專利名稱：突變型腺伴隨病毒的病毒顆粒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組腺伴隨病毒載體領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腺伴隨病毒(AAV)是一種含有兩個(gè)開(kāi)放讀框(rep和cap)的4.7Kb、單鏈DNA病毒。第一個(gè)基因編碼基因組復(fù)制所需的4種蛋白質(zhì)(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，第二個(gè)基因表達(dá)裝配形成病毒衣殼的3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-3)。如其名字所示，AAV的活性復(fù)制依賴輔助病毒，例如腺病毒或皰疹病毒的存在。無(wú)輔助病毒時(shí)，AAV呈潛伏狀態(tài)，其基因組維持為游離體形式或整合進(jìn)宿主染色體。雖然AAV2的特征了解最清楚的是可作為基因遞送載體，但迄今已鑒定了8種同源性靈長(zhǎng)類AAV血清型和許多非人靈長(zhǎng)類的類型。
1989年首次制造了重組AAV2(rAAV)基因遞送系統(tǒng)，然后基于AAV的載體顯示出能提供許多主要優(yōu)點(diǎn)。首先，既然野生型AAV是非致病性與任何已知的疾病在病原學(xué)上無(wú)關(guān)，基于AAV的載體極其安全。此外，AAV能高效遞送基因并且在許多組織中可維持轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，包括肌肉、肺和腦。另外，AAV在人類臨床試驗(yàn)中獲得成功。
盡管在這方面取得成功，載體的設(shè)計(jì)依然存在問(wèn)題。主要問(wèn)題是多數(shù)人群已接觸過(guò)各種AAV血清型，結(jié)果是將來(lái)的任何患者群中相對(duì)大的一部分人存在有阻斷其基因遞送的中和抗體(NAB)。rAAV載體的其它問(wèn)題包括利用硫酸肝素作為受體的血清型(AAV2和3)的組織分散能力有限，對(duì)非感染性(non-permissive)類型細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)的感染能力差，難以高效地使基因靶向遞送選擇的細(xì)胞群以及轉(zhuǎn)基因攜帶能力有限。
技術(shù)上需要改進(jìn)AAV載體以避免被抗AAV的血清抗體所中和。本發(fā)明滿足了這種需要。
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發(fā)明概述本發(fā)明提供顯示衣殼性能改變的突變的腺伴隨病毒(AAV)，例如與血清中和抗體的結(jié)合能力降低和/或肝素結(jié)合能力改變和/或?qū)μ囟?xì)胞類型的感染力改變的AAV。本發(fā)明還提供了在衣殼基因中含有一種或多種突變的突變型AAV文庫(kù)。本發(fā)明還提供生產(chǎn)突變型AAV和突變型AAV文庫(kù)的方法，以及含有突變型AAV的組合物。本發(fā)明還提供含有突變的衣殼蛋白的重組AAV(rAAV)病毒粒子。本發(fā)明還提供含有編碼突變的衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸和含有該核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供遞送基因產(chǎn)物至個(gè)體的方法，該方法通常涉及向需要它的個(gè)體施用有效量的所述rAAV病毒粒子。
附圖簡(jiǎn)述

圖1a和1b顯示了野生型AAV和所述病毒文庫(kù)的肝素結(jié)合性能。
圖2a和2b顯示了抗體中和逃逸突變體的產(chǎn)生。圖2a描述了在各種嚴(yán)謹(jǐn)性(按中和抗體滴度(稀釋度的倒數(shù))與實(shí)際稀釋度之比給出)時(shí)所拯救的組分(按照0嚴(yán)謹(jǐn)性時(shí)標(biāo)準(zhǔn)化)。圖2b描述了兔抗血清使野生型AAV、AAV文庫(kù)和各AAV逃逸突變體的感染力降低(減少)的百分率。
圖3A-C描述了野生型AAV cap(SEQ ID NO1)的核苷酸序列與中和抗體逃逸突變體AbE2(SEQ ID NO2)和AbE L(SEQ ID NO3)的cap的核苷酸序列的對(duì)比情況。方框表明與野生型相比核苷酸序列中的改變。
圖4A-G描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-編碼核苷酸序列(SEQ ID NO4)與示范性中和抗體逃逸突變體的對(duì)比情況。
圖5A-C描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO5)與示范性中和抗體逃逸突變體的對(duì)比情況。
圖6A-J描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-編碼核苷酸序列與示范性中和抗體逃逸突變體的對(duì)比情況。
圖7A-D描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-編碼的氨基酸序列與示范性中和抗體逃逸突變體的對(duì)比情況。
圖8A-G描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-編碼核苷酸序列與示范性肝素結(jié)合突變體的對(duì)比情況。
圖9A-C描述了野生型AAV-2 VP1的VP-1-編碼的氨基酸序列與示范性肝素結(jié)合突變體的對(duì)比情況。
定義文中使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指含有多肽或與多肽結(jié)合并可用于介導(dǎo)多肽遞送至細(xì)胞的大分子或大分子的聯(lián)合體。說(shuō)明性的載體包括，例如質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體或其它基因遞送載體。
“AAV”是腺伴隨病毒的縮寫并可用于指病毒自身或其衍生物。除了需要指出的地方，該術(shù)語(yǔ)包括所有的亞型和天然存在的和重組形式的AAV?？s寫“rAAV”指重組腺伴隨病毒，也指重組AAV載體(或“rAAV載體”)。術(shù)語(yǔ)“AAV”包括1型AAV(AAV-1)、2型AAV(AAV-2)、3型AAV(AAV-3)、4型AAV(AAV-4)、5型AAV(AAV-5)、6型AAV(AAV-6)、7型AAV(AAV-7)、8型AAV(AAV-8)、鳥(niǎo)AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長(zhǎng)類AAV、非靈長(zhǎng)類AAV和羊AAV?！办`長(zhǎng)類AAV”指能感染靈長(zhǎng)類的AAV，“非-靈長(zhǎng)類AAV”指能感染非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物的AAV，“牛AAV”指能感染牛等哺乳動(dòng)物的AAV。
文中使用的“rAAV載體”指含有非AAV起源(即，對(duì)AAV而言是異源性多核苷酸)的多核苷酸序列的AAV載體，通常是用于遺傳性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的感興趣的序列?？傮w上，異源多核苷酸的兩側(cè)連接有至少一條，一般是兩條AAV末端反向重復(fù)序列(ITR)。術(shù)語(yǔ)rAAV載體包括rAAV載體顆粒和rAAV載體質(zhì)粒。
“AAV病毒”或“AAV病毒顆?！被颉癆AV載體顆?！敝钢辽俸幸环NAAV衣殼蛋白(通常是野生型AAV的全部衣殼蛋白)和一種包裹的多核苷酸的rAAV載體的病毒顆粒。如果該顆粒含有異源性多核苷酸(即，除野生型AAV基因組以外的多核苷酸，例如要遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因)，一般稱為“rAAV載體顆?！被蚝?jiǎn)單地稱為“rAAV載體”。由于這種載體包含于rAAV顆粒中，產(chǎn)生rAAV顆粒需要包括產(chǎn)生rAAV載體。
“包裝”指導(dǎo)致AAV顆粒裝配和包裹的一系列胞內(nèi)過(guò)程。
AAV“rep”和“cap”基因指編碼腺伴隨病毒的復(fù)制和包裹蛋白的多核苷酸序列。文中AAV rep和cap指AAV“包裝基因”。
AAV的“輔助病毒”指能使AAV(例如，野生型AAV)被哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制和包裝的病毒。各種這樣的AAV輔助病毒是本領(lǐng)域已知的，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。雖然C亞群的5型腺病毒是最常用的，但腺病毒還包括許多不同的亞群。已知許多人、非人哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)源的腺病毒并可得自保藏機(jī)構(gòu)，例如ATCC。皰疹家族的病毒包括，例如單純皰疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(EBV)以及巨細(xì)胞病毒和假狂犬病病毒(PRV)，這些病毒也可得自保藏機(jī)構(gòu)，例如ATCC。
“輔助病毒功能物”指包含于輔助病毒基因組中使得AAV復(fù)制和包裝(以及文中所述復(fù)制和包裝的其它需要)的功能物。如文中所述，“輔助病毒功能物”可以許多方式提供，包括通過(guò)提供輔助病毒或提供，例如將編碼所需功能物的多核苷酸序列以反式提供給生產(chǎn)細(xì)胞。
“感染性”病毒或病毒顆粒是含有能將多核苷酸成分遞送進(jìn)該病毒種類具有嗜性的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)無(wú)需暗示病毒有任何復(fù)制能力。文中和本領(lǐng)域均描述了計(jì)數(shù)感染性病毒顆粒的試驗(yàn)。病毒感染力可表達(dá)為P∶I比或病毒顆?？倲?shù)與感染性病毒顆粒之比。
“可復(fù)制型”病毒(例如，可復(fù)制型AAV)指具有野生型表型的病毒，該病毒是感染性的并且也能被感染的細(xì)胞(即，在輔助病毒或輔助病毒功能物存在時(shí))中復(fù)制。就AAV而言，復(fù)制能力通常需要存在功能性AAV包裝基因。總體上，由于缺少一種或多種AAV包裝基因，文中所述的rAAV載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(尤其是在人細(xì)胞中)中無(wú)復(fù)制能力。為了盡可能降低AAV包裝基因和引入的rAAV載體之間重組產(chǎn)生可復(fù)制AAV，這種rAAV載體通常缺乏任何AAV包裝基因序列。在許多實(shí)施方案中，文中所述的rAAV載體制劑含有的可復(fù)制性AAV(rcAAV，也稱為RCA)即使有也極少(例如，每102個(gè)rAAV顆粒中約不到1個(gè)rcAAV，每104個(gè)rAAV顆粒中約不到1個(gè)rcAAV，每108個(gè)rAAV顆粒中約不到1個(gè)，每1012個(gè)rAAV顆粒中約不到1個(gè)rcAAV，或無(wú)rcAAV)。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式，包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可含有修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物，并且可插入非核苷酸成分。如果核苷酸結(jié)構(gòu)中存在修飾，則這種修飾可在聚合物裝配之前或之后進(jìn)行。文中使用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸指雙鏈或單鏈分子。除非另有規(guī)定或需要，文中所述的任何多核苷酸的實(shí)施方案包括雙鏈形式與已知的或預(yù)計(jì)要形成雙鏈形式的兩條互補(bǔ)單鏈形式的任一條。
核酸雜交反應(yīng)可在各種“嚴(yán)謹(jǐn)性”條件下進(jìn)行。提高雜交反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性的條件是本領(lǐng)域熟知并公之于眾的。參見(jiàn)，引為參考的Sambrook等.，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版.，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989。例如，參見(jiàn)該著作的7.52頁(yè)。相關(guān)條件的例子包括(為增加嚴(yán)謹(jǐn)性)孵育溫度為25℃、37℃、50℃和68℃；緩沖液濃度為10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(其中1×SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)和采用與它們相等的其它緩沖系統(tǒng)；甲酰胺濃度為0％、25％、50％和75％；孵育時(shí)間從5分鐘到24小時(shí)；1、2次或更多次的洗滌步驟；洗滌孵育時(shí)間為1、2或15分鐘以及洗滌溶液為6×SSC、1×SSC、0.1×SSC或去離子水。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是在50℃或更高的溫度與0.1×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中雜交。另一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子是于42℃在以下溶液中孵育過(guò)夜50％甲酰胺、1×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml經(jīng)變性剪切的鮭魚精子DNA，然后于65℃在0.1×SSC中洗滌過(guò)濾器。另一個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的例子包括于65℃在含有以下成分的溶液中預(yù)雜交8小時(shí)到過(guò)夜6×單倍濃度的檸檬酸鹽(SSC)(1×SSC是0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉；pH7.0)、5×Denhardt溶液、0.05％焦磷酸鈉和100μg/ml鯡魚精子DNA；然后于65℃在含有以下物質(zhì)的溶液中雜交18-20小時(shí)6×SSC、1×Denhardt溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸鈉；于65℃在含有0.2×SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中洗滌過(guò)濾物1小時(shí)。
嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是至少與上述代表性條件一樣嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。其它嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是本領(lǐng)域已知的也可用于鑒定本發(fā)明的該特定實(shí)施方案的核酸。
“Tm”是50％通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)由互補(bǔ)鏈的氫以反平行方向結(jié)合形成的多核苷酸雙螺旋在實(shí)驗(yàn)條件下解離成為單鏈的攝氏溫度。Tm可按照標(biāo)準(zhǔn)式估計(jì)，例如Tm＝81.5+16.6log[X+]+0.41(％G/C)-0.61(％F)-600/L其中[X+]是以mol/L計(jì)的陽(yáng)離子濃度(一般是鈉離子，Na+)；(％G/C)是G和C殘基的數(shù)目占雙螺旋中總殘基的百分比；(％F)是溶液中甲酰胺的百分比(重量/體積)；L是該雙螺旋中每條鏈的核苷酸數(shù)目。
多核苷酸或多肽與另一條多核苷酸或多肽具有某種“序列相同性”百分比，這意味著當(dāng)對(duì)比時(shí)，在兩條序列相比中相同的堿基或氨基酸的百分比。序列的相似性可以許多方式確定。為測(cè)定序列相同性，可使用得自萬(wàn)維網(wǎng)的ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/方法和計(jì)算機(jī)程序，包括BLAST來(lái)對(duì)比序列。另一種對(duì)比算法是得自Madison，Wisconsin，美國(guó)的Genetics Computing Group(GCG)軟件包的FASTA，其是Oxford Molecular Group，Inc的全資子公司。其它用于對(duì)比的其它技術(shù)描述于《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)226卷“用于大分子序列分析的計(jì)算機(jī)方法”(Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis)，(1996)，Doolittle編，Academic Press，Inc.(美國(guó)，加利福尼亞，SanDiego，Harcourt Brace & Co.的一個(gè)部門)。允許序列中有空格的算法程序是尤其感興趣的。Smith-Waterman是允許序列對(duì)比中有空格的一類算法。參見(jiàn)，Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。同樣，可使用Needleman和Wunsch對(duì)比方法的GAP程序來(lái)對(duì)比序列。參見(jiàn)，J.Mol.Biol.48443-453(1970)。
使用Smith Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics2482-489(1981))來(lái)確定序列相同性的BestFit程序是令人感興趣的?？崭癞a(chǎn)生罰分一般從1到5分，經(jīng)常是2到4分，在許多實(shí)施方案中是3分?？崭裱由炝P分一般從約0.01到0.20分，在許多例子中是0.10分。該程序的默認(rèn)參數(shù)由待比較的輸入序列確定。優(yōu)選使用由該程序確定的默認(rèn)參數(shù)測(cè)定序列的相同性。該程序也得自Madison，Wisconsin，美國(guó)的Genetics Computing Group(GCG)軟件包。
另一個(gè)感興趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于《序列比較和分析、大分子測(cè)序與合成、所選擇的方法與應(yīng)用的最新方法》(Current Methods inSequence Comparison and Analysis，Macromolecule Sequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications)，127-149頁(yè)，1988，Alan R.Liss，Inc?；谝韵聟?shù)通過(guò)FastDB計(jì)算序列相同性的百分比錯(cuò)配罰分1.00；空格罰分1.00；空格大小罰分0.33；和連接罰分30.0。
“基因”指至少含有一個(gè)開(kāi)放讀框的多核苷酸，該多核苷酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯后能編碼某特定蛋白質(zhì)。
“小干擾”或“短干擾RNA”或siRNA是能靶向感興趣基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA雙螺旋?！癛NA雙螺旋”指通過(guò)RNA分子的兩個(gè)區(qū)域之間互補(bǔ)配對(duì)所形成的結(jié)構(gòu)。siRNA“靶向”某基因，即siRNA雙螺旋部分的核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，siRNA雙螺旋的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雙螺旋的長(zhǎng)度可是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雙螺旋的長(zhǎng)度可是19-25個(gè)核苷酸。siRNA的雙螺旋部分可是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分。除了雙螺旋部分，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可含有位于形成雙螺旋的兩條序列之間的環(huán)形部分。該環(huán)的長(zhǎng)度可不同。在一些實(shí)施方案中，該環(huán)的長(zhǎng)度是5、6、7、8、9、10、11、12或13個(gè)核苷酸。發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可含有3’或5’突出端部分。在一些實(shí)施方案中，突出端是長(zhǎng)度為0、1、2、3、4或5個(gè)核苷酸的3’或5’突出端。
應(yīng)用于多核苷酸的術(shù)語(yǔ)“重組子”指該多核苷酸是克隆、限制性酶切或連接步驟和其它方法的各種組合的產(chǎn)物，這些方法導(dǎo)致不同于天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的結(jié)構(gòu)。重組病毒是含有重組多核苷酸的病毒顆粒。這些術(shù)語(yǔ)分別包括原始多核苷酸構(gòu)建物的復(fù)制物和原始病毒構(gòu)建物的后代。
“控制元件”或“控制序列”是涉及功能性調(diào)節(jié)多核苷酸的分子間相互作用的核苷酸序列，包括該多核苷酸的復(fù)制、加倍、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯或降解。調(diào)節(jié)作用可影響這些過(guò)程的頻率、速度或特異性，并且調(diào)節(jié)可以是增強(qiáng)或抑制。本領(lǐng)域已知的控制元件包括，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)。啟動(dòng)子是在某些條件下能結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)通常位于啟動(dòng)子下游(3’方向)的編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域“操作性連接”或“可操作地連接”指遺傳元件的并置，其中各元件的關(guān)系使得它們能以期待的方式操作。例如，如果某啟動(dòng)子能幫助啟動(dòng)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子是操作性連接于編碼區(qū)域。啟動(dòng)子和編碼區(qū)域之間可有間插殘基，前提是可維持這種功能性關(guān)系。
“表達(dá)載體”是含有編碼感興趣某多肽區(qū)域的載體，可用于影響預(yù)定靶細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)載體也含有操作性連接于該編碼區(qū)域以協(xié)助蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中表達(dá)的控制元件。控制元件與和其操作性相連的一個(gè)或多個(gè)基因的組合有時(shí)稱為“表達(dá)盒”，其中大多數(shù)“表達(dá)盒”是本領(lǐng)域已知且和可用的，或者可從本領(lǐng)域可用的成分容易地構(gòu)建。
“異源性”指衍生自基因型不同于要比較實(shí)體的剩余部分的實(shí)體。例如，通過(guò)遺傳工程技術(shù)引入衍生自不同種類生物的質(zhì)?；蜉d體的多核苷酸是異源性多核苷酸。將取自天然編碼序列的啟動(dòng)子操作性連接于天然不與之相連的其編碼序列，這種啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。所以，例如，含有編碼異源基因產(chǎn)物的異源核酸的rAAV，是含有天然存在的野生型AAV中通常不含有的核酸的rAAV，其編碼的異源基因產(chǎn)物是天然存在的野生型AAV通常不編碼的基因產(chǎn)物。
術(shù)語(yǔ)“遺傳改變”或“遺傳修飾”(極其語(yǔ)法上的改變形式)在文中可互換使用來(lái)指不通過(guò)有絲分裂或減數(shù)分裂將遺傳元件(例如，多核苷酸)引入細(xì)胞的方法。所述元件對(duì)細(xì)胞可是異源的，或者可是早已存在于細(xì)胞中的元件的額外拷貝或改進(jìn)形式。遺傳改變可例如通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法用重組質(zhì)?；蚱渌嗪塑账徂D(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法例如電穿孔、磷酸鈣沉淀或與多核苷酸脂質(zhì)體復(fù)合物接觸。遺傳改變也可例如通過(guò)用DNA或RNA病毒或病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染來(lái)實(shí)現(xiàn)。遺傳元件通常引入細(xì)胞的染色體或微小染色體中；但任何能改變細(xì)胞及其后代的表型和/或基因型的變化均包含于該術(shù)語(yǔ)。
如果某基因序列在細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)期間能被利用執(zhí)行其功能，就認(rèn)為該細(xì)胞受到該基因序列“穩(wěn)定”改變、轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳修飾或轉(zhuǎn)化。這種細(xì)胞通常是“遺傳上”受到改變的(遺傳修飾)，即引入的遺傳改變也可遺傳給所改變細(xì)胞的后代。
術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在文中可互換使用來(lái)指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。該術(shù)語(yǔ)也包括被修飾的氨基酸聚合物，例如，二硫鍵的形成、糖基化、脂質(zhì)化、磷酸化或與標(biāo)記成分偶聯(lián)。當(dāng)向哺乳動(dòng)物對(duì)象遞送文中所述基因產(chǎn)物多肽(例如“CFTR”、“p53”或“EPO”等)及其組合物時(shí)，所述多肽及其組合物分別指保留了完整蛋白質(zhì)所需生化功能的完整多肽、或其任何片段或其遺傳工程改造的衍生物。類似地，CFTR、p53、EPO基因和用于遞送基因產(chǎn)物至哺乳動(dòng)物對(duì)象(也指向接納細(xì)胞遞送“轉(zhuǎn)基因”)的其它這種基因包括編碼擁有所需生化功能的完整多肽或任何片段或遺傳工程改造的衍生物的多核苷酸。
“分離的”質(zhì)粒、核酸、載體、病毒、宿主細(xì)胞或其它物質(zhì)，指所述物質(zhì)至少缺乏某些其它成分的制品，這些成分也可存在于這些物質(zhì)或類似物質(zhì)天然狀況或最初從其制備時(shí)。所以，例如分離的物質(zhì)可使用純化技術(shù)從來(lái)源的混合物中富集而制備?？稍诮^對(duì)基礎(chǔ)上測(cè)定富集情況，例如重量溶液體積比，或者可相對(duì)于起源混合物中存在的第二種潛在的干擾物質(zhì)來(lái)測(cè)定。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，富集程度增加則分離程度也增加。在一些實(shí)施方案中，分離的質(zhì)粒、核酸、載體、宿主細(xì)胞或其它物質(zhì)純度例如為約80％純化至約90％純，至少約90％純、至少約95％純、至少約98％或至少約99％或更純。
文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”、“治療的”等指獲得所需的藥理和/或生理作用。就完全或部分防止疾病或其癥狀而言，該作用可是預(yù)防性的，就部分或完全治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良影響而言，該作用可是治療性的。文中使用的“治療”包括治療哺乳動(dòng)物特別是人的疾病，并且包括(a)在易于患病或有患病危險(xiǎn)但還未診斷出患病的對(duì)象中防止發(fā)生疾??；(b)抑制疾病，即停止其發(fā)展；和(c)緩解疾病，即使疾病消退。
術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“宿主”、“對(duì)象”和“患者”在文中可互換使用，并且指哺乳動(dòng)物，包括(但不限于)人和非人靈長(zhǎng)類，包括猿和人；哺乳動(dòng)物中的運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(例如，馬)；哺乳動(dòng)物中的農(nóng)用動(dòng)物(例如，綿羊、山羊等)；哺乳動(dòng)物中的寵物(狗、貓等)；和嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠等)。
在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明不限于所述的具體實(shí)施方案，因?yàn)檫@些實(shí)施方案當(dāng)然是可變的。既然本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求限制，文中使用的術(shù)語(yǔ)也應(yīng)理解是僅為了描述具體的實(shí)施方案而非限制。
除非文中另有明確指明，在提供數(shù)值范圍的地方應(yīng)理解的是，該范圍上下限之間每個(gè)插入值或該范圍中其它任何描述的或插入的值也包括于本發(fā)明中。這些小范圍的上下限可獨(dú)立地包括在屬于所述范圍任何具體排除端點(diǎn)的范圍的較小范圍內(nèi)，并且也包括于本發(fā)明中。在所述范圍包括一邊或兩邊界限的地方，排除一邊或兩邊的界限的范圍也包括于本發(fā)明中。
除非另有定義，所有文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。雖然可用任何相似或等價(jià)于文中所述的方法和材料來(lái)實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，優(yōu)選的方法和材料是現(xiàn)在所述的。文中提及的所有出版物均引為參考來(lái)披露和描述與所引用出版物有關(guān)的方法和/或材料。
必須注意的是，除非文中另有明確指明，文中和附加的權(quán)利要求所使用的單數(shù)形式的“一個(gè)”、“和”與“該”包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，“一個(gè)rAAV載體”包括多個(gè)這種載體并且“AAV突變的衣殼蛋白”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)AAV突變的衣殼蛋白及其等價(jià)物，等等。
提供文中所述的出版物僅是因?yàn)槠鋬?nèi)容先公開(kāi)于本申請(qǐng)的提交日期。文中沒(méi)有什么可被解釋為承認(rèn)由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不具資格早于該出版物。此外，提供的出版物的發(fā)表日期可能不同于實(shí)際發(fā)表日期，這些日期可能需要獨(dú)立證實(shí)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供衣殼性能顯示出變化的突變的腺伴隨病毒(AAV)，所述性能改變是例如與血清中和抗體的結(jié)合能力降低和/或與肝素結(jié)合能力改變和/或?qū)μ囟?xì)胞類型的感染力的改變。本發(fā)明還提供在衣殼基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變的突變型AAV文庫(kù)。本發(fā)明還提供產(chǎn)生突變型AAV、突變型AAV文庫(kù)的方法，和含有突變型AAV或突變型AAV文庫(kù)的組合物。本發(fā)明還提供含有突變的衣殼蛋白的重組AAV(rAAV)病毒顆粒。本發(fā)明還提供含有編碼突變的衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸與含有所述核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供向個(gè)體遞送基因產(chǎn)物的方法，所述方法通常涉及向需要它的個(gè)體施用有效量的所述rAAV病毒粒子。在許多實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒顆粒、所述核酸等是分離的。
所述突變型AAV病毒顆粒或所述rAAV病毒粒子表現(xiàn)出一種或多種以下性能1)對(duì)硫酸肝素的結(jié)合親和力比野生型AAV高；2)對(duì)硫酸肝素的結(jié)合親和力比野生型AAV低；3)對(duì)AAV感染具有抗性的細(xì)胞的感染能力提高，或者與原型可感染細(xì)胞相比，不易被AAV感染的細(xì)胞的感染力提高；4)對(duì)中和抗體的逃逸能力提高；和5)穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高。
編碼AAV突變的衣殼蛋白的所述核酸用于產(chǎn)生表現(xiàn)出性能改變的重組AAV病毒顆粒，所述性能改變例如對(duì)硫酸肝素的結(jié)合親和力提高，對(duì)硫酸肝素的結(jié)合親和力降低，對(duì)AAV感染具有抗性的細(xì)胞的感染力提高，或者與原型可感染細(xì)胞細(xì)胞對(duì)不易被AAV感染的細(xì)胞的感染力提高，對(duì)中和抗體的逃逸作用和穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高等。所述rAAV病毒粒子可用于將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體。
細(xì)胞膜結(jié)合的硫酸肝素蛋白聚糖是AAV(例如，AAV-2)的主要細(xì)胞表面受體。例如在以局部方式(例如，不需要rAAV顆粒從遞送位擴(kuò)散)遞送rAAV顆粒時(shí)提高硫酸肝素結(jié)合能力(例如，提高對(duì)肝素的親和力)是有利的。許多類型的細(xì)胞能在細(xì)胞表面或緊靠細(xì)胞的環(huán)境中產(chǎn)生硫酸肝素。所以，對(duì)硫酸肝素結(jié)合親和力提高的rAAV病毒粒子可相對(duì)接近地維持在施用位置。例如，局部遞送所述rAAV病毒粒子對(duì)將基因產(chǎn)物遞送至位于某解剖學(xué)位置(而不遞送至例如非癌性組織的周圍)的腫瘤、遞送至患病的心血管(但不遞送至健康心臟組織的周圍)等是有利的。
本發(fā)明的許多實(shí)施方案例舉了AAV-2和AAV-2的突變體。然而，文中例舉的AAV-2絕非限制性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用文中所述的方法來(lái)產(chǎn)生其它AAV的衣殼突變體，例如包括AAV-3、AAV-4、AAV-5等。所以，在例如AAV與整聯(lián)蛋白αvβ5的β5亞基結(jié)合時(shí)，本發(fā)明考慮了相比于對(duì)應(yīng)的野生型AAV表現(xiàn)出與整聯(lián)蛋白αvβ5的β5亞基結(jié)合能力增加或降低的突變型AAV。另一個(gè)例子中，在一種AAV(例如，AAV-4)與O-連接的唾液酸結(jié)合的場(chǎng)合，本發(fā)明考慮了表現(xiàn)出與O-連接的唾液酸結(jié)合能力增加或降低的突變型AAV。另一個(gè)例子中，在一種AAV(例如，AAV-5)與N-連接的唾液酸或血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)結(jié)合時(shí)，本發(fā)明考慮了表現(xiàn)出與N-連接的唾液酸或PDGFR的結(jié)合能力增加或降低的突變型AAV。對(duì)AAV受體的描述可參見(jiàn)，例如Kaludov等.，((2001)J Virol.756884)；Pasquale等.，((2003)Nat.Med.91306)和Walters等.，((2001)J Biol Chem.27620610)。
提高對(duì)肝素的親和力的優(yōu)點(diǎn)也在于它提高了對(duì)通常AAV難以感染的細(xì)胞類型，例如非感染細(xì)胞類型和“低感染”細(xì)胞類型(例如，相比于原型可感染細(xì)胞不易被感染的細(xì)胞)的感染力。這種細(xì)胞類型包括其表面硫酸肝素含量較少的細(xì)胞。提高對(duì)硫酸肝素的結(jié)合親和力提高了對(duì)表面硫酸肝素較少的細(xì)胞的結(jié)合水平，從而提高了對(duì)這些細(xì)胞的感染力。不易被AAV感染的細(xì)胞的例子包括干細(xì)胞。所述rAAV病毒粒子的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)樗芨腥靖杉?xì)胞從而能遞送基因產(chǎn)物至干細(xì)胞。AAV不能感染或不易感染細(xì)胞的其它例子包括肺上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。
降低硫酸肝素結(jié)合能力(例如，降低肝素親和力)的優(yōu)點(diǎn)是更廣泛分布或全身性遞送所述rAAV病毒粒子的治療方法所需的。這種rAAV病毒粒子從施用位置擴(kuò)散，因此可比含有野生型衣殼蛋白的rAAV病毒粒子感染更多數(shù)量的細(xì)胞。
降低與中和抗體的結(jié)合是有利的。中和抗體能與野生型衣殼蛋白結(jié)合。中和抗體與野生型衣殼蛋白結(jié)合可具有幾種效應(yīng)，包括限制病毒顆粒中含有野生型衣殼蛋白的rAAV病毒粒子的駐留時(shí)間，防止其與細(xì)胞表面結(jié)合，凝聚病毒，誘導(dǎo)衣殼結(jié)構(gòu)的改變，和防止病毒解裝配和脫衣殼(釋放DNA需要的步驟)。因此，對(duì)中和抗體結(jié)合能力降低的rAAV顆粒，可提高其感染細(xì)胞的能力以及增加在施用rAAV病毒粒子的對(duì)象體內(nèi)的駐留時(shí)間。因此增加了基因產(chǎn)物遞送的有效持續(xù)時(shí)間。
提高穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力使得rAAV病毒粒子可接近從施用位置被內(nèi)皮細(xì)胞層隔開(kāi)的組織和細(xì)胞。例如，血腦屏障、腫瘤血管系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)均存在形成屏障的內(nèi)皮細(xì)胞層阻礙了接近特定的解剖學(xué)位置。因此，所述rAAV病毒粒子可表現(xiàn)出一種或多種以下性能1)穿過(guò)血腦屏障的能力增加；2)穿過(guò)腫瘤血管系統(tǒng)和感染腫瘤細(xì)胞的能力增加；和3)穿過(guò)心臟中內(nèi)皮細(xì)胞層的能力增加。
突變體腺伴隨病毒的病毒粒子本發(fā)明提供的突變的腺伴隨病毒含有顯示衣殼性能改變的突變的衣殼蛋白。由于含有一種或多種突變的衣殼蛋白，所述突變型AAV表現(xiàn)出一種或多種以下性能1)相比于野生型AAV，肝素結(jié)合親和力提高；2)相比于野生型AAV，肝素結(jié)合親和力降低；3)對(duì)AAV不能感染細(xì)胞的感染力提高；4)逃逸中和抗體作用的能力提高；和5)穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高。所述突變型AAV的這些性能是與對(duì)應(yīng)的親代野生型AAV相比較。所以，例如當(dāng)親代野生型AAV是AAV-2時(shí)，所述突變體的性能是與野生型AAV-2的相同性能作比較。
肝素親和力提高的突變體在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV編碼的衣殼蛋白顯示與硫酸肝素的結(jié)合親和力比野生型AAV提高了。在這些實(shí)施方案中，所述突變型AAV編碼的衣殼蛋白與硫酸肝素的結(jié)合親和力至少高于野生型AAV衣殼約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約2倍、約2.5倍、約5倍、約10倍、約15倍、約50倍、約75倍、或約100倍或更高。由于肝素是結(jié)構(gòu)上類似于硫酸肝素的分子，肝素經(jīng)常用于實(shí)驗(yàn)性確定衣殼蛋白與硫酸肝素的結(jié)合是否得到改變。所以，術(shù)語(yǔ)“肝素結(jié)合親和力”和“硫酸肝素結(jié)合親和力”和類似術(shù)語(yǔ)在文中可互換使用。
例如，盡管AAV-2與肝素的結(jié)合親和力的K(d)值約2.0nM，而所述突變型AAV與肝素的結(jié)合親和力至少高于野生型AAV-2與肝素的結(jié)合親和力約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約2倍、約2.5倍、約5倍、約10倍、約15倍、約50倍、約75倍、或約100倍或更高。
通常使用濃度范圍約從450mM到約550mM的NaCl將野生型AAV從肝素親和層析介質(zhì)上洗脫。在一些實(shí)施方案中，使用濃度高于550mM的NaCl從肝素親和層析介質(zhì)上洗脫所述突變型AAV，例如用約575mM到約600mMNaCl、從約600mM到約625mM NaCl、從約625mM到約650mM NaCl、從約650mM到約675mM NaCl、從約675mM到約700mM NaCl、從約700mM到約725mM NaCl、從約725mM到約750mM NaCl、從約750mM到約775mM NaCl、或從約775mM到約800mM NaCl、或更高。
肝素親和力降低的突變體在其它實(shí)施方案中，所述突變型AAV顯示對(duì)肝素的親和力低于野生型AAV。在這些實(shí)施方案中，當(dāng)所述突變型AAV被包裝在病毒顆粒中時(shí)，其與肝素的親和力比野生型AAV(例如AAV-2)至少約低10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述突變型AAV被包裝進(jìn)病毒顆粒中時(shí)，可使用NaCl將其從肝素親和層析介質(zhì)上洗脫，所用NaCl的濃度范圍可從約440mM到約400mM NaCl、從約400mM到約375mM NaCl、從約375mM到約350mM NaCl、從約350mM到約325mM NaCl、從約325mM到約300mM NaCl、從約300mM到約275mM NaCl、從約275mM到約250mM NaCl、從約250mM到約225mM NaCl、從約225mM到約200mMNaCl、或更低。
肝素結(jié)合親和力可使用任何已知的試驗(yàn)來(lái)確定。例如，變異衣殼與硫酸肝素的親和力可通過(guò)將病毒顆粒與固定化的肝素結(jié)合來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)，例如Qui等，(2000)Virolory 269137-147。
中和抗體逃逸突變體在一些實(shí)施方案中，相比于野生型AAV(“wt AAV”)或含有野生型衣殼蛋白的AAV，所述突變型AAV顯示對(duì)中和抗體的抗性提高。在這些實(shí)施方案中，所述突變型AAV對(duì)中和抗體的抗性比野生型AAV的約高10倍到約10,000倍的，例如所述突變型AAV對(duì)中和抗體的抗性比野生型AAV(“wt AAV”)或含有野生型衣殼蛋白的AAV的約高10倍到約25倍、約25倍到約50倍、約50倍到約75倍、約75倍到約100倍、約100到約150倍、約150倍到約200倍、約200倍到約250倍、約250倍到約300倍、至少約350倍、至少約400倍、約400倍到約450倍、約450倍到約500倍、約500倍到約550倍、約550倍到約600倍、約600倍到約700倍、約700倍到約800倍、約800倍到約900倍、約900倍到約1000倍、約1,000倍到約2,000倍、約2,000倍到約3,000倍、約3,000倍到約4,000倍、約4,000倍到約5,000倍、約5,000倍到約6,000倍、約6,000倍到約7,000倍、約7,000倍到約8,000倍、約8,000倍到約9,000倍或約9,000倍到約10,000倍。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV與能結(jié)合野生型AAV衣殼蛋白的中和抗體的結(jié)合能力降低了。例如，所述突變型AAV與能結(jié)合野生型AAV衣殼蛋白的中和抗體的結(jié)合能力降低了約10倍到約10,000倍。例如，所述突變型AAV與能結(jié)合野生型AAV衣殼蛋白的中和抗體的結(jié)合能力(例如，結(jié)合的親和力)降低了約10倍到約25倍、約25倍到約50倍、約50倍到約75倍、約75倍到約100倍、約100到約150倍、約150倍到約200倍、約200倍到約250倍、約250倍到約300倍、至少約350倍、至少約400倍、約400倍到約450倍、約450倍到約500倍、約500倍到約550倍、約550倍到約600倍、約600倍到約700倍、約700倍到約800倍、約800倍到約900倍、約900倍到約1000倍、約1,000倍到約2,000倍、約2,000倍到約3,000倍、約3,000倍到約4,000倍、約4,000倍到約5,000倍、約5,000倍到約6,000倍、約6,000倍到約7,000倍、約7,000倍到約8,000倍、約8,000倍到約9,000倍或約9,000倍到約10,000倍。
在一些實(shí)施方案中，抗AAV中和抗體與所述中和抗體逃逸突變型AAV結(jié)合的親和力約小于10-7M、約小于5×10-6M、約小于10-6M、約小于5×10-5M、約小于10-5M、約小于10-4M或更低。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV的體內(nèi)駐留時(shí)間比野生型AAV增加。例如，所述突變型AAV的駐留時(shí)間比野生型AAV的駐留時(shí)間長(zhǎng)至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約100％、至少約3倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或更多倍。
某給定突變型AAV是否表現(xiàn)出與中和抗體的結(jié)合能力降低和/或?qū)χ泻涂贵w的抗性提高可通過(guò)任何已知的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，包括實(shí)施例1所述的試驗(yàn)。例如，使突變型AAV在存在中和抗體時(shí)中與可感染細(xì)胞類型(例如，293細(xì)胞)接觸。對(duì)照樣品含有細(xì)胞、突變型AAV但無(wú)中和抗體。經(jīng)合適的時(shí)間后，使該細(xì)胞與腺病毒接觸，并測(cè)定AAV顆粒。將AAV顆粒的含量與沒(méi)有中和抗體時(shí)產(chǎn)生的AAV顆粒的量進(jìn)行比較。
感染力提高的突變體在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV顯示對(duì)AAV不能感染的細(xì)胞和低感染細(xì)胞的感染力提高。AAV不能感染的細(xì)胞和低感染的細(xì)胞在文中共同稱為“非感染細(xì)胞”。當(dāng)可感染的細(xì)胞群在體外或體內(nèi)與感染復(fù)數(shù)(moi)為5的AAV接觸，約70％到約100％的細(xì)胞群被AAV所感染。當(dāng)非感染細(xì)胞群在體外或體內(nèi)與moi為5的AAV接觸，約70％以下的細(xì)胞被AAV所感染，例如，細(xì)胞群中被AAV所感染的不到約60％到約69％、約50％到約60％、約40％到約50％、約30％到約40％、約20％到約30％、約10％到約20％、或約1％到約10％，并且在一些細(xì)胞類型中，基本上無(wú)細(xì)胞被AAV感染。
可通過(guò)使某特定類型的細(xì)胞群在體外或體內(nèi)與moi為5的rAAV構(gòu)建物接觸來(lái)容易地確定該細(xì)胞是AAV可感染或不能感染的，所述rAAV構(gòu)建物含有編碼提供可檢測(cè)信號(hào)(例如，熒光蛋白，如綠色熒光蛋白)蛋白的核苷酸序列。一定比例的細(xì)胞變?yōu)樵摍z測(cè)蛋白陽(yáng)性時(shí)，表明一定百分比的細(xì)胞已受到rAAV感染。當(dāng)約0％到約69％的細(xì)胞受到rAAV感染時(shí)，可認(rèn)為這些細(xì)胞對(duì)AAV是非感染性的。當(dāng)約70％到約100％的細(xì)胞被rAAV感染時(shí)，可認(rèn)為這些細(xì)胞對(duì)AAV是感染性的。感染力可表示為293細(xì)胞的相對(duì)感染力。在一些實(shí)施方案中，相比293細(xì)胞，AAV顯示對(duì)非感染性細(xì)胞的感染力降低，例如，AAV對(duì)非感染細(xì)胞的感染力不到對(duì)293細(xì)胞的感染力的70％，例如AAV對(duì)非感染細(xì)胞的感染力不到對(duì)293細(xì)胞的感染力的約70％、不到約60％、不到約50％、不到約40％、不到約30％、不到約20％、不到約10％或更低。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV對(duì)AAV較難感染的細(xì)胞(例如，非感染細(xì)胞)的感染能力提高。在這些實(shí)施方案中，所述突變型AAV對(duì)非感染細(xì)胞的感染力比野生型AAV高至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍或更高。
較難被AAV感染的細(xì)胞的例子包括干細(xì)胞。非感染細(xì)胞類型的其它例子包括(但不限于)肺上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。
文中使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”指能自我更新并能產(chǎn)生分化后代的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Morrison等.，(1997)Cell 88287-298)。干細(xì)胞通常也具有以下一種或多種性能進(jìn)行非同步或?qū)ΨQ性復(fù)制的能力，如此分裂后產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞可具有不同的表型；廣泛的自我更新能力；以有絲休眠形式存在的能力；和其存在的所有組織中無(wú)性再生的能力，例如造血干細(xì)胞重建造血譜系的能力?！敖M細(xì)胞”與干細(xì)胞的區(qū)別在于它們通常不具有廣泛的自我更新能力并且經(jīng)常僅能產(chǎn)生它們從中衍生的組織譜系的一個(gè)亞群，例如僅能產(chǎn)生造血系統(tǒng)中的淋巴譜系或紅細(xì)胞譜系。
干細(xì)胞的特征在于存在與用抗體鑒定的特異性表位相連的標(biāo)記，同時(shí)不存在通過(guò)缺乏與特異性抗體的結(jié)合而鑒定的特定標(biāo)記。干細(xì)胞也可通過(guò)體外和體內(nèi)的功能性試驗(yàn)來(lái)鑒定，特別是涉及干細(xì)胞產(chǎn)生多重分化后代能力的試驗(yàn)。
感興趣的干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和其衍生的組細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)5,061,620)；神經(jīng)嵴干細(xì)胞(參見(jiàn)Morrison等.，(1999)Cell 96737-749)；成人神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)組細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；中胚層干細(xì)胞等。其它感興趣的造血“組細(xì)胞”包括屬于淋巴譜系的細(xì)胞，例如不成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞群。
結(jié)構(gòu)特征所述突變型AAV病毒粒子在至少一種衣殼蛋白(例如，VP1、VP2和VP3中的至少一種)中含有突變。所以，相比于野生型AAV衣殼蛋白，VP1、VP2和VP3含有至少一個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，相比于野生型AAV衣殼蛋白，VP1、VP2和VP3含有至少含有約1到25個(gè)氨基酸取代，例如相比于野生型AAV VP1、VP2和VP3，含有約1到5個(gè)、約5到10個(gè)、約10到15個(gè)、約15到20個(gè)或約20到25個(gè)氨基酸取代?；蛘撸啾扔谝吧鸵職さ鞍?，所述突變型AAV病毒粒子在至少一種衣殼蛋白中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或插入。在一些實(shí)施方案中，相比于野生型衣殼蛋白，所述突變型AAV病毒粒子在衣殼蛋白中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代和/或缺失和/或插入。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子與中和抗體的結(jié)合能力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO7、9、11、I3、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或圖5A-C或圖7A-D所示氨基酸序列至少具有約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子顯示與中和抗體的結(jié)合能力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO7、9、11、I3、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或圖5A-C或圖7A-D所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20個(gè)氨基酸差異。在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子與中和抗體的結(jié)合能力比野生型AAV降低，并且其所含VP1具有如SEQ ID NO7、9、11、I3、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或圖5A-C或圖7A-D所示的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV增加，并且其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO35或SEQ IDNO37所示或圖9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列至少具有約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子與硫酸肝素的親和力比野生型AAV增高，并且其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或圖9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20個(gè)氨基酸差異。在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子與硫酸肝素的親和力比野生型AAV增高，并且其所含VP1具有如SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或如圖9A-C(D14H1或D14L3)所示的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO39或SEQ IDNO41所示或圖9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列至少具有約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV降低，并且其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO39或SEQ IDNO41所示或圖9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20個(gè)氨基酸差異。在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV降低，并且其所含VP1具有如SEQ ID NO39或SEQID NO41所示或如圖9A-C(P1BH1或P1BH2)所示的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述突變型AAV病毒粒子含有野生型Rep73、Rep68、Rep52和Rep40蛋白。在其它的實(shí)施方案中，所述突變型AAV除了含有一個(gè)或多個(gè)突變的衣殼蛋白外，在一個(gè)或多個(gè)Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40蛋白中還含有一個(gè)或多個(gè)突變。
核酸與宿主細(xì)胞本發(fā)明提供含有編碼AAV突變的衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸以及含有所述核酸的宿主細(xì)胞。該核酸與宿主細(xì)胞可如下所述用于產(chǎn)生rAAV病毒粒子。所述核酸編碼含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的一種或多種VP1、VP2和VP3。對(duì)象核酸含有編碼VP1、VP2和VP3中至少一種的核苷酸序列，其中所編碼的衣殼蛋白與野生型AAV衣殼蛋白相比含有1到約15個(gè)氨基酸取代，例如與野生型AAV衣殼蛋白相比，所編碼的衣殼蛋白含有約1到5個(gè)、約5到10個(gè)、約10到15個(gè)、約15到20個(gè)、或約20到25個(gè)氨基酸取代。所編碼的衣殼蛋白與野生型AAV衣殼蛋白相比可額外含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或插入。
在一些實(shí)施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列與SEQ ID NO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或圖4A-G、圖6A-J或圖8A-G中所示任一核苷酸序列具有約1到30個(gè)核苷酸的差異(例如，約1到5、約5到10、約10到20或約20到30核苷酸差異)。在一些實(shí)施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與含有SEQ ID NO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或圖4A-G、圖6A-J或圖8A-G中所述任一核苷酸序列的核酸雜交。在一些實(shí)施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列與SEQID NO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或圖4A-G、圖6A-J或圖8A-G中所示任一核苷酸序列具有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或更高的相同性。在一些實(shí)施方案中，所示核酸含有的核酸具有SEQ IDNO2、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中任一所示或圖4A-G、圖6A-J或圖8A-G中所示任一核苷酸序列。
本發(fā)明還提供含有所述核酸的宿主細(xì)胞，例如，分離的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞通常是分離的細(xì)胞，例如，體外培養(yǎng)中的細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可如下所述用于生產(chǎn)所述rAAV病毒粒子。當(dāng)將所述宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)所述rAAV病毒粒子時(shí)，所述宿主細(xì)胞指“包裝細(xì)胞”。在一些實(shí)施方案中，用所述核酸穩(wěn)定地遺傳修飾所述宿主細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，用所述核酸瞬時(shí)修飾所述宿主細(xì)胞。
使用已知的技術(shù)將所述核酸穩(wěn)定地或瞬時(shí)引入宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)包括(但不限于)電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化等。為進(jìn)行穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，所述核酸通常還包含可選擇標(biāo)記，例如新霉素抗性等幾種已知的可選擇標(biāo)記中的任一種。
通過(guò)將所述核酸引入各種細(xì)胞得到所述宿主細(xì)胞，所述各種細(xì)胞是例如包括鼠細(xì)胞和靈長(zhǎng)類細(xì)胞(例如，人細(xì)胞)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括(但不限于)靈長(zhǎng)類細(xì)胞和細(xì)胞系，其中合適的細(xì)胞系包括(但不限于)293細(xì)胞、COS細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Vero細(xì)胞、3T3小鼠成纖維細(xì)胞、C3H10T1/2成纖維細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。
在一些實(shí)施方案中，除了含有編碼突變的衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸之外，所述宿主細(xì)胞還含有編碼一種或多種AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞還含有下述rAAV載體。使用所述宿主細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)rAAV病毒粒子將在下文詳述。
rAAV病毒粒子突變的衣殼蛋白摻入含有異源核酸的AAV，該異源核酸產(chǎn)生異源基因產(chǎn)物(例如，異源核酸或異源蛋白質(zhì))。所述重組AAV病毒粒子(“rAAV病毒粒子”)含有突變的衣殼蛋白和含有編碼異源基因產(chǎn)物的異源核酸。所以，本發(fā)明提供含有上述突變的衣殼蛋白和異源核酸的rAAV病毒粒子。所述rAAV病毒粒子用于將基因產(chǎn)物引入個(gè)體。
所述rAAV病毒粒子含有上述突變的衣殼蛋白。由于含有突變的衣殼蛋白，所述rAAV病毒粒子顯示一種或多種以下性能1)相比于野生型AAV，肝素結(jié)合親和力提高；2)相比于野生型AAV，肝素結(jié)合親和力降低；3)對(duì)AAV非感染細(xì)胞的感染力提高；4)逃逸中和抗體的能力提高；和5)穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與肝素的結(jié)合親和力高于野生型AAV病毒粒子。在這些實(shí)施方案中，所述對(duì)象rAAV病毒粒子編碼的衣殼蛋白顯示與肝素的親和力比野生型AAV衣殼高至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約50倍、至少約75倍、或至少約100倍或更高。通常使用濃度范圍約從450mM到約550mM的NaCl將野生型AAV從肝素親和層析介質(zhì)上洗脫。在一些實(shí)施方案中，使用濃度高于550mM的NaCl從肝素親和層析介質(zhì)上洗脫所述rAAV，例如從約575mM到約600mM NaCl、從約600mM到約625mM NaCl、從約625mM到約650mM NaCl、從約650mM到約675mM NaCl、從約675mM到約700mM NaCl、從約700mM到約725mM NaCl、從約725mM到約750mM NaCl、從約750mM到約775mM NaCl、或從約775mM到約800mM NaCl、或更高。
在其它實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與肝素的親和力低于野生型AAV。在這些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與肝素的親和力比野生型AAV低至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％。在一些實(shí)施方案中，可使用NaCl將所述rAAV病毒粒子從肝素親和層析介質(zhì)上洗脫，NaCl的濃度范圍可從約440mM到約400mM NaCl、從約400mM到約375mM NaCl、從約375mM到約350mM NaCl、從約350mM到約325mM NaCl、從約325mM到約300mM NaCl、從約300mM到約275mM NaCl、從約275mM到約250mMNaCl、從約250mM到約225mM NaCl、從約225mM到約200mM NaCl、或更低。
肝素結(jié)合親和力可使用任何已知試驗(yàn)來(lái)確定。例如，變異衣殼與硫酸肝素的親和力可通過(guò)使病毒顆粒與固定化肝素結(jié)合來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)，例如Qui等，(2000)Virolory 269137-147。
在一些實(shí)施方案中，相比于野生型AAV或含有野生型衣殼蛋白的AAV，所述rAAV病毒粒子對(duì)中和抗體的抗性提高。在這些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子對(duì)中和抗體的抗性比wt AAV高約10倍到約10,000倍的，例如對(duì)象rAAV病毒粒子對(duì)中和抗體的抗性比野生型AAV或含有野生型衣殼蛋白的AAV的高約10倍到約25倍、約25倍到約50倍、約50倍到約75倍、約75倍到約100倍、約100到約150倍、約150倍到約200倍、約200倍到約250倍、約250倍到約300倍、至少約350倍、至少約400倍、約400倍到約450倍、約450倍到約500倍、約500倍到約550倍、約550倍到約600倍、約600倍到約700倍、約700倍到約800倍、約800倍到約900倍、約900倍到約1000倍、約1,000倍到約2,000倍、約2,000倍到約3,000倍、約3,000倍到約4,000倍、約4,000倍到約5,000倍、約5,000倍到約6,000倍、約6,000倍到約7,000倍、約7,000倍到約8,000倍、約8,000倍到約9,000倍或約9,000倍到約10,000倍。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與能結(jié)合野生型AAV衣殼蛋白的中和抗體的結(jié)合能力降低。例如，所述突變型rAAV病毒粒子與能結(jié)合野生型AAV衣殼蛋白結(jié)合的中和抗體的結(jié)合能力降低約10倍到約10,000倍。例如，所述突變型rAAV病毒粒子與能結(jié)合野生型AAV衣殼蛋白的中和抗體的結(jié)合能力降低約10倍到約25倍、約25倍到約50倍、約50倍到約75倍、約75倍到約100倍、約100到約150倍、約150倍到約200倍、約200倍到約250倍、約250倍到約300倍、至少約350倍、至少約400倍、約400倍到約450倍、約450倍到約500倍、約500倍到約550倍、約550倍到約600倍、約600倍到約700倍、約700倍到約800倍、約800倍到約900倍、約900倍到約1000倍、約1,000倍到約2,000倍、約2,000倍到約3,000倍、約3,000倍到約4,000倍、約4,000倍到約5,000倍、約5,000倍到約6,000倍、約6,000倍到約7,000倍、約7,000倍到約8,000倍、約8,000倍到約9,000倍或約9,000倍到約10,000倍。
在一些實(shí)施方案中，抗AAV中和抗體與所述rAAV病毒粒子結(jié)合的親和力約小于10-7M、約小于5×10-6M、約小于10-6M、約小于5×10-5M、約小于10-5M、約小于10-4M或更低。
與中和抗體的結(jié)合能力降低的所述rAAV病毒粒子顯示在體內(nèi)的駐留時(shí)間比含有野生型衣殼蛋白的AAV病毒粒子的長(zhǎng)。例如，所述rAAV病毒粒子在體內(nèi)的駐留時(shí)間比含有野生型衣殼蛋白的AAV病毒粒子的駐留時(shí)間至少長(zhǎng)約25％、至少約50％、至少約75％、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約50倍或更多倍。
某給定的突變型rAAV病毒粒子是否表現(xiàn)出與中和抗體的結(jié)合能力降低和/或?qū)χ泻涂贵w的抗性提高可通過(guò)任何已知試驗(yàn)來(lái)確定，包括實(shí)施例中所述的試驗(yàn)。例如，使突變型rAAV病毒粒子在有中和抗體時(shí)與可感染細(xì)胞類型(例如，293細(xì)胞)接觸。對(duì)照樣品含有細(xì)胞、突變型rAAV病毒粒子但無(wú)中和抗體。合適的時(shí)間后，細(xì)胞與腺病毒接觸，并測(cè)定rAAV顆粒。rAAV顆粒的含量與在無(wú)中和抗體時(shí)產(chǎn)生的rAAV顆粒的量進(jìn)行比較。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示對(duì)AAV較難感染的細(xì)胞(例如，非感染細(xì)胞)的感染能力增加。在這些實(shí)施方案中，所述突變型AAV對(duì)非感染細(xì)胞的感染力比野生型AAV或含有野生型衣殼蛋白的AAV病毒粒子高至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約4倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約50倍或更高。
較難被AAV感染的細(xì)胞的例子包括(但不限于)干細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。
文中使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”指能自我更新并產(chǎn)生分化后代的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Morrison等.，(1997)Cell 88287-298)。干細(xì)胞通常也具有以下一種或多種性能進(jìn)行非同步或?qū)ΨQ性復(fù)制的能力，如此分裂后產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞可具有不同的表型；廣泛的自我更新能力；以有絲分裂靜止形式存在的能力；和其存在的所有組織中無(wú)性再生能力，例如造血干細(xì)胞重建所有造血譜系的能力?！敖M細(xì)胞”與干細(xì)胞的區(qū)別在于它們通常不具有廣泛的自我更新能力并且經(jīng)常僅能產(chǎn)生它們從中衍生的組織譜系的一個(gè)亞群，例如僅能產(chǎn)生造血系統(tǒng)中的淋巴譜系或紅細(xì)胞譜系。
干細(xì)胞的特征是存在與用抗體鑒定的特異性表位相連的標(biāo)記，同時(shí)不存在通過(guò)缺乏與特異性抗體的結(jié)合而鑒定的特定標(biāo)記。干細(xì)胞也可通過(guò)體外和體內(nèi)的功能性試驗(yàn)來(lái)鑒定，特別是涉及干細(xì)胞產(chǎn)生多重分化后代能力的試驗(yàn)。
感興趣的干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和其衍生的組細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)5,061,620)；神經(jīng)嵴干細(xì)胞(參見(jiàn)Morrison等.，(1999)Cell 96737-749)；成人神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)組細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；中胚層干細(xì)胞等。其它感興趣的造血“組細(xì)胞”包括屬于淋巴譜系的細(xì)胞，例如不成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞群。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力增強(qiáng)。例如，在這些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力增強(qiáng)至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約2倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍或致死約50倍。
可用熟知的系統(tǒng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定某給定的rAAV病毒粒子穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力是否增強(qiáng)。
所述rAAV病毒粒子在至少一種衣殼蛋白(例如，VP1、VP2和VP3中的至少一種)中含有突變。所以，與野生型AAV衣殼蛋白相比，VP1、VP2和VP3的至少一種含有至少一個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，與野生型AAV VP1、VP2和VP3相比，VP1、VP2和VP3的至少一種含有1到約25個(gè)氨基酸取代，例如與野生型AAV VP1、VP2和VP3相比，含有約1到5個(gè)、約5到10個(gè)、約10到15個(gè)、約15到20個(gè)或約20到25個(gè)氨基酸取代。此外，相比于野生型衣殼蛋白，所述rAAV病毒粒子在至少一種衣殼蛋白中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或插入。在一些實(shí)施方案中，相比于野生型衣殼蛋白，所述rAAV病毒粒子在一種衣殼蛋白中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代和/或缺失和/或插入。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示與中和抗體的結(jié)合能力比野生型AAV降低，其所含VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或圖5A-C或圖7A-D所示氨基酸序列至少具有約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與中和抗體的結(jié)合能力比野生型AAV降低，其所含的VP1的氨基酸序列與SEQID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或圖5A-C或圖7A-D所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20個(gè)氨基酸差異。在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與中和抗體的結(jié)合能力比野生型AAV降低，其所含的VP1具有如SEQ ID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33之一所示或圖5A-C或圖7A-D所示的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV的高，其所含的VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或圖9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列至少具有約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子與硫酸肝素的親和力比野生型AAV的高，其所含的VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或圖9A-C(D14H1或D14L3)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20個(gè)氨基酸差異。在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV的高，其所含的VP1具有如SEQ ID NO35或SEQ ID NO37所示或如圖9A-C(D14H1或D14L3)所示的氨基酸序列。
在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV的低，其所含的VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO39或SEQ ID NO41所示或圖9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列至少具有約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％、或更高的氨基酸序列相同性。在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV的低，其所含的VP1的氨基酸序列與SEQ ID NO39或SEQ ID NO41所示或圖9A-C(P1BH1或P1BH2)所示氨基酸序列具有1-5、5-10或10-20個(gè)氨基酸差異。在一些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子顯示與硫酸肝素的親和力比野生型AAV的低，其所含的VP1具有如SEQ ID NO39或SEQ ID NO41所示或如圖9A-C(P1BH1或P1BH2)所示的氨基酸序列。
所述rAAV病毒粒子的生產(chǎn)rAAV引入后，通常利用宿主或“生產(chǎn)”細(xì)胞來(lái)復(fù)制和包裝rAAV載體。這種生產(chǎn)細(xì)胞(通常是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)一般含有或經(jīng)修飾而含有幾種不同類型的rAAV產(chǎn)生所需的組分。第一種組分是可被宿主包裝細(xì)胞復(fù)制并包裝進(jìn)載體顆粒中的重組腺伴隨病毒(rAAV)載體基因組(或“rAAV原-載體”)。既然將轉(zhuǎn)基因包裝進(jìn)rAAV載體顆粒中可有效地用于將轉(zhuǎn)基因遞送至各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，rAAV原載體通常含有在基因治療中在遺傳上改變另一種細(xì)胞所需的異源多核苷酸(或“轉(zhuǎn)基因”)。轉(zhuǎn)基因的兩翼通常連接兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)序列(ITR)，該序列含有在AAV載體的切除、復(fù)制和包裝過(guò)程中以及在該載體整合入宿主細(xì)胞基因組的過(guò)程中可識(shí)別的序列。
第二種組分是可提供AAV復(fù)制輔助功能物的輔助病毒。雖然通常使用腺病毒，但如本領(lǐng)域所知也可使用其它輔助病毒?；蛘?，所需的輔助病毒的功能物可從輔助病毒用遺傳方法分離，其編碼基因可用于提供反式輔助病毒功能物?？蓪AV載體元件和輔助病毒(或輔助病毒功能物)同時(shí)或以任何順序依次引入宿主細(xì)胞。
生產(chǎn)細(xì)胞中要提供的用于AAV產(chǎn)生的最終元件是“AAV包裝基因”，例如分別提供復(fù)制和衣殼化蛋白質(zhì)的rep和cap基因?？商峁追N不同的AAV包裝基因(包括rep-cap表達(dá)盒與分開(kāi)的rep和/或cap表達(dá)盒)，其中rep和/或cap基因被置于天然啟動(dòng)子或操作性相連的異源啟動(dòng)子的控制下?？蓪⑦@種AAV包裝基因瞬時(shí)或穩(wěn)定地引入宿主包裝細(xì)胞，這是本領(lǐng)域已知的并詳述于下文。
1.rAAV載體含有感興趣的異源DNA的所述rAAV病毒粒子(感興趣的異源DNA在本文還指異源核酸)可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法生產(chǎn)。這些方法通常涉及以下步驟(1)將所述rAAV載體引入宿主細(xì)胞；(2)將AAV輔助構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞，其中輔助構(gòu)建物包含的AAV編碼區(qū)域能在宿主細(xì)胞中表達(dá)來(lái)補(bǔ)充AAV載體所缺乏的AAV輔助功能物；(3)將一種或多種AAV輔助病毒和/或附屬的功能載體引入宿主細(xì)胞，其中輔助病毒和/或附屬的功能載體提供能在宿主細(xì)胞中支持重組AAV(“rAAV”)病毒粒子有效產(chǎn)生的輔助功能物；和(4)培養(yǎng)該宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生rAAV病毒粒子。AAV表達(dá)載體，AAV輔助構(gòu)建物和輔助病毒或附屬功能物載體可使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)同時(shí)或連續(xù)引入宿主細(xì)胞。
使用已知技術(shù)構(gòu)建AAV表達(dá)載體來(lái)至少提供作為以轉(zhuǎn)錄方向操作性相連的組分的控制元件，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、感興趣的DNA和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。選擇在哺乳動(dòng)物肌肉細(xì)胞中有功能的控制元件。使得到的含有操作性相連諸組分的構(gòu)建物與功能性AAV ITR序列相連(5’和3’)。
AAV ITR區(qū)的核苷酸序列是已知的。參見(jiàn)，例如有關(guān)AAV-2序列的Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Berns，K.I.，《基礎(chǔ)病毒學(xué)》(Fundamental Virology)中的“細(xì)小病毒及其復(fù)制”(Parvoviridae and theirReplication)，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe編)。本發(fā)明的載體使用的AAVITR無(wú)需具有野生型核苷酸序列，并且可通過(guò)，例如核苷酸的插入、缺失或取代來(lái)改變。此外，AAV ITR可衍生自幾種AAV血清型中的任一種，包括(不限于)AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7等。另外，AAV表達(dá)載體中其兩翼是所選擇核苷酸序列的5’和3’ITR無(wú)需和同一AAV血清型或分離物相同或從其衍生，前提是它們具有功能，即當(dāng)細(xì)胞中存在AAV Rep基因產(chǎn)物時(shí)，可從宿主細(xì)胞基因組或載體中切除或拯救感興趣的序列，和可將DNA分子整合入受體細(xì)胞基因組。ITR能使在合適的Rep蛋白混合物存在時(shí)復(fù)制該載體序列。ITR也使得該載體序列得以插入衣殼以產(chǎn)生AAV顆粒。
用于所述rAAV載體中的合適的異源DNA分子(文中也稱為“異源核酸”)的大小通常約不到5千堿基(kb)并且含有，例如編碼接受對(duì)象缺乏或丟失的蛋白的基因(核苷酸序列)；編碼具有所需生物學(xué)或治療作用(例如，抗細(xì)菌、抗病毒或抗腫瘤功能)蛋白質(zhì)的基因；編碼能抑制或降低有害或其它不期望的蛋白產(chǎn)生的RNA的核苷酸序列；編碼抗原蛋白的核苷酸序列；或能抑制或降低蛋白產(chǎn)生的RNA的核酸序列。
合適的異源核酸包括(但不限于)編碼用于治療以下疾病蛋白質(zhì)的核酸內(nèi)分泌、代謝、血液、心血管、神經(jīng)、肌肉骨骼、泌尿、肺和免疫疾病，包括如炎性疾病，自身免疫疾病，慢性疾病和感染性疾病(例如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS))、癌癥、高膽固醇血癥；胰島素紊亂，例如糖尿?。簧L(zhǎng)紊亂，各種血液疾病，包括各種貧血癥、地中海貧血和血友?。贿z傳缺陷，例如囊腫性纖維化、高歇病、胡爾勒病、腺苷酸脫氨酶(ADA)缺乏癥、肺氣腫等。
合適的異源核酸包括(但不限于)編碼以下各種蛋白質(zhì)的核酸，包括(但不限于)干擾素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω；IFN-τ)；胰島素(例如，諾和靈、優(yōu)泌林、優(yōu)泌樂(lè)、耐而可、長(zhǎng)效胰島素鋅欣混旋液等)；促紅細(xì)胞生成素(“EPO”；例如Procrit_、Eprex_或Epogen_(倍他依泊汀-α)；Aranesp_(darbepoietin-α)；NeoRecormon_、Epogin_(倍他依泊汀-β)等；抗體(例如單克隆抗體)(例如，Rituxan_(萊圖昔單抗(rituximab))；Remicade_(因福利昔單抗(infliximab))；Herceptin_(特拉蘇珠單抗(trastuzumab))；HumiraTM(阿得利母人單抗(adalimumab))；Xolair_(奧馬利珠單抗(omalizumab))；Bexxar_(圖西圖莫單抗(tositumomab))；RaptivaTM(依法利組單抗(efalizumab))；ErbituxTM(采圖昔單抗(cetuximab)等)，包括單克隆抗體的抗原結(jié)合片段；血液因子(例如，Activase_(纖維蛋白溶酶原活化劑(alteplase))組織血纖蛋白溶酶原激活劑；NovoSeven_(重組人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(例如，Kogenate_)；因子IX(β-球蛋白；血紅蛋白等)；集落刺激因子(例如，Neupogen_(非格司亭；G-CSF)；Neulasta(peg化的非格司亭)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，巨核細(xì)胞集落刺激因子等)；生長(zhǎng)激素(例如，生長(zhǎng)激素，如Genotropin_、Nutropin_、Norditropin_、Saizen_、Serostim_、Humatrope_等；人生長(zhǎng)激素等)；白介素(例如，IL-1；IL-2，包括例如Proleukin_；IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等)；生長(zhǎng)因子(例如，Regranex_(beclapermin；PDGF)；Fiblast_(曲氟尿苷；bFGF)；Stemgen_(ancestim；干細(xì)胞因子)；角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子；酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，干細(xì)胞因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)；可溶性受體(例如，TNF-α結(jié)合可溶性受體，如Enbrel_(依那西普)；可溶性VEGF受體；可溶性白介素受體；可溶性γ/δ/T細(xì)胞受體等)；酶(例如，α-葡糖苷酶；Cerazyme_(imiglucarase；β-葡糖腦甘脂酶、Ceredase_(algucerase))；酶激活劑(例如，組織血纖蛋白溶酶原激活劑)；趨化因子(例如，IP-10；Mig；Groα/IL-8，RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4等)；血管生成劑(例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))；抗血管生成劑(例如，可溶性VEGF受體)；蛋白疫苗；神經(jīng)活性肽，例如緩激肽、縮膽囊肽、gastin、促胰液素、催產(chǎn)素、促性腺素釋放激素、β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、P物質(zhì)、促生長(zhǎng)素抑制素、促乳素、甘丙肽、生長(zhǎng)激素釋放激素、鈴蟾肽、強(qiáng)啡肽、神經(jīng)加壓素、促胃動(dòng)素、促甲狀腺激素、神經(jīng)肽Y、促黃體素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、加壓素、血管緊張肽II、促甲狀腺激素釋放激素、血管活性腸肽、睡眠肽等；其它肽，例如溶血栓劑、心房利尿鈉肽、骨形成蛋白、血栓形成素、松弛素、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、促黃體激素、巨噬細(xì)胞活化因子、腫瘤壞死因子、中性粒細(xì)胞趨化因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶組織抑制劑；血管活性腸肽、血管生成素、血管營(yíng)養(yǎng)素、纖維蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受體拮抗劑(例如，Kineret_(阿那白滯素))；離子通道，例如囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)；抗肌萎縮蛋白；肌營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白，一種腫瘤抑制劑；溶酶體酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)等。合適的核酸也包括編碼任何前述蛋白的功能性片段的核酸，與編碼任何前述蛋白的功能性變體的核酸。
合適的異源核酸也包括編碼抗原蛋白的核酸。含有編碼抗原蛋白的異源核酸的所述rAAV合適用于在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中激發(fā)產(chǎn)生針對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。抗原蛋白得自自身抗原、過(guò)敏原、腫瘤相關(guān)抗原、致病性病毒、致病性細(xì)菌、致病性原蟲(chóng)、致病性蠕蟲(chóng)或任何其它能感染哺乳動(dòng)物宿主的致病生物。文中使用的術(shù)語(yǔ)“得自某來(lái)源的編碼抗原蛋白的核酸”包括編碼野生型抗原蛋白的核酸，例如分離自致病性病毒的編碼病毒蛋白的核酸；實(shí)驗(yàn)室中合成的核酸，該核酸編碼氨基酸序列與天然存在的抗原蛋白相同的抗原蛋白；實(shí)驗(yàn)室中合成的核酸，該核酸編碼氨基酸序列(例如，1到約15個(gè)氨基酸不同)與天然存在的抗原蛋白不同的抗原蛋白，但該抗原蛋白仍能誘導(dǎo)對(duì)相應(yīng)的天然存在抗原蛋白的免疫應(yīng)答；實(shí)驗(yàn)室中合成的核酸，該核酸編碼抗原蛋白的片段(例如，約5個(gè)到約50個(gè)氨基酸的片段，該片段含有一個(gè)或多個(gè)抗原表位)，該片段誘導(dǎo)對(duì)相應(yīng)天然存在抗原蛋白的免疫應(yīng)答；等等。
類似地，“得自”自身抗原、過(guò)敏原、腫瘤相關(guān)抗原、致病性病毒、致病性細(xì)菌、致病性原蟲(chóng)、致病性蠕蟲(chóng)或任何其它能感染哺乳動(dòng)物宿主的致病性生物的抗原蛋白包括氨基酸序列與天然存在的抗原蛋白相同的蛋白；氨基酸序列(例如，1到約15個(gè)氨基酸)與天然存在的抗原蛋白不同的抗原蛋白，但該抗原蛋白仍能誘導(dǎo)對(duì)相應(yīng)的天然存在抗原蛋白的免疫應(yīng)答；抗原蛋白的片段(例如，約5個(gè)到約50個(gè)氨基酸的片段，其中含有一個(gè)或多個(gè)抗原表位)，該片段能誘導(dǎo)對(duì)相應(yīng)的天然存在抗原蛋白的免疫應(yīng)答。
在一些實(shí)施方案中，對(duì)所述rAAV編碼的抗原蛋白的免疫應(yīng)答能刺激針對(duì)在哺乳動(dòng)物宿主中顯示抗原蛋白或抗原表位(或是能與rAAV編碼的抗原蛋白或抗原表位發(fā)生交叉反應(yīng)的蛋白或表位)的致病生物的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物宿主中會(huì)誘導(dǎo)針對(duì)rAAV編碼的抗原蛋白的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。在其它實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物宿主中可誘導(dǎo)針對(duì)rAAV編碼的抗原蛋白的體液應(yīng)答。在許多實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物宿主中可誘導(dǎo)針對(duì)rAAV編碼的抗原蛋白的TH1免疫應(yīng)答。合適的抗原蛋白包括腫瘤相關(guān)抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、和原蟲(chóng)抗原及它們的抗原片段。在一些實(shí)施方案中，抗原蛋白得自胞內(nèi)病原體。在其它實(shí)施方案中，抗原蛋白是自身抗原。在其它實(shí)施方案中，抗原蛋白是過(guò)敏原。
腫瘤特異性抗原包括(但不限于)各種MAGE(黑色素瘤相關(guān)抗原E)，包括MAGE 1(例如，GenBauk登錄號(hào)M77481)、MAGE 2(例如，GenBank登錄號(hào)U03735)、MAGE 3、MAGE 4等；各種酪氨酸酶；突變的ras大鼠；突變的p53(例如，GenBank登錄號(hào)X54156和AA494311)；和p97黑色素瘤抗原(例如，GenBank登錄號(hào)M12154)。其它腫瘤特異性抗原包括與晚期癌癥相關(guān)的Ras肽和p53肽，與子宮頸癌相關(guān)的HPV16/18和E6/E7抗原，與乳腺癌相關(guān)的MUCI1-KLH抗原(例如，GenBank登錄號(hào)J03651)，與結(jié)直腸癌相關(guān)的CEA(癌胚抗原)(例如，GenBank登錄號(hào)X98311)，與黑色素瘤相關(guān)的gp100(例如，GenBank登錄號(hào)S73003)或MART1抗原，與前列腺癌相關(guān)的PSA抗原(例如，GenBank登錄號(hào)X14810)。p53基因序列是已知的(參見(jiàn)，例如Harris等.，(1986)Mol.Cell.Biol.，64650-4656)并由GenBank以登錄號(hào)M14694保藏。所以，本發(fā)明可用于以下癌癥的免疫治療，包括(但不限于)子宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌和黑色素瘤。
病毒抗原得自已知的致病病原體，包括(但不限于)麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型、乙型(例如，GenBank登錄號(hào)E02707)和丙型(例如，GenBank登錄號(hào)E06890)肝炎病毒、以及其它肝炎病毒，流感病毒、腺病毒(例如，4型和7型)、狂犬病毒(例如，GenBank登錄號(hào)M34678)、黃熱病毒、日本腦炎病毒(例如，GenBank登錄號(hào)E07883)、登革熱病毒(例如，GenBank登錄號(hào)M24444)、漢坦病毒和人免疫缺陷病毒(例如，GenBank登錄號(hào)U18552)。
合適的細(xì)菌和寄生蟲(chóng)抗原包括衍生自已知的導(dǎo)致以下疾病的生物，包括(但不限于)白喉、百日咳(例如，GenBank登錄號(hào)M35274)、破傷風(fēng)(例如，GenBank登錄號(hào)M64353)、肺結(jié)核、細(xì)菌性和真菌性肺炎(例如，流感嗜血桿菌、盧氏肺孢子蟲(chóng)等)、霍亂、傷寒、鼠疫、志賀菌病、沙門菌病(例如，GenBank登錄號(hào)L03833)、軍團(tuán)菌病、萊姆病(例如，GenBank登錄號(hào)U59487)、瘧疾(例如，GenBank登錄號(hào)X53832)、鉤蟲(chóng)、盤尾絲蟲(chóng)病(例如，GenBank登錄號(hào)M27807)、血吸蟲(chóng)病(例如，GenBank登錄號(hào)L08198)、錐蟲(chóng)病、蟠尾絲蟲(chóng)癥、賈第蟲(chóng)病(例如，GenBank登錄號(hào)M33641)、阿米巴病、絲蟲(chóng)病(例如，GenBank登錄號(hào)J03266)、包揉螺旋體病和旋毛蟲(chóng)病。
合適的編碼異源基因產(chǎn)物的異源核酸包括非翻譯RNA，例如反義RNA、核酶、RNAi和siRNA。干擾RNA(RNAi)片段，特別是雙鏈(ds)RNAi可用于抑制基因表達(dá)。本領(lǐng)域熟知的用于抑制基因表達(dá)的一種方法是短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的基因沉默，該方法通過(guò)特異性雙鏈siRNA核苷酸序列來(lái)降低靶基因表達(dá)產(chǎn)物的水平，其中該雙鏈siRNA核苷酸序列與靶基因轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)至少19-25個(gè)核苷酸的區(qū)段(例如，20-21個(gè)核苷酸的序列)互補(bǔ)，所述片段包括5′未翻譯(UT)區(qū)域、ORF或3′UT區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，短干擾RNA約長(zhǎng)19-25個(gè)核苷酸。參見(jiàn)，例如描述siRNA技術(shù)的PCT申請(qǐng)WO0/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620和WO02/29858；和美國(guó)專利公布號(hào)20040023390。siRNA可被某核酸序列所編碼，該核酸序列也可含有啟動(dòng)子。核酸序列也可含有聚腺苷酸化信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，聚腺苷酸化信號(hào)是合成的最小聚腺苷酸化信號(hào)。
靶基因包括編碼有害(例如，致病的)的靶基因產(chǎn)物(RNA或蛋白質(zhì))、功能異常的靶基因產(chǎn)物的任何基因。靶基因產(chǎn)物包括(但不限于)亨廷頓病、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、淀粉樣前體蛋白、τ、含有聚谷氨酰胺重復(fù)的蛋白、皰疹病毒(例如，帶狀皰疹)、任何致病病毒等。
如此，含有編碼siRNA的異源核酸的所述rAAV可用于治療各種疾病和病癥，包括(但不限于)神經(jīng)變性疾病，例如三核苷酸重復(fù)疾病、與聚谷氨酰胺重復(fù)相關(guān)的疾病(如亨廷頓病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓與延髓性肌萎縮(SBMA)、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)等)；獲得性疾病(例如，表現(xiàn)為異常的生理、生化、細(xì)胞、結(jié)構(gòu)或分子生物學(xué)狀態(tài)的疾病或綜合癥)，例如病毒感染，HCV感染導(dǎo)致或可能導(dǎo)致的肝炎、HIV感染導(dǎo)致的獲得性免疫缺陷綜合癥等。
在許多實(shí)施方案中，編碼siRNA的異源核酸操作性連接有啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知包括任何蛋白編碼基因的啟動(dòng)子，例如內(nèi)源性調(diào)節(jié)基因或結(jié)構(gòu)性表達(dá)基因的啟動(dòng)子。例如，可將細(xì)胞生理活動(dòng)(例如，熱休克、氧水平和/或一氧化碳水平，如缺氧時(shí))所調(diào)節(jié)的基因的啟動(dòng)子操作性連接于siRNA編碼核酸。
選擇的異源核苷酸序列(例如，編碼EPO的或感興趣的核酸)操作性連接于指導(dǎo)該核苷酸序列的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的控制元件。這種控制元件可含有通常與所選擇的基因(例如，內(nèi)源性細(xì)胞控制元件)相連的控制序列?；蛘?，可使用異源控制序列。有用的異源控制序列通常包括衍生自編碼哺乳動(dòng)物或病毒基因的序列。其例子包括(但不限于)SV40早期啟動(dòng)子、小鼠乳房瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP)、單型皰疹病毒(HSV)啟動(dòng)子、對(duì)感興趣的基因是異源性的內(nèi)源細(xì)胞啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，例如CMV立即早期啟動(dòng)子區(qū)域(CMVIE)，rous肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子、雜交啟動(dòng)子等。此外，本發(fā)明也使用的衍生自非病毒基因，例如鼠金屬硫蛋白基因的序列。這種啟動(dòng)子序列市售可得自，例如Stratagene(San Diego，Calif.)。
在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞類型特異性或組織特異性的啟動(dòng)子可操作性連接于編碼異源基因產(chǎn)物的異源核酸，因此可在特定細(xì)胞類型或組織中選擇性或擇優(yōu)地生產(chǎn)該基因產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作性連接于異源核酸。
例如，肌肉特異性和可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等可用于將基因產(chǎn)物遞送至肌肉細(xì)胞。這種控制元件包括(但不限于)衍生自肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白基因家族，例如myoD基因家族的元件；肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)子結(jié)合因子MEF-2；衍生自人骨骼肌動(dòng)蛋白基因和心臟肌動(dòng)蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件和鼠肌酸激酶增強(qiáng)子(mCK)元件；衍生自骨骼抽搐肌鈣蛋白C基因、慢抽搐心臟肌鈣蛋白C基因和慢抽搐肌鈣蛋白I基因的控制元件；缺氧誘導(dǎo)的核因子；甾體誘導(dǎo)的元件和啟動(dòng)子，例如糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GRE)；誘導(dǎo)RU486的融合共有元件；和能提供四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的元件。
具有和AAV ITR相連的感興趣的DNA分子(異源DNA)的AAV表達(dá)載體，可通過(guò)將所選擇的序列直接插入到切除了主要AAV開(kāi)放讀框(“OPT”)的AAV基因組來(lái)構(gòu)建。AAV基因組的其它部分也可刪除，只要保留的ITR部分足夠執(zhí)行復(fù)制和包裝功能。可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)這種構(gòu)建物。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,173,414和5,139,941；國(guó)際公布號(hào)WO 92/01070(1992年1月23日公布)和WO 93/03769(1993年3月4日公布)；Lebkowski等.，(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等.，(1990)Vaccines 90(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1165-169和Zhou等.，(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
或者，可使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)(見(jiàn)Sambrook，同上)從含有相同或融合的存在于另一個(gè)載體中的所選核酸構(gòu)建物5’和3’端的病毒基因組或AAV載體上切下AAV ITR。例如，連接可在20mM Tris-Cl pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl和40μM ATP、0.01-0.02(Weiss)單位的T4DNA連接酶于0到16℃進(jìn)行(進(jìn)行“粘性末端”連接)或用1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)單位的T4DNA連接酶于14℃(“平頭末端”連接)進(jìn)行。分子間“粘性末端”連接通常在30-100μg/ml總DNA濃度下進(jìn)行(5-100nM總的終濃度)。含有ITR的AAV載體描述于美國(guó)專利號(hào)5,139,941。特別是，該專利描述了幾種得自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(“ATCC”)、登錄號(hào)為53222、53223、53224、53225和53226的AAV載體。
此外，可合成產(chǎn)生嵌合基因使之含有位于一種或多種所選核酸序列5’和3’端的AAV ITR序列。優(yōu)選使用能在哺乳動(dòng)物肌肉細(xì)胞中表達(dá)該嵌合性基因序列的密碼子。從用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的重疊寡核苷酸裝配成完整的嵌合序列。參見(jiàn)，例如Edge，Nature(1981)292756；Nambair等.，Science(1984)2231299；Jay等.，J.Biol.Chem.(1984)2596311。
為產(chǎn)生rAAV病毒粒子，使用已知的技術(shù)(例如，通過(guò)轉(zhuǎn)染)將AAV表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Graham等.，(1973)Virology，52456，Sambrook等.，(1989)《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，Davis等.，(1986)《分子生物學(xué)的基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier和Chu等.，(1981)Gene 13197。尤其合適的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣共沉淀(Graham等.，(1973)Virol.52456-467)，直接顯微注射入培養(yǎng)的細(xì)胞(Capecchi，M.R.(1980)Cell 22479-488)，電穿孔(Shigekawa等.，(1990)Bio Techniques6742-751)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Mannino等.，(1988)Bio Techniques6682-690)，脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Felgner等.，(1987)Proe.Natl.Acad.Sci.美國(guó)847413-7417)和使用高速微粒遞送核酸(Klein等.，(1987)Nature 32770-73)。
出于本發(fā)明的目的，合適的用于產(chǎn)生rAAV病毒粒子的宿主細(xì)胞包括可用作異源DNA分子受體的微生物、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括被轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的后代。所以，文中使用的“宿主細(xì)胞”通常指被外源DNA序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在許多實(shí)施方案中使用得自穩(wěn)定的人細(xì)胞系的細(xì)胞293(可容易通過(guò)，例如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所以登錄號(hào)ATCC CRL1573獲得)。特別是，人細(xì)胞系293是用5型腺病毒DNA片段(Graham等.，(1977)J.Gen.Virol.3659)轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系，能表達(dá)腺病毒E1a和Elb基因(Aiello等.，(1979)Virology 94460)。293細(xì)胞系易于轉(zhuǎn)染從而提供用于產(chǎn)生rAAV病毒粒子的特別便捷的平臺(tái)。
2.AAV輔助功能物為復(fù)制和衣殼化兩翼接有AAV ITR的核苷酸序列來(lái)生產(chǎn)rAAV病毒粒子，必須向含有上述AAV表達(dá)載體的宿主細(xì)胞提供AAV輔助功能物。AAV輔助功能物通常是AAV-衍生的編碼序列，該序列可被表達(dá)來(lái)提供AAV基因產(chǎn)物，進(jìn)而對(duì)生產(chǎn)性AAV復(fù)制起反式作用。本發(fā)明的AAV輔助功能物用于補(bǔ)充AAV表達(dá)載體缺失的所需AAV功能。所以，AAV輔助功能物包括一種或兩種主要的AAV ORF(即rep和cap編碼區(qū)域)或其功能性同系物。本發(fā)明的cap功能物包括一種或多種突變的衣殼蛋白，其中至少一種衣殼蛋白含有至少一個(gè)上述的突變。
“AAV rep編碼區(qū)域”指編碼復(fù)制蛋白R(shí)ep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV基因組中技術(shù)上可識(shí)別的區(qū)域。這些Rep表達(dá)產(chǎn)物顯示擁有許多功能，包括DNA復(fù)制的AAV起點(diǎn)的識(shí)別、結(jié)合與切口，DNA解旋酶活性和調(diào)節(jié)AAV(或其它異源)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。復(fù)制AAV基因組總體需要Rep表達(dá)產(chǎn)物。對(duì)AAV rep編碼區(qū)域的描述參見(jiàn)，例如Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.andImmunol.15897-129和Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-301。合適的AAV rep編碼區(qū)域同系物包括人皰疹病毒6(HEIV-6)rep基因，該基因也已知能介導(dǎo)AAV-2 DNA復(fù)制(Thomson等.，(1994)Virology 204304-311)。
AAV cap蛋白含有VP1、VP2和VP3，其中VP1、VP2和VP3至少含有一個(gè)上述突變。
在AAV表達(dá)載體染之前或同時(shí)通過(guò)用AAV輔助構(gòu)建物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞將AAV輔助功能物引入宿主細(xì)胞。因此，AAV輔助構(gòu)建物至少用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬時(shí)表達(dá)來(lái)補(bǔ)充生產(chǎn)性AAV感染所需的缺失的AAV功能。AAV輔助構(gòu)建物缺少AAV ITR因而既不能復(fù)制也不能包裝自身。這些構(gòu)建物可是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒或病毒粒子。許多AAV輔助構(gòu)建物已見(jiàn)描述，例如通常使用的編碼Rep和Cap表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)粒pAAV/Ad和pIM29+45。參見(jiàn)，例如Samulski等.，(1989)J.Virol.633822-3828和McCarty等.，(1991)J.Virol.652936-2945。許多編碼Rep和/或Cap表達(dá)產(chǎn)物的其它載體已見(jiàn)描述。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,139,941。
可構(gòu)建AAV表達(dá)載體與AAV輔助構(gòu)建物使之含有一種或多種可任選的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括當(dāng)這些細(xì)胞在合適的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，賦予含有選擇性標(biāo)記的核酸構(gòu)建物所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以抗生素抗性或敏感性、賦予顏色或改變其抗原特性的基因。幾種用于實(shí)踐本發(fā)明的選擇性標(biāo)記基因包括能賦予潮霉素抗性而可對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行選擇的潮霉素B抗性基因(編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))；能賦予G418抗性而可對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行選擇的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)；等等。其它合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
3.AAV附屬功能物為生產(chǎn)rAAV病毒粒子，也必須向宿主細(xì)胞(或包裝細(xì)胞)提供非AAV衍生的功能物或“附屬功能物”。附屬功能物是AAV復(fù)制所依賴的非AAV衍生的病毒和/或細(xì)胞功能物。所以，附屬功能物至少包括AAV復(fù)制所需的非AAV蛋白和RNA，包括參與AAV基因轉(zhuǎn)錄的激活、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA復(fù)制、Cap表達(dá)產(chǎn)物的合成以及AAV衣殼裝配的那些蛋白和RNA?；诓《镜母綄俟δ芪锟蓮娜魏我阎妮o助病毒衍生。
特別是可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法將附屬功能物引入宿主細(xì)胞然后表達(dá)。附屬功能物通常可用無(wú)關(guān)的輔助病毒感染宿主細(xì)胞來(lái)提供。許多合適的輔助病毒是已知的，包括腺病毒；皰疹病毒，例如1型和2型單型皰疹病毒；牛痘病毒。本發(fā)明也可使用非病毒輔助功能物，例如使用各種已知試劑的任一種通過(guò)細(xì)胞同步化提供。參見(jiàn)，例如Buller等.，(1981)J.Virol.40241-247；McPherson等.，(1985)Virology 147217-222；Schlehofer等.，(1986)Virology 152110-117。
或者，可使用附屬功能物載體來(lái)提供附屬功能物。附屬功能物載體包括提供一種或多種附屬功能物的核苷酸序列。為支持宿主細(xì)胞有效產(chǎn)生AAV病毒粒子，可將附屬功能物載體引入合適的宿主細(xì)胞。附屬功能物載體的形式可是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘?；蚱渌《?。附屬載體的形式也可是一種或多種線形化的DNA或RNA片段，當(dāng)其與合適的控制元件或酶相連時(shí)，這些片段可在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)來(lái)提供輔助功能物。
提供附屬功能物的核酸序列可得自天然來(lái)源，例如腺病毒顆粒的基因組，或用本領(lǐng)域已知的重組或合成方法構(gòu)建。就此而言，腺病毒衍生的附屬功能物已得到廣泛研究，并且鑒定了許多涉及附屬功能物的腺病毒基因，其中一部分作了特性分析。參見(jiàn)，例如，Carter，B.J.(1990)《細(xì)小病毒CRC手冊(cè)》(CRC Handbook ofParvoviruses)中的“腺伴隨病毒輔助功能物”(Adeno-Associated Virus HelperFunctions)，I卷(P.Tijssen編)和Muzyczka，N.(1992)Curr.Topics.Microbiol.andImmun.15897-129。具體說(shuō)，據(jù)認(rèn)為早期腺病毒基因區(qū)域E1a、E2a、E4、VAIRNA和可能還有Elb參與了該附屬過(guò)程。Janik等.，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)781925-1929。皰疹病毒衍生的附屬功能物已見(jiàn)描述。參見(jiàn)，例如Young等.，(1979)Prog.Med.Virol.25113。牛痘病毒衍生的附屬功能物也已見(jiàn)描述。參見(jiàn)，例如，Carter，B.J.(1990)，同上，Schlehofer等.(1986)Virology152110-117。
用輔助病毒感染宿主細(xì)胞或用附屬功能物載體感染宿主細(xì)胞的結(jié)果是附屬功能物被表達(dá)，而反式激活A(yù)AV輔助構(gòu)建物以產(chǎn)生AAV Rep和/或Cap蛋白。Rep表達(dá)產(chǎn)物將重組DNA(包括感興趣的DNA，例如異源核酸)從AAV表達(dá)載體上切下。Rep蛋白的作用還可復(fù)制AAV基因組。表達(dá)的Cap蛋白裝配進(jìn)衣殼，重組AAV基因組也包裝進(jìn)該衣殼。因此，結(jié)果是生產(chǎn)性AAV復(fù)制，其DNA被包裝進(jìn)rAAV病毒粒子中。
重組AAV復(fù)制后，可使用各種常規(guī)的純化方法(例如，CsCl梯度法)從宿主細(xì)胞中純化rAAV病毒粒子。此外，如果利用感染來(lái)表達(dá)附屬功能物，可使用已知的方法使殘留的輔助病毒失活。例如，可通過(guò)加熱至溫度約60℃，20分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間使腺病毒失活。因?yàn)锳AV對(duì)熱極其穩(wěn)定，而輔助腺病毒是熱不穩(wěn)定的，該處理方法僅有效地使輔助病毒失活。
得到的rAAV病毒粒子然后可用于DNA遞送(例如用于基因治療)或用于遞送基因產(chǎn)物至哺乳動(dòng)物宿主。
遞送基因產(chǎn)物本發(fā)明還提供將基因產(chǎn)物遞送至需要它的個(gè)體的方法。該方法通常涉及將所述rAAV病毒粒子引入個(gè)體。
通常使用體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將rAAV病毒粒子引入細(xì)胞。如果是體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，需要取得對(duì)象的受體細(xì)胞，用rAAV病毒粒子轉(zhuǎn)導(dǎo)并重新引入受試對(duì)象?；蛘?，當(dāng)使用的細(xì)胞在受試對(duì)象中不產(chǎn)生不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答時(shí)，可使用同系或異種細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞遞送或引入受試對(duì)象的合適方法已見(jiàn)描述。例如，可在合適的培養(yǎng)基中使重組AAV病毒粒子與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并使用常規(guī)技術(shù)，例如Southern印跡和/或PCR，或通過(guò)使用選擇性標(biāo)記來(lái)篩選含有感興趣DNA的細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞然后可配制進(jìn)下文詳述的藥物組合物，并可通過(guò)各種技術(shù)將該組合物引入受試對(duì)象，例如通過(guò)肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射。
為進(jìn)行體內(nèi)遞送，rAAV病毒粒子可配制進(jìn)藥物組合物并一般通過(guò)胃腸外(例如，通過(guò)肌肉內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、透皮、鞘內(nèi)等施用)途徑施用。
藥物組合物含有足夠量的遺傳物質(zhì)來(lái)產(chǎn)生治療有效量的感興趣的基因產(chǎn)物，即其量足夠降低或緩解有待解決的疾病的癥狀或足夠帶來(lái)所需的益處。藥物組合物也含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。這種賦形劑包括本身不含誘導(dǎo)接受該組合物的個(gè)體產(chǎn)生有害的抗體的任何藥學(xué)試劑，并且所述試劑無(wú)不適當(dāng)?shù)亩拘?。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括(但不限于)液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。藥學(xué)上可接受的鹽是例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽(pho)，有機(jī)酸鹽是例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。此外，輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這種運(yùn)載體中。許多藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域已知的，本文無(wú)需詳細(xì)討論。藥學(xué)上可接受的賦形劑已在各種出版物中廣泛討論，包括，例如A.Gennaro(2000)《雷明頓藥劑學(xué)科學(xué)與實(shí)踐》(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，第20版，Lippincott，Williams，& Wilkins；《藥物劑型與藥物遞送系統(tǒng)》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)(1999)H.C.Ansel等編，第7版，Lippincott，Williams，& Wilkins和《藥物賦形劑手冊(cè)》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等編，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc.
合適的劑量取決于所治療的哺乳動(dòng)物(例如，人或非人靈長(zhǎng)類或其它哺乳動(dòng)物)、有待治療的對(duì)象的年齡和全身情況、所治療疾病的嚴(yán)重性、具體使用的治療性蛋白、其施用方式等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定合適的有效量。
所以，“治療有效量”的范圍相對(duì)較寬，該范圍可通過(guò)臨床試驗(yàn)確定。例如，為進(jìn)行體內(nèi)注射(即直接注射進(jìn)骨骼肌或心肌)，治療有效劑量可為約106到1015個(gè)rAAV病毒粒子，例如約108到1012個(gè)rAAV病毒粒子。為進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，要遞送入細(xì)胞的rAAV病毒粒子的有效量約為108到1013個(gè)rAAV病毒粒子。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可通過(guò)建立劑量應(yīng)答曲線的常規(guī)試驗(yàn)來(lái)容易地確定其它有效劑量。
劑量治療方案可是單劑量方案或多劑量方案。此外，受試對(duì)象可適當(dāng)?shù)厥┯枚啻蝿┝俊１绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定合適的劑量數(shù)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將基因產(chǎn)物遞送至干細(xì)胞的方法。在這些實(shí)施方案中，所述rAAV病毒粒子可在體外或體內(nèi)引入干細(xì)胞。感興趣的干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞和其衍生的祖細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)5,061,620)；神經(jīng)嵴干細(xì)胞(參見(jiàn)Morrison等.，(1999)Cell 96737-749)；成人神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；中胚層干細(xì)胞等。其它感興趣的造血“組細(xì)胞”的例子包括屬于淋巴譜系的細(xì)胞，例如不成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞群。
可使用純化的干細(xì)胞或祖細(xì)胞群。例如，人造血干細(xì)胞可使用對(duì)CD34、thy-1具特異性的抗體來(lái)陽(yáng)性選擇；或可使用含有血型糖蛋白A、CD3、CD24、CD16、CD14、CD38、CD45RA、CD36、CD2、CD19、CD56、CD66a和CD66b的譜系特異性標(biāo)記、T細(xì)胞特異性標(biāo)記、腫瘤特異性標(biāo)記等來(lái)陰性選擇。用于分離中胚層干細(xì)胞的標(biāo)記包括FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、VLA-4α、LFA-1β、HAS、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-1等。神經(jīng)嵴干細(xì)胞可使用對(duì)低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(LNGFR)的特異性抗體來(lái)陽(yáng)性選擇，和使用標(biāo)記硫苷脂、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)、髓鞘蛋白Po、外周蛋白和神經(jīng)絲來(lái)陰性選擇。人間充質(zhì)干細(xì)胞可使用標(biāo)記SH2、SH3和SH4來(lái)陽(yáng)性分離。
當(dāng)術(shù)語(yǔ)感興趣的細(xì)胞指分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物時(shí)，包括人、家用或農(nóng)用動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，如狗、馬、貓、小鼠、大鼠、兔等，感興趣的細(xì)胞通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞是人干細(xì)胞。
使用的細(xì)胞可是新鮮的、冷凍的或經(jīng)過(guò)預(yù)先培養(yǎng)的。它們可是胎兒的、新生兒的或成人的。造血干細(xì)胞可得自胎兒肝臟、骨髓、血液、特別是固定有G-CSF或GM-CSF的外周血或任何其它常規(guī)來(lái)源。從造血譜系或其它譜系分離干細(xì)胞的方式對(duì)本發(fā)明而言不重要。如上所述，基本上同源的干細(xì)胞群或祖細(xì)胞群可通過(guò)選擇性分離以下細(xì)胞來(lái)獲得，這些細(xì)胞不存在與分化細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記但顯示與干細(xì)胞相關(guān)的表位特性。
各種蛋白可使用所述方法遞送至個(gè)體。合適的蛋白包括(但不限于)干擾素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω；IFN-τ)；胰島素(例如，諾和靈、優(yōu)泌林、優(yōu)泌樂(lè)、耐而可、長(zhǎng)效胰島素鋅混旋液等)；促紅細(xì)胞生成素(“EPO”；例如Procrit_、Eprex_或Epogen_(倍他依泊汀-α)；Aranesp_(darbepoietin-α)；NeoRecormon_、Epogin_(倍他依泊汀-β)等；抗體(例如單克隆抗體)(例如Rituxan_(萊圖昔單抗(rituximab))；Remicade_(因福利昔單抗(infliximab))；Herceptin_(特拉蘇珠單抗(trastuzumab))；HumiraTM(阿得利母人單抗(adalimumab))；Xolair_(奧馬利珠單抗(omalizumab))；Bexxar_(圖西圖莫單抗(tositumomab))；RaptivaTM(依法利組單抗(efalizumab))；ErbituxTM(采圖昔單抗(cetuximab)等)，包括單克隆抗體的抗原結(jié)合片段；血液因子(例如，Activase_(纖維蛋白溶酶原活化劑)組織血纖蛋白溶酶原激活劑；NovoSeven_(重組人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(例如，Kogenate_)；因子IX(β-球蛋白；血紅蛋白等)；集落刺激因子(例如，Neupogen_(非格司亭；G-CSF)；Neulasta(peg化的非格司亭)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，巨核細(xì)胞集落刺激因子等)；生長(zhǎng)激素(例如，生長(zhǎng)激素，如Genotropin_、Nutropin_、Norditropin_、Saizen_、Serostim_、Humatrope_等；人生長(zhǎng)激素等)；白介素(例如，IL-1；IL-2，包括例如Proleukin_；IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等)；生長(zhǎng)因子(例如，Regranex_(beclapermin；PDGF)；Fiblast_(曲氟尿苷；bFGF)；Stemgen_(ancestim；干細(xì)胞因子)；角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子；酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，干細(xì)胞因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)；可溶性受體(例如，TNF-α結(jié)合可溶性受體，如Enbrel_(依那西普)；可溶性VEGF受體；可溶性白介素受體；可溶性γ/δ/T細(xì)胞受體等)；酶(例如，α-葡糖苷酶；Cerazyme_(imiglucarase；β-葡糖腦甘脂酶、Ceredase_(algucerase))；酶激活劑(例如，組織血纖蛋白溶酶原激活劑)；趨化因子(例如，IP-10；Mig；Groα/IL-8，RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4等)；血管生成劑(例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF))；抗血管生成劑(例如，可溶性VEGF受體)；蛋白疫苗；神經(jīng)活性肽，例如緩激肽、縮膽囊肽、gastin、促胰液素、催產(chǎn)素、促性腺素釋放激素、β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、P物質(zhì)、促生長(zhǎng)素抑制素、促乳素、甘丙肽、生長(zhǎng)激素釋放激素、鈴蟾肽、強(qiáng)啡肽、神經(jīng)加壓素、促胃動(dòng)素、促甲狀腺激素、神經(jīng)肽Y、促黃體素、降鈣素、胰島素、胰高血糖素、加壓素、血管緊張肽II、促甲狀腺激素釋放激素、血管活性腸肽、睡眠肽等；其它肽，例如溶血栓劑、心房利尿鈉肽、骨形成蛋白、血栓形成素、松弛素、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、促黃體激素、巨噬細(xì)胞活化因子、腫瘤壞死因子、中性粒細(xì)胞趨化因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶組織抑制劑；血管活性腸肽、血管生成素、血管營(yíng)養(yǎng)素、纖維蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受體拮抗劑(例如，Kineret_(阿那白滯素))；離子通道，例如囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)；抗肌萎縮蛋白；肌營(yíng)養(yǎng)相關(guān)蛋白，一種腫瘤抑制劑；溶酶體酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)等?？墒褂脤?duì)象方法遞送的蛋白也包括任何前述蛋白的功能性片段，以及任何前述蛋白的功能性變體。
在一些實(shí)施方案中，治療有效量的蛋白在哺乳動(dòng)物宿主中生產(chǎn)。使用所述方法在哺乳動(dòng)物宿主中是否產(chǎn)生了治療有效量的具體蛋白可使用適合于該具體蛋白的試驗(yàn)來(lái)容易地確定。例如，當(dāng)?shù)鞍资荅PO時(shí)，測(cè)量血細(xì)胞比容。
當(dāng)rAAV編碼某抗原蛋白時(shí)，可使用所述方法遞送至個(gè)體的合適的抗原蛋白包括(但不限于)腫瘤相關(guān)抗原、自身抗原(“自我”抗原)、病毒抗原、細(xì)菌抗原、原蟲(chóng)抗原和過(guò)敏原；及其抗原片段。在一些實(shí)施方案中，可在哺乳動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)針對(duì)rAAV編碼的抗原蛋白的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。在其它的實(shí)施方案中，可在哺乳動(dòng)物宿主中誘導(dǎo)針對(duì)rAAV編碼的抗原蛋白的體液應(yīng)答，例如產(chǎn)生該抗原蛋白的特異性抗體。在許多實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物宿主中可誘導(dǎo)針對(duì)rAAV編碼的抗原蛋白的TH1免疫應(yīng)答。使用建立好的方法可容易地確定針對(duì)抗原蛋白的免疫應(yīng)答是否產(chǎn)生。例如，酶聯(lián)免疫吸收分析可用于確定針對(duì)抗原蛋白的抗體是否產(chǎn)生。測(cè)定抗原特異性CTL的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可利用在其表面表達(dá)該抗原蛋白的含有可檢測(cè)標(biāo)記的靶細(xì)胞來(lái)測(cè)定血液樣品中抗原特異性CTL的存在。
可使用所述方法遞送至個(gè)體的核酸包括非翻譯的RNA，例如反義RNA、核酶、RNAi和siRNA。在一些實(shí)施方案中，治療有效量的非翻譯RNA在哺乳動(dòng)物宿主中生產(chǎn)。治療有效量的非翻譯RNA是否可使用所述方法遞送至哺乳動(dòng)物宿主可使用任何合適的試驗(yàn)來(lái)容易地確定。例如，當(dāng)基因產(chǎn)物是抑制HIV的siRNA時(shí)，可測(cè)量病毒負(fù)荷量。
產(chǎn)生突變型AAV病毒粒子的方法本發(fā)明提供產(chǎn)生在VP1、VP2和VP3的一個(gè)或多個(gè)中含有一個(gè)或多個(gè)突變的突變型AAV病毒粒子的方法。該方法通常包括產(chǎn)生突變型AAV文庫(kù)；在文庫(kù)中篩選衣殼性能改變的衣殼突變體。本發(fā)明還提供突變型AAV文庫(kù)和含有突變型AAV文庫(kù)的組合物。
在一些實(shí)施方案中，重復(fù)給定的篩選步驟兩次、三次、四次或更多次以富集衣殼性能改變的所述AAV文庫(kù)。在一些實(shí)施方案中，AAV文庫(kù)篩選后，分離單個(gè)克隆并測(cè)序。
產(chǎn)生突變型AAV文庫(kù)產(chǎn)生AAV cap基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變的突變型AAV文庫(kù)。使用已知的方法在AAV cap基因中產(chǎn)生突變。合適的誘變AAV cap基因的方法包括(但不限于)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法、寡核苷酸定點(diǎn)誘變等。產(chǎn)生突變的方法在本領(lǐng)域已得到充分描述。參見(jiàn)，例如Zhao等.，(1998)Nat.Biotechnol.16234-235；美國(guó)專利號(hào)6,579,678；美國(guó)專利號(hào)6,573,098和美國(guó)專利號(hào)6,582,914。
在一些實(shí)施方案中，使用交錯(cuò)延伸方法產(chǎn)生在cap基因中含有突變的突變型AAV文庫(kù)。交錯(cuò)延伸方法包括使用基于PCR的方法擴(kuò)增cap基因。使用特異性PCR引物引發(fā)模板cap基因，然后重復(fù)多輪變性和極短時(shí)間退火/聚合酶催化的延伸。在每輪中，生長(zhǎng)出片段的基于序列互補(bǔ)性與不同模板退火并且進(jìn)一步延伸。重復(fù)多輪變性、退火和延伸直至形成全長(zhǎng)的序列。相比于野生型AAVcap基因，得到的全長(zhǎng)序列在cap基因中含有至少一個(gè)突變。
在AAV cap序列中含有一個(gè)或多個(gè)突變的PCR產(chǎn)物插入含有野生型AAV基因組的質(zhì)粒。結(jié)果得到AAV cap突變體的文庫(kù)。因此，本發(fā)明提供含有約10到1010個(gè)成員以及在AAV cap基因中含有突變的突變型AAV cap基因文庫(kù)。文庫(kù)中的某成員在AAV cap基因中含有約1到50個(gè)突變。所述文庫(kù)含有10到約109個(gè)不同的成員，每個(gè)成員在AAV cap基因中含有不同的突變。
cap突變體文庫(kù)產(chǎn)生后，就可生產(chǎn)病毒顆粒，然后這些顆?？苫诟淖兊囊職ば阅軄?lái)選擇。文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主細(xì)胞(例如，293細(xì)胞)，然后將輔助病毒導(dǎo)入細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒(“AAV文庫(kù)顆?！?。
文庫(kù)選擇文庫(kù)產(chǎn)生后，就可選擇特定的衣殼性能。按照上述產(chǎn)生病毒顆粒，使之經(jīng)歷一步或多步選擇。要選擇的衣殼性能包括(但不限于)1]對(duì)肝素的結(jié)合親和力比野生型AAV的高；2]對(duì)肝素的結(jié)合親和力比野生型AAV的低；3]對(duì)AAV感染具有抗性的細(xì)胞的感染力提高；4]逃逸中和抗體的能力提高；和5]穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高。
1.選擇肝素結(jié)合能力改變的在一些實(shí)施方案中，選擇所述文庫(kù)改變的肝素結(jié)合能力，包括與野生型AAV病毒粒子的肝素結(jié)合能力相比，肝素結(jié)合能力提高和降低的。AAV文庫(kù)顆粒與肝素親和力基質(zhì)接觸。例如，在允許AAV文庫(kù)顆粒與肝素結(jié)合的條件下將其加載于肝素親和力柱上。示范性的條件包括用0.15M NaCl和50mM Tris、pH7.5平衡柱。AAV文庫(kù)顆粒與肝素親和力基質(zhì)結(jié)合后，用幾體積的緩沖液洗滌AAV文庫(kù)顆粒/肝素親和力基質(zhì)復(fù)合物，所述緩沖液含有濃度漸增的NaCl并且收集在每個(gè)NaCl濃度處洗脫的AAV文庫(kù)顆粒。例如，AAV文庫(kù)顆粒與肝素親和力基質(zhì)結(jié)合后，用含有200mM NaCl的1體積50mM Tris緩沖液、pH7.5洗滌AAV文庫(kù)顆粒/肝素親和力基質(zhì)復(fù)合物，收集洗脫的AAV文庫(kù)顆粒。用50mM Tris緩沖液、pH7.5重復(fù)洗脫步驟，所述緩沖液含有約250mM NaCl、約300mM NaCl、約350mM、約400mM NaCl、約450mM NaCl、約500mM NaCl、約550mM NaCl、約600mM NaCl、約650mM NaCl、約700mM NaCl或約750mMNaCl。
用濃度約低于450mM的NaCl洗脫的AAV文庫(kù)顆粒顯示與肝素的結(jié)合能力低于野生型AAV的。用濃度約高于550mM的NaCl洗脫的AAV文庫(kù)顆粒顯示與肝素的結(jié)合能力高于野生型AAV的。
在一些實(shí)施方案中，洗脫的AAV文庫(kù)顆粒通過(guò)使用輔助病毒共轉(zhuǎn)染進(jìn)可感染細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增，并在肝素親和力基質(zhì)上再次分級(jí)。該步驟可重復(fù)多次以富集肝素結(jié)合親和性能改變的AAV文庫(kù)顆粒。
2.選擇與中和抗體的結(jié)合能力降低的在一些實(shí)施方案中，與中和抗體結(jié)合野生型AAV病毒粒子而中和野生型AAV病毒粒子的情況相比，選擇所述AAV文庫(kù)與結(jié)合并中和野生型AAV病毒粒子的中和抗體的結(jié)合能力降低。AAV文庫(kù)顆粒與中和抗體接觸并測(cè)試AAV文庫(kù)顆粒感染可感染宿主細(xì)胞的能力。一般使AAV文庫(kù)顆粒與各種濃度的中和抗體接觸。降低AAV文庫(kù)顆粒感染力所需的中和抗體的濃度越高，AAV顆粒對(duì)中和抗體的抗性越高。
3.選擇對(duì)非感染性細(xì)胞的感染力提高的在一些實(shí)施方案中，選擇所述AAV文庫(kù)對(duì)非感染性細(xì)胞的感染力提高的AAV病毒粒子。AAV文庫(kù)顆粒與非感染細(xì)胞(例如，非感染性細(xì)胞群)接觸。用AAV文庫(kù)顆粒感染細(xì)胞合適的時(shí)間后，加入輔助病毒，收集成功感染非感染性細(xì)胞的AAV文庫(kù)顆粒。在一些實(shí)施方案中，每輪感染中加入輔助病毒和收集AAV顆粒，重復(fù)一次、兩次、三次或更多次。
在本發(fā)明的方法中，產(chǎn)生了AAV文庫(kù)顆粒后可進(jìn)行一次或多次選擇步驟。例如，在一些實(shí)施方案中，該方法包括選擇肝素結(jié)合能力提高、然后選擇與中和抗體的結(jié)合能力降低的病毒粒子。在其它實(shí)施方案中，該方法包括選擇與中和抗體的結(jié)合能力降低、然后選擇肝素結(jié)合能力提高的病毒粒子。在其它實(shí)施方案中，該方法包括選擇肝素結(jié)合能力降低、然后篩選與中和抗體的結(jié)合能力降低的病毒粒子。在其它實(shí)施方案中，該方法包括選擇與中和抗體的結(jié)合能力降低、然后選擇肝素結(jié)合能力降低的病毒粒子。在其它實(shí)施方案中，該方法包括選擇與中和抗體的結(jié)合能力降低、然后選擇對(duì)干細(xì)胞的感染力提高的病毒粒子。
因此，本發(fā)明提供含有多種核酸的腺伴隨病毒(AAV)文庫(kù)，其中每種核酸含有編碼突變型AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。相比于野生型AAV衣殼蛋白，編碼的突變型AAV衣殼蛋白至少含有一個(gè)氨基酸取代。本發(fā)明提供含有多個(gè)AAV顆粒的突變的腺伴隨病毒(AAV)顆粒的文庫(kù)，其中每個(gè)顆粒含有AAV衣殼蛋白，相比于野生型AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白至少含有一個(gè)氨基酸取代。編碼突變型AAV衣殼蛋白的核酸描述于上文，編碼的突變型AAV衣殼蛋白的性能也描述于上文。
實(shí)施例給出以下實(shí)施例是為了向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全公開(kāi)和說(shuō)明如何制備和使用本發(fā)明，既非為了限制本發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明的范圍，也非表明以下實(shí)驗(yàn)是所進(jìn)行的全部或僅有的實(shí)驗(yàn)。發(fā)明人盡力保證所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的精確性，但應(yīng)該考慮到一些實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差。除非另有指出，部分與部分之比是重量比，分子量是平均分子量，溫度以攝氏度計(jì)，壓力是大氣壓或接近大氣壓。使用的標(biāo)準(zhǔn)縮寫是，例如bp，堿基對(duì)；kb，千堿基；pl，皮升(picoliter)；s，秒；min，分鐘；hr，小時(shí)等。
實(shí)施例1AAV衣殼變體的產(chǎn)生和特性分析方法文庫(kù)的產(chǎn)生和載體包裝使用描述于Zhao等((1998)Nat.Biotechnol.16258-261)的交錯(cuò)延伸方法產(chǎn)生AAV2 cap ORF遺傳文庫(kù)，得到的cap產(chǎn)物插入含有野生型AAV2基因組的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌進(jìn)行大規(guī)模的質(zhì)粒生產(chǎn)和純化。然后產(chǎn)生AAV并基本上按照早先的描述(Kaspar等.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)992320-2325和Lai等.，(2003)Nat.Neurosci.621-27)通過(guò)CsCl離心純化。簡(jiǎn)言之，使用磷酸鈣方法將文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)293人胚胎腎細(xì)胞(ATCC)，然后以感染復(fù)數(shù)(MOI)3加入5血清型腺病毒(Ad5)。使用CsCl密度離心純化病毒。對(duì)所有實(shí)驗(yàn)而言，按前述(Kaspar等.，同上和Lai等.，同上)提取載體DNA，然后使用SYBR-綠染料(分子探針)和Biorad iCycler作實(shí)時(shí)PCR來(lái)定量以確定AAV基因組滴度。
肝素柱層析約1012個(gè)AAV文庫(kù)顆粒上樣于已用0.15M NaCl和50mM Tris、pH7.5預(yù)平衡的1ml HiTrap肝素柱(Amersham)。使用濃度從50mM增加至750mM含有NaCl的0.75ml相同緩沖液進(jìn)行洗滌，然后用含1M NaCl的緩沖液洗滌。rAAV-GFP作為對(duì)照也進(jìn)行肝素親和層析。為用不同的鹽濃度洗脫的文庫(kù)諸組分分離各個(gè)病毒克隆，提取諸組分的病毒DNA、PCR擴(kuò)增并插入基于pAd8的rAAV包裝質(zhì)粒。然后包裝rAAV-GFP來(lái)分析這些突變的衣殼包裝rAAV載體的能力。在U.C.Berkeley測(cè)序設(shè)施中對(duì)衣殼變體進(jìn)行測(cè)序。最后，使用Qiu等人((2000)Virol.269137-147)的方法對(duì)變體衣殼的肝素親和力進(jìn)行定量測(cè)定，除了與固定化肝素結(jié)合的病毒用實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)定。
抗血清的產(chǎn)生和抗體中和篩選按照用于U.C.Berkeley動(dòng)物照料和使用委員會(huì)與NIH的照料實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)(U.C.Berkeley Animal Care and Use Committee and NIH standards)，在兩只新西蘭白兔中產(chǎn)生了含有抗AAV2中和抗體(NAB)的多克隆血清。簡(jiǎn)言之，5×1010個(gè)CsCl純化的rAAV顆粒與0.5ml TitreMax佐劑(CytRx)混合并注射入后肢前部肌肉。間隔3周用相同的AAV劑量進(jìn)行兩次加強(qiáng)接種，然后收集抗血清。
野生型和突變型AAV文庫(kù)與75μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(pH7.4)配制的不同量血清(0-6.25μl)一起于室溫孵育30分鐘，然后加入6孔板上的2.5×105個(gè)293細(xì)胞中。48小時(shí)后，加入Ad5從感染的細(xì)胞中拯救AAV，24小時(shí)后收集細(xì)胞。
從即使存在NaBH(OAc)3時(shí)，文庫(kù)中也成功受感染的細(xì)胞組分獲得各個(gè)病毒克隆，將其插入rAAV包裝質(zhì)粒，并按上述產(chǎn)生rAAV-GFP。將含有突變衣殼的rAAV與上述5μl多克隆血清一起孵育，接著加入1×105個(gè)293細(xì)胞。感染72小時(shí)后，在U.C.Berkeley癌癥中心(U.C.Berkeley CancerCenter)(Beclman-Coulter EPICS)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)定量測(cè)定綠色細(xì)胞的組分。
結(jié)果產(chǎn)生文庫(kù)交錯(cuò)延伸方法(Zhao等，同上)用于生產(chǎn)含有隨機(jī)分布于VP1-3中的點(diǎn)突變的cap突變體文庫(kù)，該方法是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以類似于DNA改組的方式產(chǎn)生各種遺傳文庫(kù)的方法。該產(chǎn)物插入含有完全野生型AAV基因組的質(zhì)粒中，如細(xì)菌轉(zhuǎn)化后通過(guò)定量菌落數(shù)測(cè)定的那樣，產(chǎn)生了含有約106個(gè)獨(dú)立克隆的病毒文庫(kù)。對(duì)該質(zhì)粒文庫(kù)測(cè)序評(píng)估序列多樣性的程度。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞然后用Ad5感染將質(zhì)粒包裝進(jìn)病毒產(chǎn)生病毒顆粒文庫(kù)。選擇此大AAV文庫(kù)中具有各種新性能或功能的病毒變體，并對(duì)顆粒中衣殼化的AAV基因組進(jìn)行DNA序列分析而容易地回收了賦予這些新功能的衣殼結(jié)構(gòu)。
肝素結(jié)合突變體作為該文庫(kù)的序列多樣性如何翻譯成衣殼功能多樣性的初步判斷，對(duì)CsCl純化的文庫(kù)顆粒以NaCl濃度漸增步驟作肝素親和層析。如同早先報(bào)道的(Zolotukhin等.，(1999)Gene Ther.6973-985)，野生型AAV在450和550mMNaCl之間從肝素上洗脫(圖1)。完全相反，突變型AAV文庫(kù)在寬的鹽濃度范圍洗脫，即從上樣時(shí)的150mM到最終的750mM組分中洗脫。該結(jié)果表明此文庫(kù)含有顯著的序列和功能多樣性。既然體內(nèi)注射后其與硫酸肝素的親和力限制了rAAV2載體的擴(kuò)散，當(dāng)需要在大的組織或區(qū)域?qū)崿F(xiàn)寬分布時(shí)，親和力較低的突變體可能是所需的基因遞送載體。相反，親和力較高的突變體有利于區(qū)域定點(diǎn)與高水平的基因表達(dá)。
圖1a和1b.野生型AAV與該病毒文庫(kù)的肝素結(jié)合特征。a)顯示野生型AAV(有陰影的柱)和突變體文庫(kù)(空白的柱)肝素親和層析的洗脫圖。隨著NaCl濃度增加病毒逐漸從柱上洗脫。b)從該突變體文庫(kù)選出的肝素親和力較低(有陰影的柱)和肝素親和力較高(空白的柱)的合并物的層析圖。
為分離肝素親和力低和肝素親和力高的突變體，初始文庫(kù)的150mM和700mM NaCl組分分別用Ad5共感染293細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增，并在肝素柱上再次分級(jí)。三輪富集后，得到的兩個(gè)病毒合并物的大部分在150mM和750mM處從柱上洗脫(圖1b)。重要的是，因?yàn)槊枯喐患婕?93細(xì)胞感染，這些合并物依然含有高感染性病毒。然后，從每份鹽組分中分離得到各個(gè)衣殼克隆并測(cè)序。
這些突變體以不同的鹽濃度從肝素柱上洗脫的事實(shí)表明它們對(duì)肝素具有不同的親和力。然而為精確地測(cè)定這些親和力，可用Qiu等人(同上)的方法。通過(guò)進(jìn)行病毒與固定于微滴定板上的肝素的Scatchard結(jié)合分析，相比于野生型AAV與肝素的親和力，突變體對(duì)肝素親和力的差異得到確定。
中和性抗血清逃逸突變體從我們的突變型AAV文庫(kù)分離得到功能多樣的肝素結(jié)合突變體，證明該方法可用于產(chǎn)生具有新穎性能的載體。將該方法應(yīng)用于更重要的問(wèn)題通過(guò)中和抗體消除載體。產(chǎn)生了兔抗-AAV2中和性抗血清，并且相比于人血清中的NAB滴度，1∶1500的血清稀釋度足以抑制50％rAAV-GFP基因遞送至293細(xì)胞。
圖2a和2b.產(chǎn)生抗體中和逃逸突變體。a)病毒在加到293細(xì)胞中之前與抗血清一起孵育。相比于無(wú)抗血清時(shí)的對(duì)照感染，成功逃逸抗體中和作用的病毒的水平通過(guò)加入Ad5和對(duì)AAV基因組作定量實(shí)時(shí)PCR而滴定被拯救的AAV來(lái)測(cè)定。b)給出了對(duì)各個(gè)變體的數(shù)據(jù)。
抗體逃逸突變體從病毒文庫(kù)中分離。在連續(xù)幾輪選擇中，對(duì)該文庫(kù)提高嚴(yán)謹(jǐn)性，其中嚴(yán)謹(jǐn)性定義為減少50％具有野生型衣殼rAAV2所需的稀釋度(對(duì)兔抗血清而言是1500倍)與實(shí)際使用的稀釋度的比例。因此，向病毒中加入的抗血清越多，嚴(yán)謹(jǐn)性越高。三輪選擇后，用Ad5共感染293細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增，相比于野生型病毒，得到的病毒合并物對(duì)抗體的中和作用敏感性降低。然后，用它們包裝rAAV-GFP分析了該合并物的5個(gè)單獨(dú)的衣殼克隆。結(jié)果表明得到的重組載體對(duì)中和抗體的抗性提高了100到1000倍。這是與治療有關(guān)的結(jié)果。
中和抗體對(duì)rAAV基因遞送的抑制作用可按照以下方式觀察。具有野生型衣殼的rAA-V2加入293細(xì)胞并于24小時(shí)后觀察。病毒呈現(xiàn)綠色(Alexa488)、微管是紅色(Alexa546)、核是藍(lán)色(TO-PRO-3)。在中和抗血清中預(yù)孵育后，具有野生型衣殼的rAAV2的胞內(nèi)轉(zhuǎn)移如預(yù)計(jì)受到顯著抑制。
在圖3A-C顯示了相比于野生型cap序列的兩個(gè)中和抗體逃逸突變體的cap核苷酸序列。
實(shí)施例2其它AAV衣殼變體的特征鑒定按照以下方式產(chǎn)生突變型AAV一包括抗體逃逸株、肝素結(jié)合能力降低的突變體、肝素結(jié)合能力提高的突變體。
文庫(kù)的產(chǎn)生采用易錯(cuò)PCR和交錯(cuò)延伸方法(StEP)相組合來(lái)產(chǎn)生編碼衣殼蛋白的突變體DNA片段文庫(kù)。然后將此文庫(kù)插入質(zhì)粒，通過(guò)這些質(zhì)粒和腺病毒輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞將此文庫(kù)包裝進(jìn)病毒。然后用氯化銫密度離心純化此文庫(kù)。
選擇然后使此文庫(kù)經(jīng)過(guò)篩選步驟。例如，就抗體逃逸突變體而言，文庫(kù)的樣品與多克隆抗AAV抗血清混合，然后加到293細(xì)胞中。加入腺病毒擴(kuò)增能成功逃避抗血清作用的變體。
在293細(xì)胞中擴(kuò)增了“成功的”變體(例如，在有抗AAV抗體時(shí)感染293細(xì)胞的變體)后，純化變體，再次與抗血清混合，感染293細(xì)胞，最后用腺病毒再次擴(kuò)增來(lái)進(jìn)一步富集變體。幾輪富集后，純化、克隆并測(cè)序病毒DNA來(lái)確定何種突變產(chǎn)生了成功的變體。
產(chǎn)生載體在這點(diǎn)上，僅用病毒衣殼DNA來(lái)包裝可復(fù)制活性病毒，即基因組中含rep和突變cap基因而能在腺病毒存在時(shí)復(fù)制的病毒。然而，為了在基因治療方案中使用這些變體，用突變的cap基因來(lái)包裝含有治療基因的重組顆粒是重要的。為證明文中所述的突變的cap基因能包裝重組病毒，將該cap基因轉(zhuǎn)移入包裝/輔助質(zhì)粒。加入這種輔助質(zhì)粒及腺病毒輔助質(zhì)粒和含有驅(qū)動(dòng)報(bào)道基因(GEP)在細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子的載體質(zhì)粒，導(dǎo)致產(chǎn)生重組病毒顆粒。
抗體逃逸突變體使用兩種來(lái)源的抗血清來(lái)產(chǎn)生抗體逃逸突變體。一種是用野生型AAV顆粒注射家兔產(chǎn)生的兔血清(新西蘭白兔產(chǎn)生的抗AAV兔血清)。第二種是許多個(gè)體的合并人血清(Sigma產(chǎn)品#H-1388；Lot#122K0424；來(lái)源40位北美供血者)。
肝素結(jié)合突變體為產(chǎn)生肝素結(jié)合突變體，對(duì)CsCl純化的文庫(kù)病毒顆粒如實(shí)施例1所述進(jìn)行NaCl濃度提高步驟的肝素親和層析。肝素結(jié)合能力降低的突變體用相同于病毒顆粒上樣使用的NaCl濃度(例如，0.15M NaCl)洗脫。肝素結(jié)合能力降低的突變體在650-700mM NaCl之間洗脫。
特征鑒定下表1-4提供了各種突變體的VP1中不同于野生型AAV VP1的氨基酸位置。所有的氨基酸差異均是相對(duì)于圖5A-C(SEQ ID NO5)所示的VP1氨基酸序列而言。各種突變體的VP1編碼核苷酸序列示于圖4A-G、圖6A-J和圖8A-G。圖4A-G、圖6A-J和圖8A-G中與野生型AAV-2 VP1不同核苷酸以黑體表示。各種突變體的VP1氨基酸序列示于圖5A-C、圖7A-D和圖9A-C。在圖5A-C、圖7A-D和圖9A-C中，保守性氨基酸變化以方框表示，非保守性氨基酸變化以黑體表示。
表1顯示了各種AAV中和抗體逃逸突變體的克隆數(shù)和氨基酸變化。
表15個(gè)兔抗血清逃逸克隆中的突變


Moskalenko等.，(2000)J.Virol.741761-1766_Wobus等.，(2000)J.Virol.749281-9293_Xie等.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)9910405-10410表2顯示了各種AAV中和抗體逃逸突變體的克隆數(shù)和氨基酸變化。
表29個(gè)人抗血清逃逸克隆中的突變


表3顯示了各種肝素結(jié)合能力提高的突變型AAV的克隆數(shù)和氨基酸變化。
表3肝素親和力提高的克隆的突變

表4顯示了各種肝素結(jié)合能力降低的突變型AAV的克隆數(shù)和氨基酸變化。
表4肝素親和力降低的克隆的突變


盡管參考其具體的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是可做出各種改變并可用等價(jià)物替換而不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍。此外，可對(duì)本發(fā)明的目的、構(gòu)思和范圍做出許多改進(jìn)以適應(yīng)具體的條件、材料、物質(zhì)的組合物、方法、加工步驟。所有這些改進(jìn)也要包括在附加的權(quán)利要求的范圍中。
序列表<110>D.V.謝弗(SCHAFFER，DAVID V.)B.卡斯帕(KASPAR，BRIAN)N.馬赫什里(MAHESTRI，NARENDRA)<120>突變型腺伴隨病毒的病毒顆粒及其使用方法<130>BERK-024WO<140>未指定<141>
<150>60/484,111<151>2003-06-30<160>41<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2225<212>DNA<213>腺伴隨病毒<400>1atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
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<221>misc_feature<222>(2169)...(2169)<223>n＝A、G、C或T<221>misc_feature<222>(2170)...(2170)<223>n＝A、G、C或T<221>misc_feature<222>(2171)...(2171)<223>n＝A、G、C或T<400>2atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
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<210>40<211>2208<212>DNA<213>腺伴隨病毒-2<400>40atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt aggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta cgaacaaatt 780tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agccctttaa cattcaagtc 960aaaggggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ctaccacgca gtcaaggctt 1380cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620atctttggga agcaaggctc agagaaaaca gatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800cttccaggca tgatctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208
<210>41<211>735<212>PRT<213>腺伴隨病毒-2<400>41Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser1 5 10 15Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro20 25 30Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro35 40 45Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro50 55 60Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp65 70 75 80Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala85 90 95Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Arg Gly100 105 110Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro115 120 125Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg130 135 140Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly145 150 155 160Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr165 170 175Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro180 185 190Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Ash Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly195 200 205Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser210 215 220Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile225 230 235 240Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu245 250 255Tyr Glu Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr260 265 270Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His275 280 285Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp290 295 300
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1.一種含有編碼突變型腺伴隨病毒(AAV)衣殼蛋白的核苷酸序列的分離的核酸，其中，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述突變型AAV衣殼蛋白含有至少一個(gè)氨基酸取代。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述編碼的突變型AAV衣殼蛋白顯示肝素結(jié)合能力提高。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述編碼的突變型AAV衣殼蛋白顯示肝素結(jié)合能力降低。
4.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述編碼的突變型AAV衣殼蛋白顯示結(jié)合中和抗體的能力降低。
5.一種含有如權(quán)利要求1所述核酸的分離的宿主細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞用核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
7.如權(quán)利要求5所述的分離的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞還含有核酸，該核酸含有編碼腺伴隨病毒(AAV)rep蛋白的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的分離的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞還含有重組AAV載體。
9.一種腺伴隨病毒(AAV)文庫(kù)，所述文庫(kù)含有多個(gè)核酸，所述核酸含有編碼突變型AAV衣殼蛋白的核苷酸序列，其中，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述突變型AAV衣殼蛋白含有至少一個(gè)氨基酸取代。
10.一種突變型腺伴隨病毒(AAV)顆粒文庫(kù)，所述文庫(kù)包含多個(gè)含有AAV衣殼蛋白的AAV顆粒，相比于野生型AAV衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白含有至少一個(gè)氨基酸取代。
11.一種含有AAV衣殼蛋白和異源核酸的重組腺伴隨病毒(rAAV)病毒粒子，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述AAV衣殼蛋白含有至少一個(gè)氨基酸取代。
12.如權(quán)利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV，所述rAAV病毒粒子顯示肝素結(jié)合能力降低。
13.如權(quán)利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV，所述rAAV病毒粒子顯示肝素結(jié)合能力提高。
14.如權(quán)利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于中和抗體對(duì)野生型AAV病毒粒子感染的抑制，中和抗體對(duì)所述rAAV病毒粒子感染的抑制降低。
15.如權(quán)利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV病毒粒子，所述rAAV病毒粒子穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高。
16.如權(quán)利要求11所述的rAAV病毒粒子，其特征在于，相比于野生型AAV病毒粒子，所述rAAV病毒粒子對(duì)非感染細(xì)胞的感染力提高。
17.一種產(chǎn)生含有AAV衣殼蛋白的突變型腺伴隨病毒(AAV)顆粒的方法，相比于野生型AAV衣殼蛋白，所述AAV衣殼蛋白含有至少一個(gè)氨基酸取代，其中所述突變型AAV顆粒顯示衣殼性能改變，所述方法包括a)產(chǎn)生在AAV cap基因中含有突變的突變型AAV文庫(kù)；b)將該AAV文庫(kù)包裝進(jìn)AAV顆粒，產(chǎn)生AAV文庫(kù)顆粒；和c)選擇衣殼性能改變的AAV文庫(kù)顆粒。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述突變型AAV文庫(kù)的產(chǎn)生包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)誘變。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述誘變包括交錯(cuò)延伸方法。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述突變型AAV文庫(kù)的產(chǎn)生包括寡核苷酸定點(diǎn)誘變。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述選擇步驟包括選擇肝素結(jié)合能力降低。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述選擇步驟包括選擇肝素結(jié)合能力提高。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述選擇步驟包括選擇與中和抗體的結(jié)合能力降低。
24.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述選擇步驟包括選擇對(duì)非感染性細(xì)胞的感染力提高。
25.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述選擇步驟包括選擇穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層的能力提高。
26.一種將基因產(chǎn)物遞送至需要它的個(gè)體的方法，所述方法包括給予個(gè)體如權(quán)利要求11所述的重組腺伴隨病毒(r AAV)病毒粒子。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因產(chǎn)物是蛋白質(zhì)。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因產(chǎn)物是短干擾RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供顯示衣殼性能改變的突變的腺伴隨病毒(AAV)，所述性能改變例如是與血清中和抗體的結(jié)合能力降低和/或與肝素的結(jié)合能力改變和/或?qū)μ囟?xì)胞類型的感染力改變。本發(fā)明還提供在衣殼基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變的突變型AAV的文庫(kù)。本發(fā)明還提供產(chǎn)生突變型AAV、突變型AAV文庫(kù)的方法，以及含有突變型AAV的組合物。本發(fā)明還提供含有突變體衣殼蛋白的重組AAV(rAAV)病毒粒子。本發(fā)明還提供含有編碼突變體衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸，以及含有該核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體的方法，所述方法通常包括將有效量的所述rAAV病毒粒子施用至需要它的個(gè)體。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1826414SQ200480021115
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者D·V·謝弗, B·卡斯帕, N·馬赫什里 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)