專利名稱：氮限制條件下生長得以改善的植物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種在氮限制條件下改善植物的生長和產(chǎn)量的方法。
背景技術：
近代的集約農業(yè)中所見到的以供給氮為目的的大量施用復合肥料，在實現(xiàn)產(chǎn)量顯著增加的同時也使氮以過剩的硝酸鹽形式向周邊環(huán)境釋放，造成由于江河、湖沼富營養(yǎng)化而產(chǎn)生的環(huán)境污染，或隨著硝酸在農作物中的累積造成對健康的威脅，再有，殘留在土壤中的氮產(chǎn)生溫室效應氣體等環(huán)境方面的問題。此外，在氮肥的制造階段中需要大量的電力，這也成為農業(yè)環(huán)境負擔的原因。也就是說，為了確保持續(xù)性發(fā)展，需要較少使用化肥，尤其是氮肥的農業(yè)方法。
但是，除了豆科等例外，植物無法固定空氣中的氮，這種氮營養(yǎng)完全依賴于由外部供給的硝酸或氨。因而，氮對植物的生長發(fā)育而言是最大的限制因子。今后的農業(yè)需要面對在維持、增加現(xiàn)行產(chǎn)量之外，同時還要考慮減少上述環(huán)境負擔的持續(xù)性這樣看似矛盾的問題。致力于這些問題的努力，即尤其是致力于減少氮源的條件下可以獲得充分的生長和產(chǎn)量的植物開發(fā)和栽培的工作還遠遠不足。例如，對于近代的集約農業(yè)，還提倡有利于環(huán)境的所謂持續(xù)型、有機農業(yè)法，而這種考慮環(huán)境型的有機農業(yè)方法中控制氮肥施用的另一方面，在其產(chǎn)量方面又有很多問題。
植物的品種改良的觀點出發(fā)，也沒有能夠解決這些問題的育種實例，即，還沒有在減少氮肥施用的氮限制條件下獲得足夠的生長和/或產(chǎn)量的成功的植物育種的例子。因此，需要開發(fā)出在較少施加氮肥的情況下，通過改變/改善植物的氮利用率，使產(chǎn)量得以維持/改善的品種，以及用于培育上述植物品種的技術。
已知的是，在植物中將無機氮同化成有機形式的第一階段主要是將氨吸收到谷氨酸中用于生成谷氨酰胺。這是由谷氨酰胺合酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)所催化的反應，該反應中作為這兩種酶反應的總合，將1分子的氨同化成1分子2-OG產(chǎn)生1分子谷氨酸。這種GS/GOGAT循環(huán)被認為是植物中同化氮的主要途徑(文獻Miflin andLea1976，Phytochemistry，15873-885)。
另一方面，在微生物中，據(jù)利用藍細菌(Cyanobacteria)和大腸桿菌的研究報道了2-OG和谷氨酰胺的數(shù)量的平衡調節(jié)與硝酸的吸收和同化相關的酶基因的表達(文獻Forchammer and Tandeau-marsac，1995，JBacterial 1772033-2040；Jiang等，1998，biochemistry 3712795-12801)。然而，由擬南芥(Arabidopsis)中分離出與同這種調節(jié)相關的PII蛋白質高度同源的基因，然而將這種基因導入煙草中并過量表達，并沒有觀察到硝酸含量的增加，因此認為高等植物中氮的累積與微生物中的不同(文獻Hsieh等，1998，Proc Natl Acad Sci Usa 9513965-13970)。另一方面，據(jù)報道利用在反義方向導入了鐵氧化還原蛋白依賴型谷氨酸合酶基因而使谷氨酸合酶基因表達降低的煙草，對硝酸還原酶(以下簡稱為NR)的表達進行了研究，其結果顯示添加了硝酸以及蔗糖、2-OG時，NR的轉錄水平升高，而添加谷氨酰胺時NR的轉錄水平降低(文獻Ferrario-Mery等，2001，Planta 213265-271)，該文獻中還指出在高等植物中，2-OG和谷氨酰胺的數(shù)量也與NR的調節(jié)相關。然而，這些發(fā)現(xiàn)僅僅涉及NR，而對于2-OG對氮限制條件下的植物的生長發(fā)育中的影響卻沒有提及。此外，由于2-OG是一種比較不穩(wěn)定的化合物，因此認為以撒布等為目的的使用是不實際的。
此外，還制備出了導入了GDH基因的轉基因植物，據(jù)報道，為賦予植物對除草劑草丁膦(phosphinothricin)抗性為目的在煙草和玉米中導入來源于大腸桿菌的NADP依賴型GDH基因(gdhA)，干燥重量、氨基酸總含量和水溶性碳水化合物含量都有顯著增加(Lightfoot等，CA2180786，1996)。同樣，Tian等人(CN00109779.2)報道，與沒有導入基因的煙草相比，向煙草中導入來自鏈孢霉屬(Neurospora)的NADP依賴型GDH基因，其生長發(fā)育良好。而且，據(jù)報道，向番茄中導入來自構巢曲霉(Aspergillus nidulans)的NADP依賴型GDH基因，果實中的游離氨基酸含量增加(文獻kisaka等JP11-376710)，并且在馬鈴薯中導入相同的基因，塊莖的重量和塊莖數(shù)量增加(kisaka等，JP2000-404322)。然而，這些報道均沒有闡明導入基因的功能，導入的基因如何發(fā)揮作用，或由怎樣的效果產(chǎn)生這些性質。而且，也沒有涉及氮限制條件下的植物的生長和/或產(chǎn)量的改善。
另一方面，至今為止還沒有在植物中導入天冬氨酸轉氨酶基因的報道。
發(fā)明的公開本發(fā)明旨在提供一種植物培育方法，所述植物的氮吸收和代謝活性增強，且在減少氮，即在在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善。此外提供一種在氮限制條件下栽培這種植物的方法。
本發(fā)明人假設植物細胞存在著用于感知氮營養(yǎng)狀態(tài)的信號分子，并且將2-酮戊二酸(2-OG)認作此種信號分子。也就是說，2-OG是全面控制植物細胞的氮吸收、代謝的信號分子，認為如果人為地增減這種物質的含量，能夠維持植物細胞的氮吸收、代謝的亢進狀態(tài)。此外，由于考慮到這種亢進狀態(tài)的植物能夠活躍地吸收外部的氮，因而認為在限制氮的條件下，氮營養(yǎng)也是充足的，從而使生長發(fā)育和產(chǎn)量得以改善。進而，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，實際上經(jīng)由過表達谷氨酸脫氫酶(以下簡稱為GDH)活性或天冬氨酸轉氨酶(以下簡稱為ASPC)活性，使植物細胞中的2-OG含量得以增加，2-OG含量增加的植物在氮限制條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得到改善，由此完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明就是一種植物的制備方法，其特征在于通過提高所述植物中的2-OG含量，使所述植物在與在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得到改善。
此外，本發(fā)明涉及在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物及其種子，其特征在于通過導入GDH基因或ASPC基因，使這些基因在植物體內表達，由此增加2-OG的含量。此外，本發(fā)明還涉及在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的制備方法，其特征在于導入GDH基因或ASPC基因，使這些基因在植物體內表達，結果使所述植物的2-OG含量得以增加。
具體地說，本發(fā)明涉及在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的制備方法，其中在上述方法中，在對于各種植物建立的標準氮肥量的下限至下限的1/10的氮量范圍內獲得與標準氮肥量栽培條件相等或更高的生長發(fā)育和/或產(chǎn)量。
本發(fā)明涉及栽培由上述方法制備的植物的方法，其特征在于在限制氮的條件下栽培。尤其是，本發(fā)明還涉及在對各種植物建立的標準氮肥量的下限至下限的1/10的氮肥量范圍條件下栽培由上述方法制備的植物的方法。
進而，本發(fā)明涉及改善在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量的方法，其包括葉面撒布脯氨酸。
附圖的簡要說明

圖1是構建的質粒載體模式圖。Nos-Pro胭脂堿合酶啟動子；NPTII是新霉素磷酸轉移酶；Nos-Ter胭脂堿合酶終止子；35S-Pro是花椰菜花葉病毒35S啟動子；Mtd-AN-GDH是添加了線粒體轉運肽的源于構巢曲霉的谷氨酸脫氫酶基因(GDH)；HPT潮霉素磷酸轉移酶；H是Hind III，BBamH I，XXba I，SPApe I，EEcoR I；LB左邊緣，RB右邊緣。
圖2表示的是轉化的馬鈴薯的PCR分析結果。AAn-GDH基因的特異引物的使用，BNPT II基因特異性引物的使用。泳道1100bp分子量標記，泳道2未轉化的馬鈴薯、泳道3轉化的馬鈴薯Mtd1、泳道4轉化的馬鈴薯Mtd2、泳道5轉化的馬鈴薯Mtd3、泳道6轉化的馬鈴薯Mtd5、泳道7轉化的馬鈴薯Mtd8。
圖3表示的是轉化的擬南芥PCR分析結果。AAn-GDH基因的特異引物的使用，BNPT II基因特異性引物的使用。泳道1100bp的分子量標記，泳道2未轉化的擬南芥、泳道3轉化的擬南芥Mtd2、泳道4轉化的擬南芥Mtd3、泳道5轉化的擬南芥Mtd4。
圖4表示的是轉化的馬鈴薯的Northern分析結果。A從葉組織中提取的RNA、B從塊莖中提取的RNA。對10μg總RNA進行電泳、用溴化乙錠染色的圖像(A，B中均為下側的圖像)。以全長An-GDH基因作為探針。泳道1未轉化的馬鈴薯、泳道2轉化的馬鈴薯Mtd1、泳道3轉化的馬鈴薯Mtd2、泳道4轉化的馬鈴薯Mtd3、泳道5轉化的馬鈴薯Mtd5、泳道6轉化的馬鈴薯Mtd8。
圖5表示的是轉化的擬南芥的Northern分析結果。采用了從葉組織中提取的RNA。對10μg總RNA進行電泳、用溴化乙錠染色的圖像(下側的圖像)。以全長An-GDH基因作為探針。泳道1未轉化的擬南芥，泳道2轉化的擬南芥Mtd2、泳道3轉化的擬南芥Mtd3、泳道4轉化的擬南芥Mtd4。
圖6A-C是表示GDH轉化植物(擬南芥)的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素、硝酸含量的圖?？v軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。Mtd3-10GDH轉化擬南芥(no.3系統(tǒng))、哥倫比亞(Columbia)未轉化的擬南芥。(n＝3)。
圖6D-F是表示GDH轉化植物(馬鈴薯)的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素、硝酸含量的圖。縱軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。Mtd8GDH轉化馬鈴薯、對照未轉化的馬鈴薯。(n＝3)。
圖7是表示在含有任意濃度KNO3的PNS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的擬南芥葉組織的2-OG含量的圖。縱軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。C未轉化的擬南芥、M轉化的擬南芥(Mtd3系統(tǒng))。(n＝3)。
圖8是表示在含有任意濃度KNO3的PNS培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的擬南芥葉組織的硝酸含量的圖?？v軸表示的是每份鮮重的摩爾數(shù)(nmol)。C未轉化的擬南芥、M轉化的擬南芥(Mtd3系統(tǒng))。(n＝3)。
圖9是高等植物谷氨酸脫氫酶氨基酸序列的比對結果。AtGDH1擬南芥GDH1、AtGDH2擬南芥GDH2、LeGDH番茄(Lycopersiconesculentum)GDH、NtGDH煙草(Nicotiana tabacum)GDH、ZmGDH玉米(Zea mays)GDH圖10是霉菌GDH和植物(番茄)GDH氨基酸序列的比對結果。AaGDH泡盛曲霉(Aspergillus awamori)GDH、ANGDH構巢曲霉GDH、LeGDH番茄GDH圖11是表示在馬鈴薯葉面撒布展布劑、尿素和脯氨酸水溶液，撒布1小時后以及5小時后葉組織內的游離脯氨酸含量的圖(n＝6)。A撒布1小時后、B撒布5小時后圖12是表示在馬鈴薯葉面撒布展布劑、尿素和脯氨酸水溶液，撒布1小時后以及24小時后葉組織內的2-OG含量的圖(n＝6)。A撒布1小時后、B撒布24小時后圖13表示MtdECASPC轉化的擬南芥的基因組PCR分析結果。用ECASPC特異的引物進行PCR分析。進行以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為一個循環(huán)的30個循環(huán)反應。以1％瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色。泳道11∶1kbp分子量標記，泳道2mtdECASPC質粒DNA、泳道3mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC2-2、泳道4mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC6-2、泳道5mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC8-1、泳道6mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC9-1。
圖14表示MtdECASPC轉化的擬南芥的RT-PCR分析結果。用QIAGEN公司的Plant RNeasy mini-kit試劑盒從擬南芥的葉組織中提取RNA。RT-PCR是采用TaKaRa的RNA-PCR試劑盒，用ECASPC特異引物進行的。進行94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為一個循環(huán)的的30個循環(huán)反應。以1％瓊脂糖凝膠進行電泳后，用溴化乙錠染色。泳道11∶1kbp分子量標記，泳道2mtdECASPC質粒DNA、泳道3沒進行逆轉錄酶反應的RNA、泳道4-5未轉化的擬南芥、泳道6mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC2-2、泳道7mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC6-2、泳道8mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC8-1、泳道9mtdECASPC轉化的擬南芥，mtdECASPC9-1。
用于實施發(fā)明的最佳方式如上所述，本申請發(fā)明人假定植物細胞存在用于感知氮營養(yǎng)狀態(tài)的信號分子。也就是說，存在著全面控制植物細胞的氮吸收、代謝的信號分子，認為如果人為增減這種物質的含量，就能夠維持植物細胞的氮吸收以及代謝的亢進狀態(tài)。此外，由于考慮到這種亢進狀態(tài)的植物能夠活躍地吸收外部的氮，因而認為在限制氮的條件下，氮營養(yǎng)也是充足的，可見生長發(fā)育和產(chǎn)量改善。進而，本申請發(fā)明人將這種信號分子假定為2-酮戊二酸(2-OG)。
植物將無機氮同化成有機形式的第一階段主要是谷氨酸摻入進氨以生成谷氨酰胺，這是由谷氨酰胺合酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)所催化的，就像已經(jīng)提到的那樣一般認為這種GS/GOGAT循環(huán)是植物中氮同化的主要途徑。因而，認為植物細胞中氮的同化程度或氮的缺乏程度由2-OG的量反應。
本發(fā)明人設計出以過量表達谷氨酸脫氫酶(GDH)活性或天冬氨酸轉氨酶(ASPC)活性作為增加植物細胞的2-OG含量的一種手段。GDH催化將氨吸收到2-OG中以生成谷氨酸以及從谷氨酸分解出氨以反向生成2-OG的可逆反應。但是，一般認為由于GDH一般對氨有高Km值，與在細胞內通過將氨吸收到2-OG中以生成谷氨酸的生成谷氨酸的反應相比，GDH更傾向于在將谷氨酸分解成2-OG和氨的方向起作用，預計該反應的結果是2-OG含量增加。另一方面，由于天冬氨酸轉氨酶是催化轉移草酰乙酸的氨基的反應的酶，該反應的結果是生成天冬氨酸和2-OG，預計2-OG的含量增加。
本發(fā)明人制備出導入有GDH基因或ASPC基因的轉化植物，確認2-OG含量確實增加，進而確認在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下這些植物生長發(fā)育和產(chǎn)量發(fā)生改善。
在本發(fā)明的一個實施方式中，在植物中導入含有谷氨酸脫氫酶(為GDH)基因或天冬氨酸轉氨酶(ASPC)基因的核酸構建體，通過谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉氨酶(ASPC)基因的表達使2-OG含量增加，獲得在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量獲得改善的植物。
此外，本發(fā)明的其它實施方式中，通過增加內源性GDH基因或內源性ASPC基因的拷貝數(shù)和/或轉錄量增強GDH或ASPC的活性，增大植物體中的2-OG含量，獲得在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量獲得改善的植物。為了增大轉錄量，例如可以導入表達轉錄活性因子的基因構建體，和/或可以導入增強子這樣的cis作用元件。這種轉錄活性因子和cis作用元件是本領域技術人員所熟知的。
本發(fā)明中利用的谷氨酸脫氫酶其來源沒有特別的限定，但較為優(yōu)選的是采用源于曲霉屬的微生物的谷氨酸脫氫酶。更為優(yōu)選的是，采用源自構巢曲霉和泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶。進而，本發(fā)明還可以利用其酶蛋白質中有1個以上的氨基酸缺失、取代、添加的谷氨酸脫氫酶，只要其具有上述谷氨酸脫氫酶活性、具有在生物體內生理條件下優(yōu)先催化由谷氨酸生成2-OG和氨的反應活性即可。
此外，本發(fā)明所用的天冬氨酸轉氨酶其來源也沒有特別的限定，但優(yōu)選的是采用源于大腸桿菌(Escherichia ecoli)的微生物的天冬氨酸轉氨酶。進而，本發(fā)明還可以利用其酶蛋白質中有1個以上的氨基酸缺失、取代、添加的天冬氨酸轉氨酶，只要其具有上述天冬氨酸轉氨酶活性即可。
此外，就與谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉氨酶在植物細胞的細胞器的定位而言，不僅可以采用位于細胞質的谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉氨酶，也可以采用位于線粒體、葉綠體、過氧化物酶體等處的谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉氨酶。因此，本發(fā)明中還可以利用在其N端或C端添加了用于將這些酶蛋白質轉移至這些細胞器內的信號肽或轉運肽的谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉氨酶的基因。
基于已經(jīng)公開的序列信息，本領域技術人員能夠較為容易地制得上述谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉氨酶基因或其cDNA。例如，就構巢曲霉的谷氨酸脫氫酶而言，其基因組基因的核苷酸序列公開為Genbank的登錄號X16121中的序列。其核苷酸序列如序列號1中所示，其氨基酸序列如序列號2中所示。如果根據(jù)這些序列合成出擴增包括編碼蛋白質的部分的DNA片段的PCR引物、以從構巢曲霉中提取的RNA作為模板進行RT-PCR，就能夠容易地獲得谷氨酸脫氫酶的cDNA。構巢曲霉的谷氨酸脫氫酶基因的cDNA序列如序列號17中所示。構巢曲霉可以由例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的ATCC10074或ATCC11267獲得。此外，就泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶基因而言，其基因組基因公開為GENBANK中的登錄號Y15784。其核苷酸序列如序列號3中所示，氨基酸序列如序列號4中所示。此外，泡盛曲霉的谷氨酸脫氫酶基因的cDNA序列如序列號18中所示。泡盛曲霉本身可以由美國典型培養(yǎng)物保藏中心的ATCC10548或ATCC11358獲得?？梢愿鶕?jù)這些菌株及序列信息以與上述方法相似的方法獲得谷氨酸脫氫酶cDNA。
構巢曲霉的GDH和泡盛曲霉的GDH的同源性在氨基酸序列方面約為84％(圖10)。
此外，構巢曲霉、泡盛曲霉、馬鈴薯(Lycopersicon esculentum)的GDH氨基酸序列的比對結果表示于圖10中，擬南芥GDH1、擬南芥GDH2、馬鈴薯GDH、煙草(Nicotiana tabacum)GDH、玉米(Zeamays)GDH的氨基酸序列的比對結果示于圖9中。
進而，本發(fā)明中，利用谷氨酸脫氫酶基因和其它的編碼從谷氨酸產(chǎn)生2-OG的各種酶的基因，可以獲得植物中2-OG含量提高的、在與通常栽培條件相比更加限制氮條件的栽培條件下生長發(fā)育和產(chǎn)量得到改善的植物。這種酶包括例如天冬氨酸轉氨酶或丙氨酸轉氨酶。
例如，就大腸桿菌K-12菌株的天冬氨酸轉氨酶而言，其基因組DNA的堿基序列登錄為GENBANK登錄號X03629。如果根據(jù)這些序列合成出擴增包括編碼蛋白質的區(qū)域的DNA片段的PCR引物、用這種引物以從大腸桿菌K-12菌株中提取的染色體DNA作為模板進行RT-PCR，就能夠容易地獲得谷氨酸脫氫酶基因。
此外，根據(jù)本發(fā)明，可以通過葉面撒布脯氨酸作為提高植物內的2-OG含量的方法改善在與通常栽培條件相比更加限制氮條件的栽培條件下的植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。葉面撒布的脯氨酸被吸收到葉組織中，代謝到谷氨酸中。進而，這種谷氨酸經(jīng)內源性谷氨酸脫氫酶代謝成2-OG，能夠提高組織內的2-OG。通過葉面撒布這種脯氨酸2-OG含量提高的植物，在與通常栽培條件相比更加限制栽培期間的氮施用量的條件下其生長發(fā)育和產(chǎn)量得到改善。
本發(fā)明中使用的核酸構建體可以由本領域技術人員公知的方法制成。就包括分離核酸構建體，確定其序列的方法的分子生物學方法而言，可以參照例如Sambrook等人，《分子克隆-實驗室手冊》(Molecularcloning-Laboratory manual)，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress等文獻?；蛘?，以PCR方法為代表的基因擴增對于用于制備本發(fā)明中使用的核酸構建體是必要的，對于這種方法可以參照F.M.Ausubel等人(eds)，Current Procotols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.(1994)等文獻。
本發(fā)明中使用的核酸構建體一般可以含有在植物細胞內起作用的適當?shù)膯幼?，例如胭脂堿合酶基因、花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)、胭脂堿合酶基因的終止子等適當?shù)慕K止子、其它對于表達必要的或有利的序列、以及用于選擇轉化體的標記基因，例如卡那霉素的抗性、G418抗性、潮霉素抗性等抗藥性基因。這種構建體所使用的啟動子可以是組成型啟動子或器官特異的或是生長發(fā)育階段特異的啟動子，可以根據(jù)使用的宿主、必要的表達量、特定表達的器官或生長發(fā)育階段進行選擇。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，使用器官和生長發(fā)育階段中非特異表達的強啟動子，例如使用CaMV35S啟動子這樣的啟動子。作為器官特異性啟動子，采用菜豆球蛋白基因啟動子或馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動子等。本發(fā)明的最優(yōu)選實施方式中，使用以CaMV35S啟動子這樣的強組成型啟動子驅動該谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉氨酶基因的構建體。
本發(fā)明中使用的基因導入方法沒有特別的限定，本領域技術人員可以根據(jù)公知的方法根據(jù)相應的宿主選擇向植物細胞或植物體導入基因的方法。例如，本發(fā)明的一個實施方式中，利用使用農桿菌的基因導入方法。這種轉化體系中，優(yōu)選的是使用二元載體。利用農桿菌時，在轉化時使用的核酸構建體進而包括與必須導入到植物細胞中的DNA序列鄰接的T-DNA區(qū)域。優(yōu)選實施方式中，移入的序列是插入在左右的T-DNA邊界序列之間?；谶@種T-DNA的轉化載體的合適的設計和構建是本領域技術人員所熟知的。此外，用于在植物中感染具有這種核酸構建體的農桿菌的條件也是本領域技術人員所熟知的。對于這些技術和條件，可以參照例如秀潤社、細胞工學冊增刊“模式植物的實驗方法大米和擬南芥”(1996)。
本發(fā)明中，還可以利用其它的基因導入方法。作為使用的基因導入方法的實例，可以例舉為使用聚乙二醇或鈣的DNA原生質體導入法、根據(jù)電穿孔的原生質體轉化法、根據(jù)基因槍的導入法等。
進行像上述這樣的基因的操作的植物種類沒有特別的限定，除了利用植物自身進行轉化的情況之外，優(yōu)選容易轉化且植物體中建立了再生系統(tǒng)的植物種類。本發(fā)明中合適的植物除了具有前述特性的植物之外，從減少農業(yè)的環(huán)境負荷的觀點出發(fā)，更優(yōu)選建立了大量栽培技術的植物種類。作為用于實施本發(fā)明的植物，可以例舉為，例如所有蕓苔科植物之外、還有番茄、馬鈴薯、玉米、小麥、大米、甘蔗、大豆、高梁等。此外，作為難以給予大量氮的植物，有樹木和果樹等，可以例舉為白楊，桉樹和蘋果樹等。這些植物中的GDH或ASPC活性和特性與本發(fā)明的一個實施方式中使用的源自于構巢曲霉的GDH(序列號1和2)或源自于大腸桿菌K-12菌株的ASPC(序列號19和20)等同。因此，通過導入源自于構巢曲霉的GDH(序列號1)或源自于大腸桿菌K-12菌株的ASPC(序列號19)可以增大這些植物中的2-OG含量。此外，本發(fā)明中也可以以相同方式使用源自這些植物中任一種的GDH基因或ASPC基因。進行像上述這樣的遺傳操作的器官、細胞沒有特別的限定，可以根據(jù)使用的宿主、基因導入法等進行選擇。作為例子，可以列舉為器官外植體、花粉、培養(yǎng)細胞、胚、植物體等，但不僅限于此。
接下來，選擇出進行像上述這樣操作的植物細胞用以轉化。這種選擇，例如可以基于轉化中使用的核酸構建體上存在的標記基因的表達。例如，標記基因是抗藥性基因時，可以通過含有適當濃度的抗生素或除草劑等培養(yǎng)基上培養(yǎng)操作的植物細胞或使其生長發(fā)育進行選擇?；蛘撸瑯擞浕蚴铅?葡糖醛酸糖苷酶基因、螢光素酶基因等基因時，可以通過對其活性進行篩選來選擇。這樣鑒定出的轉化體如果不是植物體，例如原生質體、愈傷組織、外植體等時，可進行向植物體的再生。對于這種再生可以利用本領域技術人員所公知的、基于使用的宿主細胞的方法。
這樣獲得植物體能用通常的方法也就是與非轉化體同樣的條件栽培，為了鑒定出含有本發(fā)明的核酸構建體的轉化植物，除了基于前述標記基因進行選擇之外，還可以利用各種分子生物學方法。例如，可以利用用于檢測出重組DNA插入片段的有無和其結構的Southern印跡或PCR。為了檢出和測定源于導入的核酸構建體的RNA轉錄產(chǎn)物，可以利用Northern印跡或RT-PCR等。
接著，對于獲得的轉化體的谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉氨酶基因的表達，通過該谷氨酸脫氫酶或天冬氨酸轉氨酶蛋白質量、mRNA量或酶活性進行評價。例如，谷氨酸脫氫酶蛋白質或天冬氨酸轉氨酶蛋白質量可以通過Western印跡等方法評價，mRNA量可以通過Northern印跡、定量的RT-PCR法評價。此外，植物提取液中的谷氨酸脫氫酶活性的測定可以根據(jù)Ameziane等的方法(AmezianeR.，Bernhard K.，and Lightfood D.，Plant and Soil，22147-57，2000)進行。植物提取液中的天冬氨酸轉氨酶的活性可以按照chao等的方法進行測定(Chao YP，Lai ZI，Chen P，Chen JT.，Biotechnology Progress，15-453-458，1999)。
進而，評價確認了谷氨酸脫氫酶基因或天冬氨酸轉氨酶基因的表達或表達的增強的轉化植物的2-OG含量。2-OG含量可以例如破碎轉化植物全部或其中一部分，制備其抽提液，通過例如酶法定量。對于植物抽提液的制備及2-OG的定量，可以通過Usuda的方法進行(UsudaH.，Plant Physiol，78859-864，1985)。
對于2-OG含量的增加，在通常的栽培條件及與通常的栽培條件相比更加限制氮的條件下，其地上部分(例如，葉部、莖部或這二者，或花器、果實部分)或其地下部分(例如，根、塊莖)中的2-OG含量與導入基因的原株系相比，增大1.2倍以上時，就判定為其含量增加。
這樣一來，對于確認2-OG含量的增加的轉化植物，在栽培期間可以在與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件下栽培，可以評價其生長發(fā)育或產(chǎn)量。這里所稱的與通常栽培條件相比更為限制氮的栽培條件，是指各種植物的栽培時施加比通常使用的標準氮量、也就是標準的氮肥量更少的氮量的條件，例如70％以下，優(yōu)選50％以下的量。尤其是，如果按照本發(fā)明，給予減少到標準氮量的下限至下限的1/10量程度的范圍的氮量的栽培條件下達到與給予標準氮量的栽培條件同等以上的生長和/或產(chǎn)量。例如，就農作物而言，對于各種農作物建立標準的氮肥量。例如，對于馬鈴薯，一般認為每10a的氮肥量標準的是7kg(JRT日本馬鈴薯研究會主頁http//www.jrt.gr.jp/mini/pm_index.html；吉田 著，享受所有關于馬鈴薯的百科(まるごと楽しむジヤガイモ百科)，農文協(xié)，1988)，對于大米，一般認為是每10a 5-15kg(日向康吉、羽柴輝良編，植物生產(chǎn)農學實驗手冊，softscience公司，1995；奈良縣農業(yè)技術中心主頁，http//www.naranougi.jp/sehi-kijyun/sehikijyun-index.html)。此外，擬南芥等實驗植物中，含有5mM以上的硝酸鹽的培養(yǎng)基是適于生長發(fā)育的標準培養(yǎng)基(Matinez-Zapater J.M.，and Salinas J.ed.，Methods inMolecular Biology Arabidopsis Protocols，Humana Press，NewJersey，1998)。這樣的標準氮肥量或標準培養(yǎng)基中的氮量是本領域技術人員所熟知的。
在與通常栽培條件相比限制氮的條件下也就是在上述這樣的減少了標準氮量的下限至下限的1/10量程度的范圍的氮量下栽培轉化植物，評價其生長發(fā)育和/或產(chǎn)量。生長發(fā)育可以通過測定地上部分或植物體全部的草的高度、葉數(shù)、鮮重或干燥重量來評價。本說明書中所謂生長發(fā)育的改善，定義為至少1個與這樣的植物體的部分或全部相關的參數(shù)(例如草的高度、葉數(shù)、鮮重或干燥重量)，與同時期在標準的氮肥量下開始栽培的對照植物相比，超過1.2倍以上的狀態(tài)。
這樣，如果鑒定出與通常栽培條件相比限制施加氮量的條件下的生長發(fā)育和產(chǎn)量與作為對照的非轉化體相比得到改善的轉化體，調查這種轉化是否能保持穩(wěn)定遺傳。為此，可以在通常條件下隨之培育，栽培和采種，解析其后代的性狀、其分離?？梢砸耘c初代(T1)轉化體同樣方式解析后代中導入的核酸構建體的有無，其位置、其表達等。
在與通常栽培條件相比限制氮的條件下的生長發(fā)育和產(chǎn)量得到改善的轉化植物，也就是解除了氮限制條件下的生長抑制的轉化植物，就其源于整合于導入基因組的核酸構建體的序列而言可以是半合條件下或純合條件下獲得，半合子或純合子可以通過必要的交配等，在后代中得到。從整合到基因組中的核酸構建體中獲得序列通過孟德爾學說在后代中分離。因此，從轉化體的特征的穩(wěn)定性的觀點出發(fā)為了獲得子代植物和種子，希望使用純合子植物。
此外，轉化體在許多情況下，作為基因座，外來基因插入于1處，但是插入于多個基因座中的多拷貝轉化體并不鮮見。由于導入基因的安全性等原由，本發(fā)明中更優(yōu)選單拷貝轉化體。例如，通過核對T2(第2世代)中的卡那霉素抗性的分離比，可以選擇出導入基因是1個基因座也就是單拷貝轉化體。T1是半合子、導入基因為1個基因座時，按照孟德爾法則，T2中，卡那霉素抗性和敏感型以3∶1的比例分離。此外，導入的基因以多拷貝存在時，抗性轉化體的出現(xiàn)頻率就高。因此，獲得的T2種子再次播種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，選擇顯示3∶1的分離比的系統(tǒng)，通過選擇出認為導入基因存在于1個基因座中的轉化體，可以獲得單拷貝轉化體。
這樣獲得的轉化植物可以按照與天然存在的同種植物相同的栽培條件進行栽培，在與通常栽培條件相比限制施用氮量的條件下栽培，可以獲得等同或優(yōu)于非轉化體植物的產(chǎn)物。此外，通過與同種的非轉化植物同樣的方法可以容易地獲得種子。如果有必要，獲得種子的保存、殺菌、害蟲驅除等可以按照本領域熟知的通常的方法進行。
這樣，可以增加導入如了基因的植物的2-OG含量，除這些方法之外，還可以通過葉面撒布氨基酸的一種脯氨酸增加植物的2-OG含量。具體的說，可以將20mg/l-500mg/l范圍的脯氨酸水溶液與適當?shù)恼共紕┮黄鹜ㄟ^噴灑等方式撒布于植物的葉面。此外，對于氮的限制條件中生長發(fā)育，以與上述同樣的條件和方法進行評價。
通過對由NADP-GDH基因或天冬氨酸轉氨酶基因的過量表達操作獲得的植物進行制備、產(chǎn)量調查，以及成分分析的以下的實施例，或者關于受到脯氨酸葉面撒布的植物的產(chǎn)量調查，成分分析的以下的實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
實施例實施例1由構巢曲霉獲得的NADP依賴型GDH基因的分離和Ti質粒載體的構建(1)構巢曲霉獲得的NADP依賴型GDH基因的分離在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中接種構巢曲霉，30℃下培養(yǎng)一夜，進而將所獲得的菌落在葡萄糖液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天。從增殖的菌中提取總RNA。
采用poly(A)Qucik mRNA Isolation Kit(stratagene公司)純化mRNA后，用第一鏈cDNA合成試劑盒(Amersham Bioscience公司)制成第一鏈cDNA。以制成的第一鏈cDNA為模板進行PCR反應。PCR反應條件是94℃-3分鐘；94℃-45秒、59℃-30秒、72℃-90秒、35個循環(huán)；72℃-10分鐘，采用Perkin-Elmer公司的PCR系統(tǒng)24000進行。所用的引物有5’-TCT AGA ATG TCT AAC CCC CTT GTT GAG-3’(序列號5)和5’-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3’(序列號6)。其結果是，確定出約1.4kbp的條帶，與預測的基因大小一致。用TA-Cloning-Kit對所得PCR產(chǎn)物進行克隆。用測序儀(ABI公司377A)確定所得克隆的堿基序列。與已知的從構巢曲霉獲得的NADP依賴型GDH基因相一致，表示為An-GDH(序列號17)。
(2)Ti質粒載體的構建進而，將編碼線粒體轉運肽的堿基序列添加到獲得的基因上。這是源于番茄的NADP依賴型GDH基因的5’側的序列，其通過采用引物5’-CTG CAG ATG AAT GCT TTA GCA GCAAC-3’(序列號7)和5’-TCT AGA TAA ACC AAG AAG CCT AGC TG-3’(序列號8)的PCR獲得。這樣獲得的An-GDH基因與編碼向線粒體轉運的轉運肽的堿基序列的連結是用以下4種引物進行的5’-TCT AGA ATG AAT GCT TTAGCA GCA AC-3’(序列號9)，5’-GGG AAG GTT TAG ACA TTA AACCAA GAA GCC T-3’(序列號10)，5’-AGG CTT CTT GGT TTA ATGTCT AAC CTT CCC-3’(序列號11)和5’-GAG CTC TTA CGC CTCCCA TCC TCG AA-3’(序列號12)。添加了向線粒體轉運的轉運肽序列的GDH基因作為Mtd-An-GDH。這種Mtd-An-GDH基因與由農桿菌產(chǎn)生的用于轉化的載體、Ti質粒，pIG121-Hm的GUS區(qū)域置換(圖1)。所得Ti-質粒導入到根癌農桿菌(Agrobacterium Tumefaciens)，EHA101中，用于擬南芥和馬鈴薯的轉化。
實施例2.馬鈴薯轉化體的制備馬鈴薯(品種為May Queen)的轉化是按照Gordon等人(文獻PlantCell Reports，1993，12324-327)的方法進行的。切下無菌誘導的微型塊莖，制成塊莖切片、栽培在添加了2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚乙酸的MS瓊脂培養(yǎng)基上，25℃下24小時培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)16天。含有構建的基因的農桿菌接種在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的YEP培養(yǎng)基(10g/l細菌用胰蛋白胨，10g/酵母提取物，1g/l葡萄糖)中，28℃下振蕩培養(yǎng)過夜。在24小時培養(yǎng)的塊莖切片中加入農桿菌液感染。10分鐘后，用經(jīng)滅菌的濾紙，去除剩余的農桿菌液，移載到先前使用的皿中，相同條件下培養(yǎng)24小時。之后，將塊莖切片移栽到含有50mg/l卡那霉素，300mg/l鹽酸氨噻肟頭孢菌素(cefotaxime hydrochloride)，2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚乙酸的MS瓊脂培養(yǎng)基中，進行轉化體的選擇。將再分化的根再次移到前述選擇培養(yǎng)基中，進行抗性的鑒定。將清楚地呈現(xiàn)卡那霉素抗性的根移栽到含有50mg/l卡那霉素，300mg/l鹽酸氨噻肟頭孢菌素(cefotaxime hydrochloride)的MS瓊脂生根培養(yǎng)基中，誘導根的分化。至少切取三次生根的再分化植物的莖頂部，移栽到選擇生根培養(yǎng)基中，進行卡那霉素抗性的鑒定，排除嵌合個體。使這樣獲得的5個個體與土壤相適應，獲得塊莖。
實施例3.擬南芥轉化體的制備向擬南芥導入基因是按照Bechtold等人(文獻C.R.Acad.Sci.Paris，Life Science 3161194-1199，1993)的方法進行的。將擬南芥的種子播種在培養(yǎng)土中，將24℃下日長為16小時栽培10天的幼苗每次移栽一株到一塊石棉上，在相同條件下繼續(xù)栽培2周時間。植物一抽苔就打尖，繼續(xù)栽培一周。在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的的YEP培養(yǎng)基中28℃下振動培養(yǎng)農桿菌24小時，通過離心(7,000rpm，10分鐘)收集菌體。將菌體懸浮于用于滲透的懸浮培養(yǎng)液(1/2ms鹽，1/2B5維生素，5％蔗糖，0.5g/lMES，0.044μM苯甲酸嘌呤，pH5.7)中。去掉已經(jīng)開花、結果的花器后浸漬于農桿菌懸液中，進入干燥器，進行15分鐘的減壓(40mmHg)處理。在1個月栽培后，采集處理的植物的種子。將種子播種于含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨噻肟頭孢菌素(cefotaxime)的MS瓊脂培養(yǎng)基中，進行選擇。這樣獲得的3株轉化體被更新至T3世代，不產(chǎn)生卡那霉素抗性的分離系統(tǒng)用于分析。
實施例4.導入基因的確認從選出的顯示卡那霉素抗性的個體，即5個馬鈴薯，3個擬南芥和非感染植物中提取DNA。DNA的提取是按照Honda等人(文獻Hondaand Hirai，1990，Jpn J Breed 40339-348)的方法進行的。進行用提取的DNA，采用An-GDH基因特異的引物5’-TCT AGA ATG TCT AACCCC CTT GTT GAG-3’(序列號13)和5’-GAG CTC TCA CCA CCAGTC ACC CTG GTC-3’(序列號14)，和用于擴增載體內的NPT II基因的引物5’-CCC CTC GGT ATC CAA TTA GAG-3’(序列號15)和5’-CGG GGG GTG GGC GAA GAA CTC CAG-3’(序列號16)的PCR分析。反應以94℃-3分鐘；94℃-45秒、55℃-30秒、72℃-90秒、35個循環(huán)；72℃-10分鐘，采用Perkin-Elmer公司的PCR系統(tǒng)2400進行。對PCR產(chǎn)物進行采用0.1％瓊脂糖凝膠的電泳，用溴化乙錠染色。
其結果是，由于在選出的轉化馬鈴薯(圖2)和轉化擬南芥(圖3)中，證實了An-GDH基因特異的條帶(約1.5kbp)和NPT II基因特異的條帶(約1.1kbp)，非感染植物中，沒有這些條帶，表明含有An-GDH基因的T-DHA區(qū)域導入在轉化馬鈴薯和轉化擬南芥中。
實施例5.導入基因的表達的確認(NORTHERN分析)為了證實導入基因的表達，采用經(jīng)證實導入了An-GDH基因的轉化馬鈴薯和轉化擬南芥，進行NORTHERN分析。
根據(jù)SDS-苯酚法從轉化馬鈴薯的葉組織、塊莖和轉化擬南芥的葉組織中提取RNA。提取出的RNA在含18％甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠中進行電泳，用溴化乙錠染色。點樣在尼龍膜(HybondN+)上后，用UV固定，進行雜交。以全長An-GDH基因用作探針。Northern blot和探針的制備采用的是Roche Diagnostics公司的Dig-High Prime DNALabeling And Detection Starter Kit II和PCR Dig Probe SynthesisKit。
其結果是，在轉化馬鈴薯的葉組織和塊莖中，確認出An-GDH基因特異的條帶(圖4)。從而判明導入的基因在轉化馬鈴薯的葉組織和塊莖中的轉錄表達。另一方面，轉化擬南芥葉組織中，確認出An-GDH基因特異的條帶(圖5)。這提示導入的基因在轉化擬南芥的葉組織中轉錄表達。非轉化馬鈴薯和非轉化擬南芥中，沒有發(fā)現(xiàn)An-GDH基因特異的條帶。
實施例6.導入基因的表達(NADP-GDH活性)為了證實導入基因的表達，用經(jīng)證實已經(jīng)導入An-GDH基因的轉化馬鈴薯和轉化擬南芥，進行NADP-GDH活性的測定。
活性的測定是采用Ameziane等人(文獻Plant and Soil，2000，22147-57)的方法進行的。用液氮冰凍轉化馬鈴薯(約0.2g)和轉化擬南芥的葉組織(約0.2g)，用乳缽破碎后，加入5倍重量的提取緩沖液{200mM Tris(pH8.0)，14mMβ-巰基乙醇，10mML-半胱氨酸-HCl，0.5mMPMSF}。移到離心管中，4℃下，以12,000rpm離心30分鐘后，超濾(Millipore，Ultrafree 0.5filter unit，Biomax-10)上清，進而用提取緩沖液清洗3次。
在含有100mM Tris(pH8.5)，20mM 2-酮戊二酸，10mMCaCl2，0.2mM NADPH，200MmNH4Cl的反應液中加入先前提取的粗酶液，測定340nm處的吸收度的減少。用Bradford法以牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白質提取的粗酶液中的蛋白質濃度。
其結果是，發(fā)現(xiàn)轉化馬鈴薯的活性比非轉化馬鈴薯高約20-50倍(表1)。轉化擬南芥中也發(fā)現(xiàn)其活性比非轉化擬南芥高約5-12倍(表2)。由于未發(fā)現(xiàn)非轉化體有任何NADP-GDH活性，因此認為這種活性就是由導入的An-GDH基因的表達產(chǎn)生的活性。
表1.轉化馬鈴薯和轉化馬鈴薯的NADP-GDH活性

表2.轉化擬南芥和轉化擬南芥的NADP-GDH活性

實施例7.導入了GDH基因的擬南芥和馬鈴薯的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素和硝酸含量測定轉化馬鈴薯(Mtd8)和轉化擬南芥(Mtd3)的葉組織中的2-OG，尿素和硝酸含量。馬鈴薯是將在500g Power Soil和500g蛭石的混合土壤中栽培1個月的生長旺盛植物體的葉組織用作材料。擬南芥是用在PNS培養(yǎng)基(含5mM KNO3)中生長發(fā)育3周的植物體的葉組織作為材料。提取的方法是按照Agarie等人(文獻Plant Science，2002，162257-265)的方法進行的。用液氮破碎葉組織(約0.1g)后，加入200μl的3％HCO4充分混合。以12,000rpm離心10分鐘后，將上清轉移到其它的管中。在殘留的沉淀中再次加入200μl的3％HCO4，充分混合。以12,000rpm離心10分鐘后，將上清轉移到上次的那支管中。在回收的上清中加入50-70μl的5M的K2CO3，使溶液中和。用石蕊試紙，確認液體的pH為中性后，用滅菌水將液體體積調制成600μl，制成測定用的試樣。硝酸和尿素的測定中各自采用的是Roche Diagnostics公司的硝酸和尿素/氨F-試劑盒。對Ameziane等人(文獻前述)的方法進行了改變以測定2-OG含量。在475μl的反應液{0.1M Tris-HCl(pH8.5)，1.0mMCaCl2，0.2mM NADPH，0.2M NH4Cl}中加入20μl提取的試樣，測定340nm波長處的吸光度后，加入5μl(10個單位)的谷氨酸脫氫酶(GDH)，在37℃下反應10分鐘。再次測定340nm波長處的吸光度，根據(jù)加入酶液后的吸光度與加酶之前的吸光度值之差，計算出2-OG酸含量。
其結果是，轉化擬南芥的2-OG含量增加至非轉化擬南芥的2.6倍，尿素含量增加至非轉化擬南芥的2倍，硝酸含量增加至非轉化擬南芥的1.2倍。另一方面，轉化馬鈴薯中的2-OG含量也增加至非轉化馬鈴薯的1.7倍，尿素含量增加至非轉化馬鈴薯的1.5倍，硝酸含量增加至非轉化馬鈴薯的1.3倍(圖6A-F)。
進而，在培養(yǎng)擬南芥時，采用在培養(yǎng)基中的氮濃度調整為10，5，3，0.3，0.1mM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周的擬南芥的葉組織，測定2-OG含量和硝酸含量。其結果發(fā)現(xiàn)轉化擬南芥的2-OG含量與非轉化擬南芥的2-OG含量的差異隨著培養(yǎng)基中的氮含量的減少而增加(圖7)。根據(jù)該結果，認為導入的GDH具有分解谷氨酸，合成2-OG和氨的功能。此外，在含有3mM以上的氮時，轉化擬南芥和非轉化擬南芥的硝酸含量的累積量均保持大致穩(wěn)定，經(jīng)證實在這種條件下轉化擬南芥的累積量最大增加至非轉化擬南芥的1.3倍。經(jīng)證實在0.3和0.1mM的氮條件下也有2.5-4.5倍的增加(圖8)。根據(jù)這些結果，表示在轉化擬南芥的葉組織中，與非轉化擬南芥相比累積了更多的硝酸，這反映氮的吸收效率增加了。
實施例8.導入了GDH基因的擬南芥和馬鈴薯的葉組織的氮同化相關酶的活性測定轉化擬南芥和轉化馬鈴薯的葉組織(約0.1g)中的NADH依賴型谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)、硝酸還原酶(NR)和谷氨酸合酶(GS)的酶活性。馬鈴薯是將在500g Power Soil和500g蛭石的混合土壤中栽培1個月的生長旺盛植物體的葉組織用作材料。擬南芥是用在PNS培養(yǎng)基(含5mM KNO3)中生長發(fā)育3周的植物體的葉組織作為材料。粗酶液的提取是按照Groat等人(文獻Plant Physiol，1981，671198-1203)的方法進行的。用液氮破碎葉組織后，加入500μl的冰冷的提取緩沖液{100mM Mes-NaOH(pH7.5)，100mM蔗糖，2％(v/v)硫基乙醇，15％乙二醇，0.1％PMSF}，輕輕地混合。0℃下以12,000rpm離心20分鐘后，用Ultrafree(Biomax-10k，Millipore公司)提純上清。用相同的緩沖液清洗3次后，溶解于100μl的緩沖液制成酶液。
同樣，NADH-GOGAT活性的測定也是按照Groat等人(文獻前述)的方法進行。制備500μl的反應液{100mM K-磷酸鹽(pH8.2)，100μMNADH，2.5mM 2-酮戊二酸，10mM L-谷氨酰胺，1mMaminooxyacetate}后，加入10μl酶液混合。測定340nm的吸光度3分鐘，測定伴隨NADH的消耗吸光度值的減少。
NR的活性是按照Ferrario-Mery等人(文獻Planta，197，202510-521)的方法進行的。制備490μl的反應液{50mM Mops-KOH(pH7.8)，1mM NaF，10mM KNO3，0.17mM NADH，10mM MgCl2或5mMEDTA}，各自加入10μl的酶液混合。16分鐘后，加入500μl 1％的磺酰胺(3N HCl中的)，進而加入10μl 2％的N-萘基-1-二氯水合乙二胺(N-naphthyl-1-ethylene diamine dicholorhydrate)。以12,000rpm離心5分鐘后，測定540nm的吸光度。從加入MgCl2的反應的值中減去加入EDTA的反應時的值以獲得NR活性。
GS的活性是按照Ferrario-Mery等人(文獻前述)的方法進行的。在480μl的反應液{80mM谷氨酸，20mM MgSO4，1mM EDTA，100mMtricine，6mM羥胺，8mM ATP}中加入20μl的酶液，30℃下反應15分鐘。加入500μl的0.37MFeCl3，0.2M三氯乙酸，0.67N HCl液，停止反應后，測定540nm的吸光度。
以牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白質用Bradford法測定提取的酶液中的蛋白質濃度。其結果是，轉化擬南芥的NADH-GOGAT活性、NR活性、GS活性各自增加至非轉化擬南芥的1.38倍、1.40倍、1.25倍(表3)。另一方面，在轉化馬鈴薯中的NADH-GOGAT活性、NR活性、GS活性也各自增加至非轉化馬鈴薯的1.33倍、1.36倍、1.01倍(表4)。通過以上結果，表示轉化擬南芥和轉化馬鈴薯與非轉化體相比，不僅氮的吸收效率提高了，而且與氮代謝相關的酶的活化，氮的代謝效率也提高了。
表3.轉化擬南芥的酶(Mtd3)活性

(單位/mg蛋白質)表4.轉化馬鈴薯的酶(Mtd8)活性

(單位/mg蛋白質)實施例9.轉化馬鈴薯的產(chǎn)量調查用轉化馬鈴薯進行產(chǎn)量調查。產(chǎn)量調查中，采用從轉化馬鈴薯和非轉化馬鈴薯獲得的種子馬鈴薯。在改變氮濃度的條件下栽培時，就生長發(fā)育和塊莖重量、塊莖數(shù)等進行調查。設立作為標準條件的在8.5升的罐中加入3kg的Power Soil(氮總量為1.2kg)的情況和作為低氮標準的在7號罐中加入300g的Power Soil(氮總量為0.12kg)的情況的2組，土壤的剩余部分由蛭石(無養(yǎng)分)填補。播種3個月后就產(chǎn)量、地上部分、塊莖重量、塊莖數(shù)進行調查。
其結果是，在氮為1.2g的組中，轉化馬鈴薯的塊莖重量和塊莖數(shù)各自增加至非轉化馬鈴薯的1.12-1.13倍和1.09-1.23倍(表5)。氮為0.12g組(氮限制條件)中，轉化馬鈴薯的塊莖重量和塊莖數(shù)，各自增加至非轉化馬鈴薯的1.29-1.35倍和1.24-1.56倍(表6)。
表5.在氮為1.2g的組中轉化馬鈴薯的產(chǎn)量調查(n≥8)

表6.在氮為0.12g的組中轉化馬鈴薯的產(chǎn)量調查(n≥8)

實施例10.轉化擬南芥的生長發(fā)育調查用轉化擬南芥(Mtd3)進行生長量的調查。播種在PNS培養(yǎng)基(氮源僅為硝態(tài)氮)的KNO3濃度改變?yōu)?.1，0.3，3，5mM，加入了1％蔗糖的培養(yǎng)基(使用Thermo8cm皿)中，每個皿中培養(yǎng)8株。播種3周后測定地上部分重量。數(shù)據(jù)以每組中3個皿中的平均值和誤差表示所有8株的地上部分重量。其結果是，轉化擬南芥在低氮條件下生長發(fā)育比非轉化擬南芥更為良好，呈現(xiàn)為生長量為非轉化擬南芥鮮重的1.1-1.14倍(表7)。
表7.含有任意濃度KNO3的PNS培養(yǎng)基(含1％蔗糖)中生長發(fā)育的轉化發(fā)育擬南芥和非轉化擬南芥的鮮重(g)

實施例11.脯氨酸水溶液向馬鈴薯植物的葉面撒布采用馬鈴薯(品種為May Queen)，就在葉面撒布脯氨酸時進行生長發(fā)育和產(chǎn)量的效果調查。將馬鈴薯塊莖播種在裝入了1.5kg的PowerSoil(吳羽化學)的7號罐中。Power Soil中所含氮肥如表8所示。在通常的栽培中，使用5g氮肥作為基肥，而本栽培試驗在低氮條件下進行栽培。
葉面撒布設立展布劑組(Approach B1，花王)、尿素組(展布劑+0.87mM尿素)、脯氨酸組(展布劑+1.75Mm脯氨酸)這三組，自播種后一個月時(開花前立即)起每周對每株噴灑約20ml。撒布合計進行6次(6周)，播種3周后進行收獲。
表8.馬鈴薯栽培試驗的氮施肥條件

實施例12.脯氨酸葉面撒布馬鈴薯葉組織的游離脯氨酸含量和2-酮戊二酸含量的測定在馬鈴薯葉面撒布擴展劑和尿素、脯氨酸各水溶液后，隨時間變化測定游離脯氨酸含量和2-酮戊二酸含量。葉面撒布后，1，3，5，8小時時從植物的莖頂部取樣三份葉組織，充分水洗作為試樣。用液氮冰凍破碎后，加入5倍鮮重的80℃下加溫的80％乙醇，進而在80℃下培養(yǎng)20分鐘。12,000rpm離心10分鐘后，將上清轉移到其它管中。再次，加入80％乙醇在80℃下培養(yǎng)20分鐘，離心，回收上清，總共進行3次同樣的提取。乙醇提取物在冷凍干燥后，加入300μl滅菌水和200μl乙醚，充分混合后，12,000rpm下離心10分鐘。去除上層的乙醚層后，將水層轉移到200μl的其它管中，再次冷凍干燥。溶解于200μl的0.02N鹽酸后，用0.22μm濾膜過濾。用日立高速氨基酸分析裝置(L8800)分析如此獲得的提取液。用同樣的植物試樣，進行2-OG含量的測定。2-OG的提取和含量的測定用與實施例7中所述的方法相同的方法進行。
其結果是，葉面撒布1小時后的葉組織中的脯氨酸含量在3組間沒有觀察到有顯著差別，撒布5小時后脯氨酸撒布組的葉組織中的游離脯氨酸含量顯著增加(圖11)。認為葉面撒布的脯氨酸被吸收到葉組織中。同樣地，葉組織中的2-OG含量的測定結果是，葉面撒布1小時后的葉組織中的2-OG含量在3組間沒有觀察到有顯著差別，發(fā)現(xiàn)在撒布24小時后脯氨酸撒布組的葉組織中的游離2-OG含量顯著增加(圖12)。認為葉面撒布的脯氨酸在被吸收到葉組織中后，代謝為2-OG，吸收到TCA循環(huán)中。
實施例13.脯氨酸葉面撒布馬鈴薯的產(chǎn)量調查對播種1個月時的馬鈴薯植物每周葉面撒布6次展布劑和尿素、脯氨酸水溶液。對每組6個罐的各組進行栽培，莖數(shù)統(tǒng)一為1根，自播種起進行3個月的栽培。收獲各罐中的塊莖，求出每個罐中的塊莖重量和塊莖數(shù)。
其結果是，在塊莖重量方面，展布劑組每罐中的塊莖重量為145.8g，尿素組為140.1g、脯氨酸組為158.4g，脯氨酸組的塊莖重量增加為展布劑的1.1倍。另一方面，塊莖數(shù)量方面，展布劑組為8.2個，尿素組為6.8個、脯氨酸組為8.2個，認為就塊莖數(shù)而言沒有差異(表9)。根據(jù)以上結果，表明塊莖產(chǎn)量增加了。
表9.脯氨酸撒布的馬鈴薯產(chǎn)量 (n＝6)

實施例14.導入了從大腸桿菌獲得的天冬氨酸轉氨酶(ECASPC)基因的轉化擬南芥的制備基于大腸桿菌中已經(jīng)報道的天冬氨酸轉氨酶(ECASPC)基因的序列信息(GENBANK登錄號X03629)，分離ECASPC基因(核苷酸序列序列號19，氨基酸序列序列號20)。在相同的基因上，如實施例1中所述，添加了向線粒體轉運的轉運肽序列(mtdECASPC)。以植物轉化用的Ti-質粒載體pBI121的GUS區(qū)域置換該基因后，轉化根癌農桿菌EHA105。用這種農桿菌以與實施例3同樣方法將mtdECASPC基因導入到擬南芥中。播種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中，選擇出抗性個體(T1世代)，在下個世代中獲得卡那霉素抗性和感受性以3∶1分離的系統(tǒng)(T2世代)。進而在下個世代中，選擇所有個體顯示出抗性的系統(tǒng)(T3世代)的4個系統(tǒng)(mtdECASPC2-2，mtdECASPC6-2，mtdECASPC8-1和mtdECASPC9-1)。所得轉化體中導入基因的確認通過基因組PCR按與實施例4相同方式進行。此外，按照RT-PCR法解析導入基因的轉錄表達。用Plant Rneasy Mini-Kit從擬南芥葉組織中提取RNA。RT-PCR是采用TaKaRa的RNA-PCR試劑盒，用ECASPC特異引物進行的。進行94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘的30個循環(huán)反應。以1％瓊脂糖凝膠進行電泳后，用溴化乙錠染色。
其結果是，顯示出卡那霉素抗性的轉化擬南芥中，確認出與用作陽性對照的mtdECASPC質粒載體DNA作為模板時相同大小的條帶(圖13)。該結果提示，顯示出卡那霉素抗性的轉化擬南芥的基因組內導入了mtdECASPC基因。
實施例15.ECASPC基因轉化擬南芥的氮限制條件下的生長發(fā)育的調查用所得擬南芥，根據(jù)實施例10的主要內容進行生長量的調查。采用氮源僅為硝態(tài)氮的PNS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的KNO3濃度為5mM和10mM，各加入1％蔗糖。無菌播種種子，一周后，留下生長發(fā)育一致的10株。進而2周(自播種3周后)后，測定這10株的地上部分重量。2組植株的平均值和誤差表示于表10中。其結果顯示，導入了mtdECASPC基因的擬南芥與沒有導入基因的非轉化擬南芥相比，其地上部分鮮重顯著增加，氮為5mM的組中顯示為1.18-1.28倍，氮為10mM的組中顯示為1.12-1.38倍。
表10.

(mg，n＝2)實施例16.導入了mtdECASPC基因的擬南芥的2-OG含量的測定采用實施例14中選擇出的4個系統(tǒng)的導入了mtdECASPC基因的擬南芥進行2-OG含量的測定。無菌播種在KNO3濃度為5mM，含有1％蔗糖的PNS培養(yǎng)基中，采用24℃下日長為16小時生長發(fā)育2周的植物的地上部分。2-OG的提取和含量測定以與實施例7所述的方法相同的方法進行。
其結果表明，導入了mtdECASPC基因的轉化擬南芥的地上部分組織中的2-OG含量顯著增加為沒有導入相同基因的非轉化擬南芥的1.27-1.93倍。該結果與導入GDH基因的轉化植物中所發(fā)現(xiàn)的結果極為相似。
表11.導入了mtdECASPC基因的擬南芥的2-OG含量

(n＞3)
序列表<110>味之素公司<120>氮限制條件下生長得以改善的植物的制備方法<130>OP05262<150>JP 2003-198559<151>2003-07-17<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2334<212>DNA<213>構巢曲霉<220>
<221>CDS<222>(400)..(445)<220>
<221>CDS<222>(499)..(774)<220>
<221>CDS<222>(828)..(1882)<400>1ttagccctcc ctttccgatc ctatggttcc tccgatcctg accctggttg accagtgatc 60cggggccttc gagcctttcc accgtgccag ccgactttcc cgccagattt tagtcgcctc 120ccgtggccgc acccagggat cttctcgtcc gactccgggc agtatactca ttcgccggcc 180tccgccaggc cgccgtccgc ctctccccac cacccgtctc ctctgtcata cttaaacccg 240gtcgtgtgcc tctcttggac ggtctctttt tttttcttat ccatcagagc cctttgcttc 300
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<221>CDS<222>(741)..(785)<220>
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<221>CDS<222>(1472)..(2243)<400>3tctagattgc gacggcgtat tgcttatcct tagtaggact ccctaatgga ttccgagcaa 60gaaaagactg tttggcgtgt accaatggct catagtacca gcaagagaag aattttctct120ctcgcttcga gaaagcaatc aaaaaaaaat cctatcctac cctaccctac cctaatactt180ccattgccac ccgattcctc ccgatagtag agcgggcgac tgccatttgg cgggcgggcc240agcggattcc cgccgataga taacgggcag attctgtgac ctcaaactat cgactaacag300cccgaacttc ggcggccacc gccaaacccg ccccggaagc cggcctcatt tgccgtttgg360gcgtgccagg aaatgccgcc tgcagcggag actccctagt gtggtctgtg ttgcctgtgt420cgtctgtgta gtatactagt tactagtcta ctactgtaca gtggatggcc tgaggggggg480actttatgtc cgactccggc tgttctcctc cctctatcca ctctaccctc ttccctctct540tctgtctttc tccccgctct cgcccctccc ctcctcgaaa acataaatcg gcctttcccc600ctcgccatct tcttcttctt ctccctctcc tttctctttc ttcttcagac tacttctctt660
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<400>4Met Ser Asn Leu Pro His Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr Lys Glu1 5 10 15Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Lys Asn Pro Glu20 25 30Tyr Arg Lys Ala Leu Ala Val Val Ser Val Pro Glu Arg Val Ile Gln35 40 45Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Ala Gly Asn Val Gln Val Asn Arg50 55 60Gly Phe Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly65 70 75 80Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Gln Val Pro Trp85 90 95Phe Arg Ala Asp Leu Gln Glu Cys Ser His Trp Pro Glu His Gly Trp100 105 110Trp Tyr Val Glu His Met Ile Ala His Ala Thr Asn Gly Gln Glu Ser115 120 125Phe Lys Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Gln130 135 140Tyr Ala Ala Leu Lys Val Ile Glu Leu Gly Gly Ser Val Val Ser Leu145 150 155 160Ser Asp Thr Gln Gly Ser Leu Ile Ile Asn Gly Glu Gly Ser Phe Thr
165 170 175Pro Glu Glu Ile Glu Leu Ile Ala Gln Thr Lys Val Glu Arg Asn Glu180 185 190Leu Ala Ser Ile Val Gly Ala Ala Pro Phe Ser Asp Ala Asn Lys Phe195 200 205Lys Tyr Ile Ala Gly Ala Arg Pro Trp Val His Val Gly Lys Val Asp210 215 220Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln Asn Glu Val Ser Gly Glu Glu Ala225 230 235 240Gln Val Leu Ile Asn Ala Gly Cys Lys Phe Ile Ala Glu Gly Ser Asn245 250 255Met Gly Cys Thr Gln Glu Ala Ile Asp Thr Phe Glu Ala His Arg Thr260 265 270Ala Asn Ala Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ala Pro Gly Lys Ala Ala275 280 285Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ala Gln Asn Ser290 295 300Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ser Glu Glu Val Asp Ala Arg Leu Lys Asp305 310 315 320Ile Met Arg Asp Cys Phe Lys Asn Gly Leu Glu Thr Ala Gln Glu Tyr325 330 335Ala Thr Pro Ala Glu Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Thr Gly Ser Asn
340 345 350Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Ala Ala Met Lys Asp Gln Gly Asp355 360 365Trp Trp370<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>5tctagaatgt ctaaccccct tgttgag 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
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<220>
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<223>PCR引物<400>13tctagaatgt ctaaccccct tgttgag 27<210>14<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
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<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>PCR引物<400>16cggggggtgg gcgaagaact ccag24<210>17<211>1380<212>DNA<213>構巢曲霉<400>17atgtctaacc ttcccgttga gcccgagttc gagcaggcct acaaggagct tgcgtcgacc 60ctcgagaact ccaccctctt tgagcagcac cctgaatacc gacgggctct ccaggtcgtc120tccgttcccg agcgcgttat ccagttccgt gtcgtttggg agaacgacaa gggcgaggtt180cagatcaacc gcggttaccg tgttcagttc aactccgctc tcggtcccta caagggtggt240ctccgtttcc acccctccgt caacctttct atcctgaagt tccttggctt cgagcagatc300ttcaaaaatg ctctcacagg actaaacatg ggtggtggca agggtggttc cgacttcgac360cccaagggca agtctgactc tgaaattcgt cgcttctgta ccgctttcat gactgagctc420tgcaagcaca tcggcgcgga cactgacctt cccgctggtg atatcggtgt tactggccgt480
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<211>1191<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1188)<400>19atg ttt gag aac att acc gcc gct cct gcc gac ccg att ctg ggc ctg 48Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu1 5 10 15gcc gat ctg ttt cgt gcc gat gaa cgt ccc ggc aaa att aac ctc ggg 96Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly20 25 30att ggt gtc tat aaa gat gag acg ggc aaa acc ccg gta ctg acc agc144Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser35 40 45gtg aaa aag gct gaa cag tat ctg ctc gaa aat gaa acc acc aaa aat192Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn50 55 60tac ctc ggc att gac ggc atc cct gaa ttt ggt cgc tgc act cag gaa240Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu65 70 75 80ctg ctg ttt ggt aaa ggt agc gcc ctg atc aat gac aaa cgt gct cgc288Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg85 90 95acg gca cag act ccg ggg ggc act ggc gca cta cgc gtg gct gcc gat336Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp100 105 110ttc ctg gca aaa aat acc agc gtt aag cgt gtg tgg gtg agc aac cca384Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro115 120 125agc tgg ccg aac cat aag agc gtc ttt aac tct gca ggt ctg gaa gtt432Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
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Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly245 250 255Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe260 265 270Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala275 280 285His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg290 295 300Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg305 310 315 320Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg325 330 335Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly340 345 350Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr355 360 365Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn370 375 380Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu385 390 39權利要求
1.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于植物的2-酮戊二酸(2-OG)含量提高。
2.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于導入谷氨酸脫氫酶(GDH)基因，在植物體內表達該基因，結果所述植物的2-OG含量提高。
3.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于在植物的葉面撒布脯氨酸，結果所述植物的2-OG含量提高。
4.一種制備在將氮限制到比通常的栽培條件低的栽培條件下，生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物的方法，其特征在于導入ECASPC基因，在植物體內表達該基因，結果所述植物的2-OG含量提高。
5.一種栽培2-OG含量增加了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
6.一種栽培導入了谷氨酸脫氫酶(GDH)基因使得2-OG含量提高了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
7.一種栽培葉面撒布了脯氨酸使得2-OG含量提高了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
8.一種栽培導入了ECASPC基因使得2-OG含量提高了的植物的方法，其特征在于在限制氮的栽培條件下栽培。
9.根據(jù)權利要求1-8任一所述的方法，其中在施用標準氮肥量的下限至下限的1/10范圍的氮的條件下，獲得等同或優(yōu)于施用標準氮肥量的栽培條件下的生長發(fā)育和/或產(chǎn)量。
10.根據(jù)權利要求6-8所述的方法，其中限制氮的栽培條件就是指在標準氮肥量的下限至下限的1/10范圍的氮肥施用量的條件。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過增加植物的2－OG含量，制備植物的氮吸收和代謝活性增加且在氮減少也就是在與通常栽培條件相比更加限制氮的栽培條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量得以改善的植物方法。尤其是，本發(fā)明提供了通過導入GDH基因或ECASPC基因，在植物內表達導入的GDH基因或ECASPC基因增加2－OG含量，或者通過在植物葉面撒布脯氨酸增加植物2－OG含量，提高植物的氮吸收和代謝活性，制備在與通常栽培條件相比更加限制氮的栽培條件下生長發(fā)育和/或產(chǎn)量提高的植物的方法。此外，還提供了在氮限制條件下栽培這種植物的方法。
文檔編號C12N15/09GK1822763SQ200480020600
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權日2003年7月17日
發(fā)明者木板廣明, 三輪哲也, 秋山愛 申請人:味之素株式會社