專(zhuān)利名稱(chēng)：延遲植物中種子落粒的方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳工程。特別地，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)植物特別是十字花科(Brassicaceae)植物中果實(shí)開(kāi)裂特征的方法和組合物，特別涉及用于在植物，例如十字花科植物，特別是種植用于油料生產(chǎn)的十字花科植物中減少種子落?；蛟谑斋@前減少種子落粒至農(nóng)學(xué)上重要的程度的改進(jìn)方法和手段。
背景來(lái)自十字花科植物長(zhǎng)角果或莢果通過(guò)稱(chēng)為開(kāi)裂的過(guò)程釋放其種子。長(zhǎng)角果由兩片邊緣相連的心皮構(gòu)成。兩個(gè)邊界之間的縫形成了厚棱，稱(chēng)作胎座框。當(dāng)莢果接近成熟時(shí)，兩個(gè)裂片從胎座框沿著指定的莢果上的薄弱線逐漸分開(kāi)，最后導(dǎo)致附著在胎座框上的種子落粒。開(kāi)裂帶確定了裂片分離的確切位置。
在作物收獲前或期間，成熟莢果的種子脫落(也稱(chēng)種“種子脫?！薄ⅰ扒v果脫?！?是發(fā)育干裂果的作物的普遍現(xiàn)象。早熟種子脫落導(dǎo)致減少的種子回收，代表了在主要為獲得種子的作物例如生產(chǎn)油料的十字花科植物特別是油籽油菜中的問(wèn)題。另一個(gè)涉及早熟種子落粒的問(wèn)題是在隨后的作物年份自生生長(zhǎng)的增加。在油籽油菜中，涉及莢果落粒的產(chǎn)量損失通常是為10至28％，但也可高達(dá)50％，這依賴(lài)于天氣條件。
目前商業(yè)油籽油菜變種極其容易落粒。Kadkol等人[(1986)，Aust.J.Biol.3479]報(bào)道了一種澳大利亞油菜對(duì)落粒的抗性增加。在從輻射處理的種子生長(zhǎng)的油菜突變體中進(jìn)一步觀察到莢果成熟中的變化[Luczkiewicz(1987)，Proc.7th Int.Rapeseed Congress 2463]。然而常規(guī)的育種方法未曾成功地給油菜栽培種引入落?？剐远植桓蓴_其它所希望的性狀，例如早開(kāi)花期、成熟和黑脛病抗性[Prakash和Chopra(1990)，Genetical Research561]。
通過(guò)突變體分析，已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中鑒定了幾種促進(jìn)或抑制莢果開(kāi)裂的基因。這些基因編碼假定的MADS盒和基本螺旋-環(huán)螺旋-突變。SHATTERPROOFI(SHPI；最初稱(chēng)作AGL1)和SHATTERPROOF2(SHP2；最初稱(chēng)作AGL5)的組合突變產(chǎn)生不開(kāi)裂的長(zhǎng)角果(即，在擬南芥中成熟時(shí)保持閉合的長(zhǎng)角果)(Liljegren等人，2000，Nature 404,766-770)。類(lèi)似地，在擬南芥中INDEHISCENT基因(PCT公開(kāi)WO 01/79517)，以及ALCATRi1Z(Rajani等人2001，Current Biology11，1914-1922)中突變體干擾了莢果開(kāi)裂，導(dǎo)致莢果落?？剐?。FRUITFUL(FUL)(SHP和IND的抑制基因)在擬南芥中組成型表達(dá)時(shí)也導(dǎo)致不開(kāi)裂的長(zhǎng)角果(Ferrandiz等人，2000，Science，289,436-438)。因此這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)裂片包括裂片邊緣和開(kāi)裂帶的發(fā)育。
也已經(jīng)鑒定了許多水解酶(如內(nèi)聚半乳糖醛酸酶)的基因，在莢果開(kāi)裂期，所述基因在來(lái)自十字花科植物的莢果的開(kāi)裂帶程序化分裂中起作用(見(jiàn)，例如，WO 97/13865；Petersen等人，Plant.Mol.Biol.，1996，31517-527)。
分離在經(jīng)濟(jì)上重要的十字花科植物例如油籽油菜中對(duì)應(yīng)于ind、alc或shpl-shp2的突變等位基因是件費(fèi)力和耗時(shí)的工作。此外，由于油籽油菜中的雙二倍性和因此產(chǎn)生的相應(yīng)基因的功能冗余使這種分離復(fù)雜化。
已描述了通過(guò)使用基因沉默技術(shù)例如反義抑制或共抑制(WO99/00503；WO01/79517；WO0159122)可下調(diào)ALC、IND、AGL1和AGL5基因的表達(dá)。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain，6月28日-7月2日；2002)報(bào)導(dǎo)了來(lái)自擬南芥處于CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的FUL在油籽油菜中的表達(dá)產(chǎn)生了大量莢果落粒的抗性轉(zhuǎn)化體。這種莢果落?？剐云废档那v果沒(méi)有開(kāi)裂帶，并且只能通過(guò)施加相當(dāng)大的壓力隨機(jī)地破碎裂片才能打開(kāi)所述莢果。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain，6月28日-7月2日；2002)還報(bào)導(dǎo)了通過(guò)使用所稱(chēng)作的dsRNA沉默技術(shù)沉默擬南芥中IND基因產(chǎn)生幾乎完全莢果落?？剐?。98％的所述轉(zhuǎn)基因擬南芥品系發(fā)育出不會(huì)沿著裂片縫打開(kāi)和只能通過(guò)對(duì)所述裂片施加相當(dāng)壓力的才能打開(kāi)的長(zhǎng)莢果。
此外，描述于本申請(qǐng)(參見(jiàn)下文)的實(shí)驗(yàn)表明使用dsRNA基因沉默技術(shù)在歐洲油菜(Brassica napus)中沉默IND基因產(chǎn)生了具有在標(biāo)準(zhǔn)化的隨機(jī)碰撞試驗(yàn)中只能通過(guò)裂片隨機(jī)破裂打開(kāi)的莢果的莢果脫?？剐云废?，其中所述dsRNA序列與歐洲油菜的IND一種同源物的序列相同。
認(rèn)識(shí)到盡管種子落粒在油籽油菜栽培中構(gòu)成重要問(wèn)題時(shí)，仍要求從莢果中分離種子是很重要的，其中所述問(wèn)題可以通過(guò)培育莢果落?？剐云废到鉀Q。在正常農(nóng)業(yè)實(shí)踐中，通過(guò)聯(lián)合收割機(jī)對(duì)莢果脫?？蓪?shí)現(xiàn)這個(gè)目的。通過(guò)聯(lián)合收割機(jī)對(duì)莢果進(jìn)行脫粒必須完全和必須使對(duì)所釋放的種子的損傷減小到最小。然而，隨著莢果強(qiáng)度增加，對(duì)其進(jìn)行脫粒所要求的更強(qiáng)的作用力對(duì)種子產(chǎn)生了不可接受的破壞。因此莢果落?？剐允只浦参锏那v果不應(yīng)當(dāng)太強(qiáng)以至其不能在聯(lián)合收割機(jī)中進(jìn)行脫粒(Bruce等人2001，J.Agric.Engng Res.80，343-350)。
因此本領(lǐng)域在提供用于減少在十字花科植物特別是在油籽油菜中種子落粒而保留足夠的脫粒能力的方法和手段中仍有缺陷。
如通過(guò)本發(fā)明簡(jiǎn)述、詳述和權(quán)利要求中描述的多種實(shí)施方案所表明的，通過(guò)本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)這些和其它目標(biāo)。
發(fā)明簡(jiǎn)述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于減少植物，優(yōu)選地十字花科植物(例如油籽油菜植物)中種子落粒的方法，包括步驟-產(chǎn)生植物，優(yōu)選地十字花科植物的轉(zhuǎn)基因品系群體，其中所述群體的轉(zhuǎn)基因品系在莢果落粒抗性上表現(xiàn)出變異，并且其中所述群體可通過(guò)下列方式獲得
-向植物，優(yōu)選十字花科植物的細(xì)胞中導(dǎo)入嵌合基因以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述嵌合基因包含下列有效地連接的DNA片段-植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；-DNA區(qū)，其轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生能夠減少植物，優(yōu)選十字花科植物的內(nèi)源基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述基因涉及植物，優(yōu)選十字花科植物的莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣的發(fā)育，此類(lèi)基因選自來(lái)自擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)自擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)自擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)自擬南芥的SHATTERPROOF2基因或存在于十字花科植物中的其同源基因，并且所述RNA分子包含第一和第二個(gè)RNA區(qū)，其中(i)第一個(gè)RNA區(qū)包含與涉及莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的內(nèi)源基因的核苷酸序列具有約94％序列同一性的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(ii)第二個(gè)RNA區(qū)包含與第一個(gè)RNA區(qū)的所述19個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(iii)第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠在第一和第二區(qū)的至少所述19個(gè)連續(xù)核苷酸之間堿基配對(duì)形成雙鏈RNA分子；(b)3’末端區(qū)包含在所述植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)。
其中所述嵌合基因，當(dāng)在植物，優(yōu)選十字花科植物的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，與未轉(zhuǎn)化的植物，優(yōu)選未轉(zhuǎn)化的十字花科植物中的莢果脫粒抗性相比增加了莢果脫粒抗性，同時(shí)保持了所述植物莢果的農(nóng)學(xué)上相關(guān)的可脫粒性；-從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因品系；和-從所述群體中選擇莢果落?？剐灾参?，其中所述植物具有表現(xiàn)延遲的種子落粒的莢果。
農(nóng)學(xué)上相關(guān)的可脫粒性?xún)?yōu)選地對(duì)應(yīng)于隨機(jī)碰撞試驗(yàn)中10到60秒、優(yōu)選地40到60秒的莢果半壽期。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述植物可表達(dá)啟動(dòng)子可以是相對(duì)較弱的植物可表達(dá)啟動(dòng)子，例如來(lái)自農(nóng)桿菌(Agrobacterium spp.)的冠癭堿合成酶啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合成酶啟動(dòng)子、農(nóng)桿糖酯合成酶啟動(dòng)子或甘露堿合成酶啟動(dòng)子或開(kāi)裂帶或裂片邊緣選擇性啟動(dòng)子，并且所述正義和反義RNA區(qū)可包含約19至約500個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其與所述內(nèi)源基因核苷酸序列具有約90％至約100％的序列相似性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)RNA區(qū)可包含具有與所述內(nèi)源基因約50％至約88％，優(yōu)選地約65％至約75％的序列同一性的約50至約500個(gè)連續(xù)核苷酸的序列；所述第二個(gè)RNA可包含具有與第一個(gè)RNA區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列約90至約100％的序列相似性的核苷酸序列；并且第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠形成雙鏈RNA區(qū)。
在本發(fā)明的另一具實(shí)施方案中，十字花科植物可以是油籽油菜植物；所述第一個(gè)RNA區(qū)可包含含有至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述連續(xù)核苷酸來(lái)自涉及莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的第二種基因的核苷酸序列，所述第二種基因是不同于油籽油菜的十字花科植物的內(nèi)源基因，例如所述第二種基因是選自來(lái)源于擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)源于擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF2基因；所述第二個(gè)RNA包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有約90％至約100％序列相似性的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于減少油籽油菜植物中種子落粒的方法，其包括下列步驟(2)產(chǎn)生所述油籽油菜植物的轉(zhuǎn)基因品系群體，其中所述轉(zhuǎn)基因品系群體在莢果落粒抗性上表現(xiàn)出變異，其中所述群體通過(guò)下列步驟獲得(i)將嵌合型基因?qū)胨鲇妥延筒酥参锏募?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述嵌合基因包含下列有效連接的DNA
(a)植物可表達(dá)啟動(dòng)子；(b)DNA區(qū)，其轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生可減少油籽油菜植物內(nèi)源基因的表達(dá)，所述基因涉及所述油籽油菜植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣的發(fā)育，例如所述基因選自來(lái)源于擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)源于擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF2基因，并且所述RNA分子包含第一和第二個(gè)RNA區(qū)，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其與來(lái)源于擬南芥的基因的核苷酸序列具有至少約90％序列同一性，所述基因涉及莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育；(ii)所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的50個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠堿基配對(duì)以在第一和第二個(gè)區(qū)之間形成至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的雙鏈RNA分子。
(c)3’區(qū)，所述3’區(qū)包含在所述植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)；(ii)從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因品系；和(3)從所述群體中選擇莢果落?？剐曰颍渲兴鲋参锞哂斜憩F(xiàn)減少的種子落粒性的莢果。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的嵌合基因以及這樣的嵌合基因的十字花科植物的細(xì)胞和其種子和后代，和可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的十字花科植物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分離的DNA片段，所述分離的DNA片段包含來(lái)自SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列和獲自十字花科植物的分離DNA片段，其在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的DNA片段雜交。本發(fā)明還涉及這種分離的DNA片段的用途，用于在十字花科植物例如油籽油菜中減少種子落?；蛟黾忧v果落?？剐浴?br> 本發(fā)明還提供了包含下列步驟的農(nóng)業(yè)方法(i)在田中播種根據(jù)本發(fā)明的種子或種植根據(jù)本發(fā)明的植物；(ii)培育所述植物直至莢果成熟；(iii)通過(guò)用聯(lián)合收割機(jī)脫粒從莢果收獲種子。
附圖簡(jiǎn)述

圖1來(lái)自AT-IND、BN1-IND和BN2-IND的可讀框的5’末端的比對(duì)。
本發(fā)明的不同實(shí)施方案詳述本發(fā)明基于意外的觀察涉及十字花科植物特別是油籽油菜植物中莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣的發(fā)育的基因的適度dsRNA基因沉默允許分離轉(zhuǎn)基因品系，其具有增加的莢果落?？剐院蜏p少的種子落粒，然而通過(guò)施加有限的物理力量仍能沿著開(kāi)裂帶打開(kāi)所述品系的莢果。這與例如本領(lǐng)域中所描述的轉(zhuǎn)基因十字花科植物相反，在所述十字花科植物中dsRNA沉默更加顯著，這造成具有不裂的莢果的轉(zhuǎn)基因品系，所述莢果不再能夠沿開(kāi)裂帶開(kāi)裂，并且只有在施加顯著的物理力量通過(guò)莢果的隨機(jī)破裂才能打開(kāi)，其中所述種子仍主要保留在莢果殘骸中。
通過(guò)例如將編碼dsRNA的DNA區(qū)有效連接相對(duì)較弱的啟動(dòng)子區(qū)或通過(guò)例如選擇編碼dsRNA的DNA區(qū)的互補(bǔ)的有義和反義部分之間的序列同一性低于90％和優(yōu)選地在約60％至80％范圍內(nèi)，可方便地實(shí)現(xiàn)基因的適度dsRNA基因沉默。
不意在將本發(fā)明限定于具體作用方式，認(rèn)為在這些實(shí)例中涉及開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的內(nèi)源基因表達(dá)水平的沉默是不完全的，從而在本發(fā)明的所述基因沉默性嵌合基因存在下，所述內(nèi)源基因的表達(dá)為約5％至約20％，特別在本發(fā)明的所述基因沉默性嵌合基因存在下內(nèi)源基因的表達(dá)為約10％。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了通過(guò)產(chǎn)生十字花科植物的轉(zhuǎn)基因品系群體減少十字花科植物中種子落粒的方法，其中所述群體的所述轉(zhuǎn)基因品系在莢果落?？剐陨媳憩F(xiàn)變異。通過(guò)將嵌合基因?qū)胧只浦参锏募?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可獲得該群體，其中所述嵌合基因包含有效連接至DNA區(qū)的植物可表達(dá)啟動(dòng)子和3’末端，所述DNA區(qū)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生能夠減少十字花科植物中涉及所述十字花科植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣的發(fā)育的內(nèi)源基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述3’末端包含在十字花科植物的細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)。所述RNA分子包含第一個(gè)(有義)RNA區(qū)和第二個(gè)(反義)RNA區(qū)，其中-所述第一個(gè)RNA區(qū)包含至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其與所述內(nèi)源基因的核苷酸序列具有約94％的序列同一性；-所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；-所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠堿基配對(duì)從而在所述第一和第二個(gè)區(qū)的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸之間形成雙鏈RNA分子。
相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的十字花科植物的莢果落?？剐裕谑只浦参镏兴銮逗匣虻谋磉_(dá)增加了莢果落?？剐?，然而保持了莢果農(nóng)學(xué)上相關(guān)的可脫粒性。在從包含本發(fā)明的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因品系后，可從所產(chǎn)生的群體中選擇莢果脫?？剐灾参铩?br> 如此處所用的，涉及莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因是指這樣的基因，當(dāng)所述基因在植物中單獨(dú)突變或與其它此類(lèi)基因組合突變時(shí)，導(dǎo)致莢果的發(fā)育，其中莢果開(kāi)裂帶和/或縫發(fā)育不充分或沒(méi)有發(fā)育。這些基因包括來(lái)自以南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)自擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)自擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)自擬南芥的SHATTERPROOF2基因或其同源基因。這些基因編碼包含MADS盒或基本螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)并據(jù)認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄激活因子。
可在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)這些基因的核苷酸序列或其部分并且這些序列具有下列檢索號(hào)AT-SHP1(M55553；AV557878；AV556852)；AT-SHP2(M55550；BG459390)AT-IND(AX320925)；來(lái)自蕪菁(Brassica rapa)Pekinenis亞種的AT-IND的同源物(AT002234)；AT ALC(AX211753；AX211755；AX211760)。所有這些核苷酸序列此處引用作為參考。
通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法可從其它十字花科植物特別是從其它油籽油菜植物、亞種或變種中分離包含上述核苷酸序列的變體序列的DNA片段。這些方法包括在嚴(yán)緊條件下將來(lái)源于此類(lèi)其它植物、亞種或變種的基因組或cDNA文庫(kù)與由上面提到的基因的任一種的所有或部分組成的探針雜交。
通過(guò)例如使用合適的寡核苷酸對(duì)，使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增可鑒定和分離涉及開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因的這類(lèi)變體或其合適部分，所述寡核苷酸具有上述涉及莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因的核苷酸序列的至少約16個(gè)連續(xù)核苷酸，特別地至少約50個(gè)連續(xù)核苷酸，更特別地至少約100個(gè)連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，所述寡核苷酸序列來(lái)源于涉及十字花科植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因的核苷酸序列的部分，所述部分與編碼常見(jiàn)蛋白質(zhì)基序例如MADS盒或K區(qū)或基本螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)的這些基因的部分不同。涉及十字花科植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因的PCR擴(kuò)增序列的實(shí)例是具有SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的序列的DNA分子。用于擴(kuò)增涉及十字花科植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因部分的合適的寡核苷酸引物的核苷酸序列的實(shí)例以SEQ ID No 4到SEQ IDNo 8代表。
如此處所用的“嚴(yán)緊雜交條件”是指在探針和靶序列之間存在至少95％和優(yōu)選地至少97％的序列同一性時(shí)雜交通常會(huì)發(fā)生的條件。嚴(yán)緊雜交條件的實(shí)例為在含有50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的經(jīng)剪切的載體DNA例如鮭精DNA的溶液中溫育過(guò)夜，然后在約65℃下用0.1x SSC清洗雜交支持體。其它雜交和清洗條件是熟知的并于Sambrook等人Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特別是第11章中給出示例。
如此所用的，“十字花科植物的內(nèi)源基因”是指天然地發(fā)生于十字花科的種中的基因，所述基因被選擇用于調(diào)節(jié)莢果落?？剐?。
如此處所用的，“農(nóng)學(xué)相關(guān)的脫粒性”是指當(dāng)施加允許莢果完全打開(kāi)同時(shí)防止破壞種子的物理力，例如聯(lián)合收割機(jī)中所用力時(shí)，莢果，特別是油籽油菜莢果對(duì)沿著莢果開(kāi)裂帶開(kāi)裂同時(shí)釋放種子的抗性。已發(fā)現(xiàn)在隨機(jī)碰撞試驗(yàn)(RITs)中莢果的半壽期與其可脫粒性具有良好相關(guān)性。在Bruce等人，2001(J.Agric.Engng Res.80，343-350)和Morgan等人，1988(Fields Crop Research 58，153-165)已描述了隨機(jī)碰撞試驗(yàn)和確定在此類(lèi)RITs中莢果的半壽期的算法。兩篇文獻(xiàn)在此引用作為參考。簡(jiǎn)而言之，將未成熟莢果的樣品放入帶有鋼球的封閉的鼓室中，然后以不斷增加的時(shí)間周期(例如5s、10s、20s、40s)猛烈攪動(dòng)鼓。每個(gè)周期過(guò)后，將鼓打開(kāi)和技術(shù)裂開(kāi)和受損的莢果數(shù)。通過(guò)將所有可獲得的數(shù)據(jù)擬合線性x線性曲線并估計(jì)樣品中一半莢果破碎所用時(shí)間(“莢果落粒半壽期”)來(lái)計(jì)算對(duì)各品系落?？剐运阶罹_的估計(jì)。然而重要的是莢果主要沿著開(kāi)裂帶開(kāi)裂，而不是如不裂莢果那樣簡(jiǎn)單地被粉碎。如在RIT中所確定的，對(duì)應(yīng)于農(nóng)學(xué)相關(guān)脫粒性的油籽油菜的莢果落粒半壽期不應(yīng)當(dāng)超過(guò)60秒。商業(yè)可購(gòu)得的油籽油菜變種對(duì)照系的典型值是約10秒。因此，具有改善的莢果落?？剐圆⑶揖哂修r(nóng)學(xué)相關(guān)可脫粒性的品系在RIT中的莢果落粒半壽期為約10到約60秒、優(yōu)選地約20到約60秒、特別優(yōu)選地約40秒到約60秒。
在本發(fā)明方法的特定實(shí)施方案中，通過(guò)使用相對(duì)弱的植物可表達(dá)啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)適度基因沉默。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指在轉(zhuǎn)錄起始期間由DNA依賴(lài)性RNA聚合酶識(shí)別和(直接和間接)結(jié)合的任意DNA。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和用于轉(zhuǎn)錄超始因子和RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，并且可包含基因表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白可結(jié)合的多種其它位點(diǎn)(例如，增強(qiáng)子)。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)區(qū)”指涉及驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄和控制(即調(diào)節(jié))給定的DNA序列，例如編碼蛋白或多肽的DNA轉(zhuǎn)錄的計(jì)時(shí)和水平的任意DNA。例如，5’調(diào)節(jié)區(qū)(或“啟動(dòng)子區(qū)”)是位于編碼序列的上游(即5’)的DNA序列并且所述DNA序列包含啟動(dòng)子和5’未翻譯的前導(dǎo)序列。3’調(diào)節(jié)區(qū)是位于編碼序列的下游(即3’)的序列并且所述調(diào)節(jié)區(qū)包含合適的轉(zhuǎn)錄終止和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，包括一個(gè)或多個(gè)多腺苷酸化信號(hào)。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“植物可表達(dá)啟動(dòng)子”是指能夠在植物細(xì)胞中控制(啟動(dòng))轉(zhuǎn)錄的DNA序列。其不僅包括植物來(lái)源的任意啟動(dòng)子，還包括能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的非植物來(lái)源的任意啟動(dòng)子，即某些病毒或細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子，例如CaMV35S(Hapster等人1988，Mol.Gen.Genet.212，182-190)、地三葉(subterranean clover)病毒啟動(dòng)子No 4或No 7(W09606932)或T-DNA基因啟動(dòng)子。
如此所用的，“相對(duì)弱的植物可表達(dá)啟動(dòng)子”是指啟動(dòng)和控制有效連接的DNA片段的轉(zhuǎn)錄的效率為最優(yōu)CaMV35S啟動(dòng)子的效率約1/10至約1/100的啟動(dòng)子。相對(duì)弱的植物可表達(dá)啟動(dòng)子包括來(lái)自農(nóng)桿菌(Agrobacterium spp.)的冠癭堿合成酶基因的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)，例如胭脂堿合成酶的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)、章魚(yú)堿合成酶的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)、甘露堿合成酶的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)、農(nóng)桿堿合成酶的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)和任意在轉(zhuǎn)錄起始中具相當(dāng)活性的植物可表達(dá)啟動(dòng)子。其它相對(duì)較弱的植物可表達(dá)啟動(dòng)子可以是開(kāi)裂帶選擇性啟動(dòng)子或主要或選擇性地在十字花科莢果特別是油籽油菜莢果的開(kāi)裂帶和/或裂片邊緣中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如描述于W097/13865的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述嵌合基因可包含編碼dsRNA的轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)，其中所述有義和反義RNA區(qū)包含與十字花科植物的內(nèi)源基因(或其互補(bǔ)序列)具有高度序列同一性的核苷酸序列，所述內(nèi)源基因使得所述十字花科植物的莢果更具抗性。因此，有義和反義RNA區(qū)可包含與所述十字花科植物的內(nèi)源基因或其具有互補(bǔ)序列具有約90％至約100％的序列同一性的至少50、100、200、500個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸。
對(duì)于本發(fā)明，表示為百分比的兩個(gè)相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指在兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列中具有相同殘基的位置數(shù)(x100)除以所比較的位置數(shù)。缺口，即在比對(duì)中被認(rèn)為是不具有同一殘基的位置，在所述位置上出現(xiàn)在一個(gè)序列上的殘基在另一個(gè)序列中不存在。根據(jù)Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的序列比對(duì)進(jìn)行兩個(gè)序列的比對(duì)，通過(guò)使用例如GAP，用默認(rèn)得分矩陣，以缺口產(chǎn)生罰分為50和缺口延伸罰分為3可方便地進(jìn)行兩個(gè)序列的比對(duì)，所述GAP是Wisconsin Package 10.1版本(Genetics ComputerGroup，Madison，Wisconsin，USA)的部分。
很清楚無(wú)論何時(shí)通過(guò)參考對(duì)應(yīng)的DNA分子的核苷酸序列來(lái)確定RNA分子的核苷酸序列，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)都應(yīng)當(dāng)被尿嘧啶(U)代替。根據(jù)本申請(qǐng)的上下文可清楚地判斷參照RNA還是DNA。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用第一和第二個(gè)RNA區(qū)可獲得適度基因沉默，所述RNA區(qū)與涉及莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的內(nèi)源基因、或其部分、或其互補(bǔ)序列具有約60至約88％的序列同一性，優(yōu)選約60至約75％的序列同一性。所述有義和反義RNA區(qū)可以是至少50、100、200、500個(gè)或更多個(gè)核苷酸。
通過(guò)用于實(shí)施例的嵌合基因的來(lái)源于擬南芥的IND的序列的有義RNA區(qū)(或反義區(qū)的互補(bǔ)序列)和歐洲油菜IND基因核苷酸序列的相應(yīng)區(qū)的比對(duì)觀察到不止存在一個(gè)21個(gè)連續(xù)核苷酸的亞區(qū)，所述亞區(qū)在每個(gè)歐洲油菜序列和擬南芥序列之間是相同的或只有一個(gè)錯(cuò)配(參見(jiàn)圖2)。然而，所述序列具有只有一個(gè)錯(cuò)配(即具有約94％的同一性的序列)的19個(gè)連續(xù)核苷酸的數(shù)個(gè)亞序列。盡管不意在將本發(fā)明限定在特定的實(shí)施方案中，但認(rèn)為在所述dsRNA分子和內(nèi)源基因之間21個(gè)核苷酸的核苷酸序列“字符”的缺少可在基因沉默的節(jié)制方面起著重要作用，因?yàn)橥ǔｎA(yù)期這21聚體在啟動(dòng)和維持dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默上起著重要作用。
對(duì)于油籽油菜植物，通過(guò)使用編碼dsRNA分子的嵌合基因可方便地實(shí)現(xiàn)適度基因沉默應(yīng)答，其中所述有義和反義區(qū)包含與至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列具有約90％或95％的序列同一性，尤其相同的核苷酸序列，其中所述至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列來(lái)源于擬南芥中涉及長(zhǎng)角果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因。然而，所述核苷酸序列可長(zhǎng)于19個(gè)核苷酸并且長(zhǎng)度可以是50、100、200、500個(gè)或甚至更多個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，通過(guò)使用編碼dsRNA分子的嵌合基因可在油籽油菜中實(shí)現(xiàn)減少的種子落粒，其中所述有義和反應(yīng)區(qū)對(duì)應(yīng)于擬南芥IND基因的從核苷酸+12至+223(相對(duì)于擬南介IND基因的ATG起始密碼子)的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，即從SEQ ID No 1中27位核苷酸至237位核苷酸。
根據(jù)WO 99/53050(此處引用作為參考)的公開(kāi)內(nèi)容，本發(fā)明的編碼dsRNA的嵌合基因可包含位于有義和反義RNA區(qū)之間的間隔序列中的異源內(nèi)含子。
本發(fā)明還提供了包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的新的分離的DNA片段以及其用途，用于調(diào)節(jié)或增加植物，例如十字花科植物，特別是油籽油菜植物中莢果落?？剐?。
除了歐洲油菜以外，根據(jù)本發(fā)明處理的優(yōu)選的十字花科植物包括芥菜(Brassica iuncea)、甘藍(lán)(Brassica oleraceae)、Brassica carinata、Brassicanigra、蕓苔(Brassica campestris)等和其任意基因間雜交品系或合成品系?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明方法處理的其它十字花科植物包括Brassica cretica(芥菜)、Brassica elongata(長(zhǎng)芥菜)、塌棵菜(Brassica narinosa)(broadbeakedmustard)、Brassica nigra(黑芥菜)、蕪青(Brassica rapa)(田野芥菜)、Brassica rupstris(芥菜)、Brassica tournefortii(亞洲芥菜)。歐洲油菜(2n＝38，基因組AACC)是來(lái)源于蕪青(同義詞蕓苔；2n＝2Q，AA)和甘藍(lán)(2n＝18，CC)自然雜交的雙二倍體品系。歐洲油菜包含這兩個(gè)二倍體基因的全套染色體。
如此處所用的“來(lái)自十字花科的植物”或“十字花科植物”是指根據(jù)目前植物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)被分類(lèi)到十字花科(以前為Cruciferaeae)的植物。十字花科(Mustard)成員很容易區(qū)分。它們是一年生或多年生植物，具有無(wú)托葉的互生葉并且具有簡(jiǎn)單的花序或分枝總狀花序。花雙側(cè)對(duì)稱(chēng)和下位的。除了少數(shù)例外，花具有與4個(gè)萼片(自由的)互生的4個(gè)花瓣(自由的)；6個(gè)雄蕊(4個(gè)長(zhǎng)的和2個(gè)短的)、具有部分胎座的2個(gè)單生心皮構(gòu)成的子房、通過(guò)形成膜狀假隔膜產(chǎn)生的2個(gè)小室；果實(shí)是通過(guò)2個(gè)裂片打開(kāi)的開(kāi)裂蒴果。十字花科包括下列屬大蒜芥屬(Sisymbrium)、Descurania、蔥芥屬(Alliaria)、擬南芥屬(Arabidopsis)、Myagrum、Isatis、匙芥屬(Bunia)、Erysium、香花芥屬(Hesperis)、澀芥屬(Malcolmia)、紫羅蘭屬(Matthiola)、Chorispora、烏頭薺屬(Euclidium)、山芥屬(Barbarea)、蔊菜屬(Rorippa)、辣根屬(Armoracia)、豆瓣菜屬(Nasturtium)、碎米薺屬(Dentaria)、碎米薺屬(Cardamine)、Cardaminopsis、南芥屬(Arabis)、Lunaria、庭薺屬(Alyssum)、團(tuán)扇薺屬(Berteroa)、香雪球?qū)?Lobularia)、葶藶屬(Draba)、Erophila、巖薺屬(Cochlearia)、亞麻薺屬(Camelina)、球果薺屬(Neslia)、薺屬(Capsella)、Hornungia、Thlsapi、屈曲花屬(Iberis)、獨(dú)行菜屬(Lepidium)、群心菜屬(Cardaria)、臭薺屬(Coronopus)、Subularia、線果薺屬(Conringia)、二行薺屬(Diplotaxis)、蕓苔屬(Brassica)、白芥屬(Sinapsis)、芝麻菜屬(Eruca)、Erucastrum、Coincya、Hirschfeldia、Cakile、Rapistum、兩節(jié)薺屬(Crambe)、Enarthrocarpus、Rhaphanus和香芥屬(Clausia)等等。
如此處所用的，“油籽油菜”應(yīng)當(dāng)被理解為包括歐洲油菜、芥菜(Brassica juneeae)和蕓苔(Brassica campestris)種。
本發(fā)明的手段和方法也可用于除了十字花科以外的植物，特別是具有必須通過(guò)裂片分開(kāi)釋放種子的果實(shí)或莢果的植物。這些包括豆科(Fabaceae)成員，例如豌豆、菜豆、大豆等。
提供含有本發(fā)明的嵌合基因或RNA分子的植物細(xì)胞和植物也是本發(fā)明的目的。通過(guò)常規(guī)育種方法產(chǎn)生的含有本發(fā)明的嵌合基因的配子、種子(包括碾碎的種子和種子餅)、合子或體細(xì)胞胚、植物的后代或雜種也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
通過(guò)常規(guī)的育種技術(shù)可將通過(guò)此處描述的方法獲得的植物進(jìn)一步與其它植物雜交以獲得包含本發(fā)明嵌合基因的莢果落?？剐缘暮蟠参?。
下列非限定性的實(shí)施例描述了用于在十字花科植物減少種子落?；蛘{(diào)節(jié)果實(shí)開(kāi)裂的嵌合基因的構(gòu)建，和包含這類(lèi)嵌合基因的十字花科植物，其在農(nóng)學(xué)相關(guān)范圍內(nèi)表現(xiàn)出減少的種子落粒。
在實(shí)施例中除了另外聲明，所有的重組DNA技術(shù)都根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，所述實(shí)驗(yàn)方法描述于Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA.的第1和第2卷中。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK聯(lián)合出版。其它標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的文獻(xiàn)包括Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，Brown(1998)Molecular Biology LabFax，第二版，Academic Press(UK)的第1和第2卷。用于聚合酶鏈反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的材料和方法可見(jiàn)Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press和在MePherson等人(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，第4版SpringerVerlag，Germany。
在整個(gè)描述和實(shí)施例中，涉及下列序列SEQ ID No.1擬南芥INDEHISCENT基因(AT-IND)的核苷酸序列SEQ ID No.2來(lái)源于歐洲油菜的INDEHISCENT同源物的核苷酸序列(BN1-IND)SEQ ID No.3來(lái)源于歐洲油菜的另一種INDEHISCENT同源物的核苷酸序列(BN2-IND)SEQ ID No.4寡核苷酸C0109/CO111的共有核苷酸序列SEQ ID No.5寡核苷酸CO110/CO112的共有核苷酸序列SEQ ID No.6寡核苷酸C0113/CO114的共有核苷酸序列SEQ ID No.7寡核苷酸CO115/CO117的共有核苷酸序列SEQ ID No.8寡核苷酸CO116/CO118的共有核苷酸序列
SEQ ID No.9擬南芥SHATTERPROOF 1基因(AT-SHP1)的核苷酸序列SEQ ID No.10擬南芥SHATTERPROOF 2(AT-SHP2)的核苷酸序列SEQ ID No.11擬南芥ALCATRAZ基因(AT-ALC)的核苷酸序列實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建編碼能夠減少涉及開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因表達(dá)的dsRNA的嵌合基因和導(dǎo)入植物中A.基于IND基因序列通過(guò)PCR在標(biāo)準(zhǔn)條件下擴(kuò)增擬南芥的IND基因或歐洲油菜的同源基因的5’末端片段，在所述PCR反應(yīng)中使用來(lái)自擬南芥的基因組DNA或從歐洲油菜PCR擴(kuò)增的DNA作為模板，所述從歐洲油菜PCR擴(kuò)增的DNA包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3和下列寡核苷酸的序列-對(duì)于At-IND基因的5′末端包含SEQ ID No 7的序列的寡核苷酸和包含SEQ ID No 8的序列的寡核苷酸，在所述寡核苷酸的5’末端配備合適的限制性酶切位點(diǎn)以允許定向克隆。
-對(duì)于BN1-IND基因的5′末端包含SEQ ID No 4的序列的寡核苷酸和包含SEQ ID No 6的序列的寡核苷酸，在所述寡核苷酸的5’末端配備合適的限制性酶切位點(diǎn)以允許定向克隆。
-對(duì)于BN2-IND基因的5′末端包含SEQ ID No 4的序列的寡核苷酸和包含SEQ ID No 5的序列的寡核苷酸，在所述寡核苷酸的5’末端配備合適的限制性酶切位點(diǎn)以允許定向克隆。
來(lái)自歐洲油菜的同源基因的擴(kuò)增PCR片段具有約90％的序列同一性，而At-Ind基因和各BN-Ind間的序列同一性約為65％(參見(jiàn)圖1)。
使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)已構(gòu)建了下列嵌合基因并將其連同合適的選擇性標(biāo)記基因(植物可表達(dá)的bar基因)導(dǎo)入T-DNA載體中，其中所述嵌合基因編碼能夠降低涉及莢果的開(kāi)裂帶和/或裂片邊緣發(fā)育的基因的表達(dá)的dsRNA。
pTCO219pTC0219是在T-DNA邊界之間包含下列序列的T-DNA載體1.包含下列有效連接的DNA片段的編碼dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/AtIND)●p35S來(lái)自花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子區(qū)(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●AtIND反義相對(duì)于擬南芥Ind1基因的ATG起始密碼子從核苷酸+12至+223的211bp片段，所述片段編碼涉及莢果開(kāi)裂的基本螺旋環(huán)螺旋蛋白質(zhì)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No 1序列上的從27位核苷酸至239位核苷酸)。該片段按有義方向克隆。
●Pdk-內(nèi)含子來(lái)自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(稱(chēng)作pdk基因)的第二個(gè)內(nèi)含子的序列。
●AtIND反義相對(duì)于擬南芥Ind1基因的ATG起始密碼子從核苷酸+12至+223的211bp片段，所述片段編碼涉及莢果開(kāi)裂的基本螺旋環(huán)螺旋蛋白質(zhì)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No 1序列上的從27位核苷酸至239位核苷酸)。該片段以反義方向克隆。
●3’ocs來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的3’非翻譯末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBOJ.3835-846)。
2.包含下列有效連接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra來(lái)自擬南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列的1726bp DNA片段。
●bar來(lái)自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的編碼序列(Tbompson等人，1987，EMBO 6，2519)。
●3’g7含有獲自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻譯區(qū)的3’末端形成信號(hào)的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。
質(zhì)粒pTC0219來(lái)源pGSVl。基本中間載體pGSV1已基本上衍生于pGSC1700((Cornelissen和Vandewiele，1989)和包含下列結(jié)構(gòu)元件-包含來(lái)源于用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322(Bolivar等人，1977)的復(fù)制起點(diǎn)(pBRori)的質(zhì)粒核心和包含來(lái)自用于在根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium turnefaciens)中復(fù)制的假單胞菌(Pseudomonas)質(zhì)粒pVS1(Itoh等人，1984)的復(fù)制起點(diǎn)的限制性片段(pVSlori)；-提供用于在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中進(jìn)行繁殖和選擇的抗鏈霉素和壯觀霉素抗性的選擇標(biāo)記基因；由來(lái)自pTiB6S3的TL-DNA的左邊界和右邊界序列和多位點(diǎn)接頭組成的人工T-區(qū)允許在T-DNA邊界之間插入GOI。
pTKC89pTKC89是類(lèi)似于pTCO219的T-DNA載體，其中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)已將CaMV35S啟動(dòng)子交換成來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶啟動(dòng)子。
pTCO212pTCO212是在T-DNA邊界之間包含下列序列的T-DNA載體1.包含下列有效連接的DNA片段的編碼dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/BN2-IND)●p35S來(lái)自花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子區(qū)(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●BN2-IND反義相對(duì)于擬南芥Ind1基因的歐洲油菜同源物(同源物2)的ATG起始密碼子從核苷酸+12至+273的261bp片段，所述片段編碼涉及莢果開(kāi)裂的基本螺旋環(huán)螺旋蛋白質(zhì)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No 3序列上的從30位核苷酸至290位核苷酸)。該片段按有義方向克隆。
●Pdk-內(nèi)含子來(lái)自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(稱(chēng)作pdk基因)的第二個(gè)內(nèi)含子的序列。
●BN2-IND反義相對(duì)于擬南芥Ind1基因的歐洲油菜同源物(同源物2)的ATG起始密碼子從核苷酸+12至+273的261bp片段，所述片段編碼涉及莢果開(kāi)裂的基本螺旋環(huán)螺旋蛋白質(zhì)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No 3序列上的從30位核苷酸至290位核苷酸)。該片段以反義方向克隆。
●3’ocs來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的3’非翻譯末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效連接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra來(lái)自擬南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列的1726bpDNA片段。
●bar來(lái)自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的編碼序列(Thompson等人，1987，EMBO6，2519)。
●3’g7含有獲自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻譯區(qū)的3’末端形成信號(hào)的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。PTCO212來(lái)源于pGVS1(見(jiàn)上文)。
●pTCO218pTCO218是在T-DNA邊界之間包含下列序列的T-DNA載體1.包含下列有效連接的DNA片段的編碼dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/BN1-IND)●p35S來(lái)自花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子區(qū)(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●BN1-IND反義相對(duì)于擬南芥Ind1基因的歐洲油菜同源物(同源物1)的ATG起始密碼子從核苷酸+12至+281的269bp片段，所述片段編碼涉及莢果開(kāi)裂的基本螺旋環(huán)螺旋蛋白質(zhì)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No 2序列上的從31位核苷酸至299位核苷酸)。該片段按有義方向克隆。
●Pdk-內(nèi)含子來(lái)自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(稱(chēng)作pdk基因)的第二個(gè)內(nèi)含子的序列。
●BN1-IND反義相對(duì)于擬南芥Ind1基因的歐洲油菜同源物(同源物2)的ATG起始密碼子從核苷酸+12至+281的269bp片段，所述片段編碼涉及莢果開(kāi)裂的基本螺旋環(huán)螺旋蛋白質(zhì)(對(duì)應(yīng)于SEQ ID No 2序列上的從31位核苷酸至299位核苷酸)。該片段以反義方向克隆。
●3’ocs來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的3’非翻譯末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效連接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra來(lái)自擬南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列的1726bpDNA片段。
●bar來(lái)自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的編碼序列(Thompson等人，1987，EMBO 6，2519)。
●3’g7含有獲自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻譯區(qū)的3’末端形成信號(hào)的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.AcidsRes.136981)。
pTCO218來(lái)源于pGVS1(見(jiàn)上文)。
B.基于SHP1(SHP2)基因序列通過(guò)PCR已擴(kuò)增兩個(gè)分別標(biāo)記為AB和CD的來(lái)自以南芥SHP1基因的序列區(qū)并已將它們用于構(gòu)建TDNA載體，所述載體含有編碼能夠降低SHP基因表達(dá)的嵌合dsRNA。標(biāo)記為“AB”的區(qū)與SHP1具有100％的序列同一性，與SHP2具有約88％的序列同一性，而標(biāo)記為“CD”的區(qū)與SHP1具有100％的序列同一性和與SHP2具有約77％的序列同一性。
pTCO233pTCO233是在T-DNA邊界之間包含下列序列的T-DNA載體1.包含下列有效連接的DNA片段的編碼dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/At-SHP1AB)●p35S來(lái)自花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子區(qū)(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●At-SHP1/AB有義擬南芥SHP1基因?qū)?yīng)于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第258位核苷酸至第375位核苷酸的片段。該片段以有義方向克隆。
●Pdk-內(nèi)含子來(lái)自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(稱(chēng)作pdk基因)的第二個(gè)內(nèi)含子的序列。
●At-SHP1/AB反義擬南芥SHP1基因?qū)?yīng)于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第258位核苷酸至第375位核苷酸的片段。該片段以反義方向克隆。
●3’ocs來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的3’非翻譯末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效連接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra來(lái)自擬南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列的1726bpDNA片段。
●bar來(lái)自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的編碼序列(Thompson等人，1987，EMBO6，2519)。
●3’g7含有獲自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻譯區(qū)的3’末端形成信號(hào)的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。
pTCO233來(lái)源于pGVS1(見(jiàn)上文)。
●pTCO234pTCO234是在T-DNA邊界之間包含下列序列的T-DNA載體1.包含下列有效連接的DNA片段的編碼dsRNA的嵌合基因(p35S-dsRNA/At-SHP1CD)●p35S來(lái)自花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子區(qū)(Odell等人(1985)Nature 313810-812)●At-SHP1/CD有義擬南芥SHP1基因?qū)?yīng)于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第567位核苷酸至第762位核苷酸的片段。該片段以有義方向克隆。
●Pdk-內(nèi)含子來(lái)自Flaveria trinervia(Rosche & Westhoff(1995)Plant Molecular Biology 29-4663-678)的丙酮酸正磷酸二激酶基因(稱(chēng)作pdk基因)的第二個(gè)內(nèi)含子的序列。
●At-SHP1/CD反義擬南芥SHP1基因?qū)?yīng)于SEQ ID No 9的核苷酸序列的第567位核苷酸至第762位核苷酸的片段。該片段以反義方向克隆。
●3’ocs來(lái)自章魚(yú)堿合成酶基因的3’非翻譯末端(De Greve等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1499-512；Gielen等人(1984)EMBO J.3835-846)。
2.包含下列有效連接的DNA片段的嵌合bar基因●pSSuAra來(lái)自擬南芥rbcS ATS1A基因(Krebbers等人，1988，Plant Mol.Biol.11745-759)的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列的1726bp DNA片段。
●bar來(lái)自吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bialaphos抗性基因的編碼序列(Thompson等人，1987，EMBO 6，2519)。
●3’g7含有獲自pTiB6S3上的TL-DNA基因的3’非翻譯區(qū)的3’末端形成信號(hào)的211bp DAN片段(Dhaese等人，1983，EMBO 2419；Velten和Schell，1985，Nucl.Acids Res.136981)。
pTCO234來(lái)源于pGVS1(見(jiàn)上文)。
將上述T-DNA載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌pGV4000。該宿主株系是將pTiC58導(dǎo)入C58得到的抗利福平衍生株系(C58ClRifR)(Van Larebeke等人，1974)。非致癌接納體Ti質(zhì)粒(pGV4000)來(lái)源于胭脂堿Ti質(zhì)粒pTiC58。來(lái)自pTiC58的整個(gè)T-DNA區(qū)已被替代從而產(chǎn)生pMP90(Koncz和Schell，1986)。如Deblaere等人，1985所描述的，通過(guò)導(dǎo)入氯霉素抗性基因已從pMP90中衍生出質(zhì)粒pGV4000。
根據(jù)花浸透法(Bechtold等人1993.，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences dela vie/Life Sciences，316，1194-1199)將所獲得的農(nóng)桿菌株系用于轉(zhuǎn)化擬南芥植物或根據(jù)下胚軸外植體接種方法(基本如De Block等人的1989，PlantPhysio，9164或WO00/04173中所描述的)轉(zhuǎn)化歐洲油菜植物。使用來(lái)源于N90-740的單倍體加倍系進(jìn)行所有的歐洲油菜轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例2包含實(shí)施例1的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系和歐洲油菜品系的分析。
A.轉(zhuǎn)基因擬南芥品系通過(guò)使用實(shí)施例1中所有的T-DNA載體轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥品系。就莢果落?？剐詫?duì)所獲得的品系進(jìn)行分析。來(lái)自未轉(zhuǎn)化野生型擬南芥品系的莢果在成熟時(shí)自動(dòng)開(kāi)裂。相反地，使用特定T-DNA載體轉(zhuǎn)化的各轉(zhuǎn)基因品系群體包含轉(zhuǎn)基因品系，所述轉(zhuǎn)基因品系中的植物發(fā)育出在成熟時(shí)不開(kāi)裂的莢果(此處稱(chēng)為莢果落?？剐?。在用特定T-DNA載體轉(zhuǎn)化的系的總?cè)后w中，具有莢果落?？剐缘霓D(zhuǎn)基因品系所占比例在23％到98％之間變化(參見(jiàn)表1)。通過(guò)使用兩個(gè)手指之間的壓力以半定量的方式確定打開(kāi)落?？剐赞D(zhuǎn)基因品系閉合的成熟莢果所需要的物理力量。以最小的壓力沿著開(kāi)裂帶完全打開(kāi)的莢果被分級(jí)為“+”，而只在開(kāi)裂帶基部打開(kāi)并且需要更大壓力完全打開(kāi)的莢果被分級(jí)為“++”。只能被碾碎(和不能沿著開(kāi)裂帶打開(kāi))的莢果分級(jí)為“+++”。
從表1概括的結(jié)果中可得出下列結(jié)論。
在使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子和與擬南芥內(nèi)源IND基因完全同源的有義/反義區(qū)的dsRNA嵌合基因(pTC0219)的情況下，a)幾乎所有轉(zhuǎn)基因品系發(fā)育出在成熟時(shí)保持閉合的莢果，b)幾乎所有這些轉(zhuǎn)基因品系的莢果要求相當(dāng)大的力量才能打開(kāi)。
在使用具有相對(duì)弱的啟動(dòng)子和與擬南芥內(nèi)源IND基因完全同源的有義/反義區(qū)的dsRNA嵌合基因(pTKC89)的情況下，a)約58％的轉(zhuǎn)基因品系發(fā)育出在成熟時(shí)保持閉合的莢果，b)約一半的這些轉(zhuǎn)基因品系的莢果只需要輕微至中等的物理力量就可打開(kāi)。
在使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子和具有與擬南芥內(nèi)源IND基因約65％的序列同一性的有義/反義區(qū)的dsRNA嵌合基因(pTCO212和pTCO218)的情況下a)只有約三分之一的所述轉(zhuǎn)基因品系發(fā)育出在成熟時(shí)保持閉合的莢果，b)這些轉(zhuǎn)基因品系的絕大部分莢果只需要輕微至中等的物理力量就可打開(kāi)。
在使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子和具有與擬南芥內(nèi)源SHP1基因約100％的序列同一性和與擬南芥內(nèi)源SHP2基因約71％或88％的序列同一性的有義/反義區(qū)的dsRNA嵌合基因(pTCO233和pTCO234)的情況下，a)只有約四分之一至一半的所述轉(zhuǎn)基因品系發(fā)育出在成熟時(shí)保持閉合的莢果，
b)這些轉(zhuǎn)基因品系的絕大部分莢果只需要輕微(pTCO233)至中等(pTCO234)的物理力量就可打開(kāi)。
從這些結(jié)果可得出使用相對(duì)弱的啟動(dòng)子或表現(xiàn)與參與開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因相比低于88％和特別是約65％的序列同一性的適度基因沉默可用于產(chǎn)生莢果落?？剐詳M南芥品系，只需要施加中等物理力量就可沿開(kāi)裂帶打開(kāi)所述品系中的所有莢果。
表1.轉(zhuǎn)基因擬南芥品系中莢果落?？剐?
B.轉(zhuǎn)基因歐洲油菜品系通過(guò)使用實(shí)施例1中的T-DNA載體pTCO212、pTC0218和pTC0219進(jìn)行轉(zhuǎn)化可獲得轉(zhuǎn)基因歐洲油菜品系。選擇含有單拷貝T-DNA插入的品系。就莢果落?？剐詫?duì)這些系進(jìn)行分析。來(lái)自未轉(zhuǎn)化的野生型歐洲油菜品系的莢果在成熟時(shí)通常保持閉合，但只要施加相對(duì)輕微的力就能打開(kāi)。為確定莢果落?？剐裕褂秒S機(jī)碰撞試驗(yàn)(如上所述)確定所述莢果的半壽期(表2和圖3概括的結(jié)果)。
非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌废翟赗IT中具有約10秒的莢果半壽期。
使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子和與內(nèi)源歐洲油菜IND基因(與擬南芥IND基因同源)具有約90％至約100％序列同一性的有義/反義區(qū)的dsRNA嵌合基因(pTC0212和pTC0218)，莢果不沿著開(kāi)裂帶開(kāi)裂并且在鼓中經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間后被磨碎。不能確定有意義的半壽期。
使用具有強(qiáng)啟動(dòng)子和與內(nèi)源歐洲油菜IND基因(與擬南芥IND基因同源)具有約65％序列同一性的有義/反義區(qū)的dsRNA嵌合基因(pTC0219)，在RIT中確定莢果半壽期為約15至約40秒。
表2.包含35S-AT-IND嵌合基因的轉(zhuǎn)基因歐洲油菜品系中的莢果落粒抗性(通過(guò)RIT確定)
從這些結(jié)果可得出，如在擬南芥中所示例的，本發(fā)明的方法在油籽油菜作物植物中產(chǎn)生類(lèi)似的結(jié)果。
序列表<110>拜爾生物科學(xué)公司加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)<120>延遲植物中種子落粒的方法和手段<130>BCS 03-2003<150>EP 03076952.5<151>2003-06-23<160>11<170>PatentIn版本3.0<210>1<211>597<212>DNA<213>人工的<220>
<223>擬南芥INDEHISCENT基因(AT-IND)的核苷酸序列<400>1atggaaaatg gtatgtataa aaagaaagga gtgtgcgact cttgtgtctc gtccaaaagc60agatccaacc acagccccaa aagaagcatg atggagcctc agcctcacca tctcctcatg120gattggaaca aagctaatga tcttctcaca caagaacacg cagcttttct caatgatcct180caccatctca tgttagatcc acctcccgaa accctaattc acttggacga agacgaagag240tacgatgaag acatggatgc gatgaaggag atgcagtaca tgatcgccgt catgcagccc300gtagacatcg accctgccac ggtccctaag ccgaaccgcc gtaacgtaag gataagcgac360gatcctcaga cggtggttgc tcgtcggcgt cgggaaagga tcagcgagaa gatccgaatt420ctcaagagga tcgtgcctgg tggtgcgaag atggacacag cttccatgct cgacgaagcc480atacgttaca ccaagttctt gaaacggcag gtgaggattc ttcagcctca ctctcagatt540ggagctccta tggctaaccc ctcttacctt tgttattacc acaactccca accctga 597<210>2<211>643<212>DNA<213>人工的<220>
<223>歐洲油菜的INDEHISCENT同源物(BN1-IND)的核苷酸序列<400>2gaattcgccc ttcgcatgta taaaaagaag ggtctatgcg tctctagtcc aaaaactcta60tatgtctggt tcaaaagcag atgcagcagc catagcccca atagtcatga tggagcctca120tcatctcctt atgaactgga acaaacctat tgatctcatt acacaagaaa actcttttaa180
ccacaatcct catttcatgg tagatccacc ttccgaaacc ctaagccact tccagccccc240gccgacagtc ttctccgatc ccggaggagg agaggaagca gaagacgaag aaggagagga300agagatagat gagatgaagg agatgcaata cgcgattgct gccatgcagc ccgtagacat360cgatccagcc accgttccta agccgaaccg ccgtaacgta agggtaagcg aggaccccca420gacggtggtg gctcgtcggc gtagagaaag gataagcgag aagatccgga tattgaagag480gatggtgcca ggcggtgcaa agatggacac tgcctccatg cttgacgaag ccatccgcta540caccaagttc ttgaaacggc aggtgaggct tcttcagcct cacactcagc ttggggctcc600tatgtctgac ccttctcgcc tttgttatta ccacaactct caa 643<210>3<211>660<212>DNA<213>人工的<220>
<223>歐洲油菜的另一種INDEHISCENT同源物(BN2-IND)的核苷酸序列<400>3gaattcgccc ttggcatgta caagaagaaa ggtctatgcg tctctagtcc aaaaactcta60tatatgtctg gctcaaaagc agatgcagcc atagccccaa tagtcatgat ggagcatcat120catctcctta tgaattggaa caaacctatt gatctcatta cagaagaaaa ctcttttaac180cacaatcctc atttcatagt agatccacct tccgaaaccc taagccactt ccagcccccg240ccgacaatct tctccggtca cggaggagga gaggaagcag cagaagaaga agaagaagaa300ggagaggaag agatggatcc gatgaagaag atgcaatacg cgattgctgc catgcagccc360
gtagacctcg atccagccac cgttcctaag ccgaaccgcc gtaacgtaag ggtaagcgac420gaccctcaga cggtggtggc tcgtcggcgt agagaaagga taagcgagaa gatccggata480ttgaggagga tggtgccagg cggtgcaaag atggacactg cctccatgct cgacgaagcc540atccgctaca ccaagttctt gaaacggcag gtgaggctag cttcttcagc ctcacactca600gcttggagct cctatgtctg acccttcttg cctttgttat tatcataact cgcagccctg660<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO109/CO111的共有核苷酸序列<400>4aggtctatgc gtctctagtc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO110/CO112的共有核苷酸序列
<400>5tcttcttctg ctgcttcctc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO113/CO114的共有核苷酸序列<400>6cctctccttc ttcgtcttct20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO115/CO117的共有核苷酸序列<400>7aggagtgtgc gactcttgtg20<210>8<211>19
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>寡核苷酸CO116/CO118的共有核苷酸序列<400>8tcttcgtctt cgtccaagt 19<210>9<211>895<212>DNA<213>人工的<220>
<223>擬南芥的SHATTERPROOF 1基因(AT-SHP1)的核苷酸序列<400>9ggatcaatgg aggaaggtgg gagtagtcac gacgcagaga gtagcaagaa actagggaga60gggaaaatag agataaagag gatagagaac acaacaaatc gtcaagttac tttctgcaaa120cgacgcaatg gtcttctcaa gaaagcttat gaactctctg tcttgtgtga tgccgaagtt180gccctcgtca tcttctccac tcgtggccgt ctctatgagt acgccaacaa cagtgtgagg240ggtacaattg aaaggtacaa gaaagcttgt tccgatgccg tcaaccctcc ttccgtcacc300gaagctaata ctcagtacta tcagcaagaa gcctctaagc ttcggaggca gattcgagat360attcagaatt caaataggca tattgttggg gaatcacttg gttccttgaa cttcaaggaa420ctcaaaaacc tagaaggacg tcttgaaaaa ggaatcagcc gtgtccgctc caaaaagaat480
gagctgttag tggcagagat agagtatatg cagaagaggg aaatggagtt gcaacacaat540aacatgtacc tgcgagcaaa gatagccgaa ggcgccagat tgaatccgga ccagcaggaa600tcgagtgtga tacaagggac gacagtttac gaatccggtg tatcttctca tgaccagtcg660cagcattata atcggaacta tattccggtg aaccttcttg aaccgaatca gcaattctcc720ggccaagacc aacctcctct tcaacttgtg taactcaaaa catgataact tgtttcttcc780cctcataacg attaagagag agacgagaga gttcatttta tatttataac gcgactgtgt840attcatagtt taggttctaa taatgataat aacaaaactg ttgtttcttt gcttc 895<210>10<211>963<212>DNA<213>人工的<220>
<223>擬南芥的SHATTERPROOF 2基因(AT-SHP2)的核苷酸序列<400>10gaattcatct tcccatcctc acttctcttt ctttctgatc ataattaatc ttgctaagcc60agctagggct tatagaaatg gagggtggtg cgagtaatga agtagcagag agcagcaaga120agatagggag agggaagata gagataaaga ggatagagaa cactacgaat cgtcaagtca180ctttctgcaa acgacgcaat ggtttactca agaaagctta tgagctctct gtcttgtgtg240acgctgaggt tgctcttgtc atcttctcca ctcgaggccg tctctacgag tacgccaaca300acagtgtgag aggaacaata gaaaggtaca agaaagcttg ctccgacgcc gttaaccctc360cgaccatcac cgaagctaat actcagtact atcagcaaga ggcgtctaaa ctccggagac420
agattcggga cattcagaat ttgaacagac acattcttgg tgaatctctt ggttccttga480actttaagga actcaagaac cttgaaagta ggcttgagaa aggaatcagt cgtgtccgat540ccaagaagca cgagatgtta gttgcagaga ttgaatacat gcaaaaaagg gaaatcgagc600tgcaaaacga taacatgtat ctccgctcca agattactga aagaacaggt ctacagcaac660aagaatcgag tgtgatacat caagggacag tttacgagtc gggtgttact tcttctcacc720agtcggggca gtataaccgg aattatattg cggttaacct tcttgaaccg aatcagaatt780cctccaacca agaccaacca cctctgcaac ttgtttgatt cagtctaaca taagcttctt840tcctcagcct gagatcgatc tatagtgtca cctaaatgcg gccgcgtccc tcaacatcta900gtcgcaagct gaggggaacc actagtgtca tacgaacctc caagagacgg ttacacaaac960ggg 963<210>11<211>931<212>DNA<213>人工的<220>
<223>擬南芥的ALCATRAZ基因的核苷酸序列<400>11agagagagag agagagagag agatgggtga ttctgacgtc ggtgatcgtc ttccccctcc60atcttcttcc gacgaactct cgagctttct ccgacagatt ctttcccgta ctcctacagc120tcaaccttct tcaccaccga agagtactaa tgtttcctcc gctgagacct tcttcccttc180
cgtttccggc ggagctgttt cttccgtcgg ttatggagtc tctgaaactg gccaagacaa240atatgctttc gaacacaaga gaagtggagc taaacagaga aattcgttga agagaaacat300tgatgctcaa ttccacaact tgtctgaaaa gaagaggagg agcaagatca acgagaaaat360gaaagctttg cagaaactca ttcccaattc caacaagact gataaagcct caatgcttga420tgaagctata gaatatctga agcagcttca acttcaagtc cagactttag ccgttatgaa480tggtttaggc ttaaacccta tgcgattacc acaggttcca cctccaactc atacaaggat540caatgagacc ttagagcaag acctgaacct agagactctt ctcgctgctc ctcactcgct600ggaaccagct aaaacaagtc aaggaatgtg cttttccaca gccactctgc tttgaagata660acattcagac aatgatgatg atcggaattc ctctagtacc tgccagacag gagtgaacaa720tgttttgagt tttagcattg gccagatttc tatgttcagt tatagttatg ctaataagct780ttaggagtga acaaaatctg agtagtttga ttataatgat gtctgaagca gattatatat840aaaagactaa tttacttaca tatgagatga ttattacaac tatcaaatga ctatgtctgt900gagttgcatc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 931
權(quán)利要求書(shū)(按照條約第19條的修改)(2)從所述群體選擇莢果落?？剐灾参?，其中所述植物具有表現(xiàn)種子落粒減少的莢果。
19.權(quán)利要求18的方法，其中參與莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的所述基因是選自來(lái)源于擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)源于擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF2基因的基因。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述基因包含SEQ ID No 1、SEQ ID No2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的部分。
21.權(quán)利要求18至20任一項(xiàng)的方法，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其與來(lái)自擬南芥、參與所述莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因的核苷酸序列具有至少約90％序列同一性；(ii)所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的所述100個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠在所述第一和第二個(gè)區(qū)的至少所述100個(gè)連續(xù)核苷酸之間堿基配對(duì)形成雙鏈RNA分子。
22.嵌合基因，其如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)描述。
23.十字花科植物的細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
24.十字花科植物，其可通過(guò)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的方法獲得。
25.十字花科植物，其包含穩(wěn)定整合到它的細(xì)胞基因組中的根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的十字花科植物的后代，其包含穩(wěn)定整合到它的細(xì)胞基因組中的根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
27.來(lái)自權(quán)利要求24至26或25中任一項(xiàng)的十字花科植物的植物種子，其包含穩(wěn)定整合到它的細(xì)胞基因組中的根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
28.農(nóng)業(yè)方法，其包含(i)在田間播種根據(jù)權(quán)利要求27的種子或種植權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的植物；(ii)培育所述植物直至莢果成熟；(iii)通過(guò)用聯(lián)合收割機(jī)脫粒從所述莢果收獲種子。
權(quán)利要求
1.減少植物，優(yōu)選十字花科植物中種子落粒的方法，所述方法包括下列步驟(1)產(chǎn)生所述植物的轉(zhuǎn)基因品系群體，其中所述群體的所述轉(zhuǎn)基因品系顯示出莢果落?？剐灾械淖儺?，其中通過(guò)(i)將嵌合基因?qū)胨鲋参锏募?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述嵌合基因包含下列有效連接的DNA(a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；(b)DNA區(qū)，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生能夠減小所述植物內(nèi)源基因，優(yōu)選地所述十字花科植物內(nèi)源基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述基因參與所述植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣的發(fā)育，所述RNA分子包含第一和第二個(gè)RNA區(qū)，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含與參與所述莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的所述內(nèi)源基因的核苷酸序列具有約94％序列同一性的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(ii)所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的所述19個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠在所述第一和第二區(qū)的至少所述19個(gè)連續(xù)核苷酸之間堿基配對(duì)形成雙鏈RNA分子；(c)任選地，3’末端區(qū)，其包含在所述植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)；其中所述嵌合基因當(dāng)在所述植物，優(yōu)選所述十字花科植物的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，與未轉(zhuǎn)化的植物，優(yōu)選未轉(zhuǎn)化的十字花科植物中的莢果落?？剐韵啾仍黾恿饲v果落?？剐?，而保持所述植物的所述莢果的農(nóng)學(xué)相關(guān)的可脫粒性；(ii)從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因品系可以得到所述群體；和(2)從所述群體選擇莢果落?？剐灾参?，其中所述植物具有表現(xiàn)種子落粒減少的莢果。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物可表達(dá)的啟動(dòng)子是相對(duì)弱的植物可表達(dá)的啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物可表達(dá)的啟動(dòng)子是來(lái)源于農(nóng)桿菌的冠癭堿合成酶啟動(dòng)子，優(yōu)選地選自胭脂堿合成酶啟動(dòng)子、章魚(yú)堿合成酶啟動(dòng)子、農(nóng)桿堿合成酶啟動(dòng)子或甘露堿合成酶啟動(dòng)子或開(kāi)裂帶或裂片邊緣選擇性啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含與所述內(nèi)源基因的核苷酸序列具有約90％至約100％序列相似性的約19至約500個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(ii)所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有約90％至約100％的序列相似性的核苷酸序列；和(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠形成雙鏈RNA區(qū)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含與所述內(nèi)源基因具有約50％至約88％序列同一性的約50至約500個(gè)連續(xù)核苷酸的序列；(ii)所述第二個(gè)RNA包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有約90％至約100％序列相似性的核苷酸序列；和(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠形成雙鏈RNA區(qū)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一個(gè)RNA區(qū)包含與所述內(nèi)源基因具有約65％至約75％序列同一性的約200至300個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
7.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)源基因是選自來(lái)源于擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)源于擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF2基因或它們存在于所述十字花科植物中的同源基因的基因。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述內(nèi)源基因包含SEQ ID No 2的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述內(nèi)源基因包含SEQ ID No 3的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求1和5至7中任一項(xiàng)的方法，其中(i)所述十字花科植物是油籽油菜；(ii)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含含有至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述連續(xù)核苷酸來(lái)自參與莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的第二種基因的核苷酸序列，所述第二種基因是不同于油籽油菜的十字花科植物的內(nèi)源基因；(iii)所述第二個(gè)RNA包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有約90％至約100％的序列相似性的核苷酸序列；和(iv)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠形成雙鏈RNA區(qū)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述第一個(gè)RNA區(qū)包含參與莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的所述第二種基因的至少約50至約500個(gè)連續(xù)核苷酸。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中參與莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的所述第二種基因是選自來(lái)源于擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)源于擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF2基因或它們存在于十字花科植物中的同源基因的基因。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一個(gè)RNA區(qū)的所述核苷酸序列選自不同于MADS盒區(qū)、K區(qū)或bHLH區(qū)的參與莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的所述基因的區(qū)域。
14.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述第一個(gè)RNA區(qū)包含來(lái)自SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
15.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述第一個(gè)RNA區(qū)包含來(lái)自SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的約50至約200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
16.權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)的方法，其中所述農(nóng)學(xué)相關(guān)的可脫粒性對(duì)應(yīng)于在隨機(jī)碰撞試驗(yàn)中10到60秒的莢果半壽期。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述農(nóng)學(xué)相關(guān)的可脫粒性對(duì)應(yīng)于在隨機(jī)碰撞試驗(yàn)中40到60秒的莢果半壽期。
18.減少油籽油菜植物中種子落粒的方法，所述方法包括下列步驟(1)產(chǎn)生所述油籽油菜植物的轉(zhuǎn)基因品系群體，其中所述群體的所述轉(zhuǎn)基因品系顯示出莢果落?？剐灾械淖儺?，其中通過(guò)(i)將嵌合基因?qū)胨鲇妥延筒酥参锏募?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述嵌合基因包含下列有效連接的DNA(a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；(b)DNA區(qū)，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生能夠減小所述油籽油菜植物內(nèi)源基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，所述基因參與所述油籽油菜植物莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣的發(fā)育，所述RNA分子包含第一和第二個(gè)RNA區(qū)，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含與參與所述莢果開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的來(lái)自擬南芥的基因的核苷酸序列具有至少約90％序列同一性的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(ii)所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的所述50個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠在所述第一和第二區(qū)的至少所述50個(gè)連續(xù)核苷酸之間堿基配對(duì)形成雙鏈RNA分子；(c)3’末端區(qū)，其包含在所述植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號(hào)；(ii)從所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因品系可以得到所述群體；和(2)從所述群體選擇莢果落?？剐灾参?，其中所述植物具有表現(xiàn)種子落粒減少的莢果。
19.權(quán)利要求18的方法，其中參與莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的所述基因是選自來(lái)源于擬南芥的INDEHISCENT基因、來(lái)源于擬南芥的ALCATRAZ基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF1基因、來(lái)源于擬南芥的SHATTERPROOF2基因的基因。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述基因包含SEQ ID No 1、SEQ ID No2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的部分。
21.權(quán)利要求18至20任一項(xiàng)的方法，其中(i)所述第一個(gè)RNA區(qū)包含至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其與來(lái)自擬南芥、參與所述莢果的開(kāi)裂帶和裂片邊緣發(fā)育的基因的核苷酸序列具有至少約90％序列同一性；(ii)所述第二個(gè)RNA區(qū)包含與所述第一個(gè)RNA區(qū)的所述100個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列；(iii)所述第一和第二個(gè)RNA區(qū)能夠在所述第一和第二個(gè)區(qū)的至少所述100個(gè)連續(xù)核苷酸之間堿基配對(duì)形成雙鏈RNA分子。
22.嵌合基因，其如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)描述。
23.十字花科植物的細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
24.十字花科植物，其可通過(guò)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)的方法獲得。
25.十字花科植物，其包含穩(wěn)定整合到它的細(xì)胞基因組中的根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的十字花科植物的后代，其包含穩(wěn)定整合到它的細(xì)胞基因組中的根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
27.來(lái)自權(quán)利要求24至26或25中任一項(xiàng)的十字花科植物的植物種子，其包含穩(wěn)定整合到它的細(xì)胞基因組中的根據(jù)權(quán)利要求22的嵌合基因。
28.分離的DNA片段，其包含選自SEQ ID No 2、SEQ ID No 3的核苷酸序列。
29.從十字花科植物可以得到的分離的DNA片段，其在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 3的核苷酸序列的DNA片段雜交。
30.根據(jù)權(quán)利要求27到29任一項(xiàng)的分離的DNA片段的用途，用于減小種子落?；蛘咴黾忧v果落?？剐浴?br> 31.農(nóng)業(yè)方法，其包含(i)在田間播種根據(jù)權(quán)利要求27的種子或種植權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的植物；(ii)培育所述植物直至莢果成熟；(iii)通過(guò)用聯(lián)合收割機(jī)脫粒從所述莢果收獲種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在植物例如十字花科植物中調(diào)節(jié)果實(shí)開(kāi)裂特性的方法和組合物，特別涉及用于在十字花科植物尤其是為產(chǎn)油而生長(zhǎng)的十字花科植物中減少種子落粒至農(nóng)學(xué)上重要的程度的方法和手段。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1809640SQ200480017657
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者G·邁卡尼特, M·亞諾夫斯基, S·肯皮恩 申請(qǐng)人:拜爾生物科學(xué)公司, 加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)