專利名稱：檢測dna點突變的方法(snp分析)和相關(guān)的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測DNA點突變(SNP分析)的方法，其中利用了待測目標DNA與位于DNA芯片上的位置特異性固定化的捕手DNA的結(jié)合(雜交)。
利用雜交技術(shù)進行DNA分析是一種公知的方法(見“基因技術(shù)方法”，G.Gassen和G.Schrimpf，海德堡光譜學(xué)院出版社，1999，第11章，“印跡方法和雜交”，243到261頁)。在固態(tài)(fest)的載體材料上固定有DNA探針分子，所謂捕手(F_inger)寡核苷酸，由于其與互補的探針DNA的特異性親和性，捕獲互補的探針DNA，其中它們形成雜交體，即捕手和目標分子的配對。這種結(jié)合事件通常通過光學(xué)的或酶學(xué)的報告分子來顯示。
這種DNA分析的應(yīng)用為例如傳染病病原體，如肺結(jié)核或HIV的檢測。對DNA分析的一個特別需求通過所謂“單核苷酸多態(tài)性”，縮寫為SNP′s建立起來。在此必須的是，由約20個不同核苷酸組成的捕手分子選擇性地結(jié)合或不結(jié)合目標分子，所述目標分子僅在一個唯一的核苷酸上有所區(qū)別。因為結(jié)合能上的區(qū)別非常小，對DNA傳感器(Sensor)的選擇性的要求非常高。
DNA傳感器是現(xiàn)有技術(shù)公知的，對此，可以參閱例如申請人未預(yù)先公開的DE10259820A1和DE10259821A1。捕手/目標DNA雜交體的結(jié)合在特殊的邊界條件(Randbedingungen)下發(fā)生，而彼此相配的捕手/目標DNA對與那些含有錯誤堿基配對的相比有更高的結(jié)合能量。由于SNP中細微的結(jié)合能量差別使得“完美匹配”和“單個位點錯配”常常不能被清楚地區(qū)分。
通過在現(xiàn)有技術(shù)的分析方法中引入了所謂“嚴格洗滌步驟”，后一個難題現(xiàn)在已被解決，即，選擇洗滌溶液的離子強度以使非特異性結(jié)合的“單堿基錯配”目標分子首先從捕手物上分離，而“完美匹配”的目標分子繼續(xù)結(jié)合在捕手分子上。同樣，昂貴的光學(xué)熔點分析也是可能的。在這種方法中人們利用了DNA雙鏈熔解時光吸收的內(nèi)在改變，并且光學(xué)標記不是必需的。無論在嚴格洗滌還是在光學(xué)熔點分析中(在這兩種方法中除了需要相對大數(shù)量的DNA之外，用于對液相進行檢測的分光光度計也是必不可少的)，最多只能對單個SNP調(diào)整條件。當(dāng)在傳感器芯片上存在多個SNP時，分離所有錯配是不可能的。
在對于熔解曲線的光學(xué)檢測中，通常無法提供用于連續(xù)測量或反復(fù)測量所必需的光學(xué)信號(DNA或標簽本身的活性)的穩(wěn)定性。這同樣適用于不可逆的檢測方法。特別不可缺少的是，在能對其進行光學(xué)挑選之前，嚴格洗滌后必須對芯片進行干燥。
在″An Active Microelectronics Device for Multiplex DNA Analysis″，M.Heller，IEEE Engineering in Medicine and Biology，March/April 1996，第100到104頁中，進一步描述了一種所謂的“電嚴格處理”，其中在裝有電極的芯片上進行雜交。單一位點錯配的雜交體由于DNA的多聚陰離子特性通過電極的負極化被分離。然而這種方法不能作為可靠和通用的方法建立起來。此外，在這種方法中，為了能調(diào)整獨特的電學(xué)條件，如電勢，并且或許脈沖時間和強度，必需精確的了解各自的SNP-能量差別。通過應(yīng)用富含能量的脈沖，DNA可能被損壞。
因而得出本發(fā)明的任務(wù)是，提出一種容易的和可靠的、又是細致(schonend)的和可逆的方法，在過程中可以安全地檢測具有不同的、理想地還具有未知的熔解溫度的多個SNP，和得到用于實施該方法的相關(guān)裝置。
根據(jù)本發(fā)明，通過根據(jù)權(quán)利要求1的方法步驟的順序，解決了該任務(wù)。有利的進一步的方案在從屬的方法權(quán)利要求中給出。
用于實施根據(jù)本發(fā)明的方法的相關(guān)裝置是權(quán)利要求28的主題。該裝置的進一步的方案在從屬的產(chǎn)品權(quán)利要求中給出。
在特定的進一步的方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法有利地利用了電化學(xué)檢測方法，特別是氧化還原循環(huán)法與酶標記或酶學(xué)放大相組合的方法。在此使用的酶優(yōu)選的具有熱穩(wěn)定性。DNA捕手分子位于固定的載體材料上，優(yōu)選的是硅芯片或裝有電極的絕緣體。
所述根據(jù)本發(fā)明的裝置至少含有對芯片雜交位置進行流體溫度控制或調(diào)節(jié)的設(shè)備，以及用于調(diào)節(jié)流體流速的設(shè)備和相關(guān)的檢測手段。具體的，進一步連接了具有包括精密泵的微流系統(tǒng)(Mikrofluidiksystem)的傳感器芯片。
從以下實施例的


可以看出本發(fā)明的進一步的細節(jié)和優(yōu)點。
附圖1a、1b和1c用分別為單一雜交位置的依賴于時間的預(yù)先確定的溫度圖形(Temperaturprofil)、液體流動圖形以及用傳感器信號顯示根據(jù)本發(fā)明的方法，附圖2和3顯示從根據(jù)附圖1c的傳感器信號(電流曲線)導(dǎo)出的評估或熔解曲線，以電流初始斜率或標準化至40℃的電流升高作為溫度的函數(shù)，附圖4顯示用于實施該方法的示意性裝置，附圖5和附圖6顯示根據(jù)附圖4的裝置中兩個方法狀態(tài)的放大的圖示，附圖7和附圖8顯示根據(jù)所述SNP-法進行光學(xué)檢測的實施例，和附圖9和附圖10是該方法的電化學(xué)酶學(xué)變形的實施例。
可以進行一種用于檢測DNA點突變(SNP-分析)的方法，其中利用了待測目標DNA與在DNA芯片上位置特異性固定化的捕手DNA的結(jié)合，即，雜交為了有利的實現(xiàn)SNP-分析，特別的按如下進行變換器(Transducer)芯片，例如，硅芯片或其它，優(yōu)選的具有至少一個雜交位置的平面陣列和優(yōu)選的電化學(xué)變換器，例如以貴金屬微電極形式，在其上裝載至少一種DNA捕手探針。例如，所述變換器具有180μm的直徑和200×200μm的二維網(wǎng)格尺寸。變換器陣列擁有若干(mehrere)10到約100個位置。為了實現(xiàn)SNP-分析，選擇捕手探針的序列，使SNP的所有四個可能的核苷酸變體總能夠被定位。通過對理想的配對(匹配)和錯誤配對(錯配)的熔解條件的準確了解，還可以僅操作一種捕手探針。從熔解曲線中可以推測出匹配或錯配。為了能安全地檢測所有三種可能的分析狀況(1僅為匹配，2僅為錯配，3匹配與錯配組合)，在最簡單的情況下也仍需要，帶有匹配或錯配的捕手探針的兩個測量位置。
為了實際實施這種新測量方法，將芯片裝配入流出小室(Durchflusszell)，所述流出小室使得在芯片的雜交位置上形成薄的流體層，所述芯片構(gòu)成變換器或傳感器陣列。從而能形成所有匹配的雜交體或錯配的雜交體。在這樣的溫度下進行與分析DNA探針、特別是生物素化的PCR產(chǎn)物的雜交。隨后在生物素化的目標DNA上偶聯(lián)鏈霉抗生物素-酶-共軛物。
現(xiàn)在將帶有對所述酶特異性的底物的溶液泵到傳感器芯片上。泵優(yōu)選的在恒溫下停止例如5-10秒，測量電流升高的初始斜率。從以下事實獲得電流升高標記酶(例如，熱穩(wěn)定的酯酶)與酶底物(與酶相應(yīng)的，例如，對氨基苯乙酸)反應(yīng)，由此產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物(相應(yīng)的對氨基苯酚)在變換器電極上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，然后由此產(chǎn)生與反應(yīng)產(chǎn)物成比例的電流。電流的升高由以下事實產(chǎn)生所述酶在結(jié)合部位持續(xù)補充反應(yīng)產(chǎn)物，并且因此發(fā)生產(chǎn)物濃度的升高，隨之出現(xiàn)電流的升高。
需強調(diào)的是，要被檢測的反應(yīng)產(chǎn)物(例如，對氨基苯酚)從已連接的標記酶上釋放出來并可以自由擴散，或可用酶底物溶液的水流沖洗。當(dāng)待檢測的酶底物溶液的流速被明顯降低或優(yōu)選被置為零時，此時才可以優(yōu)選地利用電極上的電化學(xué)反應(yīng)，或通過光學(xué)檢測，例如，通過適合的光學(xué)活性反應(yīng)產(chǎn)物的吸收測量。
隨后使流體泵再次運轉(zhuǎn)(數(shù)微升/分鐘)并同時溫度決定性地升高幾℃，例如2℃。通過這種手段一方面將積聚的反應(yīng)產(chǎn)物從檢測位點移開，另一方面錯配目標-捕手DNA雜交體通過溫度升高和熔解而被溶解，并從雜交或檢測位置被移走。因而一方面先前升高了的電化學(xué)信號再次被降低(不必降至零，但要清楚地降低)，另一方面阻止了錯誤配對的目標與捕手DNA由于濃度的降低而重新雜交。首先，被降低的傳感器信號使得進一步的測量成為可能。為此，在幾秒鐘，例如20秒之后，泵再次停止例如5-10秒，并再次記錄到電流升高。
重復(fù)上述過程，直到所有DNA目標分子根據(jù)其熔點依次與捕手探針分離。分析由此獲得的熔解曲線，即，所有變換器位置上的電流升高作為溫度的函數(shù)。特別地，這根據(jù)預(yù)定的軟件程序由計算機控制進行。
整個過程在大約10分鐘后結(jié)束，因此與現(xiàn)有技術(shù)相比是一種特別快速的方法，其由于酶學(xué)放大的應(yīng)用，顯示出高靈敏度和因此也很高的可靠性。
上述熔解曲線的吸收的典型溫度范圍是約40℃到70℃。因為酶，特別是背景技術(shù)公知的標記酶通常僅到約40℃是穩(wěn)定的，也就是說在該溫度之上發(fā)生變性，從而喪失測量所必需的催化效果，根據(jù)本發(fā)明特別地使用熱穩(wěn)定的酶，例如，熱穩(wěn)定的酯酶。
借助附圖1解釋清楚了已描述的測量方法。在分圖1a、1b、1c中都應(yīng)用了相等尺度的時間作為橫座標，而在圖1a中應(yīng)用位于50℃和60℃之間溫度、在圖1b中應(yīng)用無刻度單位的液流、在圖1c中應(yīng)用傳感器信號(氧化還原循環(huán)電流)作為縱座標。人們認識到，使溫度按可預(yù)定的步驟或線性地升高，由此相關(guān)性地(同步地)改變液流。優(yōu)選的，在每次恒溫調(diào)整之后改變液流，特別地，調(diào)整到零。只要到達捕手-目標DNA雜交體的熔解溫度，包括酶標記物在內(nèi)的目標DNA按照統(tǒng)計學(xué)分布的規(guī)律從捕手DNA上脫落，并通過液體流從每個變換器位置上脫離，優(yōu)選的沖洗到廢物容器中。沒有達到其熔解溫度的目標-捕手DNA雜交體繼續(xù)被保留在其雜交位置上。酶底物存在于洗滌溶液中，所述酶底物被已結(jié)合的酶標記轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，所述產(chǎn)物就此而言由于改變的(特別地，被置于零的)液流在雜交位置上積聚，擴散到傳感器電極和被用電化學(xué)方法加以檢測。圖1c因此顯示電流測量值的顯著升高，其每次都顯示捕手/目標DNA配對的完整雜交。特別地，對電流升高的初始斜率進行分析。當(dāng)溫度升高和液流回到初始值時，新的溶液到達雜交位置，從而具有更高熔解溫度的同一測量位置的其它分子，或另一測量位置的第一個分子被熔解和洗滌掉。
任選地，也可連續(xù)地或根據(jù)預(yù)先確定的圖形相應(yīng)于曲線21′或21″進行溫度升高，而不在相應(yīng)于邊界步驟的曲線21中進行溫度升高。此外，沒有必要使相應(yīng)于液流的曲線22停止，而僅需被顯著地改變。結(jié)果是，已經(jīng)調(diào)和的圖形曲線21和22彼此作為變量。重點是調(diào)整每個靜止的或幾乎靜止的狀態(tài)。在圖1c中，傳感器信號(其例如以電流值測量)用23標出，傳感器信號的特定斜率值用24標出。附圖2顯示了因子-V-PCR產(chǎn)物的多個匹配(31)和多個單堿基錯配(32)雜交位置的熔解曲線31、32，所述曲線根據(jù)附圖1c在位置特異性變換器上測量，從而在nA/分鐘內(nèi)的電流升高dI/dt是溫度(Temperaturanfgetragen)的函數(shù)。附圖3顯示了對附圖2進行標準化的測量值電流升高(T)/電流升高(T＝40℃)作為曲線31′和32′，從而可以對比單獨的曲線。因子V-PCR-產(chǎn)物中的因子V涉及到一種基因，其意義在于凝血。
逐個地，在附圖2和附圖3中，以附圖1c中變換器或測量位置為例根據(jù)每個調(diào)整的溫度值繪出電流測量值的初始斜率(dI/dt)。針對單獨的捕手/目標-DNA對顯示顯著的、特別是S形、滴定曲線樣的曲線走向31、32。重要的是，彼此適合(匹配)的捕手/目標-DNA對具有與彼此不適合(錯配)的捕手/目標-DNA對顯著不同的信號走向，或者說沿橫座標不同的曲線走勢。特別地，彼此適合的配對(匹配)與彼此不適合的捕手/目標-DNA配對(錯配)相比在更高的溫度呈現(xiàn)熔解過程和與此相關(guān)的熔解曲線下降。
附圖4中是一種具有具體應(yīng)用的測量結(jié)構(gòu)的一般裝置，由帶有多個雜交位置5、5′、...、5n的芯片組成在附圖4中用1顯示所謂DNA芯片，正如在現(xiàn)有技術(shù)中公知的。這樣的DNA芯片1在其表面2上具有例如按陣列形式的多個測量位置5、5′、...、5n。在每個測量位置5、5′、...、5n上固定排列有捕手DNA分子，例如，在固定點6上的捕手DNA 100。在捕手DNA100上可以積聚有目標DNA 200。目標DNA 200可帶有標簽。該標簽可以是作為生物催化標記物的酶，其中在這種情況下酶標記物優(yōu)選的包括熱穩(wěn)定的酶。
捕手DNA 100的固定物的單個測量點在所有隨后的附圖中，用5、5′、...、5n標出。在用硅或其他半導(dǎo)體材料構(gòu)建的芯片1上，優(yōu)選的已經(jīng)引入了放大器和測量結(jié)構(gòu)，合用3標出。芯片1也可以由帶有沒有集成信號處理的金屬電極的絕緣材料組成。
測量芯片1安置有設(shè)備10來進行精確的溫度調(diào)節(jié)或溫度控制。對此可以采用例如珀爾帖元件或這一類材料。溫度測量在芯片上和/或任選在溫度控制設(shè)備上進行。
作為芯片1的測量面的表面2朝向液流通道20，所有分析過程中必需的物質(zhì)都通過該通道以預(yù)定的液流輸送，例如目標DNA 200，和如果必要，標記物-酶，或如果必要，帶有酶特異性底物S的來自儲存池40的洗滌溶液。還有一液流控制器30，其針對預(yù)定的時間間隔總是保持精確的液流，和確保規(guī)定的液流停止，另外還有吸收或廢物容器50用于不再需要的物質(zhì)。
利用根據(jù)附圖4所描述的裝置，特別地，帶有酶底物S的洗滌溶液有可能在精確的溫度控制下作為薄的液體層導(dǎo)入芯片上。從而可以實現(xiàn)可預(yù)先確定的流體控制和精確的測量以及評估。
在附圖5和6中顯示了兩個一般形式的過程狀況，其中從芯片1引出附屬的溫度穩(wěn)定器(Thermostatierung)10和液流通道20。在放大的顯示中，顯示了具有單個多態(tài)性和相關(guān)的點突變的捕手DNA 100和目標DNA 200。特別明顯的是，例如，在50℃的溫度下所有捕手DNA 100都結(jié)合目標DNA200，而特別存在所謂匹配結(jié)合物A-T、G-C還有錯配結(jié)合物G//A、C//A和A//A。很明顯，匹配結(jié)合物比錯配結(jié)合物堅固。
特別地，在附圖6中描述了一種溫度穩(wěn)定器為例如60℃的狀況，其中在該溫度下錯配結(jié)合物被熔解掉，因而緊接著錯配目標DNA被洗掉。被洗掉的目標DNA分子可被沖洗到廢物容器50。但洗掉的目標DNA分子僅從測量位置移開微小的距離也是足夠的，從而沒有測量位置可再對其進行檢測。
錯配結(jié)合物的熔解可以位置特異性地依賴于溫度進行檢測和評估。對此，一方面在附圖7/8中，另一方面在附圖9/10中，描述了兩個可互換的測量可能性。
附圖7和8來自附圖4或5/6，其中目標DNA 200帶有熒光標簽F。通過這種熒光標記的目標DNA200可以進行光學(xué)挑選。光學(xué)信號75用在附圖7和8中未單獨描述的光譜儀位置特異性地捕獲和評估。
從附圖7和8的對比可以清楚地顯示，通過跨越熔解溫度，例如60℃的溫度，錯配結(jié)合物被熔解，與此有關(guān)的目標DNA 200連同熒光標簽F在內(nèi)被洗掉。就此在錯配位置上產(chǎn)生降低的信號。
在優(yōu)選的、可替換的酶學(xué)/電學(xué)測量中使用了形成產(chǎn)物P的酶學(xué)催化反應(yīng)，適用如下的方程式
其中S表示酶底物，E表示酶標記、P表示反應(yīng)產(chǎn)物。
在附圖9中目標DNA分子200具有酶標記E，其中用箭頭表示酶催化反應(yīng)和反應(yīng)產(chǎn)物P在電測量位置上的擴散。在芯片1的測量位置5、5′、...、5n上存在電化學(xué)信號吸收器，或變換器95、95′，從而與已經(jīng)提及的芯片1的硅片上的信號處理結(jié)構(gòu)3相結(jié)合，可直接獲取這種電信號，例如，電流，所述信號構(gòu)成對反應(yīng)產(chǎn)物P的濃度的量度。
相應(yīng)于附圖7和8，在附圖9和附圖10中再次顯示了50℃的溫度和60℃的溫度的兩種狀況。結(jié)果在第一種情況中通過將S轉(zhuǎn)變?yōu)镻在所有測量位置上獲得了相對大的電信號，在第二種情況中，在錯配位置上獲得降低的信號、或未獲得信號，而在匹配位置上獲得了相對大的電化學(xué)信號。被洗掉的目標DNA分子，以及被洗掉的反應(yīng)產(chǎn)物P可以被再次沖洗到廢物容器50。但被洗掉的目標DNA分子和反應(yīng)產(chǎn)物僅從測量位置上移開微小的距離也是足夠的，從而現(xiàn)有的測量位置中沒有位置可再對其進行檢測。
這種酶學(xué)/電化學(xué)方法的特別的優(yōu)點在于，與例如光學(xué)方法相比很大程度上不依賴于背景信號，因為對電流升高dI/dt加以考慮進行評估，而不是絕對電流信號本身。因此不必將酶標記的目標DNA和由其產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物P沖洗到廢物容器。僅需要通過短時間的沖洗降低反應(yīng)產(chǎn)物P的測量位置特異性濃度(Aufkonzentration)。同樣，通過隨后的沖洗過程輕易地來回泵出洗滌溶液也是足夠的，從而可以節(jié)省洗滌溶液，其特別地通過整合的和最小化的實施形式是有利的。
電流信號對應(yīng)于附圖1c中的峰，從而在附圖2和3中對相應(yīng)于附圖1c中的直線24、24′、24″的其初始斜率dI/dt進行了評估。
除了檢測光學(xué)或酶學(xué)標記的兩個實施例之外，也可對結(jié)合的目標DNA200進行無標記的檢測。在光學(xué)的無標記檢測中，在DNA雙鏈熔解過程中捕捉UV吸收的內(nèi)在變化。電學(xué)無標記檢測中，相反利用內(nèi)在的鳥嘌呤氧化過程。進一步的無標簽檢測可以利用電化學(xué)的阻抗方法進行。再進一步的無標記檢測可通過測量質(zhì)量變化，即，重量測定，例如，通過聲學(xué)方法，如表面波傳感器(即，SAW)來進行。
對于標記方法也可以采用磁性標記與磁場傳感器的組合。
對于上述的方法重要的是，上述測量和相關(guān)的評估是可自動化的。從而也是合適的。依賴于此實現(xiàn)了各自的液流圖形，在此圖形中首先通過應(yīng)用預(yù)定的溫度，一方面熔解了的錯配結(jié)合物被洗掉，另一方面通過“未洗掉的”洗滌溶液實現(xiàn)了對位置特異性結(jié)合的目標DNA的檢測。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測DNA點突變(SNP分析)的方法，其中利用待測目標DNA與在DNA芯片上位置特異性固定的捕手DNA的結(jié)合(雜交)，其中進行限定的時間過程，具有以下步驟a)以已調(diào)整的流速將洗滌溶液導(dǎo)引到DNA芯片上，b)按規(guī)定改變雜交位置上的溫度，c)溫度依賴性地熔解捕手/目標DNA雜交體并通過流動的洗滌溶液將捕手/目標DNA雜交體從雜交位置上移開，d)在預(yù)定時間間隔內(nèi)將流速調(diào)整為零，e)在當(dāng)前溫度下位置特異性地檢測已結(jié)合的目標DNA，而對結(jié)合的目標DNA的位置特異性檢測通過“未被洗掉的”洗滌溶液進行，f)根據(jù)預(yù)定程序評估信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，多次重復(fù)步驟a)到e)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，溫度變化在于持續(xù)不斷的升高。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，持續(xù)不斷的溫度升高作為時間的函數(shù)是線性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，持續(xù)不斷的溫度升高以帶有保持時間的斜面作為時間的函數(shù)進行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，在保持時間中在DNA芯片上的液流被停止。
7.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的方法，其特征在于，對已結(jié)合的目標DNA的檢測是以無標記(無標記物)的形式進行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，無標記檢測以光學(xué)形式進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于，光學(xué)檢測利用DNA雙鏈熔解期間UV吸收的內(nèi)在變化。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，無標記檢測以電學(xué)方式進行。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，無標記檢測借助內(nèi)在的鳥嘌呤氧化進行。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，利用電化學(xué)阻抗方法進行無標記檢測。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，以重量測量的方式進行無標記檢測。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任何一個的方法，其特征在于，在利用標記(標記物)的情況下進行已結(jié)合的目標DNA的檢測。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，借助光學(xué)標記進行檢測。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，借助磁性標記進行檢測。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于，借助酶標記進行檢測。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于，所述洗滌溶液含有酶底物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于，所述酶在所使用的溫度范圍是穩(wěn)定的(有活性的)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16到19的方法，其特征在于，所述酶標記催化的反應(yīng)是光學(xué)可檢測的。
21.根據(jù)權(quán)利要求16到19的方法，其特征在于，所述酶標記催化的反應(yīng)是電化學(xué)可檢測的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于，在電化學(xué)檢測方法中涉及利用氧化還原循環(huán)進行加強的電流測量。
23.根據(jù)權(quán)利要求16到19的方法，其特征在于，檢測和評估底物或產(chǎn)物濃度的改變。
24.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的方法，其特征在于，傳感器信號(檢測信號)的評估和顯示作為溫度的函數(shù)進行。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征在于，在確定的溫度上進行熔解曲線的標準化。
26.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的方法，其特征在于，所述評估是計算機控制的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于，所述評估是根據(jù)軟件進行的。
28.實現(xiàn)根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2到27的任何一種方法的裝置，至少包括DNA芯片(1)和附屬的測量手段，其特征在于，至少具有用于控制和/或調(diào)節(jié)溫度的裝置(10)、使洗滌溶液在芯片表面(2)上流動的裝置(20)和用于流體控制的裝置(30)和用于檢測熔解過程的手段(1-5，75，95)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的裝置，其特征在于，在芯片表面(2)上構(gòu)建作為用于固定DNA捕手探針(100)的陣列的一部分的DNA芯片(1)變換器(5、5′、...；95)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的裝置，其特征在于，洗滌溶液含有酶底物(S)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的裝置，其特征在于，酶標記(E)作為目標DNA(100)的標記物存在。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的裝置，其特征在于，酶標記(E)是熱穩(wěn)定的。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的裝置，其特征在于，用于控制和調(diào)節(jié)溫度的裝置(10)設(shè)置有時間上可預(yù)先確定的溫度圖形。
34.根據(jù)權(quán)利要求28的裝置，其特征在于，帶有依賴于已調(diào)整的溫度的預(yù)定的液流圖形的用于使洗滌溶液在芯片表面(2)上流動的裝置(30)是可調(diào)整的。
35.根據(jù)權(quán)利要求28的裝置，其特征在于，所述檢測手段(1-5、95)被設(shè)計為用于酶反應(yīng)的電化學(xué)檢測。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的裝置，其特征在于，所述檢測手段(1-5、95)被設(shè)計為用于測量電流和/或電勢。
全文摘要
SNP分析利用DNA雜交以及運用DNA芯片。在規(guī)定的時間進程中在DNA芯片上逐個導(dǎo)引待分析的液體DNA探針。在成功的雜交之后，在低嚴格條件下改變規(guī)定的溫度，從而熔解捕手/目標DNA雜交體，由此根據(jù)溫度檢測和評估捕手/目標DNA雜交體的熔解。除已知的DNA芯片(1)之外，至少提供一種用于控制或調(diào)節(jié)溫度的設(shè)備(10)，一種用于DNA芯片(1)的表面(1)的側(cè)面流動的設(shè)備(20，30)。利用適當(dāng)?shù)臏y量手段，可以捕捉和評估用于相互適合(匹配)的雜交體和不適合(錯配/單位點錯配)的雜交體的因素。
文檔編號C12P19/34GK101094923SQ200480021969
公開日2007年12月26日 申請日期2004年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者沃爾特·岡布雷赫特, 彼得·波里卡, 曼弗雷德·斯坦?jié)蔂?申請人:西門子公司