專利名稱：T1r異寡聚味覺受體、表達所述受體的細胞系和味覺化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明部分涉及T1R受體組裝形成功能性味覺受體這一發(fā)現(xiàn)。具體地，已發(fā)現(xiàn)T1R1和T1R3的共表達導致對包括谷氨酸單鈉在內(nèi)的鮮味刺激物產(chǎn)生應答的味覺受體的產(chǎn)生。此外，已發(fā)現(xiàn)T1R2和T1R3受體的共表達導致對包括天然存在和人造甜味劑在內(nèi)的甜味刺激產(chǎn)生應答的味覺受體的產(chǎn)生。
同時，本發(fā)明涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的異寡聚味覺受體在鑒定分別對鮮味刺激物和甜味刺激物產(chǎn)生應答的化合物的測定中的用途。
本發(fā)明還涉及T1R1、T1R2和T1R3的嵌合體和截斷形式，以及包含人類、大鼠或人類和大鼠亞基的T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受體的嵌合體。
此外，本發(fā)明涉及細胞系的構建，所述細胞系在組成性或誘導性條件下穩(wěn)定地或瞬時地共表達T1R1和T1R3的組合或T1R2和T1R3的組合，所述組合包括這些亞基的截斷形式或嵌合形式，以及包含野生型或嵌合亞基的嵌合受體。
本發(fā)明還提供所述細胞系在鑒定鮮味調節(jié)化合物和甜味調節(jié)化合物的基于細胞的測定中的用途，所述測定尤其是通過使用熒光成像法檢測受體活性的高通量篩選測定。
本發(fā)明還涉及與T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受體以及與T1R1、T1R2和T1R3的嵌合或截斷的亞基和嵌合受體結合的化合物。
背景技術：
味覺系統(tǒng)提供有關外界化學組成的感覺信息。據(jù)信哺乳動物至少有5種基本的味覺甜味、苦味、酸味、咸味和鮮味(見例如Kawamura等，Introduction to UmamiA Basic Taste(1987)；Kinnamon等，Ann.Rev.Physiol.，54715-31(1992)；Lindemann，Physiol.Rev.，76718-66(1996)；Stewart等，Am.J.Physiol.，2721-26(1997))。據(jù)認為各味覺由在舌表面發(fā)現(xiàn)的味覺受體細胞中表達的一個或多個不同蛋白受體介導(Lindemann，Physol.Rev.，76718-716(1996))。識別苦味、甜味和鮮味刺激物的味覺受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族(Hoon等，Cell 96451(1999)；Adler等，Cell 100693(2000))。(據(jù)信其它味覺由離子通道介導)。
G-蛋白偶聯(lián)受體介導諸如內(nèi)分泌功能、外分泌功能、心率、脂類分解和碳水化合物代謝等許多其它生理功能。許多對所述受體的生化分析和分子克隆已揭示有關這些受體的功能的很多基本原理。例如，美國專利No.5,691,188描述了當配體與GPCR結合時，該受體將如何發(fā)生構象變化，從而在Gα亞基的表面促使結合的GDP被GTP置換而導致異三聚體G蛋白的激活、并導致隨后Gα亞基從Gβ和Gγ亞基上的解離。游離的Gα亞基和Gβγ復合物激活各種信號轉導途徑的下游元件。
早前假設T1R受體具有甜味受體的功能(Hoon等，Cell 96541-51(1999)；Kitagawa等，Biochem Biophys Res.Commun.283236-42(2001)；Max等，Nat.Genet.2858-63(2001)；Montmayeur等，Nat.Neurosci.4412-8(2001)；Sainz等，J.Neurochem.77896-903(2001))，而Nelson等(2001)和Li等(2002)最近已證明分別為大鼠和人類的T1R2和T1R3以組合形式識別甜味刺激物。
但是，在本領域中，還需要新型或改進的調味劑。例如，五種已知的基本味覺之一是谷氨酸單鈉(“MSG”)的“香味”或“鮮味”味道。已知MSG在一些人中產(chǎn)生不良的反應，但在MSG人造代替品的鑒定中的進展非常小。已知有一些天然存在的物質能夠增加或增強MSG作為香味調味劑的效果，因此在給定的口味應用中將需要較少的MSG。例如，已知天然存在的核苷酸化合物肌苷一磷酸(IMP)或鳥苷一磷酸(GMP)對MSG的香味具有增效作用。但是由于從天然來源分離和純化IMP和GMP或合成IMP和GMP非常困難和昂貴，因此對于在食物或藥物組合物中的大多數(shù)商業(yè)需求來說，IMP和GMP的實際應用非常有限。目前提供MSG本身的香味或增進任何存在的MSG的效果的較便宜的化合物會具有非常高的價值。同樣地，發(fā)現(xiàn)新的“高強度”的甜味劑(即它們比蔗糖甜數(shù)倍)的化合物也很有價值。
本領域需要的是鑒定和表征具有甜味和鮮味受體功能的受體，鑒定調節(jié)(增強或阻斷)甜味和鮮味的化合物的測定方法和與這些受體特異性結合的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供包含人類和大鼠的T1R的各種組合的嵌合受體，所述嵌合受體例如包含人類T1R2亞基和大鼠T1R3亞基的嵌合T1R2/T1R3受體；包含大鼠T1R2亞基和人類T1R3亞基的嵌合T1R2/T1R3受體；包含人類胞外域、大鼠跨膜結構域和大鼠胞內(nèi)域的嵌合T1R2受體亞基；以及包含大鼠胞外域、人類跨膜結構域和人類胞內(nèi)域的嵌合T1R3受體亞基。
本發(fā)明還提供與本文所公開的T1R1、T1R2、T1R3、T1R1/T1R3和T1R2/T1R3或其分離亞基、片段、嵌合體或截斷形式特異性結合的化合物。
本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)當T1R的不同組合共表達時，產(chǎn)生對味覺刺激物發(fā)生應答的功能性味覺受體。具體地，本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)T1R2和T1R3的共表達導致對甜味刺激物產(chǎn)生應答的異寡聚味覺受體的產(chǎn)生。同時，本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)T1R1和T1R3的共表達導致對鮮味刺激物(例如谷氨酸單鈉)產(chǎn)生應答的異寡聚味覺受體的產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及共表達T1R1和T1R3(包括人類的或大鼠的)或T1R2和T1R3(包括人類的或大鼠的)的細胞系。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些細胞系組成性或誘導性地表達增加量的受體。這些細胞系包括瞬時地或穩(wěn)定地表達T1R1和T1R3或T1R2和T1R3的細胞。
同時，本發(fā)明還提供測定方法，優(yōu)選為高通量篩選測定方法，所述測定方法利用T1R2/T1R3味覺受體或T1R1/T1R3受體來鑒定調節(jié)甜味或鮮味的化合物，優(yōu)選為高通量的基于細胞的測定方法。本發(fā)明還提供包括為確定這些化合物調節(jié)甜味或鮮味而進行味道檢驗在內(nèi)的測定方法。
本發(fā)明還涉及例如與T1R2的N-末端胞外域結合的化合物、與T1R2的富含半胱氨酸結構域結合的化合物、與T1R2的跨膜結構域結合的化合物、與T1R3的跨膜結構域結合的化合物、與截斷受體h2TM/h3TM的T1R2的跨膜結構域結合的化合物以及與截斷受體h2TM/h3TM的T1R3的跨膜結構域結合的化合物。


圖1包含人類和大鼠T1R、人類鈣敏感受體和大鼠代謝型谷氨酸受體的序列比對。
圖2為RT-PCR(反轉錄-聚合酶鏈式反應)擴增的實驗結果，所述實驗結果表明hT1R2和hT1R3在味覺組織中表達。
圖3a～3b為功能性數(shù)據(jù)(胞內(nèi)鈣應答)，所述數(shù)據(jù)由穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞中的不同甜味刺激物所獲得，其中所述穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞在不同濃度的甜味刺激物的存在下用人類T1R2、T1R3和T1R2/T1R3進行瞬時轉染(圖3a)；人類T1R2/T1R3對數(shù)種甜味刺激物產(chǎn)生應答的劑量反應性(圖3b)；人類T1R2/T1R3在抗糖尿病植物因子(gurmarin)存在時對蔗糖產(chǎn)生應答，內(nèi)源性β2-腎上腺素能受體在抗糖尿病植物因子存在時對異丙腎上腺素產(chǎn)生應答。圖3c為對不同甜味劑產(chǎn)生的經(jīng)標準化的應答。
圖4為HEK細胞中響應350mM的蔗糖、25mM的色氨酸、15mM的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和0.05％的應樂果甜蛋白而產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣應答，所述HEK細胞穩(wěn)定表達Gα15，并由hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3和rT1R2/hT1R3瞬時轉染。
圖5為基于熒光板反應器的測定的結果，其中穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞由hT1R2和hT1R3或單獨由hT1R3瞬時轉染并與鈣染料Fluo-4和甜味刺激物(12.5mM環(huán)己基氨基磺酸鹽)接觸。
圖6為經(jīng)標準化的劑量-應答曲線，該曲線顯示，根據(jù)hT1R2和hT1R3與各種甜味刺激物(trp、環(huán)己基氨基磺酸鹽、蔗糖、紐甜(neotame)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精和Acek)的劑量特異性相互關系，hT1R2和hT1R3的組合具有作為人類甜味受體的功能。
圖7為與mGluR1和T1R1有關的結構信息，該信息顯示在這些分子中觀察到關鍵的配體結合殘基。
圖8a～8c為功能性數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示HEK細胞在胞內(nèi)鈣的測定中響應谷氨酸所產(chǎn)生的應答，所述HEK細胞由T1R1/T1R3瞬時轉染并穩(wěn)定表達Gα15。圖8a顯示響應谷氨酸濃度的增加，胞內(nèi)鈣增加；圖8b顯示胞內(nèi)鈣對IMP(2mM)、谷氨酸(0.5mM)和0.2mM IMP產(chǎn)生的應答；以及圖8c顯示在存在或不存在0.2mM的IMP時，人類T1R1/T1R3對谷氨酸的應答。
圖9a～9b分別為采用Myc標記的hT1R2的免疫熒光染色測定結果和FACS實驗結果，結果表明PDZIP肽(SEQ ID No1)的摻入促進了T1R(hT1R2)在質膜上的表達。
圖10a到圖10b為鈣成像數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表明hT1R2/hT1R3對不同甜味刺激物的應答。
圖11顯示通過自動熒光成像獲得的穩(wěn)定表達hT1R1/hT1R3的細胞系對鮮味刺激物的應答。
圖12顯示通過自動熒光成像獲得的穩(wěn)定表達hT1R2/hT1R3的細胞系對甜味刺激物的應答。
圖13顯示存在或不存在0.2mM的IMP時，采用自動熒光成像確定的誘導性表達人類T1R1/T1R3味覺受體的細胞系對L-谷氨酸的劑量-應答曲線。
圖14和圖15顯示誘導性表達人類T1R1/T1R3味覺受體的細胞系(I-17克隆)對一組L-氨基酸的應答。在圖14中，在存在或不存在1mM的IMP時，對10mM不同的C-氨基酸進行檢驗。在圖15中，在存在0.2mM的IMP時，確定活性氨基酸的劑量-應答。
圖16顯示lactisole抑制人類T1R2/T1R3和人類T1R1/T1R3的受體活性。
圖17顯示人類-大鼠T1R的嵌合體的示意圖。如h2-r2、r2-h2、h3-r3和r3-h3所示，所述嵌合體為分別將人類或大鼠的胞外域與大鼠或人類的跨膜結構域融合而構建的嵌合體。
圖18顯示，新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC)增強T1R1/T1R3鮮味受體的活性。[新橙皮苷二氫查耳酮]＝5μM。谷氨酸的劑量應答曲線向左遷移2.3倍(左圖)，而谷氨酸/IMP的劑量應答向左遷移2.1倍。
圖19顯示，對照甜味劑并沒有影響T1R1/T1R3鮮味受體的活性。[蛇菊苷]＝0.5mM。[糖精]＝1mM。谷氨酸劑量應答顯示在左圖中，而谷氨酸/IMP的劑量應答顯示在右圖中。
圖20顯示NHDC在人類T1R3的跨膜結構域上的定位。
圖21顯示化合物相對于人類T1R2的跨膜結構域的定位。
圖22a～d顯示定位于人類甜味受體的不同結構域/亞基的甜味劑。圖22a顯示人類和大鼠的甜味受體對蔗糖(200mM)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(10mM)、紐甜(0.1mM)、環(huán)己基氨基磺酸鹽(10mM)和存在lactisole(1mM)時的蔗糖(200mM)(Suc/Lac)所產(chǎn)生的應答。用人類或大鼠的T1R2、T1R3和Gα15的嵌合體Gα15/il瞬時轉染HEK-293T細胞，并測定在對甜味劑產(chǎn)生應答時胞內(nèi)鈣的增加。圖22b顯示天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜定位于人類T1R2的N-末端胞外域。將T1R嵌合體的各個組合瞬時轉染到含Gα15/il的HEK-293T細胞，并測定其對23a中列出的濃度的甜味劑所產(chǎn)生的應答。是否存在應答是重要的。圖22c顯示環(huán)己基氨基磺酸鹽定位于人類T1R3的C-末端跨膜結構域。圖22d顯示lactisole定位于人類T1R3的跨膜結構域。將T1R嵌合體的不同組合瞬時轉染到含Gα15/il的HEK-293T細胞中，并在lactisole(1mM)存在或不存在時測定所述組合對蔗糖(200mM)和Acek(10mM)所產(chǎn)生的應答。B、C和D中的活性代表約1000個匯合細胞的4個成像域中響應細胞數(shù)目的平均值±SE(標準誤差)。
圖23a～d顯示T1R2或T1R3中的突變選擇性地影響不同甜味劑的活性。圖23a顯示將人類和嚙齒動物的T1R2與大鼠mGluR5的N-末端配體結合域的序列進行比對。用*標記mGluR5中涉及配體結合的8個關鍵氨基酸，這8個氨基酸酸中的3個在T1R2中是保守的并用下劃線進行標記。圖23b顯示人類T1R2的N-末端胞外域中的兩個點突變，這兩個點突變導致對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜不產(chǎn)生應答但對環(huán)己基氨基磺酸鹽的應答卻不受影響。如實施例所述，制備hT1R2/hT1R3(WT)、hT1R2 S144A/hT1R3(S144A)和hT1R2 E302A/hT1R3(E302A)的穩(wěn)定細胞系。采用FLIPR測定這些穩(wěn)定的細胞系對蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、環(huán)己基氨基磺酸鹽和紐甜的劑量-應答。該活性代表在4個記錄孔中熒光強度的倍數(shù)增加的平均值±標準誤差。圖23c顯示人類和嚙齒動物的T1R3跨膜結構域的序列比對。用下劃線標出3個胞外環(huán)并根據(jù)它們在蛋白序列中的順序將其標為EL1、EL2或EL3。圖23d顯示hT1R3的胞外環(huán)中的突變，該突變導致細胞對環(huán)己基氨基磺酸鹽不產(chǎn)生應答但不影響其對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的應答。用大鼠的蛋白序列分別代替hT1R3的3個胞外環(huán)中的各環(huán)，將所得hT1R3突變體與Gα15/il一起瞬時轉染到HEK-293T細胞中，并測定該細胞對蔗糖(200mM)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(10mM)和環(huán)己基氨基磺酸鹽(10mM)所產(chǎn)生的應答。活性代表約1000個匯合細胞的4個成像域中響應細胞數(shù)目的平均值±標準誤差。
圖24a～b顯示人類T1R2對于Gα15偶聯(lián)是必要的。圖24a顯示人類甜味受體、大鼠甜味受體和嵌合甜味受體對蔗糖(200mM)和Acek(10mM)產(chǎn)生的應答。用人類、大鼠或嵌合的T1R瞬時轉染穩(wěn)定的Gα15細胞，并測定胞內(nèi)鈣在對甜味劑的應答中的增加。圖24b顯示Gα15偶聯(lián)由人類T1R2所介導?；钚源砑s1000個匯合細胞的4個成像域中響應細胞數(shù)目的平均值±標準誤差。
圖25a～f顯示lactisole和環(huán)己基氨基磺酸鹽對人類T1R1/T1R3鮮味受體的影響。圖25a顯示存在和不存在lactisole(5mM)時，人類T1R1/T1R3穩(wěn)定細胞系對L-谷氨酸(5mM)和L-谷氨酸/IMP(1mM/0.2mM)產(chǎn)生的應答。圖25b顯示針對L-谷氨酸(Glu)和混有0.2mM IMP的L-谷氨酸(Glu/IMP)，測定lactisole的劑量-應答抑制曲線，所述Glu和Glu/IMP均采用兩個不同濃度。對于8mM和80mM的L-谷氨酸，IC50分別為0.19±0.02mM和0.21±0.01mM。對于混有IMP的0.8mM和8mM的L-谷氨酸，IC50分別為0.35±0.03mM和0.82±0.06mM。圖25c顯示存在不同濃度的lactisole時，測定在有或沒有0.2mM IMP時對L-谷氨酸的劑量應答。存在0μM、25μM或50μM的lactisole時，L-谷氨酸的EC50分別為9.9±1.5mM、7.9±0.5mM和7.0±0.3mM；存在0μM、100μM、或200μM的lactisole時，對混有IMP的L-谷氨酸的EC50分別為0.53±0.04mM、0.71±0.10mM和0.84±0.10mM。這些值代表4個獨立應答的平均值±標準誤差。圖25d顯示存在或不存在lactisole時，對甜味、鮮味和咸味刺激物的檢測閾值所進行的測定。在檢測閾值中，lactisole的抑制作用以倍數(shù)增加的形式顯示。“檢測閾值”被定義為能檢測到的調味劑的下限。檢測閾值的值由對3個對象、4次實驗進行平均得到。圖25e顯示存在和不存在各種濃度的環(huán)己基氨基磺酸鹽時，由FLIPR測定人類T1R1/T1R3穩(wěn)定細胞系對L-谷氨酸(4mM)和內(nèi)源M2受體激動劑氨甲酰膽堿的閾值水平的應答。圖25f顯示存在和不存在環(huán)己基氨基磺酸鹽(8mM)時，針對有或沒有0.2IMP的L-谷氨酸，由FLIPR測定人類T1R1/T1R3穩(wěn)定細胞系的劑量-應答。B、C、E和F中的活性代表4個記錄孔的熒光強度的倍數(shù)增加的平均值±標準誤差。B、C、E和F中的劑量-應答至少獨立重復6次。
圖26顯示甜味受體和鮮味受體的結構-功能關系的工作模型。實心箭頭表示直接激活，空心箭頭表示促進，而橫線端頭表示抑制。
圖27a顯示對甜味劑和lactisole的應答得以檢測的T1R和嵌合體的所有16個組合。rT1R2/T1R3H-R、rT1R2/hT1R3和T1R2H-R/T1R3R-H顯示對環(huán)己基氨基磺酸鹽產(chǎn)生顯著應答，并且它們可以受到lactisole的抑制。將T1R嵌合體瞬時轉染到含Gα15/il的HEK-293T細胞中。活性代表約1000個匯合細胞的4個成像域中響應細胞數(shù)目的平均值±標準誤差。在Y軸上的各個單位代表50個響應細胞。簡寫如下Suc(蔗糖100mM)；Suc/Lac(蔗糖100mM，lactisole 1mM)；AceK(乙酰舒泛鉀10mM)；AceK/Lac(乙酰舒泛鉀10mM，lactisole 1mM)；ATM(天冬氨酰苯丙氨酸甲酯10mM)；NTM(紐甜10mM)；Cyc(環(huán)己基氨基磺酸鹽10mM)。圖27b顯示針對蔗糖(Suc)、糖精(Sac)和D-色氨酸(D-Trp)(各采用2個不同的濃度)，測定人類甜味劑受體的lactisole劑量-依賴性抑制曲線。對50mM和120mM的蔗糖，IC50分別為19.6±0.1μM和64.6±0.3μM；對0.1mM和2mM的糖精，IC50分別為22.6±0.1μM和103±7μM；對D-色氨酸，IC50分別為19.9±0.2μM和168±9μM。圖27c顯示用不同濃度的lactisole測定人類甜味受體對蔗糖、D-Trp和糖精的劑量應答。存在0μM、10μM或20μM的lactisole時，蔗糖的EC50分別為19.4±0.9mM、24.7±1.0mM和31.3±0.3mM；D-Trp的EC50分別為0.37±0.02mM、0.60±0.03mM和0.94±0.08mM；糖精的EC50分別為42±3μM、67±6μM和118±2μM。這些值代表4個獨立應答的平均值±標準誤差。在B和C中的劑量-應答至少獨立測定6次，并產(chǎn)生了如此處所顯的類似結果。
具體實施例方式
本發(fā)明提供特異地與本文公開的野生型和嵌合的甜味受體和鮮味受體結合的化合物。本發(fā)明還提供特異地與甜味受體和鮮味受體的野生型、嵌合的或截斷的T1R2或T1R3亞基結合的化合物。
與T1R2/T1R3甜味受體的結合確定了一大類分子。該受體對包括碳水化合物糖、氨基酸和衍生物、甜蛋白和合成的甜味劑在內(nèi)的所檢驗的每一個甜味劑均產(chǎn)生應答。同時，該受體顯示出對某些甜味劑的立體選擇性，例如，該受體對D-色氨酸產(chǎn)生應答但對L-色氨酸不產(chǎn)生應答，這與味覺生理學數(shù)據(jù)是一致的。
因而，本發(fā)明的化合物特異地結合嵌合受體。嵌合受體的例子包括但不限于，包含人類T1R2亞基和大鼠T1R3亞基的嵌合T1R2/T1R3受體，包含大鼠T1R2亞基和人類T1R3亞基的嵌合T1R2/T1R3受體，包含人類胞外域、大鼠跨膜結構域和大鼠胞內(nèi)域的嵌合T1R2受體亞基，以及包含大鼠胞外域、人類跨膜結構域和人類胞內(nèi)域的嵌合T1R3受體亞基。本發(fā)明提供功能性的味覺受體，優(yōu)選為人類味覺受體，所述受體由不同的T1R組合(優(yōu)選為T1R1/T1R3或T1R2/T1R3)的共表達產(chǎn)生；以及在共表達時產(chǎn)生功能性味覺受體(即甜味受體(T1R2/T1R3)或鮮味受體(T1R1/T1R3))的相應的分離核酸序列或其片段、嵌合體或變體。
T1R為C類G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族，其在味覺組織中選擇性表達(Hoon，M.A.等，Cell，1999.96(4)541-551頁；Bachmanov，A.A.等，Chem Senses，2001.26(7)925-933頁；Montmayeur，J.P.等，Nat Neurosci，2001.4(5)492-498；Max，M.等，Nat Genet，2001.28(1)58-63頁；Kitagawa，M.等，Biochem Biophys Res Commun，2001.283(1)236-242頁和Nelson，G.等，Cell，2001.106(3)381-390頁)。T1R在HEK293細胞中的功能性表達揭示，T1R的不同組合對甜味刺激物和鮮味刺激物產(chǎn)生應答(Nelson，G.等，Cell，2001.106(3)381-390頁；Li，X.等，Proc NatlAcad Sci USA，2002.99(7)4692-4696頁)。當在293細胞中共表達時，T1R2和T1R3識別不同的天然或合成的甜味劑[由于以上提及的涉及“不同”的原因，請考慮我們是否需要這一實現(xiàn)部分。如果不需要，我將刪除。我們可以討論]，而T1R1和T1R3識別鮮味刺激物L-谷氨酸，而且鮮味標志物5’-核糖核苷酸促進該應答。敲除數(shù)據(jù)證實，T1R確實介導小鼠的甜味味覺和鮮味味覺(Damak，S.等，Science，2003 301(5634)850-853頁；Zhao，G.Q.等，Cell 2003年10月31日；115(3)255-266)。
C類GPCR具有較大的N-末端胞外域，該胞外域常稱為維納斯捕蠅域(Venus flytrap domain，VFD)(Pin，J.P.，Pharmacol Ther，2003 98(3)325-354頁)，并已知在代謝型谷氨酸受體(mGluR)和鈣敏感受體(CaR)的情況中以同二聚體的形式發(fā)揮作用，或在γ-氨基丁酸型B受體(GABABR)的情況中以異二聚體的形式發(fā)揮作用。功能性表達數(shù)據(jù)顯示了T1R的異二聚體機制T1R1和T1R2都需要與T1R3共表達才能發(fā)揮作用，在嚙齒動物的舌中進行的T1R的重疊表達模式支持了這一點。
本文已明確，T1R家族成員與其它T1R家族成員以組合的形式發(fā)揮甜味和鮮味受體的作用。如下文實驗例中所作的進一步詳述，已證明共表達hT1R2和hT1R3的異源細胞被甜味刺激物選擇性激活，這種激活以反映出人類的甜味味覺的方式進行。
例如，共表達hT1R2和hT1R3的HEK-293-Gα15細胞對環(huán)己基氨基磺酸鹽、蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和糖精產(chǎn)生特異性應答，而且對這些化合物的劑量應答與心理學味覺檢測閾值相關。
同時，如得到實驗例中的數(shù)據(jù)支持的那樣，已表明共表達hT1R1和hT1R3的細胞被谷氨酸(谷氨酸單鈉)和5’-核糖核苷酸選擇性激活，這種激活以反映出人類的鮮味味覺的方式進行。例如，共表達hT1R1和hT1R3的HEK-293-Gα15細胞對谷氨酸產(chǎn)生特異性應答，并且對該鮮味化合物的劑量應答與其心理學味覺檢測閾值相關。而且，諸如IMP等5’-核糖核苷酸增強T1R1/T1R3受體對谷氨酸的應答，這是鮮味的協(xié)同作用特性。
此外，如得到實驗例中的實驗數(shù)據(jù)顯示，已表明穩(wěn)定性和誘導性地共表達T1R1/T1R3的細胞對鮮味刺激物L-谷氨酸和L-天冬氨酸產(chǎn)生選擇性應答，但對其它L-氨基酸只產(chǎn)生微弱的應答，而且是在濃度很高的情況下，這進一步為T1R1/T1R3受體能夠用于鑒定調節(jié)(增強或阻斷)鮮味刺激物的化合物的測定中提供了證據(jù)。
可以在表5中找到特異地結合到甜味受體并調節(jié)甜味的化合物的例子。
表1～4提供特異地結合到鮮味受體并調節(jié)鮮味的化合物的例子。













































同時，如實施例中的實驗數(shù)據(jù)所支持的那樣，已表明共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞系分別對鮮味刺激物或甜味刺激物產(chǎn)生應答，并且為定量劑量-應答模式，該模式進一步支持以下結論與T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受體特異性的結合可以用于確定受體的激動劑和拮抗劑(例如，MSG替代物、鮮味阻斷劑、新的人造和天然的甜味劑和甜味阻斷劑)。
同時，如實驗例中的數(shù)據(jù)所支持的那樣，已表明甜味阻斷劑lactisole既抑制T1R2/T1R3甜味受體又抑制T1R1/T1R3鮮味受體。本文提供了增強、模擬、調節(jié)或阻斷甜味或鮮味的化合物。lactisole既抑制T1R1/T1R3受體又抑制T1R2/T1R3受體的事實顯示，這些受體可以具有與lactisole和其它潛在的味覺調節(jié)劑結合的相同亞基。因此，增強、模擬、調節(jié)或阻斷甜味的化合物可能對鮮味具有類似的效果，反之亦然。
此外，如實驗例中的數(shù)據(jù)所支持的那樣，已證明當通過自動熒光成像法進行分析時，穩(wěn)定地共表達T1R(即T1R1/T1R3和T1R2/T1R3)的細胞系對各種甜味刺激物和鮮味刺激物產(chǎn)生非常有效的應答，即其量要遠遠大于瞬時轉染的細胞。因此，這些細胞系非常適合用于高通量篩選測定以鑒定調節(jié)、阻斷、模擬或促進甜味或鮮味的化合物。但是，本發(fā)明還包括采用瞬時表達T1R或其組合的細胞所進行的測定。
而且，盡管本申請包括證明一些T1R以組合的形式(尤其是T1R1/T1R3和T1R2/T1R3)發(fā)揮作用以及證明這樣的受體組合可用于各種測定(優(yōu)選為高通量測定)的數(shù)據(jù)，但應該注意的是，本發(fā)明還包括單獨采用T1R1、T1R2和T1R3或與其它蛋白(例如GPCR)的組合所進行的測定。
就配體特異性、G蛋白偶聯(lián)效率以及對抑制劑的敏感性而言，人類和嚙齒動物的甜味味覺是存在差異的?？梢岳肨1R配體特異性的物種差異來證明甜味受體確實以異聚體復合物的形式發(fā)揮作用，并且在所述受體上存在不止一個的配體結合位點。此外，已顯示由T1R3介導的甜味受體和鮮味受體之間的功能性關聯(lián)(實施例16)。
人類和大鼠的甜味受體均能夠有效地偶聯(lián)到帶有來自Gαil(Gα15/il)的C-末端尾部序列的嵌合的Gα15。例如，人類的T1R2/T1R3對包括天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、紐甜和環(huán)己基氨基磺酸鹽在內(nèi)的一組甜味劑選擇性產(chǎn)生應答，而大鼠的T1R2/T1R3卻不產(chǎn)生所述的應答。這與味覺生理學數(shù)據(jù)是一致的。可以利用激動劑特異性上的這些差異來對它們在受體上的結合位點進行定位?？梢栽谌祟惡痛笫蠡蛑g產(chǎn)生嵌合的T1R，連接處位于緊鄰跨膜結構域的前端。因此各個T1R嵌合體包括兩個部分，來自不同物種的N-末端胞外域，與C-末端跨膜結構域和胞內(nèi)域。例如，稱為T1R2-R的嵌合T1R2具有來自人類T1R2 N-末端的序列，該序列融合到大鼠T1R2的C-末端序列。然后可以檢驗這些嵌合體的應答(圖22)。
在化學領域的一系列的酰胺衍生物中，已發(fā)現(xiàn)新的化合物和新的調料、調味劑和甜味增強劑。酰胺化合物還包括某些酰胺衍生物的亞類或各類與酰胺有關的衍生物，例如脲、氨基甲酸酯、草酰胺和丙烯酰胺等。當與蔗糖一起使用或單獨使用時，這些化合物促進體外應答并在人類的味覺中伴隨增加甜味感覺。這些化合物對其它天然和合成的甜味調味劑具有增強作用。這些化合物的例子列在表5中。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供新的化合物、食用調料、調味劑、口味增強劑、味道增強劑、口味調節(jié)化合物和/或包含它們的組合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供新的甜味食用調料、甜味調味劑、甜味增強劑、甜味調節(jié)劑和包含它們的組合物。
更具體地，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及天然或合成的甜味調味劑(例如天然存在和合成的甜味劑)具有調節(jié)、誘導、增強或抑制作用的化合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供含有至少一種本發(fā)明化合物的組合物，優(yōu)選適合于人類和動物食用的組合物。這些組合物包括食物、飲料和藥物以及食物添加劑，當將所述食物添加劑添加到食物、飲料或藥物中時調節(jié)其口味或味道，尤其是通過提高其甜味而調節(jié)其口味或味道。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及本發(fā)明的化合物在調節(jié)所需食物、飲料或藥物的甜味中的用途，所述組合物可以包含一種或多種引起甜味的其它化合物。當與天然存在和合成的甜味劑一起使用時，這些化合物不僅提高了體外應答而且還增強了人類味覺中的甜味和其它口味或味道感覺。當與諸如天然存在和合成的甜味劑等甜味調味劑一起使用時，這些特定化合物不僅增強了T1R2/T1R3的體外應答，而且還增強了人類味覺中的甜味和其它口味或味道感覺。
本文還公開了諸如酰胺、脲、氨基酰胺、酰氨基酰胺和β-內(nèi)酰胺等新化合物和新的調料、調味劑和鮮味增強劑和調味劑。當與MSG一起使用或單獨使用時，這些化合物提高了體外應答并增強了人類味覺中的鮮味感覺。這些化合物還增強了其它天然和合成的鮮味調味劑的作用。這些化合物的例子列在表1～4中。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供新的化合物、食用調料、調味劑、口味增強劑、味道增強劑、口味調節(jié)劑化合物和/或包含它們的組合物。
在更具體的一個實施方案中，本發(fā)明提供新的鮮味食用調料、鮮味調味劑、鮮味增強劑和鮮味調節(jié)劑和包含它們的組合物。
更具體地，在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對天然或合成的鮮味調味劑(例如谷氨酸單鈉(MSG))具有調節(jié)(誘導、增強或抑制)作用的化合物。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供含有至少一種本發(fā)明化合物的的組合物，優(yōu)選適合于人類和動物食用的組合物。這些組合物包括食物、飲料和藥物、以及食物添加劑，當將所述食物添加劑添加到食物、飲料或藥物中時調節(jié)其口味和味道，尤其是通過增強其鮮味而調節(jié)其口味和味道。
本發(fā)明的另外一個實施方案涉及本發(fā)明的化合物在調節(jié)所需食物、飲料或藥物的鮮味中的用途，其中組合物可以包含一種或多種引起鮮味的其它化合物(例如MSG)。當與MSG一起使用時，這些化合物不僅提高體外應答而且還增強了人類味覺中的鮮味和其它口味或味道感覺。當與鮮味調味劑(例如MSG)一起使用時，這些特定化合物不僅增強了T1R1/T1R3的體外應答，而且還增強了人類味覺中的鮮味和其它口味或味道感覺。當單獨品嘗時，一些所述化合物引起人類的鮮味感覺。
通過本發(fā)明T1R測定所確定的與特定受體特異性結合的化合物可以用來調節(jié)食物和飲料的味道。下文中進一步詳述的適宜測定方法，通過舉例的方式包括全細胞測定法和生化測定法，這些測定法包括用不同T1R受體、或其嵌合體或片段(尤其是包含N-末端配體結合結構域的片段)的組合之一所進行的直接結合測定。適用于本發(fā)明的適宜測定方法的例子將在下文作進一步描述，并且其在GPCR領域是已知的。
可以將所述測定設計為對不同化合物或化合物的混合物與T1R味覺受體或T1R味覺受體的組合或與其它的異源(非T1R)蛋白(例如其它GPCR)一起組合表達的T1R受體的結合進行定量測定，或對表達T1R味覺受體的細胞的激活進行定量測定。該測定可能受到在諸如HEK-293、CHO和COS細胞等異源細胞中味覺受體的穩(wěn)定或瞬時表達的影響。因而，用化合物的物理化學特征來定義共同具有這些特征的一類化合物。
所述測定優(yōu)選使用還表達(優(yōu)選穩(wěn)定地表達)諸如Gα15或Gα16或其它混雜的G蛋白或G蛋白變體或內(nèi)源性G蛋白等G蛋白的細胞。另外，其中還可以表達Gβ和Gγ蛋白。
采用表達或含有以上鑒定的受體或受體組合的細胞或組合物，通過包括使用鈣敏感染料、電壓敏感染料、cAMP測定、用熒光標記配體或諸如3H谷氨酸等放射性配體的直接結合分析、或轉錄分析(用諸如熒光素酶或β-內(nèi)酰胺酶等適宜的報道分子)等各種方法，可以確定化合物對甜味或鮮味的影響。
可以使用的采用本發(fā)明的一種或多種T1R的測定以舉例的方式包括利用對活細胞進行遺傳選擇的測定、利用全細胞或膜片段或經(jīng)純化T1R蛋白的測定、利用諸如cAMP和IP3等第二信使的測定方法、檢測將抑制蛋白轉運到細胞表面的測定、通過檢驗配體來檢測細胞表面上受體表達的缺失(內(nèi)在化作用)的測定、直接配體結合測定、用抑制劑進行的競爭結合測定、用體外翻譯蛋白進行的測定、檢測配體結合后構象變化的測定(例如，如通過蛋白水解、熒光或NMR證明)、利用表達T1R或T1R組合的轉基因非人類動物(例如蠅類、蠕蟲或小鼠)的行為測定和利用由含有T1R基因的重組病毒感染的細胞的測定。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有基于結構的分析，其中，確定了T1R或T1R片段(或T1R組合或T1R與另一個蛋白的組合)的X射線晶體結構，并通過分子模型技術將其用以預測可能與特定的T1R受體或受體組合結合的化合物和/或對特定的T1R受體或受體組合具有促進、模擬、阻斷或調節(jié)作用的化合物。更具體地，本發(fā)明包括確定T1R1/T1R3(優(yōu)選hT1R1/hT1R3)和/或T1R2/T1R3(優(yōu)選hT1R2/hT1R3)的晶體結構，以及這些晶體結構在基于結構的設計方法中用以鑒定調節(jié)T1R受體活性的分子的用途。
本發(fā)明特別包括使用細胞進行的生化測定，所述細胞例如表達一種或多種全長T1R受體或片段(優(yōu)選T1R1、T1R2和/或T1R3的N-末端結構域)的哺乳動物、酵母、昆蟲或其它異源細胞。采用競爭結合測定(例如用放射性谷氨酸或IMP、熒光(例如熒光偏振，F(xiàn)RET)或GTPγ35S結合測定)來測定化合物在這些測定方法中的作用。如所指出的那樣，在一個優(yōu)選實施方案中，所述測定將利用穩(wěn)定地共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3和適當?shù)腉蛋白(例如Gα15)的細胞系。其它適當?shù)腉蛋白包括在序列號為No.09/984,292和60/243,770的美國申請中公開的G蛋白的嵌合體和變體，通過參考的方式將它們的全部內(nèi)容引入到本文中。
另外，可以構建并表達具有改進特性(例如增強了表面表達或G蛋白偶聯(lián))的受體?？梢詫⑦@些T1R變體加入到基于細胞的測定和生化測定中。
可以預見，涉及人類T1R的本發(fā)現(xiàn)將延及其它物種，例如嚙齒動物、豬、猴、狗和貓，甚至可能延及諸如魚等非哺乳動物。在這方面，下文的實施例1已確認了幾種魚的T1R片段。因此，本發(fā)明可應用于篩選用于動物飼料制劑的化合物。
本發(fā)明還包括利用各種T1R的不同等位變體和它們的組合，據(jù)此能夠鑒定在表達那些等位變體的個體中引起特定味覺感受的化合物或在所有個體中引起特定味覺感受的化合物。所述化合物可以使食物一般要更加美味。
編碼T1R的核酸還可以提供用于鑒定味覺細胞的有用探針，這是因為該核酸在味覺細胞中特異地表達。例如，可以用T1R多肽和蛋白的探針來鑒定存在于葉狀乳頭、輪廓乳頭和菌狀乳頭中的味覺細胞，以及存在于geschmackstreifen、口腔、胃腸上皮和會厭中的味覺細胞。特別地，檢測T1R的方法可以用來鑒定對甜味和/或鮮味的刺激物或代表其它味覺形式的其它味覺刺激物敏感的味覺細胞。例如，根據(jù)本文的工作，可以推測穩(wěn)定或瞬時表達T1R2和/或T1R3的細胞會對甜味刺激物產(chǎn)生應答。類似地，可以推測表達T1R1和/或T1R3的細胞會對鮮味刺激物產(chǎn)生應答。編碼本發(fā)明的T1R蛋白和多肽的核酸可以從各種來源中分離，并可以對所述核酸進行遺傳工程化、擴增、合成和/或者根據(jù)WO 00/035374公開的方法對該核酸進行重組表達，通過參考的方式將WO 00/035374的全部內(nèi)容引入到本文中。在實施例中提供了可以根據(jù)本發(fā)明進行表達的T1R的列表。但是，應該強調的是，本發(fā)明包括基于所述T1R序列構建的其它特定的T1R或片段、變體或嵌合體的表達和用途，尤其是基于其它物種的T1R的表達和用途。
如公開的那樣，本發(fā)明的一種重要方面是篩選這些味覺細胞特異性GPCR的調節(jié)劑(例如激活劑、抑制劑、刺激劑、增強劑、激動劑和拮抗劑)的多種方法。這些味覺轉導的調節(jié)劑對調節(jié)味覺信號轉導途徑是有用的。可以采用這些篩選方法來鑒定味覺細胞活性的高親和性激動劑和拮抗劑。在食物工業(yè)中，可以利用這些調節(jié)化合物來按照具體要求定制味道，例如調節(jié)食物的甜味和/或鮮味。
本發(fā)明彌補了以前對涉及甜味和鮮味的理解的缺乏，這是因為本發(fā)明鑒定了介導甜味和鮮味感覺的特異性T1R和T1R受體組合。因此，總的來說，本申請與本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)有關，所述發(fā)現(xiàn)涉及味覺特異性G蛋白偶聯(lián)受體的T1R類和它們在味覺感受中的特定功能以及這些發(fā)現(xiàn)之間的關系，以更好地理解味覺的分子基礎。
甜味和鮮味的分子基礎—谷氨酸單鈉的風味是個謎。最近鑒定了味覺特異性G蛋白偶聯(lián)受體的三成員組，稱為T1R。重疊T1R表達模式和結構相關的GABAB受體是異二聚體的證明表明，T1R作為異二聚體的味覺受體發(fā)揮作用。在下文的實施例中，本發(fā)明人描述人類T1R1、T1R2和T1R3在異源細胞中的功能性共表達。共表達T1R1和T1R3的細胞受到鮮味刺激物的激活；而共表達T1R2和T1R3的細胞受到甜味刺激物的激活。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的活性與心理學檢測閾值是有關聯(lián)的。另外，已發(fā)現(xiàn)5’-核糖核苷酸IMP增強T1R1/T1R3對谷氨酸的應答，具有鮮味的協(xié)同特征。這些發(fā)現(xiàn)證明特異性T1R尤其是T1R的不同組合作為甜味和鮮味受體發(fā)揮功能。
據(jù)認為人類對苦味、甜味和鮮味的感受是由G蛋白偶聯(lián)受體介導的(Lindemann，B.，Physiol.Res.76718-766(1996))。最近，在對人類基因組的評價中發(fā)現(xiàn)了T2R類苦味受體(Adler等，Cell 100613-702(2000)；Chandrasgekar等，Cell 100703-711(2000)；Matsunami等，Nature 404601-604(2000))，但沒有鑒定出甜味和鮮味的受體。最近，鑒定了另外一類候選的味覺受體T1R。T1R是通過對來自大鼠味覺組織的扣除cDNA文庫進行大規(guī)模測序而首次得以鑒定的，其被鑒定為T1R1，隨后通過基于T1R1的簡并PCR，導致鑒定出了T1R2(Hoon等，Cell 96541-551(1999))。最近，本發(fā)明人和其它人在人類基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了T1R家族的第三個也可能是最后一個成員T1R3(Kitagawa等，Biochem Biophys.Res Commun.283(1)236-242(2001)；Max等，Nat.Genet.28(1)58-63(2001)；Sainz等，J.Neurochem.77(3)896-903(2001)；Montmayeur等，Nat.Neurosci.4，492-498.(2001))。據(jù)知，小鼠的T1R3定位于包含Sac(在小鼠中影響甜味感覺的基因座)的基因組間隔區(qū)中(Fuller等，J.Hered.6533-36(1974)；Li等，Mamm.Genome 1213-16(2001))。因此，推測T1R3作為甜味受體發(fā)揮功能。最近，高分辨的遺傳作圖研究增強了小鼠T1R3和Sac之間的聯(lián)系(Fuller T.C.，J.Hered.65(1)33-36(1974)；Li等，Mammal.Genome 12(1)13-16(2001))。
有趣的是，已表明目前已進行功能性表達的所有C家族受體代謝型谷氨酸受體、GABAB受體、鈣敏感受體(Conigrave，A.D.，Quinn，S.J.和Brown，E.M.，Proc Natl Acad Sci USA 97，4814-4819(2000))以及魚嗅覺受體(Speca，D.J.等，Neuron 23，487-498.(1999))受到氨基酸的激活。這些共同特征提出這樣的一種可能T1R識別氨基酸，而且T1R還可能參與除了甜味氨基酸之外的谷氨酸的檢測?；蛘?，由于在大鼠的味覺組織中選擇性表達mGluR4代謝型谷氨酸受體的轉錄變體并且受體激活閾值與谷氨酸的心理學檢測閾值相似，推測mGluR4代謝型谷氨酸受體的轉錄變體為鮮味受體(Chaudhari等，Nat.Neurosci.3113-119(2000))。這種假設難以與mGluR4變體在味覺組織中極低的表達量以及mGluR4敲除小鼠或多或少并未改變的谷氨酸味覺相吻合(Chaudhari和Roper，Ann.N.Y.Acad.Sci.855398-406(1998))。而且，味覺變體在結構上是難以置信的，其不僅缺少形成野生型受體的谷氨酸結合袋的大部分殘基，而且缺少大約一半的球狀的N-末端谷氨酸結合結構域(Kunishima等，Nature407971-977(2000))。
T1R在嚙齒動物中的表達模式的比較分析證明，T1R2和T1R1(可能)各自與T1R3共表達(Hoon等，Cell 96541-551(1999)；Kitagawa等，Biochem Biophy.Res.Commun.283236-242(2001)；Max等，Nat.Genet.2858-63(2001)；Montmayeur等，Nat.Neurosci 4492-498(2001)；Sainz等，J.Neurochem 77896-903(2001))。此外，二聚化正成為C家族受體的共同主題代謝型谷氨酸和鈣敏感受體是同二聚體(Romomano等，J.Biol.Chem.27128612-28616(1996)；Okamoto等，J.Biol.Chem.27313089-13096(1998)；Hah等，J.Biol.Chem.274100008-100013(1999)；Bai等，J.Biol.Chem.27323605-23610(1998))，而結構相關的GABAB受體是異二聚體(Jones等，Nature 396674-679(1998)；Kaupmann等，Nature396683-687(1998)；White等，Nature 396679-682(1998)；Kuner等，Science 28374-77(1999))。本發(fā)明人通過在異源細胞中對T1R進行功能性共表達已證明，與人類T1R3結合的人類T1R2作為甜味受體發(fā)揮作用，而與人類T1R3結合的人類T1R1作為具有鮮味受體發(fā)揮作用。
以前由于缺少對甜味的測定方法，因而阻礙了人造甜味劑的改進進程，因此本文中討論的發(fā)現(xiàn)特別重要。實際上，均能激活hT1R2/hT1R3的五種常用的商業(yè)人造甜味劑都是偶然發(fā)現(xiàn)的。類似地，除了感官檢驗這樣繁雜的方法之外，還沒有鑒定調節(jié)鮮味的化合物的測定方法。這些問題目前已經(jīng)得到緩解，這是因為如在下文中討論的實驗結果所確定的，人類甜味和鮮味受體已經(jīng)得到鑒定，并且也已經(jīng)建立這些受體的測定方法，尤其是利用穩(wěn)定表達功能性T1R味覺受體(即甜味受體或鮮味受體)的細胞所進行的測定。
基于此，本發(fā)明提供檢測和表征味覺調節(jié)化合物的測定方法，其中T1R家族成員如它們在味蕾中所起的作用那樣，起到味覺調節(jié)化合物對甜味和鮮味的所發(fā)揮效果的報道分子的作用。特別要提供并且在本發(fā)明范圍之內(nèi)的是用于鑒定對甜味和鮮味分別具有調節(jié)、模擬、增強和/或阻斷作用的化合物的測定方法。測定GPCR活性尤其是測定影響GPCR活性的化合物的方法是已知的，并且適用于本發(fā)明的T1R家族成員及其功能性組合。前面已經(jīng)確定了適宜的測定方法。
如在全文所公開的那樣，本發(fā)明還提供與T1R1、T1R2、T1R3、T1R2/T1R3或T1R1/T1R3或者其片段、部分或亞基相結合的化合物。
特別地，可以將所述GPCR用于測定以下體外和體內(nèi)變化例如配體結合、離子濃度、膜電位、電流、離子流、轉錄、受體配體互相作用、第二信使?jié)舛?。在另外一個實施方案中，可以在細胞中重組表達T1R家族成員，可以通過測定Ca2+水平和諸如cAMP、cGMP和IP3等其它胞內(nèi)信息的變化來測定對借助GPCR活性的味覺傳導的調節(jié)。
在某些測定中，將T1R多肽的結構域(例如胞外域、跨膜結構域或胞內(nèi)域)融合到異源多肽上，據(jù)此形成嵌合多肽(例如具有GPCR活性的嵌合蛋白)。尤其考慮使用含有N-末端配體結合結構域的T1R1、T1R2和T1R3的片段。此類蛋白例如在鑒定T1R受體的配體、激動劑、拮抗劑或其它調節(jié)劑的測定中是有用的。例如，可以將T1R多肽與異源的通過分泌途徑便于質膜運輸、成熟和定位的伴侶序列作為嵌合受體在真核細胞中表達。選擇性的異源序列可以是PDZ結構域互相作用肽(例如C-末端PDZIP片段(SEQ ID NO 1))。PDZIP是ER輸出信號，根據(jù)本發(fā)明，已顯示該輸出信號促進諸如本文所述T1R受體等異源蛋白的表面表達。更特別地，在本發(fā)明的一個方面，可以用PDZIP來促進發(fā)生問題的膜蛋白(所述膜蛋白諸如嗅覺受體、T2R味覺受體和本文所述的T1R味覺受體等)的正確定位。
所述嵌合受體的例子包括跨物種的受體?？梢砸黄鹄脕碜愿鞣N物種的受體亞基的任何組合來形成嵌合受體，然后例如將該嵌合受體用于鑒定調味劑。因此，在此考慮的是含有人類T1R2亞基和大鼠T1R3亞基的嵌合的T1R2/T1R3。還考慮的是含有大鼠T1R2亞基和人類T1R3亞基的嵌合的T1R2/T1R3。還考慮的是含有人類胞外域、大鼠跨膜結構域和大鼠胞內(nèi)域的嵌合T1R2受體亞基(例如SEQ ID NO16和17)。還考慮的是含有大鼠胞外域、人類跨膜結構域和人類胞內(nèi)域的嵌合T1R3受體亞基(例如SEQ ID NO18和19)。
可以在諸如HEK-293細胞等任意的真核細胞中表達所述的嵌合T1R受體。優(yōu)選地，所述細胞包含G蛋白，優(yōu)選諸如Gα15和Gα16等混雜的G蛋白或者能夠將大范圍的GPCR連接到胞內(nèi)信號轉導途徑或連接到信號轉導蛋白(例如磷脂酶C)上的另一種類型的混雜G蛋白。可以采用任意標準方法來檢測在所述細胞中所述嵌合受體的激活，所述標準方法例如通過檢測細胞內(nèi)的FURA-2依賴性熒光來檢測胞內(nèi)鈣的變化。如果優(yōu)選的宿主細胞沒有表達適宜的G蛋白，可以用編碼混雜的G蛋白的基因來對它們進行轉染，例如在2001年10月29日提交的序列號為No.60/243,770的美國專利申請和序列號為No.09/984,297的美國專利申請以及2001年11月21日提交的序列號為No.09/989,497的美國專利申請所述，通過參考的方式將以上所述專利的全部內(nèi)容引入到本文中。
味覺轉導調節(jié)劑的另外測定方法包括使用以下進行的體外配體結合測定T1R多肽、該多肽的部分(即胞外域、跨膜結構域或者其組合、或者包含T1R家族成員的一個或多個結構域的嵌合蛋白)；表達T1R多肽、片段或融合蛋白的卵母細胞或組織培養(yǎng)細胞；T1R家族成員的磷酸化和去磷酸化；結合GPCR的G蛋白；配體結合測定；電壓、膜電位和傳導力的變化；離子流測定；諸如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇(IP3)等胞內(nèi)第二信使的變化；以及胞內(nèi)鈣水平的變化。
此外，本發(fā)明提供檢測T1R核酸和蛋白表達的方法，使用該方法可以研究味覺轉導調節(jié)和味覺受體細胞的特異性鑒定。T1R家族成員還可以提供對父親血緣和法醫(yī)研究有用的核酸探針。T1R基因還可以作為對鑒定諸如葉狀、菌狀、輪廓、geschmackstreifen和會厭味覺受體細胞等味覺受體細胞有用的核酸探針。T1R受體還可以用于產(chǎn)生對鑒定味覺受體細胞有用的單克隆抗體和多克隆抗體。
在功能上，T1R多肽包含有關的7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族，據(jù)信所述受體參與味覺轉導，并可以與G蛋白相互相作用，從而介導味覺信號轉導(見例如Fong，Cell Signal，8217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.Cell Biol.，6180(1994))。在結構上，T1R家族成員的核苷酸序列編碼包含胞外域、7次跨膜結構域和胞質域的相關多肽。來自其它物種的有關T1R家族基因在至少約50個核苷酸長度內(nèi)，或者在100、200、500或500個以上的核苷酸長度的區(qū)域內(nèi)與本文實施例中公開的T1R核酸序列或者其保守性修飾的變體具有至少約50％，或者60％、70％、80％或90％的核苷酸序列一致性，或者所編碼的多肽在至少約25個氨基酸長度內(nèi)，或者在50～100個氨基酸長度的氨基酸區(qū)域內(nèi)與本文實施例中公開的T1R多肽序列或者其保守性修飾的變體具有至少約35～50％，或者60％、70％、80％或90％的氨基酸序列一致性。
已經(jīng)鑒定了作為T1R家族成員特征的幾個共有氨基酸序列或結構域。例如，T1R家族成員通常包含與T1R的共有序列1和序列2(分別為SEQ ID No 2和SEQ ID No 3)具有至少約50％，或者55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95～99％或更高的一致性的序列。因此可以用這些保守結構域通過一致性、特異性雜交或擴增、或由針對結構域所產(chǎn)生的抗體的特異性結合來鑒定T1R家族成員，通過舉例的方式，T1R共有序列包括以下序列T1R家族的共有序列1(SEQ ID NO2)(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)ET1R家族的共有序列2(SEQ ID NO3)(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)這些共有序列包含在本文所述T1R多肽中所發(fā)現(xiàn)的共有序列中，但預期其它有機體的T1R家族成員可能包含與本文具體描述的共有序列具有約75％或更高的一致性的共有序列。
可以用T1R的核苷酸和氨基酸序列的特定區(qū)域來鑒定T1R家族成員的多態(tài)性變體、物種間同源物和等位基因。這些鑒定可以在體外進行，例如在嚴格條件下進行雜交或利用PCR進行(例如，采用編碼以上鑒定的T1R共有序列的引物)，或在計算機系統(tǒng)中用所述序列的信息與其它核苷酸序列進行比較。在單一物種群體內(nèi)的T1R基因的不同等位基因還可以用于確定等位基因間的差異是否控制該群體成員間味覺感受的差異。可以用經(jīng)典PCR型擴增和克隆技術來分離新的T1R，例如，簡并引物在跨物種的情況中足以檢測相關基因。
通常，可以通過比較約25個氨基酸或更多的氨基酸(例如50～100個氨基酸)的氨基酸序列來鑒定T1R家族成員的多態(tài)性變體和等位基因。氨基酸的一致性約為至少35％～50％，或者60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％-99％或更高的一致性通常證明蛋白是T1R家族成員的多態(tài)性變體、物種間同源物或等位基因?？梢杂靡韵掠懻摰娜我庑蛄斜容^算法來進行序列比較。也可以用與T1R多肽或其保守區(qū)域特異性結合的抗體來鑒定等位基因、物種間同源物和多態(tài)性變體。
可以通過測定假定的T1R基因或蛋白的味覺細胞特異性表達來證實T1R基因的多態(tài)性變體、物種間同源物和等位基因。通常，可以將具有本文所述的氨基酸序列的T1R多肽用作與假定的T1R多肽進行比較的陽性對照，以證明對T1R家族成員的多態(tài)性變體或等位基因的鑒定。預期T1R基因的多態(tài)性變體、等位基因和物種間類似物都保留了G蛋白偶聯(lián)受體的7次跨膜結構。進一步的細節(jié)請見公開了有關的T1R家族成員GPCR-B3的WO 00/06592，以與本文公開一致的方式通過參考將其內(nèi)容引入到本文中。GPCR-B3受體在本文中稱為rT1R1和mT1R1。另外，見公開了有關的T1R家族成員GPCR-B4的WO 00/06593，以與本文公開一致的方式通過參考將其內(nèi)容引入到本文中。GPCR-B4受體在本文中稱為rT1R2和mT1R2。如前面討論的那樣，本發(fā)明還包括基于結構的測定，該測定利用T1R或T1R組合(例如hT1R2/hT1R3或hT1R1/hT1R3)的X射線晶體結構，以鑒定調節(jié)T1R受體活性并據(jù)此調節(jié)甜味和/或鮮味的分子。
本發(fā)明還提供用以鑒定增強、模擬、阻斷和/或調節(jié)T1R受體的分子的測定，優(yōu)選為高通量測定。在一些測定中，使用T1R家族成員的特定結構域與另一個T1R家族成員的特定結構域的組合，所述特定結構域例如胞外、跨膜或胞內(nèi)結構域或區(qū)域。在其它實施方案中，可以將胞外域、跨膜區(qū)或它們的組合結合到固體基質上，用以例如分離能夠結合T1R多肽和/或調節(jié)T1R多肽活性的配體、激動劑、拮抗劑或任意其它分子。
預想將各種保守性突變和置換均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，采用包括PCR、基因克隆、cDNA的定位誘變、宿主細胞轉染和體外轉錄等重組基因技術的已知程序進行氨基酸置換在本領域技術水平之內(nèi)。然后可以對變體進行篩選以檢測活性。
定義如本文使用的那樣，除非另有描述，以下術語具有認為屬于它們的含義。
“味覺細胞”包括組織成組以形成舌的味蕾的神經(jīng)上皮細胞，例如葉狀、菌狀和輪廓細胞(見例如Roper等，Ann.Rev.Neurosci.12329-353(1989))。還發(fā)現(xiàn)味覺細胞存在于顎和諸如食道和胃等其它組織中。
“T1R”是指在諸如葉狀、菌狀和輪廓細胞以及顎和食道的細胞等味覺細胞中表達的G蛋白偶聯(lián)受體家族的一個或多個成員(見例如Hoon等，Cell，96541-551(1999)，通過參考的方式將其全部內(nèi)容引入到本文中)。該家族成員在WO 00/06592中還稱為GPCR-B3和TR1，以及在WO00/06593中稱為GPCR-B4和TR2。在本文中GPCR-B3還稱為rT1R1，而GPCR-B4還稱為rT1R2。還可以基于多態(tài)性(見例如Roper，上文)或通過在味覺細胞中特異性表達的蛋白的表達來鑒定味覺受體細胞。T1R家族成員可以具有作為甜味轉導受體的能力或區(qū)分各種其它味覺形式的能力。在下文的實施例中鑒定包括hT1R1、hT1R2和hT1R3在內(nèi)的代表性的T1R序列。
“T1R”核酸編碼具有7個跨膜區(qū)的GPCR家族，該家族具有“G蛋白偶聯(lián)受體活性”，例如，它們可以響應胞外刺激物而結合到G蛋白上，并通過刺激諸如磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶等酶，促進諸如IP3、cAMP、cGMP和Ca2+等第二信使的產(chǎn)生(對于GPCR的結構和功能的描述，見例如Fong，上文和Baldwin，上文)。單個味覺細胞可以含有許多不同的T1R多肽。
因此，術語“T1R”家族指多態(tài)性變體、等位基因、突變體和物種間同源物，其(1)在約25個氨基酸或者50～100個氨基酸的范圍內(nèi)，與T1R多肽(優(yōu)選與實施例1中所鑒定的多肽)具有至少約35％～50％的氨基酸一致性，或者具有約60％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸一致性；(2)特異地結合針對免疫原而產(chǎn)生的抗體，所述免疫原包含優(yōu)選選自由實施例1所公開的T1R多肽序列及其保守性修飾的變體組成的組的氨基酸序列；(3)由核酸分子編碼，所述核酸分子在嚴格雜交條件下與選自由包含在實施例1中的T1R核酸序列和其保守性修飾的變體組成的組的序列特異性雜交(雜交長度至少約為100個核苷酸，或者至少約500～1000個核苷酸)；或(4)包含至少與選自由實施例1中鑒定的T1R氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列具有至少約35％～50％的一致性的序列。
在拓撲學上，本文公開的T1R具有包含“維納斯捕蠅域”和“富含半胱氨酸結構域”的“N-末端結構域”(也稱為“胞外域”)；包含7個跨膜區(qū)和相應的胞質和胞外環(huán)的“跨膜結構域”；和“C-末端結構域”(見例如Hoon等，Cell，96541-551(1999)；Buck和Axel，Cell，65175-187(1991))。用本領域技術人員已知的方法(例如確定疏水和親水結構域的序列分析程序)已從結構上確定了這些結構域(Stryer，Biochemistry，(第三版，1988))。所述結構域對構建嵌合蛋白和本發(fā)明的體外測定(例如配體結合測定)是有用的?；衔镌谶@些結構確定的結構域上的特異結合為所述化合物提供了結構上的限定。
因此，“胞外域”是指從細胞膜突出并暴露在細胞的胞外表面的T1R多肽的結構域。此類結構域通常包括暴露在細胞的胞外表面的“N-末端結構域”，或者可以包括暴露在細胞的胞外表面的跨膜結構域的胞外環(huán)部分，即在跨膜區(qū)2和3之間的環(huán)，在跨膜區(qū)4和5之間的環(huán)和在跨膜區(qū)6和7之間的環(huán)。
“N-末端結構域”部分開始于N-末端并延伸到靠近第一跨膜結構域的起始部分的區(qū)域。更具體地，在本發(fā)明的一個實施方案中，該結構域起始于N-末端并大約結束于氨基酸563上下約20個氨基酸位置的保守性谷氨酸。這些胞外域對可溶相和固相的體外配體結合測定是有用的。另外，以下描述的跨膜區(qū)也可與胞外域一起結合到配體上，因此所述跨膜區(qū)對體外配體結合測定也是有用的。
“富含半胱氨酸結構域”是指多肽的結構域。該保守序列含有幾個高度保守的形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，并定位于細胞膜外。該區(qū)域與T1R家族成員的結構域對應，并在所有的3個亞基(T1R1～T1R3)中都有發(fā)現(xiàn)。在T1R1的氨基酸510～566、T1R2的氨基酸508～565和T1R3的氨基酸512～568中發(fā)現(xiàn)富含半胱氨酸的序列。
“跨膜結構域”包含7個“跨膜區(qū)”，是指T1R多肽的定位于質膜中的的結構域，并且還可能包括相應的胞質(胞內(nèi))和胞外的環(huán)。在一個實施方案中，該區(qū)對應于T1R家族成員大約起始于氨基酸563上下20個氨基酸位置的保守性谷氨酸并大約結束于氨基酸812上下約10個氨基酸位置的保守性酪氨酸殘基的區(qū)域。可以用如Kyte和Doolittle(J.Mol.Biol.，157105-132(1982))或由Stryer(上文)記載的標準方法鑒定所述7個跨膜區(qū)與胞外環(huán)和胞質環(huán)。
“胞質結構域”是指面向細胞里面的T1R多肽的結構域，例如“C-末端區(qū)域”和跨膜結構域的胞內(nèi)環(huán)，該胞內(nèi)環(huán)例如在跨膜區(qū)1和2之間的胞內(nèi)環(huán)，在跨膜區(qū)3和4之間的胞內(nèi)環(huán)和在跨膜區(qū)5和6之間的胞內(nèi)環(huán)。
“C-末端結構域”是指跨越最后跨膜結構域的末端和蛋白的C-末端的區(qū)域，并且該區(qū)域一般定位于胞質內(nèi)。在一個實施方案中，該區(qū)域起始于氨基酸812上下約10個氨基酸位置的保守性酪氨酸殘基并延續(xù)到多肽的C-末端。
術語“配體結合區(qū)”或“配體結合結構域”是指來自味覺受體尤其是基本至少合并有該受體的胞外域的味覺受體的序列。在一個實施方案中，配體結合區(qū)的胞外域可以包括N-末端結構域并選擇性地包括跨膜結構域的部分(例如跨膜結構域的胞外環(huán))。所述配體結合區(qū)可以能夠結合配體，更具體地，結合用以增強、模擬、阻斷和/或調節(jié)味覺(例如甜味或鮮味)的化合物。
在本發(fā)明的T1R受體或多肽的上下文中的短語“異聚體”或“異聚復合物”是指至少一個T1R受體與另一個受體(一般為另一個T1R受體多肽(或選擇性地，另一個非T1R受體多肽))的功能性結合。為了清楚目的，在本申請中將T1R的功能性共依賴性描述為反映為它們作為異二聚體味覺受體復合物的可能功能。但是，如前面討論的那樣，功能性共依賴性也可以選擇性地反映間接互相作用。例如，T1R3可以單獨具有促進T1R1和T1R2的表面表達的功能，其可能獨立地作為味覺受體發(fā)揮作用。選擇性地，功能性的味覺受體可以由T1R3單獨組成，在T1R1或T1R2的控制下被區(qū)別處理，這類似于鈣相關受體的RAMP依賴性處理。
在用于檢驗調節(jié)T1R家族成員介導的味覺轉導的化合物的測定的上下文中，短語“功能性作用”包括確定對間接或直接地受該受體的影響的參數(shù)，所述影響例如功能性的、物理的和化學的作用。它包括體外、體內(nèi)和間接體內(nèi)(ex vivo)的配體結合和以下變化離子流、膜電位、電流、轉錄、G蛋白結合、GPCR磷酸化或去磷酸化、基于構象變化的測定、信號轉導、受體-配體互相作用、第二信使(例如cAMP、cGMP、IP3或胞內(nèi)鈣Ca2+)濃度，還包括諸如神經(jīng)遞質或激素釋放的提高或降低等其它的生理作用。
在測定的上下文中“確定功能性作用”是指對化合物進行的測定，所述化合物提高或降低間接或直接地受T1R家族成員的影響的參數(shù)，所述影響例如功能性的、物理的和化學的作用?？梢酝ㄟ^本領域技術人員已知的任意手段測定所述的功能性作用，所述手段例如光譜特征的變化(例如熒光、吸光度、折射率)、流體動力學(例如形狀)、層析或溶解性質、膜片鉗術、電壓敏感染料、全細胞電流、放射性同位素流出、誘導性標記、卵母細胞T1R基因表達；組織培養(yǎng)細胞T1R表達；T1R基因的轉錄激活；配體結合測定；電壓、膜電位和傳導力的變化；離子流測定；諸如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)等胞內(nèi)第二信使的變化；胞內(nèi)鈣水平的變化；神經(jīng)遞質的釋放，構象測定等。
本文“調料或調味劑”是指用于在受試對象中誘導包括甜味、酸味、咸味、苦味和鮮味以及其它等氣味和/或味道的感覺的化合物或其生物上可接受的鹽。所述受試對象可以是人類、動物和/或生物待分析物(例如在本申請中描述和引用的生物待分析物)。
本文“調料或味道調節(jié)劑”是指在受試對象中用于調節(jié)(包括增強或加強、抑制和誘導)天然或合成的調味劑的氣味和/或味道的化合物或其生物上可接受的鹽。
本文“調料或味道增強劑”是指用于增強天然或合成的調味劑的味道或氣味的化合物或其生物上可接受的鹽，所述調味劑例如用于調節(jié)鮮味的谷氨酸單鈉(MSG)和用于調節(jié)甜味的果糖。
本文“鮮味調味劑”或“鮮味化合物”是指在受試對象中引起可檢測的鮮味的化合物或其生物上可接受的鹽，例如MSG。
本文“甜味調味劑”或“甜味化合物”是指在受試對象中引起可檢測的甜味的化合物或其生物上可接受的鹽，例如果糖。
本文“鮮味調節(jié)劑”是指用于在受試對象中調節(jié)(包括增強或加強、抑制和誘導)天然或合成的鮮味調味劑(例如谷氨酸單鈉(MSG))的鮮味的化合物或其生物上可接受的鹽。
本文“甜味調節(jié)劑”是指用于在受試對象中調節(jié)(包括增強或加強、抑制和誘導)天然或合成的甜味調味劑(例如果糖)的甜味的化合物或其生物上可接受的鹽。
本文“味道增強量”是指足以增強天然或合成的調味劑的味道的化合物的量，所述調味劑例如用于調節(jié)鮮味的谷氨酸單鈉(MSG)和用于調節(jié)甜味的果糖。
“濕湯類”意為濕/液體湯，包括冷凍的湯，而不管其濃度和容器。為此目的而定義的湯意為從肉、禽、魚、蔬菜、谷物、水果和其它成分制備的食物，其在在包括可見的一些或全部的這些成分的片塊的液體中烹調而成。所述的食物可能是清的(如清湯)或濃的(如雜膾)、滑的、漿狀的或含有大塊的、即用的、半壓縮的或壓縮的，并可能在供應時是熱的或冷的，作為一頓飯中的第一道菜或作為主菜或作為餐間快餐(如飲料那樣吸允)?？梢詫米髦苽淦渌攀辰M分的成分，并且其范圍可以從清湯(清燉湯)到沙司(基于奶油或乳酪的湯)。
“脫水的烹調用食物類”意為(i)烹飪佐料產(chǎn)品，例如粉末、顆粒、糊狀物、濃縮液體產(chǎn)品(包括壓縮方塊、片狀或粉末或顆粒形式的濃縮肉湯、肉湯和肉湯類產(chǎn)品)，它們可以作為最終產(chǎn)品或作為產(chǎn)品中的成分、沙司和食譜混合物(與技術無關)而單獨銷售；(ii)膳食溶液產(chǎn)品例如脫水和凍干的湯(包括脫水的湯的混合物)、脫水的速溶湯、脫水的即煮湯、現(xiàn)成菜、一頓飯和單份主食(包括面食、土豆和米飯等主菜)的脫水或常規(guī)環(huán)境食物制品；(iii)膳食調味產(chǎn)品例如調味品、腌泡汁、色拉調料、色拉澆頭、浸液、面包屑、奶油面糊混合物、耐貯存的涂抹物、燒烤沙司、液體食譜混合物、濃縮物、沙司或沙司混合物(包括用于色拉的食譜混合物)，不管是脫水的、液體的或冷凍的，它們可以作為最終產(chǎn)品或作為產(chǎn)品中的成分銷售。
“飲料類”指飲料、飲料混合物和濃縮物，包括但不限于酒精和非酒精，即飲的和干粉的。其中加入本發(fā)明化合物的食物和飲料的其它例子通過舉例的方式包括碳酸和非碳酸飲料，例如蘇打水、果汁、酒精和非酒精飲料；甜食產(chǎn)品，例如蛋糕、餅干、餡餅、糖果、口香糖、果凍、冰淇淋、冰糕、布丁、果醬、果凍、色拉調料和其它調味品、谷類食物和其它早餐食物、罐頭水果和水果沙司等。
另外，可以將主題化合物用在意欲加到食物和飲料中的調料制品中。在一個優(yōu)選的例子中，組合物將包含諸如甜味調味劑等另外調料或味道調節(jié)劑。
在一些例子中，可以使用主題化合物的生物上可接受的鹽。所述鹽的例子包括堿金屬鹽和堿土金屬鹽、有機鹽等。具體例子包括鉀、鈉、鈣和鎂的鹽，鹽酸鹽或硫酸鹽，乙醇胺鹽等。所選擇的鹽對于攝食要具有生物安全性，并對所述化合物的甜味調節(jié)特性具有不良影響。
作為本文使用的術語“藥用產(chǎn)品”包括固體和液體的可攝入的無毒物質，該物質具有藥用價值，例如咳嗽糖漿、咳嗽滴劑、阿司匹林和可嚼的藥用片劑?？诜男l(wèi)生產(chǎn)品包括諸如牙膏和嗽口水等固體和液體。
“可食用或藥學上可接受的載體或賦形劑”是用以制備本發(fā)明化合物的所需劑型的介質?？墒秤没蛩帉W上可接受的載體包括溶劑、稀釋劑或其它液體載體；分散或懸浮助劑；表面活性劑；等滲劑；增稠或乳化劑；防腐劑；固體粘合劑和潤滑劑等。
T1R基因或蛋白的“抑制劑”、“激活劑”、“增強劑”和“調節(jié)劑”是指使用味覺轉導的體外和體內(nèi)測定而鑒定的抑制、激活、增強或調節(jié)分子，例如配體、激動劑、拮抗劑和它們的同源物和模擬物。
抑制劑是例如結合、部分地或全部地阻斷刺激，減弱、防止、延遲激活，鈍化、脫敏或下調味覺轉導的化合物，例如拮抗劑。激活劑和增強劑是結合、增強、刺激、提高、開啟、激活、促進、增強激活、敏化或上調味覺轉導的化合物，例如激動劑。調節(jié)劑包括例如改變受體與以下物質的相互相作用的化合物，所述物質為結合激活劑或抑制劑的胞外蛋白(ebnerin和疏水載體家族的其它成員)；G蛋白；激酶(例如視紫紅質激酶和參與受體的脫激活和脫敏化的β腎上腺素能受體激酶的同源物)；以及也能使受體脫激活和脫敏化的抑制蛋白。調節(jié)劑可以包括T1R家族成員的遺傳修飾形式(例如改變活性)，以及天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動劑、化學小分子等。所述針對抑制劑和激活劑的測定包括例如在細胞或細胞膜中表達T1R家族成員，存在或不存在諸如甜味調味劑等調味劑時施用假定的調節(jié)劑化合物，然后如上所述測定對味覺轉導的功能性作用。將包含用潛在增強劑、激活劑、抑制劑或調節(jié)劑處理的T1R家族成員的樣品或待分析物與不用抑制劑、激活劑或調節(jié)劑處理的對照樣品進行比較，以測定調節(jié)程度。設定陽性對照樣品(例如沒有添加調節(jié)劑的甜味調味劑)的相對T1R活性值為100％。
“EC50”被定義為不管是作為激活劑、增強劑還是調節(jié)劑，引起化合物能夠引起的最大應答的50％的該化合物的量。在一個實施例中，測定化合物的劑量依賴性應答曲線，并由該曲線得到與最大應答的50％相對應的化合物濃度。
“IC50”被定義為作為抑制劑，引起化合物能夠引起的最大效果的50％的該化合物的量。
對于甜味調味劑和增強劑，在化合物被鑒定后，它們的活性的得分以最大果糖強度的百分比(％)給出。在化合物劑量應答中，可以計算EC50以反映該化合物作為甜味激動劑的潛能。在本發(fā)明中，低于約100mM的EC50指示化合物作為甜味激動劑誘導T1R2/T1R3的活性。優(yōu)選地，對于甜味激動劑，陽性樣品(hit)具有低于約1mM的EC50，更優(yōu)選低于約10μM的EC50。
在甜味增強的測定試驗中，測定果糖劑量應答，用同時在每一個果糖濃度的一定量的候選化合物來測定第二果糖劑量應答。然后，根據(jù)以下定義計算EC50比率EC50比率＝EC50(果糖)/EC50(果糖+[化合物])其中“[化合物]”是指用以引起(或增強或加強)果糖劑量應答的化合物的濃度。這些濃度可以從pM至mM，更優(yōu)選地，從低nM至μM來進行變化。有效的甜味增強劑在所使用的化合物的低濃度時具有高的EC50比率。
在本發(fā)明中，高于1的EC50比率指示化合物調節(jié)(加強)T1R2/T1R3的活性，并且該化合物是甜味增強劑。優(yōu)選地，陽性樣品具有的EC50比率值至少為1.20，優(yōu)選范圍為至少1.50～100，或者甚至更高。
相反地，競爭性激動劑(那些相互排斥性結合的甜味調味劑)或抑制劑總是產(chǎn)生低于1(例如0～1)的EC50比率。
對于鮮味調味劑和增強劑，它們的活性的得分以最大MSG強度的百分比(％)給出。在化合物劑量應答中，可以計算EC50以反映化合物作為鮮味激動劑的潛能。在本發(fā)明中，低于約10mM的EC50指示化合物誘導T1R1/T1R3的活性，并且是鮮味激動劑。優(yōu)選地，對于鮮味激動劑，陽性樣品具有低于約1mM的EC50值，更優(yōu)選范圍為約pM到約低μM。
在增強測定試驗中，測定MSG劑量應答，同時用同時在每一個MSG濃度的一定量的候選化合物來測定第二MSG劑量應答。然后，根據(jù)以下定義計算EC50比率EC50比率＝EC50(MSG)/EC50(MSG+[化合物])其中“[化合物]”是指用以引起(或增強或加強)MSG劑量應答的化合物的濃度。這些濃度可以從pM至mM，更優(yōu)選地，從低nM到μM來進行變化。有效的鮮味增強劑在所使用的化合物的低濃度時具有高的EC50比率。
在本發(fā)明中，大于1的EC50比率指示化合物調節(jié)(加強)T1R1/T1R3的活性，并且該化合物是鮮味增強劑。優(yōu)選地，陽性樣品的EC50比率值至少為1.20，優(yōu)選范圍為至少1.50～100，或者甚至更高。
設定陰性對照樣品(例如沒有加入味覺刺激物的緩沖液)的相對T1R活性值為0％。當陽性對照樣品和調節(jié)劑的混合物導致T1R活性相對于陽性對照為約80％，或者為50％或25％～0％時，取得對T1R的抑制。當T1R活性值比陽性對照樣品高出10％、25％、50％、75％、或者100％、或者150％、或者200％～500％或者1000％～3000％時，單獨的調節(jié)劑取得對T1R的激活。
在本文中使用的術語“純化的”、“基本上純化的”和“分離的”是指不含有其它不同的化合物的狀態(tài)，所述不同的化合物為本發(fā)明的化合物通常在天然狀態(tài)與之伴隨的化合物，因此“純化的”、“基本上純化的”和“分離的”的對象包含給定樣品的量的至少0.5重量％、1重量％、5重量％、10重量％或20重量％，并且最優(yōu)選為至少50重量％或75重量％。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些術語是指至少包含給定樣品的量的至少95重量％的本發(fā)明化合物。如本文所使用的那樣，當所指的是核酸或蛋白時，術語“純化的”、“基本上純化的”和“分離的”還指不同于其在哺乳動物尤其是人類體內(nèi)天然存在狀態(tài)的純化或濃縮狀態(tài)。高于在哺乳動物尤其是人類體內(nèi)天然存在狀態(tài)的任意純化或濃縮程度均在“分離的”的意思之內(nèi)，所述純化或濃縮程度包括(1)從其它有關結構或化合物中進行的純化(2)與結構或化合物所具有的關聯(lián)，所述關聯(lián)不是在哺乳動物尤其是人體中的正常關聯(lián)。在本文中描述的核酸或蛋白或各種類別的核酸或蛋白可以根據(jù)本領域技術人員已知的各種方法和過程進行分離，或者與它們的天然不是正常關聯(lián)的結構或化合物進行聯(lián)合。
術語“核酸”或“核酸序列”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡聚核苷酸。該術語包括含有已知的天然核苷酸的同源物的核酸(即寡聚核苷酸)。該術語還包括具有合成主鏈的類似核酸的結構(見例如Oligonucleotides and Analogues，a Practical Approach，F(xiàn).Eckstein編輯，Oxford Univ.Press(1991)；Antisense Strategies，Annals of theN.Y.Academy of Sciences，第600卷，Baserga等編輯(NYAS 1992)；Milligan J.Med.Chem.361923-1937(1993)；Antisense Research andApplications(1993，CRC Press)，WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197(1997)；Strauss-Soukup，Biochemistry368692-8698(1997)；Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，6153-156(1996))。
除非另有說明，特定的核酸序列還隱含地包括其經(jīng)保守性修飾的變體(例如簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確說明的序列。具體地，可以通過產(chǎn)生例如其中一個或多個所選擇的密碼子的第三位被混合的堿基和/或三磷酸脫氧肌苷殘基置換的序列而獲得的簡并密碼子置換(Batzer等，Nucleic Acid Res.，195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.，2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes，891-98(1994))。術語核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡聚核苷酸和多核苷酸互換使用。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中是互換使用的，其是指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于一個或多個氨基酸殘基為相應的天然存在的氨基酸的人造化學模擬物的氨基酸聚合物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
術語“質膜移位結構域”或僅僅為“移位結構域”意為這樣的多肽結構域，當將其加入到多肽編碼序列中時，與沒有所述多肽結構域相比，能夠更高效地將雜合(“融合”)蛋白“伴隨”或“移位”到細胞的質膜。例如，“移位結構域”可以來自牛的視紫紅質受體多肽，該多肽為具有7次跨膜的受體。然而，如同其它移位促進序列一樣，也可以使用來自其它哺乳動物的視紫紅質。因此，移位結構域在將7次跨膜融合蛋白移位到質膜是特別有效的，并且包含氨基末端的移位結構域的蛋白(例如味覺受體多肽)比沒有所述移位結構域的蛋白能夠更有效地轉移到質膜上。但是，如果該多肽的N-末端區(qū)域例如與本發(fā)明的T1R受體具有結合活性，則優(yōu)選使用其它移位結構域。例如，可以使用如本文描述的PDZ結構域互相作用肽。
本文描述的“移位結構域”、“配體結合結構域”以及嵌合受體組合物還可以包括結構和活性基本上與作為例證的序列相對應的“類似物”、“保守性變體”和“模擬物”(“肽模擬物”)。因此，術語“保守性變體”、“類似物”或“模擬物”是指具有修飾的氨基酸序列的多肽，由此如本文所定義的，所述變化沒有使該多肽的(保守性變體的)結構和/或活性產(chǎn)生根本性改變。這些包括氨基酸序列的保守性修飾變體，即對于蛋白活性來說并不關鍵的那些殘基的置換、添加或缺失，或者用具有類似特性(例如酸性、堿性、帶正電的或帶負電的，極性的或非極性等)的殘基所進行的氨基酸置換，使得甚至是關鍵的氨基酸的置換也并不根本改變結構和/或活性。
更具體地，“保守性修飾變體”適用于氨基酸和核酸的序列。對于特定的核酸序列，保守性修飾變體是指編碼相同或實質上相同的氨基酸序列的核酸序列，或者當核酸不編碼氨基酸序列時，指實質上相同的序列。由于遺傳密碼子的簡并性，大量功能性相同的核酸編碼任意給定的蛋白。
例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子確定丙氨酸時的每一個位置，可以將該密碼子改變?yōu)槿魏我粋€所述的相應密碼子而不改變所編碼的多肽。
所述核酸變體是“沉默變異”，這是一類保守性修飾的變異。本文編碼多肽的每一條核酸序列也描述了該核酸的每一個可能的沉默變異。本領域技術人員應該認識到，可以對核酸中的各密碼子(除了一般是甲硫氨酸的唯一密碼子的AUG和一般是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外)進行修飾，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變異隱含在各所述的序列中。
提供功能類似的氨基酸的保守性置換表在本領域中是已知的。例如，一個選擇保守性置換的示例性準則包括(在原始的殘基之后為示例性置換)ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。選擇性的示例性準則使用以下6組，各組包含相互間保守性置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(I)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(還見例如Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of ProteinStructure，Springer-Vrlag(1979))。本領域技術人員應該理解，上述確定的置換并不是唯一可能的保守性置換。例如，為某些目的，不管氨基酸是帶正電的還是帶負電的，可以認為所有帶電的氨基酸均是相互間的保守性置換。另外，在編碼序列中改變、增加或缺失單個氨基酸或低百分比的氨基酸的置換、缺失或添加也可以被認為是“保守性修飾變異”。
術語“模擬物”和“肽模擬物”是指具有基本相同的多肽(例如本發(fā)明的移位結構域、配體結合結構域或嵌合受體)結構和/或功能特征的合成化學化合物。所述模擬物可以全部由氨基酸的合成的非天然類似物組成，或可以是部分天然肽氨基酸和氨基酸的部分非天然類似物的嵌合分子。該模擬物還可以混有任意量的天然氨基酸保守性置換，條件是所述置換沒有實質性改變該模擬物的結構和/或功能。
對于本發(fā)明中作為保守變體的多肽，可以用常規(guī)實驗來確定模擬物是否處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，即其結構和/或功能沒有發(fā)生實質性改變。多肽模擬物組合物可以包含非天然結構組分的任意組合，所述多肽組合物通常來自3個結構基團a)除了天然酰胺鍵(“肽鍵”)連接之外的殘基連接基團；b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基；或c)引起二級結構模擬的殘基，即誘導二級結構或使二級結構穩(wěn)定，所述二級結構例如β轉角、γ轉角、β片層和α螺旋構象等。當通過化學手段而不是天然肽鍵來連接多肽的全部或某些殘基時，可以將該多肽表征為模擬物。單個肽模擬物的殘基可以由肽鍵、其它化學鍵或偶聯(lián)手段連接，例如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能的馬來酰亞胺、N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)?？梢源?zhèn)鹘y(tǒng)酰胺鍵(“肽鍵”)連接的連接基團包括例如酮基亞甲基(例如用于-C(＝O)-NH-的-C(＝O)-CH2-)、氨基亞甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烴(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四氮唑(CN4)、噻唑、retroamide或酯(見例如Spatola，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，267-357頁，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY(1983))。多肽還可以由于其含有代替天然存在的氨基酸殘基的全部或一些非天然殘基的而被表征為模擬物；在科學或專利文獻中詳細描述了非天然的殘基。
“標記”或“可檢測部分”是通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段可檢測的組合物。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(例如在ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、制成可檢測形式的(例如通過將放射性標記混入肽)半抗原和蛋白、或用來檢測與肽特異性反應的抗體的半抗原和蛋白。
“標記的核酸探針或寡聚核苷酸”是通過接頭或化學鍵共價結合或通過離子鍵、范德華力、靜電或氫鍵非共價結合到標記上的核酸探針或寡聚核苷酸，由此可以通過檢測結合到探針上的標記的存在來檢測探針的存在。
本文使用的術語“核酸探針或寡聚核苷酸”被定義為通過一種或多種類型的化學鍵(通常通過一般由氫鍵形成的互補堿基配對)能夠與互補序列的目標核酸相結合的核酸。如本文使用的那樣，探針可以包括天然堿基(即A、G、C或T)或修飾的堿基(7-脫氮鳥嘌呤核苷、肌苷等)。另外，只要不影響雜交，探針中的堿基可以由磷酸二酯鍵之外的鍵來連接。因此，例如，探針可以是組成性堿基由磷酸二酯鍵之外的肽鍵來連接的肽核酸。本領域技術人員應該理解，探針可以與缺乏與該探針的完整互補性的目標序列相結合，這取決于雜交條件的嚴格性。選擇性地，例如用同位素、生色團、發(fā)光團、色原等直接標記探針，或者選擇性地，用諸如生物素等間接地標記探針，所述生物素可以后來與鏈霉抗生物素蛋白結合。通過測定探針的存在或者不存在，可以檢測所選擇的序列或亞序列的存在或不存在。
當指核酸的一部分時使用的術語“異源”指示所述核酸包含兩個或兩個以上相互關系與天然的相互關系不相同的亞序列。例如，核酸通常是通過重組產(chǎn)生，具有來自不相關的基因的序列，該序列經(jīng)過排列以形成新的功能性核酸，例如一種來源的啟動子和另外一種來源的編碼區(qū)。類似地，異源蛋白指示該蛋白包含兩個或兩個以上相互關系不與天然的相互關系相同的亞序列(例如融合蛋白)。
“啟動子”被定義為指導核酸轉錄的一排核酸序列。如本文所使用的那樣，啟動子包括位于轉錄起始位點附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II類型的啟動子情況中的TATA元件。選擇性地，啟動子還包括遠端的增強子或抑制子元件，該元件可以位于離轉錄起始位點多達幾千個堿基對的位置?！敖M成型”啟動子是在絕大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下具有活性的啟動子。
“誘導型”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調節(jié)下具有活性的啟動子。術語“可操作連接”是指在核酸表達控制序列(例如啟動子、轉錄因子結合位點的序列)和另一個序列之間的功能性連接，其中，所述表達控制序列指導與所述另一個序列相對應的核酸序列的轉錄。
如本文所用的那樣，“重組”指合成的或體外操作的多核苷酸(例如“重組的多核苷酸”)，指用重組多核苷酸在細胞中或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，或指由重組的多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白”)?！爸亟M手段”還包括將具有各種不同來源的編碼區(qū)或結構域或啟動子序列的核酸連入到表達盒或載體中以表達(例如誘導型或組成型表達)包含本發(fā)明的移位結構域和用本發(fā)明的引物擴增的核酸序列的融合蛋白。
如本文所用的那樣，“穩(wěn)定細胞系”是指穩(wěn)定地(即在很長的時間內(nèi))表達異源核酸序列(即T1R或G蛋白)的細胞系。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述穩(wěn)定細胞系由下述方法產(chǎn)生，所述方法為用含有T1R表達構建體(即T1R1、T1R2和/或T1R3)的線性化載體對適宜的細胞進行轉染，所述適宜的細胞一般為哺乳動物細胞，例如HEK-293細胞。最優(yōu)選地，通過共轉染表達hT1R1和hT1R3或hT1R2和hT1R3的兩個線性化質粒和適當?shù)倪x擇程序以產(chǎn)生其中穩(wěn)定整合有這些基因的細胞系而獲得所述的穩(wěn)定細胞系。最優(yōu)選地，該細胞系還穩(wěn)定表達諸如Gα15等G蛋白。
短語“選擇性(特異性)雜交”是指當復合混合物(例如全細胞DNA或文庫DNA或RNA)中存在特定核酸序列時，在嚴格雜交條件下，分子只與所述特定核酸序列結合、雙聯(lián)或雜交。
短語“嚴格雜交條件”是指在該條件下探針與其目標亞序列雜交，但不與其它序列雜交，所述雜交通常在核酸的復合混合物中進行。嚴格條件取決于序列并因環(huán)境的不同而不同。較長的序列在較高的溫度特異性雜交。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays”(1993)中可以找到核酸雜交的詳盡指南。通常，對于在一定的離子強度、pH下的特定序列，選擇的嚴格條件比熱解鏈點(Tm)約低5℃～10℃。Tm是平衡時(因為存在的目標序列過量，在Tm，平衡時50％的探針被占據(jù))50％的與目標序列互補的探針與目標序列雜交的溫度(一定的離子強度、pH和核酸濃度)。嚴格條件是以下條件其中在pH7.0～8.3，鹽濃度為低于約1.0M的鈉離子，通常鈉離子(或其它鹽)濃度約為0.01M～1.0M，并且對于短探針(例如10～50個核苷酸)，所述溫度至少為約30℃，而對于長探針(例如多于50個核苷酸)，所述溫度至少為約60℃。嚴格條件還可以通過添加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少為背景的2倍，選擇性地，為背景雜交的10倍。示例性的嚴格的雜交條件可如下50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS、并在42℃溫浴，或者，5×SSC、1％的SDS，并在65℃溫浴，在65℃于0.2×SSC和0.1％的SDS中洗滌。所述雜交和洗滌步驟例如可進行1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘或更長的時間。
如果核酸編碼的多肽是實質上相關的，那么在嚴格條件下不相互雜交的核酸還是實質上相關的。例如，當采用遺傳密碼子所允許具有的最大密碼子簡并性來生成核酸拷貝時，上述情況就會發(fā)生。在這種情況中，所述核酸通常在中等嚴格雜交條件下進行雜交。示例性的“中等嚴格雜交條件”包括在37℃于40％的甲酰胺、1M的NaCl、1％的SDS的緩沖液中進行的雜交，并在45℃于1×SSC中進行洗滌。所述雜交和洗滌步驟可進行例如1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘或更長的時間。陽性雜交至少為背景的2倍。本領域技術人員應該很容易認識到，可以利用選擇性的雜交和洗滌條件來提供嚴格程度類似的條件。
“抗體”是指特異結合和識別抗原的包含來源于免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)的多肽。普遍認為免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ的恒定區(qū)基因以及無數(shù)免疫球蛋白的可變區(qū)基因。輕鏈被歸類為κ或被歸類為λ。重鏈被歸類為γ、μ、α、δ或ε，因此依次將免疫球蛋白分別定義為以下類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性的免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體，每個四聚體包含兩對相同的多肽鏈，每對多肽鏈具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50kDa～70kDa)。每條鏈的N-末端確定主要負責抗原識別的約100～110或更多個氨基酸的可變區(qū)。所述“可變輕鏈”(VL)和“可變重鏈”(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。
“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分經(jīng)過改變、替換或交換，使得抗原結合位點(可變區(qū))連接到不同的或經(jīng)改變的類型、效應子功能和/或物種的恒定區(qū)，或者連接到賦予所述嵌合抗體新的特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)；或(b)用具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)來改變、替換或交換可變區(qū)或其部分。
“抗T1R”抗體是特異結合由T1R基因、cDNA或其亞序列編碼的多肽的抗體或抗體片段。
術語“免疫測定”是使用抗體來特異性結合抗原的測定。所述免疫測定的特征是，利用特定抗體的特異結合性質來分離、定位和/或定量抗原。
當指分子或組合物時，短語“特異性(選擇性)結合”或“特異性(選擇性)反應”，是指決定該分子在異源群體的其它生物物質中的存在的結合反應。因此，在指定的條件下，特異分子結合到特定受體(至少是背景的兩倍)，并且實質上并沒有大量地結合到樣品中存在的其它分子上。在所述條件下與受體的特異結合可能需要根據(jù)對特定分子的特異性所選擇的受體。
對于抗體，可以采用各種免疫測定形式來選擇與特定蛋白具有特異免疫反應性的抗體。例如，常規(guī)上采用固相ELISA免疫測定來選擇與蛋白具有特異免疫反應性的抗體(見例如Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，(1988)，描述能夠用來測定特異免疫反應性的免疫測定形式和條件)。典型地，特異性或選擇性反應至少是背景信號或噪音的2倍，更典型地，超過背景的10倍～100倍。
短語“選擇性結合”是指核酸與以上所確定的另一個核酸“選擇性雜交”的能力，或者抗體與以上所確定的另一個蛋白選擇性(或特異性)結合的能力。
術語“表達載體”是指在包括原核細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞等在內(nèi)的任意細胞中，為體外或體內(nèi)表達(組成型表達或誘導型表達)本發(fā)明的核酸序列目的而采用的任意重組表達系統(tǒng)。該術語包括線性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術語包括保持附加型的表達系統(tǒng)或整合到宿主細胞基因組中的表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)具有自我復制的能力或不具有自我復制的能力，所述不具有自我復制的能力指的是即只在細胞中驅動瞬時表達。該術語包括只包含重組核酸的轉錄所需要的最少元件的重組表達“盒”。
“宿主細胞”是指包含表達載體并支持該表達載體復制或表達的細胞。宿主細胞可以是諸如大腸桿菌(E.coli)等原核細胞，或者是諸如酵母、昆蟲、兩棲動物、蠕蟲或哺乳動物細胞(例如CHO、海拉細胞、HEK-293等)等真核細胞等，例如培養(yǎng)細胞、外植體和體內(nèi)細胞。
化合物如上所述，T1R受體上具有不同的結構域。T1R1、T1R2和T1R3各包含N-末端胞外域(也稱為維納斯捕蠅結構域)，包含7個跨膜區(qū)和相應的胞質和胞外環(huán)的跨膜結構域；富含半胱氨酸結構域和C-末端結構域。各區(qū)域確定了特異結合到該區(qū)域的一組特異化合物。
在人類中，N-末端胞外域包含hT1R2的氨基酸1～560和hT1R3的氨基酸1～563。在大鼠中，N-末端胞外域包含rT1R2的氨基酸1～564和rT1R3的氨基酸1～568。
在人類中，C-末端跨膜結構域和胞內(nèi)域包含hT1R2的氨基酸561～839和hT1R3的氨基酸564～852。在大鼠中，C-末端跨膜結構域和胞內(nèi)域包含rT1R2的氨基酸565～842和rT1R3的氨基酸569～858。
代謝型谷氨酸受體(mGluR)是對谷氨酸產(chǎn)生應答的另一類型的C類G蛋白偶聯(lián)受體。這些受體主要發(fā)現(xiàn)于腦和神經(jīng)元組織，它們在腦和神經(jīng)元組織的神經(jīng)元信號轉導中發(fā)揮作用。mGluR的N-末端胞外域可以與T1R共價結合以形成嵌合受體。mGluR受體可以例如是mGluR1～mGluR8中的任意一種。不同的配體結合到鮮味受體和甜味受體的不同亞基上的不同結構域。例如，天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜結合到T1R2的N-末端胞外域，而環(huán)己基氨基磺酸鹽、新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC)和lactisole則結合到T1R3的跨膜結構域。由于T1R3是T1R1/T1R3鮮味受體中的兩個亞基之一，環(huán)己基氨基磺酸鹽、NHDC和lactisole也可以與T1R1/T1R3鮮味受體中的T1R3相互作用。環(huán)己基氨基磺酸鹽和NHDC促進鮮味受體的活性，而lactisole則抑制鮮味受體。
當涉及到鮮味調味劑時，本發(fā)明的特異性結合化合物包括酰胺。酰胺化合物還包括某些亞類的酰胺衍生物或各類與酰胺有關的衍生物，例如脲、氨基甲酸酯、草酰胺、丙烯酰胺等。
與T1R2的跨膜結構域相互作用的分子例如可以是甜味的調節(jié)劑，而與T1R3的跨膜結構域相互作用的分子可以是甜味和/或鮮味的調節(jié)劑。
人類T1R2/T1R3識別不被大鼠T1R2/T1R3識別的一組甜味劑，但是人類的T1R2/T1R3受到lactisole的抑制，而大鼠的T1R2/T1R3不受lactisole的抑制。當人類T1R2的胞外域被其大鼠的對應物所代替時，人類受體失去識別天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的能力，表明人類T1R2的這一部分對于結合天冬氨酰苯丙氨酸甲酯是必要的。相反地，當大鼠T1R2的胞外域被其人類的對應物所代替時，大鼠受體獲得了識別天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的能力，表明人類T1R2的這一部分足以結合天冬氨酰苯丙氨酸甲酯。采用相同的原理，人類T1R3的跨膜結構域是必要和充分的。
表6顯示用以代表各種大鼠/人類嵌合受體和受體亞基的縮寫。
表6


本文公開了特異性結合到包含hT1R2/hT1R3(而不是rT1R2/rT1R3)的T1R2/T1R3受體上的非天然存在的化合物。所述化合物的例子包括但不限于紐甜、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、環(huán)己基氨基磺酸鹽、lactisole、化合物883360、化合物6542888、化合物403249、化合物6364395、二羥基苯甲酸(DHB)、化合物6542888和新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC)。可以在表1～4中找到其它例子。非肽的有機化合物的大小可約為維度為15×8×8埃3的長方形結構，更優(yōu)選地，維度應該為12×5×5埃3。
本文還公開了特異性結合到包含hT1R2/rT1R3(但不是rT1R2/hT1R3)的T1R2/T1R3受體上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜?？梢栽诒?中找到其它的例子。
本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3受體的T1R2的N-末端胞外域上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于紐甜、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、碳水化合物糖(例如蔗糖、果糖、葡萄糖、塔格糖、赤蘚糖醇、山梨糖醇、麥芽糖、木糖醇、乳糖和半乳糖，以及所有其它碳水化合物糖)。可以在表5中找到其它的例子。
本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3和hT1R2/rT1R3受體的T1R2的維納斯捕蠅域(VFD)上的化合物。
本文還公開了特異性結合到T1R2/T1R3受體的T1R2亞基的N-末端維納斯捕蠅域(VFD)上的化合物。更具體地，本文還公開了特異性結合到人類T1R2/T1R3受體的T1R2亞基的N-末端維納斯捕蠅域的氨基酸殘基114和氨基酸殘基302上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、紐甜、碳水化合物，以及諸如D-Trp、Ala和Gly等甜味氨基酸。
本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3受體的T1R2的富含半胱氨酸區(qū)上的化合物。本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3受體的T1R2的跨膜結構域(TM)上的化合物。
本文還公開了特異性結合到包含rT1R2/hT1R3(但不是hT1R2/rT1R3)的T1R2/T1R3受體上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于環(huán)己基氨基磺酸鹽、NHDC、lactisole、化合物883360、化合物403249和化合物6364395?？梢栽诒?中找到其它的例子。
本文還公開了特異性結合hT1R2/hT1R3和rT1R2/r3-h3但不結合rT1R2/rT1R3或hT1R2/h3-r3的化合物。所述化合物的例子包括但不限于環(huán)己基氨基磺酸鹽、NHDC、lactisole、化合物883360、化合物403249和化合物6364395。
本文還公開了特異性結合到人類T1R2/T1R3受體的T1R3亞基的C-末端結構域的胞外環(huán)2和胞外環(huán)3上的化合物。本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3和r2-h2/rT1R3但不結合到rT1R2/rT1R3或h2-r2/hT1R3上的化合物。
本文還公開了特異性結合到人類T1R2/T1R3受體的T1R3亞基的N-末端胞外域上的化合物。本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3受體的T1R3的維納斯捕蠅域(VFD)上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、紐甜、碳水化合物，以及諸如D-Trp、Ala和Gly等甜味氨基酸。
本文還公開了特異性結合到hT1R2/hT1R3受體的T1R3的跨膜結構域的化合物。本文還公開了特異性結合到人類T1R2/T1R3的T1R3亞基的跨膜結構域的胞外環(huán)2和胞外環(huán)3上的化合物。所述化合物的例子包括但不限于環(huán)己基氨基磺酸鹽。
本發(fā)明的化合物不包括蔗糖、果糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇(isomalt)、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇，某些已知的天然萜類化合物、黃酮類化合物或蛋白甜味劑、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、鹵代糖、乙酰舒泛鉀、環(huán)己基氨基磺酸鹽、三氯蔗糖和天胺甜素。紐甜、紫蘇葶、SC-45647、SC-40014、應樂果甜蛋白、NC-002740-01、奇異果甜蛋白、CC-00100、NC-00420、天胺甜素、SC-44102、對乙氧基苯脲、NC-00576、甘草酸(slycyrrhizic Acid)、蛇菊苷、糖精鈉、D-色氨酸、環(huán)己基氨基磺酸鹽、DHB、乙醇酸、甘氨酸、D(-)果糖、高呋喃(homofuronol)、D(-)塔格糖、麥芽糖、D(+)葡萄糖、D-山梨糖醇、D(+)半乳糖、α-乳糖、L()果糖、L(+)化合物403249和葡萄糖。
選擇性地，本發(fā)明的化合物也不是化合物6364395。
本文還公開了結合T1R域的截斷區(qū)的化合物。例如，公開了特異性結合包含h2TM/h3TM的截斷的甜味受體的T1R2的TM域的化合物，特異性結合包含h2TM/h3TM的截斷的甜味受體的T1R3的TM域的化合物，特異性結合包含mGluR-h2/mGluR-h3的嵌合受體的T1R2的TM域的化合物，特異性結合包含mGluR-h2/mGluR-h3的嵌合受體的T1R3的TM域的化合物，結合包含h1TM/h3TM的截斷的風味受體的T1R1的TM域的化合物，結合包含h1TM/h3TM的截斷的甜味受體的T1R3的TM域的化合物，結合包含mGluR-h1/mGluR-h3的嵌合受體的T1R1的TM域的化合物，以及結合包含mGluR-h1/mGluR-h3的嵌合受體的T1R3的TM域的化合物。SEQ ID NO29～33代表所述截斷的受體。
本發(fā)明的化合物不包括谷氨酸單鈉(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)或鳥苷一磷酸(GMP)、蔗糖、果糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇，某些已知的天然萜類化合物、黃酮類化合物或蛋白甜味劑、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、鹵代糖、乙酰舒泛鉀、環(huán)己基氨基磺酸鹽、三氯蔗糖、天胺甜素、谷氨酸單鈉(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)或鳥苷一磷酸(GMP)或腺苷一磷酸。
化合物403249是(5-(4H-苯并[d][1，3]氧硫雜環(huán)己二烯-2-基)-2-甲氧基苯酚，而化合物6364395是3-(3-羥基-4-甲氧基苯乙基)苯并[d]異氧氮雜茂-4，6-二醇。
在用FLIPR儀器(熒光測定強度平板讀取器(Fluorometric IntensityPlate Reader，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)進行基于熒光的測定中，相對于果糖最大活性，上述化合物可以顯示出化合物依賴性熒光活性至少增加25％。例如，所述程序的例子見實施例12和實施例18。所述化合物顯出(demonstrate)在用FLIPR儀器(Molecular Devices)進行的基于熒光的測定中，甜味劑的EC50(EC50for a sweetener)以化合物依賴性方式降低至少2倍。而且，在基于細胞的測定中，所述化合物可導致用野生型或嵌合受體轉染的100個細胞中的至少10個顯示出化合物依賴性的熒光增強。在實施例24中可以找到基于細胞的測定的例子。所述化合物還顯示對亞最大水平(sub-maximal level)的甜味劑產(chǎn)生應答的熒光細胞數(shù)目以化合物依賴性方式增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2倍或者更高倍數(shù)，或者倍數(shù)為其間的任意數(shù)?？梢酝ㄟ^熒光、鈣水平、IP3水平、cAMP水平、GTPγS結合或報道基因活性(例如熒光素酶、β-半乳糖苷酶)來對應答進行測定。
此外，本文公開的化合物可以在細胞中具有一個或多個以下特征相對于對照，EC50至少約下降50％；胞內(nèi)鈣水平至少約上升25％；胞內(nèi)cAMP至少約上升25％；胞內(nèi)cGMP至少約上升25％；胞內(nèi)IP3至少約上升25％或GTPγS與G蛋白的結合至少約上升25％。
使用化合物的方法本發(fā)明還公開了調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的風味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或者其前體，并將食用或藥用產(chǎn)品或者其前體與至少風味調節(jié)量的本文公開的至少一種非天然存在的化合物或其食用上可接受的鹽進行組合，以形成經(jīng)改進的食用產(chǎn)品或藥用產(chǎn)品；據(jù)此調節(jié)食用產(chǎn)品或藥用產(chǎn)品的風味。
本發(fā)明還公開了抑制食用或藥用產(chǎn)品的風味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或者其前體，并將食用或藥用產(chǎn)品或者其前體與至少風味抑制量的本文公開的至少一種非天然存在的化合物或其食用上可接受的鹽進行組合，以形成經(jīng)改進的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此抑制食用或藥用產(chǎn)品的風味。
本發(fā)明還公開了增強食用或藥用產(chǎn)品的風味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或者其前體，并將食用或藥用產(chǎn)品或者其前體與至少風味增強量的本文公開的至少一種非天然存在的化合物或其食用上可接受的鹽進行組合，以形成經(jīng)改進的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此提高食用或藥用產(chǎn)品的風味。
本發(fā)明還公開了調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的甜味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或者其前體，并將食用或藥用產(chǎn)品或者其前體與至少甜味調節(jié)量的本文公開的至少一種非天然存在的化合物或其食用上可接受的鹽進行組合，以形成經(jīng)改進的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的甜味。
本發(fā)明還公開了抑制食用或藥用產(chǎn)品的甜味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或者其前體，并將食用或藥用產(chǎn)品或者其前體與至少甜味抑制量的本文公開的至少一種非天然存在的化合物或其食用上可接受的鹽進行組合，以形成經(jīng)改進的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此抑制食用或藥用產(chǎn)品的甜味。
本發(fā)明還公開了增強食用或藥用產(chǎn)品的甜味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或者其前體，并將食用或藥用產(chǎn)品或者其前體與至少甜味增強量的本文公開的至少一種非天然存在的化合物或其食用上可接受的鹽進行組合，以形成經(jīng)改進的食用產(chǎn)品或藥用產(chǎn)品；據(jù)此增強食用或藥用產(chǎn)品的甜味。
本發(fā)明還公開了增強鮮味感覺的方法，該方法包括用環(huán)己基氨基磺酸鹽和NHDC以及它們的衍生物接觸鮮味受體；以及公開了增強鮮味感覺的方法，該方法包括用lactisole衍生物接觸鮮味受體。本發(fā)明還公開了增強甜味感覺的方法，該方法包括用環(huán)己基氨基磺酸鹽和NHDC以及它們的衍生物接觸甜味受體；以及公開了增強甜味感覺的方法，該方法包括用lactisole衍生物接觸甜味受體。
T1R多肽的分離和表達可以如下所述對本發(fā)明的T1R或其片段或變體進行分離和表達。可以利用PCR引物來擴增編碼味覺受體配體結合區(qū)的核酸，并可選擇性地建立這些核酸的文庫。然后可以用個體表達載體或表達載體的文庫感染或轉染宿主細胞以用于這些核酸或文庫的功能性表達?？梢栽隗w外或體內(nèi)制備并表達這些基因或載體。本領域技術人員應該認識到，可以通過調節(jié)本發(fā)明載體內(nèi)的所述基因和核酸(例如啟動子、增強子等)的表達或活性，獲得用于改變和控制核酸表達的所需表型?？梢允褂糜糜谔岣呋蚪档捅磉_或活性的任意已知的所述方法。本發(fā)明可以結合在科學和專利文獻中進行充分描述的本領域已知的任意方法或程序來實施。
可以從各種來源(基因工程的、擴增的和/或重組表達的)分離本發(fā)明的核酸序列和用于實施本發(fā)明的其它核酸，所述核酸不論是RNA、cDNA、基因組DNA、載體、病毒或者它們的雜合體。除了哺乳動物細胞以外，還可以使用諸如細菌系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)、昆蟲系統(tǒng)或植物系統(tǒng)等任意的重組表達系統(tǒng)。
選擇性地，可以通過已知的體外化學合成技術來合成所述核酸，所述技術例如在Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444(1997)；Frenkel，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.19373-380(1995)；Blommers，Biochemistry 337886-7896(1994)；Narang，Meth.Enzymol.6890(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.221859(1981)；美國專利No.4,458,066中描述的技術。然后可以通過合成互補鏈并在適宜的條件下使所述鏈一起退火或者通過采用DNA聚合酶和適宜的引物序列來添加互補鏈而獲得雙鏈DNA片段。
在科學和專利文獻中詳細描述了對核酸進行操作的技術，所述技術例如在序列中引入突變、亞克隆、探針標記、測序和雜交等技術，見例如Sambrook編，Molecular Cloninga Laboratory manual(第二版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel編，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization WithNucleic Acid Probes，第I部分，Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen編，Elsevier，N.Y.(1993)。
可以通過本領域技術人員已知的任意的大量普通方法對核酸、載體、衣殼和多肽等進行分析和定量。所述方法包括諸如NMR、分光光度法、放射照相法、電泳法、毛細管電泳法、高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)和超擴散色譜法等分析生物化學方法，諸如流體或凝膠沉淀素反應法、免疫擴散法、免疫電泳法、放射性免疫測定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、免疫-熒光測定法等各種免疫學方法，Southern分析，Northern分析，點印跡分析，凝膠電泳法(例如SDS-PAGE)，RT-PCR，定量PCR，其它核酸或目標或信號擴增方法，放射性標記法，閃爍計數(shù)法和親和色譜法。
可以利用寡核苷酸引物來擴增編碼味覺受體配體結合區(qū)的核酸片段。還可以用擴增技術對本文所述的核酸進行克隆或定量測定。擴增方法也是本領域已知的技術，包括例如聚合酶鏈式反應(PCR)(PCRProtocols，a Guide to Methods and Applications，Innis編.Academic Press，N.Y.(1990)和PCR Strategies，Innis編，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995))；連接酶鏈式反應(LCR)(見例如Wu，Genomics 4560(1989)；Landegren，Science 2411077，(1988)；Barringer，Gene 89117(1990))；轉錄擴增(見例如，Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))；以及自動維持序列復制(見例如Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874(1990))；Q-β復制酶擴增(見例如Smith，J.Clin.Microbiol.351477-1491(1997))；自動Q-β復制酶擴增測定(見例如Burg，Mol.Cell.Probes 10257-271(1996))和其它RNA聚合酶介導的技術(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；還見Berger，Methods Enzymol.152307-316(1987)；Sambrook；Ausubel；美國專利No.4,683,195和No.4,683,202；Sooknanan，Biotechnology 13563-564(1995))?？梢詫⒁镌O計為保留“供體”7-膜受體的原始序列。選擇性地，引物可以編碼保守性置換(例如疏水殘基的疏水性，見以上討論)的氨基酸殘基或功能上的良性置換(例如不阻止質膜插入，不引起肽酶的剪切，不引起受體的異常折疊等)。一旦擴增，可以根據(jù)本領域已知方法克隆單獨的核酸或作為文庫的核酸，如果需要，可以采用常規(guī)的分子生物學方法將所述核酸克隆到任意的各種載體中；在例如美國專利No.5,426,039中描述了用于體外克隆經(jīng)擴增的核酸的方法。
可以設計引物對以選擇性地擴增T1R家族成員的配體結合區(qū)。對于不同的配體或調味劑，所述區(qū)域可以不同。因此，對于一種調味劑來說可能是最小結合區(qū)的區(qū)域對于另外一種調味劑來說可能太有限。因此，可以擴增包含不同胞外域結構的的不同大小的配體結合區(qū)。
在本領域中，設計簡并引物對的范例是已知的。例如，可以從http://blocks.fhcrc.org/codehop.html獲得共有-簡并雜交寡核苷酸引物(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer，CODEHOP)策略計算機程序，該程序與BlockMaker多序列比對站點直接鏈接，所述站點用于以一組相關蛋白序列(如已知味覺受體的配體結合區(qū))為起始來進行雜合引物預測(見例如Rose，Nucleic Acids Res.261628-1635(1998)；Singh，Biotechniques 24318-319(1998))。
在本領域中，合成寡核苷酸引物對的手段是已知的?！疤烊弧钡膲A基對或合成的堿基對都可以采用。例如，人造核苷酸堿基的應用提供了操縱引物序列的通用方法并產(chǎn)生更復雜的擴增產(chǎn)物混合物。各種家族的人造核苷酸堿基能夠通過內(nèi)鍵旋轉來呈現(xiàn)多氫成鍵取向而提供用于簡并分子識別的方法。在PCR引物的單位點中引入這些類似物可以允許產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的復合文庫，見例如Hoops，Nucleic Acids Res.254866-4871(1997)。非極性分子也可以用來模擬天然DNA堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵合形式模擬物可以針對胸腺嘧啶的非極性形式模擬物進行有效和選擇性復制(見例如Morales，Nat.Struct.Biol.5950-954(1998))。例如，兩個簡并堿基可以是嘧啶堿基6H，8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮或嘌呤堿基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(見例如Hill，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 954258-4263(1998))。本發(fā)明的示例性簡并引物中加入了核苷酸堿基類似物5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰-2’-脫氧-胞嘧啶核苷、3’-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(序列中的術語“P”見上文)。所述嘧啶類似物通過氫鍵與包括A和G殘基在內(nèi)的嘌呤配對。
可以采用上述的核酸探針分離與本文公開的味覺受體基本相同的多態(tài)性變體、等位基因和物種間同源物。選擇性地，可以通過檢測與抗血清或純化抗體產(chǎn)生免疫的經(jīng)表達的同源物，采用表達文庫來克隆T1R多肽及其多態(tài)性變體、等位基因和物種間同源物，所述抗血清或純化抗體通過抗T1R多肽而制得，其還可以識別并選擇性地結合T1R同源物。
可以采用簡并引物對，通過擴增(例如PCR)適宜的核酸序列，產(chǎn)生編碼味覺受體的配體結合區(qū)的核酸。經(jīng)擴增的核酸可以是來自任意細胞或組織的基因組DNA或者來自味覺受體表達細胞的mRNA或cDNA。
在一個實施方案中，可以構建雜合蛋白編碼序列，該雜合蛋白編碼序列包含編碼融合到移位序列的T1R的核酸。還提供了包含其它家族的化學感覺受體尤其是味覺受體的移位基序和調味劑結合結構域的雜合T1R?？梢詫⑺龊怂嵝蛄胁僮餍缘剡B接到轉錄或翻譯控制元件，所述元件例如轉錄和翻譯起始序列、啟動子和增強子、轉錄和翻譯終止子、多腺苷酸化序列和對將DNA轉錄為RNA有用的其它序列。在構建重組表達盒、載體和轉基因物中，可以采用啟動子片段指導所需核酸在所有所需細胞或組織中的表達。
在另外一個實施方案中，融合蛋白可以包括C-末端或N-末端的移位序列。此外，融合蛋白可以包含附加的元件(例如為了蛋白的檢測、純化或其它應用)。有利于檢測和純化的結構域包括例如金屬螯合肽(例如聚組氨酸序列、組氨酸-色氨酸模塊或者其它允許在固定的金屬上純化的區(qū)域)；麥芽糖結合蛋白；允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域；或在FLAGS展開/親和純化系統(tǒng)(Immunex Corp.，Seattle，WA)中應用的結構域。
在移位結構域(為有效地進行質膜表達)和其它新翻譯的多肽之間包括諸如因子Xa(見例如Ottavi，Biochimie 80289-293(1998))、枯草桿菌蛋白酶識別基序(見例如Polyak，Protein Eng.10615-619(1997))等可剪切的接頭序列，以及腸激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等，這對于促進純化可以是有用的。例如，一個構建體可以包括連接到6個組氨酸殘基的編碼多肽的核酸序列，在所述6個組氨酸殘基之后為硫氧還蛋白、腸激酶可剪切位點(見例如Williams，Biochemistry 341787-1797(1995))和C-末端移位結構域。組氨酸殘基促進檢測和純化，而腸激酶可剪切位點提供用于從融合蛋白的剩余物中純化所需蛋白的手段。在科學和專利文獻(見例如Kroll，DNA Cell.Biol.12441-453(1993))中充分描述了有關編碼融合蛋白的載體的技術和融合蛋白的應用。
可以通過各種常規(guī)技術，將包含配體結合結構域編碼序列的表達載體(不管是單獨的表達載體還是表達載體文庫)導入到基因組或細胞的細胞質或細胞核中并進行表達，在科學和專利文獻(見例如Roberts，Nature 328731(1987)；Berger(上文)；Schneider，Protein Expr.Purif.643510(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel)中詳細描述了所述的常規(guī)技術。來自生物試劑和實驗裝備制造商的產(chǎn)品信息也提供了有關已知生物學方法的信息。載體可以從天然來源中分離，從諸如ATCC或GenBank文庫等來源中獲得，或通過合成或重組方法制備。
可以采用在細胞中穩(wěn)定表達或瞬時表達的表達盒、載體或病毒(例如附加型表達系統(tǒng))來表達核酸?？梢栽诒磉_盒和載體中引入選擇標記而使轉化細胞和序列具有可選擇的表型。例如，選擇標記可以編碼為附加維持型和復制型，因此不需要整合到宿主的基因組中。例如，所述標記可以編碼抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、殺稻瘟素、潮霉素)或除草劑抗性(例如氯磺隆或Basta)，以允許對轉化有所需DNA序列的那些細胞進行選擇(見例如Blondelet-Rouault，Gene 190315-317(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281992-997(1997))。由于賦予抗諸如新霉素或潮霉素等底物的抗性的選擇性標記基因僅可用在組織培養(yǎng)中，因此在體外和體內(nèi)還可以將化學抗性基因用作選擇性標記。
嵌合的核酸序列可以編碼在任意的7次跨膜多肽中的T1R配體結合結構域。由于7次跨膜受體多肽具有相似的一級序列和二級和三級結構，所以通過序列分析可以容易地鑒定出結構域(例如胞外域、TM域、胞質域等)。例如，同源性模型化、傅立葉分析和螺旋周期檢測能夠鑒定和表征帶有7次跨膜受體序列的7個結構域?？焖俑盗⑷~轉換(Fast FourierTransform，F(xiàn)FT)算法可以用來估定表征所分析序列的疏水性和變化性的概況的主要周期。周期性檢測增強和α螺旋周期性指數(shù)可以根據(jù)例如Donnelly(Protein Sci.255-70(1993))的方法進行。其它的比對和模型化算法在本領域內(nèi)是已知的，見例如Peitsch，Receptors Channels 4161-164(1996)；Kyte和Doolittle，J.Med.Bio.，157105-132(1982)；Cronet，ProteinEng.659-64(1993)。
本發(fā)明還不僅包括具有指定核酸序列和氨基酸序列的DNA和蛋白，而且還包括DNA片段尤其是例如40、60、80、100、150、200或250個或者更多個核苷酸的片段以及例如10、20、30、50、70、100或150個或者更多個氨基酸的蛋白片段。選擇性地，核酸片段可以編碼抗原性多肽，該抗原性多肽能夠結合抗T1R家族成員而制得的抗體。此外，本發(fā)明的蛋白片段可以選擇性地為抗原性多肽，該抗原多肽能夠結合抗T1R家族成員而制得的抗體。
本發(fā)明還考慮包含嵌合蛋白，該嵌合蛋白包含至少一條本文所述的T1R多肽之一的至少10、20、30、50、70、100或150或者更多個氨基酸，該氨基酸與代表所有的或部分的另一種GPCR的附加氨基酸相偶聯(lián)，所述GPCR優(yōu)選為7次跨膜超家族的成員。這些嵌合體可以從本發(fā)明的受體或另外的GPCR制備，或者它們可以通過結合2個或2個以上本發(fā)明T1R受體而制得。在一個實施方案中，嵌合受體的一部分對應于或來自于本發(fā)明的T1R多肽的胞外域。在另外一個實施方案中，嵌合體的一部分對應于或來自于本文所述的T1R多肽的胞外域和一個或多個跨膜結構域，而剩余的一個部分或多個部分可以來自于另外的GPCR。在本領域中，嵌合受體是已知的，并且嵌合受體的產(chǎn)生技術以及用于整合到其中的G蛋白偶聯(lián)受體的結構域或片段的選擇和其邊界(boundaries)也是已知的。因此，采用本領域技術人員的這些知識可以容易地產(chǎn)生所述的嵌合受體。使用所述的嵌合受體可以提供例如本文具體公開的受體之一的味覺選擇性特征，該特征與另外受體(例如在現(xiàn)有技術測定系統(tǒng)中所使用的熟知受體)的信號轉導特征偶聯(lián)。
如以上所述，類似于天然的T1R受體的所述嵌合體或與天然的T1R受體組合或聯(lián)合的所述嵌合體將與通常影響甜味或鮮味的分子相結合和/或被這些分子激活。功能性的嵌合T1R受體或受體組合是當單獨表達或與其它T1R或其它GPCR(它們本身也可能是嵌合的)結合表達時結合到味覺刺激物尤其是甜味刺激物(T1R2/3)或鮮味刺激物(T1R1/3)上或被所述刺激物激活的分子。引起甜味的分子包括諸如蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、木糖醇、環(huán)己基氨基磺酸鹽等天然和人造甜味劑，引起鮮味的分子包括谷氨酸和谷氨酸類似物和諸如5’-核苷酸等結合到天然的T1R1和/或T1R3的其它化合物。
例如，諸如配體結合結構域、胞外域、跨膜區(qū)、跨膜結構域、胞質域、N-末端結構域、C-末端結構域等結構域或它們的任意組合可以共價連接到異源蛋白上。例如，T1R胞外域可以連接到異源GPCR跨膜結構域，或異源GPCR胞外域可以連接到T1R跨膜結構域?？梢允褂闷渌x擇的異源蛋白，例如綠色熒光蛋白。
處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)的還有用于表達本發(fā)明的T1R、片段、嵌合體或變體的宿主細胞。為了獲得克隆的基因或核酸(例如編碼本發(fā)明的T1R、片段或變體的cDNA)的高水平表達，本領域技術人員通常將所述感興趣的核酸序列亞克隆到表達載體中，所述表達載體包含指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子，如果所述核酸是編碼蛋白的核酸，所述表達載體包含用于翻譯起始的核糖體結合位點。適當?shù)募毦鷨幼邮潜绢I域已知的(例如Sambrook等描述)。但是，也可以使用細菌或真核表達系統(tǒng)。
用于將外源核苷酸序列導入宿主細胞中的任意熟知程序都可以使用。所述程序包括使用磷酸鈣轉染、多聚季銨鹽、原生質體融合、電穿孔、脂質體、微注射、原生質載體、病毒載體和其它任意的用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質導入宿主細胞中熟知方法(見例如Sambrook等)。只要所使用的特定遺傳工程程序能夠成功地將至少一個核酸分子導入到能夠表達感興趣的T1R、片段或變體的宿主細胞中即可。
將表達載體導入到細胞中以后，在有利于感興趣的受體、片段或變體表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉染的細胞，然后采用標準技術從培養(yǎng)物中回收所述的受體、片段或變體。在本領域中，所述技術的例子是熟知的，見例如WO 00/06593，與該公開內(nèi)容一致的方式以參考方式引入。
T1R多肽的檢測除了采用核酸雜交技術檢測T1R基因和基因表達之外，還可以采用免疫測定來檢測T1R，例如鑒定味覺受體細胞和T1R家族成員的變體。免疫測定可以用來對T1R進行定性或定量分析。可以在Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)中找到可應用的技術的概述。
1.T1R家族成員的抗體產(chǎn)生與T1R家族成員發(fā)生特異性反應的多克隆和單克隆抗體的方法對于本領域技術人員來說是已知的(見例如Coligan，Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow和Lane(上文)；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第二版，1986)；和Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975))。所述技術包括通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫中選擇抗體而進行抗體制備，以及通過免疫兔或小鼠而制備多克隆和單克隆抗體(見例如Huse等，Science，2461275-1281(1989)；Ward等，Nature，341544-546(1989))。
很多包含T1R的免疫原可以用來產(chǎn)生與T1R家族成員發(fā)生特異性反應的抗體。例如，可以根據(jù)本文所述來分離重組的T1R多肽或其抗原性片段。適當?shù)目乖瓍^(qū)包括例如用以鑒定T1R家族成員的共有序列。如上所述，可以在真核細胞或原核細胞中表達重組蛋白，并一般按如上所述純化重組蛋白。重組蛋白是優(yōu)選用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體的免疫原。選擇性地，可以將來自本文公開的序列并與載體蛋白結合的合成肽用作免疫原。也可以使用純化或非純化形式的天然存在的蛋白。然后將產(chǎn)物注射到能夠產(chǎn)生抗體的動物中?？梢灾苽鋯慰寺】贵w或多克隆抗體，以備后續(xù)用于測定蛋白而進行的免疫測定中。
對于本領域技術人員來說，多克隆抗體的制備方法是已知的。例如，通過標準的佐劑(例如弗氏佐劑)和標準的免疫程序，采用所述蛋白對近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔進行免疫。通過驗血并測定對T1R的反應滴度來監(jiān)測動物對免疫原制備物的免疫應答。當獲得抗所述免疫原的抗體的適當高滴度時，從動物中收集血液并制備抗血清。如果需要，可以進一步分離所述抗血清組分，以富集與所述蛋白反應的抗體(見Harlow和Lane，上文)。
可以通過本領域技術人員熟悉的各種技術獲得單克隆抗體。簡而言之，可以使來自經(jīng)所需抗原免疫的動物的脾細胞無限增殖(一般通過與骨髓瘤細胞融合)(見Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976))?？蛇x擇的無限增殖的方法包括采用EB病毒、致癌基因或逆轉錄病毒進行轉化，或本領域熟知的其它方法。篩選來自無限增殖的單細胞的克隆，以制備對抗原具有所需特異性和親和性的抗體，并通過各種技術提高由所述細胞制備的單克隆抗體的產(chǎn)率，所述技術包括注射到脊椎動物宿主的腹膜腔中。選擇性地，根據(jù)由Huse等(Science，2461275-1281(1989))概述的常規(guī)程序，通過篩選來自人類B細胞的DNA文庫，可以分離編碼單克隆抗體或其結合性片段的DNA序列。
在免疫測定中，收集單克隆抗體和多克隆血清并用免疫原蛋白進行滴定，所述免疫測定例如用固定在固體支持物上的免疫原進行的固相免疫測定。通常，采用競爭性結合免疫測定，選擇具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并檢驗它們抗非T1R多肽或甚至是其它的T1R家族成員或來自其它生物體的其它相關蛋白的交叉反應性。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體通常結合的Kd至少約為0.1mM，更普遍至少約為1pM，選擇性地至少約為0.1pM或更佳，選擇性地為0.01pM或更佳。
一旦獲得T1R家族成員特異性抗體，可以采用各種免疫測定方法檢測單個的T1R蛋白和蛋白片段。對于免疫學程序和免疫測定程序的綜述，見Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991)。而且，可以在任意的數(shù)種組合中進行本發(fā)明的免疫測定，在EnzymeImmunoassay(Maggio編，1980)和Harlow和Lane的文獻(見上文)中有所述組合的全面綜述。
2.免疫結合測定可以采用大量公知的免疫結合測定中的任意測定對T1R蛋白、片段和變體進行檢測和/或定量(見例如美國專利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。對于常規(guī)免疫測定的綜述，也可見Methods in CellBiologyAntibodies in Cell Biology，第37卷(Asai編，1993)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991)。免疫學結合測定(或免疫測定)通常采用特異性結合所選擇的蛋白或抗原(在這種情況下，T1R家族成員或其抗原性亞序列)的抗體?？梢酝ㄟ^大量本領域技術人員公知手段和任意上述手段制備所述抗體(例如抗T1R)。
免疫測定還經(jīng)常采用標記劑來特異性結合并標記由抗體和抗原形成的復合物。所述標記劑本身可以是含有抗體/抗原復合物的組分之一。因此，所述標記劑可以是經(jīng)標記的T1R多肽或經(jīng)標記的抗T1R抗體。選擇性地，所述標記劑可以是第三組分，例如特異性結合到抗體/T1R復合物的第二抗體(第二抗體一般對獲得第一抗體的物種的抗體具有特異性)。也可以采用諸如蛋白A或蛋白G等能夠特異性結合免疫球蛋白恒定區(qū)的其它蛋白作為標記劑。這些蛋白表現(xiàn)出與來自各種物種的免疫球蛋白恒定區(qū)具有強的非免疫原反應性(見例如Kronval等，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.，1352589-2542(1985))?？梢杂媚軌蚺c另外的分子(例如鏈霉抗生物素蛋白)特異性結合的可檢測組分(諸如生物素)修飾標記劑。對于本領域技術人員來說，各種可檢測組分是公知的。
在整個測定過程中，各種試劑組合后，可能需要進行溫育和/或洗滌步驟。溫育步驟的時間可以為約5秒鐘至幾小時，選擇性地在約5分鐘至約24小時的范圍內(nèi)變化。但是，溫育時間將取決于測定形式、抗原、溶液體積和濃度等。盡管所述測定可以在一個溫度范圍內(nèi)(例如10℃～40℃)進行，但是一般在環(huán)境溫度進行所述測定。
A.非競爭性測定形式用于在樣品中檢測T1R多肽的免疫測定可以是競爭性也可以是非競爭性。非競爭性免疫測定是在測定中直接檢測抗原的量的測定。在一個優(yōu)選的“夾心式”測定中，例如，可以將抗T1R抗體直接結合到固體基質上，在其上該抗體被固定。然后所述經(jīng)固定的抗體捕獲存在于待測樣品中的T1R多肽。然后，如此固定的T1R多肽與標記劑(例如帶有標記的第二T1R抗體)結合。或者，第二抗體可以沒有標記，但它接下來可以被經(jīng)標記的第三抗體結合，所述經(jīng)標記的第三抗體對獲得第二抗體的物種的抗體具有特異性。第二或第三抗體一般用能夠與另外的分子(例如鏈霉抗生物素蛋白)特異性結合的可檢測組分(例如生物素)進行修飾，以提供可檢測組分。
B.競爭性測定形式在競爭性測定中，通過測定已知添加的(外源的)被樣品中存在的未知T1R多肽從抗T1R抗體上置換(競爭走)的T1R多肽的量來間接檢測樣品中存在的T1R多肽的量。在一個競爭性測定中，將已知量的T1R多肽添加到樣品中，然后使該樣品與特異性結合所述T1R的抗體接觸。結合到所述抗體的外源T1R多肽的量與樣品中存在的T1R多肽的濃度成反比。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述抗體被固定到固體基質上?？梢酝ㄟ^測定存在于T1R/抗體復合物中的T1R多肽的量或者通過測定剩下的未形成復合物的蛋白的量，測定結合到抗體上的T1R多肽的量。T1R多肽的量可以通過提供經(jīng)標記的T1R分子來進行檢測。
半抗原抑制測定是另外一種優(yōu)選的競爭性測定。在該測定中，已知的T1R多肽被固定到固體基質上。將已知量的抗T1R抗體添加到樣品中，然后使該樣品與固定的T1R接觸。結合到已知的固定的T1R多肽的抗T1R抗體的量與樣品中存在的T1R多肽的量成反比。同樣地，可以通過測定被固定的抗體部分或余留在溶液中的抗體部分來測定被固定的抗體的量。如上所述，當抗體被標記時，檢測可以是直接檢測；通過隨后添加特異性結合抗體的經(jīng)標記的組分時，檢測是間接檢測。
C.交叉反應性測定競爭性結合形式中的免疫測定可以用于交叉反應性測定。例如，可以將至少部分由本文公開的核酸序列編碼的蛋白固定到固體支持物上。向與所述經(jīng)固定的抗原競爭結合抗血清的待分析物中添加蛋白(例如T1R多肽和同源物)。比較所添加的蛋白與所述經(jīng)固定的蛋白競爭結合抗血清的能力和由本文公開的核酸序列編碼的T1R多肽與其本身競爭的能力。用標準的計算方法，計算上述蛋白的交叉反應性的百分比。選擇與上述列出的各添加蛋白的交叉反應性低于10％的那些抗血清并將其合并。用所添加的經(jīng)考慮(considered)的蛋白(例如相關性較低的同源物)通過免疫吸附從經(jīng)合并的抗血清中選擇性地除去交叉反應抗體。另外，可以將包含代表保守性基序的氨基酸序列的肽用于交叉反應性測定，所述保守性基序用于鑒定T1R家族的成員。
然后將經(jīng)免疫吸附并合并的抗血清用于上述的競爭性結合免疫測定，以對第二蛋白(認為可能是T1R家族成員的等位基因或多態(tài)性變體)和免疫原蛋白(即由本文公開的核酸序列編碼的T1R多肽)進行比較。為了進行這種比較，在很寬的濃度范圍內(nèi)各對這兩種蛋白進行測定，并確定抑制抗血清與經(jīng)固定的蛋白的結合的50％所需的各蛋白的量。如果抑制結合的50％所需的第二蛋白的量比抑制結合的50％所需的由本文公開的核酸序列編碼的蛋白的量低10倍，那么就認為第二蛋白特異性結合由T1R免疫原制得的多克隆抗體。
可以用所產(chǎn)生的抗T1R保守性基序的抗體來制備只特異性結合到T1R家族的GPCR但不結合到其它家族的GPCR的抗體。
可以通過采用其它T1R家族成員扣除交叉反應抗體，來制備特異性結合到T1R家族的特定成員的多克隆抗體。物種特異性的多克隆抗體可以采用類似的方法制備。例如，可以通過扣除與直向同源序列(例如大鼠T1R1或小鼠T1R1)具有交叉反應性的抗體來制備對人類T1R1特異的抗體。
D.其它測定形式用Western印跡(免疫印跡)分析對樣品中存在的T1R多肽進行檢測和定量。該技術通常包括通過基于分子量的凝膠電泳分離樣品蛋白，將分離的蛋白轉移到適宜的固體支持物(例如硝酸纖維素濾膜、尼龍濾膜或衍生的尼龍濾膜)上，將所述樣品與特異性結合T1R多肽的抗體溫育?？筎1R多肽抗體特異性結合到固體支持物上的T1R多肽?？梢灾苯訕擞浰隹贵w，或者隨后用特異性結合到抗T1R抗體的標記抗體(例如標記的羊抗小鼠抗體)進行檢測。
其它測定形式包括脂質體免疫測定(LIA)，該測定方法使用經(jīng)設計而結合特異性分子(例如抗體)的脂質體并釋放經(jīng)包封的試劑或標記。然后根據(jù)標準方法(見Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev，534-41(1986))測定釋放后的化學物質。
E.非特異性結合的降低本領域技術人員應該理解，在免疫測定中經(jīng)常需要使非特異性結合最小化。特別地，當測定涉及到固定到固體基質上的抗原或抗體時，使與所述基質的非特異性結合量最小化是可取的。對于本領域技術人員來說，降低所述非特異性結合的手段是熟知的。一般地，該技術涉及用蛋白質組合物包被所述基質。特別地，廣泛使用諸如牛血清清蛋白(BSA)、脫脂奶粉和明膠等蛋白組合物，其中最優(yōu)選的是奶粉。
F.標記在所述測定中使用的特定標記或可檢測基團不是本發(fā)明的關鍵方面，只要所述標記或可檢測基團沒有顯著干擾在所述測定中使用的抗體的特異性結合即可?？蓹z測基團可以是具有可檢測的物理或化學特性的任意物質。在免疫測定領域，所述可檢測標記已經(jīng)發(fā)展得非常完善，并且通常大部分在所述免疫測定方法中有用的任意標記都可應用于本發(fā)明。因此，標記是通過分光光度法、光化學法、生物化學法、免疫化學法、電學法、光學法或化學法可以檢測的任意組合物。在本發(fā)明中有用的標記包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明等)、放射性標記(例如3H、125I、14C、35S)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和在ELISA中常用的其它酶)，以及諸如膠體金、著色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚苯丙烯、膠乳等)等比色標記。
根據(jù)本領域熟知方法，所述標記可以直接或間接地與待分析物的所需成分相偶聯(lián)。如以上所述，可以使用大量標記，標記的選擇取決于所需要的靈敏度、與化合物結合的容易程度、穩(wěn)定性要求、可獲得的儀器和處置規(guī)定。
非放射性標記經(jīng)常通過間接方法進行連接。通常，配體分子(例如生物素)共價結合到所述分子上。然后配體結合到另外一個分子(例如鏈霉抗生物素蛋白分子)上，所述另外一個分子本身是可檢測的或者共價結合到諸如可檢測的酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物等信號系統(tǒng)上。配體和它們的靶可以與識別T1R多肽的抗體或識別抗T1R的第二抗體適當組合使用。
也可以將所述分子例如通過與酶或熒光團結合而直接結合到產(chǎn)生信號的化合物上。作為標記的感興趣的酶主要是水解酶，尤其是磷酸酶、酯酶、糖苷酶，或氧化酶(oxidotase)，尤其是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮等?；瘜W發(fā)光化合物包括螢光素和2，3-二氫酞嗪二酮，例如魯米諾?？梢允褂玫母鞣N標記系統(tǒng)或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述見美國專利No.4,391,904。
對于本領域技術人員來說，檢測標記的手段是熟知的。因此，例如，當標記為放射性標記時，檢測手段包括閃爍計數(shù)器或如放射自顯影中的照相膠片。當標記為熒光標記時，可以通過用適當波長的光激發(fā)熒光染料并檢測所獲得的熒光而對熒光標記進行檢測?？梢酝ㄟ^照相膠片手段，通過使用諸如電荷耦合裝置(CCDs)或光電倍增管等電子檢測儀而通過目視檢測熒光。類似地，可以通過為酶提供適當?shù)牡孜锊z測所獲得的反應產(chǎn)物來對酶促標記進行檢測。最后，可以通過觀察與比色標記有關的顏色而簡單地檢測簡單的比色標記。因此，在各種浸染試條測定法中，結合的金通常呈現(xiàn)粉色，而各種結合的珠子呈現(xiàn)所述珠子的顏色。
有些測定方式不需要使用標記成分。例如，凝集測定可以用來檢測目標抗體的存在。在這種情況中，含有目標抗體的樣品凝集包被有抗原的粒子。在這種形式中，不需要標記任何成分，并且通過簡單的目視檢查來檢測目標抗體的存在。
調節(jié)劑的檢測以下描述了用于在體外和體內(nèi)測定待測化合物是否特異性結合本發(fā)明的T1R受體的組合物和方法?？梢詫毎韺W的許多方面進行監(jiān)測，以評價配體結合到本發(fā)明的T1R多肽的效果?？梢栽诒磉_化學感應受體的完整細胞中、在經(jīng)透化處理的細胞中或在通過標準方法制備的膜組分上或體外從頭合成的合成蛋白中進行這些測定。
在體內(nèi)，味覺受體與調味劑結合并啟動由化學刺激到電信號的轉換。受到激活或抑制的G蛋白接著改變目標酶、通道和其它效應蛋白的特性。其中的一些例子是視覺系統(tǒng)的轉導蛋白對cGMP磷酸二酯酶的激活、刺激性G蛋白對腺苷酸環(huán)化酶的激活、Gq和其它同源G蛋白對磷酸酯酶C的激活以及Gi和其它G蛋白對多種通道的調節(jié)。也可以測定下游的結果，例如磷酸酯酶C引起甘油二酯和IP3的產(chǎn)生，以及接著由IP3引起的鈣動員。
測定的T1R蛋白或多肽優(yōu)選為選自實施例1中公開的序列中選擇的具有T1R多肽序列的多肽，或該多肽的片段或保守性修飾的變體?；蛘撸銎魏妥凅w可以是結合到抗T1R抗體的抗原性片段和變體。或者，所述片段和變體可以結合甜味劑或鮮味調味劑或者由甜味劑或鮮味調味劑激活。
選擇性地，測定的T1R蛋白或多肽可以來自真核宿主細胞并可以包括與實施例1公開的T1R多肽或該多肽的片段或保守性修飾的變體具有氨基酸序列同一性的氨基酸亞序列。通常，所述氨基酸同一性為至少35～50％，或者選擇性地為75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％。選擇性地，測定的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的諸如胞外域、跨膜區(qū)、跨膜結構域、胞質域、配體結合結構域等結構域。此外，如上所述，T1R蛋白或其結構域可以共價連接到異源蛋白而形成用于本文所述的測定中的嵌合蛋白。
用上述重組的或天然存在的T1R蛋白或多肽檢驗T1R受體活性的調節(jié)劑。可以將重組的或天然存在的T1R蛋白或多肽進行分離，在細胞中進行共表達，在來自細胞的膜中進行共表達，在組織或動物中進行共表達。例如，可以使用舌切片、來自舌的解離細胞、經(jīng)轉化的細胞或膜?？梢杂帽疚拿枋龅捏w外或體內(nèi)測定之一檢驗調節(jié)。
例如，如在下文的實驗例中所公開的那樣，已發(fā)現(xiàn)某些5’-核苷酸(例如5’IMP或5’GMP)增強L-谷氨酸激活鮮味受體的活性或阻斷鮮味刺激物(例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸)對鮮味受體的激活。
1.體外結合測定也可以采用本發(fā)明的T1R多肽，采用可溶狀態(tài)或固態(tài)的反應對味覺轉導進行體外測定。在一個特定實施方案中，可以在可溶狀態(tài)或固態(tài)的反應中用T1R配體結合結構域體外測定配體的結合。
例如，推測T1R的N-末端結構域參與配體的結合。更具體地，T1R屬于GPCR亞家族，該家族的特征是胞外N-末端片段大(約600個氨基酸)。據(jù)認為所述N-末端片段形成配體結合結構域，因此在鑒定T1R激動劑和拮抗劑的生化測定中是有用的。配體結合結構域有可能由諸如跨膜結構域的胞外環(huán)等胞外域的附加部分形成。
曾用與T1R有關的諸如代謝型谷氨酸受體等其它GPCR進行體外結合測定(見例如Han和Hampson，J.Biol.Chem.27410008-10013(1999))。所述測定可能通過置換放射性標記或熒光標記的配體來進行，測定內(nèi)在熒光的變化或蛋白水解敏感性的變化等。
配體與本發(fā)明的T1R多肽的異聚體復合物的結合可以在溶液中、在雙層膜上、任選附著到固相上、在脂單層中或囊泡中進行檢驗。調節(jié)劑的結合可以采用例如光譜特征(例如熒光、吸光度、折射率)、流體動力學(例如形狀)、色譜層析或溶解特性的變化進行檢驗。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以采用GTPγ35S測定。如上所述，一旦激活GPCR，就刺激G蛋白復合物的Gα亞基將結合的GDP換成GTP。在存在假定配體的情況下，可以通過測定添加的放射性標記的GTPγ35S與G蛋白的結合來測定生化待分析物中G蛋白交換活性的配體介導的刺激。通常，將包含感興趣的化學感應受體的膜和G蛋白復合物混合。向待分析物中添加可能的抑制劑和/或激活劑以及GTPγ35S，測定GTPγ35S與G蛋白的結合?？梢酝ㄟ^液體閃爍計數(shù)或包括閃爍親近測定(SPA)在內(nèi)的本領域已知的其它任意方法來對結合進行測定。在其它的測定形式中，可以采用熒光標記的GTPγ35S。
2.熒光偏振測定在另一個實施方案中，可以采用基于熒光偏振(“FP”)的測定來檢測和監(jiān)測配體結合。熒光偏振是用于測定平衡結合、核酸雜交和酶活性的多用途的實驗室技術。各種熒光偏振測定的類似之處在于它們都不需要諸如離心、過濾、色譜層析、沉淀或電泳等分離步驟。這些測定可以直接在溶液中實時進行，并且不需要固定相。由于偏振測定的速度快并且對樣品不造成破壞，因此偏振值的測定可以重復進行和在添加各種試劑之后進行。通常，該技術可以用來測定低皮摩爾～微摩爾水平的熒光團的偏振值。這一部分描述可如何采用熒光偏振來以簡單和定量方式測定配體與本發(fā)明的T1R多肽的結合。
當熒光標記分子被平面偏振光激發(fā)時，它發(fā)出偏振程度與它的分子旋轉成反比的光。熒光標記的大分子在激發(fā)態(tài)(在熒光素的情況中為4納秒)期間保持相對穩(wěn)定，并且所述光的偏振在激發(fā)和發(fā)射之間保持相對恒定。熒光標記的小分子在激發(fā)態(tài)期間快速轉動，并且偏振在激發(fā)和發(fā)射之間變化顯著。因此，小分子具有低的偏振值而大分子具有高的偏振值。例如，單鏈的熒光素標記的寡核苷酸具有相對低的偏振值，但是當它與互補鏈雜交時，它就具有較高的偏振值。當用FP檢測和監(jiān)測可能激活和/或抑制本發(fā)明的化學感應受體的調味劑結合時，可以使用熒光標記的調味劑或自動熒光調味劑。
熒光偏振(P)定義為
其中， 為與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光的強度，而Int⊥為與激發(fā)光平面垂直的發(fā)射光的強度。P是光強度比率，是無量綱的數(shù)。例如，Beacon和Beacon 2000TM系統(tǒng)可以與這些測定聯(lián)用。所述系統(tǒng)通常以毫偏振單位來表示偏振(1個偏振單位＝1000mP單位)分子的旋光度和大小的關系由Perrin方程表示，而讀取器由Jolley，M.E.(1991)在Journal of Analytical Toxicology第236-240頁中描述，其中給出了上述方程的詳細解釋。類似地，Perrin方程認為偏振與旋轉弛豫時間成正比例，所述時間是分子旋轉約68.5°的角度所需要的時間。旋轉弛豫時間與粘度(η)、絕對溫度(T)、分子體積(V)和氣體常數(shù)(R)的相關性由以下方程表示 對于小分子(例如熒光素)，旋轉弛豫時間短(≈1納秒)，而對于大分子(例如免疫球蛋白)，旋轉弛豫時間長(≈100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，旋轉弛豫時間與分子體積直接相關，因而偏振與分子體積直接相關。分子體積的變化可以是由于熒光標記分子與其它分子的相互作用、解離、聚合、降解、雜交或發(fā)生構象變化。例如，曾利用熒光偏振來測定由蛋白酶、DNA酶和RNA酶對較大的熒光素標記的聚合物進行的酶切。也曾利用熒光偏振來測定蛋白/蛋白相互作用、抗體/抗原結合和蛋白/DNA結合的平衡結合。
A.固態(tài)和可溶的高通量測定在另一個實施方案中，本發(fā)明提供采用異寡聚T1R多肽復合物或共表達T1R多肽的細胞或組織進行的可溶測定。優(yōu)選地，所述細胞包括穩(wěn)定共表達功能性T1R1/T1R3(鮮味)味覺受體或T1R2/T1R3(甜味)味覺受體的細胞系。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供高通量形式的基于固相的體外測定，其中所述的T1R多肽或表達T1R多肽的細胞或組織被附著到固相基質或味覺刺激化合物上并與T1R受體接觸，并采用適當?shù)臉擞浕蛩a(chǎn)生的抗T1R受體的抗體對結合進行檢測。
在本發(fā)明的高通量測定中，僅在一天之內(nèi)就可以篩選高達數(shù)千個不同的調節(jié)劑或配體。特別地，微量滴定板的各個孔可以用來分別測定所選擇的可能調節(jié)劑，或者，如果要觀測濃度或溫育時間的效果，可以每5～10個孔檢測一個調節(jié)劑。因此，單個標準微量滴定板可以測定約100(例如96)個調節(jié)劑。如果采用1536孔微量滴定板，那么采用單個板就可以很容易地測定約1000～約1500個不同的化合物。在各板孔中測定多個化合物也是可能的。每天測定幾個不同的板是可能的；用本發(fā)明的集成系統(tǒng)，可以進行篩選最高達約6000～20000個不同化合物的測定。新近，也研制出針對試劑進行操作的微觀流體途徑。
可通過共價鍵或非共價鍵(例如通過標記)直接或間接地將感興趣的分子結合到固態(tài)組分上。所述標記可以是多種化合物中的任意化合物。一般地，將結合標記的分子(標記結合物)固定到固體支持物上，并通過所述標記和標記結合物的相互作用將感興趣的標記分子(例如感興趣的味覺轉導分子)附著到固體支持物上。
根據(jù)文獻中充分描述的已知分子的互相作用，可以采用許多標記和標記結合物。例如，當標記為諸如生物素、蛋白A或蛋白G等天然結合物時，可以將該標記與適當?shù)臉擞浗Y合物(抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性鏈親和素、免疫球蛋白的Fc區(qū)等)組合使用?？箮в兄T如生物素等天然結合物的分子的抗體也是可以大量獲得的，并且所述抗體是適當?shù)臉擞浗Y合物(見SIGMA Immunochemicals 1998 SIGMA目錄，St.Louis MO)。
類似地，任意的半抗原或抗原化合物均可以與適當?shù)目贵w組合使用，以形成標記/標記結合物對?？梢酝ㄟ^商購獲得數(shù)千種特異性抗體，在文獻中也描述了很多其它抗體。例如，在一個普通的組合中，標記為第一抗體，而標記結合物是識別所述第一抗體的第二抗體。除了抗原-抗體的相互作用之外，受體-配體的相互作用也適合于作為標記和標記結合物對。例如細胞膜受體的激動劑和拮抗劑(例如，細胞受體-配體的相互作用，例如鐵傳遞蛋白、c-盒(c-kit)、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整合蛋白家族、選擇蛋白家族等，見例如Pigott和Power，The Adhesion MoleculeFacts Book I(1993))。類似地，毒素和毒液、病毒抗原決定簇、激素(例如阿片劑、類固醇等)、胞內(nèi)受體(例如介導包括類固醇、甲狀腺激素、類維生素A和維生素D等各種小配體和肽等的作用的胞內(nèi)受體)、藥物、凝集素、糖類、核酸(線性和環(huán)狀聚合物構型)、寡聚糖、蛋白、磷脂和抗體可以與各種細胞受體發(fā)生相互作用。
諸如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺和聚乙酸酯等合成的聚合物也可以形成適宜的標記或標記結合物。本領域技術人員根據(jù)本文所公開的評述將會顯而易見，很多其它的標記/標記結合物在本文所述的測定系統(tǒng)中也是有用的。
諸如肽、聚醚等常規(guī)接頭也可以用作標記，并包括諸如約5～200個氨基酸之間的聚甘氨酸等多肽序列。對于本領域技術人員來說，該類柔性接頭是已知的。例如，可以從Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama獲得聚乙二醇接頭。所述接頭選擇性地具有酰胺鍵、硫氫鍵或者雜官能團鍵。
可以采用目前可利用的任意各種方法將標記結合物固定到固體基質上?？梢酝ㄟ^將全部或部分基質與化學試劑接觸而對固體基質進行常規(guī)衍生化或功能化，所述化學試劑將與標記結合物的一部分具有反應性的化學基團固定到表面上。例如，適合于與較長的鏈部分附著的基團包括胺、羥基、巰基和羧基?？梢圆捎冒被榛柰楹土u基烷基硅烷對諸如玻璃表面等各種表面進行功能化。在文獻中有所述固相生物聚合物陣列的組成的詳細描述，見例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.，102259-274(1987)(描述固相組分在針(pin)上的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron，4460316040(1988)(描述各種肽序列在纖維素盤上的合成)；Fodor等，Science，251767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry，39(4)718-719(1993)；以及Kozal等，Nature Medicine，2(7)753759(1996)(都描述固定到固體基質上的生物聚合物陣列)。用于將標記結合物固定到基質上的非化學手段包括諸如加熱、通過紫外線照射進行交聯(lián)等其它常規(guī)方法。
3.基于細胞的測定在一個優(yōu)選的處理方案中，在真核細胞中瞬時或穩(wěn)定地共表達T1R蛋白或多肽的組合，所述T1R蛋白或多肽為未經(jīng)修飾的形式或為嵌合體、變體或截斷的受體，帶有或優(yōu)選地不帶有有利于其成熟和通過分泌途徑進行定位的異源伴侶序列。所述的T1R多肽可以在諸如HEK-293細胞等任意真核細胞中表達。優(yōu)選地，所述細胞包含功能性G蛋白，例如Gα15或先前鑒定的嵌合G蛋白，或者另一種G蛋白，該另一種G蛋白能夠將該嵌合受體偶聯(lián)到胞內(nèi)信號轉導途徑中或者諸如磷脂酶C等信號轉導蛋白上。此外，優(yōu)選地，產(chǎn)生穩(wěn)定地共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞，原因在于，已發(fā)現(xiàn)(如實驗例中所顯示的)此類細胞表現(xiàn)出對味覺刺激物的應答增強(與瞬時表達相同的T1R組合的細胞相比)?？梢圆捎萌我鈽藴史椒▉頇z測此類細胞中T1R受體的激活，所述標準方法例如通過檢測細胞中Fluo-4依賴性熒光來檢測胞內(nèi)鈣的變化。所述測定是本申請中提供的實驗發(fā)現(xiàn)的基礎。
激活的GPCR受體經(jīng)常是使受體的C-末端尾部(并且可能還有其它位點)磷酸化的激酶的底物。因此，激活劑促進32P從放射性標記的ATP轉移到受體，而這可以由閃爍計數(shù)器進行測定。C-末端尾部的磷酸化將促進抑制蛋白樣蛋白的結合并會干擾G蛋白的結合。對于GPCR信號轉導和測定信號轉導的方法的總述，見例如Methods in Enzymology，第237和238卷(1994)以及第96卷(1983)；Bourne等，Nature，10349117-127(1991)；Bourne等，Nature，348125-132(1990)；Pitcher等，Annu.Rev.Biochem.，67653-692(1998)。
可以通過對用假定的T1R調節(jié)劑處理的T1R多肽的應答和未處理對照樣品或含有已知的“陽性”對照的樣品的應答進行比較，測定T1R調節(jié)。所述假定的T1R調節(jié)劑可以包括抑制或激活T1R多肽活性的分子。在一個實施方案中，將對照樣品(未用激活劑或抑制劑處理)的相對T1R活性值指定為100。相對于對照，當T1R活性值為約90％，選擇性地為50％，選擇性地為25％～0％時，實現(xiàn)對T1R多肽的抑制。相對于對照，當T1R活性值為110％，選擇性地為150％，選擇性地為200％～500％或者1000％～2000％時，實現(xiàn)對T1R多肽的激活。
可以通過測定表達T1R多肽的細胞或膜的離子極化(即電勢)的變化來評價離子流的變化。測定細胞極化變化的一個手段是采用電壓夾和膜片鉗技術測定電流的變化(據(jù)此測定極化的變化)(見例如the“cell-attached”mode，the“inside-out”mode，and the“whole cell”mode，例如Ackerman等，New Engl.J Med.，3361575-1595(1997))。采用標準方法可以方便地測定全細胞的電流。其它已知的測定包括放射性標記的離子流測定和采用電壓敏感染料的熒光測定(見例如Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol.，8867-75(1988)；Gonzales和Tsien，Chem.Biol.，4269277(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth.，25185-193(1991)；Holevinsky等，J.Membrane Biology，13759-70(1994))。
可以通過檢測上述任意參數(shù)來測定待測化合物對所述多肽的功能的影響。影響GPCR活性的任何適宜的生理學變化都可以用來評價待測化合物對本發(fā)明的多肽的影響。當采用完整細胞或動物對功能性結果進行測定時，還可以測定對已知的和未表征的遺傳標記的諸如遞質釋放、激素釋放、轉錄變化(例如Northern印跡)等各種效果，諸如細胞生長或pH變化等細胞代謝變化，以及諸如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP等胞內(nèi)第二信使的變化。
優(yōu)選的GPCR測定包括裝載有離子或電壓敏感染料以報道受體活性的細胞。檢測所述受體活性的測定方法也可以采用已知的其它G蛋白偶聯(lián)受體的激動劑和拮抗劑作為對照以評價待測化合物的活性。在鑒定調節(jié)化合物(例如激動劑、拮抗劑)的測定中，可以分別采用離子敏感指示劑或膜電壓熒光指示劑監(jiān)測細胞質中離子水平或膜電壓的變化。可以利用的離子敏感指示劑和電壓探針可以是Molecular Probes的1997年的目錄中公開的指示劑和探針。對于G蛋白偶聯(lián)受體，諸如Gα15和Gα16等混雜G蛋白可以在所選擇的測定中使用(Wilkie等，Proc.Nat’l Acad.Sci.，8810049-10053(1991))。
受體的激活啟動后續(xù)胞內(nèi)事件，例如第二信使的增加。一些G蛋白偶聯(lián)受體的激活通過磷脂酶C介導的磷脂酰肌醇的水解而刺激肌醇三磷酸(IP3)的形成(Berridge和Irvine，Nature，312315-321(1984))。IP3接著刺激胞內(nèi)鈣離子庫的釋放。因此，細胞質中鈣離子水平的變化或者諸如IP3等第二信使水平的變化可以用來評價G蛋白偶聯(lián)受體的功能。作為從胞內(nèi)庫的鈣釋放和胞外鈣借助質膜離子通道的進入的結果，表達所述G蛋白偶聯(lián)受體的細胞可以顯示出細胞質鈣水平的上升。
在一個優(yōu)選的實施方案中，可以在帶有混合的G蛋白的異源細胞中穩(wěn)定地或瞬時地共表達T1R基因(優(yōu)選穩(wěn)定地共表達T1R基因)而測定T1R多肽活性，所述混合的G蛋白將受體連接到磷脂酶C信號轉導途徑中(見Offermanns和Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995))。在另一個優(yōu)選的實施方案中，細胞系為HEK-293(其一般不表達T1R基因)，而混合的G蛋白為Gα15(Offermanns和Simon，上文)。通過測定胞內(nèi)Ca2+水平的變化而對味覺轉導的調節(jié)進行測定，所述胞內(nèi)Ca2+水平在通過施用與T1R多肽結合的分子而對T1R信號轉導途徑的調節(jié)產(chǎn)生應答而發(fā)生變化。選擇性地，采用熒光Ca2+指示劑染料和熒光測定成像來測定Ca2+水平的變化。
在另一個實施方案中，可以根據(jù)美國專利5,436,128來分析磷脂酰肌醇(PI)的水解，以參考的方式將該專利內(nèi)容引入到本文中。簡而言之，該測定涉及用3H-肌醇對細胞進行48小時或48小時以上的標記。用待測化合物處理經(jīng)標記的細胞1小時。裂解所處理的細胞并在氯仿-甲醇-水中進行提取，此后通過離子交換層析分離肌醇磷酸并通過閃爍計數(shù)進行定量。通過計算存在激動劑時的cpm與存在緩沖液對照時的cpm的比率，從而測定刺激倍數(shù)。類似地，通過計算存在拮抗劑時的cpm與存在緩沖液對照(可以含或不含激動劑)時的cpm的比率，從而測定抑制倍數(shù)。
其它受體測定可以包括測定胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸(例如cAMP或cGMP)的水平。在受體的激活導致環(huán)狀核苷酸水平下降的情況中，優(yōu)選在將受體激活化合物添加到測定所用的細胞中之前，使所述細胞與提高胞內(nèi)環(huán)狀核苷酸水平的試劑(例如毛喉素)接觸。在一個實施方案中，可以采用免疫測定來檢測胞內(nèi)cAMP或cGMP的變化。在Offermanns和Simon，J.Bio.Chem.，27015175-15180(1995)中描述的方法可以用來測定cAMP的水平。另外，在Felley-Bosco等，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11159-164(1994)中描述的方法可以用于測定cGMP水平。此外，在美國專利4,115,538描述了用于測定cAMP和/或cGMP的測定試劑盒，以參考的方式將該專利的內(nèi)容引入到本文中。
在另一個實施方案中，可以對轉錄水平進行測定，以評價待測化合物對信號轉導的作用。使含有感興趣的T1R多肽的宿主細胞與待測化合物接觸足夠長的時間，以實現(xiàn)任何的互相作用，然后測定基因的表達水平。實現(xiàn)所述互相作用的時間的長短可以根據(jù)經(jīng)驗進行確定，例如通過持續(xù)一段時間并測定轉錄水平(將該轉錄水平作為時間的函數(shù))來確定。轉錄的量可以采用本領域技術人員任意已知地適宜方法來測定。例如，采用northern印跡檢測感興趣的蛋白的mRNA的表達，或者可以采用免疫測定來鑒定它們的多肽產(chǎn)物。選擇性地，如美國專利5,436,128所述，可以采用利用報道基因的基于轉錄的測定方法，以參考的方式將該專利的內(nèi)容引入到本文中。所述報道基因可以是例如氯霉素乙酰轉移酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶和堿性磷酸酶。此外，可以通過將感興趣的蛋白附著到第二報道分子(例如綠色熒光蛋白)而將該蛋白用作間接的報道分子(見例如Mistili和Spector，Nature Biotechnology，15961-964(1997))。
然后將轉錄的量與不存在待測化合物的相同細胞中的轉錄的量進行比較，或者將轉錄的量與缺乏感興趣的T1R多肽的基本相同的細胞中的轉錄的量進行比較?；鞠嗤募毎梢詠碜杂靡灾苽渲亟M細胞但沒有通過引入異源DNA而進行修飾的相同細胞。轉錄的量中的任何差異指示待測化合物以某種方式改變了感興趣的T1R多肽的活性。
4.表達化學感應受體的轉基因的非人類動物表達本發(fā)明的T1R味覺受體序列組合的非人類動物也可以用于受體測定。通過將非人類動物(該非人類動物用編碼化學感應受體或其配體結合區(qū)的核酸進行穩(wěn)定或瞬時轉染)與待測化合物接觸，并確定該動物是否通過與受體多肽復合物的特異性結合來與待測化合物進行反應，從而可以將所述表達用于確定待測化合物是否在體內(nèi)與哺乳動物味覺跨膜受體復合物特異性結合。
用本發(fā)明的載體轉染或感染的動物對鑒定和表征能夠結合到特異的或一組受體上的味覺刺激物的測定尤其有用?？梢詫⒈磉_人類味覺受體序列的所述載體感染的動物用于體內(nèi)篩選味覺刺激物及其對例如細胞生理學(例如對味覺神經(jīng)元)、對CNS或行為的影響。選擇性地，可以將表達T1R或其組合的穩(wěn)定細胞系用作核酸轉移供體，以產(chǎn)生穩(wěn)定表達特定T1R或組合的克隆的轉基因動物。用核酸轉移產(chǎn)生穩(wěn)定表達所需的異源DNA的克隆動物的方法是授予麻薩諸塞州大學(University ofMassachusettes(許可給Advanced Cell Technology，Inc.)和Roslin Institute(許可給Geron Corp.)的已授權的數(shù)個美國專利的主題。
本領域熟知感染/表達單獨的或文庫形式的核酸和載體的方法。可以通過各種手段測定各種單獨的細胞、器官和整個動物的參數(shù)。例如，可以采用諸如腺病毒表達載體等感染劑通過遞送而例如使本發(fā)明的T1R序列在動物味覺組織中共表達。
內(nèi)源味覺受體基因可以保持具有功能性而野生型(天然)的活性仍可以存在。在其它情況中，當需要使所有味覺受體的活性都是來自引入的外源雜合受體的活性時，優(yōu)選使用敲除系。本領域熟知用于構建非人類動物尤其是轉基因小鼠的方法，以及選擇和制備重組構建體以產(chǎn)生轉化細胞的方法。
“敲除”細胞或動物的構建是基于這樣的前提通過將用以破壞所要抑制的基因的DNA序列的某些部分的新DNA序列引入基因組中，可以降低或完全消除該特定基因在哺乳動物細胞中的表達水平。此外，可以采用“基因陷阱插入”來破壞宿主基因，并且可以采用小鼠胚胎干(ES)細胞來產(chǎn)生敲除的轉基因動物(見例如Holzschu，Transgenic Res 697-106(1997))。通常通過在互補核酸序列之間進行同源重組來插入外源序列。外源序列是所要修飾的目標基因的某些部分，例如外顯子、內(nèi)含子、轉錄調節(jié)序列或任何能夠影響目標基因的表達水平的基因組序列；或者它們的組合。借助在多潛能胚胎干細胞中進行同源重組的基因靶向可以準確修飾感興趣的基因組序列。可以使用任意技術產(chǎn)生、篩選、繁殖敲除動物，例如見Bijvoet，Hum.Mol.Genet.753-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology 19161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6321-328(1997)；美國專利No 5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。
本發(fā)明的核酸也可以用作產(chǎn)生“敲除”人類細胞或其子代的反應物。同樣地，本發(fā)明的核酸也可以用作在小鼠中產(chǎn)生“敲進”的反應物。人類或大鼠的T1R基因序列可以置換小鼠基因組中的直向同源T1R。采用這種方式，得以產(chǎn)生表達人類或大鼠的T1R的小鼠。然后采用所述小鼠分析人類或大鼠的T1R的功能和鑒定所述T1R的配體。
a.調節(jié)劑檢驗為T1R家族成員的調節(jié)劑的化合物可以是任意的小化學化合物或生物學物質(例如蛋白、核酸或脂類)。所述化學化合物或生物學物質的例子包括51IMP和51GMP。實質上，任何化學化合物都可以用作本發(fā)明的測定中的潛在的調節(jié)劑或配體，但是大多時候所檢測的化合物是在水溶液中可溶的化合物?？梢酝ㄟ^使測定步驟自動化并從方便的任意來源提供化合物而將所述測定設計為用以篩選大的化學物質文庫；通常這些測定是平行進行的(例如在自動儀器測定中，采用微量滴定板進行的微量滴定形式)。應該理解，可以通過諸多化學反應之一合成化學物質文庫(例如Senomyx proprietary chemistries)。另外，還有很多化學化合物的供應商，其中包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，瑞士)等。
在一個優(yōu)選實施方案中，高通量篩選方法包括提供包含大量的潛在的味覺影響化合物(潛在的調節(jié)劑或配體化合物)的組合性化學物質文庫或肽文庫。然后如本文所述，在一個或多個測定中篩選所述“組合性化學物質文庫”或“配體文庫”，以鑒定顯示出所需的特征活性的那些文庫成員(尤其是化學物質種類或亞類)。如此鑒定出的化合物可以作為常規(guī)“引導化合物”或者可以將它們本身用作潛在的或實際的味覺調節(jié)劑。
優(yōu)選地，所述文庫的篩選是針對穩(wěn)定表達T1R或T1R組合(即T1R1/T1R3或T1R2/T1R3)和優(yōu)選適宜的G蛋白(例如Gα15)的細胞或細胞系進行的。如下文實施例中那樣，所述穩(wěn)定表達的細胞系對味覺刺激物(例如鮮味或甜味刺激物)表現(xiàn)出極為顯著的應答。但是，也可以在所述的測定中使用瞬時表達一個或多個T1R的細胞和細胞系。
組合性化學物質文庫是由化學合成或生物合成或者組合大量的化學“構件”(例如反應物)而產(chǎn)生的多種化學化合物的集合。例如，通過按給定的化合物長度(即多肽化合物中的氨基酸數(shù)目)以每一種可能的方式將一套化學構件(氨基酸)組合而形成線性的組合性化學物質文庫，例如多肽文庫。通過化學構件的組合混合，可以合成成千上萬的化學化合物。
對于本領域技術人員來說，組合性化學物質文庫的制備和篩選是熟知的。所述組合性化學物質文庫包括但不限于肽文庫(見例如美國專利5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493(1991)和Houghton等，Nature，35484-88(1991))。也可以使用其它用于產(chǎn)生化學上不同文庫的化學物質。所述化學物質包括但不限于擬肽(例如PCT公布No.WO91/19735)，編碼的肽(例如PCT公布WO 93/20242)，隨機的生物寡聚物(例如PCT公布No.WO 92/00091)，苯并二氮卓(例如美國專利No.5,288,514)，諸如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮卓和二肽等多種物質(diversomers)(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.，906909-6913(1993))，乙烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))，帶有葡萄糖骨架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1992))，類似的有機合成的小分子化合物文庫(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162661(1994))，低聚氨基甲酸酯(Cho等，Science，2611303(1993))，肽酰磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.，59658(1994))，核酸文庫(Ausubel，Berger和Sambrook，全部見上文)，肽核酸文庫(美國專利5,539,083)，抗體文庫(Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)，碳水化合物文庫(Liang等，Science，2741520-1522(1996)和美國專利5,593,853)，有機小分子文庫(苯并二氮雜卓，Baum，C&EN，1月18日，第33頁(1993)；噻唑烷酮和metathiazanones，美國專利5,549,974；pynrolidines，美國專利5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物，美國專利5,506,337；苯并二氮卓，5,288,514等)。
制備組合性文庫的設備可以通過商購獲得(見例如357MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，9050 Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，許多組合性文庫本身可以通過商購獲得(見例如ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences；Columbia，MD等)。
在本發(fā)明的一個方面，T1R調節(jié)劑可以用于任何的食品、糖果、藥物組合物或它們的成分中，據(jù)此以所需的方式調節(jié)所述產(chǎn)品、組合物或成分的味道。例如，可以添加增強甜味感覺的T1R調節(jié)劑，以使產(chǎn)品或組合物變甜；可以將增強鮮味感覺的T1R調節(jié)劑添加到食物中，以增加香味。選擇性地，可以用T1R拮抗劑阻斷甜味和/或鮮味。
b.試劑盒T1R基因和它們的同源物是用于鑒定化學感應受體細胞、法醫(yī)和父親血源確認以及檢查味道轉導的有用工具。諸如T1R探針和引物等與T1R核酸特異性雜交的T1R家族成員特異性試劑以及諸如T1R抗體等與T1R多肽特異性結合的T1R特異性試劑可以用來檢查味覺細胞表達和味覺轉導調節(jié)。
用于測定樣品中T1R家族成員的DNA和RNA的存在的核酸測定方法包括本領域技術人員已知的眾多技術，例如Southern分析、northern分析、點印跡、RNA酶保護、S1分析，擴增技術(例如PCR)，以及原位雜交。例如，在原位雜交中，目標核酸分子從其細胞環(huán)境中被釋放出來從而可用以在細胞內(nèi)進行雜交，同時保持了細胞的形態(tài)以備隨后的解釋和分析。以下文章提供了原位雜交技術的綜述Singer等，Biotechniques(4230250(1986))；Haase等，Methods in Virology(第VII卷第189-226頁(1984))；和Names等編的Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach(1987)。另外，可以采用上述的各種免疫測定技術檢測T1R多肽。一般將待測樣品與陽性對照(例如表達重組的T1R多肽的樣品)和陰性對照進行比較。
本發(fā)明還提供用于篩選T1R家族成員的調節(jié)劑的試劑盒。所述試劑盒可以由容易獲得的物質和試劑制備。例如，所述試劑盒可以包含任意的一種或多種以下物質T1R核酸或蛋白、反應管和用于檢測T1R活性的說明書。選擇性地，試劑盒包括具有生物活性的T1R受體或穩(wěn)定表達或瞬時表達具有生物活性的包含味覺受體在內(nèi)的T1R。可以根據(jù)本發(fā)明制備多種試劑盒和成分，這取決于試劑盒的預期的使用者和使用者的特定需要。
實施例盡管已在上文中詳細描述了本發(fā)明，但是還是提供以下實施例以闡明優(yōu)選的實施方案。這些實施例的目的是為了對本發(fā)明進行描述，而不是對本發(fā)明范圍進行限定。
在本文提供的蛋白序列中，一個字母代碼X或Xaa是指二十種常規(guī)氨基酸殘基中的任意一種。在本文提供的DNA序列中，一個字母代碼N或n是指4個常規(guī)核苷酸堿基A、T、C或G中的任意一個。
實施例1無內(nèi)含子的hT1R表達構建體的產(chǎn)生通過基于cDNA和基因組DNA的方法的組合，克隆無內(nèi)含子的hT1R表達構建體。為了產(chǎn)生全長的hT1R1表達構建體，通過重疊PCR，將在克隆的hT1R間隔序列(登錄號AL159177)中確認的兩個5’編碼外顯子合并，然后將其連接到5’截斷的睪丸cDNA克隆。hT1R2的表達構建體是由經(jīng)部分測序的hT1R2的基因組的間隔序列產(chǎn)生。采用來自大鼠的相應編碼序列的探針，通過篩選克隆的基因組的間隔序列的鳥槍(shotgun)文庫，鑒定出hT1R2的2個丟失的5’外顯子。然后通過重疊PCR合并編碼外顯子而產(chǎn)生全長的表達構建體。由經(jīng)過測序的hT1R3基因組的間隔序列(登錄號AL139287)通過重疊PCR產(chǎn)生hT1R3的表達構建體。采用通過基于hT1R3的簡并PCR產(chǎn)生的rT1R3外顯子片段，從來自大鼠味覺組織的cDNA文庫中分離到大鼠T1R3。從Charles Zuker博士(Universityof California，San Diego)獲得部分的hT1R1 cDNA、rT1R2 cDNA和部分的hT1R2的基因組序列。
序列表提供了以上鑒定的T1R的克隆序列以及其它全長的或部分的T1R序列的核酸和氨基酸序列。
同時，以下與兩對直向同源的魚T1R的C-末端相對應的概念性翻譯來自未公開的基因組序列片段，并在此提供所述概念性翻譯。Fugu T1RA來自登錄號′scaffold 164′；Fugu T1RB來自登錄號LPC61711；河豚T1RA來自登錄號AL226735；河豚T1RB來自登錄號AL222381。在概念性翻譯中的不明確之處(′X′)來源于數(shù)據(jù)庫序列中的不明確之處。這些序列可以在序列表中找到。
另外，在公共領域中涉及小鼠和大鼠的T1R及其等位基因變體的登錄號和引用的參考文獻提供如下rT1R1(登錄號AAD18069)(Hoon等，Cell 96(4)541-551(1999))；rT1R2(登錄號AAD18070)(Hoon等，Cell 96(4)541-559(1999))；mT1R1(登錄號AAK39437)；mT1R2(登錄號AAK39438)；mT1R3(登錄號AAK55537)(Max等，Nat.Genet.28(1)58-63(2001))；rT1R1(登錄號AAK7092)(Li等，Mamm.Genome(12(1)13-16(2001))；mT1R1(登錄號NP 114073)；mT1R1(登錄號AAK07091)(Li等，Mamm.Genome(121)13-16(2001))；rT1R2(登錄號AAD18070)(Hoon等，Cell 9664)541-551(1999))；mT1R2(登錄號NP114079)；mT1R3(登錄號AAK39436)；mT1R3(登錄號BAB47181)；(Kitagawa等，Biochem.Biophys.Res.Comm.283(1)236-242(2001))；mT1R3(登錄號NP114078)；mT1R3(登錄號AAK55536)(Max等，Nat.Genet.28(1)58-63(2001))；和mT1R3(登錄號No.AAK01937)。
實施例2人類T1R和大鼠T1R的序列比對將選自以上鑒定的那些序列的克隆T1R序列與相應的大鼠的T1R進行比對。如圖1所示，將人類T1R1、人類T1R2、人類T1R3和大鼠T1R3與以前描述的T1R(rT1R1，其登錄號為AAD18069；rT1R2，其登錄號為AAD18070)、大鼠mGluR1代謝型谷氨酸受體(登錄號P23385)；以及人類的鈣敏感受體(登錄號為P41180)進行比對。為了使上述比較清楚，截斷了mGluR1和鈣敏感受體的C-末端。將7個可能的跨膜片段框成藍色。將在mGluR1的晶體結構中與谷氨酸側鏈正丁酸基(carbutylate)接觸的殘基框成紅色，而將與谷氨酸α-氨基酸部分接觸的殘基框成綠色。將mGluR1和鈣敏感受體中涉及在亞基之間形成二硫鍵的半胱氨酸殘基圈成紫色。這些半胱氨酸在T1R1和T1R2中并不保守但位于比對的退化區(qū)(degraded region)，該退化區(qū)包含可能類似的T1R3的半胱氨酸殘基，該半胱氨酸也被圈起來。
實施例3通過RT-PCR證實hT1R2和hT1R3在味覺組織中表達如圖2所示，將hT1R2和hT1R3在味覺組織中進行表達由切除的人類輪廓乳頭進行RT-PCR可以檢測到所述兩個基因的表達。
實施例4在異源細胞中進行T1R的異源表達的方法在37℃，將穩(wěn)定地表達Gα15的HEK-293衍生細胞(Chandrashekar等Cell 100(6)703-711(2000))培養(yǎng)并保持在Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基，Gibco BRL)中，所述培養(yǎng)基添加有10％的FBS、MEM非必需氨基酸(Gibco BRL)和3μg/ml殺稻瘟素。對于鈣成像實驗，首先將細胞接種在24孔的組織培養(yǎng)板(約10萬細胞/孔)上，并用MirusTransIt-293(PanVera)通過脂質轉染法進行轉染。為了使谷氨酸誘導的和葡萄糖誘導的脫敏最小化，在轉染后約24小時，用低葡萄糖的DMEM/GlutaMAX(Gibco BRL)代替所添加的DMEM。24小時后，給細胞裝載鈣染料Fluo-4(Molecular Probes)(在Dulbecco’s PBS緩沖液(DPBS，GibcoBRL)中的濃度為3μm)，在室溫裝載1.5小時。用250μl的DPBS替換后，在室溫下通過添加200μl的DPBS進行刺激，所述DPBS添加有味覺刺激物。用Imaging Workbench 4.0軟件(Axon)在Axiovert S100TV顯微鏡(Zeiss)上監(jiān)測鈣動員。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的應答非常短暫—鈣上升很少超過15秒，并且是不同步的。因此一個時段內(nèi)響應細胞的數(shù)目是相對穩(wěn)定的；因此，在固定的時間點(通常在添加刺激物后30秒時)通過對響應細胞的數(shù)目進行手動計數(shù)而對細胞應答進行定量。
實施例5人類T1R2/T1R3發(fā)揮作為甜味受體的功能用人類T1R2、T1R3和T1R2/T1R3瞬時轉染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞，并測定因對提高蔗糖濃度產(chǎn)生應答而增加的胞內(nèi)鈣(圖3(a))。另外，針對數(shù)種甜味刺激物，測定T1R2/T1R3的劑量應答(圖3(b))。對于不同的甜味劑，響應細胞的最大百分比也不同，該百分比在10％～30％的范圍內(nèi)。為清楚目的，將劑量應答標準化為響應細胞的最大百分比。圖3中的值代表4次獨立應答的平均值±標準誤差。X軸圓圈標志著通過味覺檢驗而測定的心理學檢測閾值。Gurmarin(經(jīng)過濾的10g/l的武靴藤(Gymnema sylvestre)水性提取物的50倍稀釋物)抑制T1R2/T1R3對250mM蔗糖的應答，但不抑制內(nèi)源β2-腎上腺素能受體對20μM異丙基腎上腺素的應答(圖3(b))。圖3(c)包含T1R2/T1R3共表達細胞系對不同甜味劑(蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、D-色氨酸和糖精)的經(jīng)標準化的應答。
實施例6大鼠T1R2/T1R3也發(fā)揮作為甜味受體的功能用hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3和rT1R2/hT1R3瞬時轉染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞，然后測定這些細胞因對350mM蔗糖、25mM色氨酸、15mM天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和0.05％應樂果甜蛋白產(chǎn)生應答而引起的胞內(nèi)鈣的升高。蔗糖和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的結果包含在圖4中，指示rT1R2/rT1R3也具有作為甜味受體的功能。另外，這些結果表明T1R2可以控制T1R2/T1R3的配體特異性。
實施例7用基于自動熒光的測定獲得的T1R2/T1R3的應答用hT1R2、hT1R3瞬時轉染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞。將鈣染料Fluo-4裝載到這些細胞中，并用熒光讀板儀測定它們對甜味劑的應答。圖5包含表達hT1R2/hT1R3的細胞和只表達hT1R3(J19-22)的細胞對環(huán)己基氨基磺酸鹽(12.5mM)的應答。所獲得的熒光結果表明，對這些味覺刺激物的應答只發(fā)生在表達hT1R2/hT1R3的細胞中。圖6包含經(jīng)過標準化的劑量-應答曲線，其結果表明，根據(jù)hT1R2和hT1R3與各種甜味刺激物的劑量特異性相互作用，hT1R2和hT1R3一起發(fā)揮作為人類味覺受體的功能。特別地，圖6包含對蔗糖、色氨酸和其它各種可商購獲得的甜味劑的劑量-應答。這些結果表明，由于在測定中獲得的等級次序和閾值忠實地反映了對人類甜味的值，因此T1R2/T1R3是人類的甜味受體。
實施例8mGluR1的配體結合殘基在T1R1中是保守的如圖6所示，mGluR1的關鍵的配體結合殘基在T1R1中是保守的。顯示了谷氨酸與mGluR1的相互作用，其中根據(jù)與圖1相同的顏色方案，突出顯示幾個關鍵殘基。
實施例9人類的T1R1/T1R3發(fā)揮作為鮮味受體的功能用人類的T1R1、T1R3和T1R1/T1R3瞬時轉染穩(wěn)定表達Gα15的HEK細胞，然后測定因對谷氨酸的濃度上升(圖8(a))以及0.5mM的谷氨酸、0.2mM IMP和0.5mM谷氨酸加上0.2mM IMP(圖8(b))產(chǎn)生應答而引起的胞內(nèi)鈣的上升。存在和不存在0.2mM IMP時，測定人類T1R1/T1R3對谷氨酸的劑量應答(圖8(c))。對于谷氨酸，響應細胞的最大百分比約為5％；而對谷氨酸加上IMP，響應細胞的最大百分比約為10％。為清楚目的，將劑量應答標準化為響應細胞的最大百分比。其值代表4次獨立應答的平均值±標準誤差，X軸圓圈標志著通過味覺檢驗而測定的味覺檢測閾值。
實施例10將PDZIP作為輸出序列將6殘基PDZIP序列(SVSTW(SEQ ID NO1))融合到hT1R2的C-末端，并將該嵌合受體(即hT1R2-PDZIP)轉染到HEK-293宿主細胞中，然后采用免疫熒光和FACS掃描數(shù)據(jù)，檢測hT1R2的表面表達。如圖9A和圖9B所示，相對于hT1R2，包含的PDZIP序列增加了hT1R2-PDZIP的表面表達。更具體地，圖9A顯示myc標記的hT1R2的免疫熒光染色，證明PDZIP顯著提高hT1R2蛋白在質膜上的量。圖9B顯示FACS分析數(shù)據(jù)，證明了相同的結果表達myc標記的hT1R2的細胞用虛線表示，而表達myc標記的hT1R2-PDZIP的細胞用實線表示。特別地，圖10A顯示在HBS緩沖液中的未轉染的Gα15穩(wěn)定宿主細胞；圖10B顯示在5號甜味劑集合體(糖精、環(huán)己基氨基磺酸鈉、乙酰舒泛鉀和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，在HBS緩沖液中濃度各為20mM)中，hT1R2-PDZIP轉染的Gα15穩(wěn)定宿主細胞；圖10C顯示在5號甜味劑集合體中T1R3-PDZIP轉染的Gα15穩(wěn)定宿主細胞；和圖10D顯示在5號甜味劑集合體中，hT1R2-PDZIP/hT1R3-PDZIP共轉染的Gα15穩(wěn)定宿主細胞。此外，圖10E～10H顯示hT1R2/hT1R3共轉染的Gα15穩(wěn)定宿主細胞對蔗糖(E0mM(在HBS緩沖液中)；F30mM；G60mM和H250mM)的劑量依賴性應答。圖10I-10L顯示hT1R2/hT1R3共轉染的Gα15穩(wěn)定宿主細胞對單獨的甜味劑(I天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(1.5mM)；J乙酰舒泛鉀(1mM)；K紐甜(20mM)；L環(huán)己基氨基磺酸鈉(20mM))的應答。如由圖10的鈣圖像所示，hT1R2和hT1R3對由甜味刺激物引發(fā)的活性是必要的。
實施例11穩(wěn)定地共表達T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的細胞系的產(chǎn)生通過將分別包含hT1R1或hT1R2表達構建體(質粒SAV2485用于T1R1，質粒SAV2486用于T1R2)和hT1R3(質粒SXV550用于T1R3)的線性化的由PEAK10衍生而來(Edge Biosystems)的載體和由pCDNA3.1/ZEO衍生而來(Invitrogen)的載體轉染到Gα15表達細胞系中，產(chǎn)生穩(wěn)定地共表達人類T1R2/T1R3或人類T1R1/T1R3的人類細胞系。具體地，通過將線性化的SAV2486和SXV550共轉染到穩(wěn)定表達Gα15的AuroraBioscience的HEK-293細胞系中，產(chǎn)生T1R2/T1R3穩(wěn)定細胞系。通過將線性化的SAV2485和SXV550共轉染到穩(wěn)定表達Gα15的相同的HEK-293細胞系中，產(chǎn)生T1R1/T1R3穩(wěn)定細胞系。在SAV2485/SXV550和SAV2486/SXV550轉染之后，選擇抗嘌呤霉素和抗零霉素的克隆進行擴大培養(yǎng)，并通過鈣成像檢驗對甜味或鮮味刺激物所產(chǎn)生的應答。細胞是于37℃在添加有GlutaMAX、10％經(jīng)過透析的FBS和0.003mg/ml的殺稻瘟素的低葡萄糖DMEM中在0.0005mg/ml嘌呤霉素(CALBIOCHEM)和0.1mg/ml零霉素(Invitrogen)中進行選擇的。擴大培養(yǎng)抗性克隆，并通過熒光顯微鏡評估所述抗性克隆對甜味刺激物的應答。對于在VIPR-II儀器(Aurora Biosciences)上進行的自動熒光測定成像，首先將T1R2/T1R3穩(wěn)定細胞接種到96孔板上(約100,000細胞/孔)。24小時后，將鈣染料fluo-3-AM(Molecular Probes)(在PBS中為0.005mM)在室溫裝載到細胞中1小時。用70μl PBS替換后，在室溫通過添加其中加有味覺刺激物的70μl PBS進行刺激。在添加化合物后計算20秒～30秒內(nèi)的熒光(480nm激發(fā)和535nm發(fā)射)應答的平均值，用在化合物添加前測定的背景熒光進行修正，并標準化為對0.001mM離子霉素(CALBIOCHEM)的應答，所述離子霉素為一種鈣離子載體。
然后觀測到當這些細胞系與甜味或鮮味刺激物接觸時，對于活性克隆，通常有80％～100％的細胞對味覺刺激物產(chǎn)生應答。沒有想到的是，單細胞應答的強度顯著大于瞬時轉染的細胞應答的強度。
根據(jù)這些觀測，本發(fā)明人利用上述的Aurora Bioscience的VIPR儀器通過自動熒光成像檢驗了T1R穩(wěn)定細胞系的活性。在圖11和圖12中分別顯示了2個T1R1/T1R3細胞系和1個T1R2/T1R3細胞系的應答。
顯著地，相對于瞬時轉染細胞，增加的響應細胞數(shù)目和增強的應答強度導致活性上升10倍(通過比較的方式，在最適宜的條件下，用T1R2/T1R3瞬時轉染的細胞對離子霉素的應答百分比約為5％)。而且，對穩(wěn)定表達的人類T1R2/T1R3和T1R1/T1R3，所獲得的劑量應答與人類味覺檢測閾值有關聯(lián)。這些穩(wěn)定細胞系的很強的T1R活性表明，它們非常適合高通量篩選化學物質文庫以鑒定化合物，該化合物例如小分子，該小分子調節(jié)甜味或鮮味受體并因此調節(jié)、增強、阻斷或模擬甜味或鮮味。
實施例12選擇性響應鮮味刺激物的誘導性共表達T1R1/T1R3的細胞系的產(chǎn)生相對于瞬時轉染的細胞系，穩(wěn)定表達鮮味受體的T1R1/T1R3 HEK293細胞系表現(xiàn)出顯著提高的活性。但是，一個缺點是它們在細胞增殖過程中可以很快地失去活性。
另外，這些發(fā)現(xiàn)表明(i)T1R1/T1R3是鮮味受體，即(ii)顯著表達T1R1/T1R3的細胞系(優(yōu)選為穩(wěn)定和/或可誘導型T1R1/T1R3細胞系)可以用在測定中，優(yōu)選地，用在高通量篩選化學物質文庫中以鑒定新的鮮味調節(jié)劑?？梢允褂迷鰪婖r味的調節(jié)劑。
為了克服T1R1/T1R3穩(wěn)定細胞系的不穩(wěn)定性，用GeneSwitch系統(tǒng)(Invitrogen)對HEK-Gα15進行改造，以誘導表達T1R1/T1R3。對用于人類T1R1和T1R3的PGene衍生而來抗零霉素的表達載體(質粒SXV603用于T1R1而質粒SXV611用于T1R3)和抗嘌呤霉素的攜帶有GeneSwitch蛋白的pSwitch衍生而來的載體(質粒SXV628)進行線性化，并將它們共轉染到HEK-Gα15細胞系中。選擇抗零霉素和嘌呤霉素的克隆進行擴大培養(yǎng)，用各種量的米非司酮誘導，并采用鈣成像來檢測對鮮味刺激物產(chǎn)生的應答。
T1R1/T1R3的誘導表達導致很強的活性。例如，約80％的誘導細胞對L-谷氨酸產(chǎn)生應答，而只有約10％的瞬時轉染細胞對L-谷氨酸產(chǎn)生應答。更具體地，對表達人類T1R1和人類T1R3的pGene衍生而來的抗零霉素的表達載體和抗嘌呤霉素的pSwitch衍生而來的攜帶有GeneSwitch蛋白的載體進行線性化，并共轉染到Gα15細胞中。在0.5μg/ml嘌呤霉素(CAL BIOCHEM)和100μg/ml零霉素(Invitrogen)中，于37℃在添加有GlutaMAX、10％經(jīng)過透析的FBS和3μg/ml殺稻瘟素的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中對細胞進行選擇。擴大培養(yǎng)抗性克隆，在用10-10M米非司酮進行誘導后，按照Li等(PNAS 99(7)4692-4696(2002))的方法，通過熒光顯微鏡檢測它們對鮮味刺激物的應答。
對于在FLIPR儀器(Molecular Device)上進行的自動熒光測定成像，在存在10-10M米非司酮時，將來自一個克隆(指定為克隆I-17)的細胞接種到96孔板上(約80,000個細胞/孔)并溫育48小時。然后用鈣染料fluo-4-AM(Molecular Probes)(在PBS中為3μM)將細胞在室溫裝載1.5小時。
用50μl PBS替換后，在室溫通過添加其中加有不同刺激物的50μlPBS進行刺激。不同于先前需要通過對響應細胞進行單個計數(shù)以對T1R1/T1R3受體活性進行定量的瞬時T1R1/T1R3鮮味受體表達系統(tǒng)(Li等，PNAS 99(7)4692-4696(2002))，(因為其中的受體的活性低)，本發(fā)明的誘導型表達系統(tǒng)導致克隆I-17具有實質性提高的活性，其可通過對成像細胞視野內(nèi)的最大熒光增加進行求和(480nm激發(fā)和535nm發(fā)射)來對受體活性進行定量。對來自4次獨立測定的最大熒光進行平均，用在化合物添加之前測定的背景熒光進行修正，并標準化為對0.002mM的離子霉素(CALBIOCHEM)的應答。
這些結果包含在圖13中。特別地，圖13包含存在或不存在0.2mMIMP時，所測定的對L-谷氨酸的劑量應答曲線。在該圖中，每一個數(shù)值表示對4次獨立測定的最大熒光(經(jīng)過采用背景熒光進行修正)進行求和后的平均數(shù)。這些劑量-應答曲線與用T1R1/T1R3瞬時轉染的細胞所測定的曲線相對應。
還通過采用不同的L-氨基酸進行篩選來評估鮮味T1R1/T1R3味覺受體的選擇性。所獲得的結果表明，T1R1/T1R3被具有鮮味的L-氨基酸(L-谷氨酸和L-天冬氨酸)選擇性激活。
在圖14和圖15中顯示了當存在不同的L-氨基酸時I-17克隆應答實驗的測定結果。圖14顯示存在或不存在1mM的IMP時，使I-17細胞系與濃度為10mM的不同L-氨基酸接觸的實驗結果。
圖15包含存在0.2mM的IMP時所測定的對活性氨基酸的劑量-應答曲線。每一個數(shù)值表示4次獨立測定的平均值。
在這些實驗中所獲得的結果支持鮮味受體對鮮味刺激物的特異性和選擇性。雖然鮮味刺激物L-谷氨酸和L天冬氨酸在不同的濃度中都顯著激活T1R1/T1R3受體(見圖14和圖15)，但激活人類T1R1/T1R3受體的其它L-氨基酸只稍微激活該受體且是在高得多的濃度條件下。
因此，這些結果支持T1R1/T1R3受體對鮮味刺激物的選擇性以及所述誘導型穩(wěn)定表達系統(tǒng)在高通量篩選測定中使用時的適用性，所述高通量篩選測定采用自動熒光測定成像儀器來鑒定激活鮮味受體的化合物(例如L-谷氨酸或L-天冬氨酸)或增強L-谷氨酸激活鮮味受體的活性的化合物(例如5’-IMP或5’-GMP)或阻斷鮮味受體刺激物(例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸)對鮮味受體的激活的化合物。
采用所述測定而鑒定的化合物具有作為在食物和飲料組合物中用于模擬或阻斷鮮味刺激物的食用調料的潛在實用性。
實施例13lactisole抑制人類T1R2/T1R3和T1R1/T1R3的受體活性以及甜味和鮮味Lactisole是芳烷基羧酸，曾被認為是選擇性的甜味抑制劑(見例如Lindley(1986)的美國專利4,567,053；和Schiffrnan等，Chem Senses24439-447(1999))。測定存在各種濃度的lactisole時用T1R2/T1R3瞬時轉染的HEK-Gα15細胞對150mM蔗糖的應答。Lactisole抑制人類T1R2/T1R3的活性，其IC50為24μM。
T1R1/T1R3鮮味受體和T1R2/T1R3甜味受體可以具有共同的亞基。因此理論上曾認為，抑制T1R2/T1R3甜味受體的lactisole對T1R1/T1R3鮮味受體可能也具有類似的作用。本發(fā)明人檢驗了lactisole影響人類T1R1/T1R3對10mM的L-谷氨酸的應答的效果。如同lactisole對T1R2/T1R3甜味受體的作用一樣，lactisole抑制T1R1/T1R3，其IC50為165μM。由于毒蕈堿乙酰膽堿受體并沒有被lactisole所抑制，所以lactisole的抑制作用可能反映了其對T1R受體的拮抗作用，而不是例如對Gα15介導的信號轉導的非特異抑制。
然后，本發(fā)明人評估了lactisole對人類鮮味味覺的作用。根據(jù)Schiffman等(Chem.Senses 24439-447(1989))的方法，在存在1mM的lactisole和2mM的lactisole時，測定鮮味刺激物L-谷氨酸(存在或不存在0.2mM的IMP)、甜味刺激物蔗糖和D-色氨酸以及咸味刺激物氯化鈉的味覺閾值。毫摩爾濃度的lactisole顯著提高甜味刺激物和鮮味刺激物的檢測閾值，但并沒有提高咸味刺激物的檢測閾值。這些結果包含在圖16中。
總而言之，(i)這些發(fā)現(xiàn)進一步支持本發(fā)明人的以下假設T1R1/T1R3是唯一的鮮味受體，和(ii)T1R1/T1R3受體和T1R2/T1R3受體可能具有結構上相關的lactisole結合結構域。
盡管上文的詳細描述已經(jīng)記述了本發(fā)明的多個實施方案，但是應該理解，以上描述的目的只是為了對本發(fā)明進行闡述，而不是對所公開的發(fā)明進行限定。本發(fā)明只由后附權利要求來限定。
實施例14在甜味受體上對配體互相作用位點進行定位通過共表達T1R2R-H和人類T1R3，人類甜味受體的一部分(T1R2的N-末端結構域)被大鼠蛋白序列置換。對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜的應答的消除顯示人類T1R2的N-末端結構域對于識別天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜是必要的。類似地，通過共表達T1R2H-R和大鼠T1R3，大鼠T1R2的N-末端結構域也被人類蛋白序列置換。該嵌合受體獲得對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜產(chǎn)生應答的能力，表明人類T1R2的相同結構域足以(在甜味受體的情況中)識別那兩種甜味劑(圖22B)。這些體外功能性表達數(shù)據(jù)表明，重要的相互作用的決定簇位于N-末端胞外域。
相反地，用大鼠蛋白序列置換人類T1R2的任一半，并不影響對環(huán)己基氨基磺酸鹽的應答。實際上，當與T1R2共表達時，人類T1R3的C-末端結構域對于識別環(huán)己基氨基磺酸鹽是必要和充分的(圖22C)。已知家族C GPCR的跨膜結構域包含變構調節(jié)劑的結合位點(Gasparini，F(xiàn).，R.Kuhn和J.P.Pin，Curr Opin Pharmacol，2002年2月；2(1)43-49)。這在家族C GPCR中是第一次出現(xiàn)的，其中激動劑直接結合到跨膜結構域并在缺乏其它配體的情況下激活受體。
芳烷基羧酸lactisole是特異的人類甜味抑制劑，其對嚙齒動物的味覺具有生理作用。與味覺效果一致的是，在本發(fā)明人的測定系統(tǒng)中，lactisole抑制人類的T1R2/T1R3對蔗糖產(chǎn)生的應答，但不抑制大鼠的T1R2/T1R3對蔗糖產(chǎn)生的應答(圖22A)。采用T1R嵌合體對lactisole互相作用位點進行相同類型的定位實驗。和環(huán)己基氨基磺酸鹽一樣，lactisole需要人類T1R3的C-末端結構域來抑制受體對蔗糖和乙酰舒泛鉀產(chǎn)生應答(圖22D)。這一結果進一步證明T1R3的C-末端結構域在甜味受體功能中的重要性。檢驗了所有16種可能組合形式的嵌合體，而所有功能性組合所得到的結果與本發(fā)明人模型是一致的。
對T1R2和T1R3進行誘變研究，以限定在天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、紐甜和環(huán)己基氨基磺酸鹽的識別中的必要氨基酸。如果T1R2和T1R3負責識別不同的甜味劑，則T1R2的N-末端結構域中的突變將影響對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜的應答，但不影響對環(huán)己基氨基磺酸鹽的應答。而且，T1R3的C-末端結構域的突變將具有相反的效果。為了選擇T1R2的N-末端結構域中的關鍵氨基酸殘基，對T1R2序列與mGluR1進行比對(圖23A)。在對mGluR1的配體結合中起關鍵作用的8個殘基中(Kunishima，N.，等，Nature，2000.407(6807)971-977)，3個殘基在人類T1R2是保守的(S144、Y218和E302)。分別對這3個殘基進行突變，并檢驗所獲得的受體對不同甜味劑的應答。將Y218置換為A消除了所有所檢驗的甜味劑的應答，表明Y218對該受體的總體構象是重要的。包含S144A和E302A的兩個其它hT1R2變體選擇性地影響對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜的應答，但是不影響對環(huán)己基氨基磺酸鹽的應答。表達S144A和E302A hT1R2變體(與野生型hT1R3和Gα15共表達)的穩(wěn)定細胞系在生理濃度下并不對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯或紐甜產(chǎn)生應答，但是對環(huán)己基氨基磺酸鹽產(chǎn)生應答(圖23B)。
為了進一步對環(huán)己基氨基磺酸鹽-結合位點進行定位，將T1R3的C-末端結構域的3個胞外環(huán)融合。對人類和嚙齒動物的T1R3的比對揭示，在這3個胞外環(huán)中存在多個氨基酸差異(圖23C)。用大鼠的序列置換胞外環(huán)2或胞外環(huán)3，消除了環(huán)己基氨基磺酸鹽應答，但不影響蔗糖或天冬氨酰苯丙氨酸甲酯應答。相反地，置換胞外環(huán)1對環(huán)己基氨基磺酸鹽的應答并不產(chǎn)生明顯的影響，表明EC環(huán)(胞外環(huán))2和EC環(huán)3在識別環(huán)己基氨基磺酸鹽中起重要的作用(圖23D)。任何所述環(huán)的置換均沒有影響lactisole的抑制作用，表明不同的結合機制。總而言之，T1R2或T1R3中的氨基酸置換選擇性地干擾了由不同甜味劑誘導的活性，這與嵌合受體的結果是一致的。
以上結果表明人類甜味受體作為T1R2和T1R3的異聚復合物發(fā)揮功能。兩個亞基對于不同甜味劑的識別是必要的，這些數(shù)據(jù)表明，在受體上存在用于不同種類的激動劑的多個結合袋。多配體結合位點的存在為本發(fā)明的特異性結合的化合物提供了結構上的指導和界定。
實施例15受體-G蛋白相互作用的定位人類和大鼠甜味劑受體在它們的G蛋白偶聯(lián)效力上也存在差異。盡管人類和大鼠的受體都能夠有效地偶聯(lián)到Gα15/il，但是只有人類受體能夠有效地偶聯(lián)到Gα15上(圖24A)。這種物種上的差異允許采用上述相同的嵌合受體對受體G蛋白的相互相作用進行定位。T1R2似乎對于Gα15偶聯(lián)是關鍵的，但是T1R3則不然，這是因為用大鼠相應的序列置換人類T1R2的C-末端消除了偶聯(lián)，而用人類序列置換大鼠的T1R2的C-末端這半部分使該受體能夠偶聯(lián)Gα15并對蔗糖和乙酰舒泛鉀產(chǎn)生應答(圖24)；交換T1R3的C-末端序列對Gα15偶聯(lián)并沒有產(chǎn)生影響(圖24B)。這些觀測結果表明，T1R2在功能性表達系統(tǒng)的G蛋白偶聯(lián)中發(fā)揮重要作用。曾推測味導素(Wong，G.T.，K.S.Gannon和R.F.Margolskee，Nature，1996.381(6585)796-800頁)是對于甜味受體的內(nèi)源G蛋白，而T1R2可能是味覺細胞中負責體內(nèi)偶聯(lián)的亞基。GABABR是異聚的家族C GPCR的其它例子，同時一個亞基(GABABR1)負責配體結合，而另一個亞基(GABABR2)負責G蛋白偶聯(lián)(Margeta-Mitrovic，M.，Paroc Natl Acad SciUSA，2001.98(25)14643-14648；Margeta-Mitrovic，M.，Proc Natl AcadSci USA，2001.98(25)14649-14654)。甜味受體與GABABR是不同的，因為T1R2對于配體識別和G蛋白偶聯(lián)都是必要的。
實施例16lactisole對人類T1R1/T1R3具有拮抗作用并抑制人類的鮮味味覺曾假設，由于T1R1/T1R3作為異聚受體以及甜味受體發(fā)揮功能，因此lactisole應該對T1R1/T1R3活性具有類似的作用，這是因為T1R3是甜味受體和鮮味受體的共同亞基。實際上，lactisole對人類T1R1/T1R3具有拮抗作用(圖25A)。Lactisole起著T1R1/T1R3的非競爭性抑制劑的作用，這是因為IC50值顯然不依賴于谷氨酸的濃度(圖25B)，并且lactisole降低了受體的最大活性而沒有顯著改變激動劑的EC50(圖25C)。這些結果表明，lactisole結合在L-谷氨酸的不同位點，并與以下假設是一致的，即谷氨酸結合袋位于T1R1中。Lactisole似乎是甜味受體的競爭性抑制劑，這是因為它的IC50依賴于甜味劑的濃度，并且提高了甜味劑的EC50而沒有顯著影響最大活性。
由于Lactisole對HEK細胞中的內(nèi)源毒蕈堿乙酰膽堿受體沒有影響，或者對在HEK細胞中瞬時表達的小鼠苦味受體mT2R5沒有影響，因此Lactisole的抑制效果由T1R受體介導。如同T1R2/T1R3受體的情況一樣，在洗掉并重新刺激后，lactisole對T1R1/T1R3對鮮味刺激物產(chǎn)生的應答所產(chǎn)生的抑制作用是可逆的。
為了將受體活性與行為聯(lián)系起來，檢驗lactisole對人類鮮味味覺的作用。如所預期的那樣，毫摩爾濃度的lactisole顯著地提高了甜味刺激物和鮮味刺激物的檢測閾值，但沒有提高成味刺激物的檢測閾值(圖25D)。以前不知道Lactisole是鮮味抑制劑。受體活性和味覺結果之間的關聯(lián)表明T1R在人類的鮮味味覺中具有關鍵的作用。
實施例17環(huán)己基氨基磺酸鹽增強人類T1R1/T1R3受體的活性基于相同的T1R異聚模型(圖26)，曾推測環(huán)己基氨基磺酸鹽也將通過作用于T1R3而調節(jié)人類T1R1/T1R3鮮味受體的活性。盡管單獨的環(huán)己基氨基磺酸鹽對T1R1/T1R3沒有影響，但是在存在L-谷氨酸時它增強了受體的活性(圖27E)。這種作用是對人類T1R1/T1R3具有特異性的，這是因為存在碳酰膽堿時環(huán)己基氨基磺酸鹽對內(nèi)源的毒蕈堿乙酰膽堿受體的活性沒有影響(圖27E)。值得一提的是，環(huán)己基氨基磺酸鹽對甜味受體(圖23B)和鮮味受體具有類似的EC50。在存在或不存在IMP時，環(huán)己基氨基磺酸鹽可再現(xiàn)地將對L-谷氨酸的劑量-應答曲線向左遷移約兩倍(圖25F)。IMP具有更為顯著的增強受體的作用，并且在存在IMP時，可以觀察到環(huán)己基氨基磺酸鹽的作用(圖25F)，表明其與IMP具有增強受體的不同機制。由于IMP對甜味受體沒有影響，因此它可能結合到T1R1。包括蔗糖、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精和D-色氨酸等其它甜味劑對人類T1R1/T1R3的活性沒有影響。
總之，已證明，T1R2和T1R3均對功能性的甜味受體是必要的，天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜需要T1R2的N-末端胞外域，G蛋白偶聯(lián)需要T1R2的C-末端這半部分，以及環(huán)己基氨基磺酸鹽和lactisole需要T1R3的跨膜結構域。這些發(fā)現(xiàn)表明，T1R亞基在異聚復合物中具有不同的功能性作用并且在甜味受體上存在多個甜味劑相互作用位點。由于T1R3是甜味受體和鮮味受體的共同亞基，因而推測環(huán)己基氨基磺酸鹽和lactisole對鮮味受體具有作用，并證實了這種作用。而且，可以建立lactisole對受體活性的作用和味覺的關聯(lián)。基于這些發(fā)現(xiàn)，建立了T1R家族味覺受體的結構-功能關系的模型(圖26)。類似于天冬氨酰苯丙氨酸甲酯和紐甜，天然碳水化合物甜味劑結合到T1R2的N-末端區(qū)域，并且在甜味受體上還有其它配體結合位點，例如T1R2的跨膜結構域。類似地，鮮味受體作為異聚復合物發(fā)揮功能，并且MSG和IMP可能均結合到T1R1亞基上，這是因為MSG和IMP對甜味受體均不具有任何影響，而T1R1的跨膜結構域負責G蛋白的偶聯(lián)。
實施例18用于甜味調味劑的HTS程序將穩(wěn)定表達Gα15和hT1R2/hT1R3(Li，X.，Staszewski，L.，Xu，H.，Durick，K.，Zoller，M.，Adler，E.Proc Natl Acad Sci USA 2002，99，4692-4696，國際專利申請?zhí)朩O 03/001876 A2，以參考的方式將其全部內(nèi)容引入到本文中)的HEK293細胞系衍生物(Chandrashekar，J.，Mueller，K.L.，Hoon，M.A.，Adler，E.，F(xiàn)eng，L.，Guo，W，Zuker，C.S.，Ryba，NJ.，.Cel，12000，100，703-711)用來鑒定具有甜味增強特性的化合物。
首先基于化合物對hT1R2/hT1R3-HEK293-Gα15細胞系(Li等，請見上文)的活性對化合物進行選擇。在FLIPR儀器(熒光測定強度讀板儀(Fluorometric Intensity Plate Reader)，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上用自動熒光成像測定方法對活性進行測定(稱為FLIPR測定)。將來自一個克隆的細胞(指定為S-9細胞)接種到384孔板(約50,000個細胞/孔)的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有DMEM低葡萄糖(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10％經(jīng)透析的胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100單位/毫升的青霉素G和100μg/ml鏈霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)(Li等，請見上文)，還見國際專利申請WO 03/001876 A2)。使S-9細胞在37℃生長24小時。然后在室溫用鈣染料Fluo-3AM(Molecular Probes，Eugene，OR)(在磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中為4μM)將S-9細胞裝載1小時。用25μl D-PBS替換后，在室溫下通過添加25μl D-PBS在FLIPR儀器中進行刺激，所述D-PBS添加有相應濃度為所需最終水平兩倍的不同刺激物。通過測定最大熒光上升(使用480nm激發(fā)和535nm發(fā)射)，在用刺激前測定的基礎熒光強度標準化后，對受體活性進行定量。
對于劑量應答分析，提供在60nM～30μM范圍內(nèi)的10個不同濃度的刺激物(每個濃度具有2個重復)。將活性標準化為用400mM的D-果糖(引起最大受體應答的濃度)獲得的應答。用非線性回歸算法測定EC50(用Senomyx，Inc.軟件)，其中希爾斜率、底部漸近線和頂部漸近線是允許改變的。當采用可商購用于非線性回歸分析的軟件(例如GraphPad PRISM(San Diego，CA))來分析劑量-應答數(shù)據(jù)時也獲得了相同的結果。
為了測定細胞對不同刺激物的應答對hT1R2/hT1R3的依賴性，對所選擇的化合物針對HEK293-Gα15細胞(不表達人類甜味受體)進行同樣的分析。在FLIPR測定中，HEK293-Gα15細胞對D-果糖或者任何其它已知的甜味劑都沒有顯示出任何功能性應答。類似地，在FLIPR測定中，當采用HEK293-Gα15細胞時，本文中所描述的化合物也沒有誘導任何功能性應答。
實施例19通過人類志愿者進行甜味調味劑的口味增強測定感官味覺檢驗者的基本篩查檢驗潛在的調查對象排列和評定代表5種基本味道的溶液的強度的能力。調查對象排列和評定以下5種化合物各5種不同濃度的強度蔗糖(甜味)、氯化鈉(咸味)、檸檬酸(酸味)、咖啡因(苦味)和谷氨酸單鈉(鮮味)。每一次調查期間，調查對象品嘗總共25個樣品(5個樣品，每個樣品5種溶液類型)。在第一次調查期間，調查對象針對所討論的特征的強度排列出5種濃度。這種排列要用其它樣品另外重復4次。在第二次調查期間中，調查對象用稱為“標記的量值等級(LMS)”的線性等級評定每個樣品的5種濃度的強度。用強度(例如難以檢測、弱、中等、強、非常強和可想象到的最強)設置LMS，以幫助調查對象對樣品進行評定。在室溫下品嘗10ml體積的樣品并用3位數(shù)的盲法編碼進行標記。在每種樣品溶液(例如蔗糖、檸檬酸等)樣品中，以隨機平衡次序的方式提供樣品。
為了能夠被選中以參加檢驗，調查對象需要在合理出錯次數(shù)的情況下準確地排列和評定樣品的強度，大約有25個人成功地完成了這一程序。
在上述程序中被選中的調查對象被認為有資格進行初步檢驗程序。采用初步味覺檢驗來評估新的化合物的基本味道和異味(off-taste)的強度。一小組的調查對象(n＝5)品嘗大約5種濃度的化合物(一般在1μM～100μM范圍內(nèi)，按半對數(shù)周期，例如1μM、3μM、10μM、30μM和100μM)，所述化合物在水溶液中或緩沖液中，或者為評估增強作用而在4％(重量/體積，117mM)的蔗糖溶液中。為了有助于化合物分散在基于水的溶液中，樣品通常還包含0.1％的乙醇。調查對象在LMS上評定所述5種基本味道(甜味、咸味、酸味、苦味和鮮味)以及異味(例如化學物質、金屬、硫磺)。樣品是在室溫下提供，每份提供的體積為10ml。檢驗的目的是為了確定沒有令人不快的異味的最高濃度，以及確定在所檢驗的任何濃度下甜味是否存在明顯的增強。
如果化合物是有效的并且不產(chǎn)生令人不快的異味，那么該化合物將在更大規(guī)模的研究中由經(jīng)過專門訓練的人員(專家小組)進行檢驗。
例如，5位調查對象評估了在水中和在4％的蔗糖溶液中的1μM、3μM、10μM、30μM和100μM的XVI-3。含有化合物的所有樣品都由0.1％的乙醇進行平衡(有助于化合物的分散)。要求調查對象采用LMS評定所品嘗的每個樣品的基本味道和異味。當調查對象記錄任何樣品中的甜味時，他們被要求品嘗蔗糖的參考樣品(2％、4％、6％、8％的蔗糖)以估計相等值的甜味。
采用經(jīng)過專門訓練的人員(專家)小組進一步評估經(jīng)過初步味道檢驗進行檢驗的化合物。
從具有資格品嘗的調查對象組成的較大的組中選擇經(jīng)過專門訓練的人員小組的調查對象。采用蔗糖溶液通過排列和評定實驗進一步對調查對象進行與甜味有關的訓練。調查對象用甜味溶液完成一系列排列、評定并區(qū)分標準檢驗。在排列和評定實驗中，調查對象對蔗糖濃度為2％、4％、6％、8％(重量/體積)的蔗糖進行評估。
對由經(jīng)過專門訓練的人員檢驗的化合物與參考實驗的差異進行評估。給調查對象提供各種濃度(2％、4％、6％、8％(重量/體積)的蔗糖)的參考樣品并要求根據(jù)甜味與參考樣品的差異對樣品在-5至+5的范圍內(nèi)進行評定(分數(shù)-5＝甜味遠低于參考樣品；0＝甜味與參考樣品相同；+5＝甜味遠高于參考樣品)。待測樣品是含有各種含量的蔗糖和化合物的溶液。通常，各檢驗期間比較參考樣品(標為REF)和大量的待測樣品(標有3位數(shù)的盲法編碼)。各檢驗一般包括各種含有不同含量的蔗糖的樣品，以及一份參考樣品本身的盲樣以評估專家小組的準確度。在加有4％或6％蔗糖的樣品中對化合物與參考樣品進行比較檢驗。所有樣品都是在室溫下提供，體積為10ml。而且，為了確定單獨的化合物的甜味，以指定的濃度制備參考溶液并與蔗糖(2％)的閾值甜度進行比較。
實施例20用于鮮味調味劑的HTS程序采用GeneSwitch系統(tǒng)(Invitrogen)改造HEK-Gα15細胞，以誘導表達T1R1/T1R3。將用于人類T1R1和T1R3的由pGene衍生而來的抗零霉素的表達載體(質粒SXV603用于T1R1和質粒SXV611用于T1R3)和攜帶有GeneSwitch蛋白的抗嘌呤霉素的由pSwitch衍生而來的載體(質粒SXV628)線性化并共轉染到HEK-Gα15細胞系中。選擇抗零霉素和抗嘌呤霉素的克隆，并進行擴大培養(yǎng)，用各種量的米非司酮進行誘導，并采用鈣成像檢驗對鮮味刺激物的應答。在0.5μg/ml嘌呤霉素(CAL BIOCHEM)和100μg/ml零霉素(Invitrogen)中，于37℃在添加有GlutaMAX、10％經(jīng)過透析的FBS和3μg/ml殺稻瘟素的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中對細胞進行選擇。將抗性克隆擴大培養(yǎng)，在用10-10M米非司酮進行誘導后，采用熒光顯微鏡按照Li等(PNAS(2002)99(7)4692-4696)的方法檢測所述細胞對鮮味刺激物的應答。對于在FLIPR儀器(Molecular Devise)上進行的自動熒光測定成像，在存在10-10M米非司酮時，將來自一個克隆(指定為克隆I-17)的細胞接種到96孔板或384孔板(約80,000個細胞/孔)中，并溫育48小時。然后在室溫用鈣染料fluo-4-AM(MolecularProbes)(在PBS中為3μM)對細胞裝載，裝載1.5小時。用50μl PBS替換后，在室溫通過添加加有不同刺激物的50μl PBS進行刺激。對來自4個獨立測定的最大熒光進行平均計算，用在化合物添加之前測定的背景熒光進行修正，并將其標準化為0.002mM的離子霉素(CALBIOCHEM)的應答。
實施例21用于鮮味調味劑的味覺檢驗感官味覺檢驗者的基本檢查采用在文獻中記載的三角檢驗對品嘗者進行訓練，以評估以下標準味道化合物的水溶液(各為5mL，“假的(swash)和真的(spit)”)的味道用于甜味品嘗的蔗糖(50mM)；用于酸味品嘗的檸檬酸(5mM)或乳酸(20mM)；用于咸味品嘗的NaCl(12mM)；用于苦味品嘗的奎寧(10μM)或咖啡因(1mM)和用于鮮味或“美味”品嘗的谷氨酸單鈉(8mM)。
針對鮮味品嘗進行的訓練為品嘗者提供1～3組6份MSG和/或MSG-IMP樣品，其中MSG的范圍為3mM～60mM，而IMP的范圍為0μM～200μM，各按照濃度逐步上升的順序放在盤子中。這種訓練讓品嘗者進行劑量應答評估。另外一組由相同的6份樣品組成，但是以隨機的順序放置。然后要求品嘗者按強度逐步上升的順序排列所述樣品，并對鮮味的強度進行評定。
選擇合格的味覺調查對象用5對味覺樣品，讓品嘗者進行標準的二選一(2AFC)檢驗。要求他們對從兩份樣品(一對)中選擇最有鮮味的樣品。該檢驗包括兩組容易的樣品對、兩組中等難度的樣品對和一組具有難度的樣品對。選擇能夠區(qū)分中等難度的樣品對的品嘗者作為調查對象。
通過一小組的調查對象進行鮮味增強劑候選物(UEC)的嘗試性/定性味道檢驗在水中(如果不溶，使用最小量的乙醇)制備適當濃度(一般為1μM～50μM)的味覺樣品；單獨品嘗30μM和/或50μM的UEC的鮮味和其它屬性。對篩查名單上的適宜的標記量值等級(LMS)的那些味覺屬性進行評定；如果UEC不具有/具有較低的鮮味和其它味道，然后再進行區(qū)別檢驗；比較一定濃度的MSG，例如12mM的MSG和12mM的MSG+30μM UEC，以確定是否存在任何的增強；評定篩查名單上在適宜LMS上所品嘗出的鮮味強度；改變UEC和/或MSG的濃度，以發(fā)現(xiàn)最理想的組合；決定在專家小組篩選中使用的溶液；記錄包括研究的描述、樣品的制備、樣品的排列、名單和調查對象的簽字頁、數(shù)據(jù)錄入項和評估等所有的程序和數(shù)據(jù)。
UEC的2AFC專家小組篩查采用由嘗試性品嘗產(chǎn)生的程序通過合格的調查對象進行專家小組篩選；記錄所有程序和數(shù)據(jù)；準備統(tǒng)計學上具有顯著性結論的總結報告(如果有)。
實施例22化合物2725761和化合物3756807的定量品嘗檢驗按照以上提供的程序進行化合物2725761和化合物3756807的定量品嘗檢驗。發(fā)現(xiàn)這兩個化合物除了它們的鮮味強度的相加效應之外，它們均對MSG也具有一定的增強效果。
實施例23化合物2725761和化合物3756807的合成由化合物2725761和化合物3756807相應的酸和胺，根據(jù)實施例22所示制備化合物2725761和化合物3756807。采用常規(guī)的方法(例如堿性和酸性水洗或者制備型HPLC)對產(chǎn)物進行純化。根據(jù)常用的分析方法(例如NMR和LCMS)確認這些化合物的結構。該方法也可以用于合成在表1～表5中顯示的化合物。
實施例24
基于細胞的測定于37℃，使細胞生長并保持在Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，所述培養(yǎng)基添加有10％FBS和MEM非必需氨基酸(GibcoBRL)；用于Gα15細胞的培養(yǎng)基還包含3μg/ml的殺稻瘟素(Gibco BRL)。對于鈣成像實驗，首先將細胞接種在48孔的組織培養(yǎng)板(約3萬個細胞/孔)上，并用Mirus TransIt-293(Pan Vera)進行轉染。通過與RFP表達載體共轉染而估算的轉染效率通常約為60％。為了使谷氨酸誘導的和葡萄糖誘導的脫敏最小化，在轉染后約24小時，用添加有GlutaMAX和10％經(jīng)過透析的FBS(Gibco BRL)的低葡萄糖DMEM代替所添加的DMEM。再經(jīng)過24小時后，在室溫用鈣染料Fluo-4-AM(Molecular Probes)(在Dulbecco氏PBS緩沖液(DPBS，GibcoBRL)中為3μM)對細胞進行裝載1.5小時。用100μl的DPBS替換后，在室溫通過添加100μl添加有味覺刺激物的DPBS進行刺激。在配備有反相10X/0.5LWD平場熒光物鏡(Zeiss)和冷卻式CCD照相機(Princeton Instruments)的Axiovert S100顯微鏡上監(jiān)測鈣動員。在480nm激發(fā)和535nm發(fā)射的條件下獲得熒光圖像，并用Imaging Workbench 4.0軟件(Axon Instruments)進行分析。通過計算添加刺激物后30秒的響應細胞數(shù)目而對T1R1受體的活性進行定量。
序列表<110>西諾米克斯公司<120>T1R異寡聚味覺受體、表達所述受體的細胞系以及味覺化合物<130>FCI05US3117<140>PCT/US2004/025459<141>2004-08-06<150>60/494,071<151>2003-08-06<150>60/552,064<151>2004-03-09<160>33<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>1Ser Val Ser Thr Trp1 5<210>2<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<221>變體<222>1、3、4、6、7、8、11、12、13<223>在位置1，Xaa可以為Thr或Arg在位置3，Xaa可以為Phe或Leu在位置4，Xaa可以為Arg、Gln或Pro在位置6，Xaa可以為Arg或Thr在位置7，Xaa可以為Ser、Pro或Val在位置8，Xaa可以為Val、Glu、Arg、Lys或Thr在位置11，Xaa可以為Ala或Glu
在位置12，Xaa可以為Trp或Leu在位置13，Xaa可以為Arg、His或Gly<400>2Xaa Cys Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Glu1 5 10<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<221>變體<222>1、3、4、7、9、10、11、13、14、15<223>在位置1，Xaa可以為Leu或Gln在位置3，Xaa可以為Glu、Gly或Thr在位置4，Xaa可以為Asn、Arg或Cys在位置7，Xaa可以為Arg或Glu在位置9，Xaa可以為Arg或Lys在位置10，Xaa可以為Cys、Gly或Phe在位置11，Xaa可以為Val、Leu或Ile在位置13，Xaa可以為Phe或Leu在位置14，Xaa可以為Ala或Ser在位置15，Xaa可以為Met或Leu<400>3Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa1 5 10 15<210>4<211>858<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>4Met Pro Gly Leu Ala Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Glu1 5 10 15Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu Ser Gln Gln Phe Lys Ala Gln20 25 30Gly Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu35 40 45Ala Thr Leu Asn Gln Arg Thr Gln Pro Asn Gly Ile Leu Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala Met Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80
Glu Glu Ile Asn Asn Gly Ser Ala Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Thr Met Lys Pro100 105 110Ser Leu Met Phe Met Ala Lys Val Gly Ser Gln Ser Ile Ala Ala Tyr115 120 125Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro130 135 140His Ser Ser Glu Leu Ala Leu Ile Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe145 150 155 160Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Ser Ala Ser Met Asp Arg Leu Ser Asp165 170 175Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val180 185 190Gln Leu Gln Ala Val Val Thr Leu Leu Gln Asn Phe Ser Trp Asn Trp195 200 205Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Gly Leu Ser210 215 220Ile Phe Ser Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu225 230 235 240Gly Leu Val Pro Gln His Asp Thr Ser Gly Gln Gln Leu Gly Lys Val245 250 255Val Asp Val Leu Arg Gln Val Asn Gln Ser Lys Val Gln Val Val Val260 265 270Leu Phe Ala Ser Ala Arg Ala Val Tyr Ser Leu Phe Ser Tyr Ser Ile275 280 285Leu His Asp Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ser Trp Leu290 295 300Thr Ser Asp Leu Val Met Thr Leu Pro Asn Ile Ala Arg Val Gly Thr305 310 315 320Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Leu Leu Pro Glu Phe Ser His325 330 335Tyr Val Glu Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ala Asp Pro Thr Phe Cys Ala340 345 350Ser Leu Lys Ala Glu Leu Asp Leu Glu Glu Arg Val Met Gly Pro Arg355 360 365Cys Ser Gln Cys Asp Tyr Ile Met Leu Gln Asn Leu Ser Ser Gly Leu370 375 380Met Gln Asn Leu Ser Ala Gly Gln Leu His His Gln Ile Phe Ala Thr385 390 395 400Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln405 410 415Cys Asn Val Ser His Cys His Thr Ser Glu Pro Val Gln Pro Trp Gln420 425 430Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn Met Ser Phe Arg Ala Arg Asp Leu Thr435 440 445Leu Gln Phe Asp Ala Lys Gly Ser Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys450 455 460Met Trp Val Trp Gln Ser Pro Thr Pro Val Leu His Thr Val Gly Thr465 470 475 480Phe Asn Gly Thr Leu Gln Leu Gln His Ser Lys Met Tyr Trp Pro Gly485 490 495Asn Gln Val Pro Val Ser Gln Cys Ser Arg Gln Cys Lys Asp Gly Gln500 505 510Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp515 520 525Cys Lys Ala Gly Ser Tyr Arg Lys His Pro Asp Asp Phe Thr Cys Thr530 535 540
Pro Cys Gly Lys Asp Gln Trp Ser Pro Glu Lys Ser Thr Thr Cys Leu545 550 555 560Pro Arg Arg Pro Lys Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Ser565 570 575Leu Leu Leu Leu Leu Cys Leu Val Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Leu580 585 590Gly Leu Phe Val His Tyr Trp Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly595 600 605Gly Ser Leu Phe Cys Phe Gly Leu Ile Cys Leu Gly Leu Phe Cys Leu610 615 620Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Arg Pro Arg Ser Ala Ser Cys Leu Ala625 630 635 640Gln Gln Pro Met Ala His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu645 650 655Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser660 665 670Trp Ala Asn Trp Leu Cys Ser Tyr Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu675 680 685Val Val Leu Leu Ala Thr Leu Val Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr690 695 700Leu Met Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp Gln Val Leu Pro705 710 715 720Thr Glu Val Leu Glu His Cys Arg Met Arg Ser Trp Val Ser Leu Gly725 730 735Leu Val His Ile Thr Asn Ala Val Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly740 745 750Thr Phe Leu Val Gln Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly755 760 765Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Ile Trp Val Ser Phe Val770 775 780Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Ala Tyr Gln Pro Ala Val Gln Met785 790 795 800Gly Ala Ile Leu Phe Cys Ala Leu Gly Ile Leu Ala Thr Phe His Leu805 810 815Pro Lys Cys Tyr Val Leu Leu Trp Leu Pro Glu Leu Asn Thr Gln Glu820 825 830Phe Phe Leu Gly Arg Ser Pro Lys Glu Ala Ser Asp Gly Asn Ser Gly835 840 845Ser Ser Glu Ala Thr Arg Gly His Ser Glu850 855<210>5<211>841<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>5Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser1 5 10 15Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe20 25 30Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser35 40 45
Gly Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg50 55 60Ser Cys Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg65 70 75 80Leu Gly Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile85 90 95Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val100 105 110Tyr Ala Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu115 120 125Leu Gln Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile130 135 140Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser145 150 155 160Pro Phe Leu Val Pro Met Ile Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu165 170 175Ser Val Lys Arg Gln Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp180 185 190Lys Tyr Gln Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu Gln Lys Phe Gly Trp195 200 205Thr Trp Ile Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Gly210 215 220Val Gln Ala Leu Glu Asn Gln Ala Thr Gly Gln Gly Ile Cys Ile Ala225 230 235 240Phe Lys Asp Ile Met Pro Phe Ser Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Met245 250 255Gln Cys Leu Met Arg His Leu Ala Gln Ala Gly Ala Thr Val Val Val260 265 270Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe phe Glu Ser Val Val275 280 285Leu Thr Asn Leu Thr Gly Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Ala290 295 300Leu Ser Arg His Ile Thr Gly Val Pro Gly Ile Gln Arg Ile Gly Met305 310 315 320Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Lys Arg Ala Val Pro Gly Leu Lys Ala325 330 335Phe Glu Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Asp Lys Lys Ala Pro Arg pro Cys340 345 350His Lys Gly Ser Trp Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Gln355 360 365Ala Phe Met Ala His Thr Met Pro Lys Leu Lys Ala Phe Ser Met Ser370 375 380Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu385 390 395 400His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Gly Arg Val405 410 415Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu Gln Ile His Lys Val His Phe Leu Leu420 425 430His Lys Asp Thr Val Ala Phe Asn Asp Asn Arg Asp Pro Leu Ser Ser435 440 445Tyr Asn Ile Ile Ala Trp Asp Trp Asn Gly Pro Lys Trp Thr Phe Thr450 455 460Val Leu Gly Ser Ser Thr Trp Ser Pro Val Gln Leu Asn Ile Asn Glu465 470 475 480Thr Lys Ile Gln Trp His Gly Lys Asp Asn Gln Val Pro Lys Ser Val485 490 495Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe500 505 510
His His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu515 520 525Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp530 535 540Ala Pro Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu545 550 555 560Ala Leu Arg Glu His Thr Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu565 570 575Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu580 585 590Asp Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met595 600 605Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly610 615 620Glu Pro Thr Arg Pro Ala Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu625 630 635 640Gly Phe Thr Ile Phe Leu Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu645 650 655Ile Ile Ile Phe Lys Phe Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala660 665 670Trp Val Gln Asn His Gly Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala675 680 685Ala Gln Leu Leu Ile Cys Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu690 695 700Pro Ala Arg Glu Tyr Gln Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys705 710 715 720Thr Glu Thr Asn Ser Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly725 730 735Leu Leu Ser Ile Ser Ala Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu740 745 750Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe755 760 765Asn Phe Val Ser Trp Ile Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp770 775 780Gly Lys Tyr Leu Pro Ala Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu785 790 795 800Ser Ser Gly Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu805 810 815Cys Arg Pro Asp Leu Asn Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln820 825 830Asp Tyr Thr Arg Arg Cys Gly Ser Thr835 840<210>6<211>839<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>6Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp1 5 10 15Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp20 25 30
Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile35 40 45Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val50 55 60Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu65 70 75 80Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr85 90 95Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu100 105 110Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr115 120 125Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser130 135 140Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro145 150 155 160Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg165 170 175Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu180 185 190Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val195 200 205Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly210 215 220Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu225 230 235 240Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg245 250 255Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val260 265 270Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val275 280 285Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp290 295 300Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly305 310 315 320Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser325 330 335Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg340 345 350Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn355 360 365Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val370 375 380Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His385 390 395 400Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr405 410 415Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu420 425 430Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu435 440 445Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser450 455 460Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp465 470 475 480Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser485 490 495
Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val500 505 510Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His515 520 525Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser530 535 540Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu545 550 555 560Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly565 570 575Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln580 585 590Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu595 600 605Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro610 615 620Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys625 630 635 640Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val645 650 655Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp660 665 670Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu675 680 685Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro690 695 700Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys705 710 715 720Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu725 730 735Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu740 745 750Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe755 760 765Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser770 775 780Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu785 790 795 800Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu805 810 815Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln820 825 830Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp835<210>7<211>852<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>7Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His1 5 10 15
Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys20 25 30Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu35 40 45Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro100 105 110Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr115 120 125Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro130 135 140His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe145 150 155 160Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala165 170 175Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val180 185 190Gln Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp195 200 205Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser210 215 220Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu225 230 235 240Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val245 250 255Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu260 265 270Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile275 280 285Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu290 295 300Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr305 310 315 320Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln325 330 335Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser340 345 350Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln355 360 365Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly370 375 380Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val385 390 395 400Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro405 410 415Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn420 425 430Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly435 440 445Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser450 455 460Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr465 470 475 480
Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val485 490 495Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys500 505 510Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser515 520 525Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp530 535 540Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg545 550 555 560Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu565 570 575Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His580 585 590His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys595 600 605Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe610 615 620Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser625 630 635 640His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala645 650 655Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu660 665 670Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala675 680 685Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro690 695 700Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val705 710 715 720His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr725 730 735Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg740 745 750Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met755 760 765Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn770 775 780Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu785 790 795 800Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu805 810 815Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly820 825 830Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln835 840 845Gly Lys His Glu850<210>8<211>2526<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體
<400>8atgctgctct gcacggctcg cctggtcggc ctgcagcttc tcatttcctg ctgctgggcc60tttgcctgcc atagcacgga gtcttctcct gacttcaccc tccccggaga ttacctcctg120gcaggcctgt tccctctcca ttctggctgt ctgcaggtga ggcacagacc cgaggtgacc180ctgtgtgaca ggtcttgtag cttcaatgag catggctacc acctcttcca ggctatgcgg240cttggggttg aggagataaa caactccacg gccctgctgc ccaacatcac cctggggtac300cagctgtatg atgtgtgttc tgactctgcc aatgtgtatg ccacgctgag agtgctctcc360ctgccagggc aacaccacat agagctccaa ggagaccttc tccactattc ccctacggtg420ctggcagtga ttgggcctga cagcaccaac cgtgctgcca ccacagccgc cctgctgagc480cctttcctgg tgcccatgat tagctatgcg gccagcagcg agacgctcag cgtgaagcgg540cagtatccct ctttcctgcg caccatcccc aatgacaagt accaggtgga gaccatggtg600ctgctgctgc agaagttcgg gtggacctgg atctctctgg ttggcagcag tgacgactat660gggcagctag gggtgcaggc actggagaac caggccactg gtcaggggat ctgcattgct720ttcaaggaca tcatgccctt ctctgcccag gtgggcgatg agaggatgca gtgcctcatg780cgccacctgg cccaggccgg ggccaccgtc gtggttgttt tttccagccg gcagttggcc840agggtgtttt tcgagtccgt ggtgctgacc aacctgactg gcaaggtgtg ggtcgcctca900gaagcctggg ccctctccag gcacatcact ggggtgcccg ggatccagcg cattgggatg960gtgctgggcg tggccatcca gaagagggct gtccctggcc tgaaggcgtt tgaagaagcc1020tatgcccggg cagacaagaa ggcccctagg ccttgccaca agggctcctg gtgcagcagc1080aatcagctct gcagagaatg ccaagctttc atggcacaca cgatgcccaa gctcaaagcc1140ttctccatga gttctgccta caacgcatac cgggctgtgt atgcggtggc ccatggcctc1200caccagctcc tgggctgtgc ctctggagct tgttccaggg gccgagtcta cccctggcag1260cttttggagc agatccacaa ggtgcatttc cttctacaca aggacactgt ggcgtttaat1320gacaacagag atcccctcag tagctataac ataattgcct gggactggaa tggacccaag1380tggaccttca cggtcctcgg ttcctccaca tggtctccag ttcagctaaa cataaatgag1440accaaaatcc agtggcacgg aaaggacaac caggtgccta agtctgtgtg ttccagcgac1500tgtcttgaag ggcaccagcg agtggttacg ggtttccatc actgctgctt tgagtgtgtg1560ccctgtgggg ctgggacctt cctcaacaag agtgacctct acagatgcca gccttgtggg1620aaagaagagt gggcacctga gggaagccag acctgcttcc cgcgcactgt ggtgtttttg1680gctttgcgtg agcacacctc ttgggtgctg ctggcagcta acacgctgct gctgctgctg1740ctgcttggga ctgctggcct gtttgcctgg cacctagaca cccctgtggt gaggtcagca1800gggggccgcc tgtgctttct tatgctgggc tccctggcag caggtagtgg cagcctctat1860ggcttctttg gggaacccac aaggcctgcg tgcttgctac gccaggccct ctttgccctt1920ggtttcacca tcttcctgtc ctgcctgaca gttcgctcat tccaactaat catcatcttc1980aagttttcca ccaaggtacc tacattctac cacgcctggg tccaaaacca cggtgctggc2040ctgtttgtga tgatcagctc agcggcccag ctgcttatct gtctaacttg gctggtggtg2100tggaccccac tgcctgctag ggaataccag cgcttccccc atctggtgat gcttgagtgc2160acagagacca actccctggg cttcatactg gccttcctct acaatggcct cctctccatc2220agtgcctttg cctgcagcta cctgggtaag gacttgccag agaactacaa cgaggccaaa2280tgtgtcacct tcagcctgct cttcaacttc gtgtcctgga tcgccttctt caccacggcc2340agcgtctacg acggcaagta cctgcctgcg gccaacatga tggctgggct gagcagcctg2400agcagcggct tcggtgggta ttttctgcct aagtgctacg tgatcctctg ccgcccagac2460ctcaacagca cagagcactt ccaggcctcc attcaggact acacgaggcg ctgcggctcc2520acctga 2526<210>9<211>2559<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>9atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg60
gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg atgaaggggg actacgtgct gggggggctg120ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct180gtgtgcacca ggttctcctc aaacggcctg ctctgggcac tggccatgaa aatggccgtg240gaggagatca acaacaagtc ggatctgctg cccgggctgc gcctgggcta cgacctcttt300gatacgtgct cggagcctgt ggtggccatg aagcccagcc tcatgttcct ggccaaggca360ggcagccgcg acatcgccgc ctactgcaac tacacgcagt accagccccg tgtgctggct420gtcatcgggc cccactcgtc agagctcgcc atggtcaccg gcaagttctt cagcttcttc480ctcatgcccc aggtcagcta cggtgctagc atggagctgc tgagcgcccg ggagaccttc540ccctccttct tccgcaccgt gcccagcgac cgtgtgcagc tgacggccgc cgcggagctg600ctgcaggagt tcggctggaa ctgggtggcc gccctgggca gcgacgacga gtacggccgg660cagggcctga gcatcttctc ggccctggcc gcggcacgcg gcatctgcat cgcgcacgag720ggcctggtgc cgctgccccg tgccgatgac tcgcggctgg ggaaggtgca ggacgtcctg780caccaggtga accagagcag cgtgcaggtg gtgctgctgt tcgcctccgt gcacgccgcc840cacgccctct tcaactacag catcagcagc aggctctcgc ccaaggtgtg ggtggccagc900gaggcctggc tgacctctga cctggtcatg gggctgcccg gcatggccca gatgggcacg960gtgcttggct tcctccagag gggtgcccag ctgcacgagt tcccccagta cgtgaagacg1020cacctggccc tggccaccga cccggccttc tgctctgccc tgggcgagag ggagcagggt1080ctggaggagg acgtggtggg ccagcgctgc ccgcagtgtg actgcatcac gctgcagaac1140gtgagcgcag ggctaaatca ccaccagacg ttctctgtct acgcagctgt gtatagcgtg1200gcccaggccc tgcacaacac tcttcagtgc aacgcctcag gctgccccgc gcaggacccc1260gtgaagccct ggcagctcct ggagaacatg tacaacctga ccttccacgt gggcgggctg1320ccgctgcggt tcgacagcag cggaaacgtg gacatggagt acgacctgaa gctgtgggtg1380tggcagggct cagtgcccag gctccacgac gtgggcaggt tcaacggcag cctcaggaca1440gagcgcctga agatccgctg gcacacgtct gacaaccaga agcccgtgtc ccggtgctcg1500cggcagtgcc aggagggcca ggtgcgccgg gtcaaggggt tccactcctg ctgctacgac1560tgtgtggact gcgaggcggg cagctaccgg caaaacccag acgacatcgc ctgcaccttt1620tgtggccagg atgagtggtc cccggagcga agcacacgct gcttccgccg caggtctcgg1680ttcctggcat ggggcgagcc ggctgtgctg ctgctgctcc tgctgctgag cctggcgctg1740ggccttgtgc tggctgcttt ggggctgttc gttcaccatc gggacagccc actggttcag1800gcctcggggg ggcccctggc ctgctttggc ctggtgtgcc tgggcctggt ctgcctcagc1860gtcctcctgt tccctggcca gcccagccct gcccgatgcc tggcccagca gcccttgtcc1920cacctcccgc tcacgggctg cctgagcaca ctcttcctgc aggcggccga gatcttcgtg1980gagtcagaac tgcctctgag ctgggcagac cggctgagtg gctgcctgcg ggggccctgg2040gcctggctgg tggtgctgct ggccatgctg gtggaggtcg cactgtgcac ctggtacctg2100gtggccttcc cgccggaggt ggtgacggac tggcacatgc tgcccacgga ggcgctggtg2160cactgccgca cacgctcctg ggtcagcttc ggcctagcgc acgccaccaa tgccacgctg2220gcctttctct gcttcctggg cactttcctg gtgcggagcc agccgggctg ctacaaccgt2280gcccgtggcc tcacctttgc catgctggcc tacttcatca cctgggtctc ctttgtgccc2340ctcctggcca atgtgcaggt ggtcctcagg cccgccgtgc agatgggcgc cctcctgctc2400tgtgtcctgg gcatcctggc tgccttccac ctgcccaggt gttacctgct catgcggcag2460ccagggctca acacccccga gttcttcctg ggagggggcc ctggggatgc ccaaggccag2520aatgacggga acacaggaaa tcaggggaaa catgagtga 2559<210>10<211>2518<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>10atggggccca gggcaaagac catctgctcc ctgttcttcc tcctatgggt cctggctgag60ccggctgaga actcggactt ctacctgcct ggggattacc tcctgggtgg cctcttctcc120ctccatgcca acatgaaggg cattgttcac cttaacttcc tgcaggtgcc catgtgcaag180
gagtatgaag tgaaggtgat aggctacaac ctcatgcagg ccatgcgctt cgcggtggag240gagatcaaca atgacagcag cctgctgcct ggtgtgctgc tgggctatga gatcgtggat300gtgtgctaca tctccaacaa tgtccagccg gtgctctact tcctggcaca cgaggacaac360ctccttccca tccaagagga ctacagtaac tacatttccc gtgtggtggc tgtcattggc420cctgacaact ccgagtctgt catgactgtg gccaattcct ctccctattt ctccttccac480agatcaccta cagcgccatc agcgatgagc tgcgagacaa ggtgcgcttc ccggctttgc540tgcgtaccac acccagcgcc gaccaccacg tcgaggccat ggtgcagctg atgctgcact600tccgctggaa ctggatcatt gtgctggtga gcagcgacac ctatggccgc gacaatggca660gctgcttggc gagcgcgtgg cccggcgcga catctgcatc gccttccagg agacgctgcc720cacactgcag cccaaccaga acatgacgtc agaggagcgc cagcgcctgg tgaccattgt780ggacaagctg cagcagagca cagcgcgcgt cgtggtcgtg ttctcgcccg acctgaccct840gtaccacttc ttcaatgagg tgctgcgcca gaacttcacg ggcgccgtgt ggatcgcctc900cgagtcctgg gccatcgacc cggtcctgca caacctcacg gagctgggcc acttgggcac960cttcctgggc atcaccatcc agagcgtgcc catcccgggc ttcagtgagt tccgcgagtg1020gggcccacag gctgggccgc cacccctcag caggaccagc cagagctata cctgcaacca1080ggagtgcgac aactgcctga acgccacctt gtccttcaac accattctca ggctctctgg1140ggagcgtgtc gtctacagcg tgtactctgc ggtctatgct gtggcccatg ccctgcacag1200cctcctcggc tgtgacaaaa gcacctgcac caagagggtg gtctacccct ggcagctgct1260tgaggagatc tggaaggtca acttcactct cctggaccac caaatcttct tcgacccgca1320aggggacgtg gctctgcact tggagattgt ccagtggcaa tgggaccgga gccagaatcc1380cttccagagc gtcgcctcct actaccccct gcagcgacag ctgaagaaca tccaagacat1440ctcctggcac accgtcaaca acacgatccc tatgtccatg tgttccaaga ggtgccagtc1500agggcaaaag aagaagcctg tgggcatcca cgtctgctgc ttcgagtgca tcgactgcct1560tcccggcacc ttcctcaacc acactgaaga tgaatatgaa tgccaggcct gcccgaataa1620cgagtggtcc taccagagtg agacctcctg cttcaagcgg cagctggtct tcctggaatg1680gcatgaggca cccaccatcg ctgtggccct gctggccgcc ctgggcttcc tcagcaccct1740ggccatcctg gtgatattct ggaggcactt ccagacaccc atagttcgct cggctggggg1800ccccatgtgc ttcctgatgc tgacactgct gctggtggca tacatggtgg tcccggtgta1860cgtggggccg cccaaggtct ccacctgcct ctgccgccag gccctctttc ccctctgctt1920cacaatttgc atctcctgta tcgccgtgcg ttctttccag atcgtctgcg ccttcaagat1980ggccagccgc ttcccacgcg cctacagcta ctgggtccgc taccaggggc cctacgtctc2040tatggcattt atcacggtac tcaaaatggt cattgtggta attggcatgc tggccacggg2100cctcagtccc accacccgta ctgaccccga tgaccccaag atcacaattg tctcctgtaa2160ccccaactac cgcaacagcc tgctgttcaa caccagcctg gacctgctgc tctcagtggt2220gggtttcagc ttcgcctaca tgggcaaaga gctgcccacc aactacaacg aggccaagtt2280catcaccctc agcatgacct tctatttcac ctcatccgtc tccctctgca ccttcatgtc2340tgcctacagc ggggtgctgg tcaccatcgt ggacctcttg gtcactgtgc tcaacctcct2400ggccatcagc ctgggctact tcggccccaa gtgctacatg atcctcttct acccggagcg2460caacacgccc gcctacttca acagcatgat ccagggctac accatgagga gggactag 2518<210>11<211>2577<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>11atgccgggtt tggctatctt gggcctcagt ctggctgctt tcctggagct tgggatgggg60tcctctttgt gtctgtcaca gcaattcaag gcacaagggg actatatatt gggtggacta120tttcccctgg gcacaactga ggaggccact ctcaaccaga gaacacagcc caacggcatc180ctatgtacca ggttctcgcc ccttggtttg ttcctggcca tggctatgaa gatggctgta240gaggagatca acaatggatc tgccttgctc cctgggctgc gactgggcta tgacctgttt300gacacatgct cagagccagt ggtcaccatg aagcccagcc tcatgttcat ggccaaggtg360ggaagtcaaa gcattgctgc ctactgcaac tacacacagt accaaccccg tgtgctggct420
gtcattggtc cccactcatc agagcttgcc ctcattacag gcaagttctt cagcttcttc480ctcatgccac aggtcagcta tagtgccagc atggatcggc taagtgaccg ggaaacattt540ccatccttct tccgcacagt gcccagtgac cgggtgcagc tgcaggccgt tgtgacactg600ttgcagaatt tcagctggaa ctgggtggct gccttaggta gtgatgatga ctatggccgg660gaaggtctga gcatcttttc tggtctggcc aactcacgag gtatctgcat tgcacacgag720ggcctggtgc cacaacatga cactagtggc caacaattgg gcaaggtggt ggatgtgcta780cgccaagtga accaaagcaa agtacaggtg gtggtgctgt ttgcatctgc ccgtgctgtc840tactcccttt ttagctacag catccttcat gacctctcac ccaaggtatg ggtggccagt900gagtcctggc tgacctctga cctggtcatg acacttccca atattgcccg tgtgggcact960gttcttgggt ttctgcagcg cggtgcccta ctgcctgaat tttcccatta tgtggagact1020cgccttgccc tagctgctga cccaacattc tgtgcctccc tgaaagctga gttggatctg1080gaggagcgcg tgatggggcc acgctgttca caatgtgact acatcatgct acagaacctg1140tcatctgggc tgatgcagaa cctatcagct gggcagttgc accaccaaat atttgcaacc1200tatgcagctg tgtacagtgt ggctcaggcc cttcacaaca ccctgcagtg caatgtctca1260cattgccaca catcagagcc tgttcaaccc tggcagctcc tggagaacat gtacaatatg1320agtttccgtg ctcgagactt gacactgcag tttgatgcca aagggagtgt agacatggaa1380tatgacctga agatgtgggt gtggcagagc cctacacctg tactacatac tgtaggcacc1440ttcaacggca cccttcagct gcagcactcg aaaatgtatt ggccaggcaa ccaggtgcca1500gtctcccagt gctcccggca gtgcaaagat ggccaggtgc gcagagtaaa gggctttcat1560tcctgctgct atgactgtgt ggactgcaag gcagggagct accggaagca tccagatgac1620ttcacctgta ctccatgtgg caaggatcag tggtccccag aaaaaagcac aacctgctta1680cctcgcaggc ccaagtttct ggcttggggg gagccagctg tgctgtcact tctcctgctg1740ctttgcctgg tgctgggcct gacactggct gccctggggc tctttgtcca ctactgggac1800agccctcttg ttcaggcctc aggtgggtca ctgttctgct ttggcctgat ctgcctaggc1860ctcttctgcc tcagtgtcct tctgttccca ggacgaccac gctctgccag ctgccttgcc1920caacaaccaa tggctcacct ccctctcaca ggctgcctga gcacactctt cctgcaagca1980gccgagatct ttgtggagtc tgagctgcca ctgagttggg caaactggct ctgcagctac2040cttcggggcc cctgggcttg gctggtggta ctgctggcca ctcttgtgga ggctgcacta2100tgtgcctggt acttgatggc tttccctcca gaggtggtga cagattggca ggtgctgccc2160acggaggtac tggaacactg ccgcatgcgt tcctgggtca gcctgggctt ggtgcacatc2220accaatgcag tgttagcttt cctctgcttt ctgggcactt tcctggtaca gagccagcct2280ggtcgctata accgtgcccg tggcctcacc ttcgccatgc tagcttattt catcatctgg2340gtctcttttg tgcccctcct ggctaatgtg caggtggcct accagccagc tgtgcagatg2400ggtgctatct tattctgtgc cctgggcatc ctggccacct tccacctgcc caaatgctat2460gtacttctgt ggctgccaga gctcaacacc caggagttct tcctgggaag gagccccaag2520gaagcatcag atgggaatag tggtagtagt gaggcaactc ggggacacag tgaatga 2577<210>12<211>137<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>12Pro Ser Pro Phe Arg Asp Ile Val Ser Tyr Pro Asp Lys Ile Ile Leu1 5 10 15Gly Cys Phe Met Asn Leu Lys Thr Ser Ser Val Ser Phe Val Leu Leu20 25 30Leu Leu Leu Cys Leu Leu Cys Phe Ile Phe Ser Tyr Met Gly Lys Asp35 40 45Leu Pro Lys Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Ala Ile Thr Phe Cys Leu Leu50 55 60Leu Leu Ile Leu Thr Trp Ile Ile Phe Thr Thr Ala Ser Leu Leu Tyr
65 70 75 80Gln Gly Lys Tyr Ile His Ser Leu Asn Ala Leu Ala Val Leu Ser Ser85 90 95Ile Tyr Ser Phe Leu Leu Trp Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Ile Ile100 105 110Ile Phe Gln Pro Gln Lys Asn Thr Gln Lys Tyr Phe Gln Gly Leu Ile115 120 125Gln Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Ser Gln130 135<210>13<211>242<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>13Phe Ala Val Asn Tyr Asn Thr Pro Val Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro1 5 10 15Met Cys Phe Leu Ile Leu Gly Cys Leu Ser Leu Cys Ser Ile Ser Val20 25 30Phe Phe Tyr Phe Glu Arg Pro Thr Glu Ala Phe Cys Ile Leu Arg Phe35 40 45Met Pro Phe Leu Leu Phe Tyr Ala Val Cys Leu Ala Cys Phe Ala Val50 55 60Arg Ser Phe Gln Ile Val Ile Ile Phe Lys Ile Ala Ala Lys Phe Pro65 70 75 80Arg Val His Ser Trp Trp Met Lys Tyr His Gly Gln Trp Leu Val Ile85 90 95Ser Met Thr Phe Val Leu Gln Ala Val Val Ile Val Ile Gly Phe Ser100 105 110Ser Asn Pro Pro Leu Pro Tyr Xaa Xaa Phe Val Ser Tyr Pro Asp Lys115 120 125Ile Ile Leu Gly Cys Asp Val Asn Leu Asn Met Ala Ser Thr Ser Phe130 135 140Phe Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ile Leu Cys Phe Thr Phe Ser Tyr Met145 150 155 160Gly Lys Asp Leu Pro Lys Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Ala Ile Thr Phe165 170 175Cys Leu Leu Leu Leu Ile Leu Thr Trp Ile Ile Phe Ala Thr Ala Phe180 185 190Met Leu Tyr His Gly Lys Tyr Ile His Thr Leu Asn Ala Leu Ala Val195 200 205Leu Ser Ser Ala Tyr Cys Phe Leu Leu Trp Tyr Phe Leu Pro Lys Cys210 215 220Tyr Ile Ile Ile Phe Gln Pro His Lys Asn Thr Gln Lys Tyr Phe Gln225 230 235 240Leu Ser<210>14<211>165<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>14Lys Lys Gln Gly Pro Glu Val Asp Ile Phe Ile Val Ser Val Thr Ile1 5 10 15Leu Cys Ile Ser Val Leu Gly Val Ala Val Gly Pro Pro Glu Pro Ser20 25 30Gln Asp Leu Asp Phe Tyr Met Asp Ser Ile Val Leu Glu Cys Ser Asn35 40 45Thr Leu Ser Pro Gly Ser Phe Ile Glu Leu Cys Tyr Val Cys Val Leu50 55 60Ser Val Leu Cys Phe Phe Phe Ser Tyr Met Gly Lys Asp Leu Pro Ala65 70 75 80Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Met Val Tyr Met85 90 95Ile Ser Trp Ile Ser Phe Phe Thr Val Tyr Leu Ile Ser Arg Gly Pro100 105 110Phe Thr Val Ala Ala Tyr Val Cys Ala Thr Leu Val Ser Val Leu Ala115 120 125Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Leu Pro Lys Ile Tyr Ile Ile Val Leu Lys130 135 140Pro Gln Met Asn Thr Thr Ala His Phe Gln Asn Cys Ile Gln Met Tyr145 150 155 160Thr Met Ser Lys Gln165<210>15<211>236<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>15Ala Pro Lys Ser Ser Gln Arg Xaa Leu Arg Arg Thr Arg Leu Xaa Leu1 5 10 15Glu Trp Asp His Pro Met Ser Val Ala Leu Leu Phe Phe Leu Val Cys20 25 30Cys Leu Leu Met Thr Ser Ser Ser Ala Val Ile Leu Leu Leu Asn Ile35 40 45Asn Thr Pro Val Ala Lys Ser Ala Gly Gly Xaa Thr Cys Xaa Leu Lys50 55 60Leu Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Met Ser Ser Xaa Cys His Phe Gly65 70 75 80Gln Pro Ser Pro Leu Ala Ser Lys Leu Lys Gln Pro Gln Phe Thr Phe85 90 95Ser Phe Thr Val Cys Leu Ala Cys Asn Arg Cys Ala Leu Ala Thr Gly100 105 110His Leu His Phe Xaa Ile Arg Val Ala Leu Pro Pro Ala Tyr Asn Xaa115 120 125Trp Ala Lys Asn His Gly Pro Xaa Ala Thr Ile Phe Ile Ala Ser Ala130 135 140
Ala Ile Leu Cys Val Leu Cys Leu Arg Val Ala Val Gly Pro Pro Gln145 150 155 160Pro Ser Gln Asx Leu Asx Phe Xaa Thr Asn Ser Ile Xaa Leu Xaa Xaa165 170 175Ser Asn Thr Leu Ser Pro Gly Ser Phe Val Glu Leu Cys Asn Val Ser180 185 190Leu Leu Ser Ala Val Cys Phe Val Phe Ser Xaa Met Gly Lys Asx Leu195 200 205Pro Ala Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Met Val210 215 220Asn Xaa Ile Ser Trp Ile Ser Phe Phe Thr Val Tyr225 230 235<210>16<211>838<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>16Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp1 5 10 15Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp20 25 30Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile35 40 45Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val50 55 60Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu65 70 75 80Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr85 90 95Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu100 105 110Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr115 120 125Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser130 135 140Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro145 150 155 160Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg165 170 175Phe Pro Ala Leu Leu Arg Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Val Glu180 185 190Ala Met Val Gln Leu Met Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val195 200 205Leu Val Ser Ser Asp Thr Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly210 215 220Glu Arg Val Ala Arg Arg Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu225 230 235 240Pro Thr Leu Gln Pro Asn Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg245 250 255Leu Val Thr Ile Val Asp Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val260 265 270
Val Val Phe Ser Pro Asp Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val275 280 285Leu Arg Gln Asn Phe Thr Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp290 295 300Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu Gly His Leu Gly305 310 315 320Thr Phe Leu Gly Ile Thr Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser325 330 335Glu Phe Arg Glu Trp Gly Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg340 345 350Thr Ser Gln Ser Tyr Thr Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn355 360 365Ala Thr Leu Ser Phe Asn Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val370 375 380Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His385 390 395 400Ser Leu Leu Gly Cys Asp Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr405 410 415Pro Trp Gln Leu Leu Glu Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu420 425 430Asp His Gln Ile Phe Phe Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu435 440 445Glu Ile Val Gln Trp Gln Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser450 455 460Val Ala Ser Tyr Tyr Pro Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp465 470 475 480Ile Ser Trp His Thr Val Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser485 490 495Lys Arg Cys Gln Ser Gly Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val500 505 510Cys Cys Phe Glu Cys Ile Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His515 520 525Thr Glu Asp Glu Tyr Glu Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser530 535 540Tyr Gln Ser Glu Thr Ser Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu545 550 555 560His Glu Val Pro Thr Ile Val Val Ala Ile Leu Ala Ala Leu Gly Phe565 570 575Phe Ser Thr Leu Ala Ile Leu Phe Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr580 585 590Pro Met Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Val595 600 605Pro Leu Leu Leu Ala Phe Gly Met Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro610 615 620Thr Val Phe Ser Cys Phe Cys Arg Gln Ala Phe Phe Thr Val Cys Phe625 630 635 640Ser Ile Cys Leu Ser Cys Ile Thr Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys645 650 655Val Phe Lys Met Ala Arg Arg Leu Pro Ser Ala Tyr Ser Phe Trp Met660 665 670Arg Tyr His Gly Pro Tyr Val Phe Val Ala Phe Ile Thr Ala Ile Lys675 680 685Val Ala Leu Val Val Gly Asn Met Leu Ala Thr Thr Ile Asn Pro Ile690 695 700Gly Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Asn Ile Met Ile Leu Ser Cys His705 710 715 720Pro Asn Tyr Arg Asn Gly Leu Leu Phe Asn Thr Ser Met Asp Leu Leu725 730 735
Leu Ser Val Leu Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro740 745 750Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Ser755 760 765Phe Thr Ser Ser Ile Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Val His Asp Gly770 775 780Val Leu Val Thr Ile Met Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Phe Leu785 790 795 800Ala Ile Gly Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe805 810 815Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly820 825 830Tyr Thr Met Arg Lys Ser835<210>17<211>844<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>17Met Gly Pro Gln Ala Arg Thr Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu His1 5 10 15Val Leu Pro Lys Pro Gly Lys Leu Val Glu Asn Ser Asp Phe His Leu20 25 30Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Thr Leu His Ala Asn Val35 40 45Lys Ser Ile Ser His Leu Ser Tyr Leu Gln Val Pro Lys Cys Asn Glu50 55 60Phe Thr Met Lys Val Leu Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe65 70 75 80Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn Cys Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu85 90 95Leu Gly Tyr Glu Met Val Asp Val Cys Tyr Leu Ser Asn Asn Ile His100 105 110Pro Gly Leu Tyr Phe Leu Ala Gln Asp Asp Asp Leu Leu Pro Ile Leu115 120 125Lys Asp Tyr Ser Gln Tyr Met Pro His Val Val Ala Val Ile Gly Pro130 135 140Asp Asn Ser Glu Ser Ala Ile Thr Val Ser Asn Ile Leu Ser His Phe145 150 155 160Leu Ile Pro Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Lys Leu Arg Asp165 170 175Lys Arg His Phe Pro Ser Met Leu Arg Thr Val Pro Ser Ala Thr His180 185 190His Ile Glu Ala Met Val Gln Leu Met Val His Phe Gln Trp Asn Trp195 200 205Ile Val Val Leu Val Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Asn Ser His210 215 220Leu Leu Ser Gln Arg Leu Thr Lys Thr Ser Asp Ile Cys Ile Ala Phe225 230 235 240Gln Glu Val Leu Pro Ile Pro Glu Ser Ser Gln Val Met Arg Ser Glu245 250 255
Glu Gln Arg Gln Leu Asp Asn Ile Leu Asp Lys Leu Arg Arg Thr Ser260 265 270Ala Arg Val Val Val Val Phe Ser Pro Glu Leu Ser Leu Tyr Ser Phe275 280 285Phe His Glu Val Leu Arg Trp Asn Phe Thr Gly Phe Val Trp Ile Ala290 295 300Ser Glu Ser Trp Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu305 310 315 320Arg His Thr Gly Thr Phe Leu Gly Val Thr Ile Gln Arg Val Ser Ile325 330 335Pro Gly Phe Ser Gln Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Pro Gly Tyr Pro340 345 350Val Pro Asn Thr Thr Asn Leu Arg Thr Thr Cys Asn Gln Asp Cys Asp355 360 365Ala Cys Leu Asn Thr Thr Lys Ser Phe Asn Asn Ile Leu Ile Leu Ser370 375 380Gly Glu Arg Val Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala385 390 395 400His Ala Leu His Arg Leu Leu Gly Cys Asn Arg Val Arg Cys Thr Lys405 410 415Gln Lys Val Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Arg Glu Ile Trp His Val Asn420 425 430Phe Thr Leu Leu Gly Asn Arg Leu Phe Phe Asp Gln Gln Gly Asp Met435 440 445Pro Met Leu Leu Asp Ile Ile Gln Trp Gln Trp Asp Leu Ser Gln Asn450 455 460Pro Phe Gln Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Lys Arg Leu Thr465 470 475 480Tyr Ile Asn Asn Val Ser Trp Tyr Thr Pro Asn Asn Thr Val Pro Val485 490 495Ser Met Cys Ser Lys Ser Cys Gln Pro Gly Gln Met Lys Lys Ser Val500 505 510Gly Leu His Pro Cys Cys Phe Glu Cys Leu Asp Cys Met Pro Gly Thr515 520 525Tyr Leu Asn Arg Ser Ala Asp Glu Phe Asn Cys Leu Ser Cys Pro Gly530 535 540Ser Met Trp Ser Tyr Lys Asn Asp Ile Thr Cys Phe Gln Arg Arg Pro545 550 555 560Thr Phe Leu Glu Trp Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu565 570 575Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe580 585 590Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met595 600 605Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro610 615 620Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala625 630 635 640Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg645 650 655Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg660 665 670Ala Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala675 680 685Phe Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala690 695 700Thr Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile705 710 715 720
Thr Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn725 730 735Thr Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr740 745 750Met Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr755 760 765Leu Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe770 775 780Met Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val785 790 795 800Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys805 810 815Cys Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe820 825 830Asn Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp835 840<210>18<211>855<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>18Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His1 5 10 15Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys20 25 30Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu35 40 45Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro100 105 110Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr115 120 125Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro130 135 140His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe145 150 155 160Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala165 170 175Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val180 185 190Gln Lau Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp195 200 205Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser210 215 220Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu225 230 235 240
Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val245 250 255Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu260 265 270Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile275 280 285Ser Ser Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu290 295 300Thr Ser Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr305 310 315 320Val Leu Gly Phe Leu Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln325 330 335Tyr Val Lys Thr His Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser340 345 350Ala Leu Gly Glu Arg Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln355 360 365Arg Cys Pro Gln Cys Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly370 375 380Leu Asn His His Gln Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val385 390 395 400Ala Gln Ala Leu His Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro405 410 415Ala Gln Asp Pro Val Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn420 425 430Leu Thr Phe His Val Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly435 440 445Asn Val Asp Met Glu Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser450 455 460Val Pro Arg Leu His Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr465 470 475 480Glu Arg Leu Lys Ile Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val485 490 495Ser Arg Cys Ser Arg Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys500 505 510Gly Phe His Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser515 520 525Tyr Arg Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp530 535 540Glu Trp Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg545 550 555 560Phe Leu Glu Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Ser Leu Leu Leu565 570 575Leu Leu Cys Leu Val Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe580 585 590Val His Tyr Trp Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Ser Leu595 600 605Phe Cys Phe Gly Leu Ile Cys Leu Gly Leu Phe Cys Leu Ser Val Leu610 615 620Leu Phe Pro Gly Arg Pro Arg Ser Ala Ser Cys Leu Ala Gln Gln Pro625 630 635 640Met Ala His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln645 650 655Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asn660 665 670Trp Leu Cys Ser Tyr Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu675 680 685Leu Ala Thr Leu Val Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr Leu Met Ala690 695 700
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>19Met Pro Glv Leu Ala Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Glu1 5 10 15Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu Ser Gln Gln Phe Lys Ala Gln20 25 30Gly Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu35 40 45Ala Thr Leu Asn Gln Arg Thr Gln Pro Asn Gly Ile Leu Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala Met Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80Glu Glu Ile Asn Asn Gly Ser Ala Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Thr Met Lys Pro100 105 l10Ser Leu Met Phe Met Ala Lys Val Gly Ser Gln Ser Ile Ala Ala Tyr115 120 125Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro130 135 140His Ser Ser Glu Leu Ala Leu Ile Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe145 150 155 160Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Ser Ala Ser Met Asp Arg Leu Ser Asp165 170 175Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val180 185 190Gln Leu Gln Ala Val Val Thr Leu Leu Gln Asn Phe Ser Trp Asn Trp195 200 205
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>20Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser1 5 10 15Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe20 25 30Thr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser35 40 45Gly Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg50 55 60Ser Cys Ser Phe Asn Glu His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg65 70 75 80Leu Gly Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Ile85 90 95Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Asp Ser Ala Asn Val100 105 110Tyr Ala Thr Leu Arg Val Leu Ser Leu Pro Gly Gln His His Ile Glu115 120 125Leu Gln Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr Val Leu Ala Val Ile130 135 140Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser145 150 155 160Pro Phe Leu Val Pro Met Ile Ser Tyr Ala Ala Ser Ser Glu Thr Leu165 170 175
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>21Met Leu Phe Trp Ala Ala His Leu Leu Leu Ser Leu Gln Leu Val Tyr1 5 10 15Cys Trp Ala Phe Ser Cys Gln Arg Thr Glu Ser Ser Pro Gly Phe Ser20 25 30Leu Pro Gly Asp Phe Leu Leu Ala Gly Leu Phe Ser Leu His Gly Asp35 40 45Cys Leu Gln Val Arg His Arg Pro Leu Val Thr Ser Cys Asp Arg Pro50 55 60Asp Ser Phe Asn Gly His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg Phe65 70 75 80Thr Val Glu Glu Ile Asn Asn Ser Ser Ala Leu Leu Pro Asn Ile Thr85 90 95Leu Gly Tyr Glu Leu Tyr Asp Val Cys Ser Glu Ser Ala Asn Val Tyr100 105 110Ala Thr Leu Arg Val Leu Ala Leu Gln Gly Pro Arg His Ile Glu Ile115 120 125Gln Lys Asp Leu Arg Asn His Ser Ser Lys Val Val Ala Phe Ile Gly130 135 140Pro Asp Asn Thr Asp His Ala Val Thr Thr Ala Ala Leu Leu Gly Pro145 150 155 160
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>22Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp1 5 10 15Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp20 25 30Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile35 40 45Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val50 55 60Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu65 70 75 80Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr85 90 95Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu100 105 110Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr115 120 125Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser130 135 140
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Pro Leu Leu Leu Ala Phe Gly Met Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro610 615 620Thr Val Phe Ser Cys Phe Cys Arg Gln Ala Phe Phe Thr Val Cys Phe625 630 635 640Ser Ile Cys Leu Ser Cys Ile Thr Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys645 650 655Val Phe Lys Met Ala Arg Arg Leu Pro Ser Ala Tyr Ser Phe Trp Met660 665 670Arg Tyr His Gly Pro Tyr Val Phe Val Ala Phe Ile Thr Ala Ile Lys675 680 685Val Ala Leu Val Val Gly Asn Met Leu Ala Thr Thr Ile Asn Pro Ile690 695 700Gly Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Asn Ile Met Ile Leu Ser Cys His705 710 715 720Pro Asn Tyr Arg Asn Gly Leu Leu Phe Asn Thr Ser Met Asp Leu Leu725 730 735Leu Ser Val Leu Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro740 745 750Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Ser755 760 765Phe Thr Ser Ser Ile Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Val His Asp Gly770 775 780Val Leu Val Thr Ile Met Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Phe Leu785 790 795 800Ala Ile Gly Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe805 810 815Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Ser Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly820 825 830Tyr Thr Met Arg Lys Ser835<210>23<211>843<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>23Met Gly Pro Gln Ala Arg Thr Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu His1 5 10 15Val Leu Pro Lys Pro Gly Lys Leu Val Glu Asn Ser Asp Phe His Leu20 25 30Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Thr Leu His Ala Asn Val35 40 45Lys Ser Ile Ser His Leu Ser Tyr Leu Gln Val Pro Lys Cys Asn Glu50 55 60Phe Thr Met Lys Val Leu Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe65 70 75 80Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn Cys Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu85 90 95Leu Gly Tyr Glu Met Val Asp Val Cys Tyr Leu Ser Asn Asn Ile His100 105 110Pro Gly Leu Tyr Phe Leu Ala Gln Asp Asp Asp Leu Leu Pro Ile Leu115 120 125
Lys Asp Tyr Ser Gln Tyr Met Pro His Val Val Ala Val Ile Gly Pro130 135 140Asp Asn Ser Glu Ser Ala Ile Thr Val Ser Asn Ile Leu Ser His Phe145 150 155 160Leu Ile Pro Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Lys Leu Arg Asp165 170 175Lys Arg His Phe Pro Ser Met Leu Arg Thr Val Pro Ser Ala Thr His180 185 190His Ile Glu Ala Met Val Gln Leu Met Val His Phe Gln Trp Asn Trp195 200 205Ile Val Val Leu Val Ser Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Glu Asn Ser His210 215 220Leu Leu Ser Gln Arg Leu Thr Lys Thr Ser Asp Ile Cys Ile Ala Phe225 230 235 240Gln Glu Val Leu Pro Ile pro Glu Ser Ser Gln Val Met Arg Ser Glu245 250 255Glu Gln Arg Gln Leu Asp Asn Ile Leu Asp Lys Leu Arg Arg Thr Ser260 265 270Ala Arg Val Val Val Val phe Ser pro Glu Leu Ser Leu Tyr Ser Phe275 280 285phe His Glu Val Leu Arg Trp Asn Phe Thr Gly Phe Val Trp Ile Ala290 295 300Ser Glu Ser Trp Ala Ile Asp Pro Val Leu His Asn Leu Thr Glu Leu305 310 315 320Arg His Thr Gly Thr Phe Leu Gly Val Thr Ile Gln Arg Val Ser Ile325 330 335Pro Gly Phe Ser Gln Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Pro Gly Tyr Pro340 345 350Val Pro Asn Thr Thr Asn Leu Arg Thr Thr Cys Asn Gln Asp Cys Asp355 360 365Ala Cys Leu Asn Thr Thr Lys Ser Phe Asn Asn Ile Leu Ile Leu Ser370 375 380Gly Glu Arg Val Val Tyr Ser Val Tyr Ser Ala Val Tyr Ala Val Ala385 390 395 400His Ala Leu His Arg Leu Leu Gly Cys Asn Arg Val Arg Cys Thr Lys405 410 415Gln Lys Val Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Arg Glu Ile Trp His Val Asn420 425 430Phe Thr Leu Leu Gly Asn Arg Leu Phe Phe Asp Gln Gln Gly Asp Met435 440 445Pro Met Leu Leu Asp Ile Ile Gln Trp Gln Trp Asp Leu Ser Gln Asn450 455 460Pro Phe Gln Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Pro Thr Ser Lys Arg Leu Thr465 470 475 480Tyr Ile Asn Asn Val Ser Trp Tyr Thr Pro Asn Asn Thr Val Pro Val485 490 495Ser Met Cys Ser Lys Ser Cys Gln Pro Gly Gln Met Lys Lys Ser Val500 505 510Gly Leu His Pro Cys Cys Phe Glu Cys Leu Asp Cys Met Pro Gly Thr515 520 525Tyr Leu Asn Arg Ser Ala Asp Glu Phe Asn Cys Leu Ser Cys Pro Gly530 535 540Ser Met Trp Ser Tyr Lys Asn Asp Ile Thr Cys Phe Gln Arg Arg Pro545 550 555 560Thr Phe Leu Glu Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu565 570 575Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp580 585 590
Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys595 600 605Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val610 615 620Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu625 630 635 640Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser645 650 655Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala660 665 670Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe675 680 685Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr690 695 700Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr705 710 715 720Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr725 730 735Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met740 745 750Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu755 760 765Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met770 775 780Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr785 790 795 800Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys805 810 815Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn820 825 830Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp835 840<210>24<211>853<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>24Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His1 5 10 15Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys20 25 30Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu35 40 45Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro100 105 110
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Cys Leu Val Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His580 585 590Tyr Trp Asp Ser Pro Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Ser Leu Phe Cys595 600 605Phe Gly Leu Ile Cys Leu Gly Leu Phe Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe610 615 620Pro Gly Arg Pro Arg Ser Ala Ser Cys Leu Ala Gln Gln Pro Met Ala625 630 635 640His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala645 650 655Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asn Trp Leu660 665 670Cys Ser Tyr Leu Arg Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala675 680 685Thr Leu Val Glu Ala Ala Leu Cys Ala Trp Tyr Leu Met Ala Phe Pro690 695 700Pro Glu Val Val Thr Asp Trp Gln Val Leu Pro Thr Glu Val Leu Glu705 710 715 720His Cys Arg Met Arg Ser Trp Val Ser Leu Gly Leu Val His Ile Thr725 730 735Asn Ala Val Leu Ala Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Gln740 745 750Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met755 760 765Leu Ala Tyr Phe Ile Ile Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn770 775 780Val Gln Val Ala Tyr Gln Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Ile Leu Phe785 790 795 800Cys Ala Leu Gly Ile Leu Ala Thr Phe His Leu Pro Lys Cys Tyr Val805 810 815Leu Leu Trp Leu Pro Glu Leu Asn Thr Gln Glu Phe Phe Leu Gly Arg820 825 830Ser Pro Lys Glu Ala Ser Asp Gly Asn Ser Gly Ser Ser Glu Ala Thr835 840 845Arg Gly His Ser Glu850<210>25<211>857<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>25Met Pro Gly Leu Ala Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Phe Leu Glu1 5 10 15Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu Ser Gln Gln Phe Lys Ala Gln20 25 30Gly Asp Tyr Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu35 40 45Ala Thr Lau Asn Gln Arg Thr Gln Pro Asn Gly Ile Leu Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala Met Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>26Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp1 5 10 15Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp20 25 30Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile35 40 45
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>27Met Leu Leu Cys Thr Ala Arg Leu Val Gly Leu Gln Leu Leu Ile Ser1 5 10 15Cys Cys Trp Ala Phe Ala Cys His Ser Thr Glu Ser Ser Pro Asp Phe20 25 30
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Cys Ser Ser Asp Cys Leu Glu Gly His Gln Arg Val Val Thr Gly Phe500 505 510His His Cys Cys Phe Glu Cys Val Pro Cys Gly Ala Gly Thr Phe Leu515 520 525Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys Gln Pro Cys Gly Lys Glu Glu Trp530 535 540Ala Pro Glu Gly Ser Gln Thr Cys Phe Pro Arg Thr Val Val Phe Leu545 550 555 560Glu Trp His Glu Ala Pro Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu565 570 575Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe580 585 590Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met595 600 605Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly610 615 620Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu625 630 635 640Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile645 650 655Val Cys Ala Phe Lys Met Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr660 665 670Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val675 680 685Leu Lys Met Val Ile Val Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser690 695 700Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser705 710 715 720Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp725 730 735Leu Leu Leu Ser Val Val Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu740 745 750Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr755 760 765Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr770 775 780Ser Gly Val Leu Val Thr Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn785 790 795 800Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile805 810 815Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile820 825 830Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg Asp835 840<210>28<211>1123<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>28Leu Gln Val Arg His Arg Pro Glu Val Thr Leu Cys Asp Arg Ser Cys1 5 10 15
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>29Met Gly Pro Arg Ala Lys Thr Ile Cys Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp1 5 10 15Val Leu Ala Glu Pro Ala Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp20 25 30Tyr Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile35 40 45Val His Leu Asn Phe Leu Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val50 55 60Lys Val Ile Gly Tyr Asn Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu65 70 75 80Glu Ile Asn Asn Asp Ser Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr85 90 95Glu Ile Val Asp Val Cys Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu100 105 110Tyr Phe Leu Ala His Glu Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr115 120 125Ser Asn Tyr Ile Ser Arg Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp ASn Ser130 135 140Glu Ser Val Met Thr Val Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro145 150 155 160Gln Ile Thr Tyr Ser Ala Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg
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<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>30Met Leu Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu Hisl 5 10 15Pro Gly Thr Gly Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys20 25 30Gly Asp Tyr Val Leu Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu35 40 45Ala Gly Leu Arg Ser Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg50 55 60Phe Ser Ser Asn Gly Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val65 70 75 80Glu Glu Ile Asn Asn Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly85 90 95Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro100 105 110Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr115 120 125Cys Asn Tyr Thr Gln Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro130 135 140His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe145 150 155 160Leu Met Pro Gln Val Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala165 170 175Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val180 185 190Gln Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp195 200 205Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser210 215 220Ile Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu225 230 235 240Gly Leu Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val245 250 255Gln Asp Val Leu His Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu260 265 270Leu Phe Ala Ser Val His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile
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<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>31Met Val Arg Leu Leu Leu Ile Phe Phe Pro Met Ile Phe Leu Glu Met1 5 10 15Ser Ile Leu Pro Arg Met Pro Asp Arg Lys Val Leu Leu Ala Gly Ala20 25 30Ser Ser Gln Arg Ser Val Ala Arg Met Asp Gly Asp Val Ile Ile Gly35 40 45Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Pro Ala Glu Lys Val Pro Glu50 55 60Arg Lys Cys Gly Glu Ile Arg Glu Gln Tyr Gly Ile Gln Arg Val Glu65 70 75 80Ala Met Phe His Thr Leu Asp Lys Ile Asn Ala Asp Pro Val Leu Leu85 90 95Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ser Cys Trp His Ser100 105 110Ser Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe Ile Arg Asp Ser Leu Ile115 120 125Ser Ile Arg Asp Glu Lys Asp Gly Leu Asn Arg Cys Leu Pro Asp Gly130 135 140Gln Thr Leu Pro Pro Gly Arg Thr Lys Lys Pro Ile Ala Gly Val Ile145 150 155 160Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu Leu Gln165 170 175Leu Phe Asp Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Leu180 185 190Ser Asp Lys Thr Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Val Val Pro Ser Asp195 200 205Thr Leu Gln Ala Arg Ala Met Leu Asp Ile Val Lys Arg Tyr Asn Trp210 215 220Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Ser Gly225 230 235 240Met Asp Ala Phe Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Gly Leu Cys Ile Ala245 250 255His Ser Asp Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Lys Ser Phe Asp Arg260 265 270Leu Leu Arg Lys Leu Arg Glu Arg Leu Pro Lys Ala Arg Val Val Val275 280 285Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Ser Ala Met Arg290 295 300Arg Leu Gly Val Val Gly Glu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Asp Gly Trp305 310 315 320Ala Asp Arg Asp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Glu Val Glu Ala Asn Gly325 330 335Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Glu Val Arg Ser Phe Asp Asp340 345 350Tyr Phe Leu Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Thr Arg Asn Pro Trp Phe355 360 365Pro Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Pro Gly His Leu370 375 380Leu Glu Asn Pro Asn Phe Lys Lys Val Cys Thr Gly Asn Glu Ser Leu
385 390 395 400Glu Glu Asn Tyr Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile Asn Ala405 410 415Ile Tyr Ala Met Ala His Gly Leu Gln Asn Met His His Ala Leu Cys420 425 430Pro Gly His Val Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp Gly Arg435 440 445Lys Leu Leu Asp Phe Leu Ile Lys Ser Ser Phe Val Gly Val Ser Gly450 455 460Glu Glu Val Trp Phe Asp Glu Lys Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp465 470 475 480Ile Met Asn Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Asn Arg Tyr Asp Tyr Val His485 490 495Val Gly Thr Trp His Glu Gly Val Leu Asn Ile Asp Asp Tyr Lys Ile500 505 510Gln Met Asn Lys Ser Gly Met Val Arg Ser Val Cys Ser Glu Pro Cys515 520 525Leu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser Cys Cys530 535 540Trp Ile Cys Thr Ala Cys Lys Glu Asn Glu Phe Val Gln Asp Glu Phe545 550 555 560Thr Cys Arg Ala Cys Asp Leu Gly Trp Trp Pro Asn Ala Glu Leu Thr565 570 575Gly Cys Glu Pro Ile Pro Val Arg Tyr Leu Glu Leu Arg Glu His Thr580 585 590Ser Trp Val Leu Leu Ala Ala Asn Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu595 600 605Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ala Trp His Leu Asp Thr Pro Val Val Arg610 615 620Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Leu Met Leu Gly Ser Leu Ala Ala625 630 635 640Gly Ser Gly Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly Glu Pro Thr Arg Pro Ala645 650 655Cys Leu Leu Arg Gln Ala Leu Phe Ala Leu Gly Phe Thr Ile Phe Leu660 665 670Ser Cys Leu Thr Val Arg Ser Phe Gln Leu Ile Ile Ile Phe Lys Phe675 680 685Ser Thr Lys Val Pro Thr Phe Tyr His Ala Trp Val Gln Asn His Gly690 695 700Ala Gly Leu Phe Val Met Ile Ser Ser Ala Ala Gln Leu Leu Ile Cys705 710 715 720Leu Thr Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu Pro Ala Arg Glu Tyr Gln725 730 735Arg Phe Pro His Leu Val Met Leu Glu Cys Thr Glu Thr Asn Ser Leu740 745 750Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly Leu Leu Ser Ile Ser Ala755 760 765Phe Ala Cys Ser Tyr Leu Gly Lys Asp Leu Pro Glu Asn Tyr Asn Glu770 775 780Ala Lys Cys Val Thr Phe Ser Leu Leu Phe Asn Phe Val Ser Trp Ile785 790 795 800Ala Phe Phe Thr Thr Ala Ser Val Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Pro Ala805 810 815Ala Asn Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu Ser Ser Gly Phe Gly Gly820 825 830Tyr Phe Leu Pro Lys Cys Tyr Val Ile Leu Cys Arg Pro Asp Leu Asn835 840 845Ser Thr Glu His Phe Gln Ala Ser Ile Gln Asp Tyr Thr Arg Arg Cys
850 855 860Gly Ser Thr865<210>32<211>866<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>32Met Val Arg Leu Leu Leu Ile Phe Phe Pro Met Ile Phe Leu Glu Met1 5 10 15Ser Ile Leu Pro Arg Met Pro Asp Arg Lys Val Leu Leu Ala Gly Ala20 25 30Ser Ser Gln Arg Ser Val Ala Arg Met Asp Gly Asp Val Ile Ile Gly35 40 45Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Pro Ala Glu Lys Val Pro Glu50 55 60Arg Lys Cys Gly Glu Ile Arg Glu Gln Tyr Gly Ile Gln Arg Val Glu65 70 75 80Ala Met Phe His Thr Leu Asp Lys Ile Asn Ala Asp Pro Val Leu Leu85 90 95Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ser Cys Trp His Ser100 105 110Ser Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe Ile Arg Asp Ser Leu Ile115 120 125Ser Ile Arg Asp Glu Lys Asp Gly Leu Asn Arg Cys Leu Pro Asp Gly130 135 140Gln Thr Leu Pro Pro Gly Arg Thr Lys Lys Pro Ile Ala Gly Val Ile145 150 155 160Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu Leu Gln165 170 175Leu Phe Asp Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Leu180 185 190Ser Asp Lys Thr Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Val Val Pro Ser Asp195 200 205Thr Leu Gln Ala Arg Ala Met Leu Asp Ile Val Lys Arg Tyr Asn Trp210 215 220Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Ser Gly225 230 235 240Met Asp Ala Phe Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Gly Leu Cys Ile Ala245 250 255His Ser Asp Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Lys Ser Phe Asp Arg260 265 270Leu Leu Arg Lys Leu Arg Glu Arg Leu Pro Lys Ala Arg Val Val Val275 280 285Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Ser Ala Met Arg290 295 300Arg Leu Gly Val Val Gly Glu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Asp Gly Trp305 310 315 320Ala Asp Arg Asp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Glu Val Glu Ala Asn Gly325 330 335Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Glu Val Arg Ser Phe Asp Asp
340 345 350Tyr Phe Leu Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Thr Arg Asn Pro Trp Phe355 360 365Pro Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Pro Gly His Leu370 375 380Leu Glu Asn Pro Asn Phe Lys Lys Val Cys Thr Gly Asn Glu Ser Leu385 390 395 400Glu Glu Asn Tyr Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile Asn Ala405 410 415Ile Tyr Ala Met Ala His Gly Leu Gln Asn Met His His Ala Leu Cys420 425 430Pro Gly His Val Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp Gly Arg435 440 445Lys Leu Leu Asp Phe Leu Ile Lys Ser Ser Phe Val Gly Val Ser Gly450 455 460Glu Glu Val Trp Phe Asp Glu Lys Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp465 470 475 480Ile Met Asn Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Asn Arg Tyr Asp Tyr Val His485 490 495Val Gly Thr Trp His Glu Gly Val Leu Asn Ile Asp Asp Tyr Lys Ile500 505 510Gln Met Asn Lys Ser Gly Met Val Arg Ser Val Cys Ser Glu Pro Cys515 520 525Leu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser Cys Cys530 535 540Trp Ile Cys Thr Ala Cys Lys Glu Asn Glu Phe Val Gln Asp Glu Phe545 550 555 560Thr Cys Arg Ala Cys Asp Leu Gly Trp Trp Pro Asn Ala Glu Leu Thr565 570 575Gly Cys Glu Pro Ile Pro Val Arg Tyr Leu Glu Trp His Glu Ala Pro580 585 590Thr Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu595 600 605Ala Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg610 615 620Ser Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val625 630 635 640Ala Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr645 650 655Cys Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile660 665 670Ser Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met675 680 685Ala Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly690 695 700Pro Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val705 710 715 720Val Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp725 730 735Pro Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg740 745 750Asn Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val755 760 765Gly Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn770 775 780Glu Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser785 790 795 800Val Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr
805 810 815Ile Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu820 825 830Gly Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg835 840 845Asn Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg850 855 860Arg Asp865<210>33<211>876<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；注釋＝人造構建體<400>33Met Val Arg Leu Leu Leu Ile Phe Phe Pro Met Ile Phe Leu Glu Met1 5 10 15Ser Ile Leu Pro Arg Met Pro Asp Arg Lys Val Leu Leu Ala Gly Ala20 25 30Ser Ser Gln Arg Ser Val Ala Arg Met Asp Gly Asp Val Ile Ile Gly35 40 45Ala Leu Phe Ser Val His His Gln Pro Pro Ala Glu Lys Val Pro Glu50 55 60Arg Lys Cys Gly Glu Ile Arg Glu Gln Tyr Gly Ile Gln Arg Val Glu65 70 75 80Ala Met Phe His Thr Leu Asp Lys Ile Asn Ala Asp Pro Val Leu Leu85 90 95Pro Asn Ile Thr Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ser Cys Trp His Ser100 105 110Ser Val Ala Leu Glu Gln Ser Ile Glu Phe Ile Arg Asp Ser Leu Ile115 120 125Ser Ile Arg Asp Glu Lys Asp Gly Leu Asn Arg Cys Leu Pro Asp Gly130 135 140Gln Thr Leu Pro Pro Gly Arg Thr Lys Lys Pro Ile Ala Gly Val Ile145 150 155 160Gly Pro Gly Ser Ser Ser Val Ala Ile Gln Val Gln Asn Leu Leu Gln165 170 175Leu Phe Asp Ile Pro Gln Ile Ala Tyr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Leu180 185 190Ser Asp Lys Thr Leu Tyr Lys Tyr Phe Leu Arg Val Val Pro Ser Asp195 200 205Thr Leu Gln Ala Arg Ala Met Leu Asp Ile Val Lys Arg Tyr Asn Trp210 215 220Thr Tyr Val Ser Ala Val His Thr Glu Gly Asn Tyr Gly Glu Ser Gly225 230 235 240Met Asp Ala Phe Lys Glu Leu Ala Ala Gln Glu Gly Leu Cys Ile Ala245 250 255His Ser Asp Lys Ile Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Lys Ser Phe Asp Arg260 265 270Leu Leu Arg Lys Leu Arg Glu Arg Leu Pro Lys Ala Arg Val Val Val275 280 285Cys Phe Cys Glu Gly Met Thr Val Arg Gly Leu Leu Ser Ala Met Arg
290 295 300Arg Leu Gly Val Val Gly Glu Phe Ser Leu Ile Gly Ser Asp Gly Trp305 310 315 320Ala Asp Arg Asp Glu Val Ile Glu Gly Tyr Glu Val Glu Ala Asn Gly325 330 335Gly Ile Thr Ile Lys Leu Gln Ser Pro Glu Val Arg Ser Phe Asp Asp340 345 350Tyr Phe Leu Lys Leu Arg Leu Asp Thr Asn Thr Arg Asn Pro Trp Phe355 360 365Pro Glu Phe Trp Gln His Arg Phe Gln Cys Arg Leu Pro Gly His Leu370 375 380Leu Glu ASn Pro Asn Phe Lys Lys Val Cys Thr Gly Asn Glu Ser Leu385 390 395 400Glu Glu Asn Tyr Val Gln Asp Ser Lys Met Gly Phe Val Ile Asn Ala405 410 415Ile Tyr Ala Met Ala His Gly Leu Gln Asn Met His His Ala Leu Cys420 425 430Pro Gly His Val Gly Leu Cys Asp Ala Met Lys Pro Ile Asp Gly Arg435 440 445Lys Leu Leu Asp Phe Leu Ile Lys Ser Ser Phe Val Gly Val Ser Gly450 455 460Glu Glu Val Trp Phe Asp Glu Lys Gly Asp Ala Pro Gly Arg Tyr Asp465 470 475 480Ile Met Asn Leu Gln Tyr Thr Glu Ala Asn Arg Tyr Asp Tyr Val His485 490 495Val Gly Thr Trp His Glu Gly Val Leu Asn Ile Asp Asp Tyr Lys Ile500 505 510Gln Met Asn Lys Ser Gly Met Val Arg Ser Val Cys Ser Glu Pro Cys515 520 525Leu Lys Gly Gln Ile Lys Val Ile Arg Lys Gly Glu Val Ser Cys Cys530 535 540Trp Ile Cys Thr Ala Cys Lys Glu Asn Glu Phe Val Gln Asp Glu Phe545 550 555 560Thr Cys Arg Ala Cys Asp Leu Gly Trp Trp Pro Asn Ala Glu Leu Thr565 570 575Gly Cys Glu Pro Ile Pro Val Arg Tyr Leu Glu Trp Gly Glu Pro Ala580 585 590Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Leu Val Leu595 600 605Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro Leu Val Gln610 615 620Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys Leu Gly Leu625 630 635 640Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser Pro Ala Arg645 650 655Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr Gly Cys Leu660 665 670Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu Ser Glu Leu675 680 685Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg Gly Pro Trp690 695 700Ala Trp Lau Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val Ala Leu Cys705 710 715 720Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr Asp Trp His725 730 735Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg Ser Trp Val740 745 750Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala Phe Leu Cys
755 760 765Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Arg Tyr Asn Arg770 775 780Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Trp Val785 790 795 800Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu Arg Pro Ala805 810 815Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala820 825 830Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro Gly Leu Asn835 840 845Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala Gln Gly Gln850 855 860Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu865 870 87權利要求
1.非天然存在的化合物，該化合物與由hT1R2/hT1R3組成的T1R2/T1R3受體特異性結合，而不與由rT1R2/rT1R3組成的T1R2/T1R3受體特異性結合。
2.非天然存在的化合物，該化合物與由hT1R2/rT1R3組成的T1R2/T1R3受體特異性結合，而不與由rT1R2/hT1R3組成的T1R2/T1R3受體特異性結合。
3.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3受體的T1R2的N-末端胞外域特異性結合。
4.非天然存在的化合物，該化合物與由rT1R2/hT1R3組成的T1R2/T1R3受體特異性結合，而不與由hT1R2/rT1R3組成的T1R2/T1R3受體特異性結合。
5.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3和rT1R2/r3-h3特異性結合，但是不與rT1R2/rT1R3或hT1R2/h3-r3特異性結合。
6.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3和r2-h2/rT1R3特異性結合，但不與rT1R2/rT1R3或h2-r2/hT1R3特異性結合。
7.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3和hT1R2/rT1R3受體的T1R2的維納斯捕蠅域(VFD)特異性結合。
8.非天然存在的化合物，該化合物與T1R2/T1R3受體的T1R2亞基的人類N-末端維納斯捕蠅域的氨基酸殘基144和氨基酸殘基302特異性結合。
9.非天然存在的化合物，該化合物與T1R2/T1R3受體的T1R2亞基的N-末端維納斯捕蠅域特異性結合，其中所述化合物約為12?！?埃×5埃。
10.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3受體的T1R2的富含半胱氨酸的區(qū)域特異性結合。
11.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3受體的T1R2的跨膜結構域(TM)特異性結合。
12.非天然存在的化合物，該化合物與T1R2/T1R3的T1R3亞基的人類N-末端胞外域特異性結合。
13.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3受體的T1R3的維納斯捕蠅域(VFD)特異性結合。
14.非天然存在的化合物，該化合物與hT1R2/hT1R3受體的T1R3的跨膜結構域(TM)特異性結合。
15.非天然存在的化合物，該化合物與T1R2/T1R3的T1R3亞基的人類跨膜結構域的胞外環(huán)2和胞外環(huán)3特異性結合。
16.如權利要求1～15任一項所述的化合物，該化合物顯示在采用FLIPR(Molecular Devices公司)儀器的基于熒光的測定中，相對于果糖的最大活性，熒光活性以化合物依賴性方式增加至少25％。
17.如權利要求1～16任一項所述的化合物，該化合物顯示在采用FLIPR(Molecular Devices公司)儀器的基于熒光的測定中，甜味劑的EC50以化合物依賴性方式降低至少兩倍。
18.如權利要求1～17中任一項所述的化合物，該化合物導致用野生型或嵌合受體所轉染的100個細胞中的至少10個顯示出化合物依賴性的熒光加強。
19.如權利要求1～18任一項所述的化合物，該化合物顯示在對亞最大水平的甜味劑的應答中，熒光細胞數(shù)目以化合物依賴性方式增加至少2倍。
20.如權利要求1～16任一項所述的化合物，該化合物顯示細胞對亞最大水平的甜味劑的應答相對于對單獨的甜味劑的應答以化合物依賴性方式增加至少1.25倍。
21.如權利要求20所述的化合物，其中，所述的應答是通過熒光、鈣水平、IP3水平、cAMP水平、GTPγS結合或報道基因活性(例如熒光素酶、β-半乳糖苷酶)進行測定的。
22.如權利要求1～21中任一項所述的化合物，該化合物在細胞中具有一項或一項以上的以下特征相對于對照，EC50下降50％，胞內(nèi)Ca2+水平上升至少約25％，胞內(nèi)cAMP上升至少約25％，胞內(nèi)cGMP上升至少約25％，胞內(nèi)IP3上升至少約25％，或G蛋白與GTPγS的結合上升至少約25％。
23.嵌合的T1R2/T1R3受體，該受體包含人類T1R2亞基和大鼠T1R3亞基。
24.嵌合的T1R2/T1R3受體，該受體包含大鼠T1R2亞基和人類T1R3亞基。
25.嵌合的T1R2受體亞基，該亞基包含人類的胞外域、大鼠的跨膜結構域和大鼠的胞內(nèi)域。
26.嵌合的T1R3受體亞基，該亞基包含大鼠的胞外域、人類的跨膜結構域和人類的胞內(nèi)域。
27.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/hT1R3受體的T1R1的N-末端胞外域結合。
28.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/T1R3味覺受體的T1R1的維納斯捕蠅域結合。
29.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/hT1R3受體的T1R1的富含半胱氨酸的區(qū)域結合。
30.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/T1R3香味受體的T1R1的跨膜結構域結合。
31.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/hT1R3受體的T1R3的N-末端胞外域結合。
32.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/T1R3香味受體的T1R3的維納斯捕蠅域結合。
33.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/hT1R3受體的T1R3的富含半胱氨酸的區(qū)域結合。
34.非天然存在的化合物，該化合物與T1R1/T1R3香味受體的T1R3的跨膜結構域結合。
35.非天然存在的化合物，該化合物與由h1TM/h3TM組成的截斷的香味受體的T1R1的跨膜結構域結合。
36.非天然存在的化合物，該化合物與由h1TM/h3TM組成的截斷的甜味受體的T1R3的跨膜結構域結合。
37.非天然存在的化合物，該化合物與由mGluR-h1/mGluR-h3組成的嵌合受體的T1R1的跨膜結構域結合。
38.非天然存在的化合物，該化合物與由mGluR-h1/mGluR-h3組成的嵌合受體的T1R3的跨膜結構域結合。
39.如權利要求27～38任一項所述的化合物，該化合物顯示在采用FLIPR(Molecular Devices公司)儀器的基于熒光的測定中，相對于谷氨酸的最大活性，熒光活性以化合物依賴性方式增強至少25％。
40.如權利要求27～38任一項所述的化合物，該化合物顯示在采用FLIPR(Molecular Devices公司)儀器的基于熒光的測定中，谷氨酸的EC50以化合物依賴性方式降低至少兩倍。
41.如權利要求27～38任一項所述的化合物，該化合物導致100個感染細胞中的至少10個顯示出化合物依賴性的熒光增強，所述熒光是用熒光顯微鏡測定的。
42.如權利要求27～38任一項所述的化合物，該化合物導致在對亞最大水平的谷氨酸的應答中，熒光細胞數(shù)目以化合物依賴性方式增加至少2倍。
43.如權利要求27～38任一項所述的化合物，該化合物導致細胞對亞最大水平的谷氨酸的應答相對于對單獨的谷氨酸的應答，以化合物依賴性方式增加至少1.25倍。
44.如權利要求43所述的化合物，其中，所述的應答是通過熒光、鈣水平、IP3水平、cAMP水平、GTPγS結合或報道基因活性進行測定的。
45.調節(jié)味覺感覺的化合物的鑒定方法，該方法通過對結合到、激活、抑制、增強、和/或調節(jié)權利要求23～26任一項所述的一個或一個以上的受體的化合物進行鑒定來進行。
46.調節(jié)甜味感覺的化合物的鑒定方法，該方法包括將待測化合物對甜味受體的作用與權利要求1～22任一項所述化合物對甜味受體的作用進行比較，若待測化合物的甜味感覺增強約等于或大于所述化合物的甜味增強，則表明待測化合物為增強甜味感覺的化合物。
47.調節(jié)鮮味感覺的化合物的鑒定方法，該方法包括將待測化合物對鮮味受體的作用與權利要求27～44任一項所述化合物對鮮味受體的作用進行比較，若待測化合物的香味感覺增強約等于或大于所述化合物的香味增強，則表明待測化合物為增強鮮味感覺的化合物。
48.調節(jié)味覺感覺的化合物的鑒定方法，該方法通過對結合到、激活、抑制和/或調節(jié)細胞所表達的受體的化合物進行鑒定來進行，所述細胞穩(wěn)定表達權利要求23～26任一項所述的一個或一個以上的受體。
49.調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的香味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或其前體，和將食用或藥用產(chǎn)品或其前體與至少香味調節(jié)量的至少一種如權利要求27～44任一項所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的鹽組合，從而形成經(jīng)調節(jié)的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的香味。
50.抑制食用或藥用產(chǎn)品的香味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或其前體，和將食用或藥用產(chǎn)品或其前體與至少香味抑制量的至少一種如權利要求27～44任一項所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的鹽組合，從而形成經(jīng)調節(jié)的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此抑制食用或藥用產(chǎn)品的香味。
51.增強食用或藥用產(chǎn)品的香味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或其前體，和將食用或藥用產(chǎn)品或其前體與至少香味提高量的至少一種如權利要求27～44任一項所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的鹽組合，從而形成經(jīng)調節(jié)的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此增強食用或藥用產(chǎn)品的香味。
52.調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的甜味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或其前體，和將食用或藥用產(chǎn)品或其前體與至少甜味調節(jié)量的至少一種如權利要求1～22和權利要求60～61任一項所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的鹽組合，從而形成經(jīng)調節(jié)的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此調節(jié)食用或藥用產(chǎn)品的甜味。
53.抑制食用或藥用產(chǎn)品的甜味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或其前體，和將食用或藥用產(chǎn)品或其前體與至少甜味抑制量的至少一種如權利要求1～22和權利要求60～61任一項所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的鹽組合，從而形成經(jīng)調節(jié)的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此抑制食用或藥用產(chǎn)品的甜味。
54.增強食用或藥用產(chǎn)品的甜味的方法，該方法包括提供至少一種食用或藥用產(chǎn)品或其前體，和將食用或藥用產(chǎn)品或其前體與至少甜味提高量的至少一種如權利要求1～22或權利要求60～61任一項所述的非天然存在的化合物或其膳食上可接受的鹽組合，從而形成經(jīng)調節(jié)的食用或藥用產(chǎn)品；據(jù)此增強食用或藥用產(chǎn)品的甜味。
55.增強鮮味感覺的方法，該方法包括將鮮味受體與環(huán)己基氨基磺酸鹽和NHDC以及它們的衍生物接觸。
56.增強鮮味感覺的方法，該方法包括將鮮味受體與lactisole衍生物接觸。
57.增強甜味感覺的方法，該方法包括將甜味受體與環(huán)己基氨基磺酸鹽和NHDC以及它們的衍生物接觸。
58.增強甜味感覺的方法，該方法包括將甜味受體與lactisole衍生物接觸。
59.如權利要求27～44任一項所述的化合物，該化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜類化合物、黃酮類化合物，或蛋白甜味劑、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、鹵代糖、乙酰舒泛鉀、環(huán)己基氨基磺酸鹽、三氯蔗糖、天胺甜素、谷氨酸單鈉(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)、腺苷一磷酸或鳥苷一磷酸(GMP)。
60.如權利要求1～22任一項所述的化合物，該化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜類化合物、黃酮類化合物，或蛋白甜味劑、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、鹵代糖、乙酰舒泛鉀、環(huán)己基氨基磺酸鹽、三氯蔗糖、天胺甜素、紐甜、紫蘇葶、SC-45647、SC-40014、應樂果甜蛋白、NC-002740-01、奇異果甜蛋白、CC-00100、NC-00420、天胺甜素、SC-44102、對乙氧基苯脲、NC-00576、甘草酸、蛇菊苷、糖精鈉、D-色氨酸、環(huán)己基氨基磺酸鹽、DHB、乙醇酸、甘氨酸、D(-)果糖、高呋喃、D(-)塔格糖、麥芽糖、D(+)葡萄糖、D-山梨糖醇、D(+)半乳糖、α-乳糖、L()果糖、L(+)、化合物403249或葡萄糖。
61.如權利要求1～22任一項所述的化合物，其中所述化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜類化合物、黃酮類化合物，或蛋白甜味劑、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、鹵代糖、乙酰舒泛鉀、環(huán)己基氨基磺酸鹽、三氯蔗糖、天胺甜素、紐甜、紫蘇葶、SC-45647、SC-40014、應樂果甜蛋白、NC-002740-01、奇異果甜蛋白、CC-00100、NC-00420、天胺甜素、SC-44102、對乙氧基苯脲、NC-00576、甘草酸、蛇菊苷、糖精鈉、D-色氨酸、環(huán)己基氨基磺酸鹽、DHB、乙醇酸、甘氨酸、D(-)果糖、高呋喃、D(-)塔格糖、麥芽糖、D(+)葡萄糖、D-山梨糖醇、D(+)半乳糖、α-乳糖、L()果糖、L(+)、化合物403249、葡萄糖或化合物6364395。
62.如權利要求27～44任一項所述的化合物，其中所述化合物不是蔗糖、果糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、某些已知的天然萜類化合物、黃酮類化合物，或蛋白甜味劑、二肽、三肽、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、三氯蔗糖、鹵代糖、乙酰舒泛鉀、環(huán)己基氨基磺酸鹽、三氯蔗糖、天胺甜素、谷氨酸單鈉(“MSG”)、肌苷一磷酸(IMP)、腺苷一磷酸或化合物6364395、鳥苷一磷酸(GMP)。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性結合T1R1/T1R3或T1R2/T1R3受體或其片段或亞基的化合物。本發(fā)明還涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的異寡聚和嵌合的味覺受體在鑒定分別對鮮味刺激物和甜味刺激物產(chǎn)生應答的化合物的檢測中的用途。此外，本發(fā)明還涉及在組成性或誘導性條件下穩(wěn)定或瞬時共表達T1R1和T1R3，或T1R2和T1R3的組合的細胞系的構成。本發(fā)明還提供所述細胞系在基于細胞的測定中用以鑒定鮮味和甜味的調節(jié)化合物的用途，所述測定尤其是采用熒光測定成像法檢測受體活性的高通量篩選測定。
文檔編號C12P21/06GK101052725SQ200480022612
公開日2007年10月10日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權日2003年8月6日
發(fā)明者李曉東, 莉娜·斯塔謝夫斯基, 徐紅 申請人:西諾米克斯公司