專利名稱：使用微顆粒多重檢測法檢測非整倍性的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了用于在微顆?；旌衔镏袡z測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方法能夠檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒的大小、任何附著的報告分子的熒光光譜、報告分子的熒光強度和各分類箱中顆粒的數(shù)目。這些微顆粒種類特別地用于許多遺傳或生化多重研究中并且特別地用作用于在生物體或生物體的胚胎中檢測非整倍性的結(jié)合劑。在人中，至少24種微顆粒的檢測和分選可滿足用于針對所有染色體的同時檢測的單管方法，其中各不同的微顆粒種類包含與多核苷酸序列(對特定的人染色體是唯一的)互補和特異性地針對其的多核式酸序列。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本發(fā)明用于同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性，所述生物體具有216或更少的染色體對。也提供了用于在一個或多個人染色體中同時檢測非整倍性的試劑盒。
現(xiàn)有技術(shù)描述在說明書的末尾也收集了本說明書參考的文獻的詳細目錄。本說明書中的任何現(xiàn)有技術(shù)不是也不應(yīng)當被認為是承認或任何形式的暗示在任何國家該現(xiàn)有技術(shù)形成了部分共同的普遍知識。
在正常情況下在二倍體生物體中，來自各親本的一個染色體傳遞給子代胚胎。然而，于母本、父本或雙方中的不分離事件可導(dǎo)致具有異常染色體數(shù)目的胚胎，稱作非整倍性的狀況。
整倍性是具有正確數(shù)目的結(jié)構(gòu)正常的染色體的狀況。例如，整倍性人雌性個體具有46條染色體(44條常染色體和2條X染色體)，而整倍性公牛具有60條染色體(58條常染色體加一條X和一條Y染色體)。
非整倍性是具有少于或多于天然整倍性染色體數(shù)目的狀況，并且最有可能觀察到細胞形成異常的類型。換句話說，其是來自整倍性的任何異常，盡管許多作者將該術(shù)語限定用于只有少量染色體丟失或添加的狀況。
通常，因為大的異常幾乎是與存活不相容的并且這樣的個體通常在出生前就已死亡，所以由于這個簡單的原因非整倍性被認為是整倍性的小異常。
兩個最普遍觀察到的非整倍性形式是單體性和三體性。
單體性缺少成對染色體中的一個染色體。具有只有一個6號染色體的個體稱為具有單體性6。在許多物種中見到的普遍的單體性是X染色體單體性，在人中也稱為Turner綜合征。在出生前的發(fā)育期單體性是最普遍的致死因子。
三體性是具有三條特定類型的染色體。人中普遍的常染色體三體性是Down綜合癥，或三體性21，其中人具有三條而不是正常的兩條21號染色體。三體性是多體性的特殊例子，多體性是更廣義的術(shù)語，其表示具有超過兩個任意給定的染色體(在二倍體生物中)。
另一種非整倍性是三倍性。三倍體個體中每個染色體都有三條，即，三套單倍體的染色體。三倍體人具有69條染色體(3套23個染色體的單倍體)，三倍體狗具有117條染色體。三倍體的產(chǎn)生似乎相對普遍并且可通過例如用兩個精子受精產(chǎn)生。然而，活的三倍體的出生是非常罕見的并且這種個體非常不正常的。出生后存活超過數(shù)小時的稀有三倍體幾乎肯定是嵌合體，其具有很大比例的雙倍體細胞。
當染色體斷裂和碎片丟失時，便發(fā)生染色體缺失。這當然涉及到遺傳信息的丟失并導(dǎo)致針對該染色體被稱作“部分單倍性”的狀況。
相關(guān)的畸形是染色體倒位。在該情況下，斷裂發(fā)生并且染色體片段倒置并重新連接起來而不是丟失。因此倒位是重排，不涉及遺傳物質(zhì)的丟失，并且除非斷裂點破壞了重要的基因，否則攜帶倒位的個體具有正常的表型。
在單體性樣品中(具有2n-1條染色體)，一條完整的染色體和所有其座位丟失。類似地，在2n+1三體性樣品中，各細胞中出現(xiàn)一條額外的染色體，意味著由于不分離事件(通常發(fā)生在雌配子形成過程中)造成一條特定的染色體出現(xiàn)三次。類似的但更明顯的情形在三倍體樣品的情況下發(fā)生，在三倍體樣品中各染色體在所有細胞中出現(xiàn)三次而不是兩次。
通過使用體外受精(IVF)技術(shù)可使不育婦女產(chǎn)生懷孕。盡管體外受精率較高，但按照這些方法的懷孕率相對較低，在15％至25％的范圍內(nèi)。人卵母細胞(不能體外受精后固定的卵母細胞)的細胞發(fā)生研究顯示相對較高的染色體異常(非整倍性)發(fā)生率。同樣，許多自然流產(chǎn)和不足月胚胎的研究顯示染色體異?？赡苁翘毫魇У闹饕?。在使用IVF產(chǎn)生的胚胎中染色體異常的頻率遠高于報道的針對精子和卵母細胞的總的異常性。
在IVF方法中，非整倍性是產(chǎn)生的胚胎中最常觀察到的異常性。許多報道強有力地表明染色體的非整倍性是卵母細胞受精和胚胎移植失敗的主要原因。非整倍性主要產(chǎn)生于減數(shù)分裂性不分離時間；但許多環(huán)境因素也可以破壞紡錘體并最終導(dǎo)致非整倍體胚胎的形成。
使用目前本領(lǐng)域已知的方法估計胚胎總體染色體組成，可進行細胞形成分析，例如核型分析。然而，該方法不是針對單個細胞的實際解決方法，因而不能進行植入前篩查。
因此，需要發(fā)展用于在胚胎中檢測非整倍性的快速、便宜、自動化的方法，所述方法可用于體外受精的植入前設(shè)計。本發(fā)明提供了方法，除其它以外，所述方法用作同時檢測受試者的一個、多個或全部染色體非整性的快速、單管的方法。
特別地，該方法可增加IVF的成功率，因為具有異常染色體成員(非整倍體)的胚胎可通過胚胎發(fā)生的遺傳組成的植入前掃描篩查出來。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供用于在微顆?；旌衔镏袡z測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方法能用于檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒大小、任何附著的報告分子的熒光光譜、報告分子的熒光強度。第四種分類特征是特定顆粒種類中顆粒的數(shù)目。通過使用重復(fù)數(shù)目在對微顆粒重復(fù)實驗以區(qū)分獨立的實驗的結(jié)果是可能的。這些微顆粒種類具有特別地應(yīng)用，在生物體或生物體的胚胎中檢測非整倍性中作為結(jié)合劑。在人中，至少24種微顆粒的檢測和分選滿足用單管方法同時檢測所有染色體的非整倍性，其中各不同的微顆粒種類包含多核苷酸序列，所述序列與對特定的人染色體來說是唯一的多核酸序列互補，且對其是特異性的。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本方法用于同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性，所述生物體具有216對或更少染色體對。也提供了用于在一種或多種人染色體中同時檢測非整倍性的試劑盒。
通過用于從微顆粒混合物中多重檢測和分選幾種不同種類的微顆粒的方法可部分地預(yù)測本發(fā)明，所述方法基于微顆粒的大小、存在于微顆粒上的任何標記、標記的強度和微顆粒存在的數(shù)目。
本發(fā)明者已證實有可能區(qū)分在特定大小的微顆粒上給定的熒光標記的強度。此外，本發(fā)明者已制造了對于給定的標記物具有6種不同熒光強度的微顆粒。另外，基于顆粒數(shù)目可對事件進行區(qū)分。
因此，通過將微顆粒大小的數(shù)據(jù)與熒光強度數(shù)據(jù)相結(jié)合，本發(fā)明提供了對于單標記的微顆粒種類區(qū)分36種不同微顆粒種類的方法。然而，本發(fā)明也包括多重標記的微顆粒，例如雙標記的微顆粒，所述微顆粒接著可分成至少216類。此外，本發(fā)明允許無限的基于差別分類的種類，所述差別分類基于顆粒數(shù)目。
因此，本發(fā)明涉及用于從微顆?；旌衔镏袡z測和分選標記的或未標記的微顆粒的方法，其基于一個或多個下列特征(i)微顆粒大小(ii)微顆粒標記物(iii)微顆粒標記物強度(iv)微顆粒數(shù)目在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法使用流式細胞儀檢測和/或分選微顆粒。
本發(fā)明特別優(yōu)選的應(yīng)用是在生物體或生物體胚胎的一個或多個染色體中同時多重檢測非整倍性。
如果給定量的代表特定染色體數(shù)目的DNA(來自已知的對照二倍體DNA)與相似量的來自給定的生物學(xué)樣品的DNA競爭有限數(shù)目的結(jié)合靶，那么所述DNA應(yīng)當以其相對頻率結(jié)合靶。
在本發(fā)明中為了區(qū)分標準和樣品，優(yōu)選地用于樣品和標準的標記物具有不同的發(fā)射光譜。此外，當進行部分多重反應(yīng)時，樣品和標準的標記物的熒光光譜必須與附著在結(jié)合劑上的標記物的熒光光譜不同。
因此，本發(fā)明提供了用于同時檢測受試者一個或多個染色體非整倍性的方法，所述方法包括(i)產(chǎn)生報告分子標記的多核苷酸樣品，所述多核苷酸樣品是所述受試者的各染色體豐度的代表；(ii)產(chǎn)生針對各染色體的等量的非-非整倍性多核苷酸標準，其用不同報告分子標記；(iii)針對各染色體將所述樣品和所述標準與一定量的結(jié)合劑混合，其中所述結(jié)合劑包含與針對各染色體的樣品和標準互補的多核苷酸，其中所述結(jié)合劑多核苷酸固定在微顆粒上，結(jié)合針對各染色體的多核苷酸序列的微顆粒在大小和/或熒光標記物和/或熒光標記物強度上不同；其中來自樣品和標準之標記的在微顆粒上的熒光標記物(如果存在)具有不同的發(fā)射光譜；其中通過樣品和標準對結(jié)合劑的不等同結(jié)合來檢測非整倍性。
使用本發(fā)明的多重檢測方法能夠同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性。各結(jié)合劑或結(jié)合劑組包含特異性針對特定染色體(和與來自該染色體的樣品和標準多核苷酸序列互補)的多核苷酸，所述多核苷酸被固定在微顆粒上，所述微顆粒在大小、熒光標記物、熒光強度或這些特征的組合上與其它結(jié)合劑不同。然后單個地估計這些不同的微顆粒對樣品和標準的結(jié)合。因此，其提供了針對樣品中多個染色體相對頻率的同時測量。
在一個方面，結(jié)合于來自特定染色體的微顆粒的多核苷酸數(shù)目可以從大約1至大約40,000。在優(yōu)選的方面，結(jié)合所述微顆粒的多核苷酸的數(shù)目從大約1至大約3,000。在最優(yōu)選的方面，結(jié)合微顆粒的多核苷酸的數(shù)目大約為2,000。
本發(fā)明的方法用于在任何生物體中非整倍性的檢測。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，受試者是使用體外受精產(chǎn)生的人或其它動物的胚胎。
本發(fā)明的方法能夠在提取的和/或從單個細胞擴增的DNA中檢測非整倍性。因此，本發(fā)明的方法尤其適合用于在移植利用體外受精產(chǎn)生的動物胚胎之前，在所述胚胎中檢測非整倍性。
為了檢測生物體中染色體的數(shù)目，本發(fā)明用于檢測生殖細胞中的不分離事件。
本發(fā)明進一步提供用于在生物體、胚胎或生殖組織中對多個染色體同時檢測非整倍性的試劑盒。
表1提供此處所用的縮寫詞目錄表1.
縮寫詞
附圖簡述

圖1.描述典型的流式細胞儀圖2.說明在單檢測通道內(nèi)使用4種微珠尺寸和3個熒光強度水平的AmpaSandTMBeads的12-plex區(qū)分。珠子可根據(jù)大小(3.0、4.12、5.0和6.8μm)以及熒光強度(在這種情況下區(qū)分為無熒光，1/3熒光和完全熒光)分離。使用四甲基羅丹明作為標記物并且在第2通道測量熒光水平。
圖3是流式細胞儀點陣圖的代表性示例，所述點陣圖說明2種不同數(shù)量的微珠在不同樣品的分析中的用途?；贔SC和SSC初選微珠，然后基于熒光標記物分析微珠。較下的圖是比較樣品的點陣圖，其中一個樣品對于hGATA4基因序列是純合的，而另一個雜合的。分析表明2個不同的群體基于核苷酸的不同被分離。
圖4是流式細胞儀點陣圖的代表性示例，所述點陣圖說明2種不同數(shù)量的微珠在不同樣品的分析中的用途?；贔SC和SSC初選微珠，然后基于熒光標記物分析微珠。較下的圖是比較樣品的點陣圖，其中一個樣品對于hGATA4基因序列中“A”是純合的，另一個是陰性對照。分析表明2個不同的群體基于核苷酸的不同被分離。
圖5是流式細胞儀點陣圖的代表性示例，所述點陣圖說明2種不同數(shù)量的微珠在不同樣品的分析中的用途?；贔SC和SSC初選微珠，然后基于熒光標記物分析微珠。較下的圖是比較樣品的點陣圖，其中一個樣品對于hGATA4基因序列的“A”是純合的，而另一個雜合的。分析表明2個不同的群基于核苷酸的不同被分離。
圖6是流式細胞儀點陣圖的代表性示例，所述點陣圖說明2種不同數(shù)量的微珠在不同樣品的分析中的用途?；贔SC和SSC初選微珠，然后基于熒光標記物分析微珠。較下的圖是比較樣品的點陣圖，其中兩個樣品對于hGATA4基因序列中的“A”都是純合的。分析表明存在一個組成兩個樣品的群體。
圖7是流式細胞儀點陣圖的代表性示例，所述點陣圖說明2種不同數(shù)量的微珠在不同樣品的分析中的用途?；贔SC和SSC初選微珠，然后基于熒光標記物分析微珠。較下的圖是比較樣品的點陣圖，其中一個樣品對于hGATA4基因序列中的“G”是純合的，而另一個對“A”是純合的。分析表明基于核苷酸的不同可分離2個不同的群體。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于在微顆?；旌衔镏袡z測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方面能夠檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒大小、任何附著的報告分子的熒光光譜、報告分子的熒光強度和傳遞于顆粒數(shù)量之事件的差異。這些微顆粒種類特別地用作用于在生物體或生物體的胚胎中檢測非整倍性的結(jié)合劑。在人中，至少24種微顆粒的檢測和分選滿足用于同時檢測所有染色體非整倍性的單管方法，其中各不同的微顆粒種類包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列與多核苷酸序列(對于特定的人染色體來說是唯一的)互補和針對其是特異性的。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本方法用于同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性，所述生物體具有216或更少的染色體對。也提供了用于同時檢測一個或多個人染色體非整倍性的試劑盒。
在詳細地描述本發(fā)明之前，要理解除非特別指出，本發(fā)明不限于特定的試劑制備、生產(chǎn)方法、方法學(xué)等，其同樣可發(fā)生改變。也要理解此處所用的術(shù)語只是為了描述特定的實施方案而不是被其限定的。
如在本說明書所使用的，除非上下文清楚地指出，否則單數(shù)形式的“一”、“一個”和“一種”包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如，“一種微顆粒”包括單個微顆粒也包括兩個或更多個微顆粒。
在描述和要求保護的本發(fā)明中，根據(jù)下面給出的定義使用下列術(shù)語。
此處所用的“受試者”是指動物，優(yōu)選地哺乳動物和更優(yōu)選的靈長類動物(包括低等靈長類動物)和更優(yōu)選地，可受益于本發(fā)明方法的人。受試者也可是是非動物例如植物。受試者，無論是人還是非人動物或胚胎，可稱為個體、受試者、患者、宿主或受體。本發(fā)明的化合物和方法用于人醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)以及一般的馴養(yǎng)的或野生的動物管理和園藝/農(nóng)業(yè)。為方便起見，“動物”特別地包括家畜物種例如牛、馬、綿羊、豬、camelids、山羊和驢。對于馬，這些包括用于賽馬業(yè)中所用的馬和用于娛樂或家畜業(yè)的馬。
人是最優(yōu)選的靶。但本發(fā)明的方法也適合于在任何其它非人動物包括實驗室試驗動物中檢測非整倍性。
實驗室試驗動物的示例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和倉鼠。兔子和嚙齒類動物，例如大鼠和小鼠，提供了方便的如靈長類動物和低等靈長類動物一樣的試驗系統(tǒng)或動物模型。也涉及非哺乳動物例如鳥類、斑馬魚、兩棲動物(包括蟾蜍)和果蠅種類例如Drosophilamelanogaster。
此外，在本發(fā)明中，術(shù)語“受試者”包括所有涉及的出生和未出生狀態(tài)的生物。例如，對于人，本說明書中所使用的“受試者”包括所有人出生前的形式，除了出生后的人，所述形式包括胚泡、胚胎和胎兒。該術(shù)語也應(yīng)當理解為包括體外產(chǎn)生和/或生長的生物體的受精卵、胚泡和胚胎，例如作為體外受精技術(shù)的部分產(chǎn)生的胚胎。因此，本發(fā)明的方法包括所有出生前形式和其它生物體的體外胚胎。受試者也可以是植物物種。
通過用于從微顆?；旌衔镏卸嘀貦z測和分選數(shù)種不同種類微顆粒的方法部分地預(yù)測本發(fā)明，所述方法基于微顆粒大小、任何存在于微顆粒上的標記、標記的強度和基于微顆粒數(shù)量的差異。
本發(fā)明的多重技術(shù)應(yīng)當理解為從單個樣品、反應(yīng)、試管等中檢測多個信號或結(jié)果。例如，多重聚合酶鏈式反應(yīng)提供了用于產(chǎn)生和檢測來自單個反應(yīng)的多個擴增子之方法。在本發(fā)明中，多重技術(shù)被理解為與混合物中不同微顆粒相關(guān)的信號之同時檢測。優(yōu)選地，多重數(shù)據(jù)涉及微顆粒大小、任何附著微顆粒的標記和任何附著的標記的強度和微顆粒的相對數(shù)目。
微顆粒是微珠和其它顆粒，通常在0.05μm直徑至1000μm直徑的大小范圍之間。顆粒的材料通常是選自下列的化合物玻璃、二氧化硅、藻酸鹽、明膠、瓊脂、纖維素、殼多糖、聚乳酸、聚d，l-乳酸-共乙醇酸(PLGA)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、三聚氰胺和金。然而，本發(fā)明不限于這些材料的微顆粒，本發(fā)明構(gòu)思了任何多核苷酸可吸附、共價結(jié)合或其它方式附著的材料。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，微顆粒是二氧化硅微顆粒。
流式細胞儀可定義為細胞在液體懸浮液中運動或流動時測量其性質(zhì)的技術(shù)。可與更熟悉的實驗室設(shè)備顯微鏡類比以進一步描述該技術(shù)。大多數(shù)顯微鏡具有如下組成光源典型的顯微鏡使用燈泡照明物體。在流式細胞儀中，光源通常是激光。使用激光是因為其提供非常集中和強烈的單頻光束。光的單頻特征在進行熒光測量中特別重要。
鏡臺在顯微鏡中，鏡臺是可移動的以允許物體通過目鏡的視野。在流式細胞儀中，細胞或顆粒存在于液體懸浮液中。液體隨氣壓流經(jīng)物鏡從而攜帶細胞或顆粒通過視野。
透鏡在顯微鏡和流式細胞儀中，透鏡從物體收集光。
濾鏡一些顯微鏡具有濾鏡以選擇對觀察者來說最重要的光的特征。這在熒光顯微鏡中尤其是這樣。在熒光顯微鏡中，染料分子被具有特征波長(或“顏色”)的光激發(fā)，然后產(chǎn)生更長波長的發(fā)射光。濾鏡除去激發(fā)光以允許觀察或測量發(fā)射光。
探測器在顯微鏡中，光探測器是觀察者。流式細胞儀使用稱為光電倍增管或“PMT”的高靈敏性光檢測器。所述探測器必須能夠測量來自細胞或顆粒之激發(fā)光的短暫閃爍，所述細胞或顆粒是以至多達每秒數(shù)千個的速率一次一個地通過物鏡視野。
大多數(shù)流式細胞儀可測量兩種類型的光散射光和熒光。
圖1顯示流式細胞儀的一個特定型號的主要組成。在底部的一個容器提供緩沖液，所述緩沖攜帶細胞或顆粒通過儀器，而第二個容器收集所有廢液。載體流體(通常稱作鞘液)的目的是吸出懸浮液以使細胞或顆粒以單列通過激光束。
左前方的激光用藍色光束照明從試管向上流過的細胞或顆粒。正向的散射光通過與激光束(激光束本身被小的不透明柵阻擋)同軸的透鏡收集并被反射到光檢測器上。通過與激光束成直角的透鏡收集側(cè)面散射光和熒光。該儀器可測量在綠、橙和紅光譜區(qū)域的三色熒光。通過濾鏡分離顏色，所述濾鏡反射或只透過想要的波長至合適的探測器。
最后，所有來自探測器的電子信號傳輸?shù)接涗浧浜惋@示結(jié)果的計算機(未顯示)。因為所有的測量值都是同時針對每一個細胞的，因此可確定其之間的相關(guān)性。并且，可使用一種測量法選擇細胞亞群，以用另一種測量法研究所述細胞。例如，可使用綠色熒光只檢查通過高度正向的散射光鑒定的大細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法通過使用流式細胞儀檢測和/或分選微顆粒。然而，本發(fā)明絕不限定于前面描述的特定的流式細胞儀方法或儀器。該實施例只作為說明性目的提供的，并且本發(fā)明不限定于所提供的實施例的儀器或方法。
通過使用流式細胞儀，通過物體散射光可確定給定的顆?；蚣毎拇笮　?br> 光散射是光和物體的相互作用。所有物質(zhì)，包括微顆粒，都會散射光。其主要由反射或折射的光組成。物體被觀察的位置通常決定關(guān)于其的可獲得的信息。在流式細胞儀中，光散射探測器通常位于激光的對面(相對于細胞或顆粒)，并且在激光的一側(cè)，與液流/激光束交點同軸。通過這些探測器產(chǎn)生的測量分別稱為正向光散射和側(cè)向光散射。
正向光散射提供了有關(guān)單個細胞或顆粒相對大小的一些信息，而側(cè)向光散射提供了一些有關(guān)單個細胞或顆粒的相對粒度的信息。其通常一起用于在未分離的哺乳動物血液中區(qū)分主要的不同種類的白細胞，但也用于廣泛的其它測定中，例如確定微顆粒的大小。
本發(fā)明者已確定流式細胞儀能夠區(qū)別直徑大約3.0μm、大約3.5μm、大約4.12μm、大約5.0μm、大約5.6μm、大約6.2μm和大約6.8μm的微顆粒。因此，本發(fā)明人已鑒別流式細胞儀可區(qū)分至多達至少7種不同大小的微顆粒。
除了大小檢測外，流式細胞儀通常具有一個或多個用于檢測樣品熒光的激光和探測器。
熒光是吸收特定波長光并再發(fā)射更長波長光的分子的特性。波長的變化涉及在該過程中發(fā)生的能量損失。其是使熒光特別有用的特征濾鏡可用于排除來自光探測器或觀測儀的激發(fā)光。因此，測量或觀察到的光只是來源于染料分子的光。來自背景或照射到探測器上的散射光的干擾是非常低的。
有許多用于流式細胞儀的熒光染料。其結(jié)合各種細胞化學(xué)組分，例如核酸、蛋白、特定的細胞膜、細胞核和細胞質(zhì)受體、細胞內(nèi)離子分子等更多的成分。確定其用于流式細胞儀測定的潛能的熒光染料的關(guān)鍵特征是激發(fā)波長其必須與可獲得的光源波長匹配。
本發(fā)明涉及用報告分子(例如熒光標記物)標記微顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉許多不同的熒光標記物，熒光標記物的選擇不限制本發(fā)明。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，用于標記微顆粒的熒光標記物包括任何能夠附著于微顆粒并能通過選自下列的光源激發(fā)的熒光標記物(i)氬離子激光-包含藍色488nm譜線，所述光源適合用于激發(fā)許多在綠色至紅色區(qū)域發(fā)熒光的染料和熒光染料。也可獲得在波長范圍(458nm、488nm、496nm、515nm等)發(fā)射的可調(diào)氬激光。
(ii)二極管激光-具有635nm發(fā)射波長?，F(xiàn)在可獲得的其它二極管激光在532nm工作。該波長最優(yōu)地激發(fā)碘丙錠(PI)。也可獲得發(fā)射大約476nm光的藍色二極管激光。
(iii)HeNe氣體激光-使用紅色633nm譜線工作。
(iv)HeCd激光-在325nm工作。
(v)100W水銀弧光燈-最有效的激發(fā)UV染料例如Hoechst和DAPI的光源。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，熒光標記物選自Alexa Fluor染料；BoDipy染料，包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665；Cy染料，特別是Cy3，Cy5和Cy5.5；6-FAM(熒光素)；熒光素dT；六氯熒光素(HEX)；6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素(JOE)；Oregon綠染料，包括488-X和514；羅丹明染料，包括羅丹明綠、羅丹明紅和ROX；羧基四甲基羅丹明(TAMRA)；四氯熒光素(TET)；和Texas紅。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，所述標記物是熒光素和Cy5。熒光標記物的示例描述于表2。
表2
1Ex激發(fā)波長(nm)峰2Em發(fā)射波長(nm)峰在優(yōu)選的實施方案中，熒光標記物是BODIPY-F1或四甲基羅丹明。
兩種染色技術(shù)通常用于熒光標記微顆粒-內(nèi)染色技術(shù)和外染色技術(shù)(表面標記)。兩種技術(shù)產(chǎn)生具有獨特特性的微珠，各微珠有利于不同的應(yīng)用。內(nèi)染色技術(shù)產(chǎn)生通常具有狹窄的熒光CV的非常穩(wěn)定的顆粒。這些顆粒通常顯示對光蝕刻具有更高的抗性。由于熒光團在微珠內(nèi)部，表面基團可用于將配體(蛋白、抗體、核酸等)連接至微珠表面。由于該原因，內(nèi)部標記的微珠通常用于分析物檢測和免疫測定的應(yīng)用中。表面標記技術(shù)包括將熒光團連接至顆粒表面。因為熒光團位于微珠表面上，所以其能夠與其環(huán)境(恰如經(jīng)染色的細胞上的熒光團)相互作用。結(jié)果是在各種不同的條件下(例如污染物存在或pH改變的情況下)表現(xiàn)出與經(jīng)染色的細胞樣品相同的激發(fā)和發(fā)射特征的微珠標準。表面標記的微顆粒的“環(huán)境響應(yīng)”本質(zhì)使其理想地適合模擬生物學(xué)樣品。外標記的微顆粒通常在許多使用熒光檢測的應(yīng)用中用作對照和標準。
本發(fā)明涉及通過任何方式將微顆粒與熒光標記物結(jié)合。然而，在優(yōu)選的實施方案中，通過使用允許用產(chǎn)生不同熒光強度的化合物標記微珠的方法使標記物與微顆粒結(jié)合。更優(yōu)選地，將微顆粒附著在微顆粒(外部染色的)的表面。
本發(fā)明人已證明可區(qū)分特定大小的微顆粒上的給定熒光標記的強度。通過改變與微顆粒結(jié)合的熒光標記物的絕對量或濃度可改變微顆粒的熒光強度。此外，本發(fā)明人已生產(chǎn)了具有至多達6種不同強度的給定標記的微顆粒。
然而，本發(fā)明絕不受限于標記物(以不同濃度附著在微顆粒上)上的不同熒光強度的數(shù)目。因素例如激光和光電倍增器技術(shù)影響熒光標記物檢測的靈敏性，同樣地影響可清淅區(qū)分的不同標記強度的數(shù)目。因此，本發(fā)明應(yīng)當不限于不同熒光強度的數(shù)目，所述熒光強度可通過用熒光標記物標記微顆粒實現(xiàn)。
因此，通過將微顆粒大小數(shù)據(jù)和熒光強度數(shù)據(jù)結(jié)合，本發(fā)明提供了用于辨別用單一熒光標記的36種不同的微顆粒的方法。
通常，流式細胞儀具有多于一個的檢測通道。許多流式細胞儀具有4個檢測通道。對通過多檢測器檢測的微顆粒使用多種染色進一步擴展了可根據(jù)本發(fā)明方法辨別的微顆粒的范圍。例如，對給定的微珠大小使用單檢測通道，具有6種不同的可定量的熒光強度，從而可區(qū)分(只基于熒光強度)6種不同的微顆粒類型。第二個通道，在微顆粒上檢測第二種染料的其它6種熒光強度水平可將可檢測的顆粒種類范圍擴展至36種(在第一通道中6種強度乘第二通道中的6種強度水平)。這些數(shù)據(jù)結(jié)合6種不同微珠大小，產(chǎn)生了216種可被分選的給定的雙標記的微顆粒種類。
因此，本發(fā)明涉及用于從微顆粒的混合物中檢測和分選標記的或未標記的微顆粒的方法，所述方法基于一個或多個下列特征(i)微顆粒大小(ii)微顆粒標記(iii)微顆粒標記強度在優(yōu)選的實施方案中，微顆粒在1-10μm的大小范圍內(nèi)，特別是大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μm，標記有0、1、2、3、4種可在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種不同強度水平上被光源和光電探測器檢測的不同熒光標記。
在相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明允許基于針對不同的實驗使用不同數(shù)目的微珠來區(qū)分微顆粒。當使用微顆粒數(shù)目區(qū)分不同樣品時，在各實驗中微顆粒數(shù)目必須以這樣的方式相關(guān)；使得每一個數(shù)目對于所有其它可能的數(shù)目組合而言都是唯一的。確保所述數(shù)目相互之間是唯一的近似式是Yj=Σj-11Yix2.15]]>其中Yj是第j個數(shù)叢。在該叢中顆粒的數(shù)目通過加上所有前面的數(shù)目并乘以2.15獲得。
本發(fā)明的特定的優(yōu)選應(yīng)用是在生物體的或生物體的胚胎中針對一個或多個染色體中同時進行多重非整倍性檢測。
在本發(fā)明中，非整倍性應(yīng)當理解為任何來自生物體中整倍體狀態(tài)的異常，其中整倍體定義為正常的2n套染色體。例如，在人中正常的整倍體2n染色體數(shù)目是46。偏離該狀態(tài)的所有狀況在本發(fā)明中都被認為是非整倍體。人中示例性的非整倍體狀況包括單體性和三體性，其中給定的染色體分別由一個或三個拷貝代表，而不是整倍體狀態(tài)中的兩個拷貝。此外，人中非整倍性可表示為多倍性，其中除了兩套整倍體染色體組外還存在一套(三倍性)或兩套(四倍性)染色體。
此外，在本發(fā)明中，應(yīng)當理解術(shù)語“非整倍性”包括部分單體性狀況，其中染色體的一部分缺失。
本發(fā)明的這個方面基于如下前提如果從DNA樣品的各個染色體中抽取等量的DNA樣品，那么各染色體對總DNA樣品的相對貢獻與總DNA的1/n相等，其中n等于健康生物體的二倍體形式攜帶的染色體對數(shù)目。例如，在非-非整倍體人受試者中，各染色體在給定的DNA樣品中貢獻總DNA的1/23。然而，在單體樣品中，來自該染色體的DNA相對量代表總DNA的1/46，而三體染色體代表總DNA的2/23。
因此，如果來自已知對照二倍體DNA的給定量DNA與來自給定生物學(xué)樣品的相同量DNA競爭有限數(shù)量的結(jié)合靶，那么DNA應(yīng)以其相對頻率與靶結(jié)合。
本發(fā)明涉及用于針對受試者的多個染色體的非整倍性的同時檢測。給定的染色體的豐度由核酸序列(此處稱作“樣品”、“DNA樣品”或“多核苷酸樣品”)代表。任何唯一的和代表給定的染色體的核酸序列可適合于本發(fā)明的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定給定的核酸序列是否是唯一和代表給定的染色體的。
可通過任何便利的方法產(chǎn)生適合用于本發(fā)明的染色體特異性多核苷酸樣品。不限制本發(fā)明的示例性方法包括從酶促或物理降解的基因組DNA分離染色體特異性多核苷酸；使用PCR從基因組DNA中擴增染色體特異性多核苷酸序列；和通過從基因組DNA克隆和篩選來鑒定染色體特異性序列。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍使用的方法分離適合產(chǎn)生或鑒定這些染色體特異性多核苷酸樣品的基因組DNA。用于分離基因組DNA的組織依賴于所述方法的具體應(yīng)用。例如，為在出生后的生物體中檢查非整倍性，生物體的體細胞適合用于分離基因組DNA，所述基因組DNA用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的樣品?；蛘撸瑸樵谏臣毎袡z測不分離事件，需要將來自給定生物體的配子的DNA用于樣品的產(chǎn)生。最后，為在出生前的胚胎中篩查非整倍性，卵裂球是最合適的產(chǎn)生樣品的組織。
在本發(fā)明中，“標準”應(yīng)理解為樣品的核酸等同物，但其中所述標準是由已知的非-非整倍性來源的基因組DNA產(chǎn)生。因此，在二倍體生物體的情況下，已知各染色體在所述標準中出現(xiàn)兩次。
關(guān)于樣品和標準，術(shù)語“等同”應(yīng)理解為在用于雜交的條件下與給定的核酸序列等同結(jié)合。例如，在非常高的嚴緊條件下，核酸樣品、標準和結(jié)合劑可能都必須具有100％相同的多核苷酸序列以使所述樣品和標準與結(jié)合劑同等結(jié)合。然而，在較低嚴緊條件下，樣品和標準可具有相互之間稍微不同的多核苷酸序列，但仍具有對結(jié)合劑的多核苷酸相同的結(jié)合親合力。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定，當考慮雜交條件時形成有關(guān)標準和樣品等同性的因素。然而，優(yōu)選地是樣品和標準包含相同的多核苷酸序列，并且結(jié)合劑包含與所述樣品和標準互補的多核苷酸序列。
當染色體樣品選自潛在的缺失區(qū)域時，可通過使用本發(fā)明的方法檢測給定染色體的部分丟失，稱作缺失或部分單體性。此外，通過使用推定的缺失區(qū)域內(nèi)的標記，與相同染色體上推定缺失的區(qū)域外的標記相比，應(yīng)用本發(fā)明的方法確定部分缺失。在這種情況下，染色體的部分缺失可作為單體通過使用染色體上的一個標記進行檢測和作為二倍體通過使用另一個在相同染色體上的標記進行檢測。
本發(fā)明進一步涉及用報告分子(例如熒光標記物)標記代表染色體的核酸。許多不同的熒光標記物對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，并且熒光標記物的選擇不限定本發(fā)明。在優(yōu)選的本發(fā)明確實施方案中，本發(fā)明的熒光標記包含任何能附著到多核苷酸和可用選自下列的光源激發(fā)的熒光標記物(i)氬離子激光-包含藍色488nm譜線，所述光源適合用于激發(fā)許多在綠色至紅色區(qū)域發(fā)熒光的染料和熒光染料。也可獲得在波長范圍(458nm、488nm、496nm、515nm等)發(fā)射的可調(diào)氬激光。
(ii)二極管激光-具有635nm發(fā)射波長?，F(xiàn)在可獲得的其它二極管激光在532nm工作。該波長最優(yōu)地激發(fā)碘丙錠(PI)。也可獲得發(fā)射大約476nm光的藍色二極管激光。
(iii)HeNe氣體激光-使用紅色633nm譜線工作。
(iv)HeCd激光-在325nm工作。
(v)100W水銀弧光燈-最有效的激發(fā)UV染料例如Hoechst和DAPI的光源。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，熒光標記物選自Alexa Fluor染料；BoDipy染料，包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665；Cy染料，特別是Cy3，Cy5和Cy5.5；6-FAM(熒光素)；熒光素dT；六氯熒光素(HEX)；6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素(JOE)；Oregon綠染料，包括488-X和514；羅丹明染料，包括羅丹明綠、羅丹明紅和ROX；羧基四甲基羅丹明(TAMRA)；四氯熒光素(TET)；和Texas紅。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，所述標記物是熒光素和Cy5。
在本發(fā)明中為了區(qū)分標準和樣品，優(yōu)選地用于樣品和標準的標記物具有不同的發(fā)射光譜。此外，當進行多重反應(yīng)的部分時，如前面所描述的，樣品和標準的標記物的熒光光譜必須與附著在結(jié)合劑上的標記物的熒光光譜不同。
用于將熒光標記物附著到多核苷酸或在合成或擴增期將所述標記物整合到多核苷酸上的方法之選擇不限制本發(fā)明。本發(fā)明涉及用于熒光標記多核苷酸的所有方法。示例性方法包括用于多核苷酸標記的合成前和合成后方法。合成前方法包括標記PCR引物，所述引物隨后用于擴增多核苷酸從而通過PCR被整合入多核苷酸。在該方法中，通常將熒光標記物附著到適合用于擴增多核苷酸的引物的5’末端。此外，通常在熒光團和多核苷酸分子間使用連接體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的連接體序列，所述合適的連接體可包括這樣的連接體，例如C6、C7和C12氨基酸修飾物，和包含巰基的連接體。由于很容易被確定，引物可包含連接體和熒光團，或單獨地包含在較后階段可附著熒光團的連接體。合成后標記方法包括缺刻標記系統(tǒng)，其中被標記的多核苷酸由Klenow聚合酶從隨機引物合成。熒光標記的核苷酸，或包含連接體基團的核苷酸可在合成期間被整合到Klenow聚合酶合成的多核苷酸中。然而，應(yīng)當理解本發(fā)明不被標記方法的選擇限定或限制。
因此，本發(fā)明提供了用于在受試者中同時對一個或多個染色體進行非整倍性檢測的方法，所述方法包括(i)產(chǎn)生報告分子標記的多核苷酸樣品，所述多核苷酸樣品是所述受試者的各染色體豐度的代表；(ii)產(chǎn)生針對各染色體的用不同報告分子標記的等同的非-非整倍性多核苷酸標準；(iii)針對各染色體將所述樣品和所述標準與有限量的結(jié)合劑混合，其中所述結(jié)合劑包含與針對各染色體的樣品和標準互補的多核苷酸，其中所述結(jié)合劑多核苷酸固定在微顆粒上，與針對各染色體的多核苷酸序列結(jié)合的微顆粒在大小和/或熒光標記物和/或熒光標記物之強度上不同；其中當與樣品和標準上的標記物的光譜比較時，在微顆粒上的熒光標記物(如果存在)具有不同的發(fā)射光譜；其中通過檢測樣品和標準對所述結(jié)合劑的不等同結(jié)合來檢測非整倍性。
使用以上描述的多重檢測方法使得在生物體的多個或全部染色體中同時檢測非整倍性成為可能。各結(jié)合劑或結(jié)合劑組包含特異性針對特定染色體(和與來自該染色體的樣品和標準多核苷酸序列互補物)、固定在微顆粒上的多核苷酸。代表各染色體的微顆粒是相互間在大小、熒光標記(如果有)、熒光強度或這些特性的組合上不同的微顆粒。然后可單個地評估這些不同的微顆粒與樣品和標準的結(jié)合。因此，這提供了對樣品中多個或所有染色體相對頻率的同時測量。
為了檢測生物體中的非整倍性，本發(fā)明的方法基于等量的來自相同生物體的樣品和標準DNA與有限量的互補結(jié)合劑競爭結(jié)合。
因此，本發(fā)明的方法用于在任何生物體中檢測非整倍性。許多生物體具有其染色體的多個拷貝，并且本發(fā)明用于在任何正常攜帶單個或多個拷貝的染色體的生物體中檢測非整倍性。示例性生物體包括，但不限定發(fā)明單倍體生物例如某些種類的雄性黃蜂、蜜蜂和螞蟻；三倍體生物體例如牡蠣；二倍體生物例如動物，特別是人；四倍體生物，包括幾中植物物種例如cyclamen和美洲榆樹，和一些種類的青蛙和蟾蜍；和六倍體生物例如植物Triticum aestivum。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，生物體是二倍體動物。在更優(yōu)選的實施方案中，動物是哺乳動物，例如人或家畜動物。在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，生物體是人。然而，本發(fā)明擴展到非動物物種例如植物。
在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實施方案中，人受試者是利用體外受精產(chǎn)生的人胚胎。
體外受精包含四個基本步驟卵巢刺激、卵子獲取、授精和胚胎轉(zhuǎn)移。人類體外受精過程的例子在下面詳細說明(i)排卵誘導(dǎo)——為了刺激卵巢產(chǎn)生更多的卵子，施用人絕經(jīng)期的促性腺激素，這是刺激排卵的天然激素的濃縮形式。促性腺激素可促使人體中的多個(從兩個到30個)卵泡同時成熟。當卵子確定成熟時，施用一定劑量的人絨毛膜促性腺激素(hCG)。hCG使卵子進入排卵和受精狀態(tài)。此處，hCG充當一種計時器，來指示從藥劑攝入開始的大約40小時，排卵將自然發(fā)生。因此，卵子獲取必須在hCG施用后大約36小時進行。
(ii)卵子獲取——將針頭放入卵巢，通過抽氣動力將液體和卵子從卵泡吸出；然后將卵子放置在試管中。一般來說，超過三分之二的卵泡可產(chǎn)生卵子。
(iii)授精和受精——在精子加入之前，卵子需要幾個小時來成熟，通常是獲取后6到8小時。授精是簡單地把精子加入到培養(yǎng)液。每個卵子隔離在其各自的培養(yǎng)皿中，一定數(shù)量的精子和每個卵子放置在一起。然后將培養(yǎng)皿置于已設(shè)定在生理溫度的孵卵器中。數(shù)小時后當精子確實進入卵子，則受精完成。受精后精子脫去尾巴、頭部變大。這一階段普遍認為是2PN階段，因為兩個前核并未融合。胚胎開始分裂。一個細胞變成兩個，進而變成四個細胞。通常卵子獲取后36到48小時，胚胎分裂成4個細胞。
(iv)胚胎轉(zhuǎn)移與移植——在卵子獲取后72小時進行胚胎轉(zhuǎn)移(移植)。將胚胎置入導(dǎo)管，將含有胚胎的液體安置在子宮腔。被轉(zhuǎn)移胚胎的數(shù)目可以變化。轉(zhuǎn)移后，則完全由胚胎來尋找并將自身附著在子宮壁。
除了幫助不孕人群生育，體外受精在農(nóng)業(yè)中也有用途。比如在家畜中，體外受精對家畜遺傳資源(genetic stock)的改善有貢獻。實例證包括
(i)年老奶牛——在過去，老齡使許多具有遺傳優(yōu)點的奶牛被排除在育種庫之外。這些有價值的年老雌牛能產(chǎn)生低風(fēng)險數(shù)量的未成熟卵母細胞，或卵子。
(ii)問題奶牛——所有品種和年齡的雌性可能因環(huán)境因素排卵失敗、輸卵管運輸失敗、子宮疾病/惡化、和對刺激激素?zé)o反應(yīng)等，而有生殖障礙。即使有這些情況，許多奶牛仍可被設(shè)法用來產(chǎn)生包含可恢復(fù)卵母細胞的卵巢卵泡。
(iii)健康的雌牛周轉(zhuǎn)——供體雌性可參與到同時具有經(jīng)典的多次排卵和胚胎轉(zhuǎn)移的體外受精方案。通過在超排卵過程的其他時期結(jié)合卵母細胞獲取和體外受精方案，供體可達到最大的成功。
因此，對運用體外受精技術(shù)產(chǎn)生的人和非人胚胎，本發(fā)明的方法應(yīng)當理解為還包含對非整倍體的篩查。
本領(lǐng)域檢測胚胎非整倍性的現(xiàn)行方法建立在移植后篩查基礎(chǔ)上。Jenderney等人(Mol.Hum.Reprod.6(9)855-860，2000)描述了對羊膜液體樣本使用QF-PCR的方法，該方法對特定染色體上的短串聯(lián)重復(fù)序列是特異的。使用諸如熒光原位雜交(FISH)(Bianchi等人，Prenat.Diag.22(7)609-615，2002)等技術(shù)，也可從母親血液中的胎兒細胞來檢測胎兒的可能非整倍性。但是，從這些研究選取的材料可以看出，這些方法僅僅適合于檢測胚胎或胎兒移植后的非整倍性。
本發(fā)明的方法能檢測從單個細胞提取和/或擴增的DNA之非整倍性。所以，本發(fā)明的方法，和其他用途相比，更適合于在所述胚胎移植之前，檢測用體外受精產(chǎn)生的動物胚胎中的非整倍性。
正如本領(lǐng)域的專業(yè)人員所熟知的，單個的細胞可以用標準的卵裂球活組織檢查方法從胚胎分離。簡單說來，卵裂球活組織檢查過程包括以下的步驟(i)在體外受精(IVF)后第三天，7細胞胚就可用來做活組織檢查。此胚用固定吸液管固定在微操作器上的合適位置。
(ii)使用帶狀吸液管，用酸性蒂羅德溶液在胚胎外殼(zona)上打孔。
(iii)然后將胚胎活組織檢查吸液管通過此開孔插入，溫和抽吸，從胚胎剝離一單個細胞(一個卵裂球)。
(iv)經(jīng)活組織檢查的胚胎仍被放回孵育箱做進一步培養(yǎng)。而卵裂球就可根據(jù)本發(fā)明的方法來篩查非整倍性。
(v)基于對卵裂球的分析，然后選擇相應(yīng)的非整倍體胚胎用于移植。
所以，本發(fā)明提供了一種在胚胎移植之前、用來檢測體外受精產(chǎn)生的動物胚胎非整倍性的方法。
在本發(fā)明一個更優(yōu)選的實施方案中，動物胚胎是人胚胎。
除了檢測生物體中的染色體數(shù)目，本發(fā)明用于生殖細胞中檢測不分離事件。就本發(fā)明的這一方面而言，所述生物體(優(yōu)選地是人)的配子可被用來檢查缺少和/或重復(fù)的染色體。本發(fā)明這方面的方法和前述方法大致相同。簡而言之，用報告分子(如熒光標記物)標記配子中某特定染色體的核酸代表，同時已知非-非整倍體配子中的相應(yīng)代表性多核苷酸用不同的熒光標記物來標記。正如在檢測體細胞或胚胎發(fā)生細胞非整倍性中所描述的方法，樣本和標準多核苷酸相互競爭地與有限數(shù)量的結(jié)合劑相結(jié)合。樣本中染色體的缺失將通過標準上結(jié)合劑檢測量的增加而顯示出來；樣本中染色體的重復(fù)將通過樣本上結(jié)合劑結(jié)合量的增加被檢測。在樣本中無分離障礙事件發(fā)生的情況下，標準和樣本對結(jié)合劑的結(jié)合量應(yīng)該是大體均等的。
本發(fā)明所預(yù)期的結(jié)合劑包含固定于基質(zhì)的多核苷酸序列。結(jié)合劑的多核苷酸序列包含的多核苷酸序列是和樣本和標準的核酸序列相互補的，如上所描述的。
可以理解，通過互補，本發(fā)明固定的多核苷酸，在低度嚴緊性條件下，將結(jié)合到樣本和標準的染色體編號代表的多核苷酸。優(yōu)選地固定的多核苷酸應(yīng)在中度嚴緊性條件下與樣本和標準相結(jié)合；最優(yōu)選的，固定的多核苷酸在高度嚴緊性條件下與樣本和標準相結(jié)合。
此處提到的低嚴緊性包括和包含從至少約0到至少約15％v/v的甲酰胺(包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％和14％v/v的甲酰胺)和從至少約1M到至少約2M的鹽用于雜交，和至少約1M到至少約2M的鹽用于洗滌條件?？偟恼f來，低度嚴緊性是從約25-30℃到約52℃，比如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52℃。溫度可以改變，較高的溫度被用來代替甲酰胺和或提供不同的嚴緊性條件。不同的嚴緊性條件可以在必要處使用，比如中度嚴緊性，其包括和包含至少約16％v/v到至少約30％v/v的甲酰胺，包括16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％和30％v/v的甲酰胺，和從至少約0.5M到至少約0.9M的鹽用于雜交，和至少約0.5M到至少約0.9M的鹽用于洗滌條件；或者高度嚴緊性，其包括和包含從至少約31％v/v到至少約50％v/v的甲酰胺，和從至少約0.01M到至少約0.15M的鹽用于雜交，和至少約0.01M到至少約0.15M的鹽用于洗滌條件。一般而言，洗滌在Tm＝69.3+0.41(G+C)％下完成(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5109，1962)。但是，隨錯配堿基對數(shù)目每增加1％，雙鏈DNA的Tm會降低1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.4683，1974)。甲酰胺在這些雜交條件下是任選的。相應(yīng)地，特別理想的嚴緊性水平按如下確定低度嚴緊性是6×SSC緩沖液、0.1％w/v的SDS、25-42℃；中度嚴緊性是2×SSC緩沖液、0.1％w/v的SDS、溫度在20-65℃范圍內(nèi)；高度嚴緊性是0.1×SSC緩沖液、0.1％w/v的SDS、至少為65℃的溫度。
多核苷酸可以在生產(chǎn)中被封裝在微顆粒內(nèi)或可以在生產(chǎn)后附著在微顆粒表面。選用何種方法將多核苷酸與基質(zhì)連接要依據(jù)所使用的材料，這一點可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕松確定。另外，為了增加所述多核苷酸在微顆粒上的結(jié)合，可在附著多核苷酸之前，在微顆粒上完成進一步處理包括硅烷化(用硅烷包被基質(zhì))。
一般說來，微顆?？捎媚芄矁r結(jié)合、或者吸附到微顆粒表面的任何化合物進行包被。另外，該試劑應(yīng)帶有一個化學(xué)基團與多核苷酸相結(jié)合，比如巰基、胺或羧基。具有這些特征的化合物的例子包括氨基結(jié)尾的硅烷，如氨基-丙基三甲氧硅烷或氨基-丙基三乙氧硅烷。除了硅烷，化合物諸如多聚L-賴氨酸(能非共價地結(jié)合在玻璃表面并可靜電吸附在多核苷酸的磷酸基團)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所以，其他化合物，包括其他適于將多核苷酸吸附在表面的硅烷可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕松確定，本發(fā)明并不會因化合物的選擇所局限。
將多核苷酸固定在基質(zhì)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在本發(fā)明中，用來把結(jié)合劑多核苷酸固定的實際基質(zhì)并不會影響本發(fā)明的運用。所以，本發(fā)明的結(jié)合劑包含固定在任何基質(zhì)上的多核苷酸。非限定性的固定多核苷酸于基質(zhì)的例證包括dipsticks；固定在膜上的多核苷酸，包括硝酸纖維素和尼龍，正如在Southern雜交中所使用的；固定在玻璃或陶瓷表面(如載玻片，正如在微列陣及同類中所用)的多核苷酸；固定在基于微珠的基質(zhì)如微顆粒上的多核苷酸，適于用流式細胞計數(shù)器進行分析。
多核苷酸可以用任何方便的途徑連接于基質(zhì)，有代表性的是通過物理吸附或化學(xué)交聯(lián)來完成。另外，基質(zhì)可以用能提高或增加多核苷酸吸附或連接到基質(zhì)表面的試劑來進一步包被，比如氨基-硅烷。但是，其他能履行此功能的試劑可被本領(lǐng)域技術(shù)人員輕松確定。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合劑包含能與樣本和標準多核苷酸互補的多核苷酸，其中所說的結(jié)合劑多核苷酸被固定于基質(zhì)，該結(jié)合劑與流式細胞計數(shù)器是相容的。
在其它優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合劑包含固定于微顆粒上的多核苷酸。在一個更優(yōu)選的實施方案中，微顆粒是硅質(zhì)微顆粒。在一個更優(yōu)選的實施方案中，為了核酸的共價結(jié)合，所述的硅質(zhì)微顆粒被硅烷化。
通過光源激發(fā)來檢測熒光化合物，并在特定波長處檢測可應(yīng)用在多種儀器上。特定的光源和光探測器已被應(yīng)用到顯微鏡上，出現(xiàn)表面熒光顯微和共聚焦激光顯微的技術(shù)。流式細胞計數(shù)器也用一種以熒光為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)來進行細胞分類。另外，許多用來在特殊應(yīng)用中估算熒光的專業(yè)化檢測儀器已研制出來，比如微陣列解讀機(microarrayreader)。本發(fā)明的方法并不會因方法和/或用來檢測熒光標記的儀器所局限。用來檢測的儀器應(yīng)根據(jù)結(jié)合劑所附著的基質(zhì)來選定。例如，包含微顆粒的結(jié)合劑可能與流式細胞計數(shù)器為基礎(chǔ)的檢測系統(tǒng)相容，而包含固定于載玻片的核酸的結(jié)合劑很可能用表面熒光或激光掃描共聚焦顯微鏡術(shù)來分析。最后，許多的結(jié)合劑，被排列成載玻片上的陣列，就最有可能用專業(yè)化的陣列解讀儀器來分析。由上所述可以確定，根據(jù)結(jié)合劑和所結(jié)合的標記核酸，對檢測方法的選擇無論如何也不會局限或限制本發(fā)明，而不過是固定方法用于某結(jié)合劑的功能體現(xiàn)。
但是，在本發(fā)明一個進一步優(yōu)選的實施方案中，被標記樣本和/或標準與結(jié)合劑的結(jié)合，和/或標記樣本與結(jié)合在所說結(jié)合劑的標準之間的相對數(shù)量，都用流式細胞計數(shù)器來測定。
本發(fā)明進而提供一種試劑盒，可用于同時檢測生物體、胚胎或生殖組織內(nèi)多個或全部染色體的非整倍性。方便地，該試劑盒是多分區(qū)的形式，其中第一分區(qū)包含一個或多個已標記(比如熒光標記的)的報告分子、用來擴增染色體特異的基因組DNA序列的寡核苷酸引物對。第二分區(qū)包含的寡核苷酸引物與第一分區(qū)相同的序列，但帶有不同的報告分子。在第三分區(qū)中，是一個或多個結(jié)合劑或結(jié)合劑組，包含的多核苷酸序列與寡核苷酸引物的預(yù)見的擴增子相互補。這些不同的多核苷酸，其每一個都固定于基質(zhì)(如微顆粒)。就每個不同的結(jié)合劑多核苷酸而言，其附著的微顆粒從大小、附著的標記物(如熒光標記物)和或熒光標記強度來說都是獨特的。這些差別將使微顆粒的不同類別可以用流式細胞計數(shù)器來檢測和分類。除了這些組分，該試劑盒的使用說明也在其中。該試劑盒采用多分區(qū)形式并不是必需的，因為組合兩個或多個分區(qū)的包含物是可能的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，樣本、標準和微顆粒結(jié)合劑用熒光標記所標記。在一個更優(yōu)選的實施方案中，附著在樣品、標準和微顆粒結(jié)合劑的標記，其發(fā)射光譜沒有重疊。
本發(fā)明可以用一下非限定性的例證來進一步說明實施例1微顆粒的12重檢測測試了本方法區(qū)分12個不同微顆粒類別的能力。用四甲基羅丹明標記3.0μm、4.12μm、5.0μm和6.8μm的微珠，設(shè)置三個不同的熒光強度水平，即0、33％和100％，這樣產(chǎn)生12個微珠類別。然后將這些珠子上樣于流式細胞計數(shù)器上的單檢測通道。其結(jié)果描述在圖2中。
實施例2全部人染色體中非整倍性同時檢測的示例性微顆粒表3顯示了一個適于同時檢測全部人染色體中非整倍性的可能結(jié)合劑的示例范圍。這些微顆粒包含5種不同大小的微珠，其用單一的熒光標記物在5個不同強度水平上標記。微珠大小和標記強度的組合產(chǎn)生25個可能的微珠類別，容納了同時檢測全部人染色體所必需的24個類別。
實施例3利用數(shù)字聚類多重分析人hGATA4，外顯子4DNA用PCR產(chǎn)生，其中正向引物帶有5′磷酸。構(gòu)建等位基因特異的探針來對PCR產(chǎn)物進行單核苷酸多態(tài)性分析。PCR后，多余的引物和引物二聚體用ExoI酶解去除。正鏈DNA優(yōu)選地被λ-外切核酸酶所降解。PCR產(chǎn)生的ssDNA和AmpaSandTM微珠(Genera Biosystems，Melbourne，澳大利亞)以每一測試25珠或每一測試50珠的配置相混合，所用微珠按照與磷酸化正向引物相同的DNA定做。等位基因特異探針(SNP-A特異探針，用四甲基若丹明(TMR)標記，其發(fā)射在黃色頻道；SNP-G特異探針，用Cy5標記，其發(fā)射在紅色頻道)。競爭性雜交后，給合兩個不同實驗中的實驗，同時用Becton-Dickinson FACSArray流式細胞計數(shù)器來檢測。收集數(shù)據(jù)并用Showplots分析包(Genera Biosystem)進行分析。簡而言之，根據(jù)PCR產(chǎn)物的狀態(tài)，微珠將聚類于四個“口袋”之一。如果PCR產(chǎn)物中只有“A”等位基因(純合A)，則只有TMR結(jié)合于AmpaSandTM微珠，并且微珠將是黃色的。如果PCR產(chǎn)物中只有“G”等位基因(純合G)，則只有Cy5結(jié)合于微珠，且微珠是紅色的。如果兩個等位基因都存在，則微珠是中間的(即一半亮紅/一半亮黃)。如果樣本是陰性的，則微珠上沒有熒光，微珠將聚類于兩個頻道都很低的一個口袋。
基因型的例證顯示在圖3-7。通過使用數(shù)字聚類多重分析(Number-Clustering multiplexing)，結(jié)果很容易確定。
表3用于人非整倍性同時檢測的示范硅質(zhì)微顆粒陣列的組成
本領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認識到，除了那些特別說明之處，這里描述的發(fā)明容許變化和修飾。應(yīng)該理解，本發(fā)明包括了所有這些變化和修飾。本發(fā)明也包括所有在本說明書中，無論個別地或集中地，提及或顯示的步驟、要點、組分和化合物，以及任何和所有的任何兩個或多個所述步驟或要點的組合。
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1.用于從微顆?；旌衔镏袡z測和分選標記的或未標記的微顆粒的方法，所述方法基于一個或多個下列特征(i)微顆粒大??；(ii)微顆粒標記物；(iii)微顆粒標記物強度；和(iv)微顆粒數(shù)目。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微顆粒用熒光標記物標記。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述微顆粒表面被標記。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述熒光標記物被內(nèi)化。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中使用流式細胞儀檢測和分選所述微顆粒。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中所述微顆粒是二氧化硅微顆粒。
7.用于在受試者的一個或多個染色體中同時檢測非整倍性的方法，所述方法包括(i)產(chǎn)生熒光性標記的多核苷酸樣品，所述多核苷酸樣品是所述患者的各染色體豐度的代表；(ii)進一步產(chǎn)生針對各染色體的等同的非-非整倍性多核苷酸標準，用與樣品不同的熒光標記物標記；(iii)針對各染色體將所述樣品和所述標準與有限量的結(jié)合劑混合，其中所述結(jié)合劑包含與針對各染色體的樣品和標準互補的多核苷酸，其固定在微顆粒上，并且針對各染色體的微顆粒在大小和/或熒光標記物和/或熒光標記物強度上不同；其中所述微顆粒上的熒光標記物，如果有的話，具有與樣品和標準的標記物不同的發(fā)射光譜；其中通過所述樣品和所述標準與所述結(jié)合劑的非等同結(jié)合來檢測非整倍性。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述患者是二倍體生物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
10.權(quán)利要求7至9中任一項的方法，其中所述哺乳動物是人。
11.權(quán)利要求7至9中任一項的方法，其中所述動物是家畜動物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述家畜動物選自牛、綿羊和馬。
13.權(quán)利要求7至12中任一項的方法，其中所述受試者是胚胎。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述胚胎利用體外受精產(chǎn)生。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述方法適于在移植之前在所述胚胎中檢測非整倍性。
16.權(quán)利要求15的方法，其中從卵裂球中分離、產(chǎn)生或擴增所述DNA樣品。
17.權(quán)利要求7至12中任一項的方法，其中所述核酸樣品和標準產(chǎn)生自來自體細胞的基因組DNA。
18.權(quán)利要求7至12中任一項的方法，其中所述核酸樣品和/或標準產(chǎn)生自來自生殖細胞或配子的基因組DNA。
19.權(quán)利要求7至18中任一項的方法，其中所述結(jié)合劑包含固定在微顆粒上對所述樣品和標準具有結(jié)合特異性的核酸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述微顆粒是二氧化硅微顆粒。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述二氧化硅微顆粒被硅烷化。
22.權(quán)利要求7至21中任一項的方法，其中使用流式細胞儀確定標記的樣品和/或標準，和/或標記的樣品與標準的相對量。
23.用于生物體、胚胎或細胞的一個或多個染色體中同時診斷非整倍性的試劑盒，其包含(i)適于染色體特異性多核苷酸序列擴增的熒光性標記的寡核苷酸引物套；(ii)具有與第一套相同的序列之寡核苷酸引物的重復(fù)樣本套，但包含具有與第一套標記物不同發(fā)射光譜的不同熒光標記物；(iii)一些結(jié)合劑，在微顆粒大小、報告分子或報告分子強度方面不同，與受試者中染色體數(shù)目相等，其中各結(jié)合劑包含與寡核苷酸引物的預(yù)期擴增子互補的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列被固定在標記的或未標記的微顆粒上；(iv)所述試劑的使用說明；其中所述微顆粒的標記物，如果存在，具有與兩個標記的寡核苷酸引物的標記物不同的發(fā)射光譜。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在微顆?；旌衔镏袡z測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方法能夠檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒的大小、任何附著的報告分子的熒光光譜、報告分子的熒光強度和各分類箱中顆粒的數(shù)目。這些微顆粒種類特別地用于許多遺傳或生化多重研究，并且特別地作為用于在生物體中或生物體的胚胎中檢測非整倍性的結(jié)合劑。在人中，至少24種微顆粒的檢測和分選可滿足用于針對所有染色體的同時檢測的單管方法，其中各不同的微顆粒種類包含與多核苷酸序列(對特定的人染色體是唯一的)互補和特異性地針對其的多核苷酸序列。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本發(fā)明用于同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性，所述生物體具有216或更少的染色體對。也提供了用于在一個或多個人染色體中同時檢測非整倍性的試劑盒。
文檔編號C12N15/12GK1836049SQ200480022976
公開日2006年9月20日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者A·P·懷爾登伯格, K·波特 申請人:杰納羅生物系統(tǒng)有限公司