來(lái)確定，而不需實(shí)際測(cè)定親和力。一般來(lái)說(shuō)，L型和H型的確定是通過(guò)綜合考慮多種特性如酶活性、分子量、底物特異性、酶定位、一級(jí)序列同源性和插入序列的存在性。因此，一般來(lái)說(shuō)，有些情況下L型和H型的邊界是不清楚的，但為了方便，在本發(fā)明中，α-葡聚糖磷酸化酶是L型還是H型可通過(guò)α-葡聚糖磷酸化酶中是否存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)確定。轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的特征在本領(lǐng)域已知。編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列是L型，而不編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列是H型。產(chǎn)生L型α-葡聚糖磷酸化酶的植物的實(shí)例包括馬鈴薯(也稱(chēng)愛(ài)爾蘭馬鈴薯)、甘薯、蠶豆、擬南芥、菠菜、玉米和水稻。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法的第一種(天然)α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選是H型α-葡聚糖磷酸化酶。產(chǎn)生H型α-葡聚糖磷酸化酶的植物的實(shí)例包括馬鈴薯、小麥、柑桔雜交栽培種、水稻、蠶豆、擬南芥和甘薯。來(lái)自馬鈴薯的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO1，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO2的第1位到第916位。來(lái)自甘薯的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO3，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO4的第1位到第912位。來(lái)自馬鈴薯的另一種天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO5，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO6的第1位到第893位。來(lái)自蠶豆的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO7，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO8的第1位到第939位。來(lái)自擬南芥的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO9，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO10的第1位到第962位。來(lái)自菠菜的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO11，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO12的第1位到第971位。來(lái)自玉米的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO13，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO14的第1位到第983位。來(lái)自水稻的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO15，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO16的第1位到第928位。來(lái)自水稻的另一種天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO17，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO18的第1位到第951位。來(lái)自小麥的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO19，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO20的第1位到第832位。來(lái)自柑桔雜交栽培種的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO21，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO22的第1位到第840位。來(lái)自水稻的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO23，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO24的第1位到第841位。來(lái)自蠶豆的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO25，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO26的第1位到第842位。來(lái)自擬南芥的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO27，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO28的第1位到第841位。來(lái)自馬鈴薯的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQIDNO29，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO30的第1位到第838位。來(lái)自甘薯的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶cDNA的部分序列表示于SEQIDNO31，由其編碼的氨基酸序列表示于SEQIDNO32。來(lái)自甘薯的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶cDNA的全序列可通過(guò)常規(guī)方法使用這個(gè)部分序列而獲得。用于本發(fā)明方法的第一種(天然)α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選來(lái)源于植物，并優(yōu)選來(lái)源于馬鈴薯、甘薯、蠶豆、擬南芥、菠菜、玉米、水稻、小麥或柑桔雜交栽培種，更優(yōu)選來(lái)源于馬鈴薯、甘薯、蠶豆、擬南芥、菠菜、玉米或水稻，最優(yōu)選來(lái)源于馬鈴薯。用于本發(fā)明方法的所述第一種(天然)α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選是L型α-葡聚糖磷酸化酶。用于本發(fā)明方法的所述第一種(天然)α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選是來(lái)源于馬鈴薯的L、L2或H型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于甘薯的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于蠶豆的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于擬南芥的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于菠菜的L型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于玉米的L型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于水稻的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于小麥的H型α-葡聚糖磷酸化酶，或來(lái)源于柑桔雜交栽培種的H型α-葡聚糖磷酸化酶；更優(yōu)選是來(lái)源于馬鈴薯的L或L2型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于甘薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于蠶豆的L型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于擬南芥的L型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于菠菜的L型α-葡聚糖磷酸化酶，來(lái)源于玉米的L型α-葡聚糖磷酸化酶，或來(lái)源于水稻的L型α-葡聚糖磷酸化酶；最優(yōu)選是來(lái)源于馬鈴薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶。在本說(shuō)明書(shū)中，“來(lái)源于”一種生物的酶不僅表示所述酶直接從所述生物分離，而且表示通過(guò)使用任意形式的所述生物而獲得的酶。例如，當(dāng)編碼從一種生物獲得的酶的基因引入大腸桿菌，并且隨后從大腸桿菌分離所表達(dá)酶時(shí)，所述酶被稱(chēng)為是“來(lái)源于”所述生物。例如，可用以下程序制備編碼來(lái)源于馬鈴薯的L型GP的基因。首先，如Takahaetal.(JournalofBiologicalChemistry，Vol.268，pp.1391-1396，1993)所述，使用公知的方法從馬鈴薯塊莖制備mRNA，并用商品試劑盒制備cDNA文庫(kù)等。然后，基于已知的GP基因序列(數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank登記號(hào)D00520)制備PCR引物，并用前述cDNA文庫(kù)作模板進(jìn)行PCR。例如，當(dāng)PCR引物15′AAATCGATAGGAGGAAAACATATGACCTTGAGTGAGAAAAT3’(SEQIDNO38)和PCR引物25′GAAGGTACCTTTTCATTCACTTCCCCCTC3′(SEQIDNO39)用作PCR引物時(shí)，在以下條件下可擴(kuò)增一種基因。進(jìn)行30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)，一個(gè)循環(huán)是94℃30秒、50℃1分鐘和72℃3分鐘。所述PCR引物1的下劃線部分對(duì)應(yīng)L型GP成熟蛋白N端區(qū)的結(jié)構(gòu)基因序列，而所述PCR引物2的下劃線部分對(duì)應(yīng)L型GP結(jié)構(gòu)基因終止密碼子即下游的堿基序列。作為替代方案，也可基于所述已知基因序列信息而直接經(jīng)化學(xué)合成制備GP基因，而不需制備cDNA文庫(kù)。例如，合成基因的方法描述于Te’o，etal.，(FEMSMicrologicalLetters，vol.190，pp.13-19，2000)。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將所得GP基因插入合適的載體。例如可以使用pMW118(NipponGeneCo.，Ltd.制造)、pUC18(TAKARABIO制造)、pKK233-2(Amersham-Pharmacia-Biotech制造)、pET3d(STRATAGENE制造)等作為用于大腸桿菌的載體，使用pUB110(可以從AmericanTypeCultureCollection購(gòu)買(mǎi))和pHY300PLK(TAKARABIO制造)等作為用于枯草桿菌的載體。例如，當(dāng)用PCR引物1和2擴(kuò)增基因時(shí)，可以通過(guò)將所擴(kuò)增基因插入預(yù)先用SmaI切割的質(zhì)粒pMW118選擇具有圖2所示序列的質(zhì)粒。這用于轉(zhuǎn)化，例如，大腸桿菌TG-1，然后選擇氨芐青霉素抗性株，并培養(yǎng)攜帶所得重組質(zhì)粒的菌株，通過(guò)提取質(zhì)?？梢垣@得GP基因。(2.提高α-葡聚糖磷酸化酶的耐熱性)根據(jù)本發(fā)明的方法包括修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的第一種核酸分子，以獲得含修飾堿基序列的第二種核酸分子；制備含所述第二種核酸分子的表達(dá)載體；將所述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，以表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，和回收所表達(dá)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶.(2.1分離含編碼第一種(天然)α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子)根據(jù)本發(fā)明含編碼耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子也在本發(fā)明范圍內(nèi)。基于本說(shuō)明書(shū)的公開(kāi)內(nèi)容，這樣的核酸分子可用本領(lǐng)域已知方法獲得。如上所述，含編碼天然α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子可以直接從產(chǎn)生天然存在α-葡聚糖磷酸化酶的植物中分離。例如，首先從馬鈴薯、擬南芥、菠菜等中分離天然α-葡聚糖磷酸化酶。為舉例說(shuō)明馬鈴薯來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶的程序，首先，1.4kg商品馬鈴薯塊莖去皮。所述已經(jīng)去皮的塊莖在榨汁機(jī)中搗碎得到糊狀流體。然后用儀器過(guò)濾此糊狀流體得到濾液。向?yàn)V液中加入Tris緩沖液(pH7.0)到終濃度100mM，得到酶溶液。此酶溶液進(jìn)而在55℃水浴加熱10分鐘，之后液體溫度達(dá)到50℃。加熱后此酶溶液用離心機(jī)(BECKMAN制造的AVANTIJ-25I)在8,500rpm離心20分鐘，以除去不溶性蛋白，并得到上清液。向上清液中加入硫酸銨至終濃度100g/L，4℃靜置2小時(shí)以沉淀蛋白。然后用離心機(jī)(BECKMAN制造的AVANTIJ-25I)在8,500rpm離心溶液20分鐘，以除去不溶性蛋白。再加入硫酸銨到所得上清液中至終濃度250g/L，并在4℃靜置2小時(shí)以沉淀蛋白。然后用離心機(jī)(BECKMAN制造的AVANTIJ-25I)在8,500rpm離心溶液20分鐘，以回收不溶性蛋白?；厥盏牟蝗苄缘鞍讘矣?50ml25mMTris緩沖液(pH7.0)。重懸的酶溶液對(duì)相同緩沖液透析過(guò)夜。透析后樣品吸附到已經(jīng)預(yù)先平衡的陰離子交換樹(shù)脂Q-Sepharose(Pharmacia制造)上，然后用含200mM氯化鈉的緩沖液洗滌。隨后用含400mM氯化鈉的緩沖液洗脫蛋白，并回收洗脫液，得到含部分純化的馬鈴薯塊莖來(lái)源葡聚糖磷酸化酶的溶液。取決于所購(gòu)買(mǎi)馬鈴薯，此階段獲得的含α-葡聚糖磷酸化酶溶液可用于胰酶處理，但在有些情況下需要進(jìn)一步純化。在這些情況下，如果必要，通過(guò)組合來(lái)自使用例如SephacrylS-200HR(Pharmacia制造)的凝膠過(guò)濾層析的組分和來(lái)自使用例如Phenyl-TOYOPEARL650M(TosohCorporation制造)的疏水層析的組分，可以獲得所述含純化馬鈴薯α-葡聚糖磷酸化酶的溶液?？上嗨频膹钠渌参镂锓N中純化α-葡聚糖磷酸化酶。用胰酶處理由此獲得的純化α-葡聚糖磷酸化酶，所得胰酶處理片段通過(guò)HPLC分離，用肽測(cè)序儀確定每個(gè)分離肽片段的N端氨基酸序列。然后用基于鑒定氨基酸序列而制備的合成寡核苷酸探針，篩選合適的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，從而獲得含編碼天然α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子(也稱(chēng)基因)。制備寡核苷酸探針和cDNA文庫(kù)以及通過(guò)核酸雜交篩選它們的基本策略對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如，見(jiàn)Sambrook，etal.，MolecularCloningAlaboratoryManual(1989)；DNACloning，vol.IandII(editedbyD.N.Glover，1985)；OligonucleotideSynthesis(editedbyM.J.Gait，1984)；NucleicAcidHybridization(editedbyB.D.Hames&S.J.Higgins，1984)。作為替代方案，基于與編碼α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列已知的某些α-葡聚糖磷酸化酶堿基序列的同源性，例如，用含至少部分該堿基序列的核酸探針通過(guò)雜交而篩選cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，從而獲得含另一種α-葡聚糖磷酸化酶堿基序列的核酸分子。這些方法在本領(lǐng)域已知。作為替代方案，制備簡(jiǎn)并引物，它們對(duì)應(yīng)于多種α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中的保守區(qū)域，并使用例如目標(biāo)物種的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)作模板進(jìn)行PCR，獲得來(lái)源于所述物種的α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列。這些方法在本領(lǐng)域已知。篩選基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)時(shí)，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法亞克隆所得核酸分子。例如通過(guò)混合含目標(biāo)基因的λ噬菌體、合適的大腸桿菌和合適的輔助噬菌體，可以容易的獲得含目標(biāo)基因的質(zhì)粒。而后，可以通過(guò)用含質(zhì)粒的溶液轉(zhuǎn)化合適的大腸桿菌來(lái)亞克隆目標(biāo)基因?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體，例如經(jīng)堿SDS方法獲得質(zhì)粒DNA，并確定目標(biāo)基因的堿基序列。確定堿基序列的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。進(jìn)而，通過(guò)使用基于DNA片段堿基序列合成的PCR引物，并使用馬鈴薯的基因組DNA或cDNA作模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，可以直接擴(kuò)增α-葡聚糖磷酸化酶基因。在本說(shuō)明書(shū)中，所述“核酸分子”可只由天然核苷酸組成，可以含有非天然核苷酸，或可以只由非天然核苷酸組成。非天然核苷酸的實(shí)例包括衍生核苷酸(也稱(chēng)核苷酸類(lèi)似物)。所述“衍生核苷酸”和所述“核苷酸類(lèi)似物”表示那些不同于天然存在核苷酸但與起源核苷酸具有相似功能的核苷酸。這些衍生核苷酸和核苷酸類(lèi)似物在本領(lǐng)域公知。這些衍生核苷酸和核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。(2.2修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的所述第一種核酸分子)修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的第一種核酸分子，獲得含修飾堿基序列的第二種核酸分子。第一種核酸分子可以是如上(2.1)獲得的含編碼天然α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子。所述第一種核酸分子也可以是含編碼α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子，其中所述α-葡聚糖磷酸化酶具有與天然α-葡聚糖磷酸化酶基本相同的酶活性，并且其中1個(gè)或幾個(gè)或更多氨基酸被替換、缺失或添加到編碼天然α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列中?！熬哂谢鞠嗤富钚浴北硎?，在與修飾前α-葡聚糖磷酸化酶相同條件下測(cè)定修飾后α-葡聚糖磷酸化酶時(shí)，酶活性范圍是修飾前α-葡聚糖磷酸化酶酶活性在+20％、優(yōu)選±10％、更優(yōu)選±5％的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)定點(diǎn)突變、用誘變劑突變(用致突變劑如亞硝酸鹽、紫外線處理受研究基因)或易錯(cuò)PCR進(jìn)行修飾。從容易獲得目標(biāo)突變的角度來(lái)看優(yōu)選使用定點(diǎn)突變，因?yàn)楫?dāng)使用定點(diǎn)突變時(shí)可在目標(biāo)位點(diǎn)引入目標(biāo)修飾。作為替代方案，可直接合成含目標(biāo)序列的核酸分子。這些化學(xué)合成方法在本領(lǐng)域公知。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在來(lái)源于植物的α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中特定位置用另一個(gè)氨基酸殘基替換氨基酸殘基，可提高所得α-葡聚糖磷酸化酶的耐熱性。這種特定位置可通過(guò)比對(duì)以下任意基序序列或SEQIDNO2的氨基酸序列、并比較受研究氨基酸序列而確定基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S(SEQIDNO44)或基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S(SEQIDNO45)，基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G(SEQIDNO46)，和基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V(SEQIDNO47)或基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V(SEQIDNO48)?；蛐蛄?L、2和3L存在于馬鈴薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列(SEQIDNO2)中。這些基序序列存在于馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的以下位置基序序列1LSEQIDNO2中氨基酸序列的第36位到第44位；基序序列2SEQIDNO2中氨基酸序列的第132位到第139位；基序序列3LSEQIDNO2中氨基酸序列的第700位到第708位?；蛐蛄?H、2和3H存在于水稻來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中。這些基序序列存在于水稻H型α-葡聚糖磷酸化酶的以下位置基序序列1HSEQIDNO24中氨基酸序列的第36位到第44位；基序序列2SEQIDNO24中氨基酸序列的第132位到第139位；基序序列3HSEQIDNO2中氨基酸序列的第625位到第633位。一般的，天然α-葡聚糖磷酸化酶具有這些基序序列或與它們高度同源的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的確定這些基序序列在其它植物來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶中的位置。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子，以得到由修飾核酸分子編碼的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。優(yōu)選的，修飾含編碼所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子，以得到由修飾核酸分子編碼的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列，與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶相比，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列在以下位置不同對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中對(duì)應(yīng)第39位苯丙氨酸(F39)的位置或?qū)?yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。如本說(shuō)明書(shū)所用，“對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置”表示，當(dāng)受研究氨基酸序列和SEQIDNO2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以使兩序列之間同源性最大時(shí)，如果必要可以在一個(gè)序列中插入間隙，與SEQIDNO2氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)匹配的位置。當(dāng)在SEQIDNO2中插入間隙時(shí)，當(dāng)計(jì)算氨基酸殘基數(shù)目時(shí)不計(jì)間隙。更優(yōu)選，以上短語(yǔ)表示當(dāng)SEQIDNO2氨基酸序列與受研究氨基酸序列在間隙罰分(GAPPenalty)(Peptide)條件下進(jìn)行比對(duì)時(shí)，與SEQIDNO2中第39位苯丙氨酸(F39)匹配的位置，其中所述比對(duì)條件是在GENETYX-WINVer.4.0的多重比對(duì)中，Insert＝-10，Extend＝-3，gapExtendontoppositionsetted(checked)，MatchModeLocalMatchusingascoretableofdefault。關(guān)于氨基酸的默認(rèn)記分表示于下表3。(表3)GENETYX-WINVer.4.0的多重比對(duì)基于以下算法。在這個(gè)比對(duì)程序中，所有可能的序列配對(duì)被比對(duì)，兩序列比對(duì)循環(huán)進(jìn)行(成對(duì)比對(duì))，并且其中具有高保守比例(成對(duì)比對(duì)中的評(píng)分)組合的序列被確定為共有序列，從共有序列產(chǎn)生假想序列(共有部分保持不變，同時(shí)對(duì)于非共有部分選擇所述序列的任意一個(gè))。用相同程序產(chǎn)生除了組成假想序列的序列以外的所有序列與假想序列之間的循環(huán)比較，直到產(chǎn)生最終的假想序列。此后，通過(guò)將有關(guān)用于產(chǎn)生所述假想序列的GAP插入和移位信息應(yīng)用到所述起始序列，以組成整體，從而完成多重比對(duì)。用于這種成對(duì)比對(duì)的計(jì)算公式如下。當(dāng)序列a和b每個(gè)分別具有序列長(zhǎng)度m或n時(shí)，各自序列表達(dá)為a＝a1a2a3...amb＝b1b2b3...bm，間隙罰分(GAPpenalty)g用以下方程表示-g＝s(ai，φ)＝a(φ，bj)，獲得比對(duì)記分的方程如下G(0，0)＝0G(i，0)＝i(-g)G(0，j)＝j(luò)(-g)-gk＝-[α+β(k-1)]E(i，j)＝{G(i-1，j)-α，E(i-1，j)-β}F(i，j)＝max{G(i，j-1)-α，F(xiàn)(i，j-1)-β}G(i，j)＝max{E(i，j)，G(i-1，j-1)+s(ai，bj)，F(xiàn)(i，j)}α是間隙插入罰分(GAPinsertionpenalty)，β是間隙延長(zhǎng)罰分(GAPextensionpenalty)。E、F和G是記分矩陣(scorematrix)，基于此，產(chǎn)生passmatrix。類(lèi)似的分析對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置。在GENETYX-WINVer.4.0的多重比對(duì)中，在前述條件下，SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28和SEQIDNO30與SEQIDNO2進(jìn)行比對(duì)。作為結(jié)果，苯丙氨酸或酪氨酸在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列的第39位苯丙氨酸(F39)的位置進(jìn)行比對(duì)，天冬酰胺在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列的第135位天冬酰胺(N135)的位置進(jìn)行比對(duì)，蘇氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列的第706位蘇氨酸(T706)的位置進(jìn)行比對(duì)。這種比對(duì)結(jié)果表示于圖1A到圖1I。在圖1A到圖1I中，“馬鈴薯L型”代表馬鈴薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO2)?！榜R鈴薯L2型”代表馬鈴薯來(lái)源的第二種L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO6)?！案适鞮型”代表甘薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO4)?！靶Q豆L型”代表蠶豆來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO8)?！皵M南芥L型”代表擬南芥來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO10)?！安げ薒型”代表菠菜來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO12)?！八綥型”代表水稻來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO16)?！八綥2型”代表水稻來(lái)源的第二種L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO18)?！坝衩譒型”代表玉米來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO14)?！榜R鈴薯H型”代表馬鈴薯來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO30)?！靶Q豆H型”代表蠶豆來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO26)?！皵M南芥H型”代表擬南芥來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO28)?！八綡型”代表水稻來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO24)?！靶←湣贝硇←渷?lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO20)?！案探跦型”代表柑桔雜交栽培種來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO22)。“E.coliMalQ”代表大腸桿菌來(lái)源的麥芽糊精磷酸化酶的氨基酸序列(SEQIDNO35)。麥芽糊精磷酸化酶是α-葡聚糖磷酸化酶的一種類(lèi)型。例如，在甘薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置是SEQIDNO4的氨基酸序列中第39位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置是SEQIDNO4的氨基酸序列中第135位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置是SEQIDNO4的氨基酸序列中第702位。例如，在馬鈴薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO6氨基酸序列中第11位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO6氨基酸序列中第107位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO6氨基酸序列中第683位。例如，在蠶豆來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO8氨基酸序列中第43位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO8氨基酸序列中第139位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO8氨基酸序列中第729位。例如，在擬南芥來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO10氨基酸序列中第106位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO10氨基酸序列中第202位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO10氨基酸序列中第752位。例如，在菠菜來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO12氨基酸序列中第112位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO12氨基酸序列中第208位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO12氨基酸序列中第761位。例如，在玉米來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO14氨基酸序列中第95位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO14氨基酸序列中第191位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO14氨基酸序列中第773位。例如，在水稻來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO16氨基酸序列中第41位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO16氨基酸序列中第137位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO16氨基酸序列中第718位。例如，在另一種水稻來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO18氨基酸序列中第91位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO18氨基酸序列中第187位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO18氨基酸序列中第741位。例如，在小麥來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO20氨基酸序列中第31位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO20氨基酸序列中第127位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO20氨基酸序列中第622位。例如，在柑桔雜交栽培種來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO22氨基酸序列中第42位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO22氨基酸序列中第138位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO22氨基酸序列中第630位。例如，在水稻來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO24氨基酸序列中第39位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO24氨基酸序列中第135位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO24氨基酸序列中第631位。例如，在蠶豆來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO26氨基酸序列中第43位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO26氨基酸序列中第139位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO26氨基酸序列中第632位。例如，在擬南芥來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO28氨基酸序列中第40位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO28氨基酸序列中第136位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO28氨基酸序列中第631位。例如，在馬鈴薯來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中F39的位置是SEQIDNO30氨基酸序列中第36位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中N135的位置是SEQIDNO30氨基酸序列中第133位，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中T706的位置是SEQIDNO30氨基酸序列中第628位。提高耐熱性的氨基酸殘基位置不僅可以通過(guò)與SEQIDNO2的916個(gè)氨基酸殘基序列比對(duì)來(lái)確定，而且可以通過(guò)與選自前述基序序列1L或1H、2、和3L或3H的一個(gè)或多個(gè)序列比對(duì)來(lái)確定。就目前已知的植物來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶進(jìn)行比對(duì)，不論是使用SEQIDNO2的情況下，還是使用基序序列1L或1H、2、和3L或3H的情況下，所確定的位置都是相同的。基序序列1L在L型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守，而基序序列1H在H型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守?？梢哉f(shuō)對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置是對(duì)應(yīng)基序序列1L或1H中第4位的位置?；蛐蛄?在L型和H型α-葡聚糖磷酸化酶中通常保守?？梢哉f(shuō)對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置是對(duì)應(yīng)基序序列2中第4位的位置?；蛐蛄?L在L型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守，而基序序列3H在H型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守?？梢哉f(shuō)對(duì)應(yīng)SEQIDNO2氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置是對(duì)應(yīng)基序序列3L或3H中第7位的位置。這樣，也可用所述基序序列指定提高耐熱性的氨基酸殘基位置。提高耐熱性的氨基酸殘基位置可以是選自下組的至少一個(gè)位置對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以說(shuō)含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的核酸分子被這樣修飾，使得由修飾核酸編碼的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。本說(shuō)明書(shū)中，所述“基序序列”表示在多種蛋白的氨基酸序列之間見(jiàn)到的、共有或高度保守的部分序列。一般的，所述基序序列在很多情況下具有特定功能，但在本說(shuō)明書(shū)中，甚至當(dāng)未確定具體功能時(shí)，只要所述序列在多種氨基酸序列之間保守，就稱(chēng)為基序序列?！盎蛐蛄?L中第4位”氨基酸殘基表示當(dāng)將所述基序序列1L的N端(左端)的氨基酸殘基當(dāng)作第1位時(shí)依次計(jì)數(shù)的第4位氨基酸殘基?！盎蛐蛄?H中第4位”、“基序序列2中第4位”、“基序序列3L中第7位”、“基序序列3H中第7位”等都與前相似。這些基序序列在植物α-葡聚糖磷酸化酶中通常非常保守。所述基序序列1L或1H和3L或3H在α-葡聚糖植物磷酸化酶中非常保守，但在來(lái)源于動(dòng)物、微生物等的α-葡聚糖磷酸化酶中不保守?；蛐蛄?在幾乎所有生物如植物、動(dòng)物和微生物的α-葡聚糖磷酸化酶中非常保守。所述基序序列2含有被認(rèn)為參與結(jié)合底物和結(jié)合吡哆醛-5’-磷酸的氨基酸殘基、并是活性必需區(qū)域的一部分，其中吡哆醛-5’-磷酸是輔酶?；蛐蛄?L和1H的位置和基序序列2的位置在圖1B中示出。基序序列3L和3H的位置在圖1G中示出。如此處所用，“對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置”表示當(dāng)在不插入間隙以使序列間同源性最大條件下，將受研究氨基酸序列和所述基序序列1L或所述基序序列1H進(jìn)行比對(duì)時(shí)，與所述基序序列1L或所述基序序列1H中第4位氨基酸殘基匹配的位置。更優(yōu)選的，它表示當(dāng)在無(wú)間隙條件下進(jìn)行GENETYX-WINVer.4.0(GeneticsCo.，Ltd.)的最大匹配時(shí)，與所述基序序列1L或所述基序序列1H中第4位氨基酸殘基匹配的位置。以相似方式來(lái)解釋對(duì)應(yīng)基序序列2中第4位的位置，和對(duì)應(yīng)基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3H中第7位的位置。GENETYX-WINVer.4.0的最大匹配如下考慮替換和缺失，待分析的序列數(shù)據(jù)和待比較的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，使得這些序列之間的氨基酸配對(duì)匹配最大，并因此分別對(duì)匹配(Matches)、錯(cuò)配(Mismatches)和間隙(Gaps)進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算總和，并輸出最低總和的比對(duì)結(jié)果(參考文獻(xiàn)Takashi，K.，andGotoh，O.1984.SequenceRelationshipsamongVarious4.5SRNASpeciesJ.Biochem.921173-1177)。優(yōu)選在Matches＝-1、Mismatches＝1、Gaps＝None、*N+＝2的條件下進(jìn)行比對(duì)。使用GENETYX-WINVer.4.0的最大匹配，馬鈴薯L型(SEQIDNO2)、甘薯L型(SEQIDNO4)、馬鈴薯第二種L型(SEQIDNO6)、蠶豆L型(SEQIDNO8)、擬南芥L型(SEQIDNO10)、菠菜L型(SEQIDNO12)、玉米L型(SEQIDNO14)、水稻L型(SEQIDNO16)、水稻第二種L型(SEQIDNO18)、小麥H型(SEQIDNO20)、柑桔雜交栽培種H型(SEQIDNO22)、水稻H型(SEQIDNO24)、蠶豆H型(SEQIDNO26)、擬南芥H型(SEQIDNO28)和馬鈴薯H型(SEQIDNO30)與基序序列1L或基序序列1H進(jìn)行比對(duì)。在Matches＝-1、Mismatches＝1、Gaps＝0、*N+＝2的條件下分析最大匹配。在GENETYX-WINVer.4.0的最大匹配中，在前述條件下，SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28和SEQIDNO30與每一種基序序列(基序序列1L、1H、2、3L或3H)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果，苯丙氨酸或酪氨酸與對(duì)應(yīng)基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1H中第4位的位置匹配，天冬酰胺與對(duì)應(yīng)基序序列2中第4位的位置匹配，而蘇氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸與對(duì)應(yīng)基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3H中第7位的位置匹配。所述基序序列1L、2和3L是SEQIDNO2的部分序列，而所述基序序列1H、2和3H是SEQIDNO24的部分序列。對(duì)于SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28和SEQIDNO30中的每一種，將使用SEQIDNO2全長(zhǎng)的比對(duì)結(jié)果和使用基序序列1L、1H、2、3L和3H的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果，在SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28和SEQIDNO30中的每一種中，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中第39位的位置和對(duì)應(yīng)所述基序序列1L或1H中第4位的位置相同；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中第135位的位置和對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置相同；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中第706位的位置和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L或3H中第7位的位置相同。這樣就證實(shí)甚至當(dāng)用基序序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，所指定位置與使用SEQIDNO2氨基酸序列時(shí)指定的位置相同。含修飾堿基序列的核酸分子位于本發(fā)明范圍內(nèi)，所述核酸分子通過(guò)修飾含編碼下面所示氨基酸序列的堿基序列的核酸分子而獲得序列表中的SEQIDNO2的第1位到第916位，SEQIDNO4的第1位到第912位，SEQIDNO6的第1位到第893位，SEQIDNO8的第1位到第939位，SEQIDNO10的第1位到第962位，SEQIDNO12的第1位到第971位，SEQIDNO14的第1位到第983位，SEQIDNO16的第1位到第928位，SEQIDNO18的第1位到第951位，SEQIDNO20的第1位到第832位，SEQIDNO22的第1位到第840位，SEQIDNO24的第1位到第841位，SEQIDNO26的第1位到第842位，SEQIDNO28的第1位到第841位，和SEQIDNO30的第1位到第838位。含修飾堿基序列的核酸分子位于本發(fā)明范圍內(nèi)，所述核酸分子通過(guò)修飾含下面給出的堿基序列的核酸分子而獲得序列表中的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27或SEQIDNO29。含修飾堿基序列的核酸分子位于本發(fā)明范圍內(nèi)，所述核酸分子通過(guò)修飾含編碼一定氨基酸序列的堿基序列的核酸分子而獲得，所述氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少50％一致性序列表中的SEQIDNO2的第1位到第916位，SEQIDNO4的第1位到第912位，SEQIDNO6的第1位到第893位，SEQIDNO8的第1位到第939位，SEQIDNO10的第1位到第962位，SEQIDNO12的第1位到第971位，SEQIDNO14的第1位到第983位，SEQIDNO16的第1位到第928位，SEQIDNO18的第1位到第951位，SEQIDNO20的第1位到第832位，SEQIDNO22的第1位到第840位，SEQIDNO24的第1位到第841位，SEQIDNO26的第1位到第842位，SEQIDNO28的第1位到第841位，和SEQIDNO30的第1位到第838位。在本發(fā)明中，序列如氨基酸序列和堿基序列的“一致性”表示兩序列之間出現(xiàn)相同氨基酸(當(dāng)比較堿基序列時(shí)為堿基)的程度。一致性的確定通常是通過(guò)比較兩種氨基酸序列或兩種堿基序列，并比較以最佳方式匹配的這兩種序列，其中可以含有插入或缺失。一致性百分率的計(jì)算是通過(guò)確定這兩種序列之間相同氨基酸(當(dāng)比較堿基序列時(shí)為堿基)位置的數(shù)目、將相同位置的數(shù)目除以比較位置的總數(shù)、并將所得結(jié)果乘以100而得到這兩種序列之間的一致性百分率。作為實(shí)例，用于獲得本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以與選自下組的氨基酸序列(即對(duì)照氨基酸序列)相同，也即100％一致SEQIDNO2的第1位到第916位，SEQIDNO4的第1位到第912位，SEQIDNO6的第1位到第893位，SEQIDNO8的第1位到第939位，SEQIDNO10的第1位到第962位，SEQIDNO12的第1位到第971位，SEQIDNO14的第1位到第983位，SEQIDNO16的第1位到第928位，SEQIDNO18的第1位到第951位，SEQIDNO20的第1位到第832位，SEQIDNO22的第1位到第840位，SEQIDNO24的第1位到第841位，SEQIDNO26的第1位到第842位，SEQIDNO28的第1位到第841位，和SEQIDNO30的第1位到第838位，或與對(duì)照氨基酸序列相比該氨基酸序列含有一個(gè)或多個(gè)改變氨基酸殘基。這些改變可以選自至少一個(gè)氨基酸的缺失、包括保守和非保守替換的替換、或插入。這種改變可以發(fā)生在對(duì)照氨基酸序列的氨基端或羧基端，或發(fā)生在這些末端以外的其它任意位置。氨基酸殘基改變可以與一個(gè)殘基分散分布，或幾個(gè)殘基可以連續(xù)。在本說(shuō)明書(shū)中，使用GENETYX-WINVer.4.0(GeneticsCo.，Ltd.)的最大匹配計(jì)算序列的一致性百分率。該程序比對(duì)待分析序列數(shù)據(jù)和待比較序列數(shù)據(jù)，使得序列間匹配的氨基酸對(duì)最多，同時(shí)還考慮替換和缺失，并因此得到匹配(Matches)、錯(cuò)配(Mismatches)和間隙(Gaps)的評(píng)分，計(jì)算總和，并輸出最小總和的比對(duì)結(jié)果，從而計(jì)算一致性百分率(參考文獻(xiàn)Takashi，K.，andGotoh，O.1984.SequenceRelationshipsamongVarious4.5SRNASpeciesJ.Biochem.921173-1177)。使用GENETYX-WINVer.4.0的最大匹配，計(jì)算馬鈴薯L型(SEQIDNO2)、甘薯L型(SEQIDNO4)、馬鈴薯另一種L型(SEQIDNO6)、蠶豆L型(SEQIDNO8)、擬南芥L型(SEQIDNO10)、菠菜L型(SEQIDNO12)、玉米L型(SEQIDNO14)、水稻L型(SEQIDNO16)、水稻第二種L型(SEQIDNO18)、小麥H型(SEQIDNO20)、柑桔雜交栽培種H型(SEQIDNO22)、水稻H型(SEQIDNO24)、蠶豆H型(SEQIDNO26)、擬南芥H型(SEQIDNO28)和馬鈴薯H型(SEQIDNO30)與馬鈴薯L型(SEQIDNO2)之間的一致性百分率，結(jié)果示于表4。在Matches＝-1、Mismatches＝1、Gaps＝1、*N+＝2的條件下分析最大匹配。表4含修飾堿基序列的核酸分子位于本發(fā)明范圍內(nèi)，所述核酸分子通過(guò)修飾在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由選自下組的堿基序列組成的核酸分子而獲得序列表中的SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27和SEQIDNO29。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易的選擇期望的α-葡聚糖磷酸化酶基因。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”表示這樣的條件，在此條件下序列與特異性序列雜交但不與非特異性序列雜交。適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)條件的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并描述于例如MolecularCloning(Sambrook，etal.，同上)。具體的，所述條件意味著使用所述條件可以鑒定多核苷酸，在此條件下，在一種溶液中用固定有來(lái)源于菌落或噬斑的DNA的濾膜在65℃進(jìn)行雜交，所述溶液含50％甲酰胺、5×SSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhart’s溶液(0.2％BSA、0.2％Ficoll400和0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭精DNA，并用0.1-2倍濃度的SSC(鹽水-檸檬酸鈉)溶液(一倍濃度的SSC溶液組成是150mMNaCl、15mM檸檬酸鈉)在65℃條件下洗滌濾膜。用于本發(fā)明方法的修飾核酸分子可以是相對(duì)于含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶堿基序列的核酸分子而被保守性修飾的核酸分子。所述“相對(duì)于含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶堿基序列的核酸分子而被保守性修飾的核酸分子”表示含編碼一定氨基酸序列的堿基序列的核酸分子，所述氨基酸序列與由編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列編碼的氨基酸序列相同或基本相同。所述“與由編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列編碼的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列”表示與第一種α-葡聚糖磷酸化酶具有基本相同酶活性的氨基酸序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，很多功能等價(jià)的堿基序列編碼指定的氨基酸序列。例如密碼子GCA、GCC、GCG和GCT都編碼丙氨酸。因此，在所有由GCA密碼子指定的丙氨酸位置上，密碼子可以換成GCC、GCG或GCT，不改變所編碼的丙氨酸。相似的，對(duì)于由多個(gè)密碼子編碼的氨基酸，在所有由一個(gè)密碼子指定的氨基酸位置，所述密碼子可以換成編碼所述氨基酸的任意另一個(gè)密碼子，而不改變所編碼具體氨基酸。堿基序列的這種變化是“沉默突變”，這是一種保守性改變的突變。本說(shuō)明書(shū)中的編碼多肽的所有堿基序列也包括所述核酸的所有可能的沉默改變。沉默突變包括其中編碼核酸(nuclearacid)不改變的“沉默替換”，和核酸原本不編碼氨基酸的情況。當(dāng)某種核酸編碼氨基酸時(shí)，沉默突變與沉默替換有相同含義。在本說(shuō)明書(shū)中，“沉默替換”表示在堿基序列中用編碼相同氨基酸的另一個(gè)堿基序列替換編碼一種氨基酸的堿基序列?；谶z傳密碼簡(jiǎn)并性的現(xiàn)象，在多種堿基序列編碼某種氨基酸(如甘氨酸)的情況下，這種沉默替換是可能的。因此，含由沉默替換產(chǎn)生的堿基序列編碼的氨基酸序列的多肽具有與原始多肽相同的氨基酸序列。因此，除了本發(fā)明針對(duì)的修飾(進(jìn)行替換使得所述α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L或1H中第4位的位置、對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置、對(duì)應(yīng)所述基序序列3L或3H中第7位的位置、或?qū)?yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置、對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置)以外，本發(fā)明所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以包括在堿基序列水平的沉默替換。在本領(lǐng)域中，可以理解核酸中的每個(gè)密碼子(不包括ATG和TGG，其中ATG是通常編碼甲硫氨酸的唯一一個(gè)密碼子，TGG是通常編碼色氨酸的唯一一個(gè)密碼子)可以修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個(gè)沉默突變也隱含在每種所述序列中。優(yōu)選的，可以進(jìn)行這些改變使得避免替換半胱氨酸，半胱氨酸是大大影響多肽構(gòu)象的氨基酸。可以改變編碼本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列，使得與將要導(dǎo)入序列供表達(dá)的生物體的密碼子使用偏好相一致。密碼子使用偏好反映所述生物中高表達(dá)基因的使用偏好。例如，當(dāng)意圖在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，可根據(jù)公開(kāi)的密碼子使用偏好表(如Sharp，etal.，NucleicAcidsResearch16，No.17，p.8207(1988))對(duì)所述序列進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)的優(yōu)化。(2.3制備表達(dá)載體)使用含上述修飾的堿基序列的核酸分子制備表達(dá)載體。使用特定核酸序列制備表達(dá)載體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中提及核酸分子時(shí)，“載體”表示可轉(zhuǎn)移目標(biāo)堿基序列到目標(biāo)細(xì)胞中的核酸分子。這些載體的實(shí)例包括可在目標(biāo)細(xì)胞中自主復(fù)制或可整合到目標(biāo)細(xì)胞染色體中、并在適于轉(zhuǎn)錄修飾堿基序列的位置有啟動(dòng)子的載體。在本說(shuō)明書(shū)中，所述載體可以是質(zhì)粒。如此處所用，所述“表達(dá)載體”表示可在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)修飾堿基序列(即編碼修飾的α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列)的載體。除了修飾堿基序列以外，表達(dá)載體還含有多種調(diào)節(jié)元件如調(diào)節(jié)表達(dá)的啟動(dòng)子，如果必要，還含有在目標(biāo)細(xì)胞中復(fù)制和選擇重組體所必需的因子(如復(fù)制起點(diǎn)(ori)和諸如藥物抗性基因的選擇標(biāo)記)。在表達(dá)載體中，修飾的堿基序列可操作的連接，使得它可以被轉(zhuǎn)錄和翻譯。調(diào)節(jié)元件包括啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子。此外，當(dāng)意圖將表達(dá)酶分泌到細(xì)胞外時(shí)，編碼分泌信號(hào)肽的堿基序列以正確的讀碼框連接到修飾的堿基序列上游。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，用于導(dǎo)入特定生物(如細(xì)菌)中的表達(dá)載體類(lèi)型和用于所述表達(dá)載體的調(diào)節(jié)元件和其它因子的種類(lèi)都可以根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞而改變。如此處所用，所述“終止子”是位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)域下游的序列，參與將堿基序列轉(zhuǎn)錄成mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程的終止，參與添加多聚A序列。已知所述終止子在mRNA穩(wěn)定性方面影響基因表達(dá)水平。如此處所用，所述“啟動(dòng)子”表示DNA上確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄頻率的區(qū)域，同時(shí)還是結(jié)合RNA聚合酶并因此啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的堿基序列。因?yàn)樵谟肈NA分析軟件預(yù)測(cè)基因組堿基序列中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域時(shí)，在很多情況下啟動(dòng)子區(qū)域通常是推斷的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域上游約2kbp或更近的區(qū)域，啟動(dòng)子區(qū)域是可以推斷的。推斷性啟動(dòng)子區(qū)域隨每個(gè)結(jié)構(gòu)基因而變化，并通常非限制性的位于結(jié)構(gòu)基因上游，還可以在結(jié)構(gòu)基因下游。推斷性啟動(dòng)子區(qū)域優(yōu)選位于第一個(gè)外顯子翻譯起始位點(diǎn)上游約2kbp或更近。如此處所用，所述“增強(qiáng)子”可用于增強(qiáng)目標(biāo)基因的表達(dá)效率。這樣的增強(qiáng)子在本領(lǐng)域公知?？梢允褂枚喾N增強(qiáng)子，但只可以使用一種，或可以完全不用。如此處所用，“可操作的連接”表示將期望堿基序列放置于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)或?qū)崿F(xiàn)表達(dá)的翻譯調(diào)節(jié)序列(即操作)的控制之下。為了使啟動(dòng)子與基因可操作的連接，通常將啟動(dòng)子置于所述基因的即上游，但不必要將啟動(dòng)子置于與所述基因臨近的位置。為了將修飾核酸序列與前述調(diào)節(jié)元件可操作的連接，在有些情況下要加工目標(biāo)α-葡聚糖磷酸化酶基因。實(shí)例包括啟動(dòng)子和編碼區(qū)之間距離太長(zhǎng)而預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)錄效率降低的情況、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間距離不合適的情況等。所述加工含義的實(shí)例包括用限制酶消化、用核酸外切酶如Bal31和ExoIII消化或用單鏈DNA如M13或PCR引入定點(diǎn)突變。(2.4耐熱性α-葡聚糖磷酸化酶的表達(dá))然后，將如上述制備的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，因而表達(dá)耐熱性α-葡聚糖磷酸化酶。在本說(shuō)明書(shū)中，酶的“表達(dá)”指編碼所述酶的堿基序列在體內(nèi)或體外的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及所編碼酶的生成。導(dǎo)入表達(dá)載體的細(xì)胞(也稱(chēng)為宿主)包括原核和真核細(xì)胞。考慮多種條件如表達(dá)α-葡聚糖磷酸化酶的難易、培養(yǎng)的難易、生長(zhǎng)速率和安全性，可以容易的選擇導(dǎo)入表達(dá)載體的細(xì)胞。例如當(dāng)使用α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)合成高分子量直鏈淀粉時(shí)，因?yàn)閮?yōu)選α-葡聚糖磷酸化酶不含淀粉酶污染，優(yōu)選使用不產(chǎn)生淀粉酶或僅產(chǎn)生低水平淀粉酶的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞的實(shí)例包括微生物，如細(xì)菌和真菌。更優(yōu)選的細(xì)胞的實(shí)例包括中溫性微生物(例如大腸桿菌、枯草桿菌)。在本說(shuō)明書(shū)中，所述“中溫性微生物”是具有正常溫度環(huán)境生長(zhǎng)溫度的微生物，具體指最佳生長(zhǎng)溫度20℃-40℃的微生物。細(xì)胞可以是如微生物細(xì)胞，或可以是植物或動(dòng)物細(xì)胞。依賴(lài)于待用細(xì)胞，本發(fā)明的酶可以是經(jīng)歷翻譯后加工的酶。植物包括但不限于雙子葉植物，和單子葉植物如水稻、小麥、大麥和玉米。谷類(lèi)如水稻具有在種子中積累儲(chǔ)藏蛋白的性質(zhì)，使用儲(chǔ)藏蛋白系統(tǒng)，可以表達(dá)所述谷類(lèi)使得本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在種子中積累(見(jiàn)日本特開(kāi)平公開(kāi)No.2002-58492的說(shuō)明書(shū))。在本發(fā)明方法中，將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中的技術(shù)可以是本領(lǐng)域已知的任一種技術(shù)。這種技術(shù)的實(shí)例例如包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染。這種導(dǎo)入核酸分子的技術(shù)在本領(lǐng)域公知，并且是常規(guī)技術(shù)，例如描述于AusubelF.A.，etal.ed.(1988)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Wiley，NewYork，NY；SambrookJ，etal.(1987)MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，和BessatsuJikkenkagaku“Idenshidounyu&Hatsugenkaisekijikkenhou”，Yodosha，1997。當(dāng)使用植物細(xì)胞作為細(xì)胞時(shí)，使轉(zhuǎn)化體重新分化成組織或植物的方法在本領(lǐng)域公知。這種方法的實(shí)例描述如下Rogers，etal.，MethodsinEnzymology118627-640(1986)；Tabata，etal.，PlantCellPhysiol.，2873-82(1987)；Shaw，PlantMolecularBiologyAPracticalApproach.IRLpress(1988)；Shimamoto，etal.，Nature338274(1989)；和Maliga，etal.，MethodsinPlantMolecularBiologyALaboratorycourse.ColdSpringHarborLaboratoryPress(1995)。轉(zhuǎn)化木本植物的方法描述于MolecularBiologyofWoodyPlants(Vol.I，II)(ed.S.MohanJain，SubhashC.Minocha)，KluwerAcademicPublishers，(2000)。此外，轉(zhuǎn)化木本植物的方法例如詳細(xì)描述于PlantCellReports(1999)19106-110。因此，根據(jù)目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)氖褂们笆龉椒ㄊ罐D(zhuǎn)化體重新分化。目標(biāo)基因?qū)肴绱怂棉D(zhuǎn)基因植物，并且可以用已知方法如Northern印跡和Western印跡分析或其它公知常規(guī)技術(shù)確認(rèn)基因的導(dǎo)入。通過(guò)培養(yǎng)已導(dǎo)入表達(dá)載體并獲得表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶能力的細(xì)胞(也稱(chēng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞)，可以在細(xì)胞中表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的條件可根據(jù)待使用宿主細(xì)胞種類(lèi)和表達(dá)載體中表達(dá)調(diào)節(jié)因子的種類(lèi)適當(dāng)選擇。例如，通常使用振蕩培養(yǎng)方法。不具有限定用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基，只要所使用細(xì)胞生長(zhǎng)并能表達(dá)目標(biāo)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶即可。除了碳源和氮源以外，如果必要可在培養(yǎng)基中單獨(dú)或適當(dāng)混合使用無(wú)機(jī)鹽如磷酸鹽、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Na+、K+等。此外，如果必要，可以添加培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞或表達(dá)目標(biāo)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶所必需的多種無(wú)機(jī)物或有機(jī)物。可以選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)溫度使得適于生長(zhǎng)待使用轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通常，溫度在15℃-60℃之間。使連續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的時(shí)間足以表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。當(dāng)使用帶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體時(shí)，可通過(guò)加入誘導(dǎo)劑、改變培養(yǎng)溫度和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來(lái)控制表達(dá)。例如，當(dāng)使用帶乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)載體時(shí)，可通過(guò)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。(2.5回收耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶)然后可以回收所表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。例如，當(dāng)在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中生成所表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶時(shí)，通過(guò)離心或過(guò)濾培養(yǎng)物從轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物中回收細(xì)胞。所回收細(xì)胞懸于合適緩沖液中，并用常規(guī)方法(超聲、Frenchpress、溶菌酶處理)破碎而獲得粗酶液。進(jìn)而，通過(guò)用適當(dāng)組合的常規(guī)酶純化方法如離心、層析、膜分離、電泳和鹽析來(lái)純化所述粗酶液，從而獲得粗酶液或具有更高比活性的純化酶。當(dāng)不含水解葡聚糖的酶如α-淀粉酶時(shí)，可以直接使用粗酶，例如用于制備高分子量葡聚糖。通過(guò)如上述生產(chǎn)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，可以相當(dāng)大的提高天然α-葡聚糖磷酸化酶的耐熱性。此外，所表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以利用這種耐熱性簡(jiǎn)單純化。簡(jiǎn)單的說(shuō)，通過(guò)在約60℃熱處理含耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的細(xì)胞提取物，使污染酶不再溶解。通過(guò)離心所述不溶物而除去它們，并進(jìn)行透析處理，從而獲得純化的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。(3.耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶)通過(guò)前述方法獲得的本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置。，除了這些位置上的氨基酸替換以外，本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶還可以含有相對(duì)于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，，本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶含有下述氨基酸序列，其中相對(duì)于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，并在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置。本發(fā)明的所述酶是通過(guò)修飾植物來(lái)源的天然α-葡聚糖磷酸化酶而獲得的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，含有下述氨基酸序列，其中相對(duì)于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替換或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，并在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置。優(yōu)選本發(fā)明的酶在選自下組的至少兩個(gè)位置具有不同于天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置。最優(yōu)選本發(fā)明的酶在以下所有位置具有不同于天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置。天然α-葡聚糖磷酸化酶的前述三個(gè)位置被認(rèn)為在α-葡聚糖磷酸化酶立體結(jié)構(gòu)中與周?chē)被嵯嗷プ饔眯纬闪Ⅲw的部分結(jié)構(gòu)，使所述酶去穩(wěn)定化。通過(guò)將這些位置的殘基改變成另一個(gè)氨基酸殘基，酶被穩(wěn)定化，并且耐熱性提高。此外，因?yàn)檫@些位置的殘基在立體結(jié)構(gòu)上與周?chē)被釟埢嗷プ饔?，替換所述氨基酸殘基具有意料之外重要的顯著影響。例如，對(duì)于馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶，用其它殘基替換F39位置的F具有意料之外重要的顯著結(jié)果。此外，例如，對(duì)于馬鈴薯來(lái)源H型α-葡聚糖磷酸化酶，對(duì)應(yīng)F39位置的氨基酸是Y，用其它氨基酸替換Y具有意料之外重要的顯著影響。根據(jù)本發(fā)明的所述酶中，對(duì)應(yīng)所述基序序列1L或1H中第4位或F39位置的氨基酸殘基可以是天然α-葡聚糖磷酸化酶中所發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基以外的氨基酸。對(duì)應(yīng)所述基序序列1L或1H中第4位或F39位置的氨基酸殘基優(yōu)選是脂肪族氨基酸或雜環(huán)氨基酸，更優(yōu)選是脂肪族氨基酸，特別優(yōu)選支鏈氨基酸(即纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)，尤其優(yōu)選異亮氨酸或亮氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。根據(jù)本發(fā)明的所述酶中，對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位或N135位置的氨基酸殘基可以是天然α-葡聚糖磷酸化酶中所發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基以外的氨基酸。對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位或N135位置的氨基酸殘基優(yōu)選是脂肪族氨基酸或雜環(huán)氨基酸，更優(yōu)選是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或酪氨酸，特別優(yōu)選半胱氨酸、甘氨酸、絲氨酸或纈氨酸。根據(jù)本發(fā)明的所述酶中，對(duì)應(yīng)所述基序序列3L或3H中第7位或T706位置的氨基酸殘基可以是天然α-葡聚糖磷酸化酶中所發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基以外的氨基酸。對(duì)應(yīng)所述基序序列3L或3H中第7位或T706位置的氨基酸殘基優(yōu)選是脂肪族氨基酸，更優(yōu)選是支鏈氨基酸(即纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)或含硫氨基酸(即半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸)，特別優(yōu)選半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或色氨酸，特別優(yōu)選半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，最優(yōu)選異亮氨酸。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，為制備耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，除了本發(fā)明目的的改變以外(這種替換使得α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第706位蘇氨酸(T706)的位置)還可以進(jìn)行氨基酸替換、添加、缺失或修飾。氨基酸替換表示用一種氨基酸替換另一種氨基酸。氨基酸添加表示在原氨基酸序列的任意位置插入一個(gè)或更多，例如1-10個(gè)、優(yōu)選1-5個(gè)、更優(yōu)選1-3個(gè)氨基酸。氨基酸缺失表示從原氨基酸序列的任意位置去除一個(gè)或更多，例如1-10個(gè)、優(yōu)選1-5個(gè)、更優(yōu)選1-3個(gè)氨基酸。氨基酸修飾的實(shí)例包括但不限于酰胺化、羧化、硫酸化、鹵化、烷基化、糖基化、磷酸化、羥化和?；?如乙酰化)。本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以通過(guò)肽合成方法合成，在這種情況下待替換或添加的氨基酸可以是天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸類(lèi)似物。優(yōu)選天然氨基酸。本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以是具有α-葡聚糖磷酸化酶相同酶活性的酶類(lèi)似物。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“酶類(lèi)似物”表示一種實(shí)體，它是與天然酶不同的化合物(compound)，但在至少一種化學(xué)功能或生物學(xué)功能上與天然酶等價(jià)。因此，所述酶類(lèi)似物包括相對(duì)于起始天然酶添加或替換一個(gè)或更多個(gè)氨基酸類(lèi)似物的實(shí)體。所述酶類(lèi)似物具有這樣的添加或替換，使得它的功能(如α-酸化酶活性或耐熱性)與起始天然酶的功能基本相同或更好。這樣的酶類(lèi)似物可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備。因此，所述酶類(lèi)似物可以是含氨基酸類(lèi)似物的聚合物。在本說(shuō)明書(shū)中，除非另外說(shuō)明，所述“酶”包括這種酶類(lèi)似物。在本說(shuō)明書(shū)中，所述“氨基酸”可以是天然氨基酸、非天然氨基酸、衍生氨基酸或氨基酸類(lèi)似物。優(yōu)選天然氨基酸。術(shù)語(yǔ)“天然氨基酸”指天然氨基酸的L-異構(gòu)體。天然氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-羧基谷氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸和賴(lài)氨酸。除非另外說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)提及的氨基酸是L-構(gòu)型，同時(shí)使用D-構(gòu)型氨基酸的實(shí)施方案也在本發(fā)明范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“非天然氨基酸”表示通常在天然蛋白中不被發(fā)現(xiàn)的氨基酸。非天然氨基酸的實(shí)例包括正亮氨酸、對(duì)-硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、對(duì)-氟苯丙氨酸、3-氨基-2-苯甲基丙酸、D-構(gòu)型或N構(gòu)型高精氨酸，以及D-苯丙氨酸。術(shù)語(yǔ)“衍生氨基酸”表示通過(guò)衍生化氨基酸而獲得的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“氨基酸類(lèi)似物”表示不是氨基酸、但在物理性質(zhì)和/或功能上與氨基酸相似的分子。氨基酸類(lèi)似物的實(shí)例例如包括乙硫氨酸、刀豆氨酸和2-甲基谷氨酰胺。在本說(shuō)明書(shū)中，氨基酸可以用IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission推薦的任意公知三字母符號(hào)和單字母符號(hào)表示。與之相似，核苷酸可以用一般接受的單字母代碼表示。除了所述目的性修飾以外，耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶還可以包括相對(duì)于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言一個(gè)或幾個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失引起的修飾，這樣的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶也在本發(fā)明范圍內(nèi)。包括一個(gè)或幾個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失的這種耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶例如可以根據(jù)描述于下文的方法制備MolecualrCloning，ALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Supplement1-38，JohnWiley&Sons(1987-1997)，NucleicAcidsResearch，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，NucleicAcidsResearch13，443(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，5662(1984)，Science，224，1431(1984)，PCTWO85/00817(1985)，Nature，316，601(1985)。根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可用本領(lǐng)域公知的方法制備。例如，根據(jù)本發(fā)明的所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶中氨基酸的缺失、替換或添加可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行。定點(diǎn)突變程序在本領(lǐng)域公知。例如，見(jiàn)Nucl.AcidResearch，Vol.10，pp.6487-6500(1982)。在本說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)用于耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶時(shí)，所述“一個(gè)或幾個(gè)或更多個(gè)氨基酸的替換、添加或缺失”或所述“至少一個(gè)氨基酸的替換、添加或缺失”表示一定數(shù)目的替換、添加或缺失，這種改變程度使α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性不喪失，優(yōu)選所述酶活性與標(biāo)準(zhǔn)品(如天然α-葡聚糖磷酸化酶)等價(jià)或超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的選擇具有期望性質(zhì)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。另外，目標(biāo)性耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以直接化學(xué)合成。這種化學(xué)合成方法在本領(lǐng)域公知。由此制備的本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選與第一種(天然)α-葡聚糖磷酸化酶(優(yōu)選馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶)的氨基酸序列具有約40％、更優(yōu)選約45％、更優(yōu)選約50％、更優(yōu)選約55％、更優(yōu)選約60％、更優(yōu)選約65％、更優(yōu)選約70％、更優(yōu)選約75％、更優(yōu)選約80％、更優(yōu)選約85％、更優(yōu)選約90％、更優(yōu)選約95％和最更優(yōu)選約99％一致性。設(shè)計(jì)前述改變時(shí)，可以考慮氨基酸的疏水性指數(shù)。賦予蛋白質(zhì)相互作用性生物功能的疏水性氨基酸指數(shù)顯著性在本領(lǐng)域公知(Kyte.JandDoolittle，R.F.J.Mol.Biol.157(1)105-132，1982)。氨基酸的疏水性對(duì)所產(chǎn)生蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)，并限定所述蛋白質(zhì)和其它分子(如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等)之間的相互作用?；谑杷院蛶щ娦再|(zhì)，氨基酸被指定一個(gè)疏水性指數(shù)。它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴(lài)氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域公知用具有相似疏水性指數(shù)的另一種氨基酸替換某種氨基酸，從而可以產(chǎn)生仍然具有相似生物功能的蛋白質(zhì)(如酶活性等價(jià)的蛋白質(zhì))。在這種氨基酸替換中，疏水性指數(shù)優(yōu)選在±2以內(nèi)，更優(yōu)選在±1以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選在±0.5以內(nèi)。本領(lǐng)域中可以理解基于疏水性的這種氨基酸替換是有效率的。如USPNo.4,554,101中描述，給氨基酸殘基指定以下親水性指數(shù)精氨酸(+3.0)；賴(lài)氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)?？梢岳斫?，氨基酸可以用具有相似親水性指數(shù)的另一種氨基酸替換，且仍然能是生物學(xué)等價(jià)的。在這種氨基酸替換中，所述親水性指數(shù)優(yōu)選在±2以內(nèi)，更優(yōu)選在±1以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選在±0.5以內(nèi)。本發(fā)明中，“保守性替換”表示在氨基酸替換中起始氨基酸和待替換氨基酸之間如上述的親水性指數(shù)或/和疏水性指數(shù)相似的替換。保守性替換的實(shí)例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并包括但不限于以下每組中間的替換，例如精氨酸和賴(lài)氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。(3.2評(píng)價(jià)耐熱性的方法)本發(fā)明所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶有一種特性，在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘以后，耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘以后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的優(yōu)選約20％或更多，更優(yōu)選約25％或更多，更優(yōu)選約30％或更多，更優(yōu)選約40％或更多，更優(yōu)選約50％或更多，更優(yōu)選約55％或更多，更優(yōu)選約60％或更多，進(jìn)一步優(yōu)選約65％或更多，進(jìn)一步優(yōu)選約70％或更多，特別優(yōu)選約80％或更多，最優(yōu)選約90％或更多。在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中65℃加熱2分鐘以后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的優(yōu)選約40％或更多，更優(yōu)選約45％或更多，進(jìn)一步優(yōu)選約50％或更多，進(jìn)一步優(yōu)選約55％或更多，特別優(yōu)選約60％或更多，最優(yōu)選約65％或更多。(3.2.1測(cè)定α-葡聚糖磷酸化酶(GP)活性的方法)這種測(cè)定GP酶活性的方法定量由G-1-P產(chǎn)生的游離無(wú)機(jī)磷酸(Pi)。(i)200μl反應(yīng)液(含12.5mMG-1-P、1％糊精和酶溶液的100mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0))在37℃保溫15分鐘。(ii)加入800μl鉬試劑(15mM鉬酸銨，100mM乙酸鋅)，攪拌以終止反應(yīng)。(iii)加入200μl568mM抗壞血酸(pH5.8)，然后混合。(iv)37℃保溫15分鐘后，用分光光度計(jì)測(cè)定850nm吸光度。(v)相似的用已知濃度的無(wú)機(jī)磷酸測(cè)定吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(vi)由樣品獲得的吸光度值擬合到此標(biāo)準(zhǔn)曲線上，并由此確定樣品中無(wú)機(jī)磷酸量。無(wú)機(jī)磷酸作為磷酸離子定量。未定量葡萄糖-1-磷酸的量。在本說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)用這種測(cè)定方法測(cè)定時(shí)，1單位α-葡聚糖磷酸化酶活性定義如下1分鐘產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷酸(Pi)的活性定義作1單位(U)。(3.2.2測(cè)定耐熱性的方法)根據(jù)以下程序測(cè)定耐熱性。(i)0.2U/ml酶溶液(在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中)在55℃、60℃或65℃保溫0到60分鐘。(ii)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取酶溶液樣品，并保持在冰上。(iii)步驟(ii)中的酶溶液樣品稀釋10倍，根據(jù)GP活性測(cè)定方法測(cè)定酶活性。使用(Aafter)/(Abefore)×100％，計(jì)算在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性Aafter與加熱前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性Abefore的比值。加熱后耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶酶活性Aafter相對(duì)于加熱前耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶酶活性Abefore的比值也稱(chēng)為剩余活性。(3.3評(píng)價(jià)合成直鏈淀粉能力的方法)本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶具有一種特性，它具有合成葡聚糖(尤其是直鏈淀粉)的能力，所述葡聚糖的重均分子量?jī)?yōu)選是約60kDa或更高，更優(yōu)選約100kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約150kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約200kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約250kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約300kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約350kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約400kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約450kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約500kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約550kDa或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約600kDa或更高，最優(yōu)選約650kDa或更高。重均分子量約5kDa到約599kDa的葡聚糖幾乎不溶于水，而重均分子量約600kDa或更高的葡聚糖有可溶于水的特別優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶合成葡聚糖的重均分子量沒(méi)有具體上限，但可以極高生產(chǎn)率合成最高為1000kDa、最高為10000kDa、最高為100000kDa的葡聚糖。所述“合成重均分子量為60kDa或更高的直鏈淀粉的能力”表示當(dāng)通過(guò)使用40μM麥芽四糖、250mM葡萄糖-1-磷酸、200mM乙酸鹽緩沖液(pH5.5)和4U/ml耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶(純化酶)反應(yīng)液在37保溫18小時(shí)合成直鏈淀粉時(shí)，其重均分子量是60kDa或更高。類(lèi)似的定義合成具有其它重均分子量直鏈淀粉的能力，例如，“合成重均分子量為600kDa或更高的直鏈淀粉的能力”表示當(dāng)在此條件下合成直鏈淀粉時(shí)，其重均分子量是600kDa或更高。例如可以通過(guò)以下方法測(cè)定直鏈淀粉的重均分子量。首先，將所合成直鏈淀粉完全溶解于1N氫氧化鈉，用適量鹽酸中和，使用差示折光計(jì)和多角光散射檢測(cè)器將一小份約30-300μg的直鏈淀粉進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，從而獲得平均分子量。更具體的，使用ShodexSB806M-HQ(SHOWADENKOK.K.制造)作為柱子，使用依次連接的多角光散射檢測(cè)器(DAWN-DSP，WyattTechnology制造)和差示折光計(jì)(ShodexRI-71，SHOWADENKOK.K.制造)作為檢測(cè)器。柱子保持在40℃，并使用0.1M硝酸鈉溶液以1mL/min流速作為洗脫劑。用數(shù)據(jù)分析軟件(商品名ASTRA，WyattTechnology制造)收集所得信號(hào)，并用相同軟件分析，從而得到重均分子量。(3.4評(píng)價(jià)保存穩(wěn)定性的方法)與天然α-葡聚糖磷酸化酶比較，根據(jù)本發(fā)明的所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選具有更高保存穩(wěn)定性。在本說(shuō)明書(shū)中，所述“保存穩(wěn)定性更高”表示與天然α-葡聚糖磷酸化酶比較所述酶幾乎不被降解的情況。在一個(gè)實(shí)施方案中，保存穩(wěn)定性表示當(dāng)保存在4℃時(shí)的穩(wěn)定性。在此情況下，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶純化后在4℃保存一段時(shí)間時(shí)，所述酶蛋白的分子量幾乎等于純化后即刻的分子量。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)天然α-葡聚糖磷酸化酶在4℃長(zhǎng)期保存時(shí)會(huì)降解，與純化后即刻比較酶蛋白的分子量降低。本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選在4℃保存1個(gè)月、更優(yōu)選在4℃保存3個(gè)月、最優(yōu)選在4℃保存5個(gè)月后，它具有與純化后即刻大致相等的分子量。另一方面，保存穩(wěn)定性表示保存在37℃時(shí)的穩(wěn)定性。在此情況下，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶純化后在37℃保存一段時(shí)間時(shí)，所述酶蛋白的分子量與純化后即刻的分子量大致相等。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)天然α-葡聚糖磷酸化酶在37℃長(zhǎng)期保存時(shí)會(huì)降解，并且與純化后即刻比較酶蛋白的分子量降低。另一方面，本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選在37℃保存4天、更優(yōu)選在37℃保存7天、最優(yōu)選在37℃保存10天后，它具有與純化后即刻大致相等的分子量。當(dāng)然，本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以保存在正常用于保存的任意溫度。用于保存的溫度可以是約4℃到約37℃之間的任意溫度(如約4℃、約5℃、約10℃、約20℃、約25℃、約37℃等)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任意方法評(píng)價(jià)保存穩(wěn)定性。例如，純化后即刻的酶蛋白和已在預(yù)定溫度保存一段時(shí)間的酶蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)，并通過(guò)比較這些酶蛋白的分子量評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。(4.用本發(fā)明的酶制備葡聚糖的方法)本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可有利地用于合成葡聚糖的方法。用本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶合成葡聚糖的方法可以是本領(lǐng)域已知的合成葡聚糖的任意方法。但本發(fā)明的α-葡聚糖磷酸化酶優(yōu)選用于同時(shí)用蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶使蔗糖和引發(fā)劑反應(yīng)的方法(也稱(chēng)SP-GP方法)中。所述SP-GP方法具有可使用廉價(jià)底物生產(chǎn)線性葡聚糖的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明合成葡聚糖的方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有本發(fā)明的所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑，和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸。本發(fā)明合成葡聚糖的方法可以是不基于SP-GP方法的方法。在這種方法的情況下，本發(fā)明合成葡聚糖的方法包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有本發(fā)明的所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、引發(fā)劑和葡萄糖-1-磷酸。在本說(shuō)明書(shū)中，所述“葡聚糖”表示一種糖，其中含D-葡萄糖作為組成單元，并具有以α-1，4-糖苷鍵連接的至少兩個(gè)糖單元或更多個(gè)糖單元。葡聚糖可以是線性、支鏈或環(huán)狀分子。線性葡聚糖與α-1，4-葡聚糖有相同含義。在線性葡聚糖中，糖單元之間只用α-1，4-糖苷鍵連接。含有一個(gè)或更多α-1，6-糖苷鍵的葡聚糖是支鏈葡聚糖。某種程度上葡聚糖優(yōu)選含有線性節(jié)段。無(wú)分支的線性葡聚糖較為優(yōu)選。某些情況下葡聚糖優(yōu)選具有小數(shù)目的(即α-1，6-糖苷鍵的數(shù)目)分支。這種情況下，分支數(shù)目代表性的是0-10000，優(yōu)選0-1000，更優(yōu)選0-500，進(jìn)一步優(yōu)選0-100，進(jìn)一步優(yōu)選0-50，進(jìn)一步優(yōu)選0-25，進(jìn)一步優(yōu)選0。本發(fā)明的葡聚糖中，將α-1，6-糖苷鍵當(dāng)作1，α-1，4-糖苷鍵數(shù)目相對(duì)于α-1，6-糖苷鍵數(shù)目的比值優(yōu)選是1-10000，更優(yōu)選2-5000，進(jìn)一步優(yōu)選5-1000，進(jìn)一步優(yōu)選10-500。α-1，6-糖苷鍵可以隨機(jī)分布于葡聚糖中，也可以均勻分布。分布程度使得在葡聚糖中優(yōu)選形成5個(gè)或更多糖單元的線性部分。葡聚糖可以只由D-葡聚糖構(gòu)成，或可以是一定程度修飾的衍生物，這種修飾程度使這種葡聚糖的性質(zhì)不變差。所述葡聚糖優(yōu)選不修飾。葡聚糖的代表性分子量是約8×103或更高，優(yōu)選約1×104或更高，更優(yōu)選約5×104或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約1×105或更高，進(jìn)一步優(yōu)選約6×105或更高。葡聚糖的代表性分子量是約1×108或更低，優(yōu)選約3×107或更低，更優(yōu)選約1×107或更低，進(jìn)一步優(yōu)選約5×106或更低，進(jìn)一步優(yōu)選約1×106或更低。在本發(fā)明中，除非另外說(shuō)明，葡聚糖的分子量指重均分子量。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，通過(guò)適當(dāng)選擇用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的底物量、酶量、反應(yīng)時(shí)間等可以獲得具有期望分子量的葡聚糖。具有極佳生產(chǎn)率的SP-GP法描述于國(guó)際公開(kāi)WO02/097107小冊(cè)子。在本發(fā)明生產(chǎn)方法中，例如，耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑、無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸、緩沖劑和溶解它的溶劑被用作主要材料。通常這些材料在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)全部加入，其中的任何材料還可以在反應(yīng)過(guò)程中加入。在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，如果必要，可以使用選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶。根據(jù)葡聚糖的期望結(jié)構(gòu)，可以在本發(fā)明生產(chǎn)方法開(kāi)始時(shí)或在反應(yīng)中途將選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶加入反應(yīng)溶液中。在本說(shuō)明書(shū)中，所述“蔗糖磷酸化酶”表示將蔗糖的α-糖苷基轉(zhuǎn)移到磷酸基上以進(jìn)行磷酸解作用的任何酶。由蔗糖磷酸化酶催化的反應(yīng)由以下方程式表示自然界中多種生物含有蔗糖磷酸化酶。產(chǎn)生蔗糖磷酸化酶的實(shí)例包括但不限于鏈球菌屬的細(xì)菌(如嗜熱鏈球菌、轉(zhuǎn)糖鏈球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌)、腸膜明串珠菌、假單胞菌屬、梭菌屬、Pullulariapullulans、木醋桿菌、農(nóng)桿菌屬、Synecococcussp.、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌、青春雙歧桿菌、黑曲霉、鏈孢霉、Sclerotineaescerotiorum和衣藻。蔗糖磷酸化酶可以來(lái)源于產(chǎn)生蔗糖磷酸化酶的任何生物。蔗糖磷酸化酶優(yōu)選具有一定程度的耐熱性。更優(yōu)選當(dāng)蔗糖磷酸化酶單獨(dú)存在時(shí)具有更高耐熱性。例如在存在4％蔗糖下在55℃加熱蔗糖磷酸化酶30分鐘時(shí)，優(yōu)選保留加熱前蔗糖磷酸化酶活性的20％或更多。蔗糖磷酸化酶優(yōu)選來(lái)源于選自轉(zhuǎn)糖鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸膜明串珠菌、酒類(lèi)酒球菌、長(zhǎng)雙岐桿菌、葡萄土壤桿菌、嗜糖假單胞桿菌、大腸桿菌和無(wú)害利斯特氏菌的細(xì)菌，更優(yōu)選可以來(lái)源于選自轉(zhuǎn)糖鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸膜明串珠菌和酒類(lèi)酒球菌的細(xì)菌，進(jìn)一步優(yōu)選可以來(lái)源于轉(zhuǎn)糖鏈球菌或肺炎鏈球菌。蔗糖是分子量約342的二糖，用C12H22O11表示。蔗糖存在于具有光合作用能力的所有植物中。蔗糖可以從植物中分離，或可以化學(xué)合成。從成本觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選從植物分離蔗糖。含大量蔗糖的植物的實(shí)例包括甘蔗和甜菜。甘蔗汁含約20％蔗糖。甜菜汁含約10-15％蔗糖?？梢栽趶暮崽堑闹参镆夯蛑郊兓崽堑娜我饧兓A段提供蔗糖。用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶和蔗糖磷酸化酶可分別用于反應(yīng)，甚至當(dāng)固定化時(shí)也是如此，而無(wú)論是純化酶還是粗酶，并且反應(yīng)形式可以是批次形式或連續(xù)形式。作為固定化方法，可以使用載體結(jié)合方法(如共價(jià)結(jié)合方法、離子結(jié)合方法或物理吸附方法)、交聯(lián)方法或包合方法(格形式或微膠囊形式)。引發(fā)劑的實(shí)例包括低聚麥芽糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、糊精、普魯分支葡聚糖、偶聯(lián)糖、淀粉，及其衍生物。在本說(shuō)明書(shū)中，無(wú)機(jī)磷酸指SP反應(yīng)中能提供磷酸根底物的物質(zhì)。在本說(shuō)明書(shū)中，磷酸根底物表示用作葡萄糖-1-磷酸的磷酸部分原材料的物質(zhì)。人們認(rèn)為，在由蔗糖磷酸化酶催化的蔗糖磷酸解中，無(wú)機(jī)磷酸以磷酸根離子形式起底物作用。因?yàn)檫@種底物一般在本領(lǐng)域稱(chēng)為無(wú)機(jī)磷酸，在本說(shuō)明書(shū)中這種底物也被稱(chēng)為無(wú)機(jī)磷酸。無(wú)計(jì)磷酸包括磷酸和磷酸的無(wú)機(jī)鹽。通常，無(wú)機(jī)磷酸在含陽(yáng)離子如堿金屬離子的水中使用。在此情況下，因?yàn)榱姿?、磷酸鹽和磷酸根離子處于平衡狀態(tài)，不可能區(qū)分磷酸和磷酸鹽。因此，為了方便，磷酸和磷酸鹽通稱(chēng)無(wú)機(jī)磷酸。在本發(fā)明中，無(wú)機(jī)磷酸優(yōu)選是磷酸的的任意金屬鹽，更優(yōu)選是磷酸的堿金屬鹽。無(wú)機(jī)磷酸的優(yōu)選具體實(shí)例包括磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀、磷酸(H3PO4)、磷酸二氫銨和磷酸氫二銨。SP-GP反應(yīng)體系中在反應(yīng)起始時(shí)可以含有僅一種或多種無(wú)機(jī)磷酸。例如可以通過(guò)物理、化學(xué)或酶促反應(yīng)降解磷酸縮合物如多磷酸(如焦磷酸、三磷酸和四磷酸)或其鹽、并將此加入反應(yīng)液中來(lái)提供無(wú)機(jī)磷酸。在本說(shuō)明書(shū)中，葡萄糖-1-磷酸指葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其鹽。葡萄糖-1-磷酸優(yōu)選是狹義葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任意金屬鹽，更優(yōu)選是葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任意堿金屬鹽。葡萄糖-1-磷酸的優(yōu)選具體實(shí)例包括葡萄糖-1-磷酸二鈉、葡萄糖-1-磷酸二鉀和葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)。在本說(shuō)明書(shū)中，沒(méi)有在括號(hào)內(nèi)標(biāo)出化學(xué)式的葡萄糖-1-磷酸表示廣義的葡萄糖-1-磷酸，即狹義葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其鹽。SP-GP反應(yīng)體系中在反應(yīng)起始時(shí)可以含有僅一種或多種葡萄糖-1-磷酸。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)葡聚糖的方法中，當(dāng)在產(chǎn)物中產(chǎn)生分支時(shí)，如當(dāng)使用含α-1，6-糖苷鍵的起始材料時(shí)，如果必要可使用脫支酶?？捎糜诒景l(fā)明的脫支酶是能切割α-1，6-糖苷鍵的酶。脫支酶分成兩類(lèi)，良好作用于支鏈淀粉和糖原的異淀粉酶(EC3.2.1.68)，和作用于支鏈淀粉、糖原和普魯分支葡聚糖的α-糊精內(nèi)-1，6-α-糖苷酶(也稱(chēng)支鏈淀粉酶(pullulanase))(EC3.2.1.41)。脫支酶存在于微生物、細(xì)菌和植物中。產(chǎn)生脫支酶的微生物實(shí)例包括釀酒酵母菌和衣藻屬物種。產(chǎn)生脫支酶的細(xì)菌實(shí)例包括短芽孢桿菌、Bacillusacidopullulyticus、浸麻芽孢桿菌(Bacillusmacerans)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、環(huán)狀芽孢桿菌、水生棲熱菌(Thermusaquaticus)、肺炎克雷伯氏菌、嗜溫高溫放線菌(Thermoactinomycesthalpophilus)、Thermoanaerobacterethanolicus和Pseudomonasamyloderamosa。產(chǎn)生脫支酶的植物實(shí)例包括馬鈴薯、甘薯、玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥和甜菜。產(chǎn)生脫支酶的生物不限于以上實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明的方法中，當(dāng)希望在產(chǎn)物中產(chǎn)生分支時(shí)，如果必要可使用分支酶?？捎糜诒景l(fā)明的分支酶是可轉(zhuǎn)移一部分α-1，4-葡聚糖鏈到該α-1，4-葡聚糖鏈的某個(gè)葡萄糖殘基上的第6位從而形成分支的酶。分支酶也稱(chēng)1，4-α-葡聚糖分支酶、分支產(chǎn)生酶或Q酶。分支酶存在于微生物、動(dòng)物和植物中。產(chǎn)生分支酶的微生物實(shí)例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熱容芽孢桿菌(Bacilluscaldolyticus)、Bacilluslichecniformis、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、Bacilluscaldovelox、Bacillusthermocatenulatus、Bacillussmithii、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短芽孢桿菌、AlkalophilicBacillussp.、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、Aquifexaeolicus、藍(lán)藻物種(Synechosystissp.)、大腸桿菌、根癌土壤桿菌、水生棲熱菌、Rhodothermusobamensis、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)和酵母。產(chǎn)生分支酶的動(dòng)物的實(shí)例包括諸如人、兔、大鼠和豬的哺乳動(dòng)物。產(chǎn)生分支酶的植物實(shí)例包括藻類(lèi)；塊莖和根作物如馬鈴薯、甘薯、薯蕷和木薯；蔬菜如菠菜；谷類(lèi)如玉米、水稻、小麥、大麥、黑麥和粟；與豆類(lèi)如豌豆、大豆、赤豆和雜色菜豆。產(chǎn)生分支酶的生物不限于以上實(shí)例。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，當(dāng)在產(chǎn)物中產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，如果必要可以使用4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶?？捎糜诒景l(fā)明的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶也稱(chēng)歧化酶、D-酶或淀粉麥芽糖酶，是可催化低聚麥芽糖的糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)(歧化反應(yīng))的酶。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是將葡萄糖基團(tuán)或麥芽糖基或低聚麥芽糖基單元從供體分子的非還原端轉(zhuǎn)移到受體分子的非還原端的酶。因此酶反應(yīng)導(dǎo)致最初給定的低聚麥芽糖的聚合程度歧化。當(dāng)供體分子和受體分子相同時(shí)，引起分子內(nèi)轉(zhuǎn)移，并因而得到有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶存在于微生物和植物中。產(chǎn)生4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的微生物實(shí)例包括Aquifexaeolicus、肺炎鏈球菌、丁酸桿菌(Clostridiumbutylicum)、耐輻射奇異球菌(Deinococcusradiodurans)、流感嗜血桿菌、結(jié)核分枝桿菌、Thermococcuslitralis、海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)、Thermotoganeapolitana、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)、熱球菌屬物種(Pyrococcussp.)、嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、藍(lán)藻、大腸桿菌和水生棲熱菌。產(chǎn)生4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的植物實(shí)例包括塊莖和根作物如馬鈴薯、甘薯、薯蕷和木薯；谷類(lèi)如玉米、水稻和小麥；與豆類(lèi)如豌豆和大豆。產(chǎn)生4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的生物不限于以上實(shí)例。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，當(dāng)在產(chǎn)物中產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，如果必要可以使用糖原脫支酶?？捎糜诒景l(fā)明的糖原脫支酶是具有兩種活性的酶，即α-1，6-糖苷酶活性和4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性。由于糖原脫支酶具有4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性，而獲得具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。糖原脫支酶存在于微生物和動(dòng)物。產(chǎn)生糖原脫支酶的微生物實(shí)例包括酵母。產(chǎn)生糖原脫支酶的動(dòng)物實(shí)例包括哺乳動(dòng)物如人、兔、大鼠和豬。產(chǎn)生糖原脫支酶的生物不限于以上實(shí)例。用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的溶劑可以是任何溶劑，只要它不破壞蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性。只要產(chǎn)生葡聚糖的反應(yīng)可以發(fā)生，溶劑就不必要完全溶解用于根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)方法的物質(zhì)。例如，當(dāng)酶由固相載體攜帶時(shí)，酶不必要溶于溶劑。進(jìn)而，不必所有反應(yīng)物質(zhì)如蔗糖都溶解，只要部分物質(zhì)的溶解程度可使反應(yīng)進(jìn)行就足夠了。代表性的溶劑是水。溶劑可以是細(xì)胞裂解液中的水，在制備蔗糖磷酸化酶或α-葡聚糖磷酸化酶時(shí)同時(shí)伴隨蔗糖磷酸化酶或α-葡聚糖磷酸化酶。在含有α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑、和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸的溶液中，還可以含有任何其它物質(zhì)，只要不阻礙所述蔗糖磷酸化酶和蔗糖之間相互作用以及所述α-葡聚糖磷酸化酶與所述引發(fā)劑之間相互作用即可。這種物質(zhì)的實(shí)例包括緩沖劑、產(chǎn)生α-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如細(xì)菌、真菌)成分、產(chǎn)生蔗糖磷酸化酶的微生物(如細(xì)菌、真菌)成分、鹽和培養(yǎng)基成分。待使用的這些物質(zhì)的量是已知的，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。在根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，首先制備反應(yīng)溶液。例如，可通過(guò)向合適溶劑中加入α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、固體蔗糖、引發(fā)劑、和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸來(lái)制備反應(yīng)溶液。另外，可通過(guò)混合分別含有α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑、或無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸的溶液來(lái)制備反應(yīng)溶液。作為替代方案，可通過(guò)將其它固體成分與含有α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑、和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸中一些成分的溶液混合來(lái)制備反應(yīng)溶液。如果必要，為調(diào)節(jié)pH的目的，可以向此反應(yīng)溶液中加入任何緩沖劑，只要它不抑制酶反應(yīng)即可。如果必要，可以向此反應(yīng)溶液中加入選自脫支酶、分支酶、4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和糖原脫支酶的酶。如果必要，然后通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法加熱反應(yīng)溶液以使之反應(yīng)。只要得到本發(fā)明的效果，反應(yīng)溫度可以是任何溫度。當(dāng)反應(yīng)起始時(shí)反應(yīng)溶液中的蔗糖濃度是約5％到約100％時(shí)，代表性的反應(yīng)溫度可以是約30℃到約75℃。優(yōu)選的是，在此反應(yīng)步驟中的溶液溫度應(yīng)使得預(yù)定反應(yīng)時(shí)間后此反應(yīng)溶液中所含蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶中至少一種、優(yōu)選兩種酶活性保持反應(yīng)前活性的約20％或更高，更優(yōu)選約30％或更高。這種溫度優(yōu)選是約55℃到約75℃，更優(yōu)選約60℃到約75℃，進(jìn)一步優(yōu)選約60℃到約70℃，特別優(yōu)選約60℃到約65℃。考慮到反應(yīng)溫度、反應(yīng)產(chǎn)生葡聚糖的分子量和剩余酶活性，反應(yīng)時(shí)間可以設(shè)定為任何時(shí)間。代表性反應(yīng)時(shí)間是約1小時(shí)到約100小時(shí)，更優(yōu)選約1小時(shí)到約72小時(shí)，進(jìn)一步更優(yōu)選約2小時(shí)到約36小時(shí)，最優(yōu)選約2小時(shí)到約24小時(shí)。以此方式，生產(chǎn)含葡聚糖的溶液。(5.用根據(jù)本發(fā)明的酶合成葡萄糖-1-磷酸的方法)本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶也可以優(yōu)選用于合成葡萄糖-1-磷酸的方法。使用根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶合成葡萄糖-1-磷酸的方法可以是本領(lǐng)域已知合成葡萄糖-1-磷酸的任何方法。本發(fā)明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使含有本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸的反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)，以產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸。用于根據(jù)本發(fā)明合成葡萄糖-1-磷酸的方法中葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸的定義與前述4中的相同。待用于合成葡萄糖-1-磷酸方法中的物質(zhì)的量已知，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇。在根據(jù)本發(fā)明合成葡萄糖-1-磷酸方法中首先制備反應(yīng)溶液。例如，可通過(guò)向合適溶劑中加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸來(lái)制備反應(yīng)溶液。作為替代方案，可通過(guò)混合分別含有α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖或無(wú)機(jī)磷酸的溶液來(lái)制備反應(yīng)溶液。作為替代方案，可通過(guò)將其它固體成分與含α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸中一些成分的溶液混合來(lái)制備反應(yīng)溶液。如果必要，為調(diào)節(jié)pH的目的，可以向此反應(yīng)溶液中加入任何緩沖劑，只要它不抑制酶反應(yīng)即可。如果必要，可以向此反應(yīng)溶液中加入脫支酶。然后，如果必要，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法加熱反應(yīng)溶液以使之反應(yīng)。只要得到本發(fā)明的效果，反應(yīng)溫度可以是任何溫度。代表性的反應(yīng)溫度可以是約30℃到約75℃。優(yōu)選的是，此反應(yīng)步驟中的溶液溫度應(yīng)使得預(yù)定反應(yīng)時(shí)間后此反應(yīng)溶液中所含α-葡聚糖磷酸化酶活性保持反應(yīng)前活性的約20％或更高，更優(yōu)選約30％或更高。這種溫度優(yōu)選是約55℃到約75℃，更優(yōu)選約60℃到約75℃，進(jìn)一步優(yōu)選約60℃到約70℃，特別優(yōu)選約60℃到約65℃?？紤]到反應(yīng)溫度和剩余酶活性，反應(yīng)時(shí)間可以設(shè)定為任何時(shí)間。代表性反應(yīng)時(shí)間是約1小時(shí)到約100小時(shí)，更優(yōu)選約1小時(shí)到約72小時(shí)，進(jìn)一步更優(yōu)選約2小時(shí)到約36小時(shí)，最優(yōu)選約2小時(shí)到約24小時(shí)。以此方式，生產(chǎn)含葡萄糖-1-磷酸的溶液。(6.使用根據(jù)本發(fā)明酶的其它生產(chǎn)方法)除了前述生產(chǎn)方法以外，本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可用于使用α-葡聚糖磷酸化酶的本領(lǐng)域已知的任何生產(chǎn)方法。在這些生產(chǎn)方法中使用本發(fā)明耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可容易的由本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施。(7.通過(guò)本發(fā)明生產(chǎn)方法獲得的葡聚糖的用途)通過(guò)本發(fā)明生產(chǎn)方法獲得的葡聚糖可用于本領(lǐng)域已知的葡聚糖用途。葡聚糖中，尤其是不溶性直鏈淀粉中，預(yù)測(cè)具有與膳食纖維相同的功能，并預(yù)計(jì)可用于健康食品。另外，因?yàn)橹辨湹矸劬哂欣缒茉诜肿又邪系饣蛑舅岬奶匦?，可以預(yù)計(jì)在藥物、化妝品或衛(wèi)生產(chǎn)品領(lǐng)域的用途。直鏈淀粉能用作生產(chǎn)具有與直鏈淀粉相同包合能力的環(huán)糊精和環(huán)狀淀粉(cycloamylose)的原材料。另外，含直鏈淀粉的膜具有與通用塑料相當(dāng)?shù)目箯垙?qiáng)度，因而是非常有前景的生物降解塑料的材料。以此方式，可以預(yù)計(jì)直鏈淀粉的很多用途。(8.通過(guò)本發(fā)明合成方法獲得的葡萄糖-1-磷酸的用途)根據(jù)本發(fā)明合成方法獲得的葡萄糖-1-磷酸可用于本領(lǐng)域已知的葡萄糖-1-磷酸用途。葡萄糖-1-磷酸用作醫(yī)用抗菌藥、抗腫瘤藥(作為鉑絡(luò)合物)、治療心臟病的藥物(作為胺鹽)或合成葡聚糖的底物。將基于實(shí)施例在下面解釋本發(fā)明，但提供實(shí)施例的目的只是為了舉例說(shuō)明。因此，本發(fā)明的范圍不受前述本發(fā)明詳細(xì)解釋和以下實(shí)施例的限制，而僅受權(quán)利要求書(shū)限制。實(shí)施例(1.測(cè)定方法和計(jì)算方法)根據(jù)以下測(cè)定方法測(cè)定本發(fā)明中的各種物質(zhì)。(1.1定量葡萄糖)用商品化測(cè)定試劑盒定量葡萄糖。用葡萄糖AR-II顯色試劑(由WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)測(cè)定葡萄糖。(1.2定量果糖)用商品化測(cè)定試劑盒定量果糖。用F-kit，D-glucose/D-fructose(Roche制造)測(cè)定果糖。(1.3定量葡萄糖-1-磷酸)用以下方法定量葡萄糖-1-磷酸。向300μl測(cè)定試劑(200mMTris-HCl(pH7.0)，3mMNADP，15mM氯化鎂，3mMEDTA，15μM葡萄糖-1，6-二磷酸，6μg/ml葡萄糖磷酸變位酶，6μg/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)中加入600μl含適當(dāng)稀釋葡萄糖-1-磷酸的溶液，攪拌，所得反應(yīng)混合物在37℃反應(yīng)30分鐘。此后，用分光光度計(jì)測(cè)定340nm吸光度。相似的測(cè)定已知濃度的葡萄糖-1-磷酸鈉鹽的吸光度，以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將由樣品獲得的吸光度值擬合到此標(biāo)準(zhǔn)曲線上，并由此確定樣品中葡萄糖-1-磷酸濃度。通常，在1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol葡萄糖-1-磷酸的活性定義為1單位。在此定量方法中，只定量葡萄糖-1-磷酸，而不定量無(wú)機(jī)磷酸的量。(1.4定量無(wú)機(jī)磷酸)用以下方法獲得磷酸根離子形式的無(wú)機(jī)磷酸。向含無(wú)機(jī)磷酸的溶液(200μl)中混合800μl鉬試劑(15mM鉬酸銨，100mM乙酸鋅)，隨后加入200μl568mM抗壞血酸(pH5.0)，攪拌，所得反應(yīng)混合物在37℃反應(yīng)30分鐘。此后，用分光光度計(jì)測(cè)定850nm吸光度。相似的測(cè)定已知濃度的無(wú)機(jī)磷酸的吸光度，以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將由樣品獲得的吸光度值擬合到此標(biāo)準(zhǔn)曲線上，并由此確定樣品中無(wú)機(jī)磷酸的測(cè)定值。在此定量方法中，定量無(wú)機(jī)磷酸的量，而不定量葡萄糖-1-磷酸的量。(1.5由葡萄糖-1-磷酸產(chǎn)生葡聚糖產(chǎn)率的計(jì)算方法)通過(guò)以下公式，從反應(yīng)終止后溶液中無(wú)機(jī)磷酸和葡萄糖的量得到不用蔗糖磷酸化酶、用α-葡聚糖磷酸化酶和作為起始材料的葡萄糖-1-磷酸產(chǎn)生葡聚糖(如直鏈淀粉)的產(chǎn)率。(葡聚糖產(chǎn)率(％))＝(用于葡聚糖合成的葡萄糖(mM))÷(初始葡萄糖-1-磷酸(mM))×100＝{(反應(yīng)產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷酸(mM))-(反應(yīng)后葡萄糖(mM))}÷(初始葡萄糖-1-磷酸(mM))×100(1.6由蔗糖產(chǎn)生葡聚糖產(chǎn)量的計(jì)算方法)用以下公式，從反應(yīng)終止后溶液中葡萄糖、果糖和葡萄糖-1-磷酸的量得到SP-GP方法中用無(wú)機(jī)磷酸作為起始物產(chǎn)生葡聚糖(如直鏈淀粉)的產(chǎn)量。葡聚糖(mM葡萄糖當(dāng)量)＝(果糖(mM)-(葡萄糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))此公式基于以下原理。在本發(fā)明生產(chǎn)方法中，首先可以發(fā)生根據(jù)以下方程式的反應(yīng)(A)。(A)蔗糖+無(wú)機(jī)磷酸→葡萄糖-1-磷酸+果糖此反應(yīng)由蔗糖磷酸化酶催化。在此反應(yīng)中，蔗糖和無(wú)機(jī)磷酸反應(yīng)生成等摩爾量的葡萄糖-1-磷酸和果糖。因?yàn)樗霉遣辉倥c其它物質(zhì)反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定果糖的摩爾量可知所生成葡萄糖-1-磷酸的摩爾量。除了前述反應(yīng)(A)以外，作為副反應(yīng)，蔗糖磷酸化酶可以催化以下反應(yīng)(B)中蔗糖水解。(B)蔗糖→葡萄糖+果糖摻入葡聚糖中的葡萄糖量可如下計(jì)算。摻入葡聚糖中的葡萄糖量＝(反應(yīng)(A)生成的葡萄糖-1-磷酸量)-(未反應(yīng)葡萄糖-1-磷酸量)＝(反應(yīng)(A)生成的果糖量)-(未反應(yīng)葡萄糖-1-磷酸量)考慮到反應(yīng)(B)生成的果糖，如下計(jì)算反應(yīng)(A)生成的果糖量反應(yīng)(A)生成的果糖量＝(反應(yīng)終止后的果糖量)-(反應(yīng)終止后的葡萄糖量)因此，由以下公式得到葡聚糖的產(chǎn)量。(葡聚糖(mM葡萄糖當(dāng)量))＝(果糖(mM)-(葡萄糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))由以下公式，從起始葡萄糖-1-磷酸量以及反應(yīng)終止后溶液中葡萄糖、果糖和葡萄糖-1-磷酸量得到用葡萄糖-1-磷酸作為起始材料生成的葡聚糖產(chǎn)量。(葡聚糖(mM葡萄糖當(dāng)量))＝(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM)-(葡萄糖(mM))-(反應(yīng)后葡萄糖-1-磷酸(mM))此公式基于以下原理。在反應(yīng)溶液中，除了起始葡萄糖-1-磷酸，還由反應(yīng)(A)產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸。也就是說(shuō)，起始葡萄糖-1-磷酸和生成的葡萄糖-1-磷酸可用于葡聚糖合成。通過(guò)從可用于葡聚糖合成的葡萄糖-1-磷酸量中減去反應(yīng)終止后反應(yīng)溶液中剩余的葡萄糖-1-磷酸量，可以計(jì)算用于反應(yīng)的葡萄糖-1-磷酸量，即摻入葡聚糖中的葡萄糖量。因此，可用前述公式得到摻入葡聚糖中的葡萄糖量。當(dāng)在SP-GP反應(yīng)體系中一起使用無(wú)機(jī)磷酸和葡萄糖-1-磷酸作為起始材料時(shí)也可應(yīng)用此公式。(1.7由蔗糖產(chǎn)生的葡聚糖產(chǎn)率的計(jì)算方法)當(dāng)用無(wú)機(jī)磷酸作為起始材料時(shí)生成的葡聚糖產(chǎn)率可用以下公式得到。(葡聚糖產(chǎn)率(％))＝(葡聚糖(mM葡萄糖當(dāng)量))/(起始蔗糖(mM))×100當(dāng)用葡萄糖-1-磷酸作為起始材料時(shí)生成的葡聚糖產(chǎn)率可用以下公式得到。(葡聚糖產(chǎn)率(％))＝{(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM))-(反應(yīng)后葡萄糖-1-磷酸(mM))}÷{(起始蔗糖(mM))+(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))}×100當(dāng)在SP-GP反應(yīng)體系中一起使用無(wú)機(jī)磷酸和葡萄糖-1-磷酸作為起始材料時(shí)此公式也適用。(實(shí)施例1馬鈴薯耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的制備、篩選和測(cè)序)簡(jiǎn)單概括的說(shuō)，向馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶基因中引入隨機(jī)突變，將帶有隨機(jī)突變的基因?qū)氪竽c桿菌，表達(dá)帶隨機(jī)突變的α-葡聚糖磷酸化酶，并從表達(dá)α-葡聚糖磷酸化酶的大腸桿菌中，選擇所表達(dá)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在60℃加熱10分鐘后能夠合成葡聚糖的大腸桿菌，從該大腸桿菌中分離耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的基因，并確定其序列。細(xì)節(jié)如下。首先，制備馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶(GP)基因。根據(jù)Takaha等人(JournalofBiologicalChemistry，vol.268，pp.1391-1396，1993)所述，用公知方法從馬鈴薯塊莖制備mRNA，并用商品試劑盒制備cDNA文庫(kù)。然后，基于已知GP基因序列(數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank登記號(hào)D00520)，設(shè)計(jì)PCR引物1和PCR引物2。利用前述cDNA文庫(kù)作模板，并用如下PCR引物1和2，PCR引物15′AAATCGATAGGAGGAAAACATATGACCTTGAGTGAGAAAAT3’(SEQIDNO38)和PCR引物25′GAAGGTACCTTTTCATTCACTTCCCCCTC3′(SEQIDNO39)，進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增馬鈴薯來(lái)源GP的基因。PCR條件是30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，一個(gè)循環(huán)是94℃30秒、50℃1分鐘和72℃3分鐘。PCR引物1的下劃線部分對(duì)應(yīng)L型GP成熟蛋白N端區(qū)的結(jié)構(gòu)基因序列，而PCR引物2的下劃線部分對(duì)應(yīng)L型GP結(jié)構(gòu)基因終止密碼子即下游的堿基序列。擴(kuò)增的GP基因插入預(yù)先用SmaI切割的質(zhì)粒pMW118(由NipponGeneCo.Ltd.制造)中，并選擇具有如圖2序列的質(zhì)粒。用磷酸鈣沉淀方法將此質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌TG-1，選擇氨芐青霉素抗性菌株，培養(yǎng)此氨芐青霉素抗性菌株，并從此氨芐青霉素抗性菌株回收質(zhì)粒，從而得到馬鈴薯來(lái)源L型GP的基因。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的易錯(cuò)PCR方法(參考文獻(xiàn)Leung，etal.(Technique1，11-15，1989)和CadwellandJoyce(PCRMethodsApplic.2，28-33，1992))，用PCR引物3和PCR引物4進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增所得馬鈴薯來(lái)源L型GP的基因，PCR引物35′-TTCGGATCCTCACCTTGAGTGAGAAAATTCAC-3′(SEQIDNO40)和PCR引物45′-TTCGGATCCTTTTCATTCACTTCCCCCTC-3′(SEQIDNO41)，PCR反應(yīng)條件為90℃30秒，隨后25個(gè)循環(huán)，一個(gè)循環(huán)是94℃30秒和68℃3分鐘，隨后68℃1分鐘。所擴(kuò)增DNA片段的平均2到3個(gè)位置引入堿基替換。PCR引物3的下劃線部分對(duì)應(yīng)L型GP成熟蛋白N端區(qū)的結(jié)構(gòu)基因序列，而PCR引物4的下劃線部分對(duì)應(yīng)L型GP結(jié)構(gòu)基因終止密碼子即下游的堿基序列。將帶隨機(jī)突變的GP基因擴(kuò)增片段引入預(yù)先用BamHI切割的質(zhì)粒pET3d(STRATAGENE制造)中，制備帶隨機(jī)突變的質(zhì)粒文庫(kù)供篩選耐熱化GP。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，稀釋轉(zhuǎn)化子以獲得獨(dú)立菌落，并鋪板于含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素，Difco制造的胰蛋白胨1％，Difco制造的酵母提取物0.5％，NaCl0.5％，1.5％瓊脂糖，pH7.3)上，隨后在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。將所得平板上的菌落轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上。充分干燥粘附菌落的濾膜表面，并將濾膜在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃保溫10分鐘。轉(zhuǎn)移后，剩余平板接著在37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，然后保存于4℃作為母板。將熱處理的濾膜施加到含葡聚糖合成底物的凝膠(含0.05％糊精，50mMG-1-P，100mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)，0.7％瓊脂糖)上，使得粘附菌落的表面與凝膠表面粘附，并在50℃保溫2小時(shí)。從凝膠上剝離濾膜，浸入碘溶液(0.1％碘化鉀，0.01％碘)中，利用碘淀粉反應(yīng)檢測(cè)濾膜上合成的葡聚糖。從母板上分離對(duì)應(yīng)染成藍(lán)色的菌落。從由此所得每種大腸桿菌中，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法回收質(zhì)粒，并用DNA測(cè)序儀(ABI制造)確定此質(zhì)粒上耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶基因的堿基序列。當(dāng)將由這種耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶基因編碼的氨基酸序列與天然馬鈴薯L型(即突變前)α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，突變被引入天然馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的第39位、第135位或第706位氨基酸，并分別發(fā)生氨基酸替換F39→L、N135→S或T706→I。此外，F(xiàn)39突變成非L氨基酸、N135突變成非S氨基酸或T706突變成非I氨基酸的GP中也發(fā)現(xiàn)耐熱性提高。(實(shí)施例2-1A通過(guò)定點(diǎn)突變制備馬鈴薯L型耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶)在本實(shí)施例中，制備只在實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)有助于提高耐熱性的一個(gè)位置發(fā)生替換的耐熱化GP、具有任意兩個(gè)替換組合的耐熱化GP、和具有所有三個(gè)替換的耐熱化GP。作為實(shí)例，具有所有三種突變(F39L+N135S+T706I)的耐熱化GP的氨基酸序列表示于SEQIDNO34，編碼它的堿基序列表示于SEQIDNO33。為了比較，制備在第39位、第135位和第706位沒(méi)有氨基酸替換、而在與這些氨基酸位置無(wú)關(guān)位置的氨基酸被替換(僅467位賴(lài)氨酸被替換成天冬氨酸的GP，和僅711位蘇氨酸被替換成丙氨酸的GP)的GP。已公開(kāi)很多替換氨基酸的方法(參考文獻(xiàn)Kinkel，T.A.，Proo.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1995)，Vandeyar，M.，etal.，Gene，65129-133(1988)，Sugimoto，M.，etal.，Anal.Biochem.，179309-311(1989)，Taylor，J.W.andEokstein，F(xiàn).，Nucl.AcidsRes.，138764(1985)，Nelson，M.andMcClelland，M.，MethodsEnzymol.，216279-303(1992))。在本發(fā)明中，使用QuickchangeXLSite-DirectedMutagenesis試劑盒(STRATAGENE制造)。使用實(shí)施例1中所示的含插入pMW-118質(zhì)粒中的馬鈴薯來(lái)源L型GP基因的質(zhì)粒作為模板，并且每個(gè)突變使用一組引入突變的引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變，其中每組引物相對(duì)于中心引入突變位置有約35bp互補(bǔ)，并設(shè)計(jì)引入突變F39L、N135S、T706I、K467D或T711A。制備含由此獲得的耐熱化GP編碼基因的質(zhì)粒pMW-PGP。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1，稀釋轉(zhuǎn)化子以獲得獨(dú)立菌落，并鋪板到含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素，Difco制造的胰蛋白胨1％，Difco制造的酵母提取物0.5％，NaCl0.5％，1.5％瓊脂糖，pH7.3)上，隨后在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。在這種含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸桿菌攜帶導(dǎo)入的質(zhì)粒。以此方式，制備表達(dá)耐熱化GP的大腸桿菌。從所得大腸桿菌中提取質(zhì)粒，并測(cè)序編碼GP的基因，確認(rèn)本實(shí)施例獲得的大腸桿菌中含有的質(zhì)粒具有編碼帶目標(biāo)突變的耐熱化GP的突變型GP基因。按如下驗(yàn)證本實(shí)施例所得大腸桿菌表達(dá)的GP是耐熱化GP。攜帶導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌TG-1接種在含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素，Difco制造的胰蛋白胨1％，Difco制造的酵母提取物0.5％，NaCl0.5％，1.5％瓊脂糖，pH7.3)上，隨后在37℃生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中期，溫度降低到約22℃，加入基因表達(dá)誘導(dǎo)劑異丙基β-D-硫代半乳糖苷到終濃度0.1mM，加入吡哆醇到終濃度1mM，隨后在22℃培養(yǎng)約20小時(shí)。離心培養(yǎng)物以回收細(xì)菌細(xì)胞，將細(xì)菌細(xì)胞懸于緩沖液中，并超聲處理懸液以得到細(xì)菌細(xì)胞提取物。將此細(xì)菌提取物在60℃處理30分鐘，以獲得確證的GP制備物。當(dāng)通過(guò)使蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶對(duì)蔗糖和引發(fā)劑進(jìn)行反應(yīng)的方法(描述于國(guó)際公開(kāi)WO02/097107小冊(cè)子中的方法)，用所得確證GP制備物生產(chǎn)葡聚糖時(shí)，對(duì)于所有耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可以高產(chǎn)率獲得高分子量葡聚糖。另一方面，在與提高耐熱性無(wú)關(guān)位置氨基酸被替換的GP經(jīng)60℃處理30分鐘被滅活，而不能產(chǎn)生葡聚糖。(實(shí)施例2-1B制備多種氨基酸替換的修飾型馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶)除了使用設(shè)計(jì)的引物使得在F39、N135和T706的一個(gè)位置用另一個(gè)氨基酸殘基替換以外，根據(jù)與實(shí)施例2-1A相同的方式，制備含修飾型α-葡聚糖磷酸化酶基因的質(zhì)粒，并得到多種修飾型GP的確證制備物。這些修飾型GP確證制備物的耐熱性在以下實(shí)施例3-1(3-1)中詳細(xì)研究。(實(shí)施例2-2A通過(guò)定點(diǎn)突變制備馬鈴薯H型耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶)除了用馬鈴薯來(lái)源H型α-葡聚糖磷酸化酶基因代替馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶基因以外，根據(jù)與實(shí)施例2-1A相同的方式，制備含耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶基因的質(zhì)粒，并獲得GP的確證制備物。在本實(shí)施例中，制備下述耐熱化GP，在實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)有助于提高耐熱性的替換位置中，其僅在對(duì)應(yīng)馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中N135S或T706I的位置(分別是馬鈴薯H型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列的第133位和第628位)具有一個(gè)替換。當(dāng)如實(shí)施例2-1A所述將這些GP確證制備物用于60℃處理30分鐘并制備葡聚糖時(shí)，所有耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶都可獲得高分子量葡聚糖，這與天然馬鈴薯H型α-葡聚糖磷酸化酶相似。(實(shí)施例2-2B用定點(diǎn)突變制備馬鈴薯H型耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶)除了用馬鈴薯來(lái)源H型α-葡聚糖磷酸化酶基因代替馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶基因、并使用引入突變的引物使得在對(duì)應(yīng)F39的位置(Y36)、對(duì)應(yīng)N135的位置(N133)和對(duì)應(yīng)T706的位置(T628)分別用亮氨酸(L)、絲氨酸(S)和異亮氨酸(I)替換以外，根據(jù)與實(shí)施例2-1A相同的方式，制備含耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶基因的質(zhì)粒，并獲得三重突變型(Y36L+N133S+T628I)GP的確證制備物。在本實(shí)施例中，制備在實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)有助于提高耐熱性的所有三個(gè)位置進(jìn)行替換的耐熱化GP。這些修飾型GP的確證制備物的耐熱性在以下實(shí)施例3-2(2)中詳細(xì)研究。(實(shí)施例2-2C用定點(diǎn)突變制備擬南芥H型耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶)首先，用商品化擬南芥來(lái)源的cDNA(PCRReadyFirstStrandcDNA，WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)制備擬南芥來(lái)源的H型α-葡聚糖磷酸化酶基因。更具體的，基于已知擬南芥GP基因序列(數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank登記號(hào)AL133292；CAB61943.1)，設(shè)計(jì)PCR引物5和6。用前述擬南芥來(lái)源的cDNA作模板，并用PCR引物55′AAATCGATAGGAGGAAAACATATGGCAAACGCCAATGGAAAAGCTGCGACTAGTTTACCGGAGAAAATCTC3′(SEQIDNO42)和PCR引物65′GAAGGTACCTTAGGGAACAGGACAAGCCTCAATGTTCCAAATCTCTTTGGCATACTGAG3′(SEQIDNO43)，進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增擬南芥來(lái)源的H型GP基因。PCR反應(yīng)條件是30個(gè)循環(huán)，一個(gè)循環(huán)是94℃30秒、60℃1分鐘和72℃3分鐘。PCR引物5的下劃線部分對(duì)應(yīng)擬南芥來(lái)源H型GP基因成熟蛋白N端區(qū)的結(jié)構(gòu)基因，而PCR引物6的下劃線部分對(duì)應(yīng)擬南芥來(lái)源H型GP基因成熟蛋白C端區(qū)的結(jié)構(gòu)基因。將擴(kuò)增的擬南芥來(lái)源H型GP基因插入預(yù)先用SmaI切割的pMW118質(zhì)粒(由NipponGeneCo.，Ltd.制造)，用感受態(tài)細(xì)胞方法將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌TG-1，選擇氨芐青霉素抗性菌株，培養(yǎng)此氨芐青霉素抗性菌株，并從此氨芐青霉素抗性菌株中回收質(zhì)粒，從而獲得擬南芥來(lái)源的H型GP基因。除了用所得擬南芥來(lái)源的H型GP基因代替馬鈴薯來(lái)源的L型GP基因、并使用引入突變的引物使得在對(duì)應(yīng)F39的位置(Y40)、對(duì)應(yīng)N135的位置(N136)和對(duì)應(yīng)T706的位置(N631)分別用亮氨酸(L)、絲氨酸(S)和異亮氨酸(I)替換以外，根據(jù)與實(shí)施例2-1A相同的方式，制備含耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶基因的質(zhì)粒，并獲得三重突變型(Y40L+N136S+N631I)GP的確證制備物。在本實(shí)施例中，制備在實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)有助于提高耐熱性的所有三個(gè)位置進(jìn)行替換的耐熱化GP。這些修飾型GP的確證制備物的耐熱性在以下實(shí)施例3-2(2)中詳細(xì)研究。(實(shí)施例3-1大規(guī)模制備多種耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶并比較耐熱性)(1)大規(guī)模制備酶實(shí)施例2-1A或2-1B中制備的表達(dá)耐熱化GP的各種大腸桿菌在TB培養(yǎng)基(含Terrificbroth(GIBCO)47g/L，甘油4ml/L和50μg/ml氨芐青霉素)中37℃培養(yǎng)5小時(shí)。向此培養(yǎng)液中加入IPTG和鹽酸吡哆醇至終濃度0.1mMIPTG和1mM鹽酸吡哆醇，繼續(xù)在22℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后離心培養(yǎng)物回收細(xì)菌細(xì)胞，用20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)洗滌除去培養(yǎng)基成分。洗滌后細(xì)菌細(xì)胞懸于20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)，用超聲儀裂解細(xì)菌細(xì)胞，離心，取上清液用作細(xì)菌細(xì)胞提取物。所得細(xì)菌細(xì)胞提取物加載到預(yù)平衡的Q-SepharoseFF柱上，回收用含0.1M到0.3MNaCl濃度梯度的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)洗脫的含耐熱化GP的組分。所回收酶組分加載到預(yù)平衡的Phenyl-TOYOPEARL650M柱上，并回收用含17.5％到7.5％飽和度的硫酸銨濃度梯度的20mM檸檬酸鹽緩沖液洗脫的含耐熱化GP組分的組分。所回收酶組分加載到預(yù)平衡的HiTrapHQP柱，并回收用含0.1M到0.4MNaCl濃度梯度的20mM檸檬酸鹽緩沖液洗脫的活性組分。所得活性組分進(jìn)一步加載到預(yù)平衡的ResourceQ柱上，用含0.1M到0.4MNaCl濃度梯度的20mM檸檬酸鹽緩沖液洗脫，以回收含純化酶的活性組分。取約1μg所得含純化酶活性組分進(jìn)行非變性PAGE(Native聚丙烯酰胺凝膠電泳)。結(jié)果，對(duì)于所有表達(dá)耐熱化GP的大腸桿菌，在分子量約210kDa處見(jiàn)到單一條帶，并且在任意其它位置未發(fā)現(xiàn)條帶。因?yàn)閺陌被嵝蛄蓄A(yù)測(cè)GP的分子量為約104kDa，認(rèn)為GP具有二聚體結(jié)構(gòu)。這樣就表明耐熱化GP得到了均質(zhì)純化。(2)測(cè)定純化的耐熱化GP的活性測(cè)定(1)中純化的耐熱化GP的活性。按如下測(cè)定。首先，200μl反應(yīng)液(含12.5mMG-1-P、1％糊精和酶溶液的100mM乙酸鹽緩沖液(pH6.0))在37℃保溫15分鐘。然后，加入800μl鉬試劑(15mM鉬酸銨，100mM乙酸鋅)，并攪拌以終止反應(yīng)。然后，加入200μl568mM抗壞血酸(pH5.8)，混合，并在37℃保溫15分鐘，用分光光度計(jì)測(cè)定850nm吸光度。在本實(shí)施例中，通過(guò)定量由G-1P生成的游離無(wú)機(jī)磷酸來(lái)測(cè)定GP酶活性。1分鐘內(nèi)生成1μmol無(wú)機(jī)磷酸的酶量被定義為1個(gè)單位(U)。(3-1)比較實(shí)施例2-1A制備的耐熱化GP在60℃和65℃的耐熱性比較實(shí)施例2-1A制備并在(1)中大規(guī)模制備和純化的各種耐熱化GP在60℃和65℃的耐熱性。使用通過(guò)相同方法純化的天然(非突變)馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶作為對(duì)照。首先，0.2U/ml純化酶溶液(在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中)在60℃或65℃保溫0到30分鐘。在特定時(shí)間點(diǎn)如0、2、10、20和30分鐘取酶溶液的小份，并保持于冰上。用20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)將保持于冰上的酶溶液樣品稀釋10倍，并根據(jù)(2)中描述的活性測(cè)定方法測(cè)定酶活性。將60℃或65℃保溫前的酶在37℃的酶活性當(dāng)作100％，用保溫后酶在37℃的酶活性比率(即剩余活性)判斷酶的耐熱性。60℃保溫的結(jié)果表示于下表5。65℃保溫的結(jié)果表示于下表6。表560℃保溫時(shí)剩余活性(％)表665℃保溫時(shí)剩余活性(％)在上表5和表6中，天然馬鈴薯L型指天然馬鈴薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L指第39位苯丙氨酸替換成亮氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。T706I指第706位蘇氨酸替換成異亮氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。N135S指第135位天冬酰胺替換成絲氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L+T706I指第39位苯丙氨酸替換成亮氨酸并且第706位蘇氨酸替換成異亮氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。N135S+T706I指第135位天冬酰胺替換成絲氨酸并且第706位蘇氨酸替換成異亮氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L+N135S指第39位苯丙氨酸替換成亮氨酸并且第135位天冬酰胺替換成絲氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L+N135S+T706I指第39位苯丙氨酸替換成亮氨酸、第135位天冬酰胺替換成絲氨酸并且第706位蘇氨酸替換成異亮氨酸的天然馬鈴薯來(lái)源L型α-葡聚糖磷酸化酶。在表5和表6給出的結(jié)果中，60℃加熱30分鐘的結(jié)果和65℃加熱2分鐘的結(jié)果作為圖示于圖3。發(fā)現(xiàn)與天然馬鈴薯L型GP比較，本發(fā)明耐熱化GP具有非常高的耐熱性。從耐熱性較差GP到耐熱性極佳GP的順序如下天然馬鈴薯L型GP＜F39L＜T706I＜N135S＜F39L+T706I＜N135S+T706I＜F39L+N135S＜F39L+N135S+T706I。通過(guò)在有助于耐熱性的三個(gè)位置氨基酸殘基中僅替換一個(gè)位置提高了耐熱性。進(jìn)而，可以看到，通過(guò)替換多個(gè)這些氨基酸殘基，耐熱性急劇提高。(3-2)比較實(shí)施例2-1B制備的修飾型GP在60℃和65℃的耐熱性比較實(shí)施例2-1B制備并在實(shí)施例3-1(1)中大規(guī)模制備和純化的各種修飾型GP在60℃和65℃的耐熱性。使用通過(guò)相同方法純化的天然(非突變)馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶作為對(duì)照。首先，0.2U/ml純化酶溶液(在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中)在60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘。在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(10分鐘或2分鐘)取酶溶液的小份，并保持于冰上。用20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)將保持于冰上的酶溶液樣品稀釋10倍，并根據(jù)(2)中描述的活性測(cè)定方法測(cè)定酶活性。將60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘前的酶在37℃的酶活性當(dāng)作100％，用保溫后酶在37℃的酶活性比率(即剩余活性)判斷酶的耐熱性。結(jié)果表示于下表7和圖8-10中。表739位替換突變體的剩余活性706位替換突變體的剩余少性135位替換突變體的剩余活性在上表7中，WT指天然馬鈴薯來(lái)源的L型α-葡聚糖磷酸化酶。每一行中，單字母縮寫(xiě)代表的氨基酸表示修飾型GP中的氨基酸替換。例如左端有記F39的行中用I表達(dá)的實(shí)體是指第39位苯丙氨酸替換成異亮氨酸的修飾型GP。對(duì)于其它行中的修飾型GP也是如此。氨基酸的單字母縮寫(xiě)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，并如下列出A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，組氨酸；I，異亮氨酸；K，賴(lài)氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸；V，纈氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。結(jié)果可以看出，當(dāng)上述實(shí)施例2-1A中替換的特定氨基酸以外的氨基酸用來(lái)替換第39位、第135位和第706位氨基酸時(shí)，天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性提高。當(dāng)?shù)?9位苯丙氨酸替換成異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸時(shí)，從60℃保溫10分鐘后的剩余活性來(lái)看，修飾型GP的耐熱性高于天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性。對(duì)于第39位的替換，替換成亮氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是61.2％)對(duì)耐熱性最佳。當(dāng)?shù)?35位天冬酰胺替換成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或酪氨酸時(shí)，修飾型GP的耐熱性高于天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性。對(duì)于第135位的替換，替換成丙氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是76.2％)、半胱氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是85.0％)、甘氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是85.2％)、異亮氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是60.0％)、絲氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是65.4％)、蘇氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是73.4％)或纈氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是82.8％)對(duì)耐熱性特別好。當(dāng)?shù)?06位蘇氨酸替換成半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或色氨酸時(shí)，修飾型GP的耐熱性高于天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性。對(duì)于第706位的替換，替換成半胱氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是65.4％)、異亮氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是70.5％)或纈氨酸(60℃保溫10分鐘后的剩余活性是68.7％)對(duì)耐熱性特別好。當(dāng)?shù)?9位苯丙氨酸替換成異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸時(shí)，從65℃保溫2分鐘后的剩余活性來(lái)看，修飾型GP的耐熱性高于天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性。對(duì)于第39位的替換，替換成亮氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是61.2％)對(duì)耐熱性最佳。當(dāng)?shù)?35位天冬酰胺替換成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或酪氨酸時(shí)，修飾型GP的耐熱性高于天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性。對(duì)于第135位的替換，替換成丙氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是79.0％)、半胱氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是76.9％)、甘氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是58.4％)、甲硫氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是52.6％)、絲氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是86.5％)、蘇氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是62.4％)或纈氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是79.3％)對(duì)耐熱性特別好。當(dāng)?shù)?06位蘇氨酸替換成半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或色氨酸時(shí)，修飾型GP的耐熱性高于天然馬鈴薯來(lái)源L型GP的耐熱性。對(duì)于第706位的替換，替換成亮氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是57.8％)或纈氨酸(65℃保溫2分鐘后的剩余活性是59.2％)對(duì)耐熱性特別好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與天然馬鈴薯L型GP比較，本發(fā)明修飾型GP的耐熱性有很大提高。(實(shí)施例3-2制備H型耐熱化GP酶)(1)大規(guī)模制備酶實(shí)施例2-2B和2-2C中制備的表達(dá)馬鈴薯H型耐熱化GP的每種大腸桿菌和表達(dá)擬南芥H型耐熱化GP的每種大腸桿菌分別在TB培養(yǎng)基(含Terrificbroth(GIBCO)47g/L，甘油4ml/L和50μg/ml氨芐青霉素)中37℃培養(yǎng)5小時(shí)，向此培養(yǎng)液中加入IPTG和鹽酸吡哆醇至終濃度0.1mMIPTG和1mM鹽酸吡哆醇，繼續(xù)在22℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后離心培養(yǎng)物回收細(xì)菌細(xì)胞，用20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)洗滌除去培養(yǎng)基成分。洗滌后細(xì)菌細(xì)胞懸于20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)，用超聲儀裂解細(xì)菌細(xì)胞，離心，取上清液用作細(xì)菌細(xì)胞提取物。所得細(xì)菌細(xì)胞提取物用離子交換層析和疏水層析純化，以回收含純化酶的活性組分，所述組分在非變性PAGE(Native聚丙烯酰胺凝膠電泳)中顯示為單一條帶。(2)比較耐熱化H型GP酶的耐熱性比較(1)中純化的各種耐熱化GP在60℃和65℃的耐熱性。使用通過(guò)相同方法純化的天然(非突變)馬鈴薯H型GP和擬南芥H型GP作為對(duì)照。0.2U/ml純化酶溶液(20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7))在60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘，并保持于冰上。用20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)將保持于冰上的酶溶液稀釋10倍，并根據(jù)實(shí)施例3-1(2)中描述的活性測(cè)定方法測(cè)定酶活性。將58℃保溫10分鐘、60℃保溫10分鐘或65℃保溫2分鐘前的酶在37℃的酶活性當(dāng)作100％，用保溫后酶在37℃的酶活性比率(即剩余活性)判斷酶的耐熱性。耐熱化馬鈴薯H型GP和天然馬鈴薯H型GP的結(jié)果示于下表8和圖11。耐熱化擬南芥H型GP和天然擬南芥H型GP的結(jié)果示于下表9和圖12。表8表9從這些結(jié)果來(lái)看，甚至在65℃加熱2分鐘以后，本發(fā)明的耐熱化馬鈴薯H型GP仍保留34.5％活性。另一方面，65℃加熱2分鐘以后天然馬鈴薯H型GP保留0％活性。由此發(fā)現(xiàn)，與天然馬鈴薯H型GP比較，本發(fā)明的耐熱化馬鈴薯H型GP具有高度耐熱性。此外，甚至在65℃加熱2分鐘以后，本發(fā)明的耐熱化擬南芥H型GP仍保留29.2％活性。另一方面，65℃加熱2分鐘以后天然擬南芥H型GP保留0.5％活性。由此發(fā)現(xiàn)，與天然擬南芥H型GP比較，本發(fā)明的耐熱化擬南芥H型GP具有高度耐熱性。(實(shí)施例4用耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶合成重均分子量600kDa或更高的直鏈淀粉)使用根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，研究是否可以合成重均分子量600kDa或更高的直鏈淀粉。使用以上實(shí)施例3-1(1)制備的多種耐熱化GP的任何一種(單突變F39L、單突變N135S、單突變T706I、雙突變(F39L+N135S)、雙突變(F39L+T706I)、雙突變(N135S+T706I)和三突變(F39L+N135S+T706I))作為耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。使用嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶(也稱(chēng)作嗜熱脂肪芽孢桿菌)和水生棲熱菌來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶(也稱(chēng)作水生棲熱菌)作為對(duì)照。使用具有下表10所述組成的反應(yīng)溶液在50℃進(jìn)行直鏈淀粉合成反應(yīng)18小時(shí)。表10使用描述于前述“1.測(cè)定方法和計(jì)算方法”的1.5中的計(jì)算方法計(jì)算該反應(yīng)合成的直鏈淀粉產(chǎn)率。用以下方法測(cè)定該反應(yīng)合成直鏈淀粉的重均分子量。該反應(yīng)合成的直鏈淀粉完全溶解于1N氫氧化鈉中，用適量鹽酸中和，取約30-300μg等份直鏈淀粉用于同時(shí)使用差示折光計(jì)和多角光散射檢測(cè)器的凝膠過(guò)濾層析，以獲得重均分子量。更具體的，使用ShodexSB806M-HQ(SHOWADENKOK.K.制造)作為柱子，使用多角光散射檢測(cè)器(DAWN-DSP，WyattTechnology制造)作為檢測(cè)器，并通過(guò)以這種順序?qū)⑺鼈冞B接而使用差示折光計(jì)(ShodexRI-71，SHOWADENKOK.K.制造)。柱子保持在40℃，并使用0.1M硝酸鈉溶液以1mL/min流速作為洗脫劑。用數(shù)據(jù)分析軟件(商品名ASTRA，WyattTechnology制造)收集所得信號(hào)，并用相同軟件分析，從而得到重均分子量。這種方法也稱(chēng)為MALLS分析法。以此方式獲得的合成直鏈淀粉的產(chǎn)率和分子量示于下表11。表11合成直鏈淀粉的產(chǎn)率和分子量如上所述，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的耐熱化GP可以合成重均分子量約600kDa或更高的高分子直鏈淀粉。此外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的耐熱化GP合成直鏈淀粉的產(chǎn)率約40％或更高。用作比較實(shí)施例的嗜熱脂肪芽孢桿菌GP和水生棲熱菌GP是耐熱性酶，但不能合成高分子直鏈淀粉。(實(shí)施例5用耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶從蔗糖合成直鏈淀粉)使用根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，并使用蔗糖作為原材料，來(lái)合成直鏈淀粉。使用以上實(shí)施例3-1(1)制備的所述多種耐熱化GP的任何一種(單突變F39L、單突變N135S、單突變T706I、雙突變(F39L+N135S)、雙突變(F39L+T706I)、雙突變(N135S+T706I)和三突變(F39L+N135S+T706I))作為耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。使用具有下表12所述組成的反應(yīng)溶液在50℃進(jìn)行直鏈淀粉合成反應(yīng)18小時(shí)。表12使用描述于前述“1.測(cè)定方法和計(jì)算方法”的1.7中的計(jì)算公式計(jì)算該反應(yīng)合成的直鏈淀粉產(chǎn)率(％)。用與以上實(shí)施例4中相同的方法測(cè)定該反應(yīng)合成直鏈淀粉的重均分子量。以此方式獲得的合成直鏈淀粉的產(chǎn)率和分子量示于下表13。表13合成直鏈淀粉的產(chǎn)率和重均分子量如上所述，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用蔗糖作為合成直鏈淀粉的原材料時(shí)，像天然GP一樣，本發(fā)明的耐熱化GP可以合成重均分子量約600kDa的高分子直鏈淀粉。此外，還發(fā)現(xiàn)與天然GP相似，直鏈淀粉的產(chǎn)率高，如約40％或更高。(實(shí)施例6在高溫條件下(50℃、55℃和60℃)用耐熱化GP由葡萄糖-1-磷酸合成葡聚糖)使用根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，并使用葡萄糖-1-磷酸作為原材料，在高溫條件下來(lái)合成直鏈淀粉。使用實(shí)施例3-1(1)制備的耐熱化GP(三突變(F39L+N135S+T706I))，同時(shí)使用由相同方法純化的天然馬鈴薯L型GP作為對(duì)照。通過(guò)在37℃、50℃、55℃或60℃將含G-1-P6.1g/L、麥芽四糖(G4)0.3g/L和GP20U/L的反應(yīng)溶液保溫18小時(shí)進(jìn)行直鏈淀粉合成反應(yīng)。時(shí)間過(guò)去后測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的合成直鏈淀粉的量?；谝韵鹿接?jì)算合成直鏈淀粉的量(g/L)。(合成直鏈淀粉的量(g/L))＝(用于直鏈淀粉合成的葡萄糖(mM))×180(葡萄糖分子量)＝[(反應(yīng)生成的無(wú)機(jī)磷酸(mM))-(反應(yīng)后葡萄糖(mM))]×180(葡萄糖分子量)反應(yīng)18小時(shí)后合成直鏈淀粉的量示于下表14和圖17。表14合成直鏈淀粉的量(g/L)當(dāng)使用耐熱化GP時(shí)，在37℃、50℃和55℃合成約3g/L直鏈淀粉，甚至在60℃也合成約1.5g/L直鏈淀粉。另一方面，當(dāng)使用天然馬鈴薯L型GP時(shí)，在37℃、50℃和55℃有直鏈淀粉合成，但在60℃根本不合成直鏈淀粉。認(rèn)為對(duì)于天然馬鈴薯L型GP，60℃時(shí)在反應(yīng)的起始階段GP即被滅活。另一方面，認(rèn)為因?yàn)槟蜔峄疓P在60℃也穩(wěn)定保留酶活性，足以使直鏈淀粉合成反應(yīng)進(jìn)行。此外，當(dāng)在37℃、50℃、55℃和60℃的每個(gè)溫度使用耐熱化GP時(shí)，所合成直鏈淀粉量大于使用天然馬鈴薯L型GP時(shí)的量?？梢哉J(rèn)為，使用耐熱化GP合成直鏈淀粉的量將隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增加。如上所述，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的耐熱化GP可以在60℃合成葡聚糖，而天然馬鈴薯L型GP不能在此溫度反應(yīng)。(實(shí)施例7用耐熱化GP在65℃和70℃由葡萄糖-1-磷酸合成葡聚糖)如實(shí)施例6，使用實(shí)施例3-1(1)制備的耐熱化GP(三突變(F39L+N135S+T706I))，在更高溫度條件下由葡萄糖-1-磷酸合成葡聚糖。使用天然馬鈴薯L型GP作為對(duì)照。通過(guò)在37℃、65℃或70℃將含G-1-P15.2g/L、麥芽四糖(G4)2.7g/L和GP200U/L的反應(yīng)溶液保溫4小時(shí)進(jìn)行直鏈淀粉合成反應(yīng)。如實(shí)施例6計(jì)算合成直鏈淀粉的量。反應(yīng)4小時(shí)后，當(dāng)使用馬鈴薯L型GP時(shí)，在65℃或70℃根本不合成直鏈淀粉，而當(dāng)使用耐熱化GP時(shí)，在65℃由15.2gG-1-P合成約5.6g/L直鏈淀粉，而在70℃由15.2gG-1-P合成約0.3g/L直鏈淀粉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天然馬鈴薯L型GP不能在65℃到70℃合成直鏈淀粉，但耐熱化GP在高溫如70℃保持GP活性，并具有合成直鏈淀粉能力?；趯?shí)施例6和7的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的耐熱化GP在高溫條件下具有合成直鏈淀粉的能力，而天然馬鈴薯L型GP在如此條件下根本不反應(yīng)。(實(shí)施例8確認(rèn)經(jīng)熱處理去除污染蛋白質(zhì))確認(rèn)使用熱處理，以下方法可用于容易地純化耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶。如實(shí)施例2-1A所述，將實(shí)施例2-1A中制備的表達(dá)耐熱化GP(三重突變體(F39L+N135S+T706I))基因的大腸桿菌(TG-1)培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中。如實(shí)施例2-1A所述，將表達(dá)天然馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的大腸桿菌(TG-1)培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中作為對(duì)照。離心培養(yǎng)液回收細(xì)菌細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞懸于緩沖液中，并進(jìn)行超聲以獲得細(xì)菌細(xì)胞提取物。在60℃水浴中加熱該細(xì)菌細(xì)胞提取物0到60分鐘，離心去除不溶性蛋白以獲得上清液。測(cè)定該上清液的GP活性和蛋白質(zhì)含量，從而得到GP酶的比活性。用實(shí)施例3-1(2)所述活性測(cè)定方法測(cè)定GP活性，用Bradford方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.，72，248-254(1976))測(cè)定蛋白質(zhì)含量。Bradford方法是一種比色方法，其中顯色物質(zhì)與溶液中含有的所有蛋白質(zhì)結(jié)合。在本說(shuō)明書(shū)中，用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(NipponBio-RadLaboratories，Inc.)和牛球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。由以下方法計(jì)算GP酶比活性。比活性(U/ml)＝(α-葡聚糖磷酸化酶活性)/(上清液中所含蛋白質(zhì)的質(zhì)量mg)圖6表示耐熱化GP酶(稱(chēng)作耐熱化GP(F39L+N135S+T706I))和天然馬鈴薯L型GP酶比活性隨時(shí)間的變化。如圖6所示，耐熱化GP的比活性經(jīng)60℃加熱增加約10倍。污染蛋白幾乎完全熱變性并被除去。相反，天然馬鈴薯L型GP的比活性隨時(shí)間降低?？梢哉J(rèn)為這是因?yàn)椴粌H污染蛋白而且所述GP蛋白也被變性。以此方式，發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱處理可以簡(jiǎn)單的純化耐熱化GP。(實(shí)施例9確認(rèn)經(jīng)熱處理去除污染蛋白質(zhì))如實(shí)施例8，培養(yǎng)表達(dá)耐熱化GP(F39L+N135S+T706I)基因的大腸桿菌(TG-1)，并制備細(xì)菌細(xì)胞提取物。使用該細(xì)菌細(xì)胞提取物，確認(rèn)經(jīng)過(guò)60℃熱處理可以使淀粉酶活性和磷酸酶活性降低到可用于工業(yè)生產(chǎn)直鏈淀粉或G-1-P的水平。如實(shí)施例8，在60℃水浴中加熱細(xì)菌細(xì)胞提取物30分鐘，離心去除不溶性蛋白以獲得上清液。測(cè)定該上清液的磷酸酶活性和淀粉酶活性。通過(guò)將含100μl該上清液和100μl50mM葡萄糖-1-磷酸的反應(yīng)溶液在37℃保溫60分鐘，并用(1.測(cè)定方法和計(jì)算方法)所述的方法定量由反應(yīng)溶液中葡萄糖-1-磷酸生成的游離無(wú)機(jī)磷酸，從而測(cè)定磷酸酶活性。在1分鐘內(nèi)生成1μmol無(wú)機(jī)磷酸的酶量定義為1個(gè)單位(U)。通過(guò)將含25μl該上清液和25μl0.5％直鏈淀粉(重均分子量約50kDa)的反應(yīng)溶液在37℃保溫60分鐘，加入1ml碘溶液(0.1％碘化鉀，0.01)，并測(cè)定伴隨反應(yīng)溶液中直鏈淀粉轉(zhuǎn)化成低分子直鏈淀粉時(shí)碘顯色的降低速率，獲得酶活性。在1分鐘內(nèi)能降低A660吸光度約10％的活性定義為1U。淀粉酶活性(U/分鐘)＝(反應(yīng)前A660nm吸光度一反應(yīng)后A660nm吸光度)÷(反應(yīng)前A660nm吸光度)×100÷10÷(時(shí)間(分鐘))下表15表示細(xì)菌細(xì)胞提取物中磷酸酶活性和淀粉酶活性的剩余比例。如表15所示，將加熱前細(xì)菌細(xì)胞提取物的活性當(dāng)作100％，經(jīng)60℃加熱后，磷酸酶活性和淀粉酶活性分別是磷酸酶活性約3％，淀粉酶活性約0.3％，這兩種污染蛋白質(zhì)幾乎被滅活。表15以此方式，根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶是即使經(jīng)60℃熱處理也不喪失活性的植物GP酶，并發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)60℃熱處理可以容易的生產(chǎn)含很少淀粉酶活性和磷酸酶活性的極好GP。(實(shí)施例10GP蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性)已經(jīng)報(bào)道天然馬鈴薯來(lái)源L型GP容易降解。這些GP，甚至純化后低溫保存，在保存期間也逐漸降解。一般來(lái)說(shuō)，酶降解時(shí)，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶的性質(zhì)發(fā)生變化，同時(shí)活性降低等。如果能增強(qiáng)GP蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，則可以降低以上因素的影響，這有利于酶的保存和使用。將實(shí)施例3-1(1)制備的天然馬鈴薯來(lái)源L型GP和7種耐熱化GP(單突變F39L、單突變N135S、單突變T706I、雙突變(F39L+N135S)、雙突變(F39L+T706I)、雙突變(N135S+T706I)和三突變(F39L+N135S+T706I))保存于4℃，并經(jīng)過(guò)5個(gè)月檢測(cè)所述GP蛋白質(zhì)的分子量。此外，相似的檢測(cè)37℃保存10天后的GP蛋白質(zhì)分子量。純化后即刻和4℃保存5個(gè)月后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分子量，結(jié)果示于圖13。加到凝膠上的蛋白量對(duì)所有GP蛋白相同。結(jié)果，純化后即刻，天然馬鈴薯L型GP和7種耐熱化GP都在分子量約210kDa位置(GP單體分子量約104kDa，形成二聚體)顯示條帶。另一方面，天然馬鈴薯L型GP和N135S突變體在4℃保存5個(gè)月后具有約140kDa的分子量，這比純化后即刻要小。這表明在保存期間天然馬鈴薯L型GP和N135S單突變體被降解。天然馬鈴薯L型GP和N135S突變體在37℃保存10天后也被降解。另外6種耐熱化GP(單突變F39L、單突變T706I、雙突變F39L+N135S、雙突變F39L+T706I、雙突變N135S+T706I和三突變F39L+N135S+T706I)在4℃保存5個(gè)月后的分子量約為210kDa，這與純化后即刻相同，未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解。此外，這六種耐熱化GP在37℃保存10天后分子量也沒(méi)有改變，未發(fā)現(xiàn)這些GP蛋白降解。這表明這些耐熱化GP在4℃到37℃具有出色的抗降解能力，并且比天然馬鈴薯L型GP具有更高穩(wěn)定性。由此發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)39位替換和T706位替換不僅提供提高耐熱性的作用，而且提供抑制GP蛋白質(zhì)降解的作用。(實(shí)施例11合成葡萄糖-1-磷酸)(1)用耐熱化GP在65℃合成G-1-P使用根據(jù)本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，并使用葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸作為原材料，在65℃合成葡萄糖-1-磷酸。使用實(shí)施例3-1(1)中制備的耐熱化GP(三突變(F39L+N135S+T706I))，并使用由同樣方法純化的天然馬鈴薯L型GP作為對(duì)照。通過(guò)在37℃或65℃將反應(yīng)溶液保溫18小時(shí)，進(jìn)行G-1-P合成反應(yīng)，其中所述反應(yīng)溶液含300mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、10g/L糊精和1000U/L任一種GP。用以上“1.測(cè)定方法和計(jì)算方法”的1.3中所述的定量葡萄糖-1-磷酸方法獲得的G-1-P濃度(mM)乘以G-1-P的分子量260，計(jì)算合成G-1-P的量。反應(yīng)后合成G-1-P的量示于下表16。表16合成葡萄糖-1-磷酸的量(g/L)當(dāng)使用天然馬鈴薯L型GP時(shí)在65℃不合成G-1-P。然而當(dāng)使用耐熱化GP時(shí)，即使在65℃也可以生成G-1-P。(2)用耐熱化GP在70℃合成G-1-P如以上實(shí)施例11(1)，使用根據(jù)本發(fā)明的耐熱化GP和天然馬鈴薯L型GP，并使用葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸作為原材料，在70℃合成G-1-P。將含300mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)、10g/L糊精和10,000U/L任一種GP的反應(yīng)溶液在70℃保溫4小時(shí)，合成G-1-P。如前述實(shí)施例計(jì)算合成G-1-P的量。當(dāng)使用天然馬鈴薯L型GP時(shí)在70℃根本不合成G-1-P。然而當(dāng)使用耐熱化GP時(shí)，合成約1gG-1-P。如上述，本發(fā)明用本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案舉例說(shuō)明，但不應(yīng)理解為將本發(fā)明限制到這些實(shí)施方案內(nèi)?？梢岳斫?，本發(fā)明的范圍只由權(quán)利要求書(shū)解釋?？梢岳斫猓诒景l(fā)明的描述和常規(guī)技術(shù)知識(shí)，從本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的具體描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在等價(jià)的范圍實(shí)施?？梢岳斫猓瑢?zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和本說(shuō)明書(shū)引用的參考文獻(xiàn)內(nèi)容本身應(yīng)引入作為參考，就像其內(nèi)容在本說(shuō)明書(shū)中具體描述一樣。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明得到在高溫下(如60℃或更高)具有極佳耐熱性的植物來(lái)源GP酶。本發(fā)明的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶可用于高溫條件(如60℃或更高)下的葡聚糖合成反應(yīng)，天然GP酶在此條件下不能反應(yīng)。當(dāng)使用中溫性細(xì)菌如大腸桿菌作為宿主，高度表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的編碼耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶基因(如通過(guò)提高馬鈴薯來(lái)源GP耐熱性獲得的編碼耐熱化GP的基因)時(shí)，通過(guò)在60℃加熱含耐熱化酶的細(xì)菌細(xì)胞提取物，可以簡(jiǎn)單的除去來(lái)源于宿主細(xì)菌的污染酶。具體來(lái)說(shuō)，淀粉酶活性和磷酸酶活性是大問(wèn)題，尤其是在GP酶的工業(yè)應(yīng)用中如此，經(jīng)熱處理可以大大降低這兩種酶活性。因此，本發(fā)明的酶尤其在酶純化中有用。本發(fā)明方法不僅對(duì)馬鈴薯來(lái)源GP和擬南芥來(lái)源GP有效，而且可優(yōu)選應(yīng)用于提高與馬鈴薯來(lái)源GP和擬南芥來(lái)源GP的氨基酸序列高度同源的其它A類(lèi)GP的耐熱性。通過(guò)使用本發(fā)明方法，可以制備來(lái)源于馬鈴薯和擬南芥以外其它生物物種的耐熱化GP。根據(jù)本發(fā)明，提供耐熱化GP，其中酶蛋白降解被抑制并且保存穩(wěn)定性提高。(序列表解釋)SEQIDNO1編碼馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO2馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO3編碼甘薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO4甘薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO5編碼馬鈴薯第二種L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO6馬鈴薯第二種L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO7編碼蠶豆L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO8蠶豆L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO9編碼擬南芥L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO10擬南芥L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO11編碼菠菜L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO12菠菜L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO13編碼玉米L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO14玉米L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO15編碼水稻L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO16水稻L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO17編碼水稻第二種L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO18水稻第二種L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO19編碼小麥H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO20小麥H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO21編碼柑桔雜交栽培種H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO22柑桔雜交栽培種H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO23編碼水稻H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO24水稻H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO25編碼蠶豆H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO26蠶豆H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO27編碼擬南芥H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO28擬南芥H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO29編碼馬鈴薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO30馬鈴薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO31編碼甘薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的部分序列；SEQIDNO32甘薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO33編碼耐熱化馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列；SEQIDNO34耐熱化馬鈴薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNO35大腸桿菌麥芽糊精磷酸化酶的氨基酸序列；SEQIDNOs36和37圖2中所示的質(zhì)粒pMW118連接位點(diǎn)附近的堿基序列；SEQIDNO38PCR引物1的堿基序列；SEQIDNO39PCR引物2的堿基序列；SEQIDNO40PCR引物3的堿基序列；SEQIDNO41PCR引物4的堿基序列；SEQIDNO42PCR引物5的堿基序列；SEQIDNO43PCR引物6的堿基序列；SEQIDNO44基序序列1L的氨基酸序列；SEQIDNO45基序序列1H的氨基酸序列；SEQIDNO46基序序列2的氨基酸序列；SEQIDNO47基序序列3L的氨基酸序列；SEQIDNO48基序序列3H的氨基酸序列。序列表<110>江崎格力高株式會(huì)社<120>耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法<130>EG012PCT<140>PCT/JP2004/008362<141>2004-06-15<150>JP2003-173972<151>2003-06-18<160>48<170>PatentInversion3.3<210>1<211>3101<212>DNA<213>馬鈴薯(Solanumtuberosum)<220><221>CDS<222>(44)..(2941)<220><221>mat_peptide<222>(194)..(2941)<400>1atcactctcattcgaaaagctagatttgcatagagagcacaaaatggcgactgca55MetAlaThrAla-50aatggagcacacttgttcaaccattacagctccaattccagattcatc103AsnGlyAlaHisLeuPheAsnHisTyrSerSerAsnSerArgPheIle-45-40-35catttcacttctagaaacacaagctccaaattgttccttaccaaaacc151HisPheThrSerArgAsnThrSerSerLysLeuPheLeuThrLysThr-30-25-20-15tcccattttcggagacccaaacgctgtttccatgtcaacaataccttg199SerHisPheArgArgProLysArgCysPheHisValAsnAsnThrLeu-10-5-11agtgagaaaattcaccatcccattactgaacaaggtggtgagagcgac247SerGluLysIleHisHisProIleThrGluGlnGlyGlyGluSerAsp51015ctgagttcttttgctcctgatgccgcatctattacctcaagtatcaaa295LeuSerSerPheAlaProAspAlaAlaSerIleThrSerSerIleLys202530taccatgcagaattcacacctgtattctctcctgaaaggtttgagctc343TyrHisAlaGluPheThrProValPheSerProGluArgPheGluLeu35404550cctaaggcattctttgcaacagctcaaagtgttcgtgattcgctcctt391ProLysAlaPhePheAlaThrAlaGlnSerValArgAspSerLeuLeu556065attaattggaatgctacgtatgatatttatgaaaagctgaacatgaag439IleAsnTrpAsnAlaThrTyrAspIleTyrGluLysLeuAsnMetLys707580caagcgtactatctatccatggaatttctgcagggtagagcattgtta487GlnAlaTyrTyrLeuSerMetGluPheLeuGlnGlyArgAlaLeuLeu859095aatgcaattggtaatctggagcttactggtgcatttgcggaagctttg535AsnAlaIleGlyAsnLeuGluLeuThrGlyAlaPheAlaGluAlaLeu100105110aaaaaccttggccacaatctagaaaatgtggcttctcaggaaccagat583LysAsnLeuGlyHisAsnLeuGluAsnValAlaSerGlnGluProAsp115120125130gctgctcttggaaatgggggtttgggacggcttgcttcctgttttctg631AlaAlaLeuGlyAsnGlyGlyLeuGlyArgLeuAlaSerCysPheLeu135140145gactctttggcaacactaaactacccagcatggggctatggacttagg679AspSerLeuAlaThrLeuAsnTyrProAlaTrpGlyTyrGlyLeuArg150155160tacaagtatggtttatttaagcaacggattacaaaagatggtcaggag727TyrLysTyrGlyLeuPheLysGlnArgIleThrLysAspGlyGlnGlu165170175gaggtggctgaagattggcttgaaattggcagtccatgggaagttgtg775GluValAlaGluAspTrpLeuGluIleGlySerProTrpGluValVal180185190aggaatgatgtttcatatcctatcaaattctatggaaaagtctctaca823ArgAsnAspValSerTyrProIleLysPheTyrGlyLysValSerThr195200205210ggatcagatggaaagaggtattggattggtggagaggatataaaggca871GlySerAspGlyLysArgTyrTrpIleGlyGlyGluAspIleLysAla215220225gttgcgtatgatgttcccataccagggtataagaccagaaccacaatc919ValAlaTyrAspValProIleProGlyTyrLysThrArgThrThrIle230235240agccttcgactgtggtctacacaggttccatcagcggattttgattta967SerLeuArgLeuTrpSerThrGlnValProSerAlaAspPheAspLeu245250255tctgctttcaatgctggagagcacaccaaagcatgtgaagcccaagca1015SerAlaPheAsnAlaGlyGluHisThrLysAlaCysGluAlaGlnAla260265270aacgctgagaagatatgttacatactctaccctggggatgaatcagag1063AsnAlaGluLysIleCysTyrIleLeuTyrProGlyAspGluSerGlu275280285290gagggaaagatccttcggttgaagcaacaatataccttatgctcggct1111GluGlyLysIleLeuArgLeuLysGlnGlnTyrThrLeuCysSerAla295300305tctctccaagatattatttctcgatttgagaggagatcaggtgatcgt1159SerLeuGlnAspIleIleSerArgPheGluArgArgSerGlyAspArg310315320attaagtgggaagagtttcctgaaaaagttgctgtgcagatgaatgac1207IleLysTrpGluGluPheProGluLysValAlaValGlnMetAsnAsp325330335actcaccctacactttgtatccctgagctgatgagaatattgatagat1255ThrHisProThrLeuCysIleProGluLeuMetArgIleLeuIleAsp340345350ctgaagggcttgaattggaatgaagcttggaatattactcaaagaact1303LeuLysGlyLeuAsnTrpAsnGluAlaTrpAsnIleThrGlnArgThr355360365370gtggcctacacaaaccatactgttttgcctgaggcactggagaaatgg1351ValAlaTyrThrAsnHisThrValLeuProGluAlaLeuGluLysTrp375380385agttatgaattgatgcagaaactccttcccagacatgtcgaaatcatt1399SerTyrGluLeuMetGlnLysLeuLeuProArgHisValGluIleIle390395400gaggcgattgacgaggagctggtacatgaaattgtattaaaatatggt1447GluAlaIleAspGluGluLeuValHisGluIleValLeuLysTyrGly405410415tcaatggatctgaacaaattggaggaaaagttgactacaatgagaatc1495SerMetAspLeuAsnLysLeuGluGluLysLeuThrThrMetArgIle420425430ttagaaaattttgatcttcccagttctgttgctgaattatttattaag1543LeuGluAsnPheAspLeuProSerSerValAlaGluLeuPheIleLys435440445450cctgaaatctcagttgatgatgatactgaaacagtagaagtccatgac1591ProGluIleSerValAspAspAspThrGluThrValGluValHisAsp455460465aaagttgaagcttccgataaagttgtgactaatgatgaagatgacact1639LysValGluAlaSerAspLysValValThrAsnAspGluAspAspThr470475480ggtaagaaaactagtgtgaagatagaagcagctgcagaaaaagacatt1687GlyLysLysThrSerValLysIleGluAlaAlaAlaGluLysAspIle485490495gacaagaaaactcccgtgagtccggaaccagctgttataccacctaag1735AspLysLysThrProValSerProGluProAlaValIleProProLys500505510aaggtacgcatggc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laAsnValGluIleArgGlu770775780gaggttggagaagaaaacttctttctctttggtgctcaagctcatgaa2400GluValGlyGluGluAsnPhePheLeuPheGlyAlaGlnAlaHisGlu785790795attgcagggcttagaaaagaaagagctgacggaaagtttgtacctgat2448IleAlaGlyLeuArgLysGluArgAlaAspGlyLysPheValProAsp800805810815gaacgttttgaagaggtgaaggaatttgttagaagcggtgcttttggc2496GluArgPheGluGluValLysGluPheValArgSerGlyAlaPheGly820825830tcttataactatgatgacctaattggatcgttggaaggaaatgaaggt2544SerTyrAsnTyrAspAspLeuIleGlySerLeuGluGlyAsnGluGly835840845tttggccgtgctgactatttccttgtgggcaaggacttccccagttac2592PheGlyArgAlaAspTyrPheLeuValGlyLysAspPheProSerTyr850855860atagaatgccaagagaaagttgatgaggcatatcgcgaccagaaaagg2640IleGluCysGlnGluLysValAspGluAlaTyrArgAspGlnLysArg865870875tggacaacgatgtcaatcttgaatacagcgggatcgtacaagttcagc2688TrpThrThrMetSerIleLeuAsnThrAlaGlySerTyrLysPheSer880885890895agtgacagaacaatccatgaatatgccaaagacatttggaacattgaa2736SerAspArgThrIleHisGluTyrAlaLysAspIleTrpAsnIleGlu900905910gctgtggaaatagcataa2754AlaValGluIleAla915<210>34<211>917<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>34MetThrLeuSerGluLysIleHisHisProIleThrGluGlnGlyGly-1151015GluSerAspLeuSerSerPheAlaProAspAlaAlaSerIleThrSer202530SerIleLysTyrHisAlaGluLeuThrProValPheSerProGluArg354045PheGluLeuProLysAlaPhePheAlaThrAlaGlnSerValArgAsp505560SerLeuLeuIleAsnTrpAsnAlaThrTyrAspIleTyrGluLysLeu657075AsnMetLysGlnAlaTyrTyrLeuSerMetGluPheLeuGlnGlyArg80859095AlaLeuLeuAsnAlaIleGlyAsnLeuGluLeuThrGlyAlaPheAla100105110GluAlaLeuLysAsnLeuGlyHisAsnLeuGluAsnValAlaSerGln115120125GluProAspAlaAlaLeuGlySerGlyGlyLeuGlyArgLeuAlaSer130135140CysPheLeuAspSerLeuAlaThrLeuAsnTyrProAlaTrpGlyTyr145150155GlyLeuArgTyrLysTyrGlyLeuPheLysGlnArgIleThrLysAsp160165170175GlyGlnGluGluValAlaGluAspTrpLeuGluIleGlySerProTrp180185190GluValValArgAsnAspValSerTyrProIleLysPheTyrGlyLys195200205ValSerThrGlySerAspGlyLysArgTyrTrpIleGlyGlyGluAsp210215220IleLysAlaValAlaTyrAspValProIleProGlyTyrLysThrArg225230235ThrThrIleSerLeuArgLeuTrpSerThrGlnValProSerAlaAsp240245250255PheAspLeuSerAlaPheAsnAlaGlyGluHisThrLysAlaCysGlu260265270AlaGlnAlaAsnAlaGluLysIleCysTyrIleLeuTyrProGlyAsp275280285GluSerGluGluGlyLysIleLeuArgLeuLysGlnGlnTyrThrLeu290295300CysSerAlaSerLeuGlnAspIleIleSerArgPheGluArgArgSer305310315GlyAspArgIleLysTrpGluGluPheProGluLysValAlaValGln320325330335MetAsnAspThrHisProThrLeuCysIleProGluLeuMetArgIle340345350LeuIleAspLeuLysGlyLeuAsnTrpAsnGluAlaTrpAsnIleThr355360365GlnArgThrValAlaTyrThrAsnHisThrValLeuProGluAlaLeu370375380GluLysTrpSerTyrGluLeuMetGlnLysLeuLeuProArgHisVal385390395GluIleIleGluAlaIleAspGluGluLeuValHisGluIleValLeu400405410415LysTyrGlySerMetAspLeuAsnLysLeuGluGluLysLeuThrThr420425430MetArgIleLeuGluAsnPheAspLeuProSerProValAlaGluLeu435440445PheIleLysProGluIleSerValAspAspAspThrGluThrValGlu450455460ValHisAspLysValGluAlaSerAspLysValValThrAsnAspGlu465470475AspAspThrGlyLysLysThrSerValLysIleGluAlaAlaAlaGlu480485490495LysAspIleAspLysLysThrProValSerProGluProAlaValIle500505510ProProLysLysValArgMetAlaAsnLeuCysValValGlyGlyHis515520525AlaValAsnGlyValAlaGluIleHisSerGluIleValLysGluGlu530535540ValPheAsnAspPheTyrGluLeuTrpProGluLysPheGlnAsnLys545550555ThrAsnGlyValThrProArgArgTrpIleArgPheCysAsnProPro560565570575LeuSerAlaIleIleThrLysTrpThrGlyThrGluAspTrpValLeu580585590LysThrGluLysLeuAlaGluLeuGlnLysPheAlaAspAsnGluAsp595600605LeuGlnAsnGluTrpArgGluAlaLysArgSerAsnLysIleLysVal610615620ValSerPheLeuLysGluLysThrGlyTyrSerValValProAspAla625630635MetPheAspIleGlnValLysArgIleHisGluTyrLysArgGlnLeu640645650655LeuAsnIlePheGlyIleValTyrArgTyrLysLysMetLysGluMet660665670ThrAlaAlaGluArgLysThrAsnPheValProArgValCysIlePhe675680685GlyGlyLysAlaPheAlaThrTyrValGlnAlaLysArgIleValLys690695700PheIleIleAspValGlyAlaThrIleAsnHisAspProGluIleGly705710715AspLeuLeuLysValValPheValProAspTyrAsnValSerValAla720725730735GluLeuLeuIleProAlaSerAspLeuSerGluHisIleSerThrAla740745750GlyMetGluAlaSerGlyThrSerAsnMetLysPheAlaMetAsnGly755760765CysIleGlnIleGlyThrLeuAspGlyAlaAsnValGluIleArgGlu770775780GluValGlyGluGluAsnPhePheLeuPheGlyAlaGlnAlaHisGlu785790795IleAlaGlyLeuArgLysGluArgAlaAspGlyLysPheValProAsp800805810815GluArgPheGluGluValLysGluPheValArgSerGlyAlaPheGly820825830SerTyrAsnTyrAspAspLeuIleGlySerLeuGluGlyAsnGluGly835840845PheGlyArgAlaAspTyrPheLeuValGlyLysAspPheProSerTyr850855860IleGluCysGlnGluLysValAspGluAlaTyrArgAspGlnLysArg865870875TrpThrThrMetSerIleLeuAsnThrAlaGlySerTyrLysPheSer880885890895SerAspArgThrIleHisGluTyrAlaLysAspIleTrpAsnIleGlu900905910AlaValGluIleAla915<210>35<211>797<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichiacoli)<400>35MetSerGlnProIlePheAsnAspLysGlnPheGlnGluAlaLeuSer151015ArgGlnTrpGlnArgTyrGlyLeuAsnSerAlaAlaGluMetThrPro202530ArgGlnTrpTrpLeuAlaValSerGluAlaLeuAlaGluMetLeuArg354045AlaGlnProPheAlaLysProValAlaAsnGlnArgHisValAsnTyr505560IleSerMetGluPheLeuIleGlyArgLeuThrGlyAsnAsnLeuLeu65707580AsnLeuGlyTrpTyrGlnAspValGlnAspSerLeuLysAlaTyrAsp859095IleAsnLeuThrAspLeuLeuGluGluGluIleAspProAlaLeuGly100105110AsnGlyGlyLeuGlyArgLeuAlaAlaCysPheLeuAspSerMetAla115120125ThrValGlyGlnSerAlaThrGlyTyrGlyLeuAsnTyrGlnTyrGly130135140LeuPheArgGlnSerPheValAspGlyLysGlnValGluAlaProAsp145150155160AspTrpHisArgSerAsnTyrProTrpPheArgHisAsnGluAlaLeu165170175AspValGlnValGlyIleGlyGlyLysValThrLysAspGlyArgTrp180185190GluProGluPheThrIleThrGlyGlnAlaTrpAspLeuProValVal195200205GlyTyrArgAsnGlyValAlaGlnProLeuArgLeuTrpGlnAlaThr210215220HisAlaHisProPheAspLeuThrLysPheAsnAspGlyAspPheLeu225230235240ArgAlaGluGlnGlnGlyIleAsnAlaGluLysLeuThrLysValLeu245250255TyrProAsnAspAsnHisThrAlaGlyLysLysLeuArgLeuMetGln260265270GlnTyrPheGlnCysAlaCysSerValAlaAspIleLeuArgArgHis275280285HisLeuAlaGlyArgGluLeuHisGluLeuAlaAspTyrGluValIle290295300GlnLeuAsnAspThrHisProThrIleAlaIleProGluLeuLeuArg305310315320ValLeuIleAspGluHisGlnMetSerTrpAspAspAlaTrpAlaIle325330335ThrSerLysThrPheAlaTyrThrAsnHisThrLeuMetProGluAla340345350LeuGluArgTrpAspValLysLeuValLysGlyLeuLeuProArgHis355360365MetGlnIleIleAsnGluIleAsnThrArgPheLysThrLeuValGlu370375380LysThrTrpProGlyAspGluLysValTrpAlaLysLeuAlaValVal385390395400HisAspLysGlnValHisMetAlaAsnLeuCysValValGlyGlyPhe405410415AlaValAsnGlyValAlaAlaLeuHisSerAspLeuValValLysAsp420425430LeuPheProGluTyrHisGlnLeuTrpProAsnLysPheHisAsnVal435440445ThrAsnGlyIleThrProArgArgTrpIleLysGlnCysAsnProAla450455460LeuAlaAlaLeuLeuAspLysSerLeuGlnLysGluTrpAlaAsnAsp465470475480LeuAspGlnLeuIleAsnLeuValLysLeuAlaAspAspAlaLysPhe485490495ArgAspLeuTyrArgValIleLysGlnAlaAsnLysValArgLeuAla500505510GluPheValLysValArgThrGlyIleAspIleAsnProGlnAlaIle515520525PheAspIleGlnIleLysArgLeuHisGluTyrLysArgGlnHisLeu530535540AsnLeuLeuHisIleLeuAlaLeuTyrLysGluIleArgGluAsnPro545550555560GlnAlaAspArgValProArgValPheLeuPheGlyAlaLysAlaAla565570575ProGlyTyrTyrLeuAlaLysAsnIleIlePheAlaIleAsnLysVal580585590AlaAspValIleAsnAsnAspProLeuValGlyAspLysLeuLysVal595600605ValPheLeuProAspTyrCysValSerAlaAlaGluLysLeuIlePro610615620AlaAlaAspIleSerGluGlnIleSerThrAlaGlyLysGluAlaSer625630635640GlyThrGlyAsnMetLysLeuAlaLeuAsnGlyAlaLeuThrValGly645650655ThrLeuAspGlyAlaAsnValGluIleAlaGluLysValGlyGluGlu660665670AsnIlePheIlePheGlyHisThrValLysGlnValLysAlaIleLeu675680685AlaLysGlyTyrAspProValLysTrpArgLysLysAspLysValLeu690695700AspAlaValLeuLysGluLeuGluSerGlyLysTyrSerAspGlyAsp705710715720LysHisAlaPheAspGlnMetLeuHisSerIleGlyLysGlnGlyGly725730735AspProTyrLeuValMetAlaAspPheAlaAlaTyrValGluAlaGln740745750LysGlnValAspValLeuTyrArgAspGlnGluAlaTrpThrArgAla755760765AlaIleLeuAsnThrAlaArgCysGlyMetPheSerSerAspArgSer770775780IleArgAspTyrGlnAlaArgIleTrpGlnAlaLysArg785790795<210>36<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>質(zhì)粒和基因連接部分的序列<400>36acccaaatcgataggaggaaaacatatgaccttgagt37<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>質(zhì)粒和基因連接部分的序列<400>37gcataagagggggaagtgaatgaaaaggtaccttcggg38<210>38<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列<400>38aaatcgataggaggaaaacatatgaccttgagtgagaaaat41<210>39<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列<400>39gaaggtaccttttcattcacttccccctc29<210>40<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列<400>40ttcggatcctcaccttgagtgagaaaattcac32<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列<400>41ttcggatccttttcattcacttccccctc29<210>42<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列<400>42aaatcgataggaggaaaacatatggcaaacgccaatggaaaagctgcgactagtttaccg60gagaaaatctc71<210>43<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物序列<400>43gaaggtaccttagggaacaggacaagcctcaatgttccaaatctctttggcatactgag59<210>44<211>9<212>PRT<213>馬鈴薯(Solanumtuberosum)<400>44HisAlaGluPheThrProValPheSer15<210>45<211>9<212>PRT<213>水稻(Oryzasativa)<400>45HisAlaGlnTyrSerProHisPheSer15<210>46<211>8<212>PRT<213>馬鈴薯(Solanumtuberosum)<400>46AlaLeuGlyAsnGlyGlyLeuGly15<210>47<211>9<212>PRT<213>馬鈴薯(Solanumtuberosum)<400>47ArgIleValLysPheIleThrAspVal15<210>48<211>9<212>PRT<213>水稻(Oryzasativa)<400>48ArgIleValLysLeuValAsnAspVal1權(quán)利要求1.耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其通過(guò)修飾天然α-葡聚糖磷酸化酶獲得，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，并且所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。2.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置、對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。3.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列與選自下組的氨基酸序列具有至少50％一致性SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。4.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列由核酸分子編碼，所述核酸分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼選自下組氨基酸序列的堿基序列組成的核酸分子雜交SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。5.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置、對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置。6.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1H中第4位的位置、對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置和對(duì)應(yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。7.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列選自SEQIDNO2的第1位到第916位；SEQIDNO4的第1位到第912位；SEQIDNO6的第1位到第893位；SEQIDNO8的第1位到第939位；SEQIDNO10的第1位到第962位；SEQIDNO12的第1位到第971位；SEQIDNO14的第1位到第983位；SEQIDNO16的第1位到第928位；SEQIDNO18的第1位到第951位；SEQIDNO20的第1位到第832位；SEQIDNO22的第1位到第840位；SEQIDNO24的第1位到第841位；SEQIDNO26的第1位到第842位；SEQIDNO28的第1位到第841位；和SEQIDNO30的第1位到第838位。8.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于馬鈴薯或擬南芥。9.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其在選自下組的至少兩個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。10.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其在以下位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。11.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置上的氨基酸殘基選自I、L和V。12.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置上的氨基酸殘基選自I和L。13.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置上的氨基酸殘基選自A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V和Y。14.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置上的氨基酸殘基選自C、G、S和V。15.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置上的氨基酸殘基選自C、I、L、V和W。16.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置上的氨基酸殘基選自C、I、L和V。17.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的30％或更多。18.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中65℃加熱2分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。19.根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶比較其保存穩(wěn)定性被提高。20.制備耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的方法，包括修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的第一種核酸分子，以獲得含修飾堿基序列的第二種核酸分子；制備含所述第二種核酸分子的表達(dá)載體；將所述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，以表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶；和回收所表達(dá)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同于所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基在以下位置不同于所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；或?qū)?yīng)所述基序序列3L中第7位的位置或?qū)?yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1L中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3L中第7位的位置。23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)所述基序序列1H中第4位的位置；對(duì)應(yīng)所述基序序列2中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)所述基序序列3H中第7位的位置。24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于馬鈴薯或擬南芥。25.核酸分子，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列。26.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求25的核酸分子。27.細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求25的核酸分子。28.合成葡聚糖的方法，包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑，和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述反應(yīng)在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。30.合成葡聚糖的方法，包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、引發(fā)劑和葡萄糖-1-磷酸。31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述反應(yīng)在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。32.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求1的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述反應(yīng)在60℃-75℃的溫度下進(jìn)行。34.耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其通過(guò)修飾植物來(lái)源的天然α-葡聚糖磷酸化酶獲得，其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的以下位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1LH-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或?qū)?yīng)基序序列1HH-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；對(duì)應(yīng)基序序列2A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和對(duì)應(yīng)基序序列3LR-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或?qū)?yīng)基序序列3HR-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量為600kDa或更高的直鏈淀粉。35.耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其通過(guò)修飾天然α-葡聚糖磷酸化酶獲得，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸的位置(F39)、對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置；并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。36.制備耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶的方法，包括修飾含編碼第一種α-葡聚糖磷酸化酶的堿基序列的第一種核酸分子，以獲得含修飾堿基序列的第二種核酸分子；制備含所述第二種核酸分子的表達(dá)載體；將所述表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，以表達(dá)耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，和回收所表達(dá)的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述第一種α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸的位置(F39)、對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置，并且其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。37.合成葡聚糖的方法，包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求35的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引發(fā)劑，和無(wú)機(jī)磷酸或葡萄糖-1-磷酸。38.合成葡聚糖的方法，包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡聚糖，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求35的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、引發(fā)劑和葡萄糖-1-磷酸。39.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，包括使反應(yīng)液發(fā)生反應(yīng)以產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸，所述反應(yīng)液中含有根據(jù)權(quán)利要求35的耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和無(wú)機(jī)磷酸。40.耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶，其通過(guò)修飾植物來(lái)源的天然α-葡聚糖磷酸化酶而獲得，其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有與所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸殘基不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸的位置(F39)；對(duì)應(yīng)第135位天冬酰胺(N135)的位置；和對(duì)應(yīng)第706位蘇氨酸(T706)的位置，其中在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中60℃加熱10分鐘后，所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且其中所述耐熱化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量為600kDa或更高的直鏈淀粉。全文摘要通過(guò)修飾天然α－葡聚糖磷酸化酶獲得的耐熱化α－葡聚糖磷酸化酶；和制備所述耐熱化α－葡聚糖磷酸化酶的方法。所述天然α－葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于植物。與天然α－葡聚糖磷酸化酶比較，耐熱化α－葡聚糖磷酸化酶在選自下組的至少一個(gè)位置具有不同的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)基序序列1L或1H的4－位的位置、對(duì)應(yīng)基序序列2的4－位的位置和對(duì)應(yīng)基序序列3L或3H的7－位的位置，并且在20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.7)中在60℃加熱10分鐘以后，所述耐熱化α－葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加熱之前所述耐熱化α－葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性的20％或更多。文檔編號(hào)C12P19/04GK1809636SQ20048001715公開(kāi)日2006年7月26日申請(qǐng)日期2004年6月15日優(yōu)先權(quán)日2003年6月18日發(fā)明者柳瀨美千代,高田洋樹(shù),藤井和俊,鷹羽武史,栗木隆申請(qǐng)人:江崎格力高株式會(huì)社