專利名稱：用于破壞宿主對(duì)外來抗原的耐受性的嵌合抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于引起或增強(qiáng)免疫應(yīng)答(免疫反應(yīng))并且用于破壞宿主對(duì)外來抗原的耐受性的方法和組合物。
背景技術(shù)：
當(dāng)健康宿主(人類或動(dòng)物)遭遇外來抗原(如衍生自細(xì)菌、病毒和/或寄生生物的蛋白質(zhì))時(shí)，該宿主通常啟動(dòng)免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。在體液免疫應(yīng)答中，由B細(xì)胞產(chǎn)生抗體并且將抗體分泌到血液和/或淋巴液中以應(yīng)答抗原刺激。隨后該抗體中和該抗原(如病毒)，途徑是通過特異性地結(jié)合到抗原表面，標(biāo)記該抗原以便使該抗原被吞噬細(xì)胞和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的機(jī)制破壞，或通過阻斷結(jié)合或通過加強(qiáng)將游離抗原從循環(huán)中的清除。細(xì)胞免疫應(yīng)答的特征是通過選擇和增加能夠直接或間接清除包含該抗原的細(xì)胞的特異性輔助T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
在一些個(gè)體中，免疫系統(tǒng)不能對(duì)某些外來抗原產(chǎn)生應(yīng)答。當(dāng)抗原沒有促使特異性抗體和/或殺傷T細(xì)胞的生成時(shí)，免疫系統(tǒng)就不能防止隨之產(chǎn)生的疾病。因此，感染物，如病毒，能夠形成慢性感染并且該宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)該感染物產(chǎn)生的抗原變?yōu)槟褪堋?br> 當(dāng)該感染物逃避該宿主的免疫系統(tǒng)的機(jī)制尚未明確建立時(shí)，外來抗原沒有被正確的呈遞給宿主的免疫系統(tǒng)可能是慢性感染發(fā)展的影響因素?？乖蔬f細(xì)胞(APC)依據(jù)該抗原的位置以不同的方式處理所遇到的抗原。外源性抗原被內(nèi)吞并且隨后在該抗原呈遞細(xì)胞的內(nèi)吞小體內(nèi)被處理。由該外源性抗原生成的肽片段與II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)復(fù)合并被呈遞在該細(xì)胞的表面。該復(fù)合物被呈遞給CD4+T細(xì)胞從而刺激CD4+T輔助細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子可以刺激B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)該外源性抗原的抗體(體液應(yīng)答)。另一方面，胞內(nèi)抗原被處理并與I類MHC組成復(fù)合物呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的表面。抗原被呈遞給CD8+T細(xì)胞從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生針對(duì)攜帶該抗原的宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
在患有慢性病毒或寄生蟲感染(其中生物體在其生命周期的某個(gè)時(shí)刻停留在宿主細(xì)胞內(nèi))的患者中，宿主細(xì)胞將生成抗原并且在其內(nèi)表達(dá)抗原，并且循環(huán)中將出現(xiàn)分泌的抗原。例如，在慢性人類乙型肝炎病毒(HBV)攜帶者的血液中將會(huì)檢測到病毒體、HBV表面抗原和核心抗原的替代物(以e抗原的形式)。
慢性感染的有效治療需要針對(duì)與該感染物相關(guān)的抗原的較強(qiáng)的CTL應(yīng)答。這可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)通過在該宿主細(xì)胞內(nèi)生成抗原或?qū)⒃摽乖f送到合適的細(xì)胞區(qū)室以便使它得到處理并呈遞從而引起細(xì)胞應(yīng)答。文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)遞送抗原的多種途徑。其中，病毒載體(Lorenz et al.，Hum.Gen.Ther.10623-631(1999))，cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的利用(Donnelly et al.，Ann.Rev.Immunol.15617(1997))以及通過注入cDNA載體表達(dá)抗原(Lai etal.，Crit.Rev.Immunol.18449-484(1998)；以及美國專利第5,589,466號(hào))已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。此外，表達(dá)針對(duì)樹突細(xì)胞的抗原的DNA疫苗也已有報(bào)導(dǎo)(You，et al.，Cancer Res 613704-3711(2001))。
能夠運(yùn)載抗原到細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)室進(jìn)行MHC I類途徑處理的遞送載體也已經(jīng)得到利用。Hilgers，et al.(Vaccine 17219-228(1999))已經(jīng)詳細(xì)地描述了佐劑的使用以便獲得同樣的目的。另一途徑是利用可生物降解的微球進(jìn)行抗原的細(xì)胞質(zhì)遞送，這已經(jīng)通過針對(duì)卵白蛋白肽的Th1免疫應(yīng)答的產(chǎn)生而得到說明(Newman，et al.，J ControlRelease 5449-59(1998)；以及Newman，et al.，J Biomed Mater Res50591-597(2000))。另外，抗原呈遞細(xì)胞，如樹突細(xì)胞，攝取PLGA納米球(nanosphere)(Newman，et al.，J Biomed Mater Res60480-486(2002))。
樹突細(xì)胞捕獲、處理和呈遞抗原以及刺激原始T細(xì)胞的能力已經(jīng)使其成為治療性疫苗開發(fā)中非常重要的工具(Laupeze，et al.，Hum Immunol 60591-597(1999))。將抗原靶向樹突細(xì)胞是抗原呈遞中的關(guān)鍵步驟，為此目的已經(jīng)開發(fā)了用于抗體的Fc區(qū)的樹突細(xì)胞上存在的許多受體(Regnault，et al.，J Exp Med 189371-380(1999))。這種途徑的另外的實(shí)例包括卵巢癌Mab-B43.13、抗PSA抗體以及抗HBV抗體抗原復(fù)合物(Wen，et al.，Int Rev Immunol18251-258(1999))。已經(jīng)顯示利用負(fù)載有腫瘤相關(guān)抗原的樹突細(xì)胞的癌癥免疫療法可以產(chǎn)生腫瘤特異性免疫應(yīng)答和抗腫瘤活性(Fong and Engleman，Ann Rev Immunol 961865-1972(2000)；以及Campton，et al.J Invest Dermatol 11557-61(2000))。利用腫瘤抗原沖擊的(tumor-antigen-pulsed)樹突細(xì)胞在體內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)中獲得了較好的結(jié)果(Tarte and Klein，Leukemia 13653-663(1999))。這些研究清楚地表明了利用樹突細(xì)胞來產(chǎn)生針對(duì)癌抗原的免疫應(yīng)答的效果。
還可以通過抗原呈遞細(xì)胞上的甘露糖受體代替Fc受體或者同F(xiàn)c受體一起影響抗原呈遞。巨噬細(xì)胞甘露糖受體(MMR)，也稱作CD206，表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)胞(DC)上。該分子是內(nèi)吞受體的C型凝集素家族的成員。甘露糖化的抗原(mannosylatedantigens)可以被CD206連接并且內(nèi)在化。通常認(rèn)為外源性抗原主要通過MHC II類途徑被處理和呈遞。然而，當(dāng)通過CD206靶向目標(biāo)時(shí)，有證據(jù)表明MHC I類途徑和MHC II類途徑均參與在內(nèi)(Apostolopoulos et al.，Eur.J Immunol.301714(2000)；Apostolopoulos and McKenzie，Curr.Mol.Med.1469(2001)；Ramakrishna et al.，J Immunol.1722845-2852(2004))。
傳染病和癌癥是主要的公眾健康問題。例如，世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明超過20億人感染有HBV。其中，3.7億人為慢性感染，因此具有高度的可能性發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。全世界有大約1.7億人為HCV慢性攜帶者，對(duì)此沒有有效的預(yù)防性或治療性疫苗。
據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)導(dǎo)每年有1千萬人診斷有癌癥。癌癥每年導(dǎo)致6百萬人死亡，占全世界死亡人數(shù)的12％。因此，需要有可以引發(fā)針對(duì)感染和癌癥的免疫應(yīng)答的新型的、治療有效的組合物和方法，以及用于生產(chǎn)這類組合物的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于引發(fā)免疫應(yīng)答的嵌合抗原，該嵌合抗原包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(immune reponse domain)和目標(biāo)結(jié)合區(qū)(targetbinding domain)，其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。
本發(fā)明的另一方面提供了增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞中抗原呈遞的方法，該方法包括將抗原呈遞細(xì)胞與包括本發(fā)明的嵌合抗原的組合物接觸。
本發(fā)明的另一方面還提供了激活抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括將抗原呈遞細(xì)胞與本發(fā)明的嵌合抗原接觸。
本發(fā)明的一方面提供了引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將包括本發(fā)明的嵌合抗原的組合物給患者施用。
本發(fā)明的另一方面提供了破壞耐受性的方法，該方法包括將本發(fā)明的嵌合抗原給患者施用。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該患者為病毒或?qū)Ｐ约?xì)胞內(nèi)寄生蟲的慢性感染者。
本發(fā)明的一方面提供了治療免疫-可治療的疾病的方法，該方法包括將有效治療劑量的本發(fā)明的嵌合抗原給所需要的患者施用。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫-可治療疾病是指感染，尤其是慢性感染或癌癥。
本發(fā)明的另一方面還提供了給受試者接種疫苗以防治感染的方法，該方法包括將本發(fā)明的嵌合抗原給受試者施用?？梢詫?duì)受試者進(jìn)行預(yù)防性或治療性的疫苗接種。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該受試者對(duì)嵌合抗原的一個(gè)以上的表位出現(xiàn)免疫反應(yīng)，以及更優(yōu)選地，對(duì)該免疫反應(yīng)區(qū)的一個(gè)以上的表位出現(xiàn)免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，該感染為病毒感染或?qū)Ｐ缘募?xì)胞內(nèi)寄生蟲感染。
本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物組合物，該組合物包括本發(fā)明的嵌合抗原和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
本發(fā)明的一方面提供了包括本發(fā)明的嵌合抗原的制品和用于將該嵌合抗原給所需要的患者施用的說明。
本發(fā)明的另一方面提供了編碼嵌合抗原的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包括編碼免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的第一多聚核苷酸部和編碼目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二多聚核苷酸部，其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。本發(fā)明還提供了包括此類多聚核苷酸的微生物和細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一方面還提供了生成本發(fā)明的嵌合抗原的方法，該方法包括提供微生物或細(xì)胞系(該微生物或細(xì)胞系包含編碼本發(fā)明的嵌合抗原的多聚核苷酸)，以及在能夠表達(dá)該嵌合抗原的條件下培養(yǎng)該微生物或細(xì)胞系。
下面將結(jié)合附圖和說明書詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例。通過說明書、附圖、以及權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)、以及優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。


圖1A提供了作為單體的本發(fā)明的嵌合抗原的結(jié)構(gòu)示意圖，其中該嵌合抗原具有兩個(gè)部分，即免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該示意圖還示出了優(yōu)選的實(shí)施例，其中存在鉸鏈區(qū)。圖1B提供了本發(fā)明的嵌合抗原在通常狀態(tài)下，即裝配為二聚體時(shí)的結(jié)構(gòu)示意圖。該示意圖示出了特別優(yōu)選的實(shí)施例，其中該嵌合抗原除了該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域外還包括6xHis標(biāo)記和連接肽。
圖2示出了用HBV S1/S2-TBD刺激T細(xì)胞生成特異性針對(duì)來自HBV S1蛋白的表位的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。
圖3示出了用HBV S1/S2-TBD刺激T細(xì)胞生成特異性針對(duì)來自HBV S2蛋白的表位的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。
圖4示出了以濃度的函數(shù)來比較成熟樹突細(xì)胞對(duì)HBVS1/S2-TBD、IgG1和IgG2的攝取。
圖5示出了HBV S1/S2-TBD的結(jié)合與樹突細(xì)胞上CD32的表達(dá)之間的相關(guān)性以及與CD206的表達(dá)之間的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式
A.總述本發(fā)明公開了用于引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。尤其是，該化合物和方法可以引發(fā)針對(duì)外來抗原的免疫應(yīng)答(該抗原被宿主認(rèn)為是“自我”抗原)，由此破壞宿主對(duì)這些抗原的耐受。將包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段)的嵌合抗原呈遞給宿主的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)了針對(duì)外來抗原或耐受抗原的免疫應(yīng)答?？乖蔬f細(xì)胞攝取、處理以及呈遞嵌合抗原，引發(fā)針對(duì)希望的抗原的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
B.定義在進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明前，除非另有說明，本申請(qǐng)所用的術(shù)語定義如下。
“抗體”指的是人類或其它動(dòng)物體內(nèi)由抗原(免疫原)所致的由B淋巴細(xì)胞生成的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。這些分子的特征是可以特異性地與該抗原反應(yīng)，每一個(gè)都根據(jù)另一個(gè)來定義。
“抗體應(yīng)答”或“體液應(yīng)答”指的是一類免疫應(yīng)答，其中抗體由B淋巴細(xì)胞生成并被分泌到血液和/或淋巴中以應(yīng)答抗原刺激。在正常的機(jī)能免疫應(yīng)答中，該抗體在細(xì)胞(例如病原體)的表面特異性地與抗原結(jié)合，標(biāo)記該細(xì)胞以便其被吞噬細(xì)胞(phagocytoticcell)和/或補(bǔ)體介導(dǎo)的機(jī)制破壞?？贵w還可以全身循環(huán)并結(jié)合游離的病毒粒子。該抗體的結(jié)合可以中和該病毒粒子并防止它感染細(xì)胞，并且可以標(biāo)記該病毒粒子以便通過吞噬作用或腎臟中的過濾作用將該病毒粒子清除出循環(huán)。
“抗原”指的是任何進(jìn)入體內(nèi)并與適當(dāng)?shù)募?xì)胞接觸，導(dǎo)致敏感和/或免疫應(yīng)答狀態(tài)的物質(zhì)，該物質(zhì)可以在體內(nèi)或體外以可證明的方式與敏化的受試者的抗體和/或免疫細(xì)胞反應(yīng)。
“抗原呈遞細(xì)胞”指的是抗原誘導(dǎo)過程的輔助細(xì)胞，其功能主要是將抗原處理并呈遞給淋巴細(xì)胞。抗原呈遞細(xì)胞與抗原的相互作用是免疫誘導(dǎo)中的關(guān)鍵步驟，原因是它能夠使淋巴細(xì)胞遭遇并識(shí)別抗原分子并且使該淋巴細(xì)胞活化。示例性的抗原呈遞細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、朗格漢斯-樹突細(xì)胞、小結(jié)樹突細(xì)胞(濾泡樹突樣細(xì)胞)、以及B細(xì)胞。
“B細(xì)胞”指的是能夠產(chǎn)生與抗原相互作用的免疫球蛋白或抗體的淋巴細(xì)胞。
“CH1區(qū)”指的是抗體的抗原結(jié)合片段上的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。
“細(xì)胞應(yīng)答”指的是一種由特異性輔助T細(xì)胞和殺傷T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，殺傷T細(xì)胞能夠直接清除病毒感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“嵌合抗原”指的是包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過共價(jià)或非共價(jià)方式直接或間接連接。
“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”是一種特殊的淋巴細(xì)胞，它能夠破壞外來細(xì)胞和感染有能產(chǎn)生病毒抗原的感染物的宿主細(xì)胞。
“表位”指的是復(fù)合抗原分子上形式最簡單的抗原決定簇；它是能夠被免疫球蛋白或T細(xì)胞受體識(shí)別的抗原的特定部分。
“融合蛋白”指的是通過由兩個(gè)或多個(gè)基因序列組合而成的雜合基因表達(dá)所形成的蛋白。
“鉸鏈區(qū)”指的是抗體中將Fab片段連接到Fc片段的部分；鉸鏈區(qū)包含共價(jià)連接兩條重鏈的二硫鍵。
術(shù)語“同系物”指的是通過，例如，在相應(yīng)的部位具有相同或相似的化學(xué)殘基序列而表現(xiàn)出與另一分子的同源性的分子。用語“％同源的”或“％同源”指的是在同源多聚核苷酸或多肽的相同部位相同或相似的核苷酸或氨基酸的百分?jǐn)?shù)。例如，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)中80個(gè)殘基中有75個(gè)相同，那么這兩個(gè)蛋白質(zhì)具有93.75％的同源性。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說可以利用各種已知的軟件程序決定同源性的百分?jǐn)?shù)。
“宿主”指的是溫血?jiǎng)游?，包括人類，其患有免?可治療的疾病，如感染或癌癥。本文所用的“宿主”還指施用了嵌合抗原的溫血?jiǎng)游铮ㄈ祟悺?br> 在本發(fā)明的上下文中，“雜交”指的是低聚化合物的互補(bǔ)鏈的配對(duì)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的配對(duì)機(jī)制包括低聚化合物的鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核堿基)之間的氫鍵結(jié)合，該氫鍵結(jié)合可以為Watson-Crick氫鍵結(jié)合、Hoogsteen氫鍵結(jié)合、或反向的Hoogsteen氫鍵結(jié)合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補(bǔ)核堿基，它們通過形成氫鍵配對(duì)。雜交可以在不同情況下發(fā)生。在多聚核苷酸的上下文中術(shù)語“雜交”及其類似用語指的是通常的雜交條件，優(yōu)選地如在50％甲酰胺/6X SSC/0.1％ SDS/100μg/ml mDNA條件下進(jìn)行雜交，其中用于雜交的溫度高于37℃并且用于在0.1X SSC/0.1％ SDS中沖洗的溫度高于55℃。
“免疫”或“免疫應(yīng)答”指的是機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答。在特定實(shí)施例中，它指的是機(jī)體抵抗或保護(hù)自己免于傳染病的能力。
“免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域(IRD)”指的是雙功能嵌合抗原分子中不同構(gòu)造的抗原部分。該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)或多個(gè)抗原和/或一個(gè)或多個(gè)重組抗原。
本文所用的用語“免疫-可治療的疾病“指的是可以通過在患者體內(nèi)引發(fā)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來防止、抑制或減輕的疾病或病變。
“淋巴細(xì)胞”指的是血液中存在的有核細(xì)胞的亞類，其介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。
“單克隆抗體”或“mAb”指的是由融合的雜交細(xì)胞，即雜交瘤細(xì)胞的克隆或遺傳性同源群體產(chǎn)生的抗體。克隆雜交細(xì)胞以便建立產(chǎn)生特定的單克隆抗體的細(xì)胞系，該抗體具有化學(xué)和免疫學(xué)的同源性，即，其僅能識(shí)別一種類型的抗原。
“肽鍵”指的是一個(gè)氨基酸的α-氨基和另一個(gè)氨基酸的α-羧基之間通過取代的酰胺鍵共價(jià)連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸。
“藥學(xué)上可接受的”指的是與人類或其它動(dòng)物具有生理學(xué)的相容性的無毒組合物。
“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括無毒并且與人類或其它動(dòng)物具有生理學(xué)上的相容性的物質(zhì)，例如佐劑、載體、pH-調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑、防腐劑及其類似物。
本文所用的術(shù)語“多聚核苷酸”指的是任何長度的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語僅指該分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA。它還包括一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸與類似物的已知類型的修飾，例如，本領(lǐng)域已知的標(biāo)記、甲基化、“加帽”、取代；核苷酸間的修飾，如以不帶電荷的鍵合修飾(例如，磷酸甲酯、磷酸三脂、磷酸酰胺、氨基甲酸酯(鹽)等)以及以帶電荷的鍵合修飾(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，包含附屬部分的修飾，例如蛋白質(zhì)(包括例如核酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、多聚-L-賴氨酸等)，帶嵌加物(intercalator)的修飾(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)包含螯合劑的修飾(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)，包含烷化物(alkylator)的修飾，具有改性鍵合的修飾(例如α端基異構(gòu)核酸等)，以及未修飾形式的多聚核苷酸。
“蛋白酶切位點(diǎn)”指的是蛋白水解酶水解(斷開)多肽鏈。
在本發(fā)明中用于“嚴(yán)格的雜交條件”或者“嚴(yán)格的條件”指的是本發(fā)明的化合物與其目標(biāo)序列雜交而與極小量(最小量)的其它序列雜交的條件。
術(shù)語“目標(biāo)對(duì)象”指的是任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選人類。
“標(biāo)簽”指的是用于分離或純化包含該標(biāo)簽的分子的標(biāo)記物或標(biāo)記序列。示例性的標(biāo)簽包括6xHis標(biāo)簽。
“T細(xì)胞”指的是負(fù)責(zé)抗原特異性的細(xì)胞相互作用的一類淋巴細(xì)胞，它介導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
“目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD)”指的是包含抗體片段的蛋白，其能夠結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞尤其是樹突細(xì)胞上的受體，并且其隨后被受體介導(dǎo)的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)到抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)。
用語“有效治療量”指的是嵌合抗原或編碼嵌合抗原的多聚核苷酸的量，該量足以引起針對(duì)抗原的有效的B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和/或輔助T淋巴細(xì)胞(Th)應(yīng)答，并且足以阻斷或治療或至少部分的抑制或減緩疾病或病癥的癥狀和/或并發(fā)癥。
本文所用的術(shù)語“治療”包括可利用嵌合抗原治療動(dòng)物，尤其是人類的疾病的任何治療，并且包括(i)防止疾病在目標(biāo)對(duì)象體內(nèi)發(fā)生，該目標(biāo)對(duì)象可以為易患有該疾病但是還未診斷出患有該疾病的對(duì)象；(ii)抑制疾病，例如抑制或減慢它的發(fā)展；(iii)減輕該疾病，例如，引起該疾病或者其癥狀的緩解。
本文所用的“異種型”指的是起源于與宿主不同的物種。例如，從鼠基因組克隆的重組表達(dá)抗體是人而非鼠的異種型，而不管該重組表達(dá)抗體是否產(chǎn)自細(xì)菌、昆蟲或鼠的細(xì)胞。
C.新穎的嵌合抗原本發(fā)明提供了用于引發(fā)免疫應(yīng)答的嵌合抗原，該抗原包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。根據(jù)本發(fā)明，該嵌合抗原，優(yōu)選地，能夠結(jié)合到Fc受體和/或巨噬細(xì)胞甘露糖受體上。該抗體片段對(duì)宿主可以是異種型或非異種型。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，該嵌合抗原能夠引起體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答可以包括Th1應(yīng)答、Th2應(yīng)答、和/或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，該嵌合抗原引發(fā)多表位免疫應(yīng)答。該多表位免疫應(yīng)答可以包括對(duì)免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)表位的應(yīng)答和/或?qū)δ繕?biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)表位的應(yīng)答?？蛇x地該多表位應(yīng)答可被限于對(duì)免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的多于一個(gè)表位的應(yīng)答。
本發(fā)明的嵌合抗原包括兩個(gè)部分，即包含抗原序列(如病毒抗原)的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域，以及包含抗體片段的目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖1)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法連接到目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。用于將該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域連接到目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的連接方式可以包括，但不限于，共價(jià)肽鍵、化學(xué)連接、亮氨酸拉鏈和生物素/抗生物素蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為單一的融合蛋白克隆。該融合蛋白的共價(jià)肽鍵可以包括其它的肽序列，例如SRPQGGGS或VRPQGGGS(SEQ ID NO1)。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，各種免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域被生物素化，并且該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域借助作為融合蛋白的鏈酶抗生物素產(chǎn)生，以便促進(jìn)多種嵌合抗原的生成?？蛇x地，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)都可以表達(dá)為對(duì)亮氨酸拉鏈部分的融合，其將導(dǎo)致該嵌合抗原的兩部分通過混合結(jié)合。最終，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立表達(dá)，并且隨后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)結(jié)合。示例性的方法包括利用蛋白交聯(lián)劑(例如二甲基辛二酰亞胺化物(dimethylsubermidate)共價(jià)連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。
該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域主要提供了該嵌合抗原的抗原部分。該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括免疫應(yīng)答所需的整體的至少一個(gè)抗原部分。該嵌合抗原，可選地，可以包括多于一個(gè)的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括感染物(例如病毒或?qū)Ｐ园麅?nèi)寄生蟲)的至少一個(gè)抗原部分或癌抗原的至少一個(gè)抗原部分。更優(yōu)選地，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括感染病毒的至少一個(gè)抗原部分。
優(yōu)選的感染性的病毒的實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人類免疫缺陷病毒，如人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)，還指的是HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III；以及其它分離的病毒，如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲肝病毒；腸道病毒，人類柯薩奇病毒、鼻病毒、艾可病毒)；卡里西病毒科(Calciviridae)(如，引起胃腸炎的菌株)；囊膜病毒科(如馬腦炎病毒、風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae)(如丙型肝炎病毒、登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(如冠狀病毒屬)；棒狀病毒科(如水皰性口腔炎病毒、狂犬病病毒)；線狀病毒科(如埃博拉病毒)；副粘病毒科(如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(如流感病毒)；布尼亞病毒科(如漢坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和納伊羅病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(如呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(人類乙型肝炎病毒(HBV)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV))；細(xì)小病毒科(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV)1和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒、皰疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；以及虹彩病毒科(如非洲豬熱病毒)；以及未分類的病毒(如δ肝炎物質(zhì)、非A非B肝炎物質(zhì)(類1-內(nèi)部傳播)；類2-胃腸外傳播；諾沃克病毒及相關(guān)病毒、以及星狀病毒)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該嵌合抗原的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)或多個(gè)蛋白的至少一個(gè)抗原部，該蛋白選自HBV蛋白、DHBV蛋白以及HCV蛋白。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的HBV蛋白包括，但不限于，HBV S1/S2、HBV S1/S2/S、HBV核心、HBV核心ctm(C-末端修飾)、HBV e抗原、以及HBV聚合酶。本發(fā)明中所用的特別優(yōu)選的DHBV蛋白包括，但不限于，DHBV PreS/S、DHBVPreS、DHBV核心、以及DHBV聚合酶。本發(fā)明中所用的特別優(yōu)選的HCV蛋白包括，但不限于，HCV核心(1-191)、HCV核心(1-177)、HCV E1-E2、HCV E1、HCV E2、HCV NS3、HCV NS5A和NS4A。本發(fā)明中所用的其他優(yōu)選的病毒抗原包括HIV gp120、HSV堿性核酸酶以及人類乳頭瘤病毒(HPV)殼體蛋白L1和L2、以及早期區(qū)域蛋白HPV E1、HPV E2、HPV E4、HPV E5、HPV E6和HPV E7。
優(yōu)選的專性胞內(nèi)寄生蟲的實(shí)例包括四膜蟲(如梨形四膜蟲)、瘧原蟲(如惡性瘧原蟲)、隱胞子蟲(Cryptospiridium sp.)、微胞子蟲(Spraguea sp.)(如S.lophii)、賈第鞭毛蟲、弓形蟲(如剛地弓形蟲、枯氏錐蟲)、利什曼原蟲、立克次氏體(如普氏立克次體)、衣原體、分支桿菌(如人型結(jié)核桿菌)、軍團(tuán)菌、李斯特菌(如單核細(xì)胞增生性李斯特菌)、考克斯體(如伯氏考克斯體)、志賀氏菌、埃里希體、以及巴爾通氏體(Bartonelia sp.)。優(yōu)選的癌抗原包括前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、MUC1、CA125、WT1、Her-2/neu、癌胚抗原(CEA)、MAGE-3、MART-1、gp100、NY-ESSO-1、CA19.9、TAG72、CA15.3、CA27.9、gp120、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、熱激蛋白、α-胎蛋白(AFP)、端粒酶、以及網(wǎng)狀激活系統(tǒng)(ras)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，該嵌合抗原的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括與一個(gè)或多個(gè)抗原部分融合的6xHis標(biāo)簽。
根據(jù)本發(fā)明，該嵌合抗原為一種能夠與抗原呈遞細(xì)胞(尤其是樹突細(xì)胞)上的Fc受體和/或CD206結(jié)合的蛋白，并且隨后通過受體介導(dǎo)的攝取被轉(zhuǎn)運(yùn)到該抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，抗體片段的存在增強(qiáng)了該嵌合抗原通過抗原呈遞細(xì)胞(尤其是樹突細(xì)胞)上的Fc受體的攝取。借助這種特異性結(jié)合和內(nèi)在化，病毒抗原被作為外來抗原處理和呈遞。因此可以有效地引發(fā)針對(duì)先前耐受的抗原的免疫應(yīng)答。該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括對(duì)宿主為異種型或非異種型的抗體片段。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)例中，該抗體片段包括鼠Fc片段。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施例中，該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括Fc片段、鉸鏈區(qū)、CH1區(qū)的部分，并且該嵌合抗原包括適于將目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接到免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的肽鍵。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括免疫球蛋白重鏈片段，可選地，進(jìn)一步包括鉸鏈區(qū)。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，該重鏈片段包括氨基酸、CH1結(jié)構(gòu)域的VDKKI(SEQ ID NO2)和/或部分或全部CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
如上所述，被CD206連接和內(nèi)在化的抗原可以被I類MHC和II類MHC呈遞，因此引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中，該嵌合抗原被糖基化。該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和/或目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被糖基化。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，該嵌合抗原可以通過高甘露糖糖基化或通過寡甘露糖糖基化(pauci mannoseglycosylation)而被甘露糖糖基化(mannose glycosylated)(Jarvis，Viurlogy 3101-7(2003))。
D.利用嵌合抗原的新穎方法本發(fā)明包括引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將包括本發(fā)明的嵌合抗原的組合物施用于目標(biāo)對(duì)象。
為了提供該抗原的有效呈遞，發(fā)明人開發(fā)了新穎的包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原，其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。雖然不限于本發(fā)明的特定理論，該分子借助抗體片段結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞的特定受體上，而病毒抗原被處理并與I類和II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)復(fù)合而被呈遞。這樣的處理和借助I類MHC的抗原呈遞引發(fā)了增強(qiáng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致與免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的該抗原相關(guān)的任何感染物的清除。此外，通過II類MHC分子呈遞的抗原引發(fā)了體液應(yīng)答，該應(yīng)答也有助于從感染細(xì)胞和/或從循環(huán)中清除該抗原。
本發(fā)明還包括破壞耐受性的方法，該方法包括將本發(fā)明的嵌合抗原施加給目標(biāo)對(duì)象。在呈遞抗原以便借助嵌合抗原引發(fā)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的過程中，在慢性感染中作為“自我”處理的抗原被識(shí)別為“外來”抗原。因此，該宿主的免疫系統(tǒng)將產(chǎn)生CTL應(yīng)答以便清除感染的細(xì)胞。同時(shí)，在應(yīng)答該嵌合抗原的過程中，引發(fā)的抗體將結(jié)合到感染物上并且從循環(huán)中清除它或者阻斷該感染物與宿主細(xì)胞的結(jié)合。因此，本發(fā)明被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生嵌合抗原，該嵌合抗原能夠在患有慢性感染(該感染被宿主的免疫系統(tǒng)耐受)的目標(biāo)對(duì)象導(dǎo)致廣泛的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該嵌合抗原在目標(biāo)對(duì)象中破壞對(duì)抗原的耐受性，其中該目標(biāo)對(duì)象被感染物(如病毒或寄生蟲)慢性感染或患有癌癥。更優(yōu)選地，該感染物在其生命周期的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)停留在宿主細(xì)胞內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，由于抗體片段的存在以及在真核生物(如昆蟲)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中引入的糖基化的存在，宿主免疫系統(tǒng)未識(shí)別或耐受的預(yù)先選擇的抗原的免疫原性被增強(qiáng)。由于抗體成分和糖基化的存在，這樣的嵌合抗原將結(jié)合到各種免疫細(xì)胞類型(包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞以及粒細(xì)胞)上存在的特定受體上。
本發(fā)明的又一方面提供了激活抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括將抗原呈遞細(xì)胞與本發(fā)明的嵌合抗原接觸。本發(fā)明還提供了提高抗原呈遞細(xì)胞中的抗原呈遞的方法，該方法包括將抗原呈遞細(xì)胞與包括本發(fā)明的嵌合抗原的組合物接觸。該嵌合抗原可以在體內(nèi)或體外與抗原呈遞細(xì)胞(優(yōu)選樹突細(xì)胞)接觸。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將該嵌合抗原與抗原呈遞細(xì)胞接觸可以激活該抗原呈遞細(xì)胞并提高多于一個(gè)表位的抗原呈遞。這種多表位應(yīng)答可以包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)表位的呈遞和/或目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)表位的呈遞。
本發(fā)明還提供了治療免疫-可治療的疾病的方法，該方法包括將有效治療量的本發(fā)明的嵌合抗原施用給所需要的目標(biāo)對(duì)象。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該免疫-可治療的疾病為感染或癌癥。該感染可以為病毒感染、寄生蟲感染、或細(xì)菌感染。優(yōu)選地，該感染將會(huì)有感染物存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的階段。更優(yōu)選地，該免疫-可治療的疾病為慢性病毒感染。更優(yōu)選地，該免疫-可治療的疾病為慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染或慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染。為了治療HBV，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括選自以下組的蛋白的至少一個(gè)抗原部分，該組包括HBV核心蛋白、HBV S蛋白、HBV S1蛋白、HBVS2蛋白、及其組合物。為了治療HCV，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括選自以下組的蛋白的至少一個(gè)抗原部分，該組包括HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCV E1蛋白、HCV E2蛋白、HCV E1-E2蛋白、HCV NS3A蛋白、HCV NS5A蛋白、及其組合物。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，該嵌合抗原的施用引發(fā)了比施用單獨(dú)的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域更大的免疫應(yīng)答。該免疫應(yīng)答的程度可以通過以下方式測量，例如通過(i)存在于目標(biāo)對(duì)象內(nèi)的抗原特異性抗體的量；(ii)由暴露于抗原呈遞細(xì)胞引起的應(yīng)答中的T細(xì)胞分泌的干擾素-γ的量，該抗原呈遞細(xì)胞負(fù)載有該嵌合抗原或僅免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域；或者(iii)由暴露于抗原呈遞細(xì)胞所引發(fā)的免疫應(yīng)答中的抗原特異性CD8+T細(xì)胞的量，該抗原呈遞細(xì)胞負(fù)載有該嵌合抗原或僅免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域。
可以通過在體內(nèi)或體外將該嵌合抗原呈遞給樹突細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答來評(píng)估該嵌合抗原的效能。樹突細(xì)胞處理并呈遞該嵌合抗原給T淋巴細(xì)胞，該T淋巴可以作為T細(xì)胞應(yīng)答的標(biāo)志物來評(píng)估T細(xì)胞的增值和干擾素-γ的生成。特殊地，在體外環(huán)境下，原始樹突細(xì)胞從周圍血液中分離處理。通過已知的方法測量標(biāo)記物(如干擾素-γ)的水平來評(píng)估借助樹突細(xì)胞的T細(xì)胞的活化。參見，如Berlyn，et al.，Clin.Immunol 101(3)276-283(2001).分泌至少達(dá)50％的干擾素-γ的T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)的增加預(yù)示了體內(nèi)的效果。在體內(nèi)情況下，該嵌合抗原被直接經(jīng)腸胃外導(dǎo)入宿主，在該宿主內(nèi)可獲得的樹突細(xì)胞和其它抗原處理細(xì)胞具有與抗原相互作用并由此處理它們的能力。
因此，本發(fā)明包括給目標(biāo)對(duì)象接種疫苗以防止感染的方法，該方法包括將本發(fā)明的嵌合抗原施加給該目標(biāo)對(duì)象。該目標(biāo)對(duì)象可以被預(yù)防性或治療性地接種疫苗。優(yōu)選地，該感染為病毒感染。該分子的雙功能性質(zhì)有助于將抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞(如樹突細(xì)胞)，通過將具有最有效的化學(xué)計(jì)量的抗原的抗原呈遞細(xì)胞靶向抗體，使它成為治療慢性感染性疾病的獨(dú)特的方法。這在治療慢性病毒感染(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒和單純皰疹病毒、專性胞內(nèi)寄生蟲)的治療性疫苗的開發(fā)中很有用，并且還可以應(yīng)用于如癌癥和自身免疫疾病等疾病中的所有自體同源抗原。這些融合蛋白的施加可以引發(fā)來自宿主的廣泛的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。因此，它們可以用作治療性疫苗以治療對(duì)現(xiàn)存的感染表現(xiàn)為免疫耐受的目標(biāo)對(duì)象，還可以在特定感染擴(kuò)展的風(fēng)險(xiǎn)下用作預(yù)防性疫苗以使目標(biāo)對(duì)象產(chǎn)生免疫。
E.制備嵌合抗原的方法本發(fā)明的一方面提供了用于生成嵌合抗原的方法，該方法包括(a)提供包括編碼嵌合抗原的多聚核苷酸的微生物或細(xì)胞系，優(yōu)選地為真核生物，更優(yōu)選地為非哺乳動(dòng)物微生物或細(xì)胞系；以及(b)將所述微生物或細(xì)胞系在一定條件下培養(yǎng)，在該條件下嵌合抗原被表達(dá)。優(yōu)選地，該微生物或細(xì)胞系為酵母、植物細(xì)胞系或昆蟲細(xì)胞系。更優(yōu)選地，該細(xì)胞系為選自Sf9、Sf21、Drosophila S2、High FiveTM的昆蟲細(xì)胞系。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例利用已建立的重組DNA技術(shù)來生成本發(fā)明實(shí)施中必需的所選抗原和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。融合蛋白的結(jié)構(gòu)在DNA水平結(jié)合特異性限制酶切位點(diǎn)生成，其通過將所希望的DNA片段引入表達(dá)載體來生成，并用于在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所希望的融合蛋白。本文所用的術(shù)語“載體”指的是能夠攜帶編碼所希望蛋白質(zhì)的DNA的質(zhì)粒。本發(fā)明中所用的優(yōu)選的質(zhì)粒載體包括，但不限于，pFastBac HTa和在DH10BacTME.coli(invitrogen)中生成的相應(yīng)重組“桿粒”。
編碼目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因可以通過聚和酶鏈反應(yīng)(PCR)從任何抗體生成細(xì)胞(例如生成單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞)中獲得。為了促進(jìn)隨后的克隆步驟，優(yōu)選設(shè)計(jì)加入單一的限制酶識(shí)別位點(diǎn)的低聚核苷酸引物。類似地，該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的抗原部分可以從包含編碼所希望的靶標(biāo)的抗原部分的基因的任何細(xì)胞或病毒RNA或DNA獲得。優(yōu)選地，PCR用于獲得編碼該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的抗原部分的DNA，而設(shè)計(jì)PCR引物以便加入獨(dú)特的限制酶識(shí)別位點(diǎn)用于促進(jìn)克隆。然而，任何重組DNA方法可以用于獲得編碼該免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的抗原部分的DNA。隨后編碼該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)以單一的結(jié)構(gòu)組合?？蛇x地，該獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域可以借助編碼連接體(如亮氨酸拉鏈、鏈霉抗生物素或生物素化信號(hào))的DNA克隆。
優(yōu)選地，桿狀病毒系統(tǒng)用于表達(dá)本發(fā)明的嵌合抗原，不僅是因?yàn)樯纱罅康漠愒吹鞍踪|(zhì)，而且還因?yàn)樵诟腥镜睦ハx細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的真核生物蛋白的翻譯后修飾，如磷酸化和糖基化。由于直接在昆蟲細(xì)胞內(nèi)克隆會(huì)比較困難，優(yōu)選在細(xì)菌系統(tǒng)中生成編碼該嵌合抗原的多聚核苷酸并且將最終的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)到桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，如Bac-To-BacTM系統(tǒng)(Invitrogen)是已知的。Bac-to-BacTM系統(tǒng)利用借助細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn7的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座以便將相關(guān)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸桿菌-昆蟲細(xì)胞穿梭載體(桿粒)內(nèi)。生成的重組桿粒被轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞內(nèi)以便產(chǎn)生表達(dá)重組蛋白的桿狀病毒。
為了生成桿狀病毒，桿粒被轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)內(nèi)。轉(zhuǎn)染后，該細(xì)胞被孵育足夠長的一段時(shí)間以擴(kuò)大該病毒載體群體間。收集包含該桿狀病毒的培養(yǎng)基并將其在4℃黑暗中貯存?？梢酝ㄟ^檢查桿狀病毒DNA的生成來證明該轉(zhuǎn)染，該DNA的生成是通過利用對(duì)所想要的DNA插入片段具有特異性的引物使該病毒培養(yǎng)物經(jīng)歷PCR來完成的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法(如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或蛋白質(zhì)印跡)來證實(shí)該細(xì)胞內(nèi)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。
將標(biāo)準(zhǔn)化的感染復(fù)數(shù)(MOI)的重組桿粒用于感染昆蟲細(xì)胞。將細(xì)胞以大約3×105細(xì)胞/mL的密度接種并于27.5℃的懸浮培養(yǎng)基中搖動(dòng)地孵育直到細(xì)胞密度達(dá)到大約2-3×106細(xì)胞/mL。隨后將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量的各重組桿狀病毒加入到細(xì)胞內(nèi)。孵育溫度為27.5℃并且合適的感染期對(duì)于獨(dú)立的蛋白表達(dá)是標(biāo)準(zhǔn)化的。通過離心收集該細(xì)胞并將其用于重組蛋白的純化。細(xì)胞中未使用的部分可以快速冷凍在液氮中并貯存在-70℃。
嵌合抗原，優(yōu)選地，在變性條件下純化。表達(dá)嵌合抗原的細(xì)胞在變性緩沖劑(如包含6M胍鹽-HCl的緩沖劑)作用下溶解?？梢酝ㄟ^機(jī)械方法(如超聲處理)增加溶解。將溶解產(chǎn)物離心以清除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞碎屑。隨后將上清液加載在用溶解緩沖劑預(yù)先平衡的Ni-NTA Super Flow(Qiagen)玻珠柱(bead column)上。加載后，用緩沖的變性溶液(優(yōu)選包含pH約為8的6M胍鹽-HCl)沖洗該柱。在這點(diǎn)上該變性劑可以在緩沖溶液中交換為如8M脲。溶解、加載和沖洗緩沖液優(yōu)選包含低濃度(如1-40mM)的咪唑。緩沖液交換后，該柱應(yīng)當(dāng)用緩沖液沖洗直到OD280降至例如＜0.1。可以用包含8M脲以及250mM咪唑，pH為8的緩沖劑(洗提緩沖劑)洗提結(jié)合的蛋白質(zhì)。包含該蛋白質(zhì)的片段被集中起來并在4℃相對(duì)于復(fù)合變化的低(如100mM)鹽變性透析緩沖劑(優(yōu)選包含8M脲)進(jìn)行透析。透析的蛋白質(zhì)隨后被加載到離子交換柱(如DEAE(二乙氨乙基))上。在優(yōu)選的實(shí)施例中，在加載到離子交換柱之前，二硫蘇糖醇(DTT)或其它還原劑被加入到該蛋白中。該嵌合抗原將通過DEAE柱。隨后，收集DEAE流過物并將其相對(duì)于包含濃度降低的變性劑的緩沖液逐步透析。在示例性的方法中，隨后將該蛋白相對(duì)于緩中的4M脲透析至少12小時(shí)，隨后相對(duì)緩沖的2M脲透析至少12小時(shí)，隨后相對(duì)緩沖的1M脲透析至少12小時(shí)，隨后相對(duì)緩沖的0.5M脲透析至少12小時(shí)，最后相對(duì)不包含變性劑的緩沖液透析至少12小時(shí)，優(yōu)選地，隨后相對(duì)不包含變性劑的新鮮的緩沖液另外透析兩個(gè)12小時(shí)。可以純化的、重新折疊的蛋白并利用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)(包括如，SDS凝膠電泳、等電聚焦、或蛋白質(zhì)印記分析)通過針對(duì)該表達(dá)的蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的抗體描繪其特征。
除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域內(nèi)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、以及免疫學(xué)的常用技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明，參見，如，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2ndEd.，New YorkCold Spring Harbor Press，1989；以及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience Publishers，(1995，as Supplemented April 2004，Supplement 66)。
F.新穎的多聚核苷酸本發(fā)明的另一方面提供了編碼嵌合抗原的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包括編碼免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的第一多聚核苷酸部(分)和編碼目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二多聚核苷酸部(分)。給第一和第二多聚核苷酸部可以位于相同或不同的核苷酸鏈上。
本發(fā)明提供了與編碼嵌合抗原、mRNA、和/或編碼序列相應(yīng)或互補(bǔ)的多聚核苷酸(優(yōu)選以獨(dú)立的形式)，該多聚核苷酸包括編碼嵌合抗原變異蛋白(variant protein)的多聚核苷酸；DNA、RNA、DNA/RNA雜合體、以及相關(guān)分子；與編碼嵌合抗原的基因或mRNA序列或其部分互補(bǔ)或具有至少90％的同源性的多聚核苷酸或寡核苷酸；以及與編碼嵌合抗原、mRNA的基因或與編碼嵌合抗原的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸或寡核苷酸。
另外，本發(fā)明包括編碼本文特別公開的嵌合抗原的基因的類似物。類似物包括，如，突變體，該突變體保持引發(fā)免疫應(yīng)答的能力，并且優(yōu)選地與編碼嵌合抗原的任何多聚核苷酸具有至少80％、更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％的同源性，該編碼嵌合抗原的多聚核苷酸如SEQ ID Nos26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、以及44所特別描述。通常，這樣的類似物僅有1到15個(gè)密碼子的差異。實(shí)例包括這樣的多肽，其與病毒抗原或抗體片段的天然氨基酸序列相比具有較小的氨基酸變化，尤其是保守的氨基酸置換。保守的置換是指那些側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的置換。基因編碼的氨基酸通常分為四個(gè)家族(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電的極性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被一起分為芳香族氨基酸。例如，這樣的預(yù)期是合理的，即亮氨酸被異亮氨酸或纈氨酸的單獨(dú)置換、天冬氨酸被谷氨酸的單獨(dú)置換、蘇氨酸被絲氨酸單獨(dú)置換、或氨基酸被結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸的類似的保守置換將不會(huì)對(duì)生物活性產(chǎn)生較大的影響。具有與SEQ ID Nos27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中任何一個(gè)披露的任何多肽基本上相同的氨基酸序列但具有較小的氨基酸取代(其基本上不影響嵌合抗原引發(fā)免疫應(yīng)答的能力)的多肽分子，是在分別具有SEQ ID Nos27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49所述的序列的嵌合抗原的定義范圍內(nèi)。衍生物包括與其它嵌合抗原分子的聚集接合體和與不相關(guān)的化學(xué)部分的共價(jià)接合體。共價(jià)衍生物通過本領(lǐng)域已知的方法通過將官能度連接到嵌合抗原氨基酸鏈內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)或在N-末端或C-末端的殘基基團(tuán)來制備。
表1中提供了氨基酸的縮寫。
表1氨基酸的縮寫

保守的氨基酸取代可以在蛋白質(zhì)內(nèi)進(jìn)行而不改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的構(gòu)象或功能。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以包括1至15的保守的取代。這樣的改變包括將異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、和亮氨酸(L)中的任何一種取代為這些疏水性氨基酸的任何其它一種；將天冬氨酸(D)取代為谷氨酸(E)，反之亦然；將谷氨酰胺(Q)取代為天冬酰胺(N)，反之亦然；以及將將絲氨酸(S)取代為蘇氨酸(T)，反之亦然。其它的取代也被認(rèn)為是保守的取代，取決于特定的氨基酸的環(huán)境和它在蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)經(jīng)?？梢曰Q，丙氨酸(A)和纈氨酸(V)也可以如此。相對(duì)疏水的蛋氨酸(M)經(jīng)?？梢耘c亮氨酸和異亮氨酸互換，有時(shí)可以與纈氨酸互換。賴氨酸(K)和精氨酸(R)通常在一定的位置可以互換，在該位置該氨基酸殘基的重要特征是它的電荷，而這兩個(gè)氨基酸殘基的不同pK是不重要的。還有其它的交換在特定環(huán)境中可以認(rèn)為是“保守的”(參見，如，Biochemistry 4thEd.，LubertStryer ed.(W.H.Freeman and Co.)，pages 18-23；Henikoff andHenikoff，Proc Nat’l Acad Sci USA 8910915-10919(1992)；Lei etal.，J Biol Chem 270(20)11882-6(1995))。
本發(fā)明還提供了優(yōu)選在嚴(yán)格的條件下，與編碼嵌合抗原的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸，該編碼嵌合抗原的多聚核苷酸如SEQ IDNOs26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、和44所具體描述。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格條件易于由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所決定并且通常根據(jù)探針的長度、沖洗溫度、以及鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)來考慮。通常較長的探針需要較高的溫度用于正確的退火，而較短的探針需要較低的溫度。當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于它們的熔融溫度的環(huán)境中時(shí)，雜交通常依賴于變性的核酸序列再次退火的能力。探針和雜交序列之間所希望的同源性的程度越高，所使用的相對(duì)溫度就越高。因此，隨之而來的是較高的相對(duì)溫度將會(huì)導(dǎo)致該反應(yīng)條件更嚴(yán)格，而較低的溫度將會(huì)導(dǎo)致該反應(yīng)條件更寬松。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格條件的更多細(xì)節(jié)和描述參見，例如Ausubel et al.，supra，at pages 2.9.1-2.10.8和4.9.1-4.9.13。
這里所限定的“嚴(yán)格的條件”或“高度嚴(yán)格的條件”指的是但不限于那些條件(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫用于沖洗，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，50℃；(2)雜交期間采用變性劑，如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液與750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，42℃；或(3)采用50％甲酰胺、5X SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5X Denhardt′s溶液、聲波處理的鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS、以及10％硫酸葡聚糖，42℃，以及在42℃在0.2X SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中沖洗和在55℃50％甲酰胺中沖洗，隨后用包含EDTA的0.1X SSC在55℃進(jìn)行高度嚴(yán)格的沖洗。“中等嚴(yán)格的條件”是指(但不限于)Sambrook etal.supra中的那些條件，并且包括利用比上述條件嚴(yán)格度低的沖洗溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格的條件的實(shí)例是指在特定溶液中37℃過夜孵育，該溶液包括20％甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5X Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20mg/mL變性的剪切過的鮭魚精子DNA，隨后以約37-50℃1X SSC沖洗過濾物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到必要時(shí)如何調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)如探針長度之類的因素。
編碼嵌合抗原的多聚核苷酸的實(shí)施例包括具有選自SEQ IDNOs27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中的任何一個(gè)序列的編碼嵌合抗原的多聚核苷酸，或者選自SEQ IDNOs26、28、30、32、34、36、38、40、42、46和48中任何一個(gè)的嵌合抗原的核苷酸序列，其中T可選地可以為U；例如，嵌合抗原的核苷酸的實(shí)例包括，但不限于(a)包括或由下述序列組成的多聚核苷酸SEQ ID NOsSEQID NO26的第1到1326個(gè)核苷酸、SEQ ID NO28的第1到2004個(gè)核苷酸、SEQ ID NO30的第1到1350個(gè)核苷酸、SEQ ID NO32的第1到1293個(gè)核苷酸、SEQ ID N034的第1到1794個(gè)核苷酸、SEQ ID NO36的第1到1581個(gè)核苷酸、SEQ ID NO38的第1到1389個(gè)核苷酸、SEQ ID NO40的第1到1347個(gè)核苷酸、SEQ ID NO42的第1到2157個(gè)核苷酸、SEQ ID NO44的第1到1395個(gè)核苷酸、SEQ ID NO46的第1到1905個(gè)核苷酸、或者SEQ ID NO48的第1到2484個(gè)核苷酸，其中T可以為U；
(b)具有與SEQ ID NOs26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48所述的序列具有至少80％同源性的序列的多聚核苷酸；(c)編碼嵌合抗原的多聚核苷酸，其序列由包含在下述質(zhì)粒之一中的DNA編碼，所述質(zhì)粒指定為保藏在加拿大國際保藏機(jī)構(gòu)(International Depository Authority of Canada)(加拿大衛(wèi)生部微生物辦公室(Bureau of Microbiology at Health Canada))中保藏登記號(hào)分別為080504-03、080504-04、080504-05、080504-02、080504-01的pFastBacHTa HBV S1/S2-TBD、pFastBacHTa HBV核心-TBD、pFastBacHTa HCV核心(1-177)-TBD、pFastBacHTa HCVNS5A-TBD、和pFastBacHTa HCV E2-TBD。
(d)編碼嵌合抗原的多聚核苷酸，該抗原序列為SEQ ID NO27的第1到442個(gè)氨基酸、SEQ ID NO29的第1到668個(gè)氨基酸、SEQ ID NO31的第1到450個(gè)氨基酸、SEQ ID NO33的第1到431個(gè)氨基酸、SEQ ID NO35的第1到598個(gè)氨基酸、SEQ ID NO37的第1到527個(gè)氨基酸、SEQ ID NO39的第1到463個(gè)氨基酸、SEQ ID NO41的第1到449個(gè)氨基酸、SEQ ID NO43的第1到719個(gè)氨基酸、SEQ ID NO45的第1到465個(gè)氨基酸、SEQ ID NO47的第1到635個(gè)氨基酸、或SEQ ID NO49的第1到828個(gè)氨基酸。
(e)編碼嵌合抗原相關(guān)蛋白的多聚核苷酸，該蛋白與下述的整個(gè)氨基酸序列至少90％相同，該整個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NO27的第1到442個(gè)氨基酸、SEQ ID NO29的第1到668個(gè)氨基酸、SEQ ID NO31的第1到450個(gè)氨基酸、SEQ ID NO33的第1到431個(gè)氨基酸、SEQ ID NO35的第1到598個(gè)氨基酸、SEQ ID NO37的第1到527個(gè)氨基酸、SEQ ID NO39的第1到463個(gè)氨基酸、SEQ ID NO41的第1到449個(gè)氨基酸、SEQ ID NO43的第1到719個(gè)氨基酸、SEQ ID NO45的第1到465個(gè)氨基酸、SEQ ID NO47的第1到635個(gè)氨基酸、或SEQ ID NO49的第1到828個(gè)氨基酸。
(f)與(a)-(d)中任何一個(gè)的多聚核苷酸完全互補(bǔ)的多聚核苷酸；以及(g)在嚴(yán)格的條件下選擇性地與(a)-(f)的多聚核苷酸雜交的多聚核苷酸。
本發(fā)明還提供了包含嵌合抗原多聚核苷酸的重組DNA或RNA分子，及其類似物或同源物，包括但不限于噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)、以及本領(lǐng)域已知的各種病毒和非病毒載體，以及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有這種重組DNA或RNA分子的細(xì)胞。用于生成這類分子的方法是公知的(參見，例如，Sambrook et al.，1989，supra)。
本發(fā)明還提供了在合適的原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)的包括含有嵌合抗原多聚核苷酸的重組DNA分子的宿主-載體系統(tǒng)，及其類似物或同源物。合適的真核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、或動(dòng)物細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞(如，桿狀病毒感染的細(xì)胞，如Sf9、Sf21、Drosophila S2或High FiveTM細(xì)胞)。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括各種前列腺癌細(xì)胞系，如DU145和TsuPrl，其它可感染或可轉(zhuǎn)換的前列腺癌細(xì)胞系、初級(jí)細(xì)胞(PrEC)、以及通常用于重組蛋白表達(dá)的大量哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS、CHO、293、293T細(xì)胞)。更具體地，包括該嵌合抗原的編碼序列的多聚核苷酸或其片段、類似物或同源物可以利用本領(lǐng)域常規(guī)使用并且公知的任何數(shù)量的宿主-載體系統(tǒng)用于生成其嵌合抗原。
適于其嵌合抗原表達(dá)的廣泛范圍的宿主-載體系統(tǒng)是可以獲得的，參見例如，Sambrook et al.，1989，supra；Ausubel，supra，at pages1.0.1-1.16.16，9.01-9.17.3，以及13.4.1-13.6.5)。用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選的載體包括但不限于pFastBac HTa(Invitrogen)。利用這樣的表達(dá)載體，可以在多個(gè)昆蟲細(xì)胞系(包括如Sf9、Sf21、DrosophilaS2、以及High Five)中表達(dá)嵌合抗原?？蛇x地，優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)包括釀酒酵母、人體酵母菌探針、巴氏畢赤酵母、以及Pichiaaugust。本發(fā)明的宿主-載體系統(tǒng)用于生成嵌合抗原。
可以通過轉(zhuǎn)染有編碼嵌合抗原的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞來生成嵌合抗原或其類似物或同源物。例如，Sf9細(xì)胞可以被編碼嵌合抗原或其類似物或同源物的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，該嵌合抗原在Sf9細(xì)胞中表達(dá)，并利用標(biāo)準(zhǔn)的純化方法分離該嵌合抗原?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域公知的各種其它表達(dá)系統(tǒng)。編碼加入嵌合抗原編碼序列的框架中的前導(dǎo)肽的表達(dá)結(jié)構(gòu)可以被用于分泌形式的嵌合抗原的生成。
如本文所述，遺傳密碼的冗余允許嵌合抗原基因序列的變化。尤其是，本領(lǐng)域中已知特定的宿主種類通常具有特定的密碼子偏好性，因此技術(shù)人員可以根據(jù)期望宿主的偏好性修改披露的序列。例如，優(yōu)選的類似物密碼子序列通常具有被較高頻率的密碼子置換的稀有密碼子(即在所希望的宿主的已知序列中的使用頻率小于約20％的密碼子)。對(duì)于特定種類的密碼子偏向可以通過例如，利用在互聯(lián)網(wǎng)上(如在環(huán)球網(wǎng)URLwww.kazusa.or.jp/codon)可以獲得的密碼子使用表來計(jì)算。
已知另外的序列修飾可以提高細(xì)胞宿主種的蛋白表達(dá)。這些包括清除編碼假性聚腺苷酸化信號(hào)、外顯子/內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子-類似的重復(fù)的序列，和/或?qū)虮磉_(dá)不利的其它這樣的特征明顯的序列。該序列的GC含量被調(diào)節(jié)為特定細(xì)胞宿主的平均水平，該水平參照宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因來計(jì)算。其中可能的，該序列被修飾以避免預(yù)期的發(fā)卡狀二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。其它可用的修飾包括如在Kozak，Mol.Cell Biol.，95073-5080(1989)中所述的在開放閱讀框的起始處的翻譯起始共有序列的添加。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解這個(gè)通常規(guī)則，即真核生物核糖體專有地在5’端的AUG密碼子處啟動(dòng)翻譯，僅在極少情況下被取消(參見，如Kozak Proc Nat’lAcad Sci USA 92(7)2662-2666(1995)以及Kozak Nucl Acids Res15(20)8125-8148(1987))。
G.本發(fā)明的藥物組合物本發(fā)明的一方面涉及藥物組合物，該組合物包括藥學(xué)上可接受的賦形劑和包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原，其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。在治療的應(yīng)用中，該藥物組合物可以以一定的數(shù)量施用給患者，該數(shù)量足以引起針對(duì)抗原的有效的B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和/或輔助T淋巴細(xì)胞(Th)的應(yīng)答并阻止感染或者足以治療或至少部分地抑制或緩解疾病或病癥的癥狀和/或并發(fā)癥。用于這種用途的有效的數(shù)量將依賴于例如所施用的特定組合物、給藥方式、要治療的疾病的階段和嚴(yán)重性、目標(biāo)對(duì)象的體重和總的健康狀態(tài)、以及開處方的醫(yī)師的判斷。
初始治療性免疫(用嵌合抗原)的劑量通常在單位劑量范圍內(nèi)，其中較低值為約1,5,50,500，或1,000ng，而較高值為約10,000μg；20,000μg；30,000μg；或50,000μg。用于人類的劑量值通常為每70公斤體重的目標(biāo)對(duì)象施用約500ng到約50,000μg。根據(jù)持續(xù)數(shù)周到數(shù)月的遞增用法，施用的嵌合抗原的遞增劑量從約1.0ng到約50,000μg，這取決于該目標(biāo)對(duì)象的反應(yīng)和疾病。施用應(yīng)該持續(xù)進(jìn)行直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室檢測表明該疾病已被預(yù)防、抑制、緩解或消除并且在其后的期間也是如此?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法學(xué)調(diào)整劑量、施用途徑、以及劑量日程表。
人類單位劑量形式的嵌合抗原通常包括在藥物組合物中，該藥物組合物包括可接受的載體(在一個(gè)實(shí)施例中為含水載體)的人類單位劑量并且以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的體積/數(shù)量施用以便用于將這類多肽施用于人類(參見，例如，RemingtonThe science andPractice of Pharmacy，20thEdition，A.Gennaro，Editor，LippincottWilliams & Wilkins，Baltimoe，Md.，2000)。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所明了的，各種因素可以影響具體情況下的理想劑量。這樣的因素包括，例如，嵌合抗原的半衰期、該嵌合抗原的結(jié)合親和力、該組合物的免疫原性、所希望的穩(wěn)態(tài)的濃度水平、施用途徑、治療頻率、與本發(fā)明的治療方法聯(lián)用的其它物質(zhì)的影響，以及特定目標(biāo)對(duì)象的健康狀態(tài)。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物用在嚴(yán)重的疾病狀態(tài)中，即，威脅生命或潛在威脅生命的狀況。在這種情況下，由于本發(fā)明的優(yōu)選的組合物的嵌合抗原的相對(duì)非毒性，施用比這些所述的劑量超過很多的嵌合抗原是可能的并且被治療醫(yī)師認(rèn)為是理想的。
在藥物配方中本發(fā)明的嵌合抗原的濃度可以廣泛的變化，即，從少于按重量的約0.1％、通常在或至少約2％至多達(dá)20％到50％或更多，并且將根據(jù)所選的具體施用方式主要按照流體容積、粘度等選擇。
該藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的任何途徑遞送，例如腸胃外、鞘內(nèi)、血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、真皮內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、局部、經(jīng)口、直腸、陰道、肺、腹膜內(nèi)途徑遞送。優(yōu)選地，該組合物通過腸胃外途徑遞送，例如皮下或真皮內(nèi)給藥。
該藥物組合物可以通過將所想要的嵌合抗原與合適的適于所希望的給藥途徑的賦形劑混合來制備。在本發(fā)明的藥物組合物的制備中，通常將該嵌合抗原與賦形劑混合、通過賦形劑稀釋或封裝在載體內(nèi)，該載體的形式可以為膠囊、小袋、紙或其它容器。當(dāng)藥學(xué)上可接受的賦形劑作為稀釋劑時(shí)，它可以為固態(tài)、半固態(tài)、或液態(tài)物質(zhì)，其作為治療劑的賦形劑、載體、或介質(zhì)。因此，該組合物的形式可以為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、袋劑、扁囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿劑、氣溶膠(作為固體或者在液態(tài)介質(zhì)中)、包含如達(dá)到按重量10％的嵌合抗原的軟膏劑、軟膠囊和硬膠囊、栓劑、無菌注射液、以及無菌包裝粉。
合適的賦形劑的一些實(shí)例包括，但不限于，右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿、以及甲基纖維素。該配方可以另外包括潤滑劑，如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；濕潤劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，如甲基苯甲酸酯和羥丙基苯甲酸酯；甜味劑；以及芳香劑。本發(fā)明的組合物可以這樣配方以便在采用本領(lǐng)域已知的方法將該嵌合抗原施加給目標(biāo)對(duì)象后提供該嵌合抗原的速釋、持續(xù)釋放或延遲釋放。(參見，如，Remington，supra，at pages 903-92 and pages 1015-1050)。
為了制備固態(tài)組合物(如片劑)，將該嵌合抗原與藥物賦形劑混合以形成包含本發(fā)明的嵌合抗原的均勻混合物的固態(tài)預(yù)制劑組合物。當(dāng)說到這些預(yù)制劑組合物是均勻的時(shí)，意味著該嵌合抗原在整個(gè)組合物中被均勻分散以便該組合物可以容易地再分入同等有效的單位劑量形式中，如片劑、丸劑和膠囊。
本發(fā)明的片劑或丸劑可以被涂覆或以其他形式復(fù)合以提供具有延長作用的優(yōu)點(diǎn)的劑量形式。例如，該片劑或丸劑可以包括內(nèi)劑量和外劑量成分，后者以前者的外殼形式存在。這兩種成分可以被腸層(enteric layer)分離，該層起到防止在胃中崩解的作用并且允許內(nèi)部成分完好地進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。多種物質(zhì)可以用于這種腸層或包衣，這種物質(zhì)包括大量聚合酸和聚合酸與這類物質(zhì)(如蟲膠、鯨蠟醇以及醋酸纖維素)的混合物。
本發(fā)明的新穎組合物可以被并入液體形式，用于經(jīng)口腔或經(jīng)注射施加，該液態(tài)形式包括含水溶液、適合口味的糖漿、含水或油的混懸液、以及用食用油(如玉米油、棉花籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)調(diào)味的乳劑、以及酏劑和類似的藥物賦形劑。
在制備用于腸胃外施用的組合物的過程中，要嚴(yán)格注意必需進(jìn)行張力調(diào)整以便減少刺激。可復(fù)水的組合物是以干燥形式包裝的無菌固體?？蓮?fù)水的組合物是優(yōu)選的，原因是它作為干燥固體貯存時(shí)比在準(zhǔn)備用于直接施用的液體中更穩(wěn)定。該干燥固體通常封裝在用丁基橡膠閉合的無菌容器內(nèi)以確保該固體以最佳的濕度范圍保存。通過干燥填充、噴霧干燥、或冷凍-干燥方法形成可復(fù)水的干燥固體。這些方法的描述可以在如Remington，supra，at pages 681-685 and802-803中找到。
用于腸胃外注射的組合物通常被稀釋，并且以較高比例存在的成分是賦形劑。該賦形劑通常無治療活性并且無毒，但是以適合吸收的形式將嵌合抗原遞送給機(jī)體組織。當(dāng)該嵌合抗原作為水溶液被遞送時(shí)吸收通常最快速和完全。然而，具有可與水混溶的液體的賦形劑改變?yōu)榛蛉〈鸀榫哂胁慌c水混溶的液體的賦形劑可以影響吸收率。優(yōu)選地，用于該組合物的最大值的賦形劑為等滲鹽水。在制備適于注射的該組合物的過程中，人們可以使用含水的賦形劑、與水混溶的賦形劑、以及不含水的賦形劑。
另外的物質(zhì)可以包含在本發(fā)明的可注射的組合物中，以便提高或保證該組合物的質(zhì)量。因此，添加的物質(zhì)可以影響溶解度、為目標(biāo)對(duì)象提供舒適感、提高化學(xué)穩(wěn)定性或者防止制劑中微生物的生長。因此，該組合物可以包括合適的增溶劑、起著抗氧化劑作用的物質(zhì)、以及起著防腐劑作用以防止微生物生長的物質(zhì)。這些物質(zhì)可以以適于它們的功能的數(shù)量存在，但是不會(huì)不利地影響該組合物的作用。合適的抗微生物劑的實(shí)例包括硫柳汞、芐索氯銨、苯扎氯銨、苯酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、以及對(duì)羥基苯甲酸丙酯。合適的抗氧化劑可以在Remington，supra，at p.1015-1017中找到。
在某些實(shí)施例中，脂質(zhì)體、毫微囊劑、微粒、脂質(zhì)顆粒、囊泡及類似物可以用于本發(fā)明的嵌合抗原的施用。尤其是，本發(fā)明的組合物可以被配置用于包封在脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球、或毫微粒或類似物中遞送。可選地，本發(fā)明的組合物可以共價(jià)地或非共價(jià)地連接到這樣的運(yùn)載賦形劑的表面。
通過脂質(zhì)體施加的組合物還可以用來1)將嵌合抗原靶向特定的組織，如淋巴組織；2)將嵌合抗原選擇性地靶向抗原呈遞細(xì)胞；或3)提高肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳狀液、泡沫、膠團(tuán)、不溶單層、液晶、磷脂分散體、片層和類似物。在這些制劑中，要被遞送的嵌合抗原作為脂質(zhì)體的成分，單獨(dú)地或與結(jié)合到淋巴細(xì)胞中占優(yōu)勢的(prevalent)受體上的分子(例如結(jié)合到CD45抗原上的單克隆抗體)或與其它治療性或免疫原性組分聯(lián)合并入。因此，被本發(fā)明的所期望的嵌合抗原填充或修飾的脂質(zhì)體可以直接到達(dá)淋巴細(xì)胞的位點(diǎn)，隨后在該處脂質(zhì)體遞送嵌合抗原。根據(jù)本發(fā)明所用的脂質(zhì)體形成于標(biāo)準(zhǔn)的囊泡形成脂質(zhì)，其通常包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和固醇，如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常要考慮如，脂質(zhì)體的大小、血流中脂質(zhì)體的酸不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性。多種方法可以用于制備脂質(zhì)體，如Szoka，et al.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467-508(1980)以及美國專利第4,235,871號(hào)、第4,501,728號(hào)、第4,837,028號(hào)、第5,019,369號(hào)中所描述的。包含嵌合抗原的脂質(zhì)體混懸液可以以一定劑量靜脈內(nèi)、局部地等方式施用，其中該劑量根據(jù)施用方式、被遞送的嵌合抗原、以及被治療的疾病的階段等改變。
用于吸入或吹入的組合物包括藥學(xué)上可接受的含水或有機(jī)溶劑的溶液和混懸液或其混合物及粉末。該液態(tài)或固態(tài)組合物可以包含合適的如本文所述的藥學(xué)上可接受的賦形劑?？梢越?jīng)口或經(jīng)鼻吸入途徑施加該組合物用于局部或全身作用。藥物上可接受的溶劑中的組合物可以借助惰性氣體霧化。霧化的溶液可以直接從霧化裝置吸入或者該霧化裝置可以連接到面罩支管上或間歇正壓呼吸機(jī)上。溶液、混懸液、或粉末組合物可以從以合適方式遞送該制劑的裝置中優(yōu)選地經(jīng)口或經(jīng)鼻施加。
本發(fā)明的方法中所用的另一配方采用經(jīng)皮遞送裝置(“塊狀物(patches)”)。這樣的經(jīng)皮塊狀物可以用于以可控的數(shù)量提供本發(fā)明的嵌合抗原的連續(xù)或不連續(xù)的注入。用于遞送藥物制劑的經(jīng)皮塊狀物的組成和使用在本領(lǐng)域是公知的。參見，例如，以引用方式結(jié)合于本文的美國專利第5,023,252號(hào)。這樣的塊狀物可以被構(gòu)造用于藥物制劑的持續(xù)的、脈動(dòng)的、或根據(jù)需要的遞送。
此外，除了包括嵌合抗原和藥物賦形劑外還包括至少一種抗病毒治療藥或化學(xué)治療藥可能是有利的?？共《局委熕幇ǎ幌抻?，仿多肽類藥物(peptidomimetics)(如安普那韋、茚地那韋、洛匹那韋、奈非那韋、利托那韋以及沙奎那韋)、多聚核苷酸(如阿普林津(ampligen)和福米韋生)、嘌呤/嘧啶酮(pyrimidinones)(例如阿巴卡韋、阿昔洛韋、阿德福韋、西多福韋、阿糖胞苷、地達(dá)諾新、雙脫氧阿糖腺苷、阿德福韋酯(dipivoxil)、依度尿苷、恩曲他濱、恩替卡韋、法昔洛韋、更昔洛韋、碘苷、異丙肌苷、拉米夫定、MADU、戊昔洛韋、索利夫定、司他夫定、替諾福韋、三氟尿苷、伐昔洛韋、瓦更昔洛韋、阿糖腺苷、扎西胞苷以及齊多夫定)、唾液酸類似物(如奧塞米韋和扎那米韋)、乙酰嗎喃、乙酰亮氨酸單乙醇胺、金剛烷胺、胺地洛霉素、阿的維定、capravirine、地拉韋定、正二十二烷醇、依非韋倫、膦甲酸鈉、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ凱托沙、溶菌酶、甲引噻腙、嗎啉胍、奈韋拉平、pentafuside、普可那利、普達(dá)非倫毒素、利巴韋林、金剛乙胺、司他霉素、匐枝青霉素、termacamra、以及traomantadine。其它合適的抗病毒劑描述在Remingtonsupra，at Chapter 87Anti-Infectives，pp.1507-1561，尤其是pp.1555-1560中。用于包含在本發(fā)明的藥物組合物中的優(yōu)選的抗病毒治療藥包括阿德福韋、阿德福韋酯、恩替卡韋、拉米夫定以及利巴韋林。
在一些實(shí)施例中希望在本發(fā)明的藥物組合物中包括至少一種引發(fā)B淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的組分。脂質(zhì)被認(rèn)為是能在體內(nèi)引發(fā)CTL的物質(zhì)。例如，棕櫚酸殘基可以被連接到賴氨酸殘基的ε-氨基和α-氨基上，隨后可例如通過一個(gè)或多個(gè)連接殘基(如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser、或類似物)被連接到免疫原性肽上。隨后可以施加脂質(zhì)化的肽，該肽可以在微團(tuán)或微粒內(nèi)直接施加、或者并入脂質(zhì)體內(nèi)施加、或者在佐劑(如不完全的弗氏佐劑)中乳化施加。在優(yōu)選的實(shí)施例中，特別有效的免疫原性組合物包括連接到賴氨酸的ε-氨基和α-氨基上的棕櫚酸，其通過鍵合(如Ser-Ser)連接到免疫原性肽的氨基端。
作為引發(fā)CTL應(yīng)答的脂質(zhì)的另一實(shí)施例，大腸桿菌脂蛋白(如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)在共價(jià)連接到合適的肽上時(shí)可以用于引發(fā)病毒特異性CTL(參見，如，Deres，et al.，Nature 342561(1989))。本發(fā)明的嵌合抗原可以被連接到，例如，P3CSS上，并且脂肽被施用給個(gè)體以特異性地引發(fā)針對(duì)目標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答。
雖然本發(fā)明的組合物不應(yīng)當(dāng)需要利用佐劑，但是佐劑是可以利用的。各種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，這依賴于宿主種類，而佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(如溶血卵磷脂、清潔劑、復(fù)合多元醇、多聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔血藍(lán)素、二硝基酚)免疫刺激性多核苷酸序列、以及潛在有效的人類佐劑(如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌)。其它的佐劑在本領(lǐng)域也是公知的。
H.制品本發(fā)明的另一方面提供了一種制品，該制品包括容納含嵌合抗原的組合物的容器，其適于注射或重新構(gòu)成用于注射，結(jié)合有打印的標(biāo)記指示，該打印的標(biāo)記指示提供怎樣在腸胃外(如皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、經(jīng)鼻或靜脈內(nèi))施用該組合物的說明。該組合物將被容納在任何合適的容器內(nèi)，該容器不會(huì)與組合物起顯著的相互作用，并且被貼上合適的標(biāo)簽，該標(biāo)簽說明了該組合物用于腸胃外使用。與該容器相關(guān)的標(biāo)記指示將與上文所述的治療方法一致。容納本發(fā)明的組合物的容器可以是具有適于注射的液態(tài)組合物的容器，該容器具有合適的注射針和注射器以便患者、醫(yī)生、護(hù)士、或其它實(shí)施者能夠施用嵌合抗原。可選地，該組合物可以為包含可溶形式的嵌合抗原的干燥或濃縮的組合物，該嵌合抗原與含水或不含水的媒介物結(jié)合或者被含水或不含水的媒介物稀釋，以便溶解或懸浮該組合物?？蛇x地，該容器可以具有液體中的懸浮液或者可以是與媒介物結(jié)合的不可溶形式的鹽，在媒介物中不可溶形式的鹽可以被懸浮。在Remington，supra，pages 788-789，805，850-851 and 1005-1014中論述了合適的容器。
本發(fā)明的試劑盒通常包括上述容器和一個(gè)或多個(gè)包括從商業(yè)和使用者立場上所希望的材料(包括緩沖劑、稀釋劑、過濾器、注射針、注射器、以及具有使用說明的包裝插入物)的其它容器。該容器上可以有標(biāo)簽來指示該組合物用于特定治療或非治療性應(yīng)用，并且還可以指示用于體內(nèi)或體外應(yīng)用(如上所述的那些)的使用說明。使用說明和/或其它信息也可以包括在該試劑盒內(nèi)的插入物上。
V.實(shí)施例下面的非限制性實(shí)施例提供了對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明。
A.實(shí)施例1TBD表達(dá)載體的構(gòu)建編碼CH1-鉸鏈-CH2-CH3區(qū)部分的氨基酸的鼠IgG1 DNA序列由分離自雜交瘤(2C12)的mRNA產(chǎn)生，其生成針對(duì)HBV表面抗原(sAg)的mAb。利用Trizol試劑(Gibco BRL cat.No.15596-026)分離全部mRNA并且利用Superscript First-strand Synthesis(Invitrogen Cat.No.11904-018)通過反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)生成目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TBD；鼠免疫球蛋白片段)的cDNA。PCR引物包含編碼連接肽的連接序列-5’端的SRPQGGGS-(SEQ ID NO1)，5’端獨(dú)特的Not I位點(diǎn)和3’端獨(dú)特的Hint III限制位點(diǎn)。生成的cDNA包含(5’Not I)-連接序列-CH1(VDKKI)(SEQ ID NO2).-鉸鏈區(qū)-CH2-CH3-(3’Hind III)。在相應(yīng)的酶消化之后，利用相同的限制性酶切位點(diǎn)，該片段與pFastBac HTa表達(dá)載體質(zhì)粒(Invitrogen))連接。用于PCR擴(kuò)增的5’端引物是(有義)5’TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG(SEQ ID NO3)并且3’端引物是(反義)5’ACGAATCAAGCTTTGCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG(SEQID NO4)，其分別包含了Not I和Hind III位點(diǎn)。隨后是用于定向克隆的方案。產(chǎn)生的片段被相應(yīng)的酶消化，在瓊脂糖凝膠上被純化并被克隆進(jìn)入載體質(zhì)粒。DNA序列和ORF的正確性通過標(biāo)準(zhǔn)的測序方法驗(yàn)證。
編碼目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA的克隆進(jìn)入pFastBac HTa供體質(zhì)粒后，利用Bac-to-BacTM桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)表達(dá)重組蛋白。克隆的基因通過在大腸桿菌菌株DH10Bac中的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)位被轉(zhuǎn)入桿粒。DH10Bac細(xì)胞包含了該穿梭載體，其賦予卡那霉素抗性和輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)座酶并賦予四環(huán)素抗性。100μl合適的DH10Bac細(xì)胞的等分試樣在冰上融化，基于pFastBacHTa的質(zhì)粒被加入，并且混合物在冰上孵育30分鐘。將該混合物在42℃熱擊45秒，然后在冰上冷卻2分鐘。隨后將該混合物加入到900μl LB培養(yǎng)基中并在37℃孵育4小時(shí)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞連續(xù)地用LB稀釋到10-1和10-2，并且將每個(gè)稀釋液100μl置于LB瓊脂板上(該瓊脂板添加有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/ml的四環(huán)素、100μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG)并且在37℃孵育至少36小時(shí)。由pFastBac HTa、X-gal和IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)給予的慶大霉素抗性被用于區(qū)分白色菌落(重組質(zhì)粒)和藍(lán)色菌落(非重組質(zhì)粒)。挑出白色菌落并將其接種于2ml LB培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基添加有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素和10μg/ml四環(huán)素)并在37℃振蕩孵育一整夜。用無菌環(huán)取少量的過夜培養(yǎng)物的試樣并且將該試樣劃線接種在新鮮的LB瓊脂板上(該瓊脂板添加有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml慶大霉素、10μg/ml的四環(huán)素，100μg/ml X-gal以及40μg/ml IPTG)并在37℃孵育至少36小時(shí)以便確認(rèn)白色表現(xiàn)型。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，supra)分離重組的桿粒，DNA樣品被溶解在40μl TE(10mM Tris-HCL pH8，lmM EDTA)中，并用于轉(zhuǎn)染。
為了生成桿狀病毒，將桿粒轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中。將Sf9細(xì)胞(9×105)接種在2ml ESF921(表達(dá)體系)中的6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿(35mm孔)的每個(gè)孔中，并且能夠在27℃附著至少1小時(shí)。利用Cellfiction試劑(Invitrogen，Cat.No.10362-010)按照由Sf9細(xì)胞的供應(yīng)者提供的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在27℃孵育72小時(shí)。收集包含桿狀病毒的培養(yǎng)基并將其在4℃下避光(在黑暗中)貯存。
通過檢測桿狀病毒DNA的生成來證實(shí)轉(zhuǎn)染的效率。將分離出的桿狀病毒DNA進(jìn)行PCR以篩選編碼TBD的插入基因。所用的引物為(有義)5’TATTCCGGATTATTCATACCG(SEQ ID NO5)和3’(反義)5’CTCTACAAATGTGGTATGGC(SEQ ID NO6)。擴(kuò)增的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠(0.8％)上跑膠。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和利用6xHis標(biāo)記的單克隆抗體(克隆技術(shù))作為探針的蛋白質(zhì)印跡來證實(shí)細(xì)胞中異源蛋白的表達(dá)。
一旦桿狀病毒的生成和蛋白的表達(dá)被證實(shí)，就擴(kuò)增病毒的生成以產(chǎn)生攜帶編碼目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因的桿狀病毒的濃縮的原種。將桿狀病毒擴(kuò)增至少兩倍是本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)做法，并且在本文所述的全部方案中都堅(jiān)持了該標(biāo)準(zhǔn)做法。在擴(kuò)增的第二循環(huán)之后，根據(jù)試劑盒(Invitrogen)制造者所述的方案利用噬菌斑測定可將生成的桿狀病毒的濃度定量。同時(shí)還確立了病毒感染High Five細(xì)胞的最適濃度和所希望的蛋白生成的最佳時(shí)間點(diǎn)。通常，對(duì)于TBD的表達(dá)采用MOI1和48小時(shí)的時(shí)間段。
B.實(shí)施例2嵌合抗原表達(dá)載體的構(gòu)建編碼所希望的病毒抗原的DNA利用PCR方法利用表2中5’有義和3’反義引物從模板生成。得到的擴(kuò)增片段的5’端包含獨(dú)特的限制位點(diǎn)“5’酶”，以及3’端包含獨(dú)特的限制位點(diǎn)“3’酶”，以上每個(gè)位點(diǎn)都用于連接。
表2嵌合抗原載體的構(gòu)建

將擴(kuò)增的DNA用合適的5’和3’限制酶消化，并且與pFastBacHTa表達(dá)載體連接，以產(chǎn)生僅用于病毒抗原的表達(dá)質(zhì)粒。同樣的DNA片段也與質(zhì)粒pFastBac HTa-TBD連接，如實(shí)施例1所述，隨后用相應(yīng)的酶消化以產(chǎn)生用于與目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的病毒抗原的表達(dá)質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒用于產(chǎn)生重組桿狀病毒，如實(shí)施例1所述，該重組桿狀病毒用于隨后在嵌合抗原表達(dá)中的使用。該嵌合抗原的DNA和氨基酸序列如表3所示。
表3嵌合抗原的序列

C.實(shí)施例3TBD、病毒抗原和嵌合抗原的表達(dá)和純化標(biāo)準(zhǔn)化的感染復(fù)數(shù)(MOI)的重組桿粒被用于感染High FiveTM昆蟲細(xì)胞。為了懸浮培養(yǎng)，將細(xì)胞以3×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種并且在27.5℃以138rpm振蕩孵育直到細(xì)胞密度達(dá)到2-3×106個(gè)細(xì)胞/mL。將標(biāo)準(zhǔn)量的相應(yīng)的重組桿狀病毒加入到細(xì)胞中。孵育溫度為27.5℃，并且合適的感染期被標(biāo)準(zhǔn)化以用于單個(gè)的蛋白表達(dá)。通過在4℃，2500rpm離心10分鐘來收集細(xì)胞并且將其用于重組蛋白的純化。將細(xì)胞中未使用的部分迅速冷凍在液氮中并貯存在-70℃。
在變性條件下純化重組蛋白。將該細(xì)胞在緩沖液(裂解緩沖液)(在100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris，300mM氯化鈉，10mM咪唑中包含6M胍鹽-HCl(guanidinium-HCl，鹽酸胍)，pH值8.0)中裂解。將懸浮液在60瓦的功率設(shè)置下在冰上以5個(gè)脈沖(每個(gè)脈沖1分鐘)超聲，隨后在室溫下持續(xù)混合1小時(shí)。將裂解液以10,000×g離心10分鐘，以去除未破裂的細(xì)胞和細(xì)胞殘?jiān)?。將上清液加載到Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)玻珠柱上(1×5cm/100mL細(xì)胞裂解液)，用裂解緩沖液預(yù)平衡。加載后，用20柱體積6M胍鹽-HCl(在100mM NaH2PO4、10mM Tris、300mM NaCl、40mM咪唑中，pH8.0)(沖洗緩沖液1)沖洗該柱，隨后用20柱體積的8M脲(在100mMNaH2PO4、10mM Tris、300mM NaCl、40mM咪唑中，pH8.0)(沖洗緩沖液2)沖洗該柱。用包含8M脲、100mM NaH2PO4、10mM Tris、300mM NaCl、250mM咪唑、pH8的緩沖液(洗脫緩沖液)洗脫該結(jié)合蛋白質(zhì)。將包含該蛋白的片段聚集并在4℃相對(duì)透析緩沖液(10mM NaH2PO4、300mM NaCl)的多個(gè)變化透析。利用標(biāo)準(zhǔn)的生化技術(shù)來描述純化蛋白的特征，該技術(shù)包括SDS凝膠電泳、等電聚焦、以及利用針對(duì)表達(dá)的蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的抗原的蛋白印記分析。
D.實(shí)施例4利用嵌合抗原融合蛋白破壞對(duì)“自我”蛋白的耐受性為了評(píng)估對(duì)嵌合抗原融合蛋白的免疫應(yīng)答，用純化的HBVS1/S2、TBD或S1/S2-TBD蛋白使小鼠產(chǎn)生免疫，量化針對(duì)各個(gè)蛋白產(chǎn)生的抗體。在與各自的蛋白的刺激之后，收集自免疫的小鼠的脾T細(xì)胞的增殖被評(píng)估。
年齡為15周的BALB/c小鼠用于免疫。以兩周的間隔用S1/S2-TBD(4.15μg)、S1/S2(4.15μg)或TBD(4.15μg)皮下注射小鼠四次。在開始免疫前和每次免疫之后一周收集血樣。從凝結(jié)的血樣中制備血清并且將該血清用于估計(jì)由宿主動(dòng)物產(chǎn)生的針對(duì)注射的各個(gè)抗原的抗體的水平。
1.用于檢測針對(duì)HBV S1/S2、TBD或S1/S2-TBD的抗體的ELISA以1.0μg/mL濃度的抗原HBV S1/S2、TBD或S1/S2-TBD涂覆96孔板并在4℃過夜。用包含2％BSA的PBS沖洗該板。來自各個(gè)動(dòng)物的稀釋的血清以不同的稀釋比例(1∶10-1∶500)被加入到每個(gè)孔中并在37℃溫育1小時(shí)。用包含0.05％吐溫20的PBS(沖洗緩沖液)沖洗該板。將山羊抗鼠IgG Fab-辣根過氧化物酶(HRP)(1∶5000)稀釋液加入到該孔中并在37℃溫育1小時(shí)。用沖洗緩沖液沖洗該板并且利用2-2’連氮基-二(3-乙基苯甲基噻唑啉-6-磺酸酯)(KPL，Guildford，UK)顯色。利用ELISA板讀出器(MolecularDevices，USA)在405nm波長測量樣品中所產(chǎn)生的顏色的光密度。用于該實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照是來自同一動(dòng)物的預(yù)先免疫的血清，其從所有的實(shí)驗(yàn)值中減去。用HBV S1/S2-TBD使小鼠產(chǎn)生免疫的結(jié)果如表4所示。嵌合抗原引發(fā)了針對(duì)嵌合抗原(S1/S2-TBD)的強(qiáng)烈的抗體應(yīng)答。
表4針對(duì)S1/S2-TBD的體液應(yīng)答

這里所述的抗體應(yīng)答具有多價(jià)(或多表位)的性質(zhì)。表4中所示的結(jié)果表明用HBV S1/S2-TBD免疫小鼠產(chǎn)生的抗體結(jié)合到該板上涂覆的嵌合抗原和S1/S2蛋白靶上。因此，產(chǎn)生了針對(duì)嵌合抗原的S1/S2組分的抗體。同樣地，由HBV S1/S2-TBD免疫小鼠產(chǎn)生的抗體結(jié)合到目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白上(表4)。包含鼠源性的蛋白的嵌合抗原可以在鼠中產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，表明該嵌合抗原可以將“自我”抗原轉(zhuǎn)變?yōu)椤巴鈦怼笨乖Ｒ虼?，可以破壞?duì)作為“自我”蛋白處理的蛋白的耐受性。
2.T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)在第四次免疫后一周將動(dòng)物處死，摘除脾，以及產(chǎn)生單獨(dú)的細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞以4×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種在96孔板中，一式三份。它們被分別加載0.1μg/mL HBV S1/S2、1.0μg/mL TBD或10μg/mL S1/S2-TBD抗原。陰性對(duì)照(negative control)細(xì)胞僅接受培養(yǎng)基而用于T細(xì)胞增殖的陽性對(duì)照為1.0-5.0μg/mL的植物凝集素(PHA)。在7％CO2的氣氛中，將該細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃溫育四天。將每個(gè)孔的細(xì)胞用1.0mCi的3[H]-胸腺嘧啶核苷脈沖并另外培育18小時(shí)，利用TOMTEC MACH3細(xì)胞收集器(Hamden，CT，USA)收集該細(xì)胞，并且利用Wallac Trilux 1450Microbeta液體閃爍和發(fā)光計(jì)數(shù)儀(Wallac，USA)將結(jié)合到玻璃纖維濾器(Wallac Oy，Turku，F(xiàn)inland)上的放射性活度定量。結(jié)果如表5所示。
表5針對(duì)HBV S1/S2-TBD的細(xì)胞應(yīng)答

當(dāng)用HBV S1/S2-TBD，S1/S2或TBD刺激時(shí)觀察到T細(xì)胞增殖。用嵌合抗原產(chǎn)生的免疫導(dǎo)致多價(jià)的T細(xì)胞應(yīng)答，即，針對(duì)相同蛋白的不同部位的應(yīng)答。包含鼠源性蛋白的嵌合抗原可以在鼠中產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明該嵌合抗原可以將“自我”抗原轉(zhuǎn)變?yōu)椤巴鈦怼笨乖?。因此，可以破壞?duì)作為“自我”蛋白處理的蛋白的耐受性。
E.實(shí)施例5抗原呈遞實(shí)驗(yàn)利用體外抗原呈遞實(shí)驗(yàn)來測量HBV S1/S2-TBD引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。在用抗原加載的抗原呈遞細(xì)胞(APC)(如樹突細(xì)胞(DC))多次刺激原始T細(xì)胞之后有效T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生通過計(jì)數(shù)(量化)抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量的增長以及T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子IFN-γ的能力來估算。
1.通過粘附選擇單核細(xì)胞通過添加AIM-V融解外周血單核細(xì)胞(PBMC)(比率為9mlAIM-V添加到1ml冷凍細(xì)胞中)。隨后將該細(xì)胞以200×g離心5分鐘，去除上清液，然后將該細(xì)胞再次懸浮在AIM-V/1％相配的血清(matched serum)中并將其加入到100ml培養(yǎng)皿或T-25培養(yǎng)瓶中。在37℃7％的CO2下，在潮濕的培養(yǎng)箱中將PBMC溫育1小時(shí)。為了去除未粘附的細(xì)胞，將該培養(yǎng)物研磨數(shù)次，棄去上清液，并且用AIM-V培養(yǎng)基將該細(xì)胞沖洗一次。用細(xì)胞刮器收集單核細(xì)胞并以300×g離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀以2×106細(xì)胞/ml重新懸浮在AIM-V/2.5％相配的血清中，并接種在24孔皿中。將細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF(每個(gè)1000IU/ml)加入以促使單核細(xì)胞分化為未成熟的DC。
2.快速或緩慢抗原呈遞實(shí)驗(yàn)對(duì)于快速抗原呈遞實(shí)驗(yàn)(APA)，將抗原加入到未成熟的DC中在4-24小時(shí)內(nèi)分離。另外的24小時(shí)后，通過與PGE2(1μM)，IL-1β(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)培養(yǎng)24小時(shí)將抗原負(fù)載的未成熟單核細(xì)胞誘發(fā)為成熟的單核細(xì)胞。隨后將成熟的DC與自體同源的T細(xì)胞共同孵育(首次刺激)。利用磁性T細(xì)胞分離試劑盒(Dynal)根據(jù)制造者的說明借助陰性選擇從與DC相同的PBMC產(chǎn)生T細(xì)胞。
隨后在IL-2(20IU/ml)，IL-7(10ng/ml)和IL-15(5ng/ml)的存在下用抗原負(fù)載的成熟DC重新刺激T細(xì)胞7天。7天的孵育以后，用抗原負(fù)載的成熟DC第三次重新刺激T細(xì)胞。第三次刺激持續(xù)6小時(shí)，隨后T細(xì)胞被收集并為CD3、CD3和IFN-γ表達(dá)進(jìn)行免疫染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
對(duì)于緩慢APA，在添加抗原前在GM-CSF和IL-4存在5到6天的情況下單核細(xì)胞被允許分化為未成熟的DC?？乖砑雍?小時(shí)，通過TNF-α(10ng/ml)和INF-α(50IU/ml)使未成熟的DC成熟。分離后七天，將成熟的DC與自體同源T細(xì)胞共同培養(yǎng)(首次刺激)(如上所述)。
隨后，在IL-2，IL-7和IL-15存在的情況下，T細(xì)胞被抗原負(fù)載的成熟DC重新刺激7天。7天孵育后，用抗原負(fù)載的成熟DC第三次重新刺激該細(xì)胞。18個(gè)小時(shí)的孵育后，該T細(xì)胞被收集并為CD3，CD8和IFN-γ表達(dá)進(jìn)行免疫染色，并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
3.BMC抗原呈遞實(shí)驗(yàn)在該實(shí)驗(yàn)中，初始培養(yǎng)物包括總體的PBMC(即淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)，其與抗原和IL-2一起孵育，假定該系統(tǒng)類似于體內(nèi)免疫應(yīng)答，其原因是所有細(xì)胞類型存在并參與(Maini，M.K et.al J.Exp.Med.1911269-1280，2000)。PBMC被融解、沖洗和迅速與抗原孵育。在培養(yǎng)四天以允許抗原攝取和呈遞之后，IL-2(20IU/ml)被加入并停留另外的8天(即該實(shí)驗(yàn)的第12天)。在第二次刺激前兩天(即該實(shí)驗(yàn)的第10天)，通過以上所述的粘附分離DC，并且迅速將其與GM-CSF，IL-4和抗原一起孵育24小時(shí)。至于快速API，不成熟的DC被允許在加入PGE2，IL-1β和TCF-α后，分化24小時(shí)。隨后在IL-2，IL-7和IL-15的存在下將加載的成熟DC加入到PBMC培養(yǎng)物中(第二次刺激，該實(shí)驗(yàn)的第12天)。第三次刺激發(fā)生在該實(shí)驗(yàn)的第21天，用該實(shí)驗(yàn)第21天的前兩天制備的抗原負(fù)載的成熟DC。在6小時(shí)孵育后，該T細(xì)胞被收集并為CD3，CD8和IFN-γ表達(dá)進(jìn)行免疫染色，并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
對(duì)于所有上述抗原呈遞實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)的末尾，部分T細(xì)胞被孵育另外的3到5天并通過四聚物分析檢查特異性T細(xì)胞(參見下文)。
4.HBV S1/S2引發(fā)針對(duì)HBV S1和S2肽的T細(xì)胞應(yīng)答PBMC APA用于產(chǎn)生T細(xì)胞，其隨后被評(píng)估它們的抗原特異性。因此，來自健康HLA-A2個(gè)體的PBMC以5×105細(xì)胞/ml在96孔板中包含2.5％相配的血清的AIM-V中培養(yǎng)?？乖?即10μg/mlS1/S2-TBD)被加入并且細(xì)胞在37℃培養(yǎng)4天。隨后將IL-2以20IU/ml加入并且該細(xì)胞被培養(yǎng)另外的8天，同時(shí)每2-3天更換培養(yǎng)基(AIM-V/2.5％相應(yīng)的血清和20IU/ml IL-2)。在12天培養(yǎng)的末期保留的大部分細(xì)胞為T細(xì)胞，并且在IL-2(20IU/ml)，IL-7(10ng/ml)，和IL-15(5ng/ml)的存在下用自體同源的抗原負(fù)載的成熟DC重新刺激這些T細(xì)胞。
在APA中用于第二次和第三次刺激T細(xì)胞的抗原負(fù)載的成熟DC利用如下所述的方法48小時(shí)后產(chǎn)生。通過粘附在塑料的組織培養(yǎng)皿上從總體的PBMC中分離出單核細(xì)胞。該細(xì)胞(通過FACS測定其約85％為單核細(xì)胞(CD11c+，CD14+，CD19-，和CD3-))在96孔板中以1×105細(xì)胞/孔培養(yǎng)，該孔包含具有1000IU/ml的細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF的100μl AIM-V/2.5％相配的血清，4小時(shí)后將抗原如S1/S2-TBD加入。20小時(shí)孵育后，通過在PGE2(1×10-6M)，IL-1β(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)的存在下培養(yǎng)另外的24小時(shí)，生成的不成熟的DC分化為成熟的DC。
第二次刺激后將T細(xì)胞培養(yǎng)7天，每1-2天更換培養(yǎng)基(具有2.5％相配的血清的AIM V和20IU/ml IL-2)。隨后在IL-2、IL-7和IL-15(如上所述)存在的情況下將T細(xì)胞(培養(yǎng)19天)用抗原負(fù)載的成熟DC(通過上述2天的過程生成)刺激第三次，并且在6小時(shí)的培養(yǎng)后評(píng)估IFN-γ的生成或者培養(yǎng)5天(每1-2天用AIMV/2.5％對(duì)應(yīng)的血清和20IU/ml IL-2更換培養(yǎng)基)，隨后利用HBVpreS四聚物評(píng)估T細(xì)胞對(duì)HBV preS抗原的特異性(培養(yǎng)的第24天)。
根據(jù)制造者的方案用按慣例合成的iTag MHC I類四聚物(Beckman Coulter)進(jìn)行四聚物分析。因此將細(xì)胞收集、沖洗并以～2×105細(xì)胞/孔，20μl轉(zhuǎn)移到96孔v-底板上。用對(duì)CD3(抗CD3-FITC)和CD8(抗CD8-半胱氨酸-鉻)特異性的mAb和2μl PE接合的HLA-A*0201preS1四聚物(GMLTPVSTI，SEQ ID NO50)或preS2四聚物(NIASHISSI，SEQ ID NO51)一起在20℃標(biāo)記該細(xì)胞30分鐘。隨后將該細(xì)胞沖洗、用PBS中2％低聚甲醛(paraformaldyde)固定并轉(zhuǎn)移到5mlFACS管中。在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBioscience)上每個(gè)樣品中獲取80,000-100,000細(xì)胞。利用CellQuest軟件(BD Biosciences)進(jìn)行分析(該軟件在有活性的(基于FSC/SSC方面)CD3+群體上設(shè)門)，并且確定用四聚物標(biāo)記的CD8+細(xì)胞的百分比。當(dāng)PBMC用10μg/ml的HBV S1/S2-TBD培養(yǎng)并且用HBVS1/S2-TBD負(fù)載的成熟DC重新刺激兩次時(shí)，標(biāo)出的百分比的細(xì)胞用S1四聚物(圖2)和S2四聚物(圖3)標(biāo)記為陽性。這與用未經(jīng)抗原負(fù)載的成熟DC培養(yǎng)的T細(xì)胞(其中四聚物陽性的細(xì)胞的數(shù)量不顯著)形成對(duì)比。因此，負(fù)載S1/S2-TBD的成熟DC能夠誘導(dǎo)對(duì)HBV S1和HBV S2抗原的決定因子具有特異性的顯著數(shù)目的T細(xì)胞的生成。
F.實(shí)施例6利用嵌合抗原融和蛋白破壞對(duì)DHBV和DHBV抗原的耐受性DHBV在HBV的抗病毒治療的發(fā)展中被用作有效的動(dòng)物模型。先天感染有DHBV的Pekin鴨已被用于研究病毒復(fù)制的機(jī)制和用于篩選抗病毒成分。在本發(fā)明中用到了兩種鴨模型。第一種是先天感染DHBV的鴨。這類似于人類HBV感染者的垂直傳播。第二種為持續(xù)感染模型，其中新孵育的小鴨感染有DHBV并且這些小鴨攜帶感染。第二種模型類似于人類HBV感染者的水平傳播。
1.先天感染有DHBV的鴨子先天感染有DHBV的鴨子在出生四周時(shí)被分為2組。收集血液樣品(1.0mL)作為免疫前抗體水平的對(duì)照，并且在疫苗接種前每周收集血液樣品。試驗(yàn)組在每周同一天接受19.95mg/劑量皮下注射的DHBV核心-TBD嵌合抗原融和蛋白直到第5周。在第六周，劑量加倍并且每四周注射一次直到疫苗接種在第26周中斷。對(duì)照組(placebo group)接受同等量的緩沖液(20mM磷酸鈉pH8.0，300mMNaCl)。
將96孔板涂以1.0μg/mL濃度的抗原、DHBV核心、TBD或DHBV核心-TBD并在4℃過夜。用包含2％BSA的磷酸緩沖鹽(PBS)沖洗該板。將來自各個(gè)動(dòng)物的不同稀釋度(1∶10-1∶500)稀釋的血清加入到每個(gè)孔中并在37℃孵育1小時(shí)。用包含0.05％吐溫20的PBS(沖洗緩沖液)沖洗該板。將山羊抗鴨IgG-HRP(1∶5000)稀釋液加入到該孔中并在37℃孵育1小時(shí)。用沖洗緩沖液沖洗該板并用2-2’連氮基-二(3-乙基苯甲基噻唑啉-6-磺酸鹽)(KPL，Guildford，UK)顯色。利用ELISA板讀出器(MolecularDevices，USA)測量樣品中產(chǎn)生的顏色的光密度。相對(duì)于來自相同動(dòng)物的免疫前的血清計(jì)算抗體的滴定度。
在0、3、和6周來自對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的鴨中先天感染有DHBV的鴨的血清中的抗-核心抗體的水平示于表6中。雖然該鴨患有慢性DHBV感染，但是由于感染的慢性性質(zhì)以及免疫系統(tǒng)不能將該抗原作為外來分子識(shí)別，所以抗體水平較低。在用DHBV核心-TBD嵌合抗原免疫后，宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別病毒抗原并產(chǎn)生針對(duì)已經(jīng)存在于宿主體內(nèi)的核心抗原的體液免疫應(yīng)答，由此破壞宿主對(duì)病毒抗原的耐受性。
表6針對(duì)DHBV核心-TBD的體液免疫應(yīng)答

同樣地，鴨的免疫系統(tǒng)將該嵌合抗原的TBD成分識(shí)別為外來抗原并同樣產(chǎn)生針對(duì)融合蛋白的這部分的免疫應(yīng)答。用TBD和來自個(gè)體鴨的血清涂板用于通過ELISA評(píng)估抗體水平。這項(xiàng)研究的結(jié)果示于表6中。
2.孵化后感染DHBV的鴨在小鴨孵化后一天用包含DHBV的鴨血清感染正常的小鴨。這在DHBV研究領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)的做法。在免疫開始前4周利用已建立的技術(shù)確證持續(xù)的病毒血癥的存在。將感染DHBV的鴨分成兩組。從每只鴨收集血液樣品(1.0mL)作為免疫前抗體水平的對(duì)照，并且在疫苗接種前每周收集血液樣品。試驗(yàn)組在每周同一天接受19.95μg/劑量皮下注射的DHBV核心-TBD融和蛋白直到第5周。在第六周，劑量加倍并且每四周注射一次直到疫苗接種在第30周中斷。從對(duì)照組收集血液樣品，該對(duì)照組接受同等量的緩沖液(20mM磷酸鈉pH8.0，300mM NaCl)。
已檢測出在第0、3、和6周時(shí)從鴨中收集的血清中的抗體水平。在對(duì)照組和試驗(yàn)組的鴨中孵育后感染DHBV的鴨的血清中抗核心抗體的水平示于表7中。雖然DHBV已經(jīng)建立了持續(xù)的感染，但是由于免疫系統(tǒng)不能將該病毒抗原作為外來分子識(shí)別，所以抗體水平較低。在用DHBV核心-TBD嵌合抗原免疫后，宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別病毒抗原并產(chǎn)生針對(duì)已經(jīng)存在于宿主體內(nèi)的核心抗原的體液免疫應(yīng)答，由此破壞宿主對(duì)病毒抗原的耐受性。針對(duì)TBD的抗體水平也升高(表7)。因此，存在針對(duì)同一嵌合抗原的不同部位的多價(jià)(或多表位)免疫應(yīng)答。
表7針對(duì)DHBV核心-TBD的體液免疫應(yīng)答

G.實(shí)施例7嵌合交聯(lián)的HBV sAg-Fc(鼠)在4℃相對(duì)100mM HEPES(pH8.7)透析100μg sAg(USBiologicals；Cat#H1910-27)和100μg鼠多克隆IgG Fc片段(HarlanSera-Lab Ltd.，Cat#PP-19-01)的溶液一整夜。將該蛋白溶液混合到一起，并將二甲基辛二酰亞胺化物(DMS；Pierce Cat#20700)立即加入到10mM的最終濃度，隨后在室溫下將該混合物孵育1小時(shí)。通過加入0.1M Tris HCl pH7.8將該反應(yīng)終止。將反應(yīng)混合物加載在Sephadex G75柱(0.7×12cm)上，并利用磷酸緩沖鹽洗脫片段。收集0.5ml片段并集中包含摩爾比例為1∶1(其利用相應(yīng)的抗體通過ELISA估計(jì))的sAg/Fc的片段。
將集中起來的片段用于抗原呈遞實(shí)驗(yàn)(Berlyn，et al.，Clin.Immunol.101276-283，(2001))。將未成熟的樹突細(xì)胞用GM-CSF/IL4培養(yǎng)4天，與sAg-Fc接合體孵育，并在TNFα和干擾素-α存在的條件下成熟。將自體同源的CD3+T細(xì)胞加入到成熟的樹突細(xì)胞中。在暴露于成熟的樹突細(xì)胞三個(gè)循環(huán)后，通過利用流式細(xì)胞術(shù)測量胞內(nèi)干擾素-γ的生成將T細(xì)胞刺激物定量。在接合體存在的情況下T細(xì)胞中生成的胞內(nèi)干擾素-γ的水平比僅僅sAg或Fc片段存在的情況下要高的多(表8)。
表8針對(duì)HbsAg-Fc DMS接合體的T細(xì)胞應(yīng)答

H.實(shí)施例8抗原呈遞實(shí)驗(yàn)根據(jù)建立的方案(Berlyn，et al.，supra(2001))利用人類PBMC來源的樹突細(xì)胞進(jìn)行抗原呈遞實(shí)驗(yàn)。用于T細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)的方案總結(jié)以示意形式如下所示。

1.成熟的加載的樹突細(xì)胞的制備從健康捐贈(zèng)者的白細(xì)胞去除的樣品中產(chǎn)生單核細(xì)胞并且通過與抗-CD2、CD7、CD16、CD19以及CD56抗體孵育來消耗掉淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。隨后將其與磁性玻珠結(jié)合的抗鼠IgG孵育并在磁體(Dynal)上分離。陰性選擇的細(xì)胞大于95％的純單核細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)利用廣泛的CD標(biāo)記物板(CD14+、CD11c+、CD19-、CD3-、CD4-、CD64+、CD32+、CD86+、CD16-)確定其特征。隨后，將單核細(xì)胞與GM-CSF(R&D系統(tǒng))在AIMV加2.5％相應(yīng)的人類血清中孵育4天以生成未成熟的樹突細(xì)胞。再次，將該細(xì)胞的等分試樣通過廣泛的CD標(biāo)記物板染色以確保該細(xì)胞的純度和同一性。隨后在37℃用HBV S1/S2-TBD(5.0μg/ml)、HBV S1/S2(2.5μg/ml)、或TBD(2.5μg/ml)將該細(xì)胞加載2-4小時(shí)，隨后用干擾素-α和TNF-α使細(xì)胞成熟3天。利用流式細(xì)胞儀(一批CD標(biāo)記物)再次檢查樹突細(xì)胞，以確保該細(xì)胞已經(jīng)歷恰當(dāng)?shù)某墒?。所生成的成熟的加載的樹突細(xì)胞用于T細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)。
2.T細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)細(xì)胞因子分析利用磁性T細(xì)胞分離試劑盒(Dynal)根據(jù)制造者的說明借助陰性選擇從與樹突細(xì)胞相同的PMBC樣品中生成T細(xì)胞。成熟的加載的樹突細(xì)胞(DC-1)被徹底沖洗并加入T細(xì)胞中(第0天)。將該T細(xì)胞與樹突細(xì)胞孵育7天。在第7天，該T細(xì)胞被成熟的、加載的樹突細(xì)胞(DC-2)重新刺激。2小時(shí)后取該細(xì)胞的等分試樣。將該細(xì)胞的等分試樣與布雷菲德菌素A(GolgiPlugTM，R&D系統(tǒng))孵育18小時(shí)并且隨后用于下述的胞內(nèi)細(xì)胞因子染色實(shí)驗(yàn)。
將殘余的細(xì)胞孵育另外7天。在第14天，用第三批成熟的、加載的樹突細(xì)胞(DC-3)刺激殘余的細(xì)胞。2小時(shí)后取該細(xì)胞的等分試樣。將該細(xì)胞的等分試樣與布雷菲德菌素A(GolgiPlugTM，R&D系統(tǒng))孵育18小時(shí)并且隨后用于下述的胞內(nèi)細(xì)胞因子染色實(shí)驗(yàn)。
對(duì)于胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，將細(xì)胞用抗-CD3-FITC和抗CD8-半胱氨酸-鉻染色30分鐘，沖洗、固定、透化處理，隨后用抗干擾素-γ-PE在冰上染色30分鐘。將細(xì)胞沖洗并通過流式細(xì)胞儀(FACScan，BD Biosciences)分析。結(jié)果示于表9中。
表9CD3+/IFN-γ+T細(xì)胞

在第14天去除等分試樣后，將剩余的T細(xì)胞孵育另外三天并且隨后將上清液用于通過ELISA(Opt E1A ELISA kit，BDBiosciences)測量分泌的干擾素-γ的水平。通過測量細(xì)胞內(nèi)和分泌的干擾素-γ的水平來評(píng)估T細(xì)胞刺激。結(jié)果示于表10中。在相同濃度下，嵌合抗原S1/S2-TBD誘導(dǎo)的干擾素-γ生成的水平高于當(dāng)單獨(dú)用分子的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域或TBD結(jié)構(gòu)域?qū)嶒?yàn)時(shí)該分子的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域或TBD結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)的干擾素-γ生成的水平。應(yīng)當(dāng)指出5μg劑量的S1/S2-TBD大約包含2.5μg每個(gè)該組分。
表10胞內(nèi)和分泌的干擾素-γ的水平

為T細(xì)胞應(yīng)答檢測了S1/S2-TBD的各種濃度。S1/S2-TBD的作用大于類似濃度下破傷風(fēng)類毒素處理的效果。在濃度低于5μg/mL時(shí)，該嵌合抗原引發(fā)了干擾素-γ的生成和分泌的濃度依賴性(即與S1/S2-TBD抗原濃度正相關(guān))的增加。在S1/S2-TBD抗原被樹突細(xì)胞呈遞后，由CD3+T細(xì)胞生成和分泌的干擾素-γ以濃度依賴性的方式增加，如表11所示。低濃度的陽性應(yīng)答相對(duì)疫苗接種必要的劑量和制造疫苗的成本來說將是有利的。
表11針對(duì)嵌合抗原的濃度依賴性的應(yīng)答

I.實(shí)施例9嵌合抗原的結(jié)合和攝取1.成熟的加載的嵌合抗原的制備從白細(xì)胞除去的細(xì)胞(leukapheresis cell)制備(Berlyn，et al，supra(2001))的Ficoll/Histopaque(Sigma)的處理中獲得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。利用單核細(xì)胞分離試劑盒(Dynal)按照制造者的說明通過陰性選擇從PBMC群體中分離單核細(xì)胞。通過抗體分析和流式細(xì)胞術(shù)(CD14+，CD11c+，CD19-，CD3-，CD4-，CD64+，CD32+，CD86+，CD16-)估計(jì)的單核細(xì)胞的純度大于95％。用具有1％供血者相匹配的血清(如Berlyn，et al.，supra(2001)中所述分離)的AIM-V(Invitrogen)培養(yǎng)基沖洗單核細(xì)胞兩次，該培養(yǎng)基包含L-谷氨酰胺、硫酸鏈霉素(50μg/mL)以及硫酸慶大霉素(10μg/mL)。隨后，在包含2.5％供血者相匹配的血清以及細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4的AIM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)該單核細(xì)胞，以使該細(xì)胞朝向樹突細(xì)胞(DC)系分化。在7％CO2氣氛中37℃下在12孔組織培養(yǎng)板中孵育該細(xì)胞。
在第1天至第4天收集單核細(xì)胞起源的樹突細(xì)胞。隨后用具有0.1％BSC(Sigma)的AIM-V培養(yǎng)基沖洗該細(xì)胞一次，并用具有0.1％(w/v)BSA(PBSB)的Dulbecco’s磷酸緩沖鹽(Invitrogen)沖洗該細(xì)胞兩次。單核細(xì)胞起源的樹突細(xì)胞用在4℃標(biāo)記或結(jié)合實(shí)驗(yàn)中或用作37℃結(jié)合/攝取實(shí)驗(yàn)中。
2.嵌合抗原結(jié)合到成熟的樹突細(xì)胞比較S1/S2-TBD相對(duì)于鼠IgG1和IgG2a結(jié)合到成熟樹突細(xì)胞上的程度。在體外培養(yǎng)的各天中(從第0天到第4天)分離樹突細(xì)胞并將其用S1/S2-TBD(10μg/mL)或用鼠IgG1(2C12，生成TBD的親本mAb)或用IgG2a(G155-178，90μg/Ml)在4℃處理1小時(shí)。將該細(xì)胞在PBSB中與F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)處理20分鐘。將該細(xì)胞用PBSB沖洗兩次，并將其重新懸浮在具有2％多聚甲醛(PF)的PBSB中，并且被配置有CellQuest獲取和分析軟件(BD)的Becton Dickinsion(BD)FACScan獲取。門(gate)形成在可變的細(xì)胞群體上，其通過FSC和SSC分散分布圖(scatterprofile)決定并且獲得了≥10,000事件(events)。為了決定陽性細(xì)胞的百分比，基于陰性對(duì)照處理的細(xì)胞(標(biāo)記的同種型對(duì)照或僅用F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)標(biāo)記的細(xì)胞)設(shè)置了門。特異性陽性細(xì)胞的百分比計(jì)算如下(檢測樣品的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)-對(duì)照的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù))/(100-對(duì)照的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù))×100相對(duì)平均的熒光密度(MFI)是由檢測樣品的MFI減去對(duì)照樣品的MFI所決定的。
在培養(yǎng)1到4天后S1/S2-TBD相對(duì)于IgG1和IgG2a與DC的結(jié)合如表12所示。
表12嵌合抗原或抗體與成熟的樹突細(xì)胞的結(jié)合

S1/S2-TBD結(jié)合比IgG1或IgG2a的結(jié)合明顯大的多，并且S1/S2-TBD的結(jié)合在第1天比在第4天更明顯。這些實(shí)驗(yàn)表明S1/S2-TBD被高效地結(jié)合到成熟樹突細(xì)胞上。
3.成熟樹突細(xì)胞對(duì)嵌合抗原的攝取為了確定嵌合抗原(如，HBV S1/S2-TBD)相對(duì)于IgG1和IgG2a的攝取的程度，將細(xì)胞與不同濃度的該抗原、IgG1(2C12，親本mAb，TBD從其中生成)或IgG2a(G155-178)在37℃下在具有0.1％BSA的AIM V培養(yǎng)基中孵育1小時(shí)。細(xì)胞在PBSB中沖洗兩次并用具有2％PF的PBS在4℃固定一整夜。隨后，該細(xì)胞在PBSB中沖洗兩次并用包含0.1％(w/v)皂角苷(Sigma)的PBS在20℃滲透處理40分鐘。
該細(xì)胞用PBSB沖洗兩次，并在具有0.1％(w/v)皂角苷的PBSB中4℃下與F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)孵育20分鐘。在PBSB中沖洗兩次后，將該細(xì)胞懸浮在PBSB中。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的另一種方式包括如上所述處理細(xì)胞與嵌合抗原、IgG1、或IgG2a10分鐘，隨后加入F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)處理50分鐘。隨后將該細(xì)胞沖洗并懸浮在具有2％PF的PBS中。
通過配置有Cellquest獲取和分析軟件(BD)的Becton Dickinson(BD)FACScan可以獲取細(xì)胞。在由FSC和SSC分散分布圖確定的可變細(xì)胞群體上設(shè)門并且獲得≥10,000事件。為了決定陽性細(xì)胞的百分比，基于陰性對(duì)照處理的細(xì)胞(標(biāo)記的同種型對(duì)照或僅用F(ab’)2山羊抗鼠Alexa-488(10μg/mL)標(biāo)記的細(xì)胞)來設(shè)門。特異性陽性細(xì)胞的百分比計(jì)算如下(檢測樣品的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)-對(duì)照的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù))/(100-對(duì)照的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù))×100相對(duì)平均的熒光密度(MFI)是由檢測樣品的MFI減去對(duì)照樣品的MFI所決定的。
S1/S2-TBD相對(duì)于鼠和IgG2a的攝取作為樹突細(xì)胞成熟的第4天的濃度的函數(shù)被評(píng)估。在37℃將1小時(shí)內(nèi)的該攝取量化，結(jié)果示于圖4中。S1/S2-TBD的攝取(量)隨著濃度呈現(xiàn)線性增加。IgG1的攝取水平低的多，而IgG2a僅有很少量的攝取。因此，嵌合抗原S1/S2-TBD比免疫球蛋白更高效地被樹突細(xì)胞攝取。
J.實(shí)施例10在成熟DC上的Fc-γ受體和CD206的表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞上有許多結(jié)合并攝取抗原的受體。利用熒光標(biāo)記的受體特異性抗體來評(píng)估成熟樹突細(xì)胞上受體的豐富程度。FACS分析用于估計(jì)樹突細(xì)胞的總?cè)后w中特異性受體陽性細(xì)胞的百分比。受體表達(dá)程度通過確定相對(duì)平均熒光密度以及作為相對(duì)熒光密度的函數(shù)(表13)來評(píng)估。
表13在成熟樹突細(xì)胞上的抗原結(jié)合受體的表達(dá)

培養(yǎng)中CD64(Fcγ受體I)的表達(dá)隨著時(shí)間減少并且在第4天幾乎可忽略。相反，CD32(Fcγ受體II)在DC培養(yǎng)4天后繼續(xù)表達(dá)，以及CD16(Fcγ受體III)在DC培養(yǎng)4天后以較小的程度繼續(xù)表達(dá)。在培養(yǎng)的第0天，基本上沒有CD206(甘露糖巨噬細(xì)胞受體)的表達(dá)。但是在與IL-4和GM-CSF一起培養(yǎng)時(shí)被誘導(dǎo)，并且在第4天CD206以很高的水平表達(dá)。因此在第4天，當(dāng)抗原在抗原呈遞實(shí)驗(yàn)中被加載時(shí)，樹突細(xì)胞具有至少兩個(gè)用于結(jié)合嵌合抗原CD32和CD206的潛在受體。此外，它們與共刺激分子完全互補(bǔ)(數(shù)據(jù)未示出)。在培養(yǎng)中HLA-DR(II類)和HLA-ABC(I類)的表達(dá)也隨著時(shí)間增加。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間共刺激分子CD86(B7.2)和CD80(B7.1)也被表達(dá)。這些結(jié)果表明單核細(xì)胞起源的樹突細(xì)胞朝向成熟的樹突細(xì)胞分化并且能夠?yàn)門細(xì)胞處理和呈遞抗原。
K.實(shí)施例11CD32/CD206的表達(dá)和S1/S2-TBD結(jié)合到成熟DC的相關(guān)性CD32/CD206受體的表達(dá)和S1/S2-TBD結(jié)合到成熟樹突細(xì)胞之間存在直接的相關(guān)性。由于已知鼠IgG1與人CD32結(jié)合，可以預(yù)期包含鼠IgG1的Fc成分的S1/S2-TBD也將結(jié)合CD32。此外，S1/S2-TBD借助其高甘露糖糖基化，將也被預(yù)期通過CD206受體結(jié)合到樹突細(xì)胞上。
圖5中的點(diǎn)圖表明S1/S2-TBD結(jié)合(10μg/mL)和CD32的表達(dá)以及S1/S2-TBD結(jié)合和CD206的表達(dá)。S1/S2-TBD結(jié)合程度和CD32的表達(dá)程度(這是相對(duì)異質(zhì)的，即具有廣泛的表達(dá)程度)之間存在直接的相關(guān)性。這些結(jié)果表明S1/S2-TBD結(jié)合到CD32，并且CD32的表達(dá)越高，嵌合抗原S1/S2-TBD的結(jié)合程度越高。S1/S2-TBD的結(jié)合與CD206的表達(dá)的點(diǎn)圖表明表達(dá)CD206的絕大多數(shù)細(xì)胞也結(jié)合S1/S2-TBD。少量百分比的該細(xì)胞群體為CD206陰性并因此對(duì)于S1/S2-TBD的結(jié)合呈現(xiàn)陰性。因此，CD32和CD206受體均與S1/S2-TBD的結(jié)合相關(guān)。
L.實(shí)施例12S1/S2-TBD的結(jié)合和攝取主要通過CD32，通過CD206的較少作為DC成熟的第4天的濃度的函數(shù)，S1/S2-TBD相較于鼠IgG1和IgG2a的攝取被評(píng)估。在37℃在培養(yǎng)基、甘露聚糖(2mg/ml，Sigma)、和/或鼠Fcγ(2mg/ml，Jackson免疫研究實(shí)驗(yàn)室)存在的情況下將1小時(shí)內(nèi)的該攝取量化。甘露聚糖是CD206結(jié)合的競爭性抑制劑，因此抗原經(jīng)由樹突細(xì)胞上的CD206攝取。Fcγ是CD32結(jié)合的競爭性抑制劑，因此CD32介導(dǎo)抗原的攝取。結(jié)果示于表14中。
表14嵌合抗原通過Fc或甘露聚糖結(jié)合的抑制

嵌合抗原的結(jié)合隨其濃度逐步增加。細(xì)胞與高濃度鼠Fcγ片段的孵育抑制了這種結(jié)合，而甘露聚糖(CD206受體結(jié)合的抑制劑)僅具有邊緣效應(yīng)。因此，CD32可以為該嵌合抗原結(jié)合和攝取中的主要受體。
M.實(shí)施例13HBV S1/S2抗原的糖基化提供了免疫原性昆蟲細(xì)胞蛋白糖基化的途徑不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的途徑，因?yàn)槔ハx細(xì)胞中合成的蛋白經(jīng)歷的糖基化導(dǎo)致分泌的蛋白中較高的甘露糖含量和末端唾液酸殘基的缺乏(Altman，et al.，Glycoconjug16109-123(1999))。HBV S1/S2(嵌合抗原的抗原成分)在大腸桿菌(沒有糖基化)和High FiveTM昆蟲細(xì)胞(甘露糖糖基化)中均表達(dá)。
1.糖基化對(duì)抗原結(jié)合的影響如實(shí)施例9中所述，比較了這些抗原與樹突細(xì)胞的結(jié)合。成熟的樹突細(xì)胞被加載昆蟲細(xì)胞或大腸桿菌中表達(dá)的10μg/mL HBVS1/S2。糖基化的蛋白表現(xiàn)出與樹突細(xì)胞更好的結(jié)合(表15)。
表15糖基化對(duì)HBV S1/S2結(jié)合的影響

2.糖基化對(duì)引發(fā)免疫應(yīng)答的影響HBV S1/S2的糖基化引發(fā)了增強(qiáng)的免疫原性和T細(xì)胞應(yīng)答。比較大腸桿菌和High FiveTM昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的HBV S1/S2被樹突細(xì)胞呈遞時(shí)的T細(xì)胞應(yīng)答。如實(shí)施例8所述(利用2.5μg/M HBV S1/S2蛋白)測量細(xì)胞內(nèi)和分泌的干擾素-γ的水平，結(jié)果示于表16中。
表16糖基化對(duì)干擾素-γ的水平的影響

與大腸桿菌中表達(dá)的未糖基化的蛋白相比，昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的HBV S1/S2生成了更高水平的胞內(nèi)和分泌的干擾素。
在上述說明書中提及的所有出版物和專利以引用方式結(jié)合于此作為參考。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以有各種顯而易見的更改和變化而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。雖然結(jié)合特定的優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)該明了本發(fā)明的保護(hù)范圍不應(yīng)當(dāng)不恰當(dāng)?shù)鼐窒抻谶@些特定實(shí)施例。實(shí)際上，所述用于實(shí)施本發(fā)明的方式可以有各種更改，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，而這些都在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txtSEQUENCE LISTING<110>virexx Research Inc.
George，RajanTyrrell，LorneNoujaim，AntoineWang，DakunMa，Allan<120>CHIMERIC ANTIGENS FOR BREAKING HOST TOLERANCE TO FOREIGN ANTIGENS<130>17506-006WO1<150>US 60/493,449<151>2004-08-08<160>51<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>8<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>Tinker peptide<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa can be Val or Ser<400>1Xaa Arg Pro Gln Gly Gly Gly Ser1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>Mus musculus<400>2Val Asp Lys Lys Ile1 5<210>3<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
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<223>HBV plus TBD<220>
<221>CDS<222>(1)..(1359)<400>26atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat cct atg aaa aaa tgg 96Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Lys Lys Trp20 25 30tca tca aaa cct cgc aaa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aac144Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn35 40 45cct ctg gga ttc ttt ccc gat cat cag ttg gac cct gta ttc gga gcc192Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala50 55 60aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc atc aag gac cac tgg240Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp65 70 75 80cca gca gcc aac cag gta gga gtg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc288Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr85 90 95cct cca cac ggc ggt gtt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc atg336Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met100 105 110ttg acc cca gtg tca aca att cct cct cct gcc tcc gcc aat cgg cag384Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln115 120 125tca gga agg cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat432Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His130 135 140cct cag gcc atg cag tgg aat tcc act gcc ttc cac caa gct ctg caa480
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<223>Hepatitis B Virus plus murine<220>
<221>CDS<222>(1)..(2037)<400>28atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat cct atg gga ggt tgg 96Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Gly Gly Trp20 25 30tca tca aaa cct cgc aaa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aac144Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn35 40 45cct ctg gga ttc ttt ccc gat cat cag ttg gac cct gta ttc gga gcc192Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala50 55 60aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc atc aag gac cac tgg240Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp65 70 75 80cca gca gcc aac cag gta gga gtg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc288Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr85 90 95cct cca cac ggc ggt gtt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc atg336Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met100 105 110ttg acc cca gtg tca aca att cct cct cct gcc tcc gcc aat cgg cag384Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln115 120 125
17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txttca gga agg cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat432Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His130 135 140cct cag gcc atg cag tgg aat tcc act gcc ttc cac caa gct ctg caa480Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Pne His Gln Ala Leu Gln145 150 155 160gac ccc aga gtc agg ggt ctg tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tca528Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser165 170 175gga aca gta aac cct gct ccg aat att gcc tct cac atc tcg tca atc576Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile180 185 190tcc gcg agg act ggg gac cct gtg acg aac atg gag aac atc aca tca624Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser195 200 205gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg672Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu210 215 220aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct720Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser225 230 235 240ctc aat ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt ctt ggc caa aat tcg cag768Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln245 250 255tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc tgt cct cca att tgt cct816Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro260 265 270ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc864Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile275 280 285ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt ctt ctg gat tat caa ggt912Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly290 295 300atg ttg ccc gtt tgt cct cta att cca gga tca aca aca acc agt acg960Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr305 310 315 320gga cca tgc aaa acc tgc acg act cct gct caa ggc aac tct atg ttt 1008Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe325 330 335ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cct acg gat gga aat tgc acc tgt att 1056Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile340 345 350ccc atc cca tcg tct tgg gct ttc gca aaa tac cta tgg gag tgg gcc 1104Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala355 360 365tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg 1152Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp370 375 380
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<223>Synthetic Construct<400>29Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Gly Gly Trp20 25 30Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn35 40 45Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Val Phe Gly Ala50 55 60Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp65 70 75 80Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr85 90 95Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Met100 105 110Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Ala Asn Arg Gln115 120 125Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His130 135 140Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln145 150 155 160
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<223>Hepatitis B Virus plus murine<220>
<221>CDS<222>(1)..(1383)<400>30atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gac att gac cct tat aaa 96Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys20 25 30gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg cct tct gac ttc144Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe35 40 45ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac acc gcc tcg gct ctg tat cgg192Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg50 55 60gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc tca cct cac cat acc gca ctc240Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu65 70 75 80agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa ttg atg act cta gct acc tgg288Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp85 90 95gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca tcc agg gat cta gta gtc aat336Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn100 105 110tat gtt aat act aac atg gga tta aag atc agg caa ctc ttg tgg ttt384Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe115 120 125cat atc tct tgc ctt act ttt gga aga gaa act gta ctt gaa tat ttg432His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu130 135 140gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gcc tat aga cca cca480Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro145 150 155 160aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg gaa act act gtt gtt aga cga528
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<223>Duck hepatitis B virus plus murine<220>
<221>CDS<222>(1)..(1326)<400>32atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc atg ggg 96Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Met Gly20 25 30caa cat cca gca aaa tca atg gac gtc aga cgg ata gaa gga gga gaa144Gln His Pro Ala Lys Ser Met Asp Val Arg Arg Ile Glu Gly Gly Glu35 40 45ata ctg tta aac caa ctt gcc gga agg atg atc cca aaa ggg act ttg192Ile Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Gly Thr Leu50 55 60aca tgg tca ggc aag ttt cca aca cta gat cac gtg tta gac cat gtg240Thr Trp Ser Gly Lys Phe Pro Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val65 70 75 80caa aca atg gag gag ata aac acc ctc cag aat cag gga gct tgg cct288Gln Thr Met Glu Glu Ile Asn Thr Leu Gln Asn Gln Gly Ala Trp Pro85 90 95gct gcg gcg gga agg aga gta gga tta tca aat ccg act cct caa gag336Ala Gly Ala Gly Arg Arg Val Gly Leu Ser Asn Pro Thr Pro Gln Glu100 105 110att cct cag ccc cag tgg act ccc gag gaa gac caa aaa gca cgc gaa384Ile Pro Gln Pro Gln Trp Thr Pro Glu Glu Asp Gln Lys Ala Arg Glu115 120 125gct ttt cgc cgt tat caa gaa gaa aga cca ccg gaa acc acc acc att432Ala Phe Arg Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Pro Pro Glu Thr Thr Thr Ile130 135 140
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17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txt225 230 235 240tct cgg tgc ggc tcc ggt ccc tgg att aca ccc agg tgc atg gtc gac 768Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val Asp245 250 255tac ccg tat agg ctt tgg cac tat cct tgt acc atc aat tac acc ata 816Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile260 265 270ttc aaa gtc agg atg tac gtg gga ggg gtc gag cac agg ctg gaa gcg 864Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala275 280 285gcc tgc aac tgg acg cgg ggc gaa cgc tgt gat ctg gaa gac agg gac 912Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp290 295 300agg tcc gag ctc agc ccg ttg ctg ctg tcc acc aca cag tgg cag gtc 960Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln Val305 310 315 320ctt ccg tgt tct ttc acg acc ctg cca gcc ttg tcc acc ggc ctc atc1008Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile325 330 335cac ctc cac cag aac att gtg gac gtg cag tac ttg tac ggg gta ggg1056His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly340 345 350tca agc atc gcg tcc tgg gcc att aag tgg gag tac gtc gtt ctc ctg1104Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu Leu355 360 365ttc ctt ctg ctt gca gac gcg cgc gtc tgc tcc tgc ttg tgg atg atg1152Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met Met370 375 380tta ctc ata tcc caa gcg gag gcg gct gga cta gtg cgg ccg caa ggc1200Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln Gly385 390 395 400ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt aag1248Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys405 410 415cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc ccc1296Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro420 425 430cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc acg1344Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr435 440 445tgt gtt gtg gta gac atc agc aag cat gat ccc gag gtc cag ttc agc1392Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser450 455 460tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc cgg1440Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg465 470 475 480gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc atc1488
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<223>Synthetic Construct<400>47Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Asr Lau Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Thr His20 25 30Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu
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<223>Hepatitis C virus plus murine<220>
<221>CDS<222>(1)..(2517)<400>48atg tcg tac tac cat cac cat cac cat cac gat tac gat atc cca acg 48Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15acc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gcc atg gat ccg gaa ttc tac caa 96Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln20 25 30gtg cgc aat tcc tcg ggg ctt tac cat gtc acc aat gat tgc cct aac144Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn35 40 45tcg agt att gtg tac gag gcg gcc gat gcc atc ctg cac act ccg ggg192Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly50 55 60tgt gtc cct tgc gtt cgc gag ggt aac gcc tcg agg tgt tgg gtg gcg240Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala65 70 75 80
17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txtgtg acc ccc acg gtg gcc acc agg gac ggc aaa ctc ccc aca acg cag 288Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln85 90 95ctt cga cgt cat atc gat ctg ctt gtc ggg agc gcc acc ctc tgc tcg 336Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser100 105 110gcc ctc tac gtg ggg gac ctg tgc ggg tct gtc ttt ctt gtt ggt caa 384Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln115 120 125ctg ttt acc ttc tct ccc agg cgc cac tgg acg acg caa gac tgc aat 432Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn130 135 140tgt tct atc tat ccc ggc cat ata acg ggt cat cgc atg gca tgg gat 480Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp145 150 155 160atg atg atg aac tgg tcc cct acg gca gcg ttg gtg gta gct cag ctg 528Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu165 170 175ctc cgg atc cca caa gcc atc atg gac atg atc gct ggt gct cac tgg 576Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp180 185 190gga gtc ctg gcg ggc ata gcg tat ttc tcc atg gtg ggg aac tgg gcg 624Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala195 200 205aag gtc ctg gta gtg ctg ctg cta ttt gcc ggc gtc gac gcg gaa acc 672Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr210 215 220cac gtc acc ggg gga aat gcc ggc cgc acc acg gct ggg ctt gtt ggt 720His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly225 230 235 240ctc ctt aca cca ggc gcc aag cag aac atc caa ctg atc aac acc aac 768Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn245 250 255ggc agt tgg cac atc aat agc acg gcc ttg aat tgc aat gaa agc ctt 816Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu260 265 270aac acc ggc tgg tta gca ggg ctc ttc tat caa cac aaa ttc aac tct 864Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser275 280 285tca ggc tgt cct gag agg ttg gcc agc tgc cga cgc ctt acc gat ttt 912Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe290 295 300gcc cag ggc tgg ggt cct atc agt tat gcc aac gga agc ggc ctc gac 960Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp305 310 315 320gaa cgc ccc tac tgc tgg cac tac cct cca aga cct tgt ggc att gtg1008Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val325 330 335
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17506.006wo1 seg listing.ST25(1).txt580 585 590ggc ggc gga tcc gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat tgt ggt tgt1824Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys595 600 605aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc ttc atc ttc1872Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe610 615 620ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act cct aag gtc1920Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val625 630 635 640acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag gtc cag ttc1968Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe645 650 655agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag acg caa ccc2016Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro660 665 670cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt gaa ctt ccc2064Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro675 680 685atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa tgc agg gtc2112Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val690 695 700aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa acc2160Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr705 710 715 720aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca cct ccc aag2208Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys725 730 735gac cag atg gcc aag gat aaa gtc agt ctg acc tgc atg ata aca gac2256Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp740 745 750ttc ttc cct gaa gac att act gtg gag tgg cag tgg aat ggg cag cca2304Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro755 760 765gcg gag aac tac aag aac act cag ccc atc atg gac aca gat ggc tct2352Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser770 775 780tac ttc gtc tac agc aag ctc aat gtg cag aag agc aac tgg gag gca2400Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala785 790 795 800gga aat act ttc acc tgc tct gtg tta cat gag ggc ctg cac aac cac2448Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His805 810 815cat act gag aag agc ctc tcc cac tct cct ggg ctg caa agc ttg tcg2496His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser820 825 830aga agt act aga gga tca taa2517
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<223>Synthetic Construct<400>49Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr1 5 10 15Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Glu Phe Tyr Gln20 25 30Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn35 40 45Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly50 55 60Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val Ala65 70 75 80Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr Gln85 90 95Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser100 105 110Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly Gln115 120 125Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys Asn130 135 140Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp145 150 155 160Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln Leu165 170 175Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His Trp180 185 190Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp Ala
17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txt195 200 205Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr210 215 220His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val Gly225 230 235 240Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn245 250 255Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu260 265 270Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser275 280 285Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp Phe290 295 300Ala Gln Gly Trp Gly Pro Tle Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu Asp305 310 315 320Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val325 330 335Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro340 345 350Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp355 360 365Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro370 375 380Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr385 390 395 400Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn405 410 415Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr420 425 430Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met Val435 440 445
17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txtAsp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr450 455 460Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu465 470 475 480Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg485 490 495Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp Gln500 505 510Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu515 520 525Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val530 535 540Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu545 550 555 560Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp Met565 570 575Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Gly Leu Val Arg Pro Gln580 585 590Gly Gly Gly Ser Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys595 600 605Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe610 615 620Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val625 630 635 640Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe645 650 655Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro660 665 670Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro675 680 685Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val690 695 700
17506.006wo1 seq listing.ST25(1).txtAsn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr705 710 715 720Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys725 730 735Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp740 745 750Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro755 760 765Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser770 775 780Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala785 790 795 800Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His805 810 815His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Leu Gln Ser Leu Ser820 825 830Arg Ser Thr Arg Gly Ser835<210>50<211>9<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>50Gly Met Leu Thr Pro Val Ser Thr Ile1 5<210>51<211>9<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>51Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile1 5
PCT/RO/134表 圖1A 圖1B
圖2
圖3
圖4
圖權(quán)利要求
1.一種用于引發(fā)免疫應(yīng)答的嵌合抗原，所述嵌合抗原包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其中所述抗體片段為異種型抗體片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其中所述抗體片段為非異種型抗體片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原包括多于一個(gè)的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括蛋白的至少一個(gè)抗原部分，所述蛋白選自HBV蛋白、DHBV蛋白和HCV蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括HBV蛋白的至少一個(gè)抗原部分，所述HBV蛋白選自HBVS1/S2、HBV S1/S2/S、HBV核心蛋白、HBV核心ctm和HBV聚合酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括DHBV蛋白的至少一個(gè)抗原部分，所述DHBV蛋白選自DHBV PreS/S、DHBV PreS、DHBV核心蛋白和DHBV聚合酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括HCV蛋白的至少一個(gè)抗原部分，所述HCV蛋白選自HCV核心蛋白(1-191)、HCV核心蛋白(1-177)、HCV E1-E2、HCV E1、HCV E2、HCV NS3、HCV NS5A和HCV NS4A。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包括融合到所述蛋白上的6xHis標(biāo)簽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括來自HPV、HIV、HSV、專性胞內(nèi)寄生蟲或癌抗原的蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞上。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述抗體片段包括免疫球蛋白重鏈片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合抗原，其中所述免疫球蛋白重鏈片段包括鉸鏈區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原進(jìn)一步包括氨基酸、VDKKI(SEQ ID NO2)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合抗原，其中所述免疫球蛋白重鏈片段包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述抗體片段為Fc片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述抗體片段包括部分CH1區(qū)和抗體鉸鏈區(qū)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，進(jìn)一步包括用于連接所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和所述目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的連接體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的嵌合抗原，其中所述連接體為共價(jià)肽連接體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的嵌合抗原，其中所述肽連接體包括序列SRPQGGGS或VRPQGGGS(SEQ ID NO1)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的嵌合抗原，其中所述連接體選自亮氨酸拉鏈和生物素/抗生物素蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原被甘露糖糖基化。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合抗原，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域被甘露糖糖基化。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合抗原，其中所述目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域被甘露糖糖基化。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原被寡甘露糖糖基化。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合抗原，其中所述嵌合抗原被高甘露糖糖基化。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其中所述目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括氨基酸序列SRPQGGGS(SEQ ID NO1)、VDKKI(SEQ IDNO2)以及鼠免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其引發(fā)多表位應(yīng)答。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗原，其引發(fā)對(duì)免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)表位的免疫應(yīng)答。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其引發(fā)體液免疫應(yīng)答。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原，其引發(fā)Th1免疫應(yīng)答、Th2免疫應(yīng)答、CTL應(yīng)答或其組合。
33.一種提高抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)抗原呈遞的方法，所述方法包括將抗原呈遞細(xì)胞與包括根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原的組合物接觸。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞為樹突細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述方法提高了多于一個(gè)表位的抗原呈遞。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述方法提高了所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)表位的抗原呈遞。
37.一種活化抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述抗原呈遞細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原接觸。
38.根據(jù)權(quán)利要求33或37所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在體外。
39.根據(jù)權(quán)利要求33或37所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在體內(nèi)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述接觸發(fā)生在人體內(nèi)。
41.一種引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將包括根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原的組合物施加給目標(biāo)對(duì)象。
42.一種打破耐受性的方法，所述方法包括將抗原呈遞細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)的嵌合抗原接觸。
43.一種用于治療免疫-可治療的疾病的方法，包括將權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原施加給需要的目標(biāo)對(duì)象。
44.根據(jù)權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)施加不引發(fā)免疫應(yīng)答。
45.根據(jù)權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合抗原的施加所引發(fā)的免疫應(yīng)答大于單獨(dú)的免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的施加所引發(fā)的免疫應(yīng)答。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答通過存在于目標(biāo)對(duì)象中的抗原特異性抗體的數(shù)量來測量。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答通過T細(xì)胞響應(yīng)于被暴露于加載有所述嵌合抗原或僅免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的抗原呈遞細(xì)胞所分泌的干擾素-γ的數(shù)量來測量。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答通過響應(yīng)于被暴露于加載有所述嵌合抗原或僅免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的抗原呈遞細(xì)胞而引發(fā)應(yīng)答的抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量來測量。
49.根據(jù)權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述目標(biāo)對(duì)象患有感染或癌癥。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述感染為病毒感染或寄生蟲感染。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述感染為慢性病毒感染。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述慢性病毒感染為慢性乙型肝炎病毒感染或慢性丙型肝炎病毒感染、慢性人類乳頭瘤病毒感染、慢性人類免疫缺陷病毒感染或慢性單純皰疹病毒感染。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述感染為乙型肝炎病毒感染并且所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括選自HBV核心蛋白、HBVS蛋白、HBV S1蛋白和HBV S2蛋白及其組合物的蛋白的至少一個(gè)抗原部分。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述感染為丙型肝炎病毒感染并且所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括選自HCV核心(1-191)蛋白、HCV核心(1-177)蛋白、HCV E1蛋白、HCV E2蛋白、HCV E1-E2蛋白、HCV NS3蛋白、HCV NS5A蛋白及其組合物的蛋白的至少一個(gè)抗原部分。
55.一種為目標(biāo)對(duì)象接種針對(duì)病毒感染的疫苗的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原施加給所述目標(biāo)對(duì)象。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中為所述目標(biāo)對(duì)象治療性地接種針對(duì)存在的病毒感染的疫苗。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中為所述目標(biāo)對(duì)象預(yù)防性地接種針對(duì)存在的病毒感染的疫苗。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述目標(biāo)對(duì)象產(chǎn)生針對(duì)所述嵌合抗原的多于一個(gè)表位的免疫應(yīng)答。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述目標(biāo)對(duì)象產(chǎn)生針對(duì)所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的多于一個(gè)表位的免疫應(yīng)答。
60.一種藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的賦形劑和根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物配置為用于胃腸外施用。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物配置為用于經(jīng)皮給藥、真皮內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、經(jīng)鼻腔給藥、經(jīng)肺給藥或口腔內(nèi)給藥。
63.一種制品，包括根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原和用于將所述嵌合抗原施用于需要該嵌合抗原的目標(biāo)對(duì)象的說明書。
64.一種生成嵌合抗原的方法，包括(a)提供微生物或細(xì)胞系，其包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的嵌合抗原的多聚核苷酸；以及(b)在所述嵌合抗原被表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述微生物或細(xì)胞系。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述微生物或細(xì)胞系是真核微生物或細(xì)胞系。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中所述微生物或細(xì)胞系是酵母、植物細(xì)胞系或昆蟲細(xì)胞系。
67.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述嵌合抗原被翻譯后修飾以包括甘露糖糖基化。
68.一種編碼嵌合抗原的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包括編碼免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域的第一多聚核苷酸部和編碼目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二多聚核苷酸部，其中所述目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域包括病毒蛋白的至少一個(gè)抗原部分。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的多聚核苷酸，其中所述病毒蛋白為HBV蛋白或HCV蛋白。
71.根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述抗體片段是異種型抗體片段。
72.根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述抗體片段是非異種型抗體片段。
73.根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包括選自下述序列的核苷酸序列SEQ ID NO26的第1到1326個(gè)核苷酸、SEQ ID NO28的第1到2004個(gè)核苷酸、SEQ IDNO30的第1到1350個(gè)核苷酸、SEQ ID NO32的第1到1293個(gè)核苷酸、SEQ ID NO34的第1到1794個(gè)核苷酸、SEQID NO36的第1到1581個(gè)核苷酸、SEQ ID NO38的第1到1389個(gè)核苷酸、SEQ ID NO40的第1到1347個(gè)核苷酸、SEQ ID NO42的第1到2157個(gè)核苷酸、SEQ ID NO44的第1到1395個(gè)核苷酸、SEQ ID NO46的第1到1905個(gè)核苷酸或者SEQ ID NO48的第1到2484個(gè)核苷酸。
74.根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸編碼與選自下述序列的完整的氨基酸序列至少90％相同的嵌合抗原SEQ ID NO27的第1到442個(gè)氨基酸、SEQ ID NO29的第1到668個(gè)氨基酸、SEQ ID NO31的第1到450個(gè)氨基酸、SEQ ID NO33的第1到431個(gè)氨基酸、SEQ ID NO35的第1到598個(gè)氨基酸、SEQ ID NO37的第1到527個(gè)氨基酸、SEQ ID NO39的第1到463個(gè)氨基酸、SEQ ID NO41的第1到449個(gè)氨基酸、SEQ ID NO43的第1到719個(gè)氨基酸、SEQ ID NO45的第1到465個(gè)氨基酸、SEQ ID NO47的第1到635個(gè)氨基酸、或SEQ ID NO49的第1到828個(gè)氨基酸。
75.根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸在嚴(yán)格的條件下選擇性地與具有選自下述序列的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交SEQ ID NO26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48。
76.包括根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸的微生物或細(xì)胞系。
77.包括根據(jù)權(quán)利要求68所述的多聚核苷酸的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的組合物和方法。尤其是，該組合物和方法引發(fā)針對(duì)被宿主識(shí)別為“自我”抗原的外來抗原的免疫應(yīng)答，由此破壞宿主對(duì)這些抗原的耐受性。將包括免疫應(yīng)答結(jié)構(gòu)域和目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原呈遞給該宿主的免疫系統(tǒng)，其中該目標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體片段，提高了針對(duì)該外來抗原或耐受抗原的免疫應(yīng)答?？乖蔬f細(xì)胞攝取、處理、以及呈遞該嵌合抗原，引發(fā)針對(duì)所希望的抗原的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1845995SQ200480022747
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月8日
發(fā)明者拉詹·喬治, 洛恩·蒂勒爾, 安托萬·努杰姆, 王大坤, 馬友倫 申請(qǐng)人:威瑞克斯醫(yī)藥公司