專利名稱：從cDNA中回收非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生稱為單分子負(fù)鏈RNA病毒(Mononegavirales)目的感染性、復(fù)制性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的改進(jìn)方法和組合物。該方法和組合物也適用于產(chǎn)生生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型的這些病毒。
背景技術(shù)：
有包膜、非節(jié)段性、負(fù)義、單鏈RNA病毒組成和表達(dá)獨(dú)特。負(fù)義、單鏈病毒的基因組RNA在核衣殼內(nèi)容中具有兩種模板功能作為信使RNA(mRNA)的合成模板和作為反義基因組(+)鏈的合成模板。負(fù)義、單鏈RNA病毒編碼和包裝它們自己的RNA-依賴性RNA聚合酶。僅當(dāng)其核衣殼進(jìn)入受感染細(xì)胞的胞質(zhì)時(shí)，才合成信使RNA。病毒復(fù)制發(fā)生在mRNA合成之后，需要病毒蛋白的連續(xù)合成。新合成的反義基因組(+)鏈用作進(jìn)一步產(chǎn)生(-)鏈基因組RNA拷貝的模板。
RNA-依賴性聚合酶復(fù)合物通過在基因組的3’端，具體說，在啟動(dòng)子區(qū)產(chǎn)生順式作用信號(hào)而驅(qū)動(dòng)和實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。然后由基因組模板從3’至5’端單方向地轉(zhuǎn)錄病毒基因。相對(duì)于它們的上游鄰居(如核蛋白基因(N))來說，下游基因(如聚合酶基因(L))產(chǎn)生的mRNA較少。因此，諸基因根據(jù)相對(duì)于基因組3’端的位置，其mRNA豐度呈梯度分布。
對(duì)于許多非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒來說，沒有任何種類的有效疫苗可用。因此，非常需要開發(fā)改進(jìn)的免疫原性組合物和方法，以抵抗這些人和動(dòng)物的病原體。
在尋求開發(fā)抵抗非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的免疫原性組合物和方法中可使用各種方法，包括使用(1)純化的單個(gè)病毒蛋白疫苗(亞單位疫苗)；(2)滅活的全病毒制劑；和(3)減毒活病毒。
亞單位疫苗具有的優(yōu)良特征是純、成分明確和用各種方法，包括重組DNA表達(dá)方法大量產(chǎn)生相對(duì)容易。迄今，明顯地除了乙型肝炎表面抗原以外，病毒亞單位疫苗通常僅引發(fā)短期和/或不充分的免疫力，尤其是在初次受試者中。
已證明，經(jīng)福爾馬林滅活的脊髓灰質(zhì)炎(IPV)和甲型肝炎全病毒制劑是安全和有效的。相反，用類似方法滅活的全病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)和麻疹病毒疫苗免疫會(huì)引發(fā)不良的免疫應(yīng)答和/或使疫苗接種者后來遇到天然產(chǎn)生的或“野生型”病毒時(shí)易發(fā)生過度的或異常的疾病反應(yīng)。
免疫幼兒的早期嘗試(1966)采用胃腸道外給予福爾馬林滅活的RSV疫苗。不幸的是，該疫苗的幾次現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)顯示有嚴(yán)重的副反應(yīng)，包括后來天然感染RSV后，發(fā)生不尋常特征的嚴(yán)重疾病(Kapikian等，Am J Epidemiol.4405-21，1969；Kim等，Am J Epidemiol.4422-34，1969；Collins等，呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytial Virus)“現(xiàn)場(chǎng)病毒學(xué)(Field’s Virology)”，第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等，Adv.Virus.Res.，54423-451，1999)。有人提出，此種福爾馬林處理的RSV抗原引發(fā)異?；虿黄胶獾拿庖邞?yīng)答，使疫苗接種者易患RSV疾病(Collins等，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)“現(xiàn)場(chǎng)病毒學(xué)(Field’s Virology)”第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等Adv.Virus.Res.，54423-451)。
此后，通過冷傳代或化學(xué)誘變產(chǎn)生候選的減毒活RSV疫苗。發(fā)現(xiàn)這些RSV株在血清陽性成人中毒力降低。不幸的是，當(dāng)給予血清陰性的嬰兒時(shí)，證明它們是過度減毒或減毒不足的；在一些情況下，也發(fā)現(xiàn)它們?nèi)狈z傳穩(wěn)定性(Collins等，R，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)“現(xiàn)場(chǎng)病毒學(xué)(Field’s Virology)”第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等，Adv.Virus.Res.，54423-451)。另一采用胃腸道外給予活病毒進(jìn)行免疫的方法無效，沿此路線進(jìn)行的努力已停止(Collins等，呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)“現(xiàn)場(chǎng)病毒學(xué)(Field’s Virology)”第3版。Lippincott-Raven，1443-1475，2001；Collins等，Adv.Virus.Res.，54423-451)。值得注意的是，這些RSV活疫苗從來不伴有上述福爾馬林滅活RSV疫苗觀察到的病情加重。目前，沒有批準(zhǔn)給予人的RSV疫苗，但是采用各種RSV減毒突變體的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行當(dāng)中。
野生型病毒的適當(dāng)減毒的活衍生物為用于免疫原性組合物和方法提供了獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)槭腔畹膹?fù)制因子，它們可引發(fā)受試者感染，在此期間，病毒基因產(chǎn)物被表達(dá)、加工并與免疫接種者的特定的MHC I和II類分子一起提呈。在此方式中，減毒活病毒候選疫苗有效引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，以及刺激協(xié)同細(xì)胞因子和趨化因子，此與天然感染存活者的免疫應(yīng)答特性類似。
這種有利的免疫應(yīng)答模式與滅活或亞單位疫苗引發(fā)的有界限的應(yīng)答反應(yīng)完全不同，后者一般主要限于體液免疫監(jiān)督臂。而且，一些福爾馬林滅活的全病毒疫苗，例如，1960年代開發(fā)的麻疹和呼吸道合胞病毒疫苗引起的免疫應(yīng)答特性，不僅不能提供持續(xù)保護(hù)，而且實(shí)際上當(dāng)疫苗接種者后來遇到野生型病毒時(shí)，導(dǎo)致易于發(fā)生異常、過度、甚至致命的疾病。
雖然對(duì)用于免疫原性組合物和方法來說，減毒活病毒具有所需特征，但證明產(chǎn)生和評(píng)價(jià)它們很困難。困難的癥結(jié)在于需要分離得到失去致病潛力(即毒力)，但仍保留足夠的復(fù)制能力能感染接受者并引發(fā)足量所需免疫應(yīng)答的野生型病毒衍生物。
歷史上，曾在改變的生長(zhǎng)條件(如溫度)下，通過不同宿主組織或細(xì)胞連續(xù)傳代野生型病毒分離物實(shí)現(xiàn)毒力和減毒之間的這種微妙平衡。該方法推測(cè)有利于病毒變體(突變體)的生長(zhǎng)，其中有些病毒具有令人鼓舞的減毒特征。偶爾也可通過化學(xué)誘變達(dá)到進(jìn)一步減毒。
這種增殖/傳代方案一般導(dǎo)致出現(xiàn)溫度敏感型(ts)、冷適應(yīng)型(ca)和/或宿主范圍(hr)改變的病毒衍生物—其中一個(gè)或全部由野生型、致病病毒變化而來—即可能發(fā)生與減毒相關(guān)的改變。
此方法已產(chǎn)生了幾種病毒活疫苗，包括預(yù)防麻疹和腮腺炎(副粘病毒)以及預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎和風(fēng)疹(正鏈RNA病毒)的疫苗，并為整個(gè)世界提供了目前兒童時(shí)期免疫的主要方案。
然而，這種產(chǎn)生候選減毒病毒活疫苗的方法時(shí)間很長(zhǎng)，可能不能預(yù)測(cè)，很大程度上依賴于選擇性產(chǎn)生具有所需減毒特征的隨機(jī)發(fā)生的基因組突變體。產(chǎn)生的用于免疫原性組合物的候選病毒在免疫對(duì)象中常常是減毒不足或過度減毒的。
即使目前已有使用的疫苗，仍需要更有效的候選減毒活病毒，以產(chǎn)生改進(jìn)的免疫原性組合物和方法。例如，目前的麻疹疫苗能提供相當(dāng)好的保護(hù)。然而，最近麻疹流行病學(xué)資料說明目前疫苗的效率有缺陷。即使母親有免疫力，低于一歲的兒童中發(fā)生急性麻疹感染的比例仍然很高，這反映出這些疫苗不能誘導(dǎo)麻疹抗體水平達(dá)到相當(dāng)于后來野生型麻疹感染所產(chǎn)生的水平(Griffin，麻疹病毒(Measles Virus)“現(xiàn)場(chǎng)病毒學(xué)(Field’s Virology)”，第3版。Lippincott-Raven，1401-1442，2001；Cutts等，J.Infectious Dis.，170S32-S41，1994)。結(jié)果，疫苗免疫的母親不大可能透過胎盤給她們的嬰兒提供足以在新生兒生命的最初幾個(gè)月中保護(hù)他們的被動(dòng)抗體。
在曾經(jīng)免疫過的青少年和青年中發(fā)生的急性麻疹感染指出另一問題。這些第二次疫苗接種失敗說明目前的疫苗誘導(dǎo)和維持足量和長(zhǎng)效抗病毒保護(hù)的能力有限(Atkinson等，United States.Annu.Rev.Med.，43451-463，1992)。最近，又揭示了另一潛在問題。過去15年中分離的野生型麻疹病毒的血凝素蛋白顯示與疫苗株的距離不斷增加(Bellini等，Emerging Infectious Diseases，429-35，1998)。這種“抗原性漂變”引起了大家的合理關(guān)注，這些疫苗可能不含有提供最優(yōu)保護(hù)所需的理想抗原組分。因此，需要改進(jìn)的免疫原性組合物。
從cDNA中回收重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒需要特殊的拯救系統(tǒng)，因?yàn)閷⒉《净蚪MRNA(vRNA)本身引入細(xì)胞不足以啟動(dòng)病毒復(fù)制。啟動(dòng)病毒復(fù)制循環(huán)還需要在細(xì)胞內(nèi)合成三種或多種病毒反式作用蛋白，包括病毒核衣殼和聚合酶復(fù)合體的諸組分。
嘗試了許多不同的拯救方法從cDNA中回收重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。這些報(bào)道的方法大多數(shù)包括共轉(zhuǎn)染步驟，其中用多個(gè)質(zhì)粒，包括病毒基因組cDNA克隆加編碼必需病毒蛋白如核衣殼蛋白(N或NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶亞基(L)的表達(dá)載體，來轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
已采用特別為非節(jié)段性負(fù)鏈病毒、T7RNA聚合酶的胞內(nèi)表達(dá)設(shè)計(jì)的拯救方法來促進(jìn)轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄。為此目的，已使用了T7RNA聚合酶，因?yàn)閕)用適當(dāng)設(shè)計(jì)的病毒cDNA質(zhì)粒，可迫使T7聚合酶在病毒基因組的精確5’端啟動(dòng)vRNA合成，ii)T7RNA聚合酶導(dǎo)致在這類病毒復(fù)制的場(chǎng)所—胞質(zhì)中高水平表達(dá)，和iii)RNA的胞質(zhì)合成消除了通過核剪切或聚腺苷酸化途徑加工vRNA的可能性。這些特征使設(shè)計(jì)以T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的拯救系統(tǒng)具有很大優(yōu)勢(shì)。
雖然在拯救系統(tǒng)中使用T7RNA聚合酶伴有重要優(yōu)勢(shì)，但也有不足之處。為實(shí)現(xiàn)T7RNA聚合酶的高水平胞內(nèi)表達(dá)，大多數(shù)救援系統(tǒng)還需要用表達(dá)噬菌體聚合酶基因(如MVA/T7)的重組牛痘病毒感染該轉(zhuǎn)染細(xì)胞(參見，例如，Pattnaik等，J.Virol.642948-2957，1990)。Lawson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481，1995)報(bào)道，通過采用這種通用拯救方法成功回收了水泡性口炎病毒(VSV)。類似地，Conzelmann于2000年3月7日提交美國專利號(hào)6,033,886報(bào)道，通過將RV cDNA基因組與編碼RV N、P和L蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入感染了重組牛痘病毒vTF7-3可表達(dá)T7RNA聚合酶的幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞中，從cDNA中成功回收了狂犬病病毒(RV)。
即使這些和其它成功報(bào)道涉及了基于牛痘的回收系統(tǒng)，但在病毒回收系統(tǒng)中使用重組牛痘病毒仍然伴有重要不足。具體說，這種回收方法需要從牛痘輔助病毒中純化游離的所需病毒。具體說，必須從受拯救的病毒中分離得到牛痘輔助病毒以實(shí)現(xiàn)回收。使這種回收復(fù)雜化，牛痘病毒實(shí)際上可干擾被拯救病毒的復(fù)制。對(duì)于像RV和VSV這樣復(fù)制到高滴度的病毒來說，這些因素的問題較小。然而，很多其他非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒生長(zhǎng)較慢，可能在基于牛痘的系統(tǒng)中難以回收，例如，呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(HPIVs)，3型牛副流感病毒(BPIV3)和麻疹病毒(MV)。由于牛痘病毒可在宿主細(xì)胞群中，甚至幾代后引起廣泛的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，基于牛痘的回收系統(tǒng)存在相關(guān)缺點(diǎn)。牛痘病毒引起的CPE可妨礙被拯救病毒所形成噬斑的檢測(cè)，也可通過降低細(xì)胞培養(yǎng)物支持復(fù)制的能力而減少被拯救病毒的產(chǎn)率。牛痘病毒誘導(dǎo)的CPE也可能通過限制轉(zhuǎn)染細(xì)胞保持活力的時(shí)間窗口而阻礙、或甚至排除對(duì)生長(zhǎng)緩慢的減毒病毒的拯救。最后，如果想要使被拯救的重組病毒成為制備免疫原性組合物或開發(fā)基因治療載體的種子貯液，殘余牛痘病毒感染是一個(gè)重要問題。
非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的另一種拯救系統(tǒng)采用特殊的組成性表達(dá)噬菌體聚合酶基因的“輔助”細(xì)胞系。據(jù)報(bào)道，示例性T7輔助細(xì)胞系有效規(guī)避了牛痘病毒系統(tǒng)的相關(guān)問題。Billeter等(國際公告號(hào)WO 97/06270，引入本文作為參考)報(bào)道的一個(gè)開發(fā)系統(tǒng)可從cDNA中回收感染性麻疹病毒(MV)。Billeter等的系統(tǒng)用組成性表達(dá)RNA聚合酶如T7RNA聚合酶的輔助細(xì)胞系取代了輔助病毒。該輔助細(xì)胞系還提供MV的N和P蛋白的組成性“基因組表達(dá)”。將含有操作性連接有表達(dá)控制序列的MV全部(+)鏈序列的cDNA質(zhì)粒引入此特殊修飾的細(xì)胞系。將編碼MV的L蛋白的質(zhì)粒與MVcDNA共轉(zhuǎn)染入輔助細(xì)胞系中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。
雖然據(jù)報(bào)道，此種替代的T7輔助細(xì)胞回收系統(tǒng)是MV回收的成功工具，但它也具有與上述牛痘輔助系統(tǒng)不同的缺點(diǎn)。最重要的是，Billeter等的系統(tǒng)用組成性表達(dá)T7RNA聚合酶，以及MV的N和P蛋白的特殊輔助細(xì)胞系取代輔助病毒，似乎并不適合拯救其它非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。而且，當(dāng)使用這種特殊的輔助細(xì)胞系時(shí)，必須為每個(gè)不同的待拯救病毒構(gòu)建一個(gè)新細(xì)胞系。
用于回收非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的另一種細(xì)胞系也具有在輔助細(xì)胞中僅組成性表達(dá)T7聚合酶的特征。因此，Buchholz等(J.Virol.73251-259，1999，引入本文作為參考)構(gòu)建了組成性表達(dá)T7RNA聚合酶的BHK-21細(xì)胞系。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是其細(xì)胞系較不特殊，因?yàn)樗膊唤M成性表達(dá)具體病毒的N、P或L蛋白，據(jù)報(bào)道，細(xì)胞系在100次連續(xù)傳代后，T7聚合酶的表達(dá)仍是穩(wěn)定的。
但是，所有輔助細(xì)胞系的類似缺點(diǎn)是它們難以構(gòu)建，并且這些細(xì)胞系對(duì)回收廣泛范圍的不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的用途有限。目前，僅開發(fā)了幾個(gè)高水平表達(dá)聚合酶并支持病毒拯救的T7輔助細(xì)胞系。經(jīng)驗(yàn)說明，可能難于分離得到滿足不同病毒和新形成毒株的具體需要的新T7細(xì)胞系。這大大限制了可用于拯救的T7細(xì)胞系的數(shù)量，并對(duì)產(chǎn)生許多非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的合格細(xì)胞系提出了嚴(yán)重問題。顯示特異性細(xì)胞嗜性不能生長(zhǎng)于任何可利用的T7輔助細(xì)胞系中的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒產(chǎn)生了相關(guān)問題。
雖然在回收和產(chǎn)生非節(jié)段性負(fù)鏈RNA減毒活病毒上已有很多進(jìn)展，但是本領(lǐng)域仍然明確需要其它工具和方法，以工程改造產(chǎn)生安全有效的免疫原性組合物來減輕這些病原體所引起的嚴(yán)重健康問題。該領(lǐng)域的其余挑戰(zhàn)需要采用基于cDNA的回收系統(tǒng)更有效地拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的其它工具。為有助于達(dá)到這些目的，必須擴(kuò)展從cDNA中回收非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的現(xiàn)有方法。在這方面，尤其需要開發(fā)回收和遺傳操縱非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法和組合物，該方法和組合物不需要采用重組牛痘病毒或經(jīng)修飾組成性表達(dá)T7RNA聚合酶的特殊細(xì)胞系。令人驚訝的是，本發(fā)明滿足了這些需求并具有其它目的和優(yōu)點(diǎn)，如下所述。
發(fā)明概述本發(fā)明采用不依賴于輔助病毒(如牛痘病毒)和不需要經(jīng)工程改造組成性表達(dá)RNA聚合酶的特殊輔助細(xì)胞系的組合物和方法，從克隆的cDNA中有效回收大量非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法包括將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，在宿主細(xì)胞中表達(dá)N蛋白、P蛋白和L蛋白，并由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶，然后從宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法。對(duì)這些實(shí)施方式而言，需要產(chǎn)生生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型或不能隨后拯救的缺陷型病毒，例如體外或體內(nèi)生長(zhǎng)或復(fù)制能力受限的病毒。在本發(fā)明的這些實(shí)施方式中，將編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的cDNA表達(dá)構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，在宿主細(xì)胞中表達(dá)N蛋白、P蛋白和L蛋白，并由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶。然后從宿主細(xì)胞中回收生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，用于免疫原性組合物或其它目的。生長(zhǎng)和復(fù)制缺陷型病毒和亞病毒顆粒將用作“載體”，如本文下面所詳述。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法包括將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，宿主細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)(1)RNA聚合酶，(2)N蛋白，(3)P蛋白，和(4)L蛋白，其中RNA聚合酶和N、P和L蛋白各自由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體表達(dá)；然后從宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
在另一實(shí)施方式中，產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，包括將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由病毒cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，然后從宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，包括將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由病毒cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物。在將一種或多種病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞后，對(duì)宿主細(xì)胞在足以提高重組病毒的回收的條件下進(jìn)行有效熱激。
在本發(fā)明的其它方面，產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，包括將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體，在足以共表達(dá)這些載體并產(chǎn)生重組病毒的條件下引入合適的宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由病毒cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物。然后將該宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，一般為單層擴(kuò)展細(xì)胞共培養(yǎng)，從共培養(yǎng)物中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
本發(fā)明中也提供用于產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的組合物。該組合物包含含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)由cDNA合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；和在宿主細(xì)胞中編碼和指導(dǎo)(1)RNA聚合酶，(2)N蛋白，(3)P蛋白，和(4)L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體，以及在所述宿主細(xì)胞中編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的瞬時(shí)表達(dá)載體。
在另一實(shí)施方式中.，如上所述提供的組合物中，非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒?？梢愿鞣N制備性或活性制劑和混合物方式提供本發(fā)明的這些和相關(guān)組合物。例如，可提供的上述組合物中，將病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體組合成共轉(zhuǎn)染混合物。或者，可將上述諸組分在共轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)物中組合。
本發(fā)明的其它實(shí)施方式涉及根據(jù)上述方法產(chǎn)生的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，以及含有這些病毒的免疫原性組合物，在哺乳動(dòng)物對(duì)象中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法包括將所述病毒和免疫原性組合物給予該對(duì)象。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1描述了用質(zhì)粒供給T7而不是MVA-T7來拯救RSV。
圖2A-2C提供了瞬時(shí)T7聚合酶表達(dá)載體，質(zhì)粒pCl-Neo-Bcl-T7的示例性序列(SEQ ID NO1)。ATG是T7 pol起始密碼子。T7 pol的第二個(gè)密碼子是從AAC變化為gAC，以優(yōu)化翻譯起始序列(Kozak序列)。還加入序列GCCACC，以優(yōu)化翻譯起始序列。在加入T7RNA聚合酶編碼序列之前，將該序列的小寫部分get agcctcgagtgatcagaatt c插入pCI-Neo載體中取代T7啟動(dòng)子。該序列包括NheI、XhoI、Bell和EcoRI限制性位點(diǎn)。
圖3A和3B(圖A-C)說明可將異源負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的各種突變摻入本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中(在本文中摻入HPIV1構(gòu)建物中)，以產(chǎn)生減毒或其它所需的表型改變。
發(fā)明詳述本發(fā)明采用不依賴于輔助病毒(如牛痘病毒)和不需要經(jīng)工程改造組成性表達(dá)RNA聚合酶的特殊輔助細(xì)胞系的組合物和方法，從克隆的cDNA中有效回收大量非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了有效拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法和組合物，即將瞬時(shí)表達(dá)載體摻入能夠支持拯救所述病毒的宿主細(xì)胞中以瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶。在此種瞬時(shí)(表達(dá))聚合酶載體拯救系統(tǒng)中，將編碼，如T7RNA聚合酶的表達(dá)載體與病毒基因組或反義基因組cDNA協(xié)同引入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)支持病毒拯救所必需的病毒支持蛋白(如N、P和L蛋白)。圖1描述說明了本發(fā)明的拯救系統(tǒng)，如采用質(zhì)粒提供T7來拯救RSV。
因此，在本發(fā)明的病毒回收方法和組合物中，通過在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使宿主細(xì)胞程序化地表達(dá)RNA聚合酶，從而支持在非牛痘病毒系統(tǒng)中和在適于拯救不同種類和類型的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的細(xì)胞中進(jìn)行病毒回收。
本文所述方法和組合物的應(yīng)用和多能性(例如，與基于牛痘和基于輔助細(xì)胞的回收系統(tǒng)相比)克服了這些預(yù)計(jì)障礙，如瞬時(shí)載體表達(dá)系統(tǒng)常伴有的轉(zhuǎn)染效率低和表達(dá)時(shí)間短。與T7輔助細(xì)胞系統(tǒng)不同，當(dāng)所有細(xì)胞都組成性表達(dá)T7聚合酶時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)染效率通常低至約10-20％。此外，預(yù)計(jì)瞬時(shí)表達(dá)，如T7聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)會(huì)在約72小時(shí)的有限時(shí)間內(nèi)衰減和停止。據(jù)此，本文公開的多能系統(tǒng)采用瞬時(shí)RNA聚合酶共轉(zhuǎn)染有效地拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，包括許多不同的生長(zhǎng)緩慢和減毒種類和毒株，這是出人意料的。
用本發(fā)明的瞬時(shí)RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)拯救負(fù)鏈RNA病毒與現(xiàn)有系統(tǒng)相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。具體說，不需要用重組牛痘病毒感染細(xì)胞來提供RNA聚合酶，從而消除了CPE和其他因素對(duì)病毒回收效率和保真度以及開發(fā)有效免疫原性組合物的不良影響。一個(gè)相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)是開始拯救后，在轉(zhuǎn)染期間轉(zhuǎn)染細(xì)胞保持活力和支持病毒拯救的時(shí)間較長(zhǎng)。這有助于促進(jìn)拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中常見的生長(zhǎng)緩慢的病毒種和毒株。此外，本拯救系統(tǒng)不需要從所需重組病毒中純化去除重組牛痘病毒。對(duì)開發(fā)免疫原性組合物和基因治療載體而言，也消除了對(duì)拯救病毒制備物中重組牛痘病毒污染的擔(dān)心。最后，本方法和組合物無需開發(fā)特殊的輔助細(xì)胞系，任何可以被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系都可用于回收多種不同的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
可通過實(shí)施本發(fā)明的方法和組合物從cDNA中成功回收多種不同的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。根據(jù)1993年國際病毒分類學(xué)委員會(huì)修訂的重新分類，設(shè)立了稱為單分子負(fù)鏈RNA病毒目的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒目。該目包括三個(gè)具有負(fù)極性(負(fù)義)的單鏈、非節(jié)段性RNA基因組的有包膜病毒科。這些非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒科是副粘病毒科，彈狀病毒科和線狀病毒科。副粘病毒科進(jìn)一步分為兩個(gè)亞科副粘病毒亞科和肺病毒亞科。副粘病毒亞科包括三個(gè)屬呼吸道病毒屬(Respirovirus)(以前稱為副粘病毒)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)和麻疹病毒屬(Morbillivirus)。肺病毒亞科包括肺病毒屬。表1表示單分子負(fù)鏈RNA病毒的目前的分類學(xué)地位，以及各屬的非限制性例子，它們代表了可經(jīng)本發(fā)明方法和組合物拯救的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的種和屬。
表1單分子負(fù)鏈RNA病毒目的非節(jié)段性負(fù)義、單鏈RNA病毒分類副粘病毒科副粘病毒亞科呼吸道病毒屬仙臺(tái)病毒(1型小鼠副流感病毒)1和3型人副流感病毒(PIV)3型牛副流感病毒(BPV)腮腺炎病毒屬猴病毒5(SV)(2型犬副流感病毒)腮腺炎病毒新城疫病毒(NDV)(禽副粘病毒1)2、4a和4b型人副流感病毒麻疹病毒屬麻疹病毒(MV)海豚麻疹病毒犬瘟熱病毒(CDV)小反芻獸疫病毒海豹疫熱病毒牛瘟病毒未分類亨得拉病毒立百病毒肺病毒亞科肺病毒屬人呼吸道合胞病毒(RSV)牛呼吸道合胞病毒小鼠肺炎病毒肺炎后病毒(metapneumovirus)屬人肺炎后病毒(human metapneumovirus)禽肺炎病毒(以前稱為土耳其鼻氣管炎病毒)彈狀病毒科狂犬病病毒屬狂犬病病毒水泡病毒屬水泡性口炎病毒短時(shí)熱病毒屬牛短時(shí)熱病毒線狀病毒科絲狀病毒屬馬伯格病毒單分子負(fù)鏈RNA病毒成員的現(xiàn)行分類方案是根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)、病毒基因組構(gòu)成、生物學(xué)活性以及病毒基因和基因產(chǎn)物的序列相關(guān)性分類。副粘病毒亞科的有包膜病毒的形態(tài)學(xué)區(qū)別特征是核衣殼的大小和形狀。相關(guān)的生物學(xué)特征是1)屬成員之間的抗原交叉反應(yīng)性，和2)呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬有神經(jīng)氨酸酶活性，麻疹病毒屬?zèng)]有該活性。此外，要考慮P基因編碼可能不同，因?yàn)槿傺撞《緦儆幸粋€(gè)額外的基因(SH)。
可通過形態(tài)學(xué)特征將肺炎病毒與副粘病毒亞科區(qū)別開來，因?yàn)榉窝撞《竞歇M窄的核衣殼。此外，肺炎病毒與副粘病毒亞科不同的主要區(qū)別在于編碼蛋白的順反子數(shù)量不同(肺炎病毒有10個(gè)而副粘病毒亞科有6個(gè))和有一種連接蛋白(G)。雖然副粘病毒和肺炎病毒的六個(gè)蛋白似乎在功能上相對(duì)應(yīng)(N、P、M、G/H/HN、F和L)，但只有后兩個(gè)蛋白在兩個(gè)亞科之間顯示出顯著的序列相關(guān)性。幾種肺炎病毒蛋白，即非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，小疏水蛋白SH和第二蛋白M2在大多數(shù)副粘病毒中缺少相似物。一些副粘病毒蛋白，即C和V，在肺炎病毒中缺少相似物。然而，肺炎病毒和副粘病毒的基本基因組構(gòu)成是相同的，彈狀病毒和絲狀病毒也是如此。
本發(fā)明回收非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的總的方法總結(jié)如下。將從所需病毒基因組克隆的DNA等價(jià)物(正鏈，信使正義)置于合適的DNA依賴性RNA聚合酶啟動(dòng)子(如T7、T3或SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子)和插入合適的轉(zhuǎn)錄載體(如可增殖的細(xì)菌質(zhì)粒)中的自身切割核酶序列(如丁型肝炎核酶)之間。該轉(zhuǎn)錄載體提供容易操縱的DNA模板，RNA聚合酶(例如，T7RNA聚合酶)可從該模板忠實(shí)地轉(zhuǎn)錄出具有準(zhǔn)確或幾乎準(zhǔn)確的5’和3’端的病毒反義基因組(或基因組)的單鏈RNA拷貝?；蚪M的病毒DNA拷貝的方向以及側(cè)翼啟動(dòng)子和核酶序列決定反義基因組或基因組RNA等價(jià)物是否被轉(zhuǎn)錄。
根據(jù)本發(fā)明拯救新病毒后代還需要病毒特異性反式作用支持蛋白把裸露的單鏈病毒反義基因組或基因組RNA轉(zhuǎn)錄物衣殼化成為功能性核衣殼模板。這些蛋白通常包括病毒核衣殼(N)蛋白、聚合酶相關(guān)磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。不同病毒科或?qū)僦?，這些蛋白的命名可能略有不同。例如，在彈狀病毒科中，磷蛋白可稱為“P”或“NS”。在呼吸道病毒和腮腺炎病毒屬中，核衣殼蛋白稱為“NP”。本文所用術(shù)語“N蛋白”和“N基因”適合指N或NP核衣殼蛋白和基因，術(shù)語“P蛋白”和“P基因”適合指P或NS磷蛋白和基因。選作拯救的某些病毒可能需要其它蛋白。一般說，雖然不排他，但拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒還需要在攜帶有病毒cDNA的宿主細(xì)胞中表達(dá)RNA聚合酶，以驅(qū)動(dòng)含cDNA的轉(zhuǎn)錄載體和編碼支持蛋白的載體的轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明中，從cDNA中回收非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的新拯救方法，包括將編碼目標(biāo)病毒的基因組或反義基因組的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，并共同引入編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的瞬時(shí)聚合酶表達(dá)載體。本文所用的RNA聚合酶包括但不限于T7、T3或SP6噬菌體聚合酶。宿主細(xì)胞也在共同引入病毒cDNA和瞬時(shí)聚合酶表達(dá)載體之前、期間或之后在宿主細(xì)胞中表達(dá)N、P和L支持蛋白，這是產(chǎn)生復(fù)制性、感染性病毒或亞病毒顆粒所必需的。
一般來說，用編碼或指導(dǎo)支持蛋白表達(dá)的一種或多種附加表達(dá)載體將病毒cDNA和瞬時(shí)聚合酶表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。支持蛋白可能是待拯救病毒的野生型或突變蛋白，或可選自異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒相應(yīng)的支持蛋白。在另一實(shí)施方式中，可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)其它病毒蛋白，如聚合酶延伸因子(如RSV的M2-1)或能提高回收或在所述方法和組合物內(nèi)提供其它所需結(jié)果的其它病毒蛋白。在其他實(shí)施方式中，可通過在宿主細(xì)胞中組成性表達(dá)支持蛋白或通過用編碼支持蛋白的輔助病毒共感染宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種支持蛋白。
在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，病毒cDNA表達(dá)載體含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物。將該病毒cDNA載體引入瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的宿主細(xì)胞?？蓮囊环N或多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體，表達(dá)各RNA聚合酶和N、P和L蛋白。經(jīng)常由各個(gè)表達(dá)載體，通常是瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)各RNA聚合酶和N、P和L蛋白。經(jīng)過足夠時(shí)間后并在合適的條件下，從宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
為從cDNA表達(dá)的基因組或反義基因組產(chǎn)生感染性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，將該基因組或反義基因組與產(chǎn)生能夠進(jìn)行RNA復(fù)制的核衣殼，并賦予后代能夠進(jìn)行RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的核衣殼所必需的那些病毒蛋白共表達(dá)?；蚪M核衣殼的轉(zhuǎn)錄提供了其它病毒蛋白并啟動(dòng)了產(chǎn)毒性感染?；蛘撸脖磉_(dá)可提供產(chǎn)毒性感染所需的其它病毒蛋白。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用一種或多種輔助病毒提供編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄、復(fù)制病毒核衣殼所必需的蛋白的互補(bǔ)序列。這些輔助病毒可以是野生型或突變體。在某些實(shí)施方式中，可從表型上將輔助病毒與重組病毒cDNA編碼的病毒區(qū)分。例如，可能需要提供與輔助病毒而非重組病毒cDNA編碼的病毒發(fā)生免疫應(yīng)答的單克隆抗體。這種抗體可以是中和抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體可用于親和層析，來分離重組病毒與輔助病毒。為幫助獲得這種抗體，可在病毒cDNA中引入突變，以提供輔助病毒的，如糖蛋白基因的抗原多樣性。
可利用，例如以集合的完整基因組或反義基因組提供的組裝克隆的cDNA節(jié)段，通過病毒mRNA或基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄拷貝的聚合酶鏈反應(yīng)等(PCR；見美國專利號(hào)4,683,195和4,683,202中描述，PCR方法方法和應(yīng)用指南(PCR protocolsA Guideto Methods and Applications，Innis等編，Academic Press，San Diego，1990)構(gòu)建用于本發(fā)明的重組病毒基因組或反義基因組。例如，可產(chǎn)生包含含有反義基因組的左手端、跨越合適的啟動(dòng)子(如T7、T3或SP6RNA聚合酶啟動(dòng)子)和在合適的表達(dá)載體(如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或DNA病毒載體)中組裝的cDNA的第一構(gòu)建物?？捎谜T變和/或插入合成的含有經(jīng)設(shè)計(jì)有助于組裝的獨(dú)特限制性位點(diǎn)的多聚接頭修飾該載體。如需要反義基因組質(zhì)粒的右手端可含有其它序列，如側(cè)翼核酶和一個(gè)或串聯(lián)T7轉(zhuǎn)錄終止子。該核酶可以是錘頭型，它會(huì)產(chǎn)生含有一個(gè)非病毒核苷酸的3’端，或者可以是任何其它合適的核酶，如丁型肝炎病毒的核酶(Perrotta等，Nature 350434-436，1991)，它會(huì)產(chǎn)生沒有非病毒核苷酸的3’端。
構(gòu)建編碼病毒基因組或反義基因組的cDNA的替代方法包括用改進(jìn)的PCR條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(例如，Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994中所述，引入本文作為參考)，將亞基cDNA組件的數(shù)目降低到少至一或兩個(gè)。在其它實(shí)施方式中，可使用不同啟動(dòng)子(如T3或SPQ)。對(duì)于增殖可用不同DNA載體(如粘粒)來更好地容納大尺寸的基因組或反義基因組。
非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的“感染性克隆”或“感染性cDNA”指合成的cDNA或其產(chǎn)物，以及能夠直接摻入可轉(zhuǎn)錄成基因組或反義基因組病毒RNA的感染性病毒粒子的RNA，其中基因組或反義基因組病毒RNA能夠用作產(chǎn)生感染性病毒或亞病毒顆?；蚪M的模板。如上所述，可通過各種常規(guī)技術(shù)(如定位誘變)將確定的突變引入感染性病毒克隆的基因組或反義基因組的cDNA拷貝。如本文所述用基因組或反義基因組cDNA亞片段組裝完整的基因組或反義基因組cDNA具有以下優(yōu)點(diǎn)可分別操作各區(qū)域，其中小的cDNA構(gòu)建物比大cDNA構(gòu)建物更易于操作，然后容易地組裝成完整的cDNA。
構(gòu)建或修飾本發(fā)明的某些重組病毒，以限制該重組病毒的生長(zhǎng)能力、復(fù)制活性或感染性。這些生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒和亞病毒顆粒用作載體和免疫原，它們不具給予宿主完全感染性(即具有接近野生型病毒的生長(zhǎng)和/或復(fù)制活性水平)病毒時(shí)的某些風(fēng)險(xiǎn)。復(fù)制缺陷型指其在宿主細(xì)胞或哺乳動(dòng)物對(duì)象中生長(zhǎng)或復(fù)制的能力有限，或在細(xì)胞中或細(xì)胞間傳染和/或增殖的能力有缺陷的病毒或亞病毒顆粒。復(fù)制缺陷型病毒的復(fù)制能力常常僅限于在宿主細(xì)胞或?qū)ο笾袕?fù)制一輪或兩輪。常常將生長(zhǎng)和復(fù)制缺陷型病毒和亞病毒顆粒用作“載體”，見本文以下的詳述。
因此，為產(chǎn)生生長(zhǎng)和/或復(fù)制缺陷型、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒提供各種方法和組合物。在更詳細(xì)的實(shí)施方式中，與相應(yīng)野生型或親代病毒的生長(zhǎng)、復(fù)制和/或感染性相比，生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒的生長(zhǎng)、復(fù)制和/或感染性特征受到很大損傷。本文中，與野生型或親代病毒的生長(zhǎng)、復(fù)制和/或感染水平相比，其生長(zhǎng)、復(fù)制和/或感染性在體外和/或體內(nèi)受到的損傷至少約10-20％、20-50％、50-75％和高達(dá)95％或更高。
一般用下面詳述的熱激(蛋白)/T7-質(zhì)粒聯(lián)合拯救系統(tǒng)拯救具有不同程度的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷的病毒。示例性毒株包括摻入了以下所述修飾的VSV高減毒株(如C-末端G蛋白截短或易位基因)(參見，例如，Johnson等，J.Virol.715060-5078，1997，Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311359-11365，1996；Schnell等，Cell90849-857，1997；Roberts等，J.Virol.724704-4711，1998；和Rose等，Cell106539-549，2001，各自引入本文作為參考)。一些目標(biāo)病毒包含僅部分受損的缺陷，例如其中某些病毒在沒有遺傳補(bǔ)充時(shí)仍可增殖?？赏ㄟ^在編碼、非編碼和調(diào)節(jié)序列中引入氨基酸取代、核苷酸取代、部分或完全的基因缺失或敲除等實(shí)現(xiàn)本文所述的這種缺陷，例如在RSV、PIV和VSV中描述的特殊ts或ca表型。
當(dāng)重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒在細(xì)胞系中增殖時(shí)，該病毒常常具有不導(dǎo)致嚴(yán)重生長(zhǎng)損傷但在天然宿主中復(fù)制大受限制的部分或全部基因缺失或基因“敲除”。本文中的示例性突變體包括SH、NS1和NS2基因或蛋白的一種或多種部分或全部缺失或敲除的RSV。在其它實(shí)施方式中，通過引入損傷基因功能但不阻斷復(fù)制的突變或其它改變來構(gòu)建生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒。例如，上述參考文獻(xiàn)描述了有用的具有C末端缺失而影響G蛋白胞質(zhì)尾的VSV候選病毒。例如，通過將異源抗原決定簇?fù)饺胫亟M載體基因組或反義基因組中將這些和同樣的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒用作“載體”。在具體實(shí)施例中，將MV或HIV糖蛋白、糖蛋白結(jié)構(gòu)域或一種或多種抗原決定簇?fù)饺隫SV載體或“骨架”中。
其它生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒具有的堿基取代或小缺失對(duì)其在細(xì)胞系中生長(zhǎng)不需要但能影響其對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的致病性的蛋白表達(dá)有抑制作用。此方面的示例性構(gòu)建物包括C、D和/或V ORF中一種或多種全部或部分切除或缺失的HPIV(參見，例如，Durbin等，Virology 261319-30，1999，引入本文作為參考)，和V蛋白全部或部分缺失或敲除(Schneider等，Virology 227314-22，1997，引入本文作為參考)或突變(參見，例如，Parks于2003年12月16日提交的美國專利號(hào)6,664,066，引入本文作為參考)的MV。
其它生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒具有能切除(敲除)或降低基因表達(dá)的部分或全部基因缺失或其它類型的修飾，其中所述缺陷是部分損傷，但不完全阻斷在細(xì)胞系中的復(fù)制。本文中有用候選物的例子包括缺失或敲除了基質(zhì)蛋白的MV，Cathomen等，EMBOJ.173899-908，1998(引入本文作為參考)，和缺失和或敲除NS1、NS2、M2-2和/或SH中一種或多種的RSV(Jin等，Virology 273210-8，2000，引入本文作為參考)。
在其它實(shí)施方式中，重排了生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒或位置“改組”了導(dǎo)致生長(zhǎng)受損但不阻止復(fù)制的基因。本文引用的參考文獻(xiàn)中描述了各種所述位置改變的RSV突變體。本文中描述了VSV的這類其它示例性重組物(參見，例如，Wertz等于2003年7月22日發(fā)表的美國專利號(hào)6,596,529；Ball等于2000年10月24日發(fā)表的美國專利號(hào)6,136,585；和Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 953501-6，1998，各自引入本文作為參考)。
在其它實(shí)施方式中，生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒具有損害其生長(zhǎng)的部分或全部基因取代。在這個(gè)方面，可以用感染另一物種的相關(guān)病毒的基因取代一種或多種病毒基因，如表達(dá)HPIV或RSV抗原決定簇的各種宿主范圍受限的人-牛PIV(HBPIV)(Skiadopoulos等，J.Virol.771141-8，2003；Bailly等，J.Virol.743188-95，2000，Schmidt等，J.Virol.754594-603，2001，各自引入本文作為參考)和用另一RSV或VSV的F和/或G基因取代其F和/或G基因的RSV(參見，例如Oomens等，J.Virol.773785-98，2003，引入本文作為參考)。
在本發(fā)明的其它詳述實(shí)施方式中，構(gòu)建生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型病毒使其具有必須用補(bǔ)充細(xì)胞系、輔助病毒、轉(zhuǎn)染或提供所缺失功能的一些其它方式來補(bǔ)充的缺陷。示例性構(gòu)建物包括其G蛋白表達(dá)降低或消除的VSV。通過轉(zhuǎn)染或利用一些類型的輔助病毒系統(tǒng)(‘假型’)來提供缺失的G蛋白表達(dá)(參見，例如，Lefkowitz等，Virology 178373-83，1990，引入本文作為參考)?；蛘撸醚a(bǔ)充細(xì)胞系(參見，例如，Schnell等，Cell 90849-57，1997，引入本文作為參考)或用G蛋白融合物(例如，其中VSV G蛋白包括融合于異源序列(如麻疹病毒的F或H基因)的VSV跨膜序列和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)(參見，例如，Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311359-11365，1996；Schnell等，Cell 90849-857，1997Roberts等，J.Virol.724704-4711，1998；和Rose等，Cell 106539-549，2001，各自引入本文作為參考)來提供缺失的G功能。在本文描述的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，通過第二步將病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了編碼功能性G蛋白的質(zhì)粒的細(xì)胞共培養(yǎng)，回收G功能受損的重組VSV。在其它示例性候選物中，用一種雜交G蛋白代替VSV G蛋白，該雜交G蛋白構(gòu)成了將病毒靶向特定細(xì)胞，如CD4+細(xì)胞的受體(Johnson等，J.Virol.715060-5078，1997，引入本文作為參考)。
通過前導(dǎo)區(qū)或尾隨區(qū)的修飾構(gòu)建部分生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型的其它病毒，例如用見于前導(dǎo)區(qū)序列中的弱啟動(dòng)子的一個(gè)拷貝取代尾隨區(qū)(Finke等，J.Virol.733818-25，1999，引入本文作為參考)。
為易于制備，可將N、P、L和其它所需病毒蛋白組裝到一種或多種單獨(dú)載體中。很多合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，可用于摻入和指導(dǎo)編碼RNA聚合酶和支持蛋白的多核苷酸表達(dá)，包括例如質(zhì)粒、粘粒或噬菌體載體、缺陷型病毒載體、所謂“復(fù)制子”(例如辛德畢斯或委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒復(fù)制子)和其它用于指導(dǎo)瞬時(shí)和/或組成性表達(dá)的載體。與聚合酶和/或支持載體操作性整合的瞬時(shí)表達(dá)控制元件指導(dǎo)RNA聚合酶和(當(dāng)可應(yīng)用時(shí))N、P和L蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)控制元件是RNA聚合酶II調(diào)節(jié)區(qū)，如人巨細(xì)胞病毒[hCMV]的立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(參見，例如，美國專利5,168,062，引入本文作為參考)。
可通過本領(lǐng)域已知的任何各種方法，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、機(jī)械插入、轉(zhuǎn)導(dǎo)等，將編碼病毒cDNA、瞬時(shí)表達(dá)的RNA聚合酶以及N、P和L蛋白的載體引入合適的宿主細(xì)胞。在某些示例性實(shí)施方式中，通過磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro等，Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham等，Virology52456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)，DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等編，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)或陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，F(xiàn)ocus 1573-79，1993)將所述載體引入培養(yǎng)的細(xì)胞中。在另一實(shí)施方式中，加入轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑以提高細(xì)胞對(duì)DNA的攝入。很多這些試劑是本領(lǐng)域已知的。LIPOFECTACE_(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和EFFECTENE_(Qiagen，Valencia，CA)是常見的例子。LIPOFECTACE_和EFFECTING_二者也是。這些試劑是包裹DNA并增強(qiáng)細(xì)胞的攝入DNA的陽離子脂質(zhì)。LIPOFECTACE_可形成包圍DNA的脂質(zhì)體而EFFECTINE_可包被DNA但不形成脂質(zhì)體。另一種促進(jìn)DNA攝入的商業(yè)試劑是LIPOFECTAMINE-2000_(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
用于本發(fā)明的合適的宿主細(xì)胞能夠支持所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的產(chǎn)毒性感染，并允許支持病毒產(chǎn)生所必需的載體及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)。這種宿主細(xì)胞可選自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。合適的細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞如Sf9和Sf21，具有合適啟動(dòng)子的細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，和酵母細(xì)胞如釀酒酵母。宿主細(xì)胞一般選自脊椎動(dòng)物，如靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞。由于本發(fā)明所用的很多RNA病毒是人類病原體，所以在這種情況下常用靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。例如，麻疹病毒(MV)主要限于感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞。也有例外，如犬瘟熱病毒和感染非人哺乳動(dòng)物的其它麻疹病毒。對(duì)增殖病毒而言，一些真核細(xì)胞系比其它細(xì)胞系運(yùn)作得更好，對(duì)某些病毒一些細(xì)胞系根本不運(yùn)作。一般采用產(chǎn)生可檢測(cè)細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞系，以便可以容易地檢測(cè)到拯救的活病毒。宿主細(xì)胞常常衍生自人細(xì)胞，如人胚腎(HEK)細(xì)胞。Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)，以及很多其它類型的細(xì)胞也可用作宿主細(xì)胞。就麻疹和可能還有其它病毒而言，將其轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)，因?yàn)檫@類病毒在Vero細(xì)胞上快速擴(kuò)散而產(chǎn)生容易檢測(cè)的噬斑。下面是其它合適的宿主細(xì)胞的例子(1)人雙倍體原代細(xì)胞系如WI-38和MRC-5細(xì)胞；(2)猴雙倍體細(xì)胞系如Cos、胎恒河猴肺(FRhL)細(xì)胞；(3)準(zhǔn)原代連續(xù)細(xì)胞系如AGMK-非洲綠猴腎細(xì)胞；(4)人293細(xì)胞(合格的)和(5)嚙齒類(如CHO、BHK)、犬如，Madin-Darby犬腎(MDCK)和原代雞胚成纖維細(xì)胞。本發(fā)明方法和組合物所用的示例性具體細(xì)胞系包括HEp-2、HeLa、HEK(如HEK293)、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
在本文提供的方法和組合物中，將RNA聚合酶載體、病毒cDNA克隆和支持載體(如編碼N、P和L的質(zhì)粒)同時(shí)協(xié)同引入宿主細(xì)胞。例如，可將所有所述DNA組合到一個(gè)DNA轉(zhuǎn)染(如磷酸鈣轉(zhuǎn)染)混合物中，同時(shí)加入宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中實(shí)現(xiàn)協(xié)同轉(zhuǎn)染。在另一實(shí)施方式中，可對(duì)所述聚合酶和支持載體及病毒cDNA載體的任何兩種或多種分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。一般說，在有效的共轉(zhuǎn)染步驟中以接近的時(shí)間順序分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染而協(xié)同引入聚合酶和支持載體及病毒cDNA載體。在一個(gè)這種協(xié)同轉(zhuǎn)染方法中，將病毒cDNA和/或N、P和L支持質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)染RNA聚合酶質(zhì)粒。在其它實(shí)施方式中，在將RNA聚合酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的同時(shí)或之后，但在RNA聚合酶在宿主細(xì)胞中開始實(shí)質(zhì)性表達(dá)之前(例如，在T7聚合酶累積到可檢測(cè)水平之前，或在T7水平累積到足以激活T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒表達(dá)之前)將病毒cDNA和/或N、P、L支持質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的其它詳細(xì)方面，產(chǎn)生感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法包括額外熱激處理宿主細(xì)胞，以提高重組病毒的回收率。將一種或多種病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞后，使該宿主細(xì)胞接觸有效熱激刺激而提高重組病毒的回收率。
在這樣的一種方法中，使宿主細(xì)胞暴露于有效熱激溫度，暴露時(shí)間足以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的熱激，進(jìn)而促使病毒回收增加。有效的熱激溫度高于本領(lǐng)域所認(rèn)為進(jìn)行病毒拯救可接受的、推薦的或優(yōu)化的溫度。在許多情況下，有效熱激溫度高于37℃。當(dāng)在有效熱激溫度下實(shí)施本發(fā)明改良的拯救方法時(shí)，導(dǎo)致所需重組病毒的回收率比不提高溫度進(jìn)行拯救時(shí)重組病毒的回收率水平提高。有效熱激溫度和暴露時(shí)間因所用拯救系統(tǒng)而不同。這種溫度和時(shí)間的不同可能是由于所選病毒或宿主細(xì)胞類型的不同而異。
雖然溫度可能不同，但可用具體重組病毒進(jìn)行幾次試驗(yàn)性拯救程序，并測(cè)定所需重組病毒的回收百分?jǐn)?shù)隨溫度和暴露時(shí)間不同而變化，而容易地確定有效熱激溫度。確定的是，進(jìn)行拯救的任何溫度范圍的上限是轉(zhuǎn)染組分受到破壞，或轉(zhuǎn)染組分的功能在轉(zhuǎn)染中缺失或消失的溫度。用于本發(fā)明這個(gè)方面的示例性有效熱激溫度范圍是約37℃至約50℃，約38℃至約50℃，約39℃至約49℃，約39℃至約48℃，約40℃至約47℃，約41℃至約47℃，約41℃至約46℃。所選的有效熱激溫度范圍常用約42℃至約46℃。在更具體的實(shí)施方式中，采用約43℃、44℃、45℃或46℃的有效熱激溫度。
在進(jìn)行確定所選有效熱激溫度或溫度范圍的測(cè)試中，也可選擇進(jìn)行熱激程序的有效時(shí)間。施加有效熱激溫度的足夠時(shí)間是所需重組病毒的回收率比在上述不提高溫度進(jìn)行拯救時(shí)重組病毒回收水平有可檢測(cè)增加的時(shí)間。有效熱激時(shí)間可因拯救系統(tǒng)，包括所選病毒和宿主細(xì)胞而不同。雖然時(shí)間不同，但用具體重組病毒進(jìn)行幾次試驗(yàn)性拯救程序，并測(cè)定所需重組病毒的回收率或百分?jǐn)?shù)隨溫度和時(shí)間不同而變化，而容易地確定施加有效熱激溫度的時(shí)間量。進(jìn)行拯救所用的任何時(shí)間變化范圍的上限是轉(zhuǎn)染組分受到破壞，或轉(zhuǎn)染組分的功能在轉(zhuǎn)染中損失或消失的時(shí)間量。熱激程序的時(shí)間可不同，從幾分鐘至幾小時(shí)，只要獲得所需重組病毒回收率增加。用于本發(fā)明這個(gè)方面的示例性有效熱激時(shí)間用分鐘表示是約5至約300分鐘，約5至約200分鐘，約15至約300，約15至約240，約20至約200，約20至約150。有效熱激時(shí)間常用約30分鐘至約150分鐘。
可用許多方法確定通過使宿主細(xì)胞暴露于有效熱激而提高的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒回收水平。例如，氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)道基因可用于監(jiān)測(cè)已知方法對(duì)重組病毒的拯救。該報(bào)道基因的相應(yīng)活性確定了基線水平和重組病毒表達(dá)水平的提高。其它方法包括檢測(cè)所獲重組病毒噬斑數(shù)量和通過測(cè)序確認(rèn)拯救病毒的產(chǎn)生。一種測(cè)定回收率提高的示例性方法包括制備許多相同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)物，使它們暴露于不同的熱激條件(不同時(shí)間和溫度)下，然后將這些培養(yǎng)物的回收率值與對(duì)照細(xì)胞(如轉(zhuǎn)染并維持在恒溫37℃下的細(xì)胞)的相應(yīng)值作比較。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含約75％鋪滿的單層Vero細(xì)胞(或選用于測(cè)定重組病毒噬斑形成的細(xì)胞類型)的10厘米板中，繼續(xù)培養(yǎng)直到噬斑可見。然后，計(jì)數(shù)噬斑并與對(duì)照細(xì)胞獲得的值相比。優(yōu)化熱激條件應(yīng)該使噬斑的數(shù)量最大。
根據(jù)本發(fā)明的這些實(shí)施方式，病毒回收率的提高至少約為10％或25％，常常至少約40％。在某些實(shí)施方式中，由于暴露于有效熱激的重組病毒回收的增加比不用熱激法所見的或回收的重組病毒量增加了2倍、5倍、高達(dá)10倍和更高。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，對(duì)其中導(dǎo)入了病毒cDNA和瞬時(shí)RNA聚合酶載體(和任選的編碼必需的支持蛋白的一種或多種載體)的宿主細(xì)胞進(jìn)行“噬斑擴(kuò)增”步驟。一般在足以允許病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)的一段時(shí)間后(如轉(zhuǎn)染后)，進(jìn)行該步驟。為實(shí)現(xiàn)噬斑擴(kuò)增，將支持病毒進(jìn)一步擴(kuò)增能力常常受損的宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)。此共培養(yǎng)步驟可使受拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中，這更適于該病毒的大量擴(kuò)增。一般將宿主細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一層或多層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上。例如，可使宿主細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)散到單層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上，然后，重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒將感染該噬斑擴(kuò)增細(xì)胞并在其中進(jìn)一步擴(kuò)增。在另一實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞與噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的細(xì)胞類型相同或不同。
本發(fā)明改進(jìn)的噬斑擴(kuò)增方法和組合物提供了產(chǎn)生重組的單分子負(fù)鏈RNA病毒的改進(jìn)的拯救方法。該方法一般包括，將含有編碼單分子負(fù)鏈RNA病毒目的非節(jié)段性負(fù)義單鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的分離的核酸分子的轉(zhuǎn)錄載體，和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄載體，與至少一種包含編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必須的反式作用蛋白的至少一種分離的核酸分子的表達(dá)載體一起，在足以使所述載體共表達(dá)和產(chǎn)生重組病毒的條件下引入宿主細(xì)胞。然后將該宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上。
為了實(shí)現(xiàn)噬斑擴(kuò)增，一般將受轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)容器中。本領(lǐng)域已知的各種培養(yǎng)板或容器都可用于噬斑擴(kuò)增步驟。在某些實(shí)施方式中，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到至少約50％鋪滿的單層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上?；蛘?，噬斑擴(kuò)增細(xì)胞至少約60％鋪滿，或甚至至少約75％鋪滿。在某些實(shí)施方式中，噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的表面積大于用于準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)染病毒的表面積。如需要可將表面積比例提高到2∶1至100∶1。常常需要至少提高到10∶1的表面積比例。
根據(jù)天然或重組病毒在何種細(xì)胞中成功生長(zhǎng)來選擇噬斑擴(kuò)增細(xì)胞。用于進(jìn)行轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞常常不是所需重組病毒生長(zhǎng)的最優(yōu)宿主。因此，可通過選擇天然病毒或重組病毒在其中顯示出生長(zhǎng)增加的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞來提高從受轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的重組病毒回收。可根據(jù)上述選擇用于本發(fā)明這個(gè)方面的各種噬斑擴(kuò)增細(xì)胞。可用于支持本發(fā)明重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的回收和擴(kuò)增的示例性具體噬斑擴(kuò)增細(xì)胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。PCT公布的WO99/63064中提供了用于本發(fā)明的有關(guān)熱激和噬斑擴(kuò)增方法的其它詳情，引入本文作為參考。
本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的組合物。該組合物包括含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N、P和L蛋白在宿主細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)從cDNA合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的這個(gè)方面，該組合物在無細(xì)胞共轉(zhuǎn)染混合物中可包含病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N、P和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體?；蛘?，宿主細(xì)胞中可提供病毒cDNA表達(dá)載體和編碼和指導(dǎo)所述RNA聚合酶、N、P和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體(例如，向該宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了所述載體后)。在某些實(shí)施方式中，RNA聚合酶選自T7、T3或SP6RNA聚合酶。在其它實(shí)施方式中，編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體是質(zhì)粒。在又一實(shí)施方式中，上述組合物還包括與宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型相同或不同的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，使被拯救的病毒得以從該宿主細(xì)胞擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞而有助于重組病毒擴(kuò)增。
在下述本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施方式中，將T7RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)載體(pSC6-T7，由蘇黎世大學(xué)的Martin Billeter博士提供)與麻疹病毒(MV+)全長(zhǎng)cDNA克隆，以及操作性連接有表達(dá)控制序列(如T7RNA聚合酶啟動(dòng)子)的編碼MV N、P和L蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中，成功回收MV。
在其他示例性實(shí)施方式中，用本發(fā)明方法和組合物成功回收呼吸道合胞病毒(RSV)的40種不同重組構(gòu)建物，包括A型和B型RSV、嵌合性A/B RSV和摻入一個(gè)或多個(gè)減毒突變和/或下述的其它重組修飾(如基因缺失)的重組RSV。提供了說明成功回收的其它例子，如3型人副流感病毒(HPIV3)、嵌合性型人副流感病毒3-1(其中用1型人副流感病毒的糖蛋白基因F和HN代替了PIV-3的糖蛋白基因F和HN)、嵌合性型人副流感病毒3-2CT(其中用2型人副流感病毒的糖蛋白基因F和HN替代了PIV-3的糖蛋白基因F和HN的胞質(zhì)尾部分)、3型牛PIV(BPIV3)、嵌合性型人-牛PIV-3(其中用人PIV-3的糖蛋白基因F和HN代替了3型牛副流感病毒的糖蛋白基因F和HN)和水泡性口炎病毒(VSV)。
在本發(fā)明的其它詳述實(shí)施方式中，基于pCl-Neo骨架(Promega，Madison WI)構(gòu)建T7RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒。在插入T7RNA聚合酶基因之前，通過去除位于多個(gè)克隆位點(diǎn)5’側(cè)的T7啟動(dòng)子修飾該載體，產(chǎn)生pCl-Neo-Bcl。去除T7啟動(dòng)子以增加T7RNA聚合酶基因插入物在細(xì)菌增殖期間的穩(wěn)定性。T7RNA聚合酶的過表達(dá)對(duì)細(xì)菌可能有毒性，如果將T7RNA聚合酶基因克隆到T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游，這可能會(huì)是一個(gè)問題。
用于克隆的T7基因采用摻入PCR引物的EcoRI(5’)和Xbal(3’)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆。ATG翻譯起始密碼子的5’端也包括Kozak共有序列，以保證高效率的蛋白合成。將T7基因插入pCl-Neo-Bcl產(chǎn)生pCL-Neo-Bcl-T7，這導(dǎo)致T7基因位于hCMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的控制下。獲得的質(zhì)粒pCl-Neo-Bcl-T7具有圖2所列的序列(SEQ IDNO1)，并含有HCMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，依次后隨一個(gè)內(nèi)含子、T7RNA聚合酶SV40聚A、SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和NeoR元件。任選以新霉素抗性基因提供的選擇標(biāo)記受SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制，它位于T7基因的3’。新霉素標(biāo)記增加了該質(zhì)粒的多能性，因?yàn)樗捎糜谶x擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系?？蛇x擇標(biāo)記基因的該位置將SV40增強(qiáng)子置于T7RNA聚合酶基因的3’端也值得注意。已被證明的SV40增強(qiáng)子的雙向轉(zhuǎn)錄刺激作用可能明顯有助于T7RNA聚合酶在質(zhì)粒pCl-Neo-Bcl-T7中的全面表達(dá)。
可與被拯救病毒的各種重組修飾相結(jié)合進(jìn)行本發(fā)明方法，各種重組修飾方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，可通過缺失一個(gè)完整基因、缺失某基因的一部分、編碼區(qū)的點(diǎn)突變、用異源核酸序列(來自另一病毒、另一病原體、編碼藥學(xué)上有用的多肽或編碼免疫調(diào)節(jié)劑)取代部分或全部基因、將異源核酸序列插入如基因間區(qū)和基因順序的重排等其它修飾，來修飾病毒基因組或反義基因組。因?yàn)楸疚奶峁┑恼认到y(tǒng)足夠強(qiáng)大和有效，所以可成功實(shí)施對(duì)這些生長(zhǎng)受損和/或減毒重組或突變衍生物的回收。
因此，可通過將明確的改變引入該重組病毒并以高頻率和高保真度產(chǎn)生用于含有所確定基因組序列的免疫原性組合物的候選病毒的新共表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)生本發(fā)明的感染性、重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。這些修飾可用于各種應(yīng)用，包括開發(fā)攜帶有預(yù)定、明確的減毒突變的減毒活病毒株。通過胞內(nèi)共表達(dá)編碼病毒基因組或反義基因組RNA的一種或多種分離的多核苷酸分子與編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄性、復(fù)制性核衣殼所需或至少必要的病毒蛋白的一種或多種多核苷酸，來產(chǎn)生本發(fā)明的感染性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
構(gòu)建編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒基因組或反義基因組的cDNA，使其與所選病毒蛋白在胞內(nèi)共表達(dá)，以形成感染性病毒。“非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒反義基因組”指一種分離的正義多核苷酸分子，它可用作子代病毒基因組的合成模板。一般構(gòu)建的是復(fù)制性中間RNA相對(duì)應(yīng)的正義病毒基因組或反義基因組的cDNA，以使與編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄、復(fù)制性核衣殼所必須的蛋白的互補(bǔ)序列的正義轉(zhuǎn)錄物雜交的可能性最少。雖然如前所述，但可采用反義病毒基因組(參見，例如，Kato等，Genes to Cells1569-579，1996，引入本文作為參考)在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組僅需含有產(chǎn)生其編碼的感染性病毒或亞病毒顆粒所必需的那些基因或其部分。而且，可通過一種以上的多核苷酸分子提供這些基因或其部分，即可通過互補(bǔ)等由各個(gè)核苷酸分子提供這些基因。在其它實(shí)施方式中，所述病毒基因組或反義基因組可在沒有輔助病毒參與或質(zhì)?；蜉o助細(xì)胞系提供的病毒功能的情況下編碼病毒生長(zhǎng)、復(fù)制和感染所必需的所有功能。
“重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒”指直接或間接衍生自重組表達(dá)系統(tǒng)或由其產(chǎn)生的病毒或亞病毒顆粒增殖獲得的完整病毒或感染性亞病毒顆粒。該重組表達(dá)系統(tǒng)采用包含操作性連接的轉(zhuǎn)錄單元的重組病毒表達(dá)載體，該轉(zhuǎn)錄單元含有在病毒基因表達(dá)中組裝的具有調(diào)節(jié)作用的至少一個(gè)以上的遺傳元件，如啟動(dòng)子、可轉(zhuǎn)錄為病毒RNA的結(jié)構(gòu)或編碼序列、以及合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。
通過提供有效拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的感染性克隆的方法，本發(fā)明能將多種改變用重組方法制作到各種目標(biāo)病毒的基因組(或反義基因組)中，產(chǎn)生規(guī)定所需表型特定改變的明確突變。產(chǎn)生重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的本發(fā)明組合物和方法，能利用，例如這些明確的突變來改變所選病毒蛋白的功能或表達(dá)而易于詳細(xì)地分析和操縱病毒的分子生物學(xué)和致病機(jī)理。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解其相關(guān)的診斷用途。用本發(fā)明方法和組合物，可以容易地區(qū)分負(fù)責(zé)所需表型改變的突變和沉默的偶然突變，從而選擇摻入重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒基因組或反義基因組的表型特異性突變。
本文中，在構(gòu)建cDNA期間或之后，可以在重組病毒基因組或反義基因組中進(jìn)行各種核苷酸插入、缺失、取代和重排。例如，可以合成特異性所需核苷酸序列，用方便的限制性酶位點(diǎn)將其插入cDNA中的合適區(qū)域?；蛘撸捎么祟惣夹g(shù)如位點(diǎn)特異性誘變、丙氨酸掃描、PCR誘變或本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)將突變引入cDNA。
本發(fā)明提供的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的重組修飾定向產(chǎn)生用于診斷和免疫原性組合物的候選病毒，例如，以提高病毒的減毒和免疫原性，消除與不良免疫病理表現(xiàn)相關(guān)的表位，適應(yīng)抗原性漂變等。為實(shí)現(xiàn)這些和其它目標(biāo)，本發(fā)明組合物和方法允許將各種修飾引入非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒基因組或反義基因組中以摻入感染性重組病毒。例如，可將編碼抗原決定簇(如保護(hù)性抗原或免疫原性表位)的外來基因或基因節(jié)段加入病毒克隆中，以產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)對(duì)親代或“背景”病毒和產(chǎn)生抗原決定簇的另一“供體”病毒或病原因子的免疫力的重組病毒。或者，可將外來基因全部或部分插入編碼免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子中，以提高候選病毒的免疫原性。在本發(fā)明方法拯救的病毒克隆中可包括其它突變，例如，用重組病毒克隆中的對(duì)應(yīng)基因或基因節(jié)段取代異源基因或基因節(jié)段(例如，編碼糖蛋白基因的胞質(zhì)尾的基因節(jié)段)。或者，可以改變病毒克隆中基因的相對(duì)順序，可以將病毒基因組啟動(dòng)子或其它調(diào)節(jié)元件用其反義基因組的對(duì)應(yīng)物，或所選無功能的病毒基因(例如，通過功能性消除，包括引入終止密碼子來防止該基因表達(dá))取代?？稍诜枪?jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中產(chǎn)生其它修飾，如將獨(dú)特的限制性位點(diǎn)插入病毒基因組或反義基因組的各種非編碼或編碼區(qū)域，以利于操縱。此外，可去除不翻譯的基因序列，以提高插入外來序列的容量。
如上所述，常常需要通過引入能提高或降低減毒或者改變重組病毒的表型來調(diào)整重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的表型。針對(duì)副流感病毒，在本發(fā)明中詳細(xì)示例了從cDNA產(chǎn)生重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，以及選擇、引入和測(cè)試各種減毒突變和其它修飾的有用材料和方法，這些材料和方法通常也可應(yīng)用于本發(fā)明方法和組合物中的PIV和其它非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒(參見，例如，Durbin等，Virology235323-332，1997；1998年5月22日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/459,062；1998年5月22日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/083,793(對(duì)應(yīng)于國際公告號(hào)WO 98/53078)及其1997年5月23日提交的優(yōu)先權(quán)美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/047,575和1997年9月19日提交的60/059,385，各自引入本文作為參考)。具體說，上述引入的參考文獻(xiàn)描述了通過構(gòu)建和表達(dá)編碼與PIV必要蛋白共表達(dá)的PIV基因組或反義基因組的cDNA產(chǎn)生感染性重組HPIV3的方法，包括可用于產(chǎn)生感染性病毒克隆的示例性質(zhì)粒的描述。通過構(gòu)建和表達(dá)編碼與PIV必要蛋白共表達(dá)的HPIV1重組物或嵌合基因組或反義基因組的cDNA來產(chǎn)生感染性重組HPIV1的方法類似于2001年9月21日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/331,961，和Newman等，Virus Genes 2477-92，2002(各自引入本文作為參考)中的描述。通過構(gòu)建和表達(dá)編碼與PIV必要蛋白共表達(dá)的HPIV2重組物或嵌合基因組或反義基因組的cDNA來產(chǎn)生感染性重組HPIV2的方法類似于2002年9月18日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/412,053(引入本文作為參考)中的描述。
類似地，已經(jīng)描述了從cDNA克隆呼吸道合胞病毒(RSV)的示例性方法和材料，及本發(fā)明中涉及用于構(gòu)建重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的選擇、引入和測(cè)試減毒突變和其它修飾的其它公開內(nèi)容(參見，例如，1996年9月27日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?8/720,132，對(duì)應(yīng)于97年4月3日發(fā)表的國際公告WO97/12032和1995年9月27日提交的優(yōu)先權(quán)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/007,083；1996年7月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/021,773；1997年5月9日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/046,141；1997年5月23日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/047,634；1997年7月15日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?8/892,403，對(duì)應(yīng)于1998年1月22日公開的國際公告號(hào)WO98/02530；1999年4月13日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/291,894，對(duì)應(yīng)于2000年10月19日公開的國際公告號(hào)WO 00/61611和1999年4月13日提交的優(yōu)先權(quán)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/129,006；2000年6月23日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?9/602,212和相應(yīng)的2001年1月18日公開的相應(yīng)的國際公告號(hào)WO 01/04335和1999年4月13日提交的優(yōu)先權(quán)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/129,006、1999年7月9日提交的60/143,097和1999年7月9日提交的60/143,132；2000年10月19日公開的國際公告號(hào)WO00/61737；Collins等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.9211563-11567，1995；Bukreyev等，J.Virol.706634-41，1996，Juhasz等，J.Virol.715814-5819，1997；Durbin等，Virology 235323-332，1997；He等Virology 237249-260，1997；Baron等J.Virol.711265-1271，1997；Whitehead等，Virology 247232-9，1998a；Whitehead等，J.Virol.724467-4471，1998b；Jin等Virology 251206-214，1998；和Whitehead等，J.Virol.733438-3442，1999和Bukreyev等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.962367-72，1999，各自內(nèi)容引入本文作為參考)。
這些上述引入的參考文獻(xiàn)描述了誘變、分離和表征非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒以獲得減毒突變株(如溫度敏感型(ts)、冷傳代(cp)冷適應(yīng)的(ca)、小嗜菌斑(sp)和宿主范圍受限的(h7)突變株)的方法和步驟，及鑒定規(guī)定減毒表型的遺傳改變。與這些方法相結(jié)合，上述引入的參考文獻(xiàn)詳述了在與人體內(nèi)活性合理相關(guān)的已接受的模型系統(tǒng)中，包括倉鼠或嚙齒類和非人靈長(zhǎng)類模型系統(tǒng)中，確定通過生物學(xué)計(jì)數(shù)衍生的和重組產(chǎn)生的減毒非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的復(fù)制、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性和免疫效力的方法。此外，這些參考文獻(xiàn)描述了開發(fā)和測(cè)試非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的免疫原性組合物，包括單價(jià)和二價(jià)免疫原性組合物的通用方法。
上述引入的參考文獻(xiàn)中也公開了構(gòu)建和評(píng)價(jià)感染性、重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該病毒經(jīng)修飾摻入了在生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變體，例如冷傳代(cp)冷適應(yīng)的(ca)、宿主范圍受限的(hr)、小嗜菌斑(sp)和/或溫度敏感型(ts)突變體，如HPIV3 JS cp45突變株(根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，美國，專利保藏名為PTA-2419；保藏物引入本文作為參考)中鑒定的表型特異性突變?？蓪⒃诖瞬《竞推渌蛔儾《?例如，RSV-參見上述參考文獻(xiàn))中鑒定的突變?nèi)菀椎負(fù)饺氡景l(fā)明的重組PIV或其它非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中，見以下的進(jìn)一步詳述。
因此，可將減毒突變和其它修飾常規(guī)引入本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中。在本發(fā)明的某些方面，鑒定、評(píng)價(jià)用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變病毒的突變和將其引入相同或不同病毒的重組毒株中。用于摻入本發(fā)明重組病毒中的生物學(xué)方法產(chǎn)生的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的減毒突變可能是天然發(fā)生的，或可通過熟知的誘變和分析方法將其引入野生株后鑒定并分析特征。例如，可通過病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)期間加入化學(xué)誘變劑進(jìn)行化學(xué)誘變，通過選擇在次優(yōu)溫度下傳代的病毒以引入生長(zhǎng)限制性突變，或通過選擇在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生小嗜菌斑(sp)的誘變病毒，來產(chǎn)生不完全減毒的親代病毒突變株，見上述引入的參考文獻(xiàn)中所述。
“生物學(xué)方法產(chǎn)生的”指任何不通過重組方法產(chǎn)生的病毒。因此，生物學(xué)方法產(chǎn)生的病毒包括具有野生型基因組序列的天然產(chǎn)生的病毒和具有參比野生型序列的等位基因或突變基因組變異的病毒，例如，生物學(xué)方法產(chǎn)生的具有確定減毒表型突變的病毒。同樣，生物學(xué)方法產(chǎn)生的病毒包括通過其它方法，如不包括直接重組DNA操作而通過人工誘變和選擇方法，由親代毒株產(chǎn)生的突變體。
如需要，可以單獨(dú)或組合方式引入在生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的突變，以將本發(fā)明重組病毒調(diào)整到合適的減毒和免疫原性水平，和對(duì)減毒表型逆轉(zhuǎn)的遺傳抗性等。按照前面的描述，能從cDNA有效產(chǎn)生感染性重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒使得能將經(jīng)特定工程改造的變化引入重組病毒的廣泛組裝中?？捎眠@些感染性重組病毒進(jìn)一步鑒定生物學(xué)方法產(chǎn)生的減毒株中的特異性突變，例如規(guī)定ts、ca、att和其它表型的突變。將這個(gè)和其它方法鑒定的所需突變引入其它重組病毒株。本文提供的從cDNA產(chǎn)生新的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的獨(dú)特能力得以將這些突變以單獨(dú)或各種所選組合的方式常規(guī)摻入新病毒的cDNA克隆中，隨后不難測(cè)定含引入突變的被拯救的重組病毒的表型。
在本發(fā)明其它實(shí)施方式中，通過制作異源突變病毒的突變圖譜、用常規(guī)序列排列對(duì)比鑒定受體重組病毒的相應(yīng)位點(diǎn)、和將受體病毒的天然序列突變?yōu)樵谠摦愒赐蛔兓蛐椭杏^察到的相同或保守突變，而“轉(zhuǎn)移”異源負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的所需突變。此種轉(zhuǎn)移突變的通用性合理設(shè)計(jì)方法的描述見2000年4月12日提交的國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US00/09695,10/19/00公開的WO 00/61737，對(duì)應(yīng)于01/08/02提交的美國國家階段申請(qǐng)09/958,292，并要求1999年4月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/129,006的優(yōu)先權(quán)，各自引入本文作為參考。Newman等，Virus Gene 2477-92，2002；Feller等，Virology 10；276190-201，2000；Skiadopoulos等，Virology260125-35，1999；和Durbin等，Virology 261319-30，1999中提供了關(guān)于本發(fā)明這個(gè)方面的其它描述，各自引入本文作為參考。
常常需要修飾受體重組病毒基因組或反義基因組，使其編碼目標(biāo)突變位點(diǎn)中的改變，該改變保守地對(duì)應(yīng)于異源突變病毒中所鑒定的改變。例如，如果與相應(yīng)的野生型序列相比，某氨基酸取代標(biāo)志著該突變病毒中的一個(gè)位點(diǎn)突變，那么可在該重組病毒的相應(yīng)殘基上經(jīng)工程改造產(chǎn)生一個(gè)類似取代。一般這種取代特指與該突變病毒蛋白中存在的取代殘基相同或保守的氨基酸。然而也可以改變?cè)撏蛔兊鞍字械娜〈鷼埢姆潜Ｊ赝蛔兾稽c(diǎn)的天然氨基酸殘基(例如，利用任何其它氨基酸來破壞或削弱野生型殘基的功能)。鑒定到其中含有示例性突變并將其轉(zhuǎn)移入本發(fā)明重組病毒的負(fù)鏈RNA病毒包括PIV(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、BPIV3和MPIV1)、RSV、新城疫病毒(NDV)、猴病毒5(SV5)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒、犬瘟熱病毒(CDV)、腮腺炎病毒、狂犬病病毒(RaV)和水泡性口炎病毒(VSV)等。
如上所述，可以通過幾種已知方法來產(chǎn)生足夠減毒的生物學(xué)方法產(chǎn)生的病毒突變株。一種這樣的方法包括使部分減毒的病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物中在逐漸降低的減毒溫度下傳代。例如，通過在細(xì)胞培養(yǎng)物中，在次優(yōu)溫度下傳代來產(chǎn)生部分減毒的突變株。因此，冷適應(yīng)的(ca)突變株或其它部分減毒的病毒株適應(yīng)了在較低溫度下培養(yǎng)傳代而有效生長(zhǎng)。這種在冷傳代期間選出的突變病毒與部分減毒的親代相比，衍生株的殘余毒力大大降低?；蛘?，可通過對(duì)部分減毒的親代病毒進(jìn)行化學(xué)誘變將特定突變引入生物學(xué)方法產(chǎn)生的病毒，例如，引入ts突變，或者在對(duì)已含ts的病毒而言，引入足以提高該減毒衍生物的減毒效果和/或ts表型穩(wěn)定性的其它ts突變。將ts突變引入非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法包括在誘變劑如5-氟尿嘧啶的存在下根據(jù)公知方法復(fù)制病毒。也可使用其它化學(xué)誘變劑。雖然幾乎任何病毒基因中的ts突變均可導(dǎo)致減毒，但發(fā)現(xiàn)對(duì)于此目的特別適合的靶是聚合酶(L)基因。例如，通過比較在許可溫度下的復(fù)制與幾種限制溫度下的復(fù)制，來確定用于本發(fā)明的示例性減毒病毒復(fù)制的溫度敏感性水平。與病毒在許可溫度下的復(fù)制相比，使病毒復(fù)制降低100倍或更多的最低溫度稱為截?cái)?shutoff)溫度。在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物和人中，非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的復(fù)制和毒力與該突變體的截?cái)鄿囟认嚓P(guān)。
如圖3(A-C圖)所示，可將在異源負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的各種突變摻入本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，產(chǎn)生減毒或其它所需表型改變。該圖提供HPIV2野生型(wt)、HPIV3wt、HPIV1wt或BPIV3wt之間的示例性序列排列對(duì)比，鑒定異源病毒中含有的已知減毒突變區(qū)域。根據(jù)這些和類似比較，將以前在異源病毒中鑒定的突變繪制到本發(fā)明目標(biāo)病毒的相應(yīng)位置圖上，以便“轉(zhuǎn)移”(即通過引入相同的保守或非保守突變，可能包括在通過排列對(duì)比鑒定的同源或相應(yīng)位置上的取代、缺失或插入)到本發(fā)明的所述重組病毒中。將已可得到的這種突變的大組裝物(參見，例如，Newman等，Virus Genes 2477-92，2002；Feller等，Virology 276190-201，2000；Skiadopoulos等，Virology 260125-35，1999；和Durbin等，Virology 261319-30，1999，各自引入本文作為參考)摻入本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。如圖3A和3C(A-C圖)所示，通過常規(guī)序列對(duì)比可鑒定出以前規(guī)定異源病毒的表型改變(當(dāng)例如，通過取代改變了所指野生型殘基時(shí))所示的相應(yīng)氨基酸位置。從而鑒定本發(fā)明目標(biāo)病毒(如HPIV1)的相應(yīng)氨基酸位置，成為在重組病毒中產(chǎn)生減毒或其它所需表型改變進(jìn)行突變的靶位點(diǎn)。
在某些詳述實(shí)施方式中，本發(fā)明的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組經(jīng)重組修飾，而摻入了選自以前在HPIV3 JS cp45病毒L蛋白Tyr942、Leu992和/或Thr1558相應(yīng)位置上鑒定的氨基酸取代的一個(gè)突變或其任意組合。例如，摻入這些示例性突變的野生型(wt)HPIV2 L的相應(yīng)靶位置是Tyr948、Ala998和Leu566。在其它示例性實(shí)施方式中，修飾重組的HPIV或其它非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒基因組或反義基因組，以在與異源性突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，如另一種HPIV、非人PIV如牛PIV3(BPIV3)或鼠PIV1(MPIV1)，或非PIV病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)中所鑒定的減毒突變某氨基酸位置相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置上摻入減毒突變。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，將在BPIV3病毒L蛋白的氨基酸位置Thr 1711中鑒定的減毒突變摻入重組HPIV2的相應(yīng)位置(Ser1724)，如常規(guī)排列對(duì)比方法所鑒定的位置中(圖3A和3C，A-C圖；也參見Schmidt等，J.Virol.748922-9，2000，引入本文作為參考)。
在本發(fā)明的其它詳述實(shí)施方式中，非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組在與呼吸道合胞病毒(RSV)中所鑒定的減毒突變的某氨基酸位置相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置上摻入了規(guī)定減毒突變的重組修飾。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，與例如HPIV2、HPIV3和HPIV1 L蛋白中的保守位置對(duì)比在RSV中鑒定的減毒突變包含RSV L蛋白521位置上的苯丙氨酸取代。在HPIV2中，突變的示例性保守靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于HPIV2 L蛋白的Phe460，圖3A和3B(A-C圖)。因此，在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，HPIV2 L蛋白的Phe460被替換為L(zhǎng)eu殘基，或另一氨基酸。
下表2說明和描述了用于摻入本發(fā)明的重組RSV中和其它非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的RSV中的各種示例性突變，并在本文以下的實(shí)施例中進(jìn)一步詳述。
表2RSV cDNA突變野生型RSV與RSV cDNA突變的序列對(duì)比
可經(jīng)工程改造摻入到本發(fā)明重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的許多上述示例性突變已在基于重組HPIV3的候選病毒中被成功地工程改造和回收(Durbin等，Virology235323-332，1997；Skiadopoulos等，J.Virol.721762-1768，1998；Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999；1998年5月22日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/459,062；1997年5月23日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/047,575(對(duì)應(yīng)于國際公告號(hào)WO 98/53078)和1997年9月19日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/059,385，各自引入本文作為參考)。此外，上述引入的參考文獻(xiàn)描述了構(gòu)建嵌合性PIV重組病毒，例如，其HPIV 1的HN和F基因被替換為HPIV3的部分背景基因組或反義基因組，經(jīng)進(jìn)一步修飾而攜帶有在HPIV3 JS cp45中鑒定的一個(gè)或多個(gè)減毒突變。一種這樣的嵌合重組病毒摻入了在cp45的L基因中鑒定的所有減毒突變。已顯示，可將異源(HPIV1)HN和F基因外的所有cp45突變摻入HPIV3-1重組病毒中，來產(chǎn)生減毒的嵌合性候選病毒。
如上所述，生物學(xué)方法產(chǎn)生的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的這些和其它突變代表一個(gè)大“菜單”，可從其中選擇單個(gè)突變并與其它突變組合，以調(diào)整本發(fā)明重組病毒的減毒、免疫原性和遺傳穩(wěn)定性水平。在本文中，許多重組候選病毒包括一種或多種，常常是兩種或多種生物學(xué)方法產(chǎn)生的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的突變，例如，HPIV3 JScp45、BPIV3和RSV中鑒定的任何一個(gè)突變或其組合。本發(fā)明的許多重組病毒將摻入多個(gè)如此鑒定的突變。在規(guī)定這些突變的密碼子中進(jìn)行多個(gè)核苷酸取代而使重組病毒中的突變穩(wěn)定化，以抵制重組病毒(毒力)的回復(fù)。
通過鑒定與所需表型，如ca或ts表型相關(guān)的特定突變并將其摻入感染性重組病毒中，本發(fā)明在所鑒定的突變位置上或其附近提供了其它的位點(diǎn)特異性修飾。生物學(xué)方法產(chǎn)生的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中產(chǎn)生的大多數(shù)減毒突變是單核苷酸改變，但也可通過重組技術(shù)將其它“位點(diǎn)特異性”突變摻入本發(fā)明重組病毒中。本文使用的位點(diǎn)特異性突變包括1-3個(gè)，高達(dá)約5-15個(gè)或更多個(gè)核苷酸的改變(例如，從野生型病毒序列、從所選突變病毒株序列、或從經(jīng)過誘變的親代重組病毒克隆改變而產(chǎn)生)的插入、取代、缺失或重排?？蓪⑦@種位點(diǎn)特異性突變摻入所選的生物學(xué)方法產(chǎn)生的點(diǎn)突變的區(qū)域內(nèi)。或者，可將突變引入重組病毒克隆中的其它不同部分中，例如，引入順式作用調(diào)節(jié)序列或編碼蛋白活性位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)、免疫原性表位等的核苷酸序列中或其附近。在各種實(shí)施方式中，將位點(diǎn)特異性核苷酸取代、增加、缺失或重排引入相對(duì)于靶核苷酸5’或3’位置的上游或下游，如距離1-3個(gè)、5-10個(gè)和多達(dá)15個(gè)或更多個(gè)核苷酸，例如，以構(gòu)建或消除原有的順式作用調(diào)節(jié)元件。
除了單點(diǎn)和多點(diǎn)突變和位點(diǎn)特異性突變外，對(duì)本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的改變包括一個(gè)或多個(gè)基因或基因組節(jié)段的缺失、插入、取代或重排。特別有用的是參與產(chǎn)生其它所需表型影響的一個(gè)或多個(gè)基因或基因組節(jié)段的缺失。本文中描述了對(duì)HPIV的各種修飾(參見，例如，Durbin等于2002年6月25日發(fā)表的美國專利號(hào)6,410,023，引入本文作為參考)。例如，在HPIV3中，可通過修飾重組的HPIV3基因組或反義基因組，例如摻入改變起始密碼子的編碼分配的突變、引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或使ORF的全部或部分編碼序列缺失，而降低或消除C、D或V開放閱讀框(ORF)或另一輔助基因中的一種或多種的表達(dá)(參見，例如，Durbin等于2002年6月25日提交的美國專利號(hào)6,410,023，引入本文作為參考)。對(duì)HPIV1和HPIV2的其它示例性修飾包括能改變或消除C、C’、Y1和/或Y2ORF或其它輔助基因中一種或多種表達(dá)的修飾。這些重組病毒將擁有非常理想的用于開發(fā)免疫原性組合物的表型特征。具體說，所述修飾是高度穩(wěn)定的，可規(guī)定一種或多種所需表型改變，包括(i)在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)性能的改變，(ii)在哺乳動(dòng)物的上和/或下呼吸道中減毒，(iii)病毒噬斑大小的改變，(iv)細(xì)胞病變效應(yīng)的改變，和(v)免疫原性的改變。
因此，在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了部分或全部基因缺失、敲除突變或僅降低或提高所選基因表達(dá)的突變中的一種或多種。這可通過，例如，在所選編碼序列中引入移碼框突變或終止密碼子，改變翻譯起始位點(diǎn)，改變某基因位置或引入一個(gè)上游起始密碼予以改變其表達(dá)速率，改變基因起始(GS)和/或基因終止(GE)轉(zhuǎn)錄信號(hào)以改變表型，或修飾RNA編輯位點(diǎn)(例如，生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄、溫度限制等)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，提供的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中在沒有缺失基因或其節(jié)段的情況下，通過例如將多個(gè)翻譯終止密碼子引入翻譯開放閱讀框、改變起始密碼子或修飾某編輯位點(diǎn)而能在翻譯或轉(zhuǎn)錄水平上消除一種或多種基因的表達(dá)。這些形式的敲除病毒常常顯示在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)速率降低，噬斑尺寸小。因此，這些方法提供了另一類型的減毒突變，可消除病毒基因，一般不是主要的病毒保護(hù)性抗原之一的基因的表達(dá)。本文中，可通過上述缺失誘變替代在沒有基因或基因組節(jié)段缺失的情況下所產(chǎn)生的敲除病毒表型，以有效預(yù)防可恢復(fù)靶蛋白合成的校正突變。用本領(lǐng)域已知的替代設(shè)計(jì)和方法進(jìn)行其它基因敲除(如Kretschmer等，Virology 216309-316，1996；Radecke等，Virology 217418-421，1996；Kato等，EMBO J.16578-587，1987；和Schneider等，Virology 277314-322，1996中的描述，各自引入本文作為參考)。
可引入本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的核苷酸修飾可改變基因組或反義基因組中的少量堿基(如15-30個(gè)堿基、多達(dá)35-50個(gè)堿基或更多)，大段核苷酸(如50-100、100-300、300-500、500-1,000個(gè)堿基)，或幾乎全部或全部基因(例如1,000-1,500個(gè)核苷酸、1,500-2,500個(gè)核苷酸、2,500-5,000個(gè)核苷酸、5,000-6,000個(gè)核苷酸或更多)，這取決于修飾的性質(zhì)和所需效應(yīng)。例如，可通過改變少量堿基插入或消除某免疫原性表位或改變小的基因組節(jié)段，而當(dāng)添加(插入，addition)、取代、缺失或重排諸基因或大基因組節(jié)段時(shí)，涉及大量堿基。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供的適合于在衍生自生物學(xué)方法產(chǎn)生的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的補(bǔ)充突變(例如，ca和ts突變)，涉及進(jìn)一步修飾的重組病毒中相同或不同基因的其它突變類型。例如，可根據(jù)表達(dá)水平選擇性改變，或加入、缺失或取代一種或多種天然或異源基因的整體或一部分，可單獨(dú)或與其它所需修飾組合地進(jìn)行這些修飾，以產(chǎn)生具有新特征的重組病毒。或者或此外，可以改變基因在該重組病毒中的順序，可用基因組啟動(dòng)子的反義基因組對(duì)應(yīng)物取代該基因組啟動(dòng)子，反之亦然?？梢栽谠撔蛄兄羞M(jìn)行不同或額外的修飾，以有助于操縱，如在各基因間區(qū)或其它地方插入獨(dú)特的限制性位點(diǎn)?？扇コ环g的基因序列，以增加插入外來序列的容量。
用于摻入本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的其它突變包括針對(duì)順式作用信號(hào)的突變，這可通過例如病毒微型基因組的突變分析容易地鑒定。例如，對(duì)前導(dǎo)區(qū)、尾隨區(qū)和/或側(cè)翼序列的插入和缺失分析可鑒定病毒啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄信號(hào)，并提供與RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的不同程度降低相關(guān)的一系列突變。也可利用這些順式作用信號(hào)的飽和誘變(借此將各位置修飾為各替代的核苷酸)來鑒定影響RNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的許多突變?？蓪⑦@些突變之一如本文所述插入病毒的反義基因組或基因組中。利用病毒微型基因組幫助采用完整的反義基因組cDNA評(píng)價(jià)和操縱反式作用蛋白和順式作用RNA序列，見上述引用的參考文獻(xiàn)中所述。
本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的其它突變還可包括用其反義基因組對(duì)應(yīng)物取代基因組的3’端，反之亦然，這與RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的改變相關(guān)。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，可通過用合成方法制備的和設(shè)計(jì)的能有效翻譯的序列取代天然序列，以提高特定病毒蛋白，如PIV的保護(hù)性HN和/或F抗原的表達(dá)水平。本文中顯示了密碼子的采用可能是哺乳動(dòng)物病毒蛋白翻譯水平的主要影響因素(Haas等，CurrentBiol.6315-324，1996，引入本文作為參考)。通過重組方法優(yōu)化編碼重組病毒所述蛋白的mRNA的密碼子采用將提高這些基因的表達(dá)。
在另一示例性實(shí)施方式中，單獨(dú)或與引入上游啟動(dòng)密碼子結(jié)合修飾了圍繞所選病毒基因翻譯起始位點(diǎn)的序列(常常包括相對(duì)于AUG起始位點(diǎn)-3位置的核苷酸)，以通過規(guī)定上調(diào)或下調(diào)翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)?；蛘?，與本文揭示的其它重組修飾結(jié)合，可通過改變轉(zhuǎn)錄GS或GE信號(hào)調(diào)節(jié)重組病毒任一所選基因的表達(dá)。在另一實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的基因表達(dá)水平。在一個(gè)方面，改變所選基因在病毒基因圖中的位置，使其更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子，從而分別更有效或更不有效地表達(dá)該基因。根據(jù)這個(gè)方面，可實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，使該基因的表達(dá)與常常伴隨的位置上互補(bǔ)取代的基因表達(dá)水平降低程度相當(dāng)?shù)囊吧退较啾龋档突蛏?倍，更通常是4倍，高達(dá)10倍或更高。這些和其它轉(zhuǎn)座性改變產(chǎn)生，例如由于所選涉及RNA復(fù)制的病毒蛋白的表達(dá)降低而具有減毒表型或具有其它需要性能如抗原表達(dá)增加的新重組病毒。
在其它實(shí)施方式中，可方便地修飾用于免疫原性組合物中的重組病毒，以適應(yīng)循環(huán)病毒中的抗原性漂變。一般該修飾位于抗原性糖蛋白中，例如PIV的HN和/或F蛋白，或RSV的F、G或SH蛋白中。通過替換不同毒株或群受體克隆中的相應(yīng)區(qū)域，或通過加入一個(gè)或多個(gè)拷貝的能提呈多個(gè)抗原形式的基因或基因組節(jié)段，將一個(gè)病毒株或群的整個(gè)糖蛋白基因，或編碼其具體免疫原性區(qū)域的基因組節(jié)段摻入重組基因組或反義基因組cDNA中。然后，可將該修飾的重組病毒產(chǎn)生的后代病毒用于免疫方法中對(duì)抗新出現(xiàn)的毒株。
在本發(fā)明的某些方面，用異源性(即，來自不同種病毒或株)對(duì)應(yīng)序列取代非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的編碼序列或非編碼序列(如啟動(dòng)子、基因末端、基因起點(diǎn)、基因間元件或其它順式作用元件)，產(chǎn)生具有各種可能的減毒和其它表型效應(yīng)的嵌合性病毒。例如，可將牛PIV3(BPIV3)或鼠PIV1(MPIV1)的基因或基因組節(jié)段輸入重組HPIV“背景”基因組或反義基因組中來工程改造其宿主范圍和其它所需效應(yīng)，其中牛或鼠基因不能在人細(xì)胞中起有效作用(例如，由于該異源序列或蛋白和通常與被取代序列合作行使病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯、組裝等的生物學(xué)相互作用的HPIV序列或蛋白不相容，或更通常是在宿主范圍限制上，與在許可和不太許可的宿主之間功能不同的細(xì)胞蛋白不相容)。
在示例性實(shí)施方式中，根據(jù)牛和異源性人PIV結(jié)構(gòu)和功能的已知方面，選擇用于引入HPIV的牛PIV序列。在更詳細(xì)方面，本發(fā)明提供了以構(gòu)建的HPIV和非人PIV，例如MPIV1(仙臺(tái)病毒)、BPIV3、SV5、SV41和NDV之間嵌合體為基礎(chǔ)使重組HPIV候選物減毒的方法(例如，Schmidt等于2000年6月1日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/586,479(對(duì)應(yīng)于PCT公告WO 01/04320)；Schmidt等，J.Virol.748922-9，2000中所述，各自引入本文作為參考)。該減毒方法基于因?qū)⒎侨薖IV的一個(gè)或多個(gè)基因或基因組節(jié)段引入人PIV載體的嵌合病毒中而產(chǎn)生的宿主范圍效應(yīng)。例如，BPIV和HPIV之間有許多核苷酸和氨基酸序列差異，這反映為宿主范圍不同。HPIV3和BPIV3之間，各下述蛋白的氨基酸相同性百分?jǐn)?shù)為N(86％)、P(65％)、M(93％)、F(83％)、HN(77％)和L(91％)。與BPIV3的兩種不同株在相同動(dòng)物中的限制性復(fù)制相比，HPIV3在恒河猴中高度許可地生長(zhǎng)說明宿主范圍不同(van Wyke Coelingh等，J.Infect.Dis.157655-662，1988，引入本文作為參考)。雖然HPIV3和BPIV3之間宿主范圍不同的基礎(chǔ)還有待完全闡明，但已顯示涉及到多個(gè)基因和多個(gè)氨基酸差異。涉及的多個(gè)基因和可能的順式作用調(diào)節(jié)序列，各包括多個(gè)氨基酸或核苷酸不同，為減毒對(duì)逆轉(zhuǎn)高度穩(wěn)定性提供了廣泛基礎(chǔ)。這與通過一個(gè)或幾個(gè)點(diǎn)突變減毒的其它減毒HPIV3活病毒的情況相反。在后一種情況下，任何單個(gè)突變的逆轉(zhuǎn)都可能產(chǎn)生明顯的毒力回復(fù)，或者在僅有一個(gè)殘基減毒的情況下，毒力完全回復(fù)。在本發(fā)明示例性實(shí)施方式中，重組HPIV基因組或反義基因組與異源基因或基因組節(jié)段，如來源于BPIV3的ORF的N、P、M或L，或其它動(dòng)物的副粘病毒相組合。
因此，本文提供的嵌合性人-牛或人-鼠重組HPIV，包含部分或完整的“背景”HPIV基因組或反義基因組，其衍生自或模仿HPIV與非人PIV的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組節(jié)段相組合后形成了該嵌合性PIV基因組或反義基因組。在本發(fā)明的某些方面，這種類型的嵌合性HPIV摻入了與例如牛PIV的一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組節(jié)段組合的部分或完整的HPIV背景基因組或反義基因組。該部分或完整的HPIV背景基因組或反義基因組一般起受體骨架的作用，其中摻入了對(duì)應(yīng)的非人PIV的異源基因或基因組節(jié)段。該對(duì)應(yīng)的PIV的異源基因或基因組節(jié)段代表“供體”基因，或代表與背景基因組或反義基因組相組合或在其中含有取代的多核苷酸，從而產(chǎn)生與一個(gè)或兩個(gè)供體PIV相比具有新表型特征的嵌合性HPIV。例如，在所選受體HPIV株中加入異源基因或基因組節(jié)段或取代，與未修飾的受體和/或供體的相應(yīng)表型相比，可導(dǎo)致減毒增加或降低、生長(zhǎng)改變、免疫原性改變或其它所需的表型改變(Schmidt等于2000年6月1日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/586,479；Schmidt等，.J.Virol.748922-9，2000，各自引入本文作為參考)。
可選擇用于在嵌合性PIV載體中作為異源取代或加入的基因和基因組節(jié)段，包括編碼PIV N(或者稱為NP、核衣殼蛋白)、V、P、M、F、HN和/或L蛋白或其部分的基因或基因組節(jié)段。此外，可將編碼見于其它PIV病毒的蛋白質(zhì)，以及非PIV蛋白質(zhì)(如見于腮腺炎、RSV和SV5病毒中的SH蛋白)的基因和基因組節(jié)段，摻入本發(fā)明的其它嵌合性HPIV重組物中，反之亦然。調(diào)節(jié)區(qū)，如基因外3’前導(dǎo)區(qū)或5’尾隨區(qū)，和基因起點(diǎn)、基因末端、基因間區(qū)、或者3’或5’非編碼區(qū)也可用作異源取代或加入。在示例性方面，攜帶有一個(gè)或多個(gè)牛或鼠PIV基因或基因組節(jié)段的嵌合性HPIV，例如在人PIV感染的哺乳動(dòng)物模型，如倉鼠和非人靈長(zhǎng)類的呼吸道中顯示出高度的宿主范圍限制。在更詳細(xì)的實(shí)施方式中，通過加入或取代選自N、M、L、V和P基因和基因組節(jié)段的一個(gè)或多個(gè)牛PIV3基因或基因組節(jié)段，將HPIV減毒成為部分或完整的HPIV背景基因組或反義基因組。
一般說，用于本發(fā)明免疫原性組合物的人-牛和其它嵌合病毒表現(xiàn)出的宿主范圍限制程度與各非人病毒或其它“供體”株表現(xiàn)出的宿主范圍限制程度相當(dāng)。在某些實(shí)施方式中，該限制與真正的宿主范圍表型相對(duì)應(yīng)，即，應(yīng)對(duì)所述宿主特異，體外應(yīng)不限制在合適細(xì)胞系中的復(fù)制。此外，攜帶有一個(gè)或多個(gè)異源基因或基因組節(jié)段的嵌合病毒應(yīng)能在易于被受體病毒感染的宿主中引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了根據(jù)宿主范圍效應(yīng)對(duì)活的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的減毒，用于開發(fā)防御這些病毒和其它病原體的免疫原性組合物。
與本發(fā)明嵌合病毒中提供的宿主范圍表型效應(yīng)結(jié)合，常常需要通過引入使嵌合性病毒減毒提高或降低的其它突變來調(diào)整減毒表型。因此，在本發(fā)明的其它方面，通過在得到的病毒或亞病毒顆粒中引入規(guī)定減毒表型的一種或多種減毒突變進(jìn)一步修飾產(chǎn)生的減毒嵌合病毒的嵌合基因組或反義基因組。這些可包括根據(jù)上述合理設(shè)計(jì)的誘變策略從頭產(chǎn)生的突變并測(cè)試其減毒效果。例如，可鑒定現(xiàn)有的生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變病毒中的減毒突變，然后將其摻入本發(fā)明的嵌合病毒。示例性突變具體指RNA調(diào)節(jié)序列或編碼蛋白中的損傷。
本發(fā)明的某些候選減毒病毒和嵌合病毒，與相應(yīng)的野生型或突變體親代病毒株的生長(zhǎng)相比，以在已接受的動(dòng)物模型(如倉鼠、恒河猴或黑猩猩-其中該病毒顯示了與人體中所見到的相關(guān)復(fù)制和免疫原活性)的下和/或上呼吸道中復(fù)制為標(biāo)志的減毒降低了至少約兩倍，更經(jīng)常約5倍、10倍或20倍，有時(shí)50-100倍和高達(dá)1,000倍或更高(例如，在感染后3-8天之間測(cè)定)。
可將各種添加的或取代的基因或基因組節(jié)段用常規(guī)方法引入本發(fā)明重組和嵌合性病毒。例如，可在重組或嵌合基因組或反義基因組內(nèi)的各種位點(diǎn)之一，例如在HPIV中N的3’位置，N/P、P/M和/或HN/L基因之間，或在HPIV基因組或反義基因組的其它基因間連接區(qū)或非編碼區(qū)中插入各種額外的異源基因或基因組節(jié)段。插入的基因可以在受體基因的共同控制下，或在一組獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄信號(hào)的控制下。本文中感興趣基因包括編碼細(xì)胞因子，如白介素(IL-2至IL-18，如白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL6)、白介素12(IL-12)、白介素18(IL-18)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、干擾素γ(IFNγ)或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因(參見，例如，2000年7月12日提交的美國申請(qǐng)?zhí)?9/614,285和1999年7月13日提交的優(yōu)先權(quán)美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/143,425，各自引入本文作為參考)。這些額外蛋白的共表達(dá)能夠定量和/或定性地修飾和改進(jìn)針對(duì)本發(fā)明重組病毒的免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的其它方面，分別采用將異源核苷酸序列插入重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒來調(diào)節(jié)候選重組病毒的，例如對(duì)上呼吸道感染的減毒水平。因此，可將核苷酸序列插入重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，指導(dǎo)外來蛋白的表達(dá)和在動(dòng)物宿主中減毒該病毒，或分別用核苷酸插入來減毒候選病毒。為明確支配基因插入物對(duì)減毒的影響的一些規(guī)律，可將不同長(zhǎng)度的基因單位插入野生型病毒骨架中，并檢測(cè)基因單位長(zhǎng)度對(duì)減毒的影響。在這個(gè)方面，考慮了不含明顯ORF的基因單位插入物，允許在不受該基因表達(dá)的蛋白的影響下鑒定基因單位長(zhǎng)度的影響。可將這些異源序列作為不同大小的額外基因單位插入，例如，長(zhǎng)度從約150或更多個(gè)核苷酸至長(zhǎng)度長(zhǎng)達(dá)3,000個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。如本文所證明的，基因插入或延伸的長(zhǎng)度大于約3,000個(gè)核苷酸。
長(zhǎng)度約1,000或2,000個(gè)核苷酸的基因單位(GU)插入物將使用于哺乳動(dòng)物對(duì)象上呼吸道的本發(fā)明非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒大大減毒。此外，基因單位插入物可具有使候選病毒減毒和誘導(dǎo)抗第二病毒的免疫應(yīng)答的雙重效果?；蛘?，在不能表達(dá)其它蛋白的病毒基因3’非編碼區(qū)(NCR)的基因延伸也可使其自身減毒。在本發(fā)明這些方法中，基因插入長(zhǎng)度是減毒的決定因素。
本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中的GU和NCR插入物所產(chǎn)生的減毒表型特征是在體外有效復(fù)制，而在體內(nèi)復(fù)制降低。GU插入所引起的減毒機(jī)制可能是由于一種或多種下述因素在體內(nèi)起到支配性作用所致。由于在轉(zhuǎn)錄梯度中接近啟動(dòng)子的基因的轉(zhuǎn)錄速率比遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的基因高，所以額外基因單位的加入可降低下游基因的轉(zhuǎn)錄水平。如果下游基因產(chǎn)物有限或如果改變了有效復(fù)制所需的基因產(chǎn)物的特定比率，由于下游基因產(chǎn)物的mRNA豐度降低所引起它們的表達(dá)降低可導(dǎo)致減毒。據(jù)認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄梯度是轉(zhuǎn)錄期間以及在跨越基因連接處轉(zhuǎn)移期間轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物從模板上脫落的結(jié)果?；蛘撸蚪M總長(zhǎng)度的增加和轉(zhuǎn)錄了額外的mRNA可提高產(chǎn)生的病毒雙鏈RNA的水平，進(jìn)而可誘導(dǎo)干擾素系統(tǒng)的抗病毒活性達(dá)到較高水平。最后，由于基因組和反義基因組長(zhǎng)度的增加，可降低基因組復(fù)制的總水平。這可能是由于在復(fù)制基因組RNA或反義基因組RNA期間復(fù)制酶復(fù)合物從模板上脫離。降低可用于包裝入病毒粒子中的基因組的量可致使導(dǎo)致減毒病毒產(chǎn)率降低。
涉及本發(fā)明重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中全病毒基因或基因組節(jié)段改變的缺失、插入、取代和其它突變可產(chǎn)生高度穩(wěn)定的候選病毒，這對(duì)免疫抑制的個(gè)體而言尤其重要。許多這些改變將導(dǎo)致獲得減毒的毒株，然而其它改變將規(guī)定不同類型的所需表型改變。例如，附屬(即不是體外生長(zhǎng)必需的)基因是編碼特異性干擾宿主免疫力的蛋白的優(yōu)秀候選物(參見，例如，Kato等，EMBO.J.16578-87，1997，引入本文作為參考)。預(yù)計(jì)消除候選病毒中的這種基因能降低毒力和致病性和/或提高免疫原性。
在本發(fā)明其它詳述實(shí)施方式中，用經(jīng)重組修飾摻入異源病原體的一種或多種抗原決定簇的“載體”基因組或反義基因組，構(gòu)建嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。該載體基因組或反義基因組包含部分或整個(gè)非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒基因組或反義基因組，本身可摻入核苷酸修飾如減毒突變。通過摻入異源基因或基因組節(jié)段修飾該載體基因組或反義基因組形成嵌合性結(jié)構(gòu)。更具體說，通過基于cDNA的病毒回收系統(tǒng)構(gòu)建本發(fā)明嵌合性病毒，該回收系統(tǒng)產(chǎn)生摻入與編碼異源抗原決定簇的一種或多種“供體”核苷酸序列相結(jié)合的部分或整個(gè)載體或“背景”病毒基因組或反義基因組。在示例性實(shí)施方式中，修飾非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒載體基因組或反義基因組，使其摻入編碼一種或多種異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒(如HPIV、HMPV、MV或RSV)和/或非病毒病原體的抗原決定簇的一種或多種基因或基因組節(jié)段。這樣構(gòu)建的本發(fā)明嵌合性病毒可引發(fā)針對(duì)特異性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒(如HPIV1、HPIV2、HPIV3、RSV-A、RSV-B、HMPV或MV)或針對(duì)非病毒病原體的免疫應(yīng)答?；蛘?，提供采用嵌合性病毒的組合物和方法能引發(fā)針對(duì)多個(gè)非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒(例如，多個(gè)HPIV，或者HPIV和RSV或MV)的多特異性免疫應(yīng)答的組合物和方法。在又一實(shí)施方式中，提供了用嵌合性病毒引發(fā)抗節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒(如流感A或B或冠狀病毒)、正鏈RNA病毒(如披膜病毒、α病毒(包括腦炎病毒)、黃病毒(包括西尼羅河病毒、登革熱病毒)，和小核糖核酸病毒(包括脊髓灰質(zhì)炎病毒和其它腸道病毒))或DNA病毒(如單純皰疹和帶狀皰疹病毒、乙型肝炎病毒、EB病毒和細(xì)胞巨化病毒)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
在更詳細(xì)方面，部分或整個(gè)載體基因組或反義基因組通常的作用是作為骨架摻入到不同病原體的異源基因或基因組節(jié)段中。異源病原體常常是不同的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，這些病毒的一種或多種基因或基因組節(jié)段與載體基因組或反義基因組相組合或被取代。除提供新免疫特性之外，在載體病毒中加入或代之以異源基因或基因組節(jié)段，與未修飾的載體和供體病毒的相應(yīng)表型相比可產(chǎn)生減毒提高或降低、生長(zhǎng)改變或其它所需表型改變。
引入異源免疫原性蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域和免疫原性表位以產(chǎn)生嵌合性病毒，對(duì)于在免疫宿主中產(chǎn)生新免疫應(yīng)答尤其有用。在受體載體基因組或反義基因組中加入或代之以一種供體病原體的免疫原性基因或基因組節(jié)段可產(chǎn)生針對(duì)該供體病原體、該載體或這二者的免疫應(yīng)答。
對(duì)于HPIV3已開發(fā)了用于工程改造嵌合性病毒的通用方法和組合物(Durbin等，Virology 235323-332，1997；Skiadopoulos等，J.Virol.721762-1768，1998；Tao等，J Virol 722955-2961，1998；Skiadopoulos等，J.Virol.731374-1381，1999；Skiadopoulos等，Vaccine 18503-510，1999；Tao等，Vaccine171100-1108，1999；Tao等，Vaccine 181359-1366，2000；1998年5月22日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/459,062；1997年5月23日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/047,575(對(duì)應(yīng)于國際公告號(hào)WO 98/53078)和1997年9月19日美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/059,385，各自引入本文作為參考)。具體說，上述引入的參考文獻(xiàn)描述了嵌合性PIV重組病毒的構(gòu)建，例如HPIV 1的HN和F基因被取代為部分HPIV3背景基因組或反義基因組，再經(jīng)進(jìn)一步修飾使其攜帶有在HPIV3 JS cp45中鑒定的一種或多種減毒突變。一種這類嵌合性重組病毒摻入了在異源(HPIV1)HN和F基因以外cp45的L基因中鑒定的所有減毒突變，產(chǎn)生了一種減毒的候選嵌合病毒。在上述引入的參考文獻(xiàn)中對(duì)于RSV提供了產(chǎn)生嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的其它代表性內(nèi)容。
也可構(gòu)建表達(dá)嵌合性蛋白，如對(duì)融合有不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒或非病毒病原體的異源胞外結(jié)構(gòu)域的載體具有特異性胞質(zhì)尾和/或跨膜結(jié)構(gòu)域的免疫原性糖蛋白的本發(fā)明嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，提供的融合蛋白能引發(fā)抗該異源病原體的免疫應(yīng)答。例如，可將編碼HPIV1或HPIV3的HN糖蛋白胞外結(jié)構(gòu)域或F糖蛋白的異源基因組節(jié)段與編碼相應(yīng)HPIV2 HN或F糖蛋白胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的基因組節(jié)段連接，形成的HPIV2-1或HPIV2-3嵌合性糖蛋白引發(fā)抗HPIV1或HPIV3的免疫應(yīng)答。在更詳細(xì)的實(shí)施方式中，該異源基因組節(jié)段編碼糖蛋白胞外結(jié)構(gòu)域或其免疫原性部分或表位，任選地還可包含異源糖蛋白或“供體”糖蛋白的其它部分，例如被載體基因組或反義基因組中對(duì)應(yīng)的糖蛋白胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域取代的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)。Tao等于1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/459,062中說明了有關(guān)本發(fā)明這些方面的其它詳情，引入本文作為參考。
本發(fā)明的這種嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的另一例子，是表達(dá)有效促進(jìn)該重組病毒與靶細(xì)胞膜融合的異源融合蛋白或其多肽片段的嵌合性蛋白，其與編碼病毒G蛋白一部分，具體是該蛋白的羧基端近膜胞外區(qū)(“尾”)部分的cDNA融合。在一個(gè)實(shí)施方式中，該異源融合蛋白是CD4，所述病毒是VSV。Whitt等于2002年12月24日發(fā)表的美國專利號(hào)6,497,873中說明了有關(guān)本發(fā)明這些方面的其它詳情，引入本文作為參考。
本文所用術(shù)語“基因”一般指編碼mRNA的非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒基因組的一部分，它一般在上游端的基因起始(GS)信號(hào)處開始，在下游端的基因終止(GE)信號(hào)處終止。術(shù)語基因也可與術(shù)語“翻譯開放閱讀框”或ORF互換使用，尤其是當(dāng)?shù)鞍子闪硪籓RF而非獨(dú)特的mRNA表達(dá)時(shí)。病毒基因組也含有基因外前導(dǎo)區(qū)和尾隨區(qū)，具有病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的啟動(dòng)子部分，以及非編碼和基因間區(qū)。轉(zhuǎn)錄在3’端開始，并通過依次的停止-啟動(dòng)機(jī)制進(jìn)行，該機(jī)制受基因邊界處的短保守基序指導(dǎo)。各基因的上游端含有基因起始(GS)信號(hào)，它指導(dǎo)其對(duì)應(yīng)mRNA的啟動(dòng)。各基因的下游端含有指導(dǎo)聚腺苷酸化和終止的基因終止(GE)基序。
“基因組節(jié)段”指任意長(zhǎng)度的PIV基因組的連續(xù)核苷酸，可以是ORF、基因或基因外區(qū)的一部分，或它們的組合。當(dāng)所述基因組節(jié)段編碼抗原決定簇時(shí)，該基因組節(jié)段編碼至少一個(gè)能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫原性表位。該基因組節(jié)段也可編碼免疫原性片段或蛋白結(jié)構(gòu)域。在其它方面，供體基因組節(jié)段可編碼多個(gè)免疫原性結(jié)構(gòu)域或表位，包括經(jīng)重組方法合成的含多個(gè)、重復(fù)或不同的免疫原性結(jié)構(gòu)域或表位的序列。
對(duì)于人PIV3株JS(GenBank登錄號(hào)Z11575，引入本文作為參考)和Washington(Galinski M.S.Kingsbury，D.W.(編)，《副粘病毒》(TheParamyxoviruses)，第537-568頁，Plenum Press，New York，1991，引入本文作為參考)；HPIV1/Wash64(GenBank登錄號(hào)AF457102，引入本文作為參考)；HPIV2(2002年9月18日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/412,053，引入本文作為參考)；牛PIV3(BPIV3)株910N(GenBank登錄號(hào)D80487，引入本文作為參考)；BPIV3堪薩斯(GenBank登錄號(hào)AF178654，引入本文作為參考)；BPIV航運(yùn)熱(GenBank登錄號(hào)AF178655，引入本文作為參考)；RSV A2(GenBank登錄號(hào)AF035006，引入本文作為參考)；和HMPV(GenBank登錄號(hào)AF371337，引入本文作為參考)已描述了用于構(gòu)建本發(fā)明的嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的示例性異源病毒基因組序列。例如，在1998年5月22日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/083,793；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/458,813；1999年12月10日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/459,0629；1997年5月23日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/047,575(對(duì)應(yīng)于國際公告號(hào)WO98/53078)，1997年9月19日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/059,385；1999年12月10日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/170,195；和2000年12月8日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)09/733,692(對(duì)應(yīng)于國際公告號(hào)WO 01/42445A2)中提供了關(guān)于構(gòu)建用于本發(fā)明的嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的其它詳情，各自引入本文作為參考。
可容易地修飾本發(fā)明的嵌合性非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，使其表達(dá)廣范圍病原體的一種或多種主要抗原決定簇。在此方面，本發(fā)明提供了開發(fā)的摻入有下述病毒抗原決定簇能夠引發(fā)有效的抗下述病毒的免疫應(yīng)答的重組病毒呼吸道合胞病毒(RSV)亞組A和亞組B、HMPV、麻疹病毒、人肺炎后病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎后病毒(metapneuomovirus)、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、冠狀病毒(如SARS相關(guān)人冠狀病毒)、α病毒和流感病毒等其它病原體?？勺鳛殚_發(fā)本發(fā)明方法所用免疫原性組合物的靶標(biāo)的病原體包括病毒和細(xì)菌病原體，以及原生動(dòng)物和多細(xì)胞細(xì)胞病原體。本文所述可用于摻入本發(fā)明嵌合性病毒中的許多重要人病原體的有用抗原決定簇是已知的或不難鑒定。因此，已鑒定了上述示例性病原體的主要抗原，包括麻疹病毒HA和F蛋白；RSV的F、G、SH和M2蛋白，腮腺炎病毒HN和F蛋白，人乳頭瘤病毒L1、L2、E6或E7蛋白，1型和2型人免疫缺陷病毒gpl20和gpl60蛋白，單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM蛋白，狂犬病病毒G蛋白，人肺炎后病毒F和G蛋白，EB病毒gp350蛋白；線狀病毒G蛋白，布尼亞病毒G蛋白，黃病毒E和NS1蛋白，肺炎后病毒G和F蛋白，冠狀病毒刺突(S)和小膜(E)蛋白，和α病毒E蛋白。已良好地表征了這些主要抗原，以及所列病原體和其它病原體的本領(lǐng)域已知的其它抗原，對(duì)它們的許多抗原決定簇，包括全長(zhǎng)蛋白和它們的組成性免疫原性結(jié)構(gòu)域、片段和表位作了鑒定、繪圖，并表征了各自的免疫原活性。
在鑒定和表征用于本發(fā)明的各種病原體主要抗原的眾多示例性繪圖研究中，表位作圖研究了HPIV3的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因(van Wyke Coelingh等，J.Virol.611473-1477，1987，引入本文作為參考)。該報(bào)道利用抗HN蛋白的單克隆抗體(MAb)(抑制神經(jīng)氨酸酶、血凝或二者活性)對(duì)選出的HPIV3變體的16個(gè)抗原變體作了詳細(xì)的抗原結(jié)構(gòu)分析。各變體在HN基因中含有的單-點(diǎn)突變編碼HN蛋白中的一個(gè)氨基酸取代。HN蛋白的操作性和拓?fù)鋵W(xué)圖譜與取代的相對(duì)位置良好相關(guān)。HN蛋白的計(jì)算機(jī)輔助分析預(yù)測(cè)出二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要由隨機(jī)親水性螺旋結(jié)構(gòu)互連的疏水β折疊組成。HN表位位于預(yù)測(cè)的螺旋區(qū)。抑制該病毒神經(jīng)氨酸酶活性的Mab所識(shí)別的表位位于一個(gè)似乎在幾種副粘病毒HN蛋白中結(jié)構(gòu)保守的區(qū)域可能代表了HN分子的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)。
采用常規(guī)抗原作圖方法的此示例性工作，鑒定了對(duì)HN表位完整性很重要的一個(gè)氨基酸。大多數(shù)這些表位位于該分子的C-末端一半，正如所料，一個(gè)蛋白錨定在其N末端(Elango等，J.Virol.57481-489，1986)。以前發(fā)表的PIV3 HN的操作性和拓?fù)鋱D說明所用Mab識(shí)別出組成兩個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上分離的位點(diǎn)(A和B)的六組不同的表位(I至VI)，它們通過第三位點(diǎn)(C)部分橋接。這些表位組代表了可單獨(dú)或以各種組合方式摻入本發(fā)明嵌合病毒中的有用候選抗原決定簇(也參見Coelingh等，Virology 143569-582，1985；Coelingh等，Virology 162137-143，1988；Ray等，Virology 148232-236，1986；Rydbeck等，J.Gen.Virol.671531-1542，1986，各自引入本文作為參考)。
var Wyke Coelingh等(J.Virol.63375-382，1989)進(jìn)行的其它研究提供了有關(guān)選擇用于本發(fā)明的PIV抗原決定簇的進(jìn)一步信息。在本研究中，用26個(gè)單克隆抗體(MAb)(14個(gè)中和性和12個(gè)非中和性)檢查HPIV3融合(F)糖蛋白的抗原結(jié)構(gòu)、生物學(xué)性質(zhì)和天然變異。對(duì)實(shí)驗(yàn)室選擇的抗原變體和PIV3臨床分離物的分析說明該組MAb識(shí)別至少20個(gè)表位，其中14個(gè)參與中和。競(jìng)爭(zhēng)型結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)了這14個(gè)中和表位組成了3個(gè)非重疊的主要抗原區(qū)(A、B和C)和一個(gè)橋聯(lián)位點(diǎn)(AB)，6個(gè)非中和表位形成四個(gè)位點(diǎn)(D、E、F和G)。大多數(shù)中和性MAb參與非相互競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，提示它們引起了其它中和表位中的構(gòu)象改變。
已鑒定并表征了用于本發(fā)明的呼吸道合胞病毒(RSV)的其它抗原決定簇。例如，Beeler等，J.Virol.632941-2950，1989，引入本文作為參考，利用十八種對(duì)RSV A2株的融合糖蛋白的特異性中和單克隆抗體(MAb)構(gòu)建了涉及RSV中和和融合表位的詳細(xì)拓?fù)浜筒倏v性圖。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)鑒定到三個(gè)非重疊抗原區(qū)(A、B和C)和一個(gè)橋聯(lián)位點(diǎn)(AB)。選出了十三種MAb抗性突變體(MARM)，MAb與MARM或RSV臨床株的中和模式鑒定到至少16個(gè)表位。用抗六個(gè)位點(diǎn)A和AB表位的抗體選出的MARM顯示了小噬斑表型，這與F分子的生物活性區(qū)中的改變相一致。MARM分析也表明這些中和表位占據(jù)了拓?fù)鋵W(xué)上不同但構(gòu)象上相互依賴的區(qū)域，具有獨(dú)特的生物學(xué)和免疫學(xué)性能。然后，在交叉中和試驗(yàn)中用18個(gè)抗F MAb檢測(cè)23個(gè)臨床分離物(18個(gè)亞組A和5個(gè)亞組B)F表位中的抗原性改變。該分析鑒定了該分子上的恒定、可變和超變區(qū)，表明RSV F糖蛋白中和表位中的抗原性改變是非累積性遺傳異源性的結(jié)果。這16個(gè)表位中，8個(gè)在所有23個(gè)亞組A或亞組B臨床分離物(除一個(gè)外)中是保守的。這些抗原決定簇包括全長(zhǎng)蛋白和它們的組成性抗原結(jié)構(gòu)域、片段和表位，都代表了用于整合入本發(fā)明上述嵌合病毒中以引發(fā)新免疫應(yīng)答的有用候選病毒。(也參見Anderson等，J.Infect.Dis.151626-633，1985；Coelingh等，J.Virol.63375-382，1989；Fenner等，Scand.J.Immunol.24335-340，1986；Fernie等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.171266-271，1982；Sato等，J.Gen.Virol.661397-1409，1985；Walsh等，J.Gen.Virol.67505-513，1986；Olmsted等，J.Virol.63411-420，1989，美國專利號(hào)5,639,853，各自引入本文作為參考)。
為在嵌合非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中表達(dá)異源病原體的抗原決定簇，本發(fā)明提供了許多方法和構(gòu)建物。在某些詳述實(shí)施方式中，將含有編碼抗原蛋白的基因(如麻疹病毒HA基因)的開放閱讀框(ORF)的轉(zhuǎn)錄單元加入載體基因組或反義基因組的不同位置中。在下面所述的示例性實(shí)施方式中，工程改造嵌合病毒，使其摻入編碼呼吸道合胞病毒(RSV)的保護(hù)性抗原的異源核苷酸序列以產(chǎn)生候選感染性減毒病毒。摻入一種或多種RSV抗原決定簇的嵌合非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒一般含有與編碼RSV抗原糖蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域(如糖蛋白胞外結(jié)構(gòu)域)或一種或多種免疫原性表位的異源基因或基因組節(jié)段相組合的載體基因組或反義基因組。在下面說明的一個(gè)實(shí)施方式中，將RSV F和/或G基因的一種或多種基因或基因組節(jié)段與不同亞型的RSV載體基因組或反義基因組相組合，以形成嵌合性(如RSV A/B嵌合)病毒。
相對(duì)其它病毒載體構(gòu)建物，本發(fā)明的嵌合載體構(gòu)建物提供了某些優(yōu)點(diǎn)。用作載體的大多數(shù)其它單分子負(fù)鏈RNA病毒并非衍生自人病原體(如鼠PIV1(仙臺(tái)病毒)(Sakai等，F(xiàn)EBS Lett.456221-6，1999)、屬于牛病原體的水泡性口炎病毒(VSV)(Roberts等，J.Virol.724704-11，1998)和犬PIV2(SV5)He等，Virolo 237249-60，1997))。對(duì)于這些非人病毒，其載體骨架上提呈的抗原只能產(chǎn)生很少或很弱的對(duì)任何人類病毒的免疫力。因此，表達(dá)人病原體額外基因的非人病毒載體只能誘導(dǎo)抗一種人病原體的抵抗力(然而，在一些情況下可能需要這種抵抗力)。
此外，可通過模擬天然感染的鼻內(nèi)給藥途徑給予受試者本發(fā)明方法(例如，基于RSV或HPIV)回收的許多嵌合性載體病毒。因此，本發(fā)明的病毒和免疫原性組合物將誘導(dǎo)粘膜和全身性免疫力，并降低新生兒中來自母親的血清IgG的中和免疫抑制作用。
如上所述，本發(fā)明包括對(duì)重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的廣泛修飾，產(chǎn)生規(guī)定所需表型改變的明確突變。在本發(fā)明的更詳細(xì)方面，將這些明確突變引入所述病毒基因組或反義基因組的cDNA拷貝，一般采用基因組或反義基因組cDNA亞片段組裝完整的基因組或反義基因組cDNA。該構(gòu)建方法具有的優(yōu)點(diǎn)是可分別操作基因組或反義基因組的各區(qū)域，其中小cDNA構(gòu)建物比大cDNA構(gòu)建物更易于操作，因此可容易地組裝成完整的cDNA。因此，可將完整的反義基因組或基因組cDNA，或其所選亞片段用作寡核苷酸定向誘變的模板。這可通過單鏈?zhǔn)删Ｐ问降慕閷?dǎo)，如用Bio-RadLaboratories(Richmond，CA)的MUTA-gene_試劑盒，或直接將雙鏈質(zhì)粒用作模板的方法如Strategene(La Jolla，CA)的CHAMELEON_誘變?cè)噭┖?，或通過采用含有感興趣突變的寡核苷酸引物或模板的聚合酶鏈反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。然后，可將突變的亞片段組裝成完整的反義基因組或基因組cDNA。各種其它誘變技術(shù)是已知的，可常規(guī)采納用于在本發(fā)明病毒反義基因組或基因組cDNA中產(chǎn)生感興趣突變。
因此，在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用購自Bio-Rad Laboratories的MUTA-gene_噬菌粒體外誘變?cè)噭┖姓T導(dǎo)這些突變。簡(jiǎn)要說，將編碼PIV基因組或反義基因組的cDNA克隆入質(zhì)粒pTZ18U，用于轉(zhuǎn)化CJ236細(xì)胞(Life Technologies)。如產(chǎn)生商所推薦地制備噬菌粒制品。通過將改變的核苷酸引入該基因組或反義基因組的所需位置設(shè)計(jì)用于誘變的寡核苷酸。然后擴(kuò)增含有基因組或反義基因組遺傳上改變的質(zhì)粒。
對(duì)本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因或基因組節(jié)段進(jìn)行與相同或不同病毒或其它來源的現(xiàn)有“對(duì)應(yīng)”基因或基因組節(jié)段的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)的某些取代、插入、缺失或重排(例如，對(duì)編碼所選蛋白或蛋白區(qū)域，如胞質(zhì)尾、跨膜結(jié)構(gòu)域或胞外結(jié)構(gòu)域，表位位點(diǎn)或區(qū)域，結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)域，活性位點(diǎn)或含有活性位點(diǎn)的區(qū)域等的基因組節(jié)段進(jìn)行取代)。這種修飾產(chǎn)生的新重組病毒與野生型或親代病毒株相比具有所需的表型改變。例如，此類型重組病毒可表達(dá)具有與異源病毒胞外結(jié)構(gòu)域融合的一種非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的胞質(zhì)尾和/或跨膜結(jié)構(gòu)域的嵌合性蛋白。其它此類型示例性重組病毒表達(dá)重復(fù)的蛋白區(qū)域，如重復(fù)的免疫原性區(qū)域。
本文所用的“對(duì)應(yīng)”基因、基因組節(jié)段、蛋白或蛋白區(qū)域，一般為異源來源(例如，來自不同基因，或代表不同種病毒或毒株的相同(即同源或等位)基因或基因組節(jié)段)。本文所選擇的典型對(duì)應(yīng)物共同具有大體的結(jié)構(gòu)特征，例如，各對(duì)應(yīng)物可編碼相當(dāng)?shù)牡鞍谆虻鞍捉Y(jié)構(gòu)域，如胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外結(jié)構(gòu)域、結(jié)合位點(diǎn)或區(qū)域、表位位點(diǎn)或區(qū)域等。對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域及其編碼基因組節(jié)段包括的組裝種類，具有由所述結(jié)構(gòu)域或基因組節(jié)段變體共同生物學(xué)活性而限定的大小和序列變化種類的組裝。
本文公開的用于產(chǎn)生本發(fā)明重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的對(duì)應(yīng)基因和基因組節(jié)段，以及其它多核苷酸，與所選多核苷酸“參比序列”，例如與另一所選對(duì)應(yīng)序列常常在序列上基本相同。本文所用的“參比序列”定義為用作序列比較的基礎(chǔ)序列，例如，全長(zhǎng)cDNA或基因的某節(jié)段，或完整的cDNA或基因序列。通常，參比序列的長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸，常常長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸，經(jīng)常長(zhǎng)度為至少50個(gè)核苷酸。由于兩種多核苷酸可各自(1)包含在這兩種多核苷酸之間相似的序列(即整個(gè)多核苷酸序列的一部分相似)，和(2)還可包含在這兩種多核苷酸之間不同的序列，對(duì)兩種(或多種)多核苷酸之間的序列比較一般是比較這兩種多核苷酸的“比較窗口”中的序列，以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。本文所用的，“比較窗口”指至少含20個(gè)連續(xù)核苷酸位置的概念性節(jié)段，其中可將某多核苷酸序列與至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的參比序列進(jìn)行對(duì)比。對(duì)于兩個(gè)序列的最優(yōu)排列對(duì)比而言，該多核苷酸序列的比較窗口中的部分序列與參比序列(不含有添加或缺失)相比，可含有20％或更少的添加或缺失(即缺口)。對(duì)于比較窗口中序列的最優(yōu)排列對(duì)比，可采用Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性對(duì)比算法(J.Mol.Biol.48443，1970)，Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444，1988)(各自引入本文作為參考)，通過計(jì)算機(jī)實(shí)施這些算法(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，575 Science Dr.，Madison，WI，引入本文作為參考)，或通過查看所選各種方法產(chǎn)生的最佳對(duì)比(即產(chǎn)生比較窗口序列相似性的最高百分?jǐn)?shù))進(jìn)行最優(yōu)的序列對(duì)比。術(shù)語“序列相同性”指兩個(gè)多核苷酸序列在比較窗口中是相同的(即核苷酸-核苷酸相同)。術(shù)語“序列相同性百分?jǐn)?shù)”的計(jì)算如下通過比較兩個(gè)最優(yōu)排列的序列在比較窗口中的對(duì)比序列，確定兩個(gè)序列中具有相同核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)的位置數(shù)，以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以比較窗口的位置總數(shù)(即窗口大小)，將該結(jié)果乘以100即產(chǎn)生序列相同性百分?jǐn)?shù)。本文所用的術(shù)語“基本相同性”指某多核苷酸序列的特征，其中將該多核苷酸所含的序列與參比序列比較窗口中的至少20個(gè)核苷酸位置、常常為至少25-50個(gè)核苷酸相比，具有至少70％序列相同性、常常是85％序列相同性、有時(shí)至少90-95％序列相同性和高達(dá)至少99％序列相同性，其中通過將參比序列與可包含參比序列對(duì)比窗口總共20％或更少的缺失或添加的多核苷酸序列作比較，計(jì)算出序列相同性百分?jǐn)?shù)。參比序列可以是某較大序列的亞組。
除了這些多核苷酸序列的相關(guān)性之外，通常還選擇本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒編碼的蛋白和蛋白區(qū)域，與所選參比多肽具有保守性關(guān)系，即與所選參比多肽具有基本上的序列相同性或序列相似性。應(yīng)用于多肽時(shí)術(shù)語“序列相同性”指二種肽在相應(yīng)位置具有相同的氨基酸。術(shù)語“序列相似性”指二種肽在相應(yīng)位置具有相同或相似的氨基酸(即保守取代)。術(shù)語“基本上序列相同性”指當(dāng)，如采用默認(rèn)缺口權(quán)衡的GAP或BESTFIT程序進(jìn)行最優(yōu)排列對(duì)比時(shí)，兩個(gè)肽序列具有至少70％的序列相同性，常常為80％序列相同性，有時(shí)至少為90％序列相同性，和高達(dá)至少95％序列相同性或更高(例如，99％序列相同性)。術(shù)語“基本上相似”指兩個(gè)肽序列具有相應(yīng)百分?jǐn)?shù)的序列相似性。常通過保守氨基酸取代使不相同的殘基位置不相同。保守氨基酸取代指具有類似側(cè)鏈的殘基可互換。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸組內(nèi)取代包括纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所用的二十種天然產(chǎn)生的氨基酸的縮寫遵循其常規(guī)用法(《免疫學(xué)-合成》Immunology-A synthesis，第二版，E.S.Golub和D.R.Gren編，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991，引入本文作為參考)。二十種常規(guī)氨基酸、非天然氨基酸如α，α-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)也可以是本發(fā)明多肽的合適組分。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N、N、N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙?；嚢彼?、O-磷脂酰絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、間-N-甲基精氨酸和其它類似氨基酸和亞氨基酸(如4-羥基脯氨酸)。而且，可通過糖基化、磷酸化等修飾氨基酸。
為選擇本發(fā)明的候選病毒，根據(jù)熟知方法確定活力、減毒和免疫原性的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明免疫原性組合物中最需要的病毒必須維持活力，具有穩(wěn)定的減毒表型，顯示能在免疫的宿主中復(fù)制(雖然水平較低)和能在接受者中有效引發(fā)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，使其足以引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒不僅是活的適當(dāng)減毒的病毒，它們?cè)隗w內(nèi)遺傳上更穩(wěn)定-維持激發(fā)免疫應(yīng)答和在一些情況下擴(kuò)大多種修飾所引發(fā)的免疫應(yīng)答的能力，例如，誘導(dǎo)抗不同病毒株或亞組的免疫應(yīng)答，或激發(fā)不同免疫基礎(chǔ)，如分泌性免疫球蛋白與血清免疫球蛋白、細(xì)胞免疫等介導(dǎo)的應(yīng)答。
可以在各種熟知和廣為接受的體外和體內(nèi)模型中測(cè)試本發(fā)明的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，以驗(yàn)證其足夠減毒、對(duì)表型逆轉(zhuǎn)的抗性和免疫原性。在體外試驗(yàn)中，測(cè)試該修飾病毒(如經(jīng)多重減毒的、生物學(xué)方法產(chǎn)生的或重組的病毒)的病毒復(fù)制溫度敏感性，即ts表型，和小噬斑或其它所需表型。還在病毒感染的動(dòng)物模型中測(cè)試該修飾病毒。本文引用的各種參考文獻(xiàn)中描述并總結(jié)了各種動(dòng)物模型，包括評(píng)價(jià)用于免疫原性組合物和方法中的候選病毒的減毒和免疫原活性的有用的嚙齒類和非人靈長(zhǎng)類模型。這些模型是本領(lǐng)域廣泛接受的，從它們獲得的數(shù)據(jù)與本發(fā)明所述病毒在人中感染性、減毒和免疫原性良好相關(guān)。
根據(jù)以上描述，本發(fā)明也提供用于免疫原性組合物中的分離的感染性重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。作為免疫原性組合物一種組分的減毒病毒是分離的和純化形式。分離的指不是從野生型病毒天然環(huán)境中，如感染個(gè)體的鼻咽部中分離得到的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。更通常地，分離的指所包含的減毒病毒為以控制方式在細(xì)胞培養(yǎng)物或其它人工培養(yǎng)基中增殖并經(jīng)特征鑒定的一個(gè)組分。例如，可從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，加入穩(wěn)定劑來產(chǎn)生本發(fā)明的減毒非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
為用于免疫原性組合物，可將本發(fā)明產(chǎn)生的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒直接用于制劑中，或如需要用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的凍干方法凍干。凍干的病毒一般保存在約4℃。當(dāng)準(zhǔn)備使用時(shí)，如下所述穩(wěn)定溶液，如鹽水或含有SPG、Mg++和HEPES的溶液中重建凍干病毒，加或不加佐劑。
本發(fā)明的免疫原性組合物含有免疫學(xué)有效量的如本文所述產(chǎn)生的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，作為其活性成分?？捎蒙韺W(xué)可接受的載體和/或佐劑將該修飾病毒引入宿主。有用的載體是本領(lǐng)域熟知的，包括例如水、緩沖液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等?？砂b所獲的水溶液，即用形式，或凍干后使用，在給予前將凍干制劑與無菌溶液混合，如上所述。如需要接近生理?xiàng)l件，該組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑、濕潤劑等，如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖酯，油酸三乙醇胺酯等?？山邮艿淖魟┌ú煌耆ナ献魟?、MPLTM(3-O-脫酰基單磷酰脂A；Corixa，Hamilton MT)和IL-12(Genetics Institute，Cambridge MA)等本領(lǐng)域熟知的許多其它合適佐劑。
當(dāng)如本文所述用重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒組合物免疫時(shí)(例如，通過氣霧劑、滴劑、口服、局部、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、肺、皮下，靜脈內(nèi)或其它途徑)，宿主的免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生所述病毒或病毒載體構(gòu)建物的特異性抗體而對(duì)該免疫原性組合物作出應(yīng)答反應(yīng)。用免疫學(xué)有效量的如本文所述產(chǎn)生的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒免疫的結(jié)果是，宿主對(duì)靶病毒感染至少產(chǎn)生部分或完全的免疫力，或?qū)Πl(fā)展成中度或嚴(yán)重感染產(chǎn)生抵抗力。
給予該免疫原性組合物的宿主可以是易于受所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒(或?qū)τ谇逗闲暂d體構(gòu)建物而言是供體病毒)感染的和能夠?qū)γ庖哂玫牟《究乖a(chǎn)生免疫應(yīng)答的任何哺乳動(dòng)物宿主。因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)各種人用和獸醫(yī)用免疫原性組合物的方法。
將含有本發(fā)明重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的組合物給予易受所述病毒(或供體病毒)感染的或處于所述病毒(或供體病毒)感染危險(xiǎn)中的宿主，以增強(qiáng)宿主自身的免疫應(yīng)答能力。所用劑量定義為“免疫學(xué)有效劑量”。在此種應(yīng)用中，給予重組病毒有效劑量?jī)?nèi)的準(zhǔn)確量將取決于宿主的健康狀況和體重、給予方式、劑型特性等，但通常的劑量范圍是每個(gè)宿主約103至約107噬斑形成單位(PFU)的病毒或更多，更常為每個(gè)宿主約104至106PFU病毒。在任何情況下，這些制劑提供的本發(fā)明修飾的病毒量應(yīng)足以在宿主病人中引發(fā)抗所述病原體的可檢測(cè)的免疫應(yīng)答，例如，可通過血凝抑制、補(bǔ)體固定、噬斑中和和/或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等其它方法測(cè)定。
可將本發(fā)明產(chǎn)生的重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒與其它血清型或株的病毒結(jié)合，以引發(fā)所需的抗多種病毒血清型或株的免疫應(yīng)答?；蛘?，可如本文所述將多種血清型或株的保護(hù)性表位經(jīng)工程改造組合到一個(gè)病毒中而獲得抗多種病毒血清型或株的免疫應(yīng)答。一般當(dāng)給予不同病毒時(shí)，將它們混合同時(shí)給予，但也可分別給予。用一個(gè)毒株進(jìn)行免疫可能使(宿主)產(chǎn)生對(duì)相同或不同血清型不同株的免疫力。
在新生兒和嬰兒中，可能需要多次給予才能引發(fā)足夠水平的免疫力?？梢栽诔錾牡谝粋€(gè)月中開始給予，如需要維持對(duì)天然(野生型)病毒感染的免疫應(yīng)答，在整個(gè)兒童時(shí)期以一定間隔如兩個(gè)月、六個(gè)月、一年和兩年時(shí)給予。類似地，特別易患重復(fù)和嚴(yán)重感染的成年人，如衛(wèi)生保健工作者、日托工作者、幼兒的家庭成員、老年人、心肺功能不全的個(gè)體可能需要多次免疫才能建立和/或維持免疫應(yīng)答反應(yīng)。可通過測(cè)定中和性分泌和血清抗體的量來監(jiān)測(cè)所誘導(dǎo)的免疫力水平，如需要維持所需水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)可調(diào)整劑量或重復(fù)免疫。而且，對(duì)給予不同接受者群體而言，可采用不同的候選病毒。
在本發(fā)明的又一方面，將重組非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒用作，如呼吸道短時(shí)基因治療的載體。根據(jù)該實(shí)施方式，重組病毒基因組或反義基因組摻入了能夠編碼感興趣基因產(chǎn)物的序列。該感興趣基因產(chǎn)物處在相同或不同啟動(dòng)子的控制下，由該啟動(dòng)子控制病毒的表達(dá)。通過一種或多種上述給予途徑給予含有編碼感興趣基因產(chǎn)物的序列的感染性重組病毒。給予該病毒的量足以導(dǎo)致治療或預(yù)防水平的所需基因產(chǎn)物表達(dá)?？蓳饺朐撝亟M病毒并在本方法中給予的代表性基因產(chǎn)物一般是適合于短時(shí)表達(dá)的，包括例如白介素-2、白介素-4、γ-干擾素、GM-CSF、G-CSF、促紅細(xì)胞生成素等其它細(xì)胞因子，葡糖腦苷脂酶、苯丙氨酸羥化酶、囊腫性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞毒素、腫瘤抑制基因、反義RNA等其它候選抗原。
提供以下實(shí)施例，用于說明而非限制。
將本文引用的所有專利和出版物的內(nèi)容引入本文作為參考。
實(shí)施例I用于從Vero細(xì)胞中拯救非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的通用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法溶液下述溶液通?？捎糜谒拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)染280mM NaCl[16.4克NaCl(或56毫升5MNaCl)]，50mM BES[10.7克BES(不含酸形式)]和1.5mM磷酸鈉
的2×BBS(每L)溶液(2×BES-緩沖鹽水)。用NaOH將BBS溶液的pH調(diào)整為6.95-6.98。然后將該溶液過濾除菌并冷凍儲(chǔ)存。
配制每100毫升總體積含36.8克氯化鈣的2.5M CaCl2溶液，儲(chǔ)存于-20℃。用硝酸纖維素(膜)過濾除菌該溶液。避免使用醋酸纖維素濾膜，因?yàn)樗鼈儠?huì)阻塞?；蛘?，高壓滅菌該轉(zhuǎn)染溶液。然而，不大需要后一步驟，因?yàn)?×BBS溶液在高壓滅菌期間可能發(fā)生輕微改變。
通常可將下述溶液用作培養(yǎng)基DMEM的DMEM+FBS溶液(含谷氨酰胺的高葡萄糖；Gibco/BRL，[Grand Island，NY])，添加有10％熱滅活的合格的FBS，和10-20微克/毫升(任選可高達(dá)50微克/毫升)慶大霉素。
MEM的MEM+FBS溶液(補(bǔ)充有谷氨酰胺，非必需氨基酸，10％熱滅活的合格的FBS，和10-20微克/毫升(任選可高達(dá)50微克/毫升)的20-25mM Hepes緩沖液；Gibco/BRL)(Grand Island，NY)和任選地包括1X兩性霉素B)。
Hepes-緩沖鹽水洗滌溶液，20mM hepes，pH 7.0，150mM NaCl，1mM MgCl2的HBS溶液。
方法通常采用的宿主細(xì)胞可選自分裂性Vero細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前一天將該細(xì)胞置于DMEM+FBS中，使它們?cè)诘诙焐L(zhǎng)至大約50％鋪滿[對(duì)于RSV是80-90％鋪滿](在六孔板或12.5厘米2培養(yǎng)瓶中)。較高細(xì)胞密度運(yùn)作效率較低。第二天，在轉(zhuǎn)染前1-4小時(shí)向各培養(yǎng)物中加入4.5毫升DMEM+FBS。然后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3％CO2和32℃的CO2培養(yǎng)箱中。Vero細(xì)胞可培養(yǎng)過夜，只要它們?cè)谵D(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到約50％鋪滿。
如下所述獲得CaCl2/磷酸鹽沉淀在開始前將BBS和CaCl2維持在室溫下。在含有總體積250微升的5毫升聚丙烯管中制備DNA混合物，其中總共有2-20微克的質(zhì)粒DNA和25微升CaCl2。用于全長(zhǎng)拯救的DNA包括5微克所選非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建物，400納克N蛋白，300納克P蛋白，100-200納克L蛋白，200納克M2(僅對(duì)RSV)蛋白，和5-10微克pCl-Neo-Bcl-T7質(zhì)粒(SEQ ID NO1；圖2)。在Vero細(xì)胞中的拯救效率低，因此每個(gè)被拯救的全長(zhǎng)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染3-6個(gè)孔。
制備好所有DNA/CaCl2溶液后，加入2×BBS。這通常以連續(xù)低速渦旋溫和振蕩小管并沿小管側(cè)面逐滴加入250微升2XBBS完成。對(duì)所有小管重復(fù)這一操作，室溫再放置15-20分鐘以使DNA-磷酸鈣沉淀形成。室溫孵育后，將沉淀逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，搖動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布。然后將該培養(yǎng)基在3％CO2的培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)。3％CO2水平對(duì)BBS/CaCl2轉(zhuǎn)染技術(shù)而言是重要的；如果是5％CO2，作用就非常差。3％CO2控制了培養(yǎng)基的pH，得以在培養(yǎng)基中形成有效的磷酸鈣-DNA沉淀。
然后，任選地進(jìn)行熱激步驟，例如在開始轉(zhuǎn)染后3小時(shí)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到44℃的水浴中。將該細(xì)胞密封在塑料儲(chǔ)存袋中，使培養(yǎng)物完全浸沒在水中。44℃3小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回3％CO2的32℃培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。
第二天，去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用HBS洗滌細(xì)胞兩次。洗滌后，加入2毫升新鮮的DMEM+FBS。PBS和Hank氏緩沖液在該洗滌步驟中作用差，可能是因?yàn)檫@些緩沖液中的磷酸根引起了更多的CaCl2從轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中沉淀出來。
然后，任選地進(jìn)行共培養(yǎng)程序。在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞刮入培養(yǎng)基，將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有50％鋪滿的單層Vero細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中收集細(xì)胞。開始此共培養(yǎng)后6小時(shí)，用4毫升MEM+FBS替換舊培養(yǎng)基。然后，孵育培養(yǎng)物5天。如果在此孵育期間培養(yǎng)基開始顯示耗盡的跡象，就去除2毫升培養(yǎng)基并用新鮮的MEM+FBS替換。為了保存在拯救期間在培養(yǎng)基中可能存在的小量病毒，不推薦替換所有培養(yǎng)基。在這個(gè)共培養(yǎng)期間，CPE可能變得明顯，但不會(huì)如此。如果沒有明顯的CPE，則可繼續(xù)拯救。
開始共培養(yǎng)后5天，收集細(xì)胞。首先，將0.5毫升的2.18M蔗糖，37.6mM的KH2PO4，71.0mM K2HPO4，49.0mM谷氨酸鈉溶液加入培養(yǎng)基，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶混合之。然后將細(xì)胞刮入培養(yǎng)基中，用移液器上下吹打以混合，然后分成等份加入運(yùn)輸?shù)睦鋬龉苤?，然后在干?乙醇浴中快速冷凍，儲(chǔ)存于-80℃。
實(shí)施例II拯救副粘病毒的通用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法下述另一種轉(zhuǎn)染方法采用的磷酸鈣轉(zhuǎn)染操作程序是根據(jù)Chen和Okayama，Mol.Cell.Biol.72745-2752，1987的方法，引入本文作為參考。
示例性DNA1.全長(zhǎng)病毒基因組cDNA克隆含有與正義鏈的5’端融合的T7啟動(dòng)子和與3’端融合的核酶。
2.蛋白表達(dá)質(zhì)粒，受T7RNA聚合酶啟動(dòng)子控制，編碼核衣殼蛋白(N或NP)，磷蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)。
3.編碼在人巨細(xì)胞病毒立即早期轉(zhuǎn)錄控制區(qū)控制下的T7RNA聚合酶蛋白的質(zhì)粒。
示例性磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑1. 2X BES-緩沖鹽水50nM BES(pH 6.95-6.98)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4。
2. 2.5M CaCl2。
3.Hepes-緩沖鹽水洗滌溶液(HBS)示例性操作程序1.在六孔板中用含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)HEp2、Vero或其它合適細(xì)胞系，至細(xì)胞密度約50-75％鋪滿。
2.轉(zhuǎn)染前1-2小時(shí)，向待轉(zhuǎn)染各孔加入4.5毫升含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。
3.在3％CO2的32℃培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞。
4.如下所述制備磷酸鈣-DNA轉(zhuǎn)染混合物5.在5毫升聚丙烯管中混合以下DNA400納克T7-N、300納克T7-P、100納克T7L和5微克病毒基因組cDNA克隆、5微克hCMV-T7瞬時(shí)表達(dá)載體(如pCl-Neo-Bcl-T7質(zhì)粒)。對(duì)于RSV拯救而言，還包括100納克T7-M2(聚合酶延伸因子)表達(dá)質(zhì)粒。
6.用水將體積調(diào)整到225微升。
7.加入25微升2.5M CaCl2。
8.在溫和渦旋振蕩該小管的同時(shí)，加入250微升的2×BBS，然后讓該管在室溫下靜置15-20分鐘。
*注意，可能需要優(yōu)化各質(zhì)粒DNA的量以實(shí)現(xiàn)拯救。此外，雖然實(shí)施例I和II的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法在本發(fā)明中可廣泛使用，但是也可成功地采用其它轉(zhuǎn)染方法。
9.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，在溫和渦旋振蕩培養(yǎng)基的同時(shí)，將磷酸鈣-DNA混合物緩慢地加入培養(yǎng)基。立即將細(xì)胞放回32℃-3％CO2培養(yǎng)箱。
10.開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后3小時(shí)，將培養(yǎng)皿密封在塑料袋中，完全浸沒在44℃的水浴中3小時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞熱激反應(yīng)。該任選的熱激步驟常能提高拯救結(jié)果。然而，不同細(xì)胞類型對(duì)不同有效熱激溫度(例如，在約40-45℃的范圍內(nèi))或?qū)Σ煌行峒r(shí)間(例如，約30分鐘-3小時(shí)的范圍內(nèi))均由較好反應(yīng)。
11.熱激后，將細(xì)胞放回32℃-3％CO2培養(yǎng)箱，繼續(xù)孵育過夜。
12.第二天，用HBS洗滌細(xì)胞2次，給予細(xì)胞2毫升補(bǔ)充有10％FBS的DMEM或最低必需培養(yǎng)基(MEM)。
在此階段，該方法對(duì)于需要用胰蛋白酶來促進(jìn)病毒播散的一些PIV毒株是不同的。在48小時(shí)時(shí)，用PBS洗滌細(xì)胞以去除殘留的血清，用每毫升含有約0.5微克胰蛋白酶的無血清培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基。
13.開始轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用足夠的Vero細(xì)胞接種10厘米2板，以在第二天產(chǎn)生50％鋪滿的(細(xì)胞)單層(開始轉(zhuǎn)染后72小時(shí))。為各轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物準(zhǔn)備一個(gè)10厘米2板。
14.轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞刮入培養(yǎng)基中，將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到前一天準(zhǔn)備好的10厘米2板中。這就開始了在10厘米2板中共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和單層(細(xì)胞)。將該板在5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育；對(duì)溫度敏感型突變病毒采用適當(dāng)?shù)妮^低溫度。
15.4-6小時(shí)后，用補(bǔ)充有10％FBS的新鮮DMEM替換舊培養(yǎng)基。
16.監(jiān)測(cè)細(xì)胞5-7天，以檢測(cè)出現(xiàn)的細(xì)胞病變效應(yīng)。
實(shí)施例III在Vero細(xì)胞中拯救麻疹病毒(MV)用上述實(shí)施例I中所述的示例性轉(zhuǎn)染方法在Vero細(xì)胞中拯救麻疹病毒。T7來源是質(zhì)粒pSC6-T7(無MVA)或MVA/T7(Wyatt等，1995)。結(jié)果表明成功拯救了許多MV(+)，見下表3所示(A-F列表示在不同日期進(jìn)行的不同拯救實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)由多重轉(zhuǎn)染表示—實(shí)驗(yàn)E和F中有多達(dá)12個(gè)單獨(dú)轉(zhuǎn)染(孔))。
表3用質(zhì)粒-T7或MVA/T7拯救麻疹病毒 實(shí)施例IV用不同來源的聚合酶拯救麻疹病毒(MV)本實(shí)施例證明根據(jù)本文方法的瞬時(shí)T7聚合酶表達(dá)載體提供了足夠的T7RNA聚合酶表達(dá)水平，以支持病毒拯救。用上述實(shí)施例I的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。當(dāng)用T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行拯救時(shí)，將DNA與病毒特異性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。當(dāng)用MVA-T7(Wyatt等，Virology 210202-5，1995)感染提供T7RNA聚合酶時(shí)，在轉(zhuǎn)染的同時(shí)將病毒以感染復(fù)數(shù)2加入培養(yǎng)基進(jìn)行感染。Billeter等曾描述過用于此實(shí)驗(yàn)的T7表達(dá)質(zhì)粒(pSC6-T7)，(Radelce等，EMBO J.145773-5784，1995)。它含有在hCMV轉(zhuǎn)錄控制區(qū)控制下的T7RNA聚合酶基因。將瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pCI-Neo-Bcl-T7(SEQ ID NO1；圖2)用于本文所列的所有后續(xù)病毒拯救步驟中。本實(shí)施例所用的病毒基因組克隆是含有與麻疹病毒Edmonston實(shí)驗(yàn)室毒株相應(yīng)的cDNA序列的p(+)MV(Radecke等，EMBOJ.145773-5784，1995)。
下表4中顯示了拯救麻疹病毒的陽性結(jié)果。
表4用質(zhì)粒T7或MVA/T7拯救麻疹病毒
實(shí)施例V拯救重組副流感病毒(PIV)用上述實(shí)施例I中所述的T7質(zhì)粒拯救系統(tǒng)在Vero細(xì)胞中拯救嵌合性牛-人PIV-3(HBPIV3)毒株。此示例性PIV克隆含有人PIV-3的F和HN基因，作為牛PIV-3載體或骨架中的取代物。如標(biāo)準(zhǔn)的血凝(fHAD)試驗(yàn)所測(cè)定，五個(gè)獨(dú)立拯救樣品中五個(gè)均是陽性，fHAD試驗(yàn)是將感染細(xì)胞與豚鼠紅細(xì)胞(RBC)一起孵育來測(cè)定重組病毒的存在。通過跨M/F基因連接區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)果，證實(shí)該重組病毒是預(yù)計(jì)的人-牛雜交病毒。為進(jìn)行RT-PCR培養(yǎng)了2代病毒貯存物。該貯存物在Vero細(xì)胞中的滴度是5-10×107pfu/毫升。
除HBPIV3嵌合性病毒外，根據(jù)本發(fā)明方法拯救了幾種其它重組PIV構(gòu)建物，見下表5中所作的部分小結(jié)。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，從五個(gè)轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中拯救了減毒的嵌合性重組PIV毒株P(guān)IV3cp45(3-1)(含有HPIV3cp45的冷傳代突變和取代相應(yīng)PIV3基因的PIV 1的F和G糖蛋白基因)，然后用該病毒感染新鮮的單層細(xì)胞。病毒吸附后，將細(xì)胞維持在每毫升含0.5微克胰蛋白酶的無血清培養(yǎng)基中五天。然后對(duì)感染的培養(yǎng)物進(jìn)行血凝試驗(yàn)，感染了重組PIV的細(xì)胞能吸附RBC證實(shí)了陽性拯救結(jié)果。
表5
在另一示例性實(shí)施方式中，回收HPIV3-HPIV-2嵌合性構(gòu)建物，它含有與上述HPIV3胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的HPIV2 F和HN跨膜域和胞外結(jié)構(gòu)域的嵌合性糖蛋白(稱為PIV3-2CT)。從Vero細(xì)胞中回收此嵌合性構(gòu)建物，用RT-PCR和后續(xù)限制性位點(diǎn)分析確認(rèn)了該重組病毒的身份。
用本發(fā)明方法回收的其它PIV重組病毒包括稱為“航運(yùn)熱”(SF)的BPIV毒株(Reisinger等，J.Am.Vet.Med.Assoc.135147-152，1959，引入本文作為參考)和含有L基因中的減毒突變和負(fù)責(zé)冷傳代表型的突變的重組HPIV，稱為PIV3cp45-456。在Vero細(xì)胞中拯救這二種病毒，通過RT-PCR和測(cè)序確認(rèn)它們的身份。PIV3cp45-456在HN基因中含有兩個(gè)從前述在HN中含有兩個(gè)引入突變的PIV3cp45重組病毒校正的突變，因此背離了生物學(xué)方法產(chǎn)生的cp45突變體的序列。PIV3cp45-456克隆糾正了殘基263上取代的異亮氨酸和殘基370上取代的蘇氨酸這兩個(gè)突變，使其回復(fù)到生物學(xué)方法產(chǎn)生的分別編碼蘇氨酸和脯氨酸的基因型。
實(shí)施例VI在293細(xì)胞中拯救水泡性口炎病毒本發(fā)明的瞬時(shí)RNA聚合酶載體系統(tǒng)的精妙處在于能拯救用于免疫原性組合物中的所有重組負(fù)鏈RNA病毒。在以下實(shí)施例中，為回收水泡性口炎病毒(VSV)和相關(guān)的VSV載體毒株優(yōu)化該技術(shù)。雖然大多數(shù)VSV毒株在廣泛細(xì)胞系中非常有效地復(fù)制，但迄今，證明回收重組VSV是非常困難的。文獻(xiàn)中描述的VSV拯救方法特地采用BHK細(xì)胞系和牛痘病毒/T7輔助病毒，但對(duì)于人類臨床應(yīng)用產(chǎn)生免疫原性組合物所用的方法而言，這二者都不理想。
從合格的Vero細(xì)胞中拯救重組VSV的嘗試開始時(shí)采用組合的熱激/質(zhì)粒T7拯救方案(如上述拯救副流感病毒和麻疹病毒的方案)并不成功。認(rèn)為該系統(tǒng)的限制因素之一是轉(zhuǎn)染效率差，尤其是與Vero細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)染效率低下。熱激/質(zhì)粒T7拯救系統(tǒng)這兩種不同的修飾解決了這個(gè)問題。在一種修飾中，磷酸鈣轉(zhuǎn)染/熱激方法大部分未作改變，但采用了不同類型的宿主細(xì)胞。或者，用不同轉(zhuǎn)染方法來優(yōu)化Vero細(xì)胞拯救系統(tǒng)(參見實(shí)施例VII)。
簡(jiǎn)要說，采用上述基本的熱激/質(zhì)粒T7系統(tǒng)，根據(jù)以下修訂的操作程序?qū)崿F(xiàn)了從293細(xì)胞中成功拯救VSV。
試劑質(zhì)粒DNA1.全長(zhǎng)病毒基因組cDNA2.pT7-N3.pT7-P4.pT7-L5.pT7-M6.pT7-G7.pCI-Neo-bcl-T7(p0061)磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑1.2X BES-緩沖鹽水50mM BES(pH 6.95-6.98)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4。
2.2.5M CaCl2。
3.Hepes-緩沖鹽水洗滌溶液(HBS)20mM hepes(pH7.0-7.5)，140mM KCl，1mMMgCl2。
細(xì)胞培養(yǎng)溶液1.補(bǔ)充有10％合格的熱滅活FBS的DMEM(DMEM/FBS)。
2.補(bǔ)充有10％合格的熱滅活FBS的Iscoves改良的最低必需培養(yǎng)基(IMEM)(IMEM/FBS)。
3.聚L-賴氨酸0.01％溶于H2O。
4.PBS。
5.豬胰蛋白酶/EDTA。
步驟293細(xì)胞培養(yǎng)
293細(xì)胞難于培養(yǎng)，有許多不同方法處理它們。本方法已成功用作VSV和修飾的VSV載體構(gòu)建物拯救系統(tǒng)的一部分。
常規(guī)傳代培養(yǎng)1.去除培養(yǎng)基并用5毫升溫?zé)岬腜BS洗滌鋪滿的單層(細(xì)胞)(10厘米板)；用移液器沿培養(yǎng)皿側(cè)面溫和地加入，以防止細(xì)胞脫離(293細(xì)胞在室溫下太長(zhǎng)時(shí)間，或在變?yōu)閴A性(紅色)的培養(yǎng)基中會(huì)脫離)培養(yǎng)板。
2.溫和地加入2毫升胰蛋白酶，搖動(dòng)板使其覆蓋整個(gè)單層(細(xì)胞)。吸棄胰蛋白酶，讓培養(yǎng)板在室溫下靜置約1分鐘。將板傾斜到45度角，在通風(fēng)柜的工作面上拍打板，以使細(xì)胞脫離。如果細(xì)胞不脫離，在室溫下再孵育1分鐘(在這個(gè)階段確保細(xì)胞脫離，從而可避免用移液器劇烈吹打)。
3.溫和地加入5毫升DMEM/FBS，用移液器緩慢地上下吹打，以分散細(xì)胞。
4.將1毫升細(xì)胞加入含有9毫升DMEM/FBS的板中。
5.在37℃，5％CO2中孵育。
轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)1.用聚-L賴氨酸包被所需數(shù)量的板。每板加入約3-4毫升0.001％的聚-L賴氨酸，使板室溫靜置至少30分鐘。吸棄聚-L賴氨酸溶液。用5毫升培養(yǎng)基沖洗該板。
2.如上所述用胰蛋白酶消化細(xì)胞。采用在第二天產(chǎn)生50-75％鋪滿的板以(1∶3至1∶6)比例分瓶。
3.使細(xì)胞脫離后，加入IMEM/FBS，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有9毫升IMEM/FBS的包被板中。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞分瓶，在IMEM/FBS中培養(yǎng)過夜似乎是重要的。
4.在37℃，5％CO2中孵育。
轉(zhuǎn)染1.轉(zhuǎn)染前1-3小時(shí)，給予細(xì)胞9毫升IMEM/FBS，將細(xì)胞在3％CO2的32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.磷酸鈣-DNA轉(zhuǎn)染混合物的制備如下a.在5毫升聚丙烯管中混合以下DNAi.8微克T7-Nii.4微克T7-Piii.1.2微克T7Liv.1.0微克T7-M
v.1.0微克T7-Gvi.10微克病毒基因組cDNA克隆。
vii.10微克hCMV-T7表達(dá)載體。
b.用水調(diào)整體積至終體積為450微升。
c.加入50微升2.5M CaCl2。
d.在溫和渦旋振蕩該小管的同時(shí)，加入500微升2×BBS，然后讓該小管在室溫下靜置15-20分鐘。
3.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，將磷酸鈣-DNA混合物緩慢加入培養(yǎng)基中，溫和渦旋使沉淀分散。立即將細(xì)胞放回32℃-3％CO2培養(yǎng)箱。
4.開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后3小時(shí)，將培養(yǎng)皿密封在塑料袋中，完全浸沒在43℃的水浴中2小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞熱激反應(yīng)。
5.熱激后，將細(xì)胞放回32℃-3％CO2培養(yǎng)箱，繼續(xù)孵育過夜。
6.第二天，用HBS洗滌細(xì)胞2次，給予細(xì)胞10毫升IMEM/FBS。在37℃，5％CO2中孵育。
7.在開始轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，為將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較大容器中，準(zhǔn)備足夠的含有20毫升DMEM/FBS的T150培養(yǎng)瓶。一個(gè)T150培養(yǎng)瓶用于一個(gè)10厘米板的轉(zhuǎn)染。
8.用移液器溫和吹打單層(細(xì)胞)上的培養(yǎng)液使其從細(xì)胞面分離，轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞。避免劇烈吹打，用恰好足夠的力量分離細(xì)胞。細(xì)胞分離后，用移液器上下吹打約5次減小細(xì)胞團(tuán)大小，然后將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有20毫升IMEM/FBS的T150培養(yǎng)瓶中。
9.4-6小時(shí)后，用補(bǔ)充有10％FBS的新鮮DMEM替換舊培養(yǎng)基(注意，如果細(xì)胞沒有貼附到板上，可推遲此步驟到24小時(shí)。也可成功地跳過該步驟)。
10.監(jiān)測(cè)細(xì)胞5-7天，以檢測(cè)出現(xiàn)的細(xì)胞病變效應(yīng)。
11.當(dāng)明顯出現(xiàn)CPE時(shí)，將50微升培養(yǎng)基上清轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基和已建立了單層Vero細(xì)胞的六孔板孔中。如果發(fā)生拯救，第二天就可觀察到CPE。(注意，此步驟重要，因?yàn)?93細(xì)胞有時(shí)會(huì)從T150培養(yǎng)瓶的表面脫離，從而當(dāng)它們實(shí)際上并未被感染時(shí)看起來被VSV感染)。
12.將小樣品轉(zhuǎn)移到單層Vero細(xì)胞后，收集T150培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞和培養(yǎng)基并-70℃冷凍。通常用移液器吹打單層(細(xì)胞)上的培養(yǎng)基使細(xì)胞脫離，收集293細(xì)胞。
用上述修訂的操作程序，從293細(xì)胞中回收各種重組VSV構(gòu)建物。在本文中成功回收的VSV構(gòu)建物包括本文所述基礎(chǔ)VSV載體骨架構(gòu)建物，和含有HIV包膜基因或HIV gag基因的兩種修飾的VSV載體。因此，顯然本發(fā)明的瞬時(shí)RNA聚合酶載體系統(tǒng)在不同細(xì)胞類型中能適應(yīng)一定范圍的不同重組病毒，包括經(jīng)大量修飾的(如減毒和載體)構(gòu)建物。具體說，顯然293細(xì)胞可支持VSV的拯救而改進(jìn)的轉(zhuǎn)染效率對(duì)在其它細(xì)胞(如Vero細(xì)胞)中實(shí)現(xiàn)VSV拯救可能很重要。
值得注意，用進(jìn)一步修飾的方法，包括加入編碼所選病毒結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行了其它VSV和麻疹病毒的拯救實(shí)驗(yàn)。對(duì)VSV拯救而言，將表達(dá)G和M基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞(如在以上的修飾方案中所述)。對(duì)MV拯救而言，轉(zhuǎn)染混合物補(bǔ)充有編碼M、F和H的質(zhì)粒。因此認(rèn)為，本發(fā)明的任何一種非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的拯救可任選地包括共引入和/或共表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白，包括相同病毒或異源病毒、亞型或毒株的蛋白的任何一種或任何組合。
實(shí)施例VII通過替代的電穿孔-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染在Vero細(xì)胞中拯救水泡性口炎病毒為進(jìn)一步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率在本發(fā)明的瞬時(shí)RNA聚合酶表達(dá)系統(tǒng)中的作用，研究了電穿孔作為磷酸鈣轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞的替代方法。確定了電穿孔Vero細(xì)胞的條件，然后將其加入改良的熱激/質(zhì)粒-T7拯救方案中，詳述如下。
DNA制備1.對(duì)各電穿孔而言，在微量離心管中混合下述質(zhì)粒DNA50微克表達(dá)T7的質(zhì)粒(pCI-Neo-Bcl-T7)。
0微克VSV全長(zhǎng)質(zhì)粒。
8微克N質(zhì)粒。
4微克P質(zhì)粒。
1微克L質(zhì)粒。
1微克M質(zhì)粒(VSV)。
1微克G質(zhì)粒(VSV)。
同時(shí)制備熒光素酶轉(zhuǎn)染對(duì)照的DNA50微克(pCI-Neo-Bcl-T7)。
5微克T7-熒光素酶質(zhì)粒。
a)在生物安全柜工作條件下，用無菌、無核酸酶的水將DNA體積調(diào)整到250微升。
b)加入50微升3M乙酸鈉(pH 5)。
c)加入750微升100％乙醇，并混合。
d)在-20℃孵育1小時(shí)至過夜e)在微量離心管中，14,000rpm、4℃、離心20分鐘沉淀DNAf)在生物安全柜工作條件下，棄去上清，不要攪動(dòng)沉淀。
g)快速離心該管，收集管底殘留的乙醇，用移液器去除h)讓沉淀在空氣中干燥(在生物安全柜中)5-10分鐘。
i)用50微升無菌、無核酸酶的水重懸沉淀。
溶液胰蛋白酶/EDTAHank氏緩沖鹽水用PBS制備1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制劑培養(yǎng)基組分(見下)培養(yǎng)基
制備Vero細(xì)胞每次電穿孔需要約1.3個(gè)幾乎鋪滿細(xì)胞的T150培養(yǎng)瓶。
1.用約5毫升Hank氏緩沖鹽溶液洗滌單層細(xì)胞1次。
2.加入4毫升胰蛋白酶/EDTA，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶以均勻分布該溶液。
3.室溫孵育3-5分鐘。
4.吸干胰蛋白酶溶液。
5.拍打培養(yǎng)瓶側(cè)面以分離細(xì)胞。
6.用10毫升培養(yǎng)基#1從培養(yǎng)瓶中收集細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50毫升圓錐管中。
7.加入1毫升胰蛋白酶抑制劑(1毫克/毫升)，并溫和地混合。
8.用臺(tái)式離心機(jī)室溫1000rpm離心細(xì)胞5分鐘。
9.吸干上清。
10.將細(xì)胞重懸于10毫升培養(yǎng)基2中。
11.加入1毫升胰蛋白酶抑制劑溫和地混合。
12.如上所述用臺(tái)式離心機(jī)室溫1000rpm離心收集細(xì)胞。
13.吸干培養(yǎng)基。
14.將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基2中。溫和地重懸，最終體積相當(dāng)于每次電穿孔0.8毫升(考慮到細(xì)胞沉淀會(huì)占據(jù)一定體積)。
15.將0.8毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有質(zhì)粒DNA溶液的離心管中。用裝有p1000吸頭的移液器溫和地上下吹打，混合細(xì)胞和DNA。轉(zhuǎn)移到電穿孔儀臺(tái)上。
電穿孔BTX 820方波電穿孔儀1.用移液器上下吹打細(xì)胞/DNA 3次以溫和地混合，轉(zhuǎn)移到電穿孔小杯中。
2.將小杯插入電穿孔架。
3.電穿孔細(xì)胞(4個(gè)脈沖，70毫秒，140伏)。
4.電穿孔所有樣品后，將小杯放回生物安全柜中，加入1毫升培養(yǎng)基1。用無菌塑料轉(zhuǎn)移移液管將細(xì)胞從小杯中轉(zhuǎn)移到含有10毫升培養(yǎng)基1的15毫升離心管中。
5.溫和地混合，如上所述離心收集細(xì)胞。
6.吸干培養(yǎng)基。
7.將細(xì)胞重懸于10毫升培養(yǎng)基1中，將懸液轉(zhuǎn)移到含有25毫升培養(yǎng)基1的T150培養(yǎng)瓶中。
8.37℃(5％CO2)孵育細(xì)胞3小時(shí)。
9.43℃(3-5％CO2)熱激細(xì)胞3小時(shí)。
10.將細(xì)胞放回37℃2小時(shí)。
11.用30毫升培養(yǎng)基3替換舊培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃孵育。
12.每天檢查細(xì)胞有無細(xì)胞病變效應(yīng)跡象。早至3-4天應(yīng)出現(xiàn)VSV復(fù)制，但可能更長(zhǎng)達(dá)6天。
按照上述電穿孔/熱激/T7質(zhì)粒步驟，從Vero細(xì)胞中成功回收了所有的重組VSV、MV和PIV。值得注意的是，采用含有據(jù)報(bào)道能降低提前終止的一個(gè)氨基酸取代(MacDonald等，J.Mol.Biol.238145-158，1994，引入本文作為參考)的修飾的PCl-Neo-Bcl-T7質(zhì)粒進(jìn)行了幾次成功的VSV拯救。
實(shí)施例VIII在Vero細(xì)胞中拯救呼吸道合胞病毒本實(shí)施例說明，用本發(fā)明的瞬時(shí)RNA聚合酶載體系統(tǒng)(例如上述實(shí)施例II所列改良的磷酸鈣/熱激方法)成功回收了被拯救的五十個(gè)不同重組RSV株。表6說明了此法回收的重組RSV候選病毒的各種組裝包括通過摻入生物學(xué)方法產(chǎn)生的RSV突變株的一種或多種減毒突變修飾的RSV重組病毒；通過部分或全部缺失一種或多種基因或基因組節(jié)段(如SH、NS1、NS2、M2-2)或者敲除一種或多種基因或損傷其表達(dá)的其它修飾而修飾的RSV；RSV-RSV嵌合性構(gòu)建物(如以其中含有RSV B糖蛋白取代為背景的RSV A2毒株)；含有一種或多種基因插入物的RSV；和含有相對(duì)于野生型RSV基因圖中相應(yīng)基因位置發(fā)生位置改變的一種或多種基因(即“基因改組”)的RSV重組物。表6中鑒定的被拯救毒株主要包括RSV A2毒株的變體和衍生物，但用本發(fā)明方法和組合物也成功地回收了一個(gè)RSV B1毒株。在表6中所列回收的RSV重組物中，回收了各種減毒、多重減毒和嵌合性病毒，以及含有一種或多種基因缺失的RSV重組物，上述內(nèi)容和上述引入的參考文獻(xiàn)中描述了所有這些情況。
表6RSV拯救的cDNA克隆
*MVA方法拯救的所有病毒的序列是正確的。
_僅指質(zhì)粒拯救的構(gòu)建物實(shí)施例IX通過質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法拯救其它負(fù)鏈病毒本實(shí)施例描述，通過上述實(shí)施例VII中所述改進(jìn)的質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激系統(tǒng)成功回收了其它負(fù)鏈RNA病毒。本文中還應(yīng)用此改進(jìn)的回收方法產(chǎn)生了大量其它減毒的重組VSV(rVSV)株，以及經(jīng)修飾編碼異源抗原的各種rVSV和bPIV載體。除rVSV之外，也用質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法從Vero細(xì)胞中拯救各種其它示例性重組負(fù)鏈RNA病毒(見下表7)。如上對(duì)rVSV的描述，在這些示例性實(shí)施方式中，電穿孔DNA的組合物任選地包括編碼除CMV-T7、基因組cDNA、N、P和L之外的基質(zhì)蛋白和病毒糖蛋白的質(zhì)粒。當(dāng)回收被證明難以拯救的病毒時(shí)，任選地加入編碼該基質(zhì)蛋白和糖蛋白的質(zhì)粒可提供顯著的優(yōu)點(diǎn)。如以上進(jìn)一步討論的，本發(fā)明的這些(電穿孔)方法和組合物中也可任選地包括編碼一種或多種其它結(jié)構(gòu)蛋白(如RSV的M、SH、NS1、NS2、F和/或G，以及PIV的M、HN和/或F)的質(zhì)粒。
表7 通過質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法回收的其它負(fù)鏈RNA病毒
關(guān)于rVSV，已用質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法產(chǎn)生和回收了各種其它構(gòu)建物。拯救了這些rVSV重組病毒后，在體外檢查其復(fù)制速率，在預(yù)計(jì)在人體中有活性(如減毒和免疫原性)的小動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)相對(duì)毒力，以確定這些病毒是否減毒到足以用于本發(fā)明免疫原性組合物和方法中。
在示例性實(shí)施方式中，產(chǎn)生并回收了含有編碼異源抗原，如HIV GAG蛋白或HSV-2gD糖蛋白的第六基因的許多rVSV。證明五種普通策略可有效引入阻礙病毒復(fù)制的修飾，包括(1)將參與轉(zhuǎn)錄和RNA復(fù)制(如N基因)或病毒粒子成熟(如M或G)的基因轉(zhuǎn)座或‘改組’到下游位置中導(dǎo)致相應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄降低(參見，例如，Ball等，J.Virol.734705-4712，1999；Finke等，J.Gen.Virol.841613-1621，2003；和Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 953501-3506，1998，各自引入本文作為參考)；(2)截?cái)嗖《靖街鞍?如G蛋白)的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域(CT缺失)(參見，例如，Roberts等，J.Virol.733723-3732，1999，引入本文作為參考)；(3)用編碼溫度敏感型多肽的同源物取代載體骨架中的基因(參見，例如，Pringle，J.Virol.5559-567，1970；Gallione等，J.Virol.54374-382，1985，各自引入本文作為參考)；(4)將突變引入編碼M蛋白的基因中降低病毒粒子成熟率和細(xì)胞病理作用(參見，例如，Jayakar等，J.Virol.768011-8018，2002，引入本文作為參考)；和(5)將CT缺失與改組基因、ts突變或M突變相組合。下表8列出了這些方法拯救的各種示例性減毒rVSV毒株。
關(guān)于上述策略(3)，可用在生物學(xué)方法產(chǎn)生的ts突變病毒中鑒定的突變基因取代野生型或原型基因，容易地實(shí)現(xiàn)溫度敏感型突變的引入。為了產(chǎn)生含有這種ts突變的示例性rVSV重組病毒，將用示例性的生物方法產(chǎn)生的ts突變株tsG11、tsG31、tsG41或tsO45轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞(參見，例如，Gallione等，J.Virol.54374-382，1985；Whitt等，J.Virol.644907-4913，1990；Pringle，J.Virol.5559-567，1970，各自引入本文作為參考)培養(yǎng)在許可的溫度(32℃)中，直到在約75％的培養(yǎng)物中出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，此時(shí)，將細(xì)胞刮入培養(yǎng)基中低速離心收集。用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提得到細(xì)胞沉淀中感染細(xì)胞的總RNA，將純化的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，以制備編碼蛋白的序列，然后用它取代rVSV cDNA克隆中的同源基因。通過將克隆的ts基因的序列與直接從相應(yīng)的生物學(xué)方法產(chǎn)生的ts病毒的基因組RNA測(cè)定的序列相比，證實(shí)為克隆的ts基因的序列。序列確認(rèn)后，用上述電穿孔/熱激方法拯救編碼一種或多種ts基因的rVSV毒株，除了細(xì)胞培養(yǎng)在32℃而不是37℃外(除非在熱激過程中)，以產(chǎn)生預(yù)計(jì)的ts表型。電穿孔后5-9天，在成功的拯救試驗(yàn)中出現(xiàn)了細(xì)胞病變效應(yīng)，此時(shí)收獲新毒株用于啟動(dòng)噬斑純化。3輪噬斑純化后，擴(kuò)增了病毒貯存液并測(cè)定了基因組序列。然后對(duì)含有所需序列的病毒在幾種溫度下(32℃、37℃和39℃)進(jìn)行噬斑試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)插入的ts基因的作用。
表7 質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法回收的其它rVSV毒株
*命名注釋VSV基因組含有排列為3’-N(1)-P(2)-M(3)-G(4)-L(5)-5’的5個(gè)基因。除了上述的CT修飾外，許多數(shù)字命名指在所述重組病毒中的最終基因位置。因此，例如，稱為“rVSV-M5”的病毒包含改組到最后或第5個(gè)位置的M基因。從第一個(gè)基因位置具有編碼HIV GAG的基因插入物的rVSV-M5的載體衍生物含有6個(gè)基因，一致地稱為rVSV-GAG1-M6。表8中鑒定的各VSV重組物一開始是用Indiana血清型骨架建立的，但是大多數(shù)所述重組物也是用從New Jersey(NJ)血清型背景制備的伴隨載體回收的。稱謂“ts”后接特定基因或產(chǎn)物(如“tsG”)指該重組病毒摻入了在生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變病毒中鑒定的基因或突變，如引入的參考文獻(xiàn)所述。通常采用已知減毒的生物學(xué)方法產(chǎn)生的病毒來構(gòu)建突變基因的cDNA拷貝用于摻入重組的減毒病毒中?；蛘?，當(dāng)生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變病毒中特定的靶突變基因座已知時(shí)，可將所述突變直接摻入重組病毒中，例如，通過定位誘變。
產(chǎn)生和回收表達(dá)外來或“異源”抗原或抗原決定簇—產(chǎn)生所需的免疫原特異性改變的其它rVSV和其它病毒構(gòu)建物。例如，設(shè)計(jì)了重組VSV、牛PIV(bPIV)和hPIV3-cp45，評(píng)價(jià)其可作為遞送HIV-1、A和B型流感病毒、2型單純皰疹病毒、冠狀病毒以及A和B型RSV的抗原的可能載體。如本文所述拯救這些載體，用于后續(xù)的免疫原性和安全性研究。上表8中列出了被拯救的VSV-HIV GAG構(gòu)建物和示例性VSV-HSV gD構(gòu)建物，而下表9總結(jié)了設(shè)計(jì)用于表達(dá)呼吸道病毒性病原體(RSV、流感和冠狀病毒)的糖蛋白的示例性載體。
表9 表達(dá)通過質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法回收的病毒性呼吸道病原體的糖蛋白的VSV和bPIV載體
注意上面所列VSV載體是用Indiana血清型骨架建立的。在大多數(shù)情況下，分離的伴隨載體是用NJ血清型骨架制備的。
實(shí)施例X拯救缺少G基因或基因組節(jié)段的復(fù)制缺陷型VSV載體如上所述，常常需要構(gòu)建不能從接種疫苗的部位顯著擴(kuò)散，但保留感染細(xì)胞和表達(dá)靶抗原能力的載體重組物。缺少結(jié)構(gòu)基因，如M或G基因的示例性載體可容易地實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。M或G基因的缺陷將通過完全阻斷病毒粒子的成熟而理想地防止感染后免疫載體的擴(kuò)散，但不會(huì)干擾N、P和L蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)。已描述了缺少全部或大多數(shù)G基因的rVSV，它們是吸引人的用于本發(fā)明免疫原性組合物和方法的候選物(參見，例如，Roberts等，J.Virol.733723-3732，1999，Jeetendra等，J.Virol.7612300-12311，2002；Robison等，J.Virol.742239-2246，2000，各自引入本文作為參考)。為了促進(jìn)拯救和增殖這些復(fù)制缺陷型候選病毒，本實(shí)施例描述了改進(jìn)的質(zhì)粒T7/電穿孔/熱激方法。為說明該改進(jìn)方法在產(chǎn)生和開發(fā)復(fù)制缺陷型候選病毒中的用途，工程改造并回收了兩種類型的突變病毒。一種示例性突變類型完全缺少G基因(稱為“ΔG”)。第二種突變體編碼的G蛋白缺少病毒附著所必需的G蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(稱為“G-莖”)。該突變基因編碼與最后91個(gè)殘基，包括跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的G蛋白的前19個(gè)氨基酸，G蛋白中大多數(shù)氨基酸被切掉，然后將該蛋白插入平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
用于回收復(fù)制或生長(zhǎng)缺陷型負(fù)鏈病毒(例如ΔG或G-莖病毒)的改進(jìn)的拯救方法如下。
VSV/Vero電穿孔拯救步驟溶液胰蛋白酶/EDTAHank氏緩沖鹽水用PBS制備1毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制劑培養(yǎng)基組分(見下)培養(yǎng)基
制備Vero細(xì)胞每次電穿孔需要約1.3個(gè)鋪滿細(xì)胞的T150培養(yǎng)瓶。
1)用約5毫升Hank氏緩沖鹽溶液洗滌單層細(xì)胞1次。
2)加入4毫升胰蛋白酶/EDTA，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶以均勻分布該溶液。
3)室溫孵育3-5分鐘。
4)吸干胰蛋白酶溶液。
5)拍打培養(yǎng)瓶側(cè)面以分離細(xì)胞。
6)用10毫升培養(yǎng)基#1收集培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50毫升圓錐管中。
7)加入1毫升胰蛋白酶抑制劑(1毫克/毫升)，并溫和地混合。
8)用臺(tái)式離心機(jī)室溫1000rpm離心細(xì)胞5分鐘。
9)吸干上清。
10)將細(xì)胞重懸于10毫升培養(yǎng)基2中。
11)加入1毫升胰蛋白酶抑制劑并溫和地混合。
12)如上所述用臺(tái)式離心機(jī)室溫1000rpm離心收集細(xì)胞。
13)吸干培養(yǎng)基。
14)將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基2中。溫和地重懸，至最終體積相當(dāng)于每次電穿孔0.7毫升(考慮到細(xì)胞沉淀會(huì)占據(jù)一定體積)。
15)將0.7毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有質(zhì)粒DNA溶液的離心管中。用裝有p1000吸頭的移液器溫和地上下吹打，混合細(xì)胞和DNA。轉(zhuǎn)移到電穿孔儀臺(tái)上。
DNA制備對(duì)每次拯救的電穿孔而言，電穿孔50微克CMV-Ga)在生物安全柜工作條件下，用無菌、無核酸酶的水將DNA體積調(diào)整到250微升。
b)加入50微升3M乙酸鈉(pH 5)。
c)加入750微升100％乙醇，并混合。
d)-20℃孵育1小時(shí)至過夜e)在微量離心管中，14,000rpm、4℃、離心20分鐘沉淀DNAf)在生物安全柜工作條件下，棄去上清，不要攪動(dòng)沉淀。
g)快速離心該管，收集管底殘留的乙醇，用移液器去除。
h)讓沉淀在空氣中干燥(在生物安全柜中)5-10分鐘。
i)用50微升無菌、無核酸酶的水重懸沉淀。
電穿孔BTX 820方波電穿孔儀1)用移液器上下吹打細(xì)胞/DNA3次輕輕混合，轉(zhuǎn)移到電穿孔小杯中。
2)將小杯插入電穿孔架中。
3)電穿孔細(xì)胞(4個(gè)脈沖，70毫秒，140伏)。
4)電穿孔所有樣品后，將小杯放回生物安全柜中，加入1毫升培養(yǎng)基1。用無菌的塑料轉(zhuǎn)移移液管將細(xì)胞從小杯轉(zhuǎn)移到含有10毫升培養(yǎng)基1的15毫升離心管中。
5)溫和地混合，如上所述離心收集細(xì)胞。
6)吸干培養(yǎng)基。
7)將細(xì)胞重懸于10毫升培養(yǎng)基1中，將懸液轉(zhuǎn)移到含有25毫升培養(yǎng)基1的T150培養(yǎng)瓶中。
8)37℃(5％CO2)孵育細(xì)胞3小時(shí)。
9)43℃(3-5％CO2)熱激細(xì)胞3小時(shí)。
10)將細(xì)胞放回37℃2小時(shí)。
11)用20毫升培養(yǎng)基3替換舊培養(yǎng)基。
12)吸干含有拯救物質(zhì)的T150。加入10毫升培養(yǎng)基3。將細(xì)胞刮入培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到1個(gè)含有G表達(dá)細(xì)胞的T150瓶中，繼續(xù)37℃孵育。
13)每天檢查細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)跡象。早至3-4天應(yīng)出現(xiàn)VSV復(fù)制，但可能更長(zhǎng)達(dá)6天。
與實(shí)施例VII中所述的替代示例性方法相比，上述改進(jìn)的電穿孔方法的主要不同之處是包括了共培養(yǎng)步驟，在該步驟中，將用于拯救的細(xì)胞與經(jīng)工程改造富表達(dá)G蛋白的細(xì)胞一起培養(yǎng)。簡(jiǎn)要說，通過電穿孔含有CMV-T7質(zhì)粒、病毒基因組cDNA和編碼N、P、L、M和G的載體的Vero細(xì)胞(病毒拯救細(xì)胞)啟動(dòng)VSV拯救。然后，將這些細(xì)胞熱激3小時(shí)后孵育過夜。當(dāng)進(jìn)行病毒拯救電穿孔時(shí)，電穿孔第二組Vero細(xì)胞，以準(zhǔn)備用于瞬時(shí)表達(dá)大量G蛋白的共培養(yǎng)的細(xì)胞。加入相對(duì)大量的編碼VSV G蛋白的CMV表達(dá)質(zhì)粒，電穿孔這些共培養(yǎng)細(xì)胞。電穿孔后的第二天，將轉(zhuǎn)染了該拯救混合物的細(xì)胞刮入培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移到G蛋白表達(dá)共培養(yǎng)單層細(xì)胞上。通常在2-4天后，可見明顯的病毒性細(xì)胞病變效應(yīng)。
雖然以實(shí)施例的方式詳細(xì)描述了上述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施某些改變和修改，以示例性而非限制性方式對(duì)它們進(jìn)行說明。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括以下步驟(a)將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)N蛋白、P蛋白和L蛋白，并由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶；和(b)從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體是質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的瞬時(shí)表達(dá)載體混合于DNA轉(zhuǎn)染混合物中，并同時(shí)加入宿主細(xì)胞培養(yǎng)物以實(shí)現(xiàn)協(xié)同轉(zhuǎn)染。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體之前，將所述病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體之后，但在所述RNA聚合酶在所述宿主細(xì)胞中累積到可檢測(cè)水平之前，將所述病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染或電穿孔引入到宿主細(xì)胞中。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞后，將宿主細(xì)胞在足以有效提高重組病毒回收率的條件下，暴露于有效熱激下。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將宿主細(xì)胞暴露于37℃以上的熱激溫度中。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將宿主細(xì)胞暴露于約37℃-約50℃范圍的熱激溫度中。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將宿主細(xì)胞暴露于約41℃-約47℃范圍的熱激溫度中。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行至少約5分鐘的有效熱激。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行約15-200分鐘的有效熱激。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行約30-150分鐘的有效熱激。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在足以讓所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)RNA聚合酶表達(dá)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體表達(dá)的時(shí)間后，將宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒散播到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)移所述宿主細(xì)胞到至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上以建立宿主和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是與所述噬斑擴(kuò)增細(xì)胞類型不同的細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是完全病毒。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述N、P和L蛋白中的一種或多種是異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的蛋白。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸分子編碼野生型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的序列。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、牛副流感病毒(BPIV)、嵌合性人-牛PIV(HBPIV)、麻疹病毒(MV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了一種或多種用重組方法引入的溫度敏感型(ts)減毒突變。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了在用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的一種或多種減毒突變。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了與在異源性突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的一種或多種突變對(duì)應(yīng)的一種或多種減毒突變。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了由其密碼子中規(guī)定突變的兩個(gè)或三個(gè)核苷酸改變所確定的至少一種減毒突變。
33.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了改變?cè)摬《净蚪M或反義基因組中一種或多種C、C’、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3’前導(dǎo)區(qū)、5’尾隨區(qū)和/或基因間區(qū)的重組修飾。
35.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失、或該基因的表達(dá)降低或消除。
36.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，使其編碼選自下組的非病毒分子細(xì)胞因子、T-輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物病原體或寄生物的蛋白質(zhì)。
37.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節(jié)段相組合而形成嵌合基因組或反義基因組。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，將編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節(jié)段作為額外的基因或基因組節(jié)段加到部分或完整載體基因組或反義基因組的非編碼區(qū)附近或其中，或其中用編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節(jié)段取代部分載體基因組或反義基因組中的一種或多種相對(duì)應(yīng)的基因或基因組節(jié)段。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，在部分或完整載體基因組或反義基因組中對(duì)應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置的對(duì)應(yīng)位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，在與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
41.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，修飾所述載體基因組或反義基因組，使其編碼摻入異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種異源抗原結(jié)構(gòu)域、片段或表位的嵌合糖蛋白，以形成嵌合基因組或反義基因組。
42.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞組和B亞組、人副流感病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎后病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、α病毒和流感病毒。
43.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
44.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述嵌合基因組或反義基因組摻入了在用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定出的一種或多種減毒突變。
45.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
46.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述嵌合基因組或反義基因組摻入改變?cè)摬《净蚪M或反義基因組中一種或多種C、C’、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3’前導(dǎo)區(qū)、5’尾隨區(qū)和/或基因間區(qū)的重組修飾。
47.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失、或該基因的表達(dá)降低或消除。
48.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，修飾所述嵌合基因組或反義基因組，使其編碼選自下組的非病毒分子細(xì)胞因子、T-輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物病原體或寄生物的蛋白質(zhì)。
49.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，與所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上添加、取代或轉(zhuǎn)座基因或基因組節(jié)段，來修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
50.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調(diào)節(jié)元件，包括基因外3’前導(dǎo)區(qū)或5’尾隨區(qū)、基因起始信號(hào)、基因終止信號(hào)、編輯區(qū)、基因間區(qū)或者3’或5’非編碼區(qū)。
51.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(qū)(NCR)中摻入長(zhǎng)度在150個(gè)核苷酸(nts)至4,000個(gè)核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)并規(guī)定所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的減毒表型。
52.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
53.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體在足以使得所述載體共表達(dá)和產(chǎn)生重組病毒的條件下引入合適的宿主細(xì)胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；轉(zhuǎn)移所述宿主細(xì)胞，與噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)；和從所述共培養(yǎng)物中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞后，將所述宿主細(xì)胞在足以提高重組病毒回收率的條件下暴露于有效熱激中。
57.如權(quán)利要求53所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
58.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟(a)將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，該宿主細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)(1)RNA聚合酶、(2)N蛋白、(3)P蛋白、和(4)L蛋白，其中所述RNA聚合酶和N、P和L蛋白各自由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體表達(dá)；和(b)從宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞后，將所述宿主細(xì)胞在足以提高重組病毒回收率的條件下暴露于有效熱激下。
62.如權(quán)利要求58所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
63.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述病毒cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；和從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述N、P和L蛋白中至少一種由表達(dá)控制質(zhì)粒編碼。
65.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
66.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
67.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞后，將所述宿主細(xì)胞在足以提高重組病毒回收率的條件下，暴露于有效熱激下。
68.如權(quán)利要求63所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
69.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的組合物，該組合物包含(a)含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)由所述cDNA合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；(b)在所述宿主細(xì)胞中編碼和指導(dǎo)(1)RNA聚合酶、(2)N蛋白、(3)P蛋白、和(4)L蛋白表達(dá)的一種或多種支持載體；和(c)在所述宿主細(xì)胞中編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的瞬時(shí)表達(dá)載體。
70.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，在無細(xì)胞共轉(zhuǎn)染混合物中提供了所述病毒cDNA表達(dá)載體、編碼N、P和L的所述一種或多種支持載體、以及編碼和指導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)所述RNA聚合酶的所述瞬時(shí)表達(dá)載體。
71.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，將所述病毒cDNA表達(dá)載體、編碼N、P和L的所述一種或多種支持載體、以及編碼和指導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)所述RNA聚合酶的所述瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入所述宿主細(xì)胞。
72.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
73.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，編碼和指導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)所述RNA聚合酶的所述瞬時(shí)表達(dá)載體是質(zhì)粒。
74.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含與宿主細(xì)胞細(xì)胞類型相同或不同的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，以使被拯救的病毒從宿主細(xì)胞擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
75.如權(quán)利要求74所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，以建立宿主和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)。
76.如權(quán)利要求74所述的組合物，其特征在于，所述宿主細(xì)胞與所述噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的細(xì)胞類型不同。
77.如權(quán)利要求74所述的組合物，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
78.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
79.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
80.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
81.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是完全病毒。
82.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，一種或多種所述N、P和L蛋白是異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的蛋白。
83.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸分子編碼野生型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的序列。
84.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
85.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
86.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、牛副流感病毒(BPIV)、嵌合性人-牛PIV(HBPIV)、麻疹病毒(MV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
87.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
88.如權(quán)利要求87所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入一種或多種重組引入的溫度敏感型(ts)減毒突變。
89.如權(quán)利要求87所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入在用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定出的一種或多種減毒突變。
90.如權(quán)利要求87所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入與在異源、突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定出的一種或多種突變相對(duì)應(yīng)的一種或多種減毒突變。
91.如權(quán)利要求87所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了由其密碼子規(guī)定突變的兩個(gè)或三個(gè)核苷酸改變所確定的至少一種減毒突變。
92.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
93.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入改變?cè)摬《净蚪M或反義基因組中一種或多種C、C’、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3’前導(dǎo)區(qū)、5’尾隨區(qū)和/或基因間區(qū)的重組修飾。
94.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達(dá)降低或消除。
95.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，使其編碼選自下組的非病毒分子細(xì)胞因子、T-輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物病原體或寄生物的蛋白質(zhì)。
96.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節(jié)段相組合而形成嵌合基因組或反義基因組。
97.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，將編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節(jié)段作為額外的基因或基因組節(jié)段加到部分或完整載體基因組或反義基因組的非編碼區(qū)附近或之中，或其中用編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節(jié)段取代部分載體基因組或反義基因組中的一種或多種相對(duì)應(yīng)的基因或基因組節(jié)段。
98.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，在對(duì)應(yīng)于部分或完整載體基因組或反義基因組中相應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
99.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
100.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，修飾所述載體基因組或反義基因組，使其編碼摻入有異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種異源抗原結(jié)構(gòu)域、片段或表位的嵌合糖蛋白，以形成嵌合基因組或反義基因組。
101.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，所述異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞組和B亞組、人副流感病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎后病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、α病毒和流感病毒。
102.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
103.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，所述嵌合基因組或反義基因組摻入了在用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定出的一種或多種減毒突變。
104.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
105.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，所述嵌合基因組或反義基因組摻入改變?cè)摬《净蚪M或反義基因組中一種或多種C、C’、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3’前導(dǎo)區(qū)、5’尾隨區(qū)和/或基因間區(qū)的重組修飾。
106.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達(dá)降低或消除。
107.如權(quán)利要求96所述的組合物，其特征在于，修飾所述嵌合基因組或反義基因組，使其編碼選自下組的非病毒分子細(xì)胞因子、T-輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物病原體或寄生物的蛋白質(zhì)。
108.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，與所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，通過在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上添加、取代或轉(zhuǎn)座基因或基因組節(jié)段來修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
109.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調(diào)節(jié)元件，所述元件包括基因外3’前導(dǎo)區(qū)或5’尾隨區(qū)、基因起始信號(hào)、基因終止信號(hào)、編輯區(qū)、基因間區(qū)或者3’或5’非編碼區(qū)。
110.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(qū)(NCR)中摻入長(zhǎng)度在150個(gè)核苷酸(nts)和4,000個(gè)核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)并規(guī)定了所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的減毒表型。
111.如權(quán)利要求69所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種表達(dá)載體編碼相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
112.一種通過下述方法產(chǎn)生的單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒將含有編碼非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體、編碼和指導(dǎo)N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種支持載體以及編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；和從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
113.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
114.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，編碼和指導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)所述RNA聚合酶的所述瞬時(shí)表達(dá)載體是質(zhì)粒。
115.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將所述病毒cDNA表達(dá)、編碼和指導(dǎo)N蛋白、P蛋白和L蛋白表達(dá)的所述一種或多種支持載體，以及編碼和指導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶的所述瞬時(shí)表達(dá)載體混合于DNA轉(zhuǎn)染混合物中，并同時(shí)加入宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中以實(shí)現(xiàn)協(xié)同轉(zhuǎn)染。
116.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體之前，將所述病毒cDNA表達(dá)載體以及編碼和指導(dǎo)N蛋白、P蛋白和L蛋白表達(dá)的所述一種或多種支持載體引入宿主細(xì)胞。
117.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體之后，但在所述RNA聚合酶在所述宿主細(xì)胞中累積到可檢測(cè)水平之前，將所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)N蛋白、P蛋白和L蛋白表達(dá)的所述一種或多種支持載體引入所述宿主細(xì)胞。
118.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將一種或多種(a)所述病毒cDNA表達(dá)載體和(b)所述一種或多種編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白表達(dá)的支持載體通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染或電穿孔引入宿主細(xì)胞。
119.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將一種或多種(a)所述病毒cDNA表達(dá)載體和(b)所述一種或多種編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白表達(dá)的支持載體，以及編碼和指導(dǎo)所述RNA聚合酶表達(dá)的所述瞬時(shí)表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞之后，將該宿主細(xì)胞在足以提高重組病毒回收率的條件下，暴露于有效熱激下。
120.根據(jù)權(quán)利要求119所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將宿主細(xì)胞暴露于37℃以上的熱激溫度中。
121.根據(jù)權(quán)利要求119所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將宿主細(xì)胞暴露于約37℃-約50℃范圍的熱激溫度中。
122.根據(jù)權(quán)利要求119所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將宿主細(xì)胞暴露于約41℃-約47℃范圍的熱激溫度中。
123.根據(jù)權(quán)利要求119所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行至少約5分鐘的有效熱激。
124.根據(jù)權(quán)利要求123所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行約15分鐘至約200分鐘的有效熱激。
125.根據(jù)權(quán)利要求124所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行約30分鐘至約150分鐘的有效熱激。
126.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，在讓所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)N蛋白、P蛋白和L蛋白表達(dá)的一種或多種支持載體以及編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶表達(dá)的所述瞬時(shí)表達(dá)載體表達(dá)足夠時(shí)間后，將所述宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
127.根據(jù)權(quán)利要求126所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上，以建立宿主和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)。
128.根據(jù)權(quán)利要求126所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞與所述噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的細(xì)胞類型不同。
129.根據(jù)權(quán)利要求114所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
130.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
131.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
132.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
133.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是完全病毒。
134.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，一種或多種所述N、P和L蛋白是異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的蛋白。
135.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸分子編碼野生型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的序列。
136.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
137.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
138.根據(jù)權(quán)利要求101所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒選自呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、牛副流感病毒(BPIV)、嵌合性人-牛PIV(HBPIV)、麻疹病毒(MV)或水泡性口炎病毒(VSV)。
139.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
140.根據(jù)權(quán)利要求139所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入一種或多種重組方法引入的溫度敏感型(ts)減毒突變。
141.根據(jù)權(quán)利要求139所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了在用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定出的一種或多種減毒突變。
142.根據(jù)權(quán)利要求139所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入與在異源性突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定的一種或多種突變相對(duì)應(yīng)的一種或多種減毒突變。
143.根據(jù)權(quán)利要求139所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入了由其密碼子規(guī)定突變的兩個(gè)或三個(gè)核苷酸改變所確定的至少一種減毒突變。
144.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
145.根據(jù)權(quán)利要求144所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒摻入改變病毒基因組或反義基因組中一種或多種C、C’、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3’前導(dǎo)區(qū)、5’尾隨區(qū)和/或基因間區(qū)的重組修飾。
146.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達(dá)降低或消除。
147.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，使其編碼選自下組的非病毒分子細(xì)胞因子、T-輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物病原體或寄生物的蛋白質(zhì)。
148.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節(jié)段相組合，以形成嵌合基因組或反義基因組。
149.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，將編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節(jié)段作為額外的基因或基因組節(jié)段加到部分或完整載體基因組或反義基因組的非編碼區(qū)附近或之中，或其中用編碼抗原決定簇的所述一種或多種異源基因或基因組節(jié)段取代部分載體基因組或反義基因組中的一種或多種相對(duì)應(yīng)的基因或基因組節(jié)段。
150.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，在對(duì)應(yīng)于部分或完整載體基因組或反義基因組中相應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
151.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
152.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，修飾所述載體基因組或反義基因組，使其編碼摻入了異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種異源抗原結(jié)構(gòu)域、片段或表位的嵌合性糖蛋白，以形成嵌合基因組或反義基因組。
153.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述異源病原體選自麻疹病毒、呼吸道合胞病毒A亞組和B亞組、人副流感病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒、1型和2型人免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、人肺炎后病毒、EB病毒、線狀病毒、布尼亞病毒、黃病毒、α病毒和流感病毒。
154.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
155.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述嵌合基因組或反義基因組摻入了在用生物學(xué)方法產(chǎn)生的突變非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒中鑒定出的一種或多種減毒突變。
156.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，該表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
157.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，所述嵌合基因組或反義基因組摻入改變?cè)摬《净蚪M或反義基因組中一種或多種C、C’、D、E、F、G、HA、HN、L、M、M2-1、M2-2、NS1、NS2、SH、V、Y1、和/或Y2開放閱讀框(ORF)和/或3’前導(dǎo)區(qū)、5’尾隨區(qū)和/或基因間區(qū)的重組修飾。
158.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達(dá)降低或消除。
159.根據(jù)權(quán)利要求148所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，修飾所述嵌合基因組或反義基因組，使其編碼選自下組的非病毒分子細(xì)胞因子、T-輔助表位、限制性位點(diǎn)標(biāo)記或能夠在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物病原體或寄生物的蛋白質(zhì)。
160.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，與所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置添加、取代或轉(zhuǎn)座基因或基因組節(jié)段，來修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
161.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調(diào)節(jié)元件，所述元件包括基因外3’前導(dǎo)區(qū)或5’尾隨區(qū)、基因起始信號(hào)、基因終止信號(hào)、編輯區(qū)、基因間區(qū)或者3’或5’非編碼區(qū)。
162.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(qū)(NCR)中摻入長(zhǎng)度在150個(gè)核苷酸(nts)和4,000個(gè)核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)并規(guī)定了所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的減毒表型。
163.根據(jù)權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，其特征在于，該方法還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
164.一種在藥學(xué)上可接受的載體中含有免疫學(xué)有效量的按權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的分離的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的免疫原性組合物。
165.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，其特征在于，將所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒配制成103至107PFU的劑量。
166.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，其特征在于，將其配制成上呼吸道給藥的劑型。
167.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，其特征在于，將其配制成氣霧劑、滴劑或氣溶膠劑型給藥。
168.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
169.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述宿主細(xì)胞和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞各自選自HEp-2、HeLa、HEK、BHK、FRhL-DBS2、LLC-MK2、MRC-5和Vero細(xì)胞。
170.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞后，將所述宿主細(xì)胞在足以提高重組病毒回收率的條件下，暴露于有效熱激下。
171.如權(quán)利要求164所述的免疫原性組合物，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
172.一種刺激哺乳動(dòng)物對(duì)象免疫系統(tǒng)以在該對(duì)象中誘導(dǎo)抗非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予對(duì)象包含在藥學(xué)上可接受載體中的免疫學(xué)有效量的按權(quán)利要求112所述方法產(chǎn)生的分離的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
173.如權(quán)利要求172所述的方法，其特征在于，以103至107PFU的劑量給予所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
174.如權(quán)利要求172所述的方法，其特征在于，將所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒施用于上呼吸道。
175.如權(quán)利要求172所述的方法，其特征在于，通過氣霧劑、滴劑或氣溶膠給予所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
176.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟(a)將含有編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，其中所述宿主細(xì)胞表達(dá)N蛋白、P蛋白和L蛋白，并由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶；和(b)從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
177.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述病毒在所述宿主細(xì)胞中組裝后，不能完成一輪復(fù)制。
178.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述病毒能夠在體外生長(zhǎng)和/或復(fù)制，但在體內(nèi)是生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷的。
179.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體是質(zhì)粒。
180.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，將所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)RNA聚合酶的瞬時(shí)表達(dá)載體混合于DNA轉(zhuǎn)染混合物中，并同時(shí)加入到宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中，以實(shí)現(xiàn)協(xié)同轉(zhuǎn)染。
181.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，在引入編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體之前，將所述病毒cDNA表達(dá)載體以及編碼N、P、L蛋白的一種或多種支持載體引入宿主細(xì)胞。
182.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染或電穿孔引入所述宿主細(xì)胞。
183.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，將一種或多種所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞之后，將該宿主細(xì)胞在足以提高該重組病毒回收率的條件下，暴露于有效熱激下。
184.如權(quán)利要求183所述的方法，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞暴露于37℃以上的熱激溫度中。
185.如權(quán)利要求183所述的方法，其特征在于，對(duì)所述宿主細(xì)胞進(jìn)行至少約5分鐘的有效熱激。
186.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，在讓所述病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)RNA聚合酶表達(dá)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體表達(dá)足夠時(shí)間后，將所述宿主細(xì)胞與相同或不同類型細(xì)胞的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，以使被拯救的病毒擴(kuò)散到噬斑擴(kuò)增細(xì)胞中。
189.如權(quán)利要求186所述的方法，其特征在于，將所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移到至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞上，以建立宿主和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)。
190.如權(quán)利要求186所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞與所述噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的細(xì)胞類型不同。
191.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述復(fù)制缺陷型、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是亞病毒顆粒。
192.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，一種或多種所述N、P和L蛋白是異源非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的蛋白。
193.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
194.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是彈狀病毒科的一員。
195.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
196.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
197.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達(dá)降低或消除。
198.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，所述編碼基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節(jié)段相組合而形成嵌合基因組或反義基因組。
199.如權(quán)利要求198所述的方法，其特征在于，與部分或完整載體基因組或反義基因組中相應(yīng)基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上加入或代之以所述異源基因或基因組節(jié)段。
200.如權(quán)利要求198所述的方法，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述嵌合基因組或反義基因組。
201.如權(quán)利要求198所述的方法，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾了所述嵌合基因組或反義基因組，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
202.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，與所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置添加、取代或轉(zhuǎn)座基因或基因組節(jié)段，來修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸。
203.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸，使其摻入異源調(diào)節(jié)元件，包括基因外3’前導(dǎo)區(qū)或5’尾隨區(qū)、基因起始信號(hào)、基因終止信號(hào)、編輯區(qū)、基因間區(qū)或者3’或5’非編碼區(qū)。
204.如權(quán)利要求176所述的方法，其特征在于，修飾編碼所述基因組或反義基因組的所述多核苷酸，以在該基因組或反義基因組的非編碼區(qū)(NCR)摻入長(zhǎng)度在150個(gè)核苷酸(nts)和4,000個(gè)核苷酸之間的多核苷酸插入物，或作為分離的基因單位(GU)摻入，所述多核苷酸插入物缺少完整的開放閱讀框(ORF)并規(guī)定了所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的減毒表型。
205.如權(quán)利要求176所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
206.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體和編碼并指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體在足以使得所述載體共表達(dá)和產(chǎn)生重組病毒的條件下引入合適的宿主細(xì)胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；轉(zhuǎn)移所述宿主細(xì)胞，與噬斑擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)；和從所述共培養(yǎng)物中回收組裝的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
207.如權(quán)利要求206所述的方法，其特征在于，所述復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒在所述宿主細(xì)胞中組裝后，不能完成一輪復(fù)制，或能夠在體外生長(zhǎng)和/或復(fù)制，但在體內(nèi)是生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷的。
207.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟(a)將含有編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物，該宿主細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)(1)RNA聚合酶、(2)N蛋白、(3)P蛋白、和(4)L蛋白，其中所述RNA聚合酶和N、P和L蛋白各自由瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體表達(dá)；和(b)從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
209.如權(quán)利要求208所述的方法，其特征在于，所述復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒在所述宿主細(xì)胞中組裝后，不能完成一輪復(fù)制，或能夠在體外生長(zhǎng)和/或復(fù)制，但在體內(nèi)是生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷的。
210.如權(quán)利要求208所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
211.一種產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，該方法包括下述步驟將含有編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體以及編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；和從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
212.如權(quán)利要求211所述的方法，還包括在所述宿主細(xì)胞中共引入和/或共表達(dá)相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的任何一種或任何組合。
213.一種用于產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的組合物，該組合物包含(a)含有編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體，該基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以在合適的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)由所述cDNA合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；(b)在所述宿主細(xì)胞中編碼和指導(dǎo)(1)N蛋白、(2)P蛋白、和(3)L蛋白瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種表達(dá)載體；和(c)在所述宿主細(xì)胞中編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的瞬時(shí)表達(dá)載體。
214.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述病毒在所述宿主細(xì)胞中組裝后，不能完成一輪復(fù)制，或能夠在體外生長(zhǎng)和/或復(fù)制，但在體內(nèi)是生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷的。
215.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
216.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)載體是質(zhì)粒。
217.如權(quán)利要求213所述的組合物，還包含至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，以建立宿主和噬斑擴(kuò)增細(xì)胞的共培養(yǎng)。
218.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是亞病毒顆粒。
219.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是副粘病毒科家族的一員。
220.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒是彈狀病毒科家族的一員。
221.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，通過引入一種或多種減毒突變重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
222.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，通過規(guī)定表型改變的核苷酸修飾重組修飾所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒，所述表型改變選自生長(zhǎng)特性、減毒、溫度敏感性、冷適應(yīng)性、噬斑大小、宿主范圍限制的改變或免疫原性的改變。
223.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，通過RNA編輯位點(diǎn)的突變、移碼突變、改變翻譯起始位點(diǎn)的突變、在基因的開放閱讀框(ORF)中引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子或轉(zhuǎn)錄信號(hào)中的突變，導(dǎo)致所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的一種或多種基因全部或部分缺失，或該基因的表達(dá)降低或消除。
224.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述編碼基因組或反義基因組的多核苷酸包含部分或完整的載體基因組或反義基因組，它們與編碼一種或多種異源病原體的一種或多種抗原決定簇的一種或多種異源基因或基因組節(jié)段相組合以形成嵌合基因組或反義基因組。
225.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，與所述非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組中所述基因或基因組節(jié)段的野生型基因順序位置相比，在更接近啟動(dòng)子或更遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的位置上添加、取代或轉(zhuǎn)座基因或基因組節(jié)段，修飾編碼所述基因組或反義基因組的多核苷酸。
226.如權(quán)利要求213所述的組合物，其特征在于，所述一種或多種表達(dá)載體還編碼相同或不同非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒結(jié)構(gòu)蛋白的一種或任何組合。
227.一種通過下述方法產(chǎn)生的單分子負(fù)鏈RNA病毒目的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒將含有編碼生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的基因組或反義基因組的多核苷酸的病毒cDNA表達(dá)載體、編碼和指導(dǎo)N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種支持載體以及編碼和指導(dǎo)RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)的一種或多種瞬時(shí)表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，所述基因組或反義基因組操作性連接有表達(dá)控制序列以指導(dǎo)由所述cDNA表達(dá)載體合成病毒RNA轉(zhuǎn)錄物；和從所述宿主細(xì)胞中回收組裝的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
228.一種在藥學(xué)上可接受的載體中的含有免疫學(xué)有效量的按權(quán)利要求227所述方法產(chǎn)生的分離的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的免疫原性組合物。
229.一種刺激哺乳動(dòng)物對(duì)象免疫系統(tǒng)以在該對(duì)象中誘導(dǎo)抗非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予對(duì)象在藥學(xué)上可接受載體中的免疫學(xué)有效量的按權(quán)利要求227所述方法產(chǎn)生的分離的生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的方法，包括在用編碼RNA聚合酶的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中共表達(dá)病毒的cDNA和必需病毒蛋白N、P和L。在另一種方法中，用病毒cDNA表達(dá)載體和編碼RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白和L蛋白的一種或多種載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，將宿主細(xì)胞暴露于足以提高重組病毒回收率的有效熱激條件下。在另一實(shí)施方式中，在病毒拯救開始后轉(zhuǎn)移所述宿主細(xì)胞，與噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，一般是單層擴(kuò)增細(xì)胞共培養(yǎng)，從該共培養(yǎng)物中回收組裝的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生單分子負(fù)鏈RNA病毒目的感染性、非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒的組合物，和用上述方法和組合物產(chǎn)生的重組病毒和采用該重組病毒的免疫原性組合物和方法。在其它實(shí)施方式中，采用本發(fā)明方法和組合物產(chǎn)生生長(zhǎng)或復(fù)制缺陷型非節(jié)段性負(fù)鏈RNA病毒和亞病毒顆粒。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1871355SQ200480020973
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月9日
發(fā)明者C·L·派克斯, S·A·烏登, M·S·西德胡 申請(qǐng)人:惠氏