專利名稱：Rna干擾酶及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是新型酶活性的發(fā)現(xiàn)。特別地，本發(fā)明涉及的是對(duì)這里命名為mRNA干擾酶(interferase)的一個(gè)新型蛋白質(zhì)家族的鑒定。這里描述的家族的示例成員包括MazF和PemK，以及它們的同源物和直向同源物(ortholog)。更為特別的是本發(fā)明涉及的是對(duì)作為核糖核酸內(nèi)切酶或者mRNA干擾酶的MazF和PemK多肽的生化性質(zhì)表征。發(fā)明還包括了對(duì)相關(guān)蛋白的分析，這些蛋白的作用是抑制mRNA干擾酶的活性。特別地，這里描述了對(duì)MazE蛋白質(zhì)功能及其對(duì)MazF活性影響的表征，以及對(duì)PemI蛋白質(zhì)功能及其對(duì)PemK活性影響的表征。這里還提供了對(duì)于新型mRNA干擾酶例如MazF和PemK、以及MazF和PemK活性的調(diào)節(jié)劑例如MazE和PemI的使用方法，它們可以用于研究和治療性應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在大腸桿菌中，程序性細(xì)胞死亡是通過(guò)由兩個(gè)基因組成的“上癮組件”介導(dǎo)的，其中一個(gè)基因編碼穩(wěn)定的毒性蛋白(毒素)，另一個(gè)基因編碼短壽的抗毒素(Engelberg-Kulka and Glaser，AnnuRev Microbiol 53，43-70(1999))。毒素和抗毒素由一個(gè)操縱子共同表達(dá)，相互作用形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物，它們的表達(dá)由毒素-抗毒素復(fù)合物或者抗毒素自身自動(dòng)調(diào)節(jié)。例如當(dāng)逆境條件抑制了它們的共表達(dá)時(shí)，抗毒素被蛋白酶降解，使毒素作用于其靶標(biāo)。這種細(xì)菌細(xì)胞程序性死亡的遺傳系統(tǒng)已經(jīng)在許多大腸桿菌染色體外元件中有所報(bào)導(dǎo)，即所謂的分離后殺死效應(yīng)(Tsuchimoto et al.，J Bacteriol 170，1461-6(1988)；Roberts and Helinski，J Bacteriol 174，8119-32(1992))。當(dāng)細(xì)菌丟失了質(zhì)?；蛘咂渌旧w外元件時(shí)，細(xì)胞被選擇性地殺死，因?yàn)椴环€(wěn)定的抗毒素相對(duì)于其相關(guān)的穩(wěn)定毒素降解得更快。因此細(xì)胞嗜好短壽的抗毒素，因?yàn)樗鼈兊膹念^合成對(duì)于細(xì)胞的存活是必需的。在大腸桿菌染色體上已知的上癮組件(addiction module)中(Gotfredsen and Gerdes，Mol Microbiol 29，1065-76(1998)；mittenhuber，J Mol Microbiol Biotechnol 1，295-302(1999))，大腸桿菌MazEF系統(tǒng)是第一個(gè)已知的原核染色體上癮組件(Aizenmanet al.，Proc Natl AcadSci USA 93，6059-63(1996))。mazEF組件由兩個(gè)重疊的基因mazE和mazF組成，它們位于relA基因的下游。MazF是一個(gè)穩(wěn)定的毒素，而MazE是一個(gè)不穩(wěn)定的抗毒素，很容易在體內(nèi)被ATP依賴的ClpPA絲氨酸蛋白酶降解(Aizenman et al.，Proc NatlAcad Sci USA 93，6059-63(1996))。mazEF的表達(dá)被鳥嘌呤核苷3′，5′-二焦磷酸(ppGpp)負(fù)調(diào)控，ppGpp是在嚴(yán)重的氨基酸饑餓條件下由RelA合成的(Aizenman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93，6059-63(1996))。而且，mazEF介導(dǎo)的細(xì)胞死亡可以被一些抗生素包括利福霉素、氯霉素和壯觀霉素(Sat et al.，J Bacteriol 183，2041-5(2001))所引發(fā)。使用大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MazF抑制了蛋白質(zhì)的合成和DNA的復(fù)制(Pedersen et al.，Mol Microbiol45，501-10(2002))。最近報(bào)導(dǎo)了無(wú)胸腺嘧啶的死亡是通過(guò)mazEF組件介導(dǎo)的(B.Sat，M.Reches，H.Engelberg-Kulka，J Bacteriol185，1803-7(2003))。在大腸桿菌中，已知染色體外的一些元件含有上癮組件，并且通過(guò)所謂的分離后殺死效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)菌的程序性細(xì)胞死亡。研究最透徹的染色體外上癮組件包括噬菌體P1上的phd-doc系統(tǒng)(Lehnherret al.(1993)J Mol Biol 233，414-428；Gazit and Sauer.(1999)J Biol Chem 274，16813-16818；Magnuson et al.(1996)J Biol Chem271，18705-18710；Lehnherr and Yarmolinsky.(1995)Proc NatlAcad Sci USA 92，32743277)，F(xiàn)因子上的ccdA-ccdB系統(tǒng)(Tam andKline.(1989)J Bacteriol 171，2353-2360；Bahassi et al.(1999)JBiol Chem 274，10936-10944；Afif et al.(2001)Mol Microbiol41，73-82；Dao-Thi et al.(2002)J Biol Chem 277，3733-3742)，質(zhì)粒R1上的kis-kid系統(tǒng)(Ruiz-Echevarria et al.(1991)MolMicrobiol 5，2685-2693；Hargreaves et al.(2002)Structure(Camb)10，1425-1433；Ruiz-Echevarria et al.(1995)J Mol Biol247，568-577；Santos-Sierra et al.(2003)Plasmid 50，120-130)以及質(zhì)粒R100上的pemI-pemK系統(tǒng)(Tsuchimoto et al.(1992)JBacteriol 174，42054211；Tsuchimoto et al.(1988)J Bacteriol170，1461-1466；Tsuchimoto and Ohtsubo.(1993)Mol Gen Genet237，81-88；Tsuchimoto and Ohtsubo.(1989)Mol Gen Genet215，463-468)。有趣的是，大腸桿菌染色體也含有一些上癮組件系統(tǒng)，例如relBE系統(tǒng)(Gotfredsen and Gerdes.(1998)Mol Microbiol29，1065-1076；Christensen et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA98，14328-14333；Christensen and Gerdes.(2003)Mol Microbiol48，1389-1400；Pedersen et al.(2003)Cell 112，131-140)，mazEF系統(tǒng)(Aizenman et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA93，6059-6063；Marianovsky et al.(2001)J Biol Chem 276，5975-5984；Kamada et al.(2003)Mol Cell 11，875-884；Zhang etal.(2003)J Biol Chem 278，32300-32306)以及chpB系統(tǒng)(SantosSierra et al.(1998)FEMS Microbiol Lett 168，51-58；Masuda etal.(1993)J Bacteriol 175，6850-6856；Christensen et al.(2003)J Mol Biol 332，809-819)。與上癮組件相關(guān)的毒素的細(xì)胞作用已經(jīng)被深入研究。ccdA-ccdB系統(tǒng)中的毒素ccdB與DNA解旋酶相互作用阻止了DNA的復(fù)制(Bahassi et al.(1999)同上；Kampranis et al.(1999)J MolBiol 293，733-744)，relBE系統(tǒng)中的毒素RelE以高度的密碼子特異性切割核糖體A位點(diǎn)的mRNA，但是不能降解自由的RNA(Pedersen et al.(2003)，同上)。但是最近表明，A位點(diǎn)的mRNA切割可以在沒(méi)有RelE的情況下出現(xiàn)(Hayes and Sauer.(2003)Mol Cell 12，903-911)。因此，A位點(diǎn)mRNA切割的確切機(jī)制還不知道。mazEF系統(tǒng)編碼的毒素MazF(ChpAK)和chpB系統(tǒng)編碼的毒素ChpBK被認(rèn)為通過(guò)一個(gè)與RelE的作用相似的機(jī)制，通過(guò)核糖體依賴和密碼子特異的方式抑制翻譯(Christensen et al.(2003)，同上)。但是本發(fā)明的發(fā)明者最近證明MazF是一個(gè)序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，它只對(duì)單鏈RNA起作用，優(yōu)先切割A(yù)CA序列處的mRNA，切割方式不依賴于核糖體和密碼子，因此在功能上與RelE不同(Zhang et al.(2003)Mol Cell 12，913-923)。pemI-pemK系統(tǒng)和kis-kid系統(tǒng)分別參與了對(duì)兩個(gè)密切相關(guān)的incFII低拷貝質(zhì)粒即質(zhì)粒R100(Tsuchimoto et al.(1992)同上；Tsuchimoto et al.(1988)同上)和R1(Ruiz-Echevarria etal.(1991)同上；Bravo et al.(1987)Mol Gen Genet 210，101-110)的穩(wěn)定維護(hù)?，F(xiàn)在知道這兩個(gè)系統(tǒng)是相同的(Engelberg-Kulka andGlaser.(1999)，同上)。已經(jīng)證明Kid(PemK)抑制了ColE1質(zhì)粒的復(fù)制，它在DNA合成的起始時(shí)起作用，但是不抑制P4 DNA的體外復(fù)制(Ruiz-Echevarria et al.(1995)同上)。至今為止，還沒(méi)有證據(jù)顯示Kid(PemK)抑制染色體DNA的復(fù)制。毒素Kid(PemK)和解毒劑Kis(PemI)不僅僅在細(xì)菌中起作用，而且在許多真核生物中有效作用。Kid(PemK)抑制酵母、非洲爪蟾(Xenopus laevis)和人細(xì)胞的增殖，其中Kis(PemI)解除了這種抑制(de la Cueva-Mendez et al.(2003)Embo J 22，246-251)。已經(jīng)證明Kid(PemK)引發(fā)了人細(xì)胞的凋亡(de laCueva-Mendez et al.(2003)同上)。這些結(jié)果提示Kid(PemK)在原核和真核生物中有一個(gè)共同的靶標(biāo)。這里引用的文獻(xiàn)不應(yīng)該被理解為承認(rèn)它們是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)從發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求中會(huì)變得明確。
發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及的是一個(gè)新型酶家族的發(fā)現(xiàn)，該酶在這里也被稱為“RNA干擾酶”。正如這里所描述的，mRNA干擾酶家族中示例性的核糖核酸內(nèi)切酶包括MazF和PemK及其同源物和直向同源物。因此本發(fā)明包括具有與MazF或PemK多肽同源的序列和/或同源的結(jié)構(gòu)的核糖核酸內(nèi)切酶。值得注意的是，在本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)以前，MazF的細(xì)胞靶標(biāo)還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。而且，本發(fā)明還涉及了以下發(fā)現(xiàn)，即PemK通過(guò)以序列特異的方式切割細(xì)胞mRNA阻斷蛋白質(zhì)的合成。因此本發(fā)明發(fā)明者的新發(fā)現(xiàn)提出了mRNA干擾酶(例如MazF和/或PemK)的新型應(yīng)用，其中mRNA干擾酶的核酸和氨基酸序列及其組合物可以被有利地使用。這種使用包括，但是不限于，多種不同的研究和治療性應(yīng)用，如在這里以下描述的。還提供了包含mRNA干擾酶(例如MazF和/或PemK)核酸和/或氨基酸序列、與mRNA干擾酶活性相容的緩沖液以及用法說(shuō)明材料。本發(fā)明還提供了檢測(cè)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包括(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(dá)(a)步驟中的核酸序列；(c)將步驟(b)中表達(dá)的核酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；以及(d)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的陽(yáng)性指示。本發(fā)明還包括了鑒定能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的因子的篩選方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(dá)(a)步驟中的核酸序列；(c)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(b)中表達(dá)的核酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(d)加入至少一種有可能調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子；以及(e)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的陽(yáng)性指示，其中在至少一種能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子存在時(shí)被切割底物量的改變鑒定出了一種能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子。這些方法在體外或者在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。這種使用本發(fā)明的方法確定的因子，能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性，可以引起底物切割增加或者減少。本發(fā)明還包括了使用本發(fā)明的方法鑒定出的因子。另一方面，提出了調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(dá)(a)步驟中的核酸序列；(c)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(b)中表達(dá)的核酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(d)加入能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子；以及(e)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的陽(yáng)性指示，其中在該因子存在時(shí)被切割底物量的改變提供了調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。示例性的編碼mRNA干擾酶的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO1或者3，和編碼SEQ ID NO2或者4的核酸序列，以及在這里以下描述的其同源物和直向同源物。其一個(gè)示例性的同源物/直向同源物是MazF-mtl，包含分別包含SEQ ID NO69和74的核酸和氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；以及(c)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的陽(yáng)性指示。本發(fā)明還包括了鑒定能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能片段活性的因子的篩選方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(c)加入至少一種有可能調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子；以及(d)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)mRNA干擾酶或其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段，其中在所述至少一種因子存在時(shí)被切割底物量的改變確定了能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子。這些方法可以在例如體外或者在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。使用這些方法確定的因子，能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性，可以實(shí)現(xiàn)底物切割的增加或者減少。這種調(diào)節(jié)性因子是在本發(fā)明范疇內(nèi)的。應(yīng)當(dāng)理解這種因子可以，例如通過(guò)作用于mRNA干擾酶(毒素)或者其抗毒素(例如各自PemI，MazE，或者二者中一個(gè)的功能性和/或結(jié)構(gòu)性同源物或直向同源物的抗毒素)，或者通過(guò)改變自我調(diào)節(jié)反饋機(jī)制(毒素-抗毒素復(fù)合物借此下調(diào)毒素和抗毒素基因的表達(dá))，調(diào)節(jié)mRNA干擾酶的核糖核酸內(nèi)切酶(例如PemK，MazF或者功能性和/或結(jié)構(gòu)性同源物或直向同源物)活性。能夠改變自我調(diào)節(jié)反饋機(jī)制(毒素-抗毒素復(fù)合物借此下調(diào)毒素和抗毒素基因的表達(dá))的因子能夠改變這些基因的協(xié)調(diào)調(diào)控。在該實(shí)施方案的一方面，能夠降低毒素-抗毒素復(fù)合物形成的因子抑制了抗毒素的作用，導(dǎo)致毒素活性的增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另一方面，涉及了能夠阻斷抗毒素和毒素基因表達(dá)的因子，其中該因子導(dǎo)致毒素水平由于毒素的穩(wěn)定性質(zhì)，相對(duì)于抗毒素水平的增加。這種不平衡也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。因此，這種因子可以有利地用于治療具有細(xì)菌感染的受試對(duì)象，特別是那些被對(duì)抗生素有抗性的細(xì)菌菌株感染的受試對(duì)象。這種因子屬于本發(fā)明的范疇內(nèi)并且可以單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用。還提供了調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(c)加入能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子；以及(d)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段或者是mRNA干擾酶或者其功能性片段的陽(yáng)性指示，其中在該因子存在時(shí)被切割底物量的改變提供了調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。這些方法可以在例如基于細(xì)胞的檢測(cè)中(在培養(yǎng)中或者在受試對(duì)象如非人類的動(dòng)物或者人類患者中)或者在體外使用。根據(jù)本發(fā)明，包含mRNA干擾酶的示例性氨基酸序列包括，但不限于，SEQ ID NO2或者4以及這里在下面描述的其同源物和直向同源物。其示例性的同源物/直向同源物是MazF-mt1，它包含SEQ IDNO74的氨基酸序列。本發(fā)明還包括在細(xì)胞中檢測(cè)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包括(a)提供包含表達(dá)載體的細(xì)胞，該載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或編碼包含mRNA干擾酶的氨基酸序列，以及該載體可選擇地包括至少一個(gè)調(diào)控序列；(b)在促進(jìn)至少一種細(xì)胞底物核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下孵育步驟(a)中的細(xì)胞；以及(c)測(cè)量所述的至少一種細(xì)胞底物的切割，其中所述的至少一種細(xì)胞底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)細(xì)胞中mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。一方面，提出了在細(xì)胞中調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含表達(dá)載體的細(xì)胞，該載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或編碼包含mRNA干擾酶的氨基酸序列，以及該載體可選擇地包括至少一個(gè)調(diào)控序列；(b)在促進(jìn)至少一種細(xì)胞底物核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下孵育步驟(a)中的細(xì)胞；(c)加入能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子；以及(d)測(cè)量所述的至少一種細(xì)胞底物的切割，其中所述的至少一種細(xì)胞底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)細(xì)胞中mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段，且其中在該因子存在的情況下至少一種被切割底物量的改變提供了調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。還提出的是篩選方法，以鑒定在細(xì)胞中能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能片段活性的因子，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供包含表達(dá)載體的細(xì)胞，該載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或編碼包含mRNA干擾酶的氨基酸序列，以及該載體可選擇地包括至少一個(gè)調(diào)控序列；(b)在促進(jìn)至少一種細(xì)胞底物核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下孵育步驟(a)中的細(xì)胞；(c)加入至少一種有可能調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的因子；以及(d)測(cè)量所述的至少一種細(xì)胞底物的切割，其中所述的至少一種細(xì)胞底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)細(xì)胞中mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段，且其中在該因子存在的情況下至少一種被切割底物量的改變鑒定出了能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的因子。根據(jù)本發(fā)明，包含表達(dá)載體(表達(dá)載體包含編碼mRNA干擾酶的核酸)的細(xì)胞包含的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO1或3，以及這里描述的其同源物和直向同源物；以及編碼SEQ ID NO2和4的核酸序列及這里描述的其同源物和直向同源物。示例性的其同源物和直向同源物是MazF-mt1，分別包含含有SEQ ID NO69和74的核酸和氨基酸序列。還提供的是組合物，組合物包含至少一種mRNA干擾酶或者其功能性片段、編碼mRNA干擾酶的核酸序列，和/或使用本發(fā)明的方法確定的mRNA干擾酶調(diào)節(jié)性因子，以及藥物上可以接受的緩沖劑。一方面，提供了用于治療具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治療上有效量的本發(fā)明組合物，以減輕所述疾病的癥狀。組合物包含至少一種能夠增加或者降低核糖核酸內(nèi)切酶底物切割的因子，這取決于困擾患者的疾病，以緩解疾病的癥狀。因此，本發(fā)明包括使用治療有效量的mRNA干擾酶或者其功能性片段、編碼mRNA干擾酶的核酸序列或者mRNA干擾酶調(diào)節(jié)性因子來(lái)制備藥物，用于治療具有疾病的患者以緩解所述疾病的癥狀。這種藥物還可以進(jìn)一步包含藥物上可以接受的緩沖劑。疾病例如細(xì)菌感染是可以通過(guò)向患者施用包含治療有效量的至少一種分子或者因子的組合物而被治療的，所述的分子或者因子能夠增加核糖核酸內(nèi)切酶底物的切割，通過(guò)減少患者體內(nèi)細(xì)菌的數(shù)目來(lái)緩解細(xì)菌感染的癥狀。在細(xì)菌感染包含至少一種抗生素抗性細(xì)菌菌株時(shí)使用這種方法具有特別的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的方法在過(guò)度增生性疾病的治療中也是有用的，其中將包含治療有效量的至少一種分子或者因子(能夠增加對(duì)核糖核酸內(nèi)切酶底物的切割)的本發(fā)明組合物施用給患者，以通過(guò)減少患者中的過(guò)度增生性細(xì)胞，緩解過(guò)度增生性疾病的癥狀?？梢允褂帽景l(fā)明的組合物和方法治療的過(guò)度增生性疾病(其特征是細(xì)胞增殖的失調(diào))，包括，但是不限于，不同組織的發(fā)育異常和組織變形、炎性病癥、自體免疫疾病、過(guò)度增生性皮膚疾病、牛皮癬、過(guò)敏/哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形手術(shù)后的再狹窄以及癌癥。本發(fā)明還包括治療具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向患者施用治療有效量的本發(fā)明組合物，其中至少一種所述組合物的因子實(shí)現(xiàn)了對(duì)核糖核酸內(nèi)切酶底物的切割的降低，以緩解所述疾病的癥狀。還包括在細(xì)胞中制備多肽的方法，所述的方法包括(a)用編碼所述多肽的核酸序列轉(zhuǎn)染所述的細(xì)胞，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，使用另外的三聯(lián)體密碼子替換mRNA干擾酶識(shí)別序列，其中由所述的突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒(méi)有因?yàn)樗龅耐蛔兌淖儯?b)使用編碼mRNA干擾酶的核酸序列轉(zhuǎn)染所述的細(xì)胞，其中所述的mRNA干擾酶識(shí)別所述的mRNA干擾酶識(shí)別序列；以及(c)在所述的細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列提供了在所述細(xì)胞中制備多肽的方法。根據(jù)本發(fā)明，編碼多肽或者mRNA干擾酶的核酸序列可以分別被包括在第一和第二表達(dá)載體中。而且，步驟(a)和(b)的轉(zhuǎn)染步驟可以分開或者同時(shí)(例如通過(guò)共轉(zhuǎn)染)進(jìn)行。正如在這里以上所表明的，核酸序列中mRNA干擾酶識(shí)別序列突變?yōu)椴煌娜?lián)體序列或者密碼子不會(huì)改變由突變核酸序列編碼的多肽的氨基酸序列。因此，就被編碼多肽的氨基酸序列而言，突變是沉默突變。突變核酸序列的目的是顯著降低該核酸轉(zhuǎn)錄出的mRNA對(duì)于所討論的mRNA干擾酶的核糖核酸內(nèi)切酶活性降解的敏感性。步驟(b)的核酸(例如編碼例如PemK多肽或者其功能性片段、或者M(jìn)azF多肽或者其功能性片段、或者M(jìn)azF或PemK的同源物或直向同源物的核酸序列)的表達(dá)降低或者抑制了由包含mRNA干擾酶識(shí)別序列的核酸序列編碼的細(xì)胞多肽的合成。因此，該方法產(chǎn)生了幾乎沒(méi)有細(xì)胞蛋白的所需多肽，所述細(xì)胞蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄本包含被所表達(dá)的mRNA干擾酶識(shí)別的mRNA干擾酶識(shí)別序列。因此該方法提供了在細(xì)胞中制備“純化的”多肽的方法。對(duì)于一些應(yīng)用，該方法還包含在步驟(c)之前或者當(dāng)中，將細(xì)胞在包含至少一種放射性標(biāo)記同位素的培養(yǎng)基中孵育。這些應(yīng)用包括，但是不止限于，制備標(biāo)記的多肽，用于使用核磁共振(NMR)技術(shù)進(jìn)行接下來(lái)的分析。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，在細(xì)胞中制備多肽的方法使用了mRNA識(shí)別序列腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)以及包含SEQ ID NO2的mRNA干擾酶MazF或者其功能性片段。在該實(shí)施方案中，編碼MazF或者其功能性片段的核酸的表達(dá)降低或者抑制了由包含ACA序列的核酸序列編碼的細(xì)胞多肽的合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞中制備多肽的方法使用了mRNA識(shí)別序列尿嘧啶-腺嘌呤-X(UAX)，其中X是胞嘧啶(C)，A，或U，以及包含SEQ ID NO4的mRNA干擾酶PemK或者其功能性片段。在該實(shí)施方案中，編碼PemK或者其功能性片段的核酸的表達(dá)降低或者抑制了由包含UAX序列的核酸序列編碼的細(xì)胞多肽的合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞中制備多肽的方法使用了mRNA識(shí)別序列尿嘧啶-腺嘌呤-C(UAC)，以及包含SEQ ID NO74的mRNA干擾酶MazF-mtl或者其功能性片段。在該實(shí)施方案中，編碼MazF-mtl或者其功能性片段的核酸的表達(dá)降低或者抑制了由包含UAC序列的核酸序列編碼的細(xì)胞多肽的合成。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提出了制備多肽的方法，包含(a)提供編碼所述多肽的核酸序列，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，以用另外的三聯(lián)體密碼子替代mRNA干擾酶的識(shí)別序列，其中由所述突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒(méi)有由于所述的突變而被改變；(b)提供編碼mRNA干擾酶的核酸序列，其中所述的mRNA干擾酶識(shí)別所述的mRNA干擾酶識(shí)別序列；以及(c)表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列，其中表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列提供了制備多肽的手段。該方法可以在體外進(jìn)行，例如在試管內(nèi)或者類似地進(jìn)行。在本領(lǐng)域內(nèi)以及以下的描述中已知適宜的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或者無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。mRNA干擾酶或者其片段可以可選擇地作為表達(dá)蛋白提供，而不是以需要表達(dá)的核酸序列形式。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，制備多肽的方法使用了mRNA識(shí)別序列ACA以及包含SEQ ID NO2的mRNA干擾酶MazF或者其功能性片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備多肽的方法使用了mRNA識(shí)別序列UAX以及包含SEQ ID NO4的mRNA干擾酶PemK或者其功能性片段，其中X是C、A或U。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備多肽的方法使用了mRNA識(shí)別序列UAC以及包含SEQ ID NO74的mRNA干擾酶MazF-mt1或者其功能性片段。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的mRNA干擾酶制備多個(gè)多核糖核苷酸序列的方法。該方法包含(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一個(gè)區(qū)域與所述的第二核酸序列的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)，且所述的第一和第二核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域都不包含與mRNA干擾酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它們的5′末端都被磷酸化；(b)通過(guò)所述的第一和第二核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成雙鏈的核酸序列，其包含側(cè)翼為單鏈突出端的互補(bǔ)區(qū)域，其中每一個(gè)單鏈突出端包含至少一個(gè)與mRNA干擾酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，且所述的單鏈突出端互相互補(bǔ)；(c)通過(guò)互補(bǔ)的單鏈突出端連接已經(jīng)退火的第一和第二核酸序列，形成包含多個(gè)退火的第一和第二核酸序列的串聯(lián)重復(fù)的多聯(lián)體(concatamer)；(d)使用第一引物(包含T7啟動(dòng)子以及與所述的第一核酸序列互補(bǔ)的區(qū)域)和第二引物(與所述的第二核酸序列互補(bǔ))擴(kuò)增所述的多聯(lián)體，其中所述的擴(kuò)增產(chǎn)生多個(gè)包含T7啟動(dòng)子的多聯(lián)體；(e)使用T7 RNA聚合酶從所述的多個(gè)多聯(lián)體轉(zhuǎn)錄出RNA分子，其中每一個(gè)所述的RNA分子包含多個(gè)側(cè)翼為mRNA干擾酶識(shí)別位點(diǎn)的多核糖核苷酸序列的串聯(lián)重復(fù)；以及(f)使用能夠在所述的干擾酶識(shí)別位點(diǎn)處切割RNA的mRNA干擾酶消化所述的RNA分子，其中所述的消化產(chǎn)生多個(gè)所述多核糖核苷酸序列。在制備多個(gè)多核糖核苷酸序列的方法的一個(gè)特別方面，mRNA識(shí)別序列是ACA序列，且mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段。在制備多個(gè)多核糖核苷酸序列的方法的另一個(gè)方面，mRNA識(shí)別序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，且mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。在制備多個(gè)多核糖核苷酸序列的方法的另一個(gè)方面，mRNA識(shí)別序列是UAC序列，且mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO74的MazF-mt1或者其功能性片段。本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，其編碼的多肽與SEQ IDNO2或者SEQ ID NO4或其功能性片段具有序列和/或結(jié)構(gòu)同源性，其中所述的多肽能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有與SEQ ID NO2或其功能性片段序列和/或結(jié)構(gòu)同源性的多肽是MazF的直向同源物，它能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的多肽包括，但是不止限于，耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)MazF(NP_244588.1)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)MazF(AAG23809.1)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)MazF(NP_372592.1)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)MazF(1NE8_A)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)MazF(NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(Morganella morgani)MazF(AAC82516.1)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)MazF(NP_217317.1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有與SEQ ID NO4或其功能性片段序列和/或結(jié)構(gòu)同源性的多肽是PemK同源物或者直向同源物，它能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的多肽包括，但是不止限于，PemK蛋白質(zhì)家族的73個(gè)已知成員，包括MazF(ChpAK)，ChpBK以及其他的類PemK蛋白。下面是一個(gè)在網(wǎng)站上找到的這些蛋白名稱的清單(http//pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc？acc＝PF02452)Q9RX98；Q8F5A3；Q9K6K8；CHPA_ECOLI；Q7NPF9；Q88TP7；Q7WWW1；Q8YS80；Q8DW95；Q82YR2；Q7X3Y1；Q93S64；Q8PRN1；Q8GFY1；O52205；PEMK_ECOLIQ7N4H2；Q88PS7；Q8XCF2 CHPB_ECOLI；Q82VU0；Q8UGU5；Q9RWK4；Q9PHH8；Q7TXU4；P71650；Q7U1Y5；P96295；Q9JWF2；Q9JXI1；Q8E882；Q82VB5；Q8KJS3；Q7NMY4；Q9KFF7；P96622；Q81IT4；Q81VF4；Q8ESK5；Q92DC7；Q8Y8L0；Q97LR0；Q8XNN7；Q8R861；Q88Z43；O07123；Q837I9；Q9F7V5；Q8CRQ1；O05341；P95840；Q9FCV0；Q837L1；Q93M89；Q99IU9；Q82UB5；Q93MT8；YJ91_MYCTU；Q97MV8；Q7NHWO；Q7NI95；Q8YML2；Q7NHR3；YE95_MYCTU；Q9PCB9；Q8YZW8；Q7TZ90；P95272；Q8VJR1；Q7UON2；O53450；O06780；和Q7U1I8。本發(fā)明還包括了表達(dá)載體，它們包含了分離的核酸序列，其編碼的多肽具有SEQ ID NO2或4或其功能性片段的序列和/或與SEQ ID NO2或4或其功能性片段具有結(jié)構(gòu)同源性，其中所述的多肽能夠表現(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶活性。還包括包含這些表達(dá)載體的細(xì)胞以及包含本發(fā)明分離核酸序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中核酸序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提出了分離的氨基酸序列，其包含的多肽具有SEQ ID NO2或4或其功能性片段的序列和/或與SEQ IDNO2或4或其功能性片段具有結(jié)構(gòu)同源性，其中所述的多肽能夠表現(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶活性。還包括了編碼本發(fā)明氨基酸序列的表達(dá)載體，其中氨基酸序列的表達(dá)由表達(dá)載體內(nèi)的調(diào)控序列控制，也包括包含這種表達(dá)載體的細(xì)胞以及包含本發(fā)明氨基酸序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中氨基酸序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO1或者SEQID NO3的分離核酸序列。其中的核酸序列編碼能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段。本發(fā)明還描述了包含SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3的核酸序列的表達(dá)載體，其中的核酸序列編碼能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且SEQ ID NO1或者SEQ IDNO3與調(diào)控序列有效連接。而且包含這種表達(dá)載體的細(xì)胞也屬于本發(fā)明的范疇。另一方面，提出了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其核酸序列包含SEQID NO1或者SEQ ID NO3，其中的核酸序列編碼能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且其中核酸序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)。還提供了編碼包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的多肽的分離的核酸序列，其中的多肽是mRNA干擾酶或者其功能性片段，能夠顯示核糖核酸內(nèi)切酶活性。另一方面，提供了包含分離核酸序列的表達(dá)載體，所述的核酸序列編碼包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的多肽，其中的多肽是能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，并且核酸序列與調(diào)控序列有效連接。本發(fā)明還包括了包含這些表達(dá)載體的細(xì)胞。另一方面，提出了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包含的分離核酸序列編碼包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的多肽，其中多肽是能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且核酸序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4的分離氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干擾酶或者其功能性片段，且mRNA干擾酶或者其功能性片段能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明還描述了表達(dá)載體，其編碼的分離氨基酸序列包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4，其中的氨基酸序列是mRNA干擾酶或者其功能性片段，且mRNA干擾酶或者其功能性片段能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性，且氨基酸序列的表達(dá)受到表達(dá)載體中調(diào)控序列的控制。本發(fā)明還包括包含這種表達(dá)載體的細(xì)胞。另一方面，提出了包含分離多肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述多肽包含SEQ ID NO2或者SEQ ID NO4，其中多肽是能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性的mRNA干擾酶或者其功能性片段，且多肽在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明還包括試劑盒，其包含下列成分分離的核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3，其中的核酸序列編碼mRNA干擾酶或者其功能性片段；包含SEQ ID NO2或者SEQ IDNO4的分離氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干擾酶或者其功能性片段；與mRNA干擾酶活性相容的緩沖劑；以及用法說(shuō)明材料。本發(fā)明還包括了本發(fā)明中mRNA干擾酶在涉及基因治療方面的應(yīng)用。也可以通過(guò)工程化使細(xì)胞表達(dá)分子，該分子在受試對(duì)象(例如人受試對(duì)象)中有缺陷或者缺乏，使該細(xì)胞通過(guò)整合本發(fā)明的mRNA干擾酶而自毀，mRNA干擾酶的表達(dá)受到可誘導(dǎo)調(diào)控元件的控制。在基因治療應(yīng)用中使用的用于細(xì)胞自毀的可誘導(dǎo)手段的整合，提供了一種自動(dòng)防故障機(jī)制，這樣可以在這種細(xì)胞為受試對(duì)象帶來(lái)有利影響之后和/或在它們導(dǎo)致有害影響之前被清除掉。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1A和1B顯示在不同固體培養(yǎng)基上的細(xì)胞增殖以及MazFRNA干擾酶家族不同成員的序列比對(duì)。圖1A顯示了分別轉(zhuǎn)化了pBAD-MazF，pBAD-MazF R29S或者pBAD-MazF R86G質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113(ΔaraBAD)細(xì)胞的生長(zhǎng)性質(zhì)。圖1B描繪了來(lái)自大腸桿菌的MazF(GenBank Accession No.NP_289336.1)與來(lái)自耐鹽芽孢桿菌(GenBank登錄編號(hào)NP_244588.1)，表皮葡萄球菌(GenBank登錄編號(hào)AAG23809.1)，金黃色葡萄球菌(GenBank登錄編號(hào)NP_372592.1)，枯草芽孢桿菌(GenBank登錄編號(hào)1NE8_A)，腦膜炎奈瑟氏球菌(GenBank登錄編號(hào)NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(GenBank登錄編號(hào)AAC82516.1)以及結(jié)核分枝桿菌(GenBank登錄編號(hào)NP_217317.1)的MazF的序列比對(duì)。圖2A-E顯示了曲線圖，描繪了MazF對(duì)于甲苯處理的大腸桿菌細(xì)胞35S-Met的摻入(Fig.2A)、[α-32P]dTTP的摻入(Fig.2B)以及[α-32P]UTP摻入(Fig.2C)的影響；以及MazF對(duì)于體內(nèi)35S-Met摻入到大腸桿菌細(xì)胞中(Fig.2D)的影響；以及SDS-PAGE分析MazF誘導(dǎo)后體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成(Fig.2E)。圖3A-C顯示了線性示蹤(line trace)，描繪了多核糖體性質(zhì)的光密度分析(圖3A)，它顯示了MazF對(duì)于多核糖體性質(zhì)的影響，并且顯示了蛋白質(zhì)凝膠，表明MazF(His)6對(duì)于原核(圖3B)和真核(圖3C)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響。圖4A-D顯示MazF對(duì)mRNA合成的影響。圖4A顯示在MazF存在時(shí)mazG mRNA的趾紋分析。圖4B顯示了用酚抽提后mazG mRNA的趾紋分析。圖4C顯示了MazE對(duì)于MazF對(duì)mazG mRNA切割的影響。圖4D顯示加入阿拉伯糖后(如所示)在不同時(shí)刻從含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細(xì)胞中提取總細(xì)胞mRNA進(jìn)行Northern印跡分析的結(jié)果，使用放射性標(biāo)記的ompA和lpp ORF DNA作為探針。圖5A和B顯示線性示蹤，顯示了春日霉素不存在(圖5A)和存在(圖5B)時(shí)多核糖體性質(zhì)的光密度分析。70S、50S和30S核糖體的位置如所示。圖6顯示了趾紋分析，顯示了核糖體對(duì)MazF對(duì)mazG mRNA切割的抑制。圖7顯示了趾紋分析，顯示了mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列由GGAG突變?yōu)閁UUG對(duì)MazF功能的影響。圖8顯示了趾紋分析，顯示了mazG mRNA起始密碼子的突變對(duì)于MazF功能的影響。圖9顯示了趾紋分析，顯示了在切割序列處UACAU(U1A2C3A4U5)的突變對(duì)MazF功能的影響。圖10顯示了丙烯酰胺凝膠，顯示了MazF和MazE對(duì)于16S和23S rRNA切割的影響。圖11顯示了對(duì)于純化的MazE-MazF(His)6復(fù)合物、MazF以及(His)6MazE蛋白的分析，使用tricine SDS-PAGE分離蛋白和考馬斯亮藍(lán)染色觀察。圖12A和12B顯示了天然的聚丙烯酰胺凝膠，表明了在(His)6MazE和MazF之間化學(xué)計(jì)量形成的復(fù)合物。圖13顯示了蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖線，圖示了MazF和MazE-MazF(His)6復(fù)合物的確定的分子量。圖14A，14B和14C顯示了EMSA凝膠，圖示了(His)6MazE和/或MazF與mazEF啟動(dòng)子DNA的結(jié)合。圖15顯示了MazE同源物氨基酸序列的比對(duì)。顯示了8個(gè)MazE家族蛋白質(zhì)的序列比對(duì)。圖16A和16B顯示了EMSA凝膠，圖示了蛋白質(zhì)和DNA的相互作用。如圖16A和16B所示，MazE的N端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了DNA分別與MazE-MazF(His)6復(fù)合物以及(His)6MazE蛋白質(zhì)的結(jié)合。圖17圖示了MazE及其截?cái)喈a(chǎn)物，以及酵母雙雜交試驗(yàn)的結(jié)果，表明了MazF和MazE或者其截?cái)喈a(chǎn)物/片段的相互作用。圖18A和18B分別顯示了非變性聚丙烯酰胺凝膠，圖示了蛋白質(zhì)相互作用；以及圖示了蛋白質(zhì)-DNA相互作用的EMSA凝膠。圖19圖示了MazE-MazF復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)。圖20A和20B顯示了大腸桿菌MazF的核酸和氨基酸序列。圖21A和21B顯示了大腸桿菌MazE的核酸和氨基酸序列。圖22A-22H顯示了大腸桿菌MazF直向同源物的核酸序列。圖23A-23H顯示了大腸桿菌MazF直向同源物的氨基酸序列。圖24A-24G顯示了大腸桿菌MazE直向同源物的核酸序列。圖25A-25G顯示了大腸桿菌MazE直向同源物的氨基酸序列。圖26A-C顯示了PemK對(duì)于DNA和蛋白質(zhì)合成的影響。圖26A和26B是曲線圖，圖示了PemK對(duì)于體內(nèi)DNA(A)和蛋白質(zhì)(B)合成的影響。圖26C顯示了在PemK誘導(dǎo)之后總細(xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析。圖27A-C顯示了SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)的放射性自顯影。結(jié)果表明了PemK和PemI對(duì)于無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響。圖28A-E顯示了聚丙烯酰胺凝膠(A)或者聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影(B-E)的結(jié)果，表明PemK介導(dǎo)的核糖核酸內(nèi)切酶活性。圖29A-B顯示了聚丙烯酰胺測(cè)序凝膠(A)和聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影(B)的結(jié)果，表明PemK介導(dǎo)的核糖核酸內(nèi)切酶活性對(duì)單鏈RNA的特異性。圖30A-D顯示了Northern印跡分析(A)或者聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影(B-D)的結(jié)果，圖示了PemK在體內(nèi)介導(dǎo)了對(duì)各種不同的mRNA的內(nèi)切核酸酶活性。圖31A和31B顯示了大腸桿菌PemK的核酸和氨基酸序列。圖32A和32B顯示了大腸桿菌PemI的核酸和氨基酸序列。圖33顯示了PemK、ChpBK和MazF多肽的序列比對(duì)。圖34顯示了PemK，ChpBK，MazF和來(lái)自隱藏分枝桿菌(Mycobacterium celatum)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440和弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)2a str.301的三個(gè)類PemK蛋白的序列比對(duì)。圖35顯示了成熟人嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(eotaxin)的核酸和氨基酸序列(分別是SEQ ID NO67和68)。圖36是pCold I載體的示意圖。圖37顯示了聚丙烯酰胺凝膠放射性自顯影的結(jié)果，顯示了在沒(méi)有背景蛋白質(zhì)合成的情況下成熟人嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的產(chǎn)生。圖38A-F是顯微鏡照片，顯示了被誘導(dǎo)表達(dá)MazF毒素(D-F)和未誘導(dǎo)(A-C)的人細(xì)胞的形態(tài)。圖39A-B顯示了(A)用pET28a表達(dá)的MazF(E24A)突變體N端延伸的氨基酸序列；以及(B)聚丙烯酰胺凝膠的照片，顯示了對(duì)應(yīng)于切割的MazF突變體融合蛋白的條帶(泳道1)以及凝血酶切割的MazF突變體融合蛋白(泳道2)。圖40顯示了MazF-mt1 mRNA干擾酶活性的引物延伸分析。圖41A-B顯示了(A)大腸桿菌MazF及其在結(jié)核分枝桿菌中的同源物的序列比對(duì)以及(B)大腸桿菌MazF及其在枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)和金黃色葡萄球菌中的同源物的序列比對(duì)。圖42顯示了mazF開放閱讀框(ORF)的RNA序列。所有的ACA序列用灰色顯示，替換了ACA序列而沒(méi)有改變由其編碼的MazF氨基酸序列的堿基改變?cè)赗NA序列的上方顯示。圖43A-E顯示了在結(jié)核分枝桿菌中的大腸桿菌MazF同源物的核酸序列。圖44A-E顯示了在結(jié)核分枝桿菌中的大腸桿菌MazF同源物的氨基酸序列。圖45A-D顯示了來(lái)自隱藏分枝桿菌，惡臭假單胞菌KT2440和弗氏志賀氏菌2a str.301的三個(gè)類PemK和ChpBK的核酸序列。圖46A-D顯示了來(lái)自隱藏分枝桿菌，惡臭假單胞菌KT2440和弗氏志賀氏菌2a str.301的三個(gè)類PemK蛋白和ChpBK的氨基酸序列。
發(fā)明詳述在描述這里的發(fā)現(xiàn)及其使用方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不止限于這里描述的特定試驗(yàn)方法，或者試驗(yàn)化合物及試驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和化合物可能是多樣的。還應(yīng)當(dāng)理解這里使用的術(shù)語(yǔ)目的僅僅是描述特定的實(shí)施方案，而不是要限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范疇僅僅限于所附的權(quán)利要求。因此，在說(shuō)明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)″MazF″或″PemK″指的既有一般類型的核糖核酸內(nèi)切酶，還有具有特定名稱的特定酶，包括與其具有結(jié)構(gòu)和序列同源性的酶。同樣地，本發(fā)明包括的酶家族這里稱為“RNA干擾酶”，這是這里的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的新家族。而且，本發(fā)明還包括了與其在本發(fā)明中的角色相一致的結(jié)構(gòu)和功能相似性的分子。而且，在說(shuō)明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語(yǔ)″MazE″或″PemI″指的既有一般類型的MazE(或者M(jìn)azF調(diào)節(jié)性分子)或者PemI(或者PemK調(diào)節(jié)性分子)，還有具有這一名稱的特定分子，包括與SEQ ID NO6或者SEQ ID NO8具有結(jié)構(gòu)和/或序列同源性的MazE(或者M(jìn)azF調(diào)節(jié)性分子)或者PemI(或者PemK調(diào)節(jié)性分子)。的確，本發(fā)明還包括了與其在本發(fā)明中的角色相一致的具有結(jié)構(gòu)和功能相似性的分子。細(xì)菌細(xì)胞的死亡和生長(zhǎng)抑制是由細(xì)菌基因組中的內(nèi)源毒素基因?qū)τ谀承毫l件的響應(yīng)而引發(fā)。MazF是一個(gè)內(nèi)源的毒素，它導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，由大腸桿菌中被稱為″MazEF上癮組件″的操縱子編碼。MazE是一個(gè)對(duì)抗MazF的不穩(wěn)定的抗毒素。正如這里所描述的，在通透化的細(xì)胞中檢查MazF對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成的作用。簡(jiǎn)而言之，在MazF誘導(dǎo)之后10分鐘，ATP依賴的35S-甲硫氨酸的摻入被完全抑制，而[α-32P]dTTP和[α-32P]UTP的摻入沒(méi)有被抑制，表明MazF是蛋白質(zhì)合成的特異抑制因子。而且，純化的MazF在原核和真核的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中都抑制蛋白質(zhì)的合成，且這種抑制在MazE存在的情況下被阻斷。在使用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行分析的時(shí)候，MazF的誘導(dǎo)阻斷了多核糖體的形成，同時(shí)增加了70S核糖體的組分，而50S和30S核糖體組分沒(méi)有受到MazF表達(dá)的影響。顯著的是，趾紋分析顯示MazF是一個(gè)序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，它識(shí)別ACA序列，獨(dú)立于核糖體起作用。而且，Northern印跡分析表明在MazF誘導(dǎo)后總細(xì)胞mRNA被降解。因此本發(fā)明的發(fā)明者有了一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，MazF是一個(gè)新型核糖核酸內(nèi)切酶家族第一個(gè)被確定的成員，考慮到其干擾細(xì)胞mRNA作用的能力，它在這里被命名為“mRNA干擾酶”。正如這里顯示的，干擾酶的功能由mRNA轉(zhuǎn)錄物在特異序列(ACA)處的切割產(chǎn)生，這導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的迅速停止和/或細(xì)胞死亡。正如這里表明的，mRNA干擾酶的作用在正常的細(xì)胞生理和/或由壓力條件誘導(dǎo)的受損細(xì)胞生理中具有廣泛的含意。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)純化的PemK(由“pemI-pemK上癮組件”編碼的毒素)抑制了在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的合成，而加入抗PemK的抗毒素PemI，恢復(fù)了蛋白質(zhì)的合成。這里描述的其他研究顯示PemK是一個(gè)序列特異的切割mRNA的核糖核酸內(nèi)切酶，因此抑制了蛋白質(zhì)的合成。PemI阻斷了PemK介導(dǎo)的核糖核酸內(nèi)切酶活性，這樣恢復(fù)了蛋白質(zhì)的合成。PemK只切割單鏈RNA，優(yōu)選在“UAX(X是C、A或者U)”識(shí)別位點(diǎn)的A殘基的5′或者3′一側(cè)切割。在誘導(dǎo)之后，PemK切割細(xì)胞mRNA，有效地阻斷大腸桿菌中蛋白質(zhì)的合成。pemK的同源物已經(jīng)在很多細(xì)菌的基因組中被發(fā)現(xiàn)，并且本發(fā)明的發(fā)明者在這里提出PemK及其同源物組成了一個(gè)新的核糖核酸內(nèi)切酶家族，該家族通過(guò)以序列特異的方式切割細(xì)胞mRNA干擾了mRNA的功能。為了更清楚地給出本發(fā)明的參數(shù)，使用以下的定義短語(yǔ)“側(cè)翼核酸序列”指的是那些位于內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)5′和3′的連續(xù)核酸序列。正如在本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求中所使用的，除非在上下文中明確指明，單數(shù)形式″a″，″an″和″the″包括了復(fù)數(shù)指代。因此例如，“the method”包括一種或者更多的方法，和/或這里描述的步驟類型和/或在閱讀本公開材料之后本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以明確的步驟等等。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切核酸酶”指的是可以在內(nèi)部切割DNA的酶。術(shù)語(yǔ)“核糖核酸內(nèi)切酶”指的是可以在內(nèi)部切割RNA的酶。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”指的是表現(xiàn)出大體正常的堿基配對(duì)性質(zhì)的兩條DNA鏈。但是互補(bǔ)的DNA可以含有一個(gè)或者更多的錯(cuò)配。術(shù)語(yǔ)“雜交”指的是在兩條互補(bǔ)的DNA鏈之間出現(xiàn)的氫鍵連接。“核酸”或者“核酸分子”在這里使用，指的是任何單鏈或者雙鏈的DNA或RNA分子，如果是單鏈的，核酸分子的互補(bǔ)序列的分子可以是線形或者環(huán)狀形式。在討論核酸分子時(shí)，某個(gè)核酸分子的序列或者結(jié)構(gòu)在這里進(jìn)行描述時(shí)可以根據(jù)常規(guī)按照從5′到3′的方向給出其序列。在提到本發(fā)明的核酸時(shí)有時(shí)會(huì)用到術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”。該術(shù)語(yǔ)在用于DNA時(shí)，所指的DNA分子已經(jīng)與其來(lái)源的生物體天然存在的基因組上緊鄰的序列分離開來(lái)。例如，“分離的核酸”可能包含插入到載體例如質(zhì)?；蛘卟《据d體中的DNA分子，或者整合到原核或者真核細(xì)胞或者生物體基因組DNA中的DNA分子。在用于RNA時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的核酸”主要是指根據(jù)以上確定的分離DNA分子編碼的RNA分子?；蛘咴撔g(shù)語(yǔ)所指的RNA分子已經(jīng)同在天然狀態(tài)(即在細(xì)胞或者組織中)下與該RNA分子聯(lián)系在一起的其它核酸充分地分離開來(lái)了。分離的核酸(DNA或者RNA)還可以代表通過(guò)生物學(xué)或者合成方式直接產(chǎn)生的、并且同其產(chǎn)生過(guò)程中存在的其他組分分離開來(lái)的分子。某些核酸序列的“天然等位變異體”、“突變體”和“衍生物”指的是與該序列有密切聯(lián)系、但是可能具有天然或者人工設(shè)計(jì)的序列或者結(jié)構(gòu)改變的序列。有緊密聯(lián)系的意思是序列中在確定長(zhǎng)度上至少65％但是通常是85％以上的核苷酸與用一個(gè)特定SEQ ID NO表示的核酸序列相匹配。緊密聯(lián)系的核酸序列之間核苷酸序列的改變或者差異可能代表了在某個(gè)核酸序列正常的復(fù)制過(guò)程中或者天然的重復(fù)中產(chǎn)生的序列核苷酸的改變。其他的改變可以根據(jù)特別的目的，例如改變核酸中的氨基酸密碼子或者調(diào)控區(qū)域的序列，進(jìn)行特異設(shè)計(jì)并且引入到序列中。這種特異的改變可以在體外使用多種不同的誘變技術(shù)進(jìn)行，或者在被置于特定選擇條件(該條件誘導(dǎo)或者選擇這些改變)下的宿主生物體中進(jìn)行。這種特異產(chǎn)生的序列變異體可以被稱作初始序列的“突變體”或者“衍生物”。在提及某個(gè)特定序列時(shí)使用術(shù)語(yǔ)“百分比相似性”、“百分比一致性”以及“百分比同源性”，如同University of WisconsinGCG軟件程序中提及的那樣，這在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。
本發(fā)明還包括本發(fā)明MazF多肽或者蛋白質(zhì)的活性部分、片段、衍生物以及功能性或者非功能性模擬物。MazF多肽的“活性部分”的意思是小于MazF多肽全長(zhǎng)，但是仍然保留了可測(cè)量生物活性的肽。
mRNA干擾酶的“片段”或者“部分”的意思是一段氨基酸殘基的片段，至少有大約5-7個(gè)連續(xù)的氨基酸，一般至少有大約7-9個(gè)連續(xù)的氨基酸，通常至少有大約9-13個(gè)連續(xù)的氨基酸，最優(yōu)選至少大約20-30個(gè)或者更多連續(xù)的氨基酸。mRNA干擾酶的“衍生物”或者其片段的意思是通過(guò)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，例如對(duì)編碼蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)行操作或者改變蛋白質(zhì)自身而形成的經(jīng)修飾的多肽。這種天然氨基酸序列的衍生物可能涉及了一個(gè)或者更多氨基酸插入、添加、刪除或者替換，可能或者可能沒(méi)有改變?cè)瓉?lái)mRNA干擾酶的基本活性。
在自然界中存在不同的mRNA干擾酶“變異體”。這些變異體可能是等位基因，其特征是編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸序列的差異，或者可能涉及不同的RNA加工或者翻譯后的修飾。技術(shù)人員可以制備出具有單一或者多個(gè)氨基酸替代、刪除、添加或者替換的變異體。此外，這些變異體可能包含(a)其中一個(gè)或者更多氨基酸殘基被保守或者非保守的氨基酸替代的變異體，(b)其中一個(gè)或者更多氨基酸殘基被加入到mRNA干擾酶中的變異體，(c)其中一個(gè)或者更多氨基酸包含了取代基團(tuán)的變異體，以及(d)其中mRNA干擾酶與另外一個(gè)肽或者多肽(例如融合伴侶、蛋白標(biāo)簽或者其他化學(xué)部分，它們可能使mRNA干擾酶具有有用的性質(zhì)，例如抗體的表位、多聚組氨酸序列、生物素部分等等)融合的變異體。本發(fā)明的其他mRNA干擾酶包括變異體，其中在保守或者非保守的位置來(lái)自一個(gè)物種的氨基酸殘基被另外一個(gè)物種的相應(yīng)殘基替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，非保守位置的氨基酸殘基被保守或者非保守的殘基替代。獲得這些變異體的技術(shù)，包括遺傳學(xué)的(抑制、刪除、突變等)、化學(xué)的以及酶學(xué)的技術(shù)，對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員是已知的。
這種等位變異、類似物、片段、衍生物、突變體以及修飾，包括可變核酸加工形式和可變翻譯后修飾形式產(chǎn)生保留了mRNA干擾酶任何生物學(xué)性質(zhì)的mRNA干擾酶衍生物，它們包括在本發(fā)明的范疇中。
這里使用的術(shù)語(yǔ)″直向同源物″或者″同源物″指由核酸序列編碼的核酸酶，這些序列的多肽產(chǎn)物與MazF編碼序列有大于60％的序列一致性，和/或這些序列的基因產(chǎn)物與MazF有相似的三維結(jié)構(gòu)和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但不限于，耐鹽芽孢桿菌的MazF(GenBank登錄編號(hào)NP_244588.1)，表皮葡萄球菌的MazF(GenBank登錄編號(hào)AAG23809.1)，金黃色葡萄球菌的MazF(GenBank登錄編號(hào)NP_372592.1)，枯草芽孢桿菌的MazF(GenBank登錄編號(hào)1NE8_A)，腦膜炎奈瑟氏球菌的MazF(GenBank登錄編號(hào)NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(GenBank登錄編號(hào)AAC82516.1)和結(jié)核分枝桿菌(GenBank登錄編號(hào)NP_217317.1)。參見圖22和23。術(shù)語(yǔ)″直向同源物″和″同源物″可以用來(lái)指任何物種的MazF核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這些物種包括，但是不止限于，大腸桿菌，耐鹽芽孢桿菌，表皮葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，結(jié)核分枝桿菌，小鼠(Mus musculus)，以及智人(Homo sapiens)。這里涉及了在本發(fā)明的方法中使用這些直向同源物/同源物編碼的核酸酶。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)″直向同源物″或者″同源物″還指由一些核酸序列編碼的核酸酶，這些序列的多肽產(chǎn)物與PemK編碼序列有大于60％的序列一致性，和/或這些序列的基因產(chǎn)物與PemK有相似的三維結(jié)構(gòu)和/或生化活性。術(shù)語(yǔ)″直向同源物″和″同源物″可以用來(lái)指任何物種的PemK核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這里涉及了在本發(fā)明的方法中使用這些PemK的直向同源物/同源物編碼的核酸酶。示例性的同源物和直向同源物包括，但不限于，PemK蛋白質(zhì)家族中的73個(gè)已知成員，包括MazF(ChpAK)，ChpBK以及其他類PemK蛋白。以下是在網(wǎng)站中(http//pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc？acc＝PF02452)找到的這些蛋白質(zhì)的命名清單Q9RX98；Q8F5A3；Q9K6K8；CHPA_ECOLI；Q7NPF9；Q88TP7；Q7WWW1；Q8YS80；Q8DW95；Q82YR2；Q7X3Y1；Q93S64；Q8PRN1；Q8GFY1；O52205；PEMK_ECOLI Q7N4H2；Q88PS7；Q8XCF2 CHPB_ECOLI；Q82VU0；Q8UGU5；Q9RWK4；Q9PHH8；Q7TXU4；P71650；Q7U1Y5；P96295；Q9JWF2；Q9JXI1；Q8E882；Q82VB5；Q8KJS3；Q7NMY4；Q9KFF7；P96622；Q81IT4；Q81VF4；Q8ESK5；Q92DC7；Q8Y8L0；Q97LR0；Q8XNN7；Q8R861；Q88Z43；O07123；Q837I9；Q9F7V5；Q8CRQ1；O05341；P95840；Q9FCV0；Q837L1；Q93M89；Q99IU9；Q82UB5；Q93MT8；YJ91_MYCTU；Q97MV8；Q7NHW0；Q7NI95；Q8YML2；Q7NHR3；YE95_MYCTU；Q9PCB9；Q8YZW8；Q7TZ90；P95272；Q8VJR1；Q7UON2；O53450；O06780；和Q7U1I8。參見圖33和34。Swiss-Protein編號(hào)之后是NCBI編號(hào)。Q9RX98 NP_294140 Q8F5A3 NP_711962 Q9K6K8 NP_244588 CHPA_ECOLINP_417262 Q7NPF9 NP_923042 Q88TP7 NP_786238 Q7WWW1 NP_943016 Q8YS80NP_487251 Q8DW95 NP_720642 Q82YR2 NP_816992 Q7X3Y1 NP_857606 Q93S64 NP_862570Q8PRN1 NP_644713 Q8GFY1AAN87626.O52205 AAC82516 PEMK_ECOLI NP_957647Q7N4H2 NP_929611 Q88PS7 NP_742932 Q8XCF2 NP_290857 CHPB_ECOLI D49339 Q82VU0NP_841047 Q8UGU5 NP_531638 Q9RWK4 AAF10240 Q9PHH8 NP_061683 Q7TXU4NP_856470 P71650 NP_217317 Q7U1Y5 NP_854128 P96295 CAB03645 Q9JWF2 NP_283229Q9JXI1 AAF42359 Q8E882 NP_720377 Q82VB5 NP_841237 Q8KJS3 CAA70141 Q7NMY4NP_923577 Q9KFF7 NP_241388 P96622 NP_388347 Q81IT4 NP_830134 Q81VF4 NP_842807Q8ESK5 NP_691544 Q92DC7 NP_470228 Q8Y8L0 NP_464414 Q97LR0 NP_347134 Q8XNN7NP_561211 Q8R861NP_623721 Q88Z43 NP_784302 O07123 CAA70141 Q837I9 NP_814592Q9F7V5 NP_765227 Q8CRQ1 AAO05271 O05341 NP_646809 P95840 BAB95857 Q9FCV0CAC03499 Q837L1 NP_814568 Q93M89 NP_150051 Q82UB5 NP_841618 Q93MT8 NP_713024YJ91_MYCTU NP_216507 Q99IU9 P_856470 Q97MV8 NP_346728 Q7NHW0 NP_925371Q7NI95 NP_925234 Q8YML2 NP_488961 Q7NHR3 NP_925418 YE95_MYCTU CAA17218Q9PCB9 NP_299148 Q8YZW8 NP_484381 Q7TZ90 NP_855627 P95272 NP_216458 Q8VJR1NP_336589Q7U0N2 NP_854788 O53450 NP_216458 O06780 NP_215173 Q7U1I8 NP_854336.這里使用的術(shù)語(yǔ)″直向同源物″或“同源物”還指的是由核酸序列編碼的核酸酶(抗毒素或者核酸酶的調(diào)節(jié)劑)的結(jié)合伴侶，其多肽產(chǎn)物與MazE的編碼序列有大于60％的一致性，和/或其基因產(chǎn)物具有與MazE相似的三維結(jié)構(gòu)和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但是不限于，MazE，耐放射異常球菌(Deinococcusradiodurans)(GenBank登錄號(hào)NP_294139)；MazE，耐鹽芽孢桿菌(GenBank登錄號(hào)NP_244587)；PemI，質(zhì)粒R100(GenBank登錄號(hào)NP_052993)；PemI，質(zhì)粒R466b(GenBank登錄號(hào)AAC82515)；ChpS，大腸桿菌(GenBank登錄號(hào)NP_290856)；MazE，惡臭假單胞菌KT2440(GenBank登錄號(hào)NP_742931)；MazE，Photobacteriumprofundum(AAG34554)。參見圖24和25。術(shù)語(yǔ)″直向同源物″或“同源物”還可以指任何物種的MazE的核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這些物種包括，但是不止限于，大腸桿菌，耐放射異常球菌，耐鹽芽孢桿菌，惡臭假單胞菌，Photobacterium profundum，表皮葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，結(jié)核分枝桿菌，小鼠(Mus musculus)，以及智人。這里還涉及由這些直向同源物/同源物編碼的核酸酶調(diào)節(jié)性分子(抗毒素)在本發(fā)明方法中的使用。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)″直向同源物″或“同源物”還指的是由核酸序列編碼的核酸酶結(jié)合伴侶(抗毒素或核酸酶的調(diào)節(jié)劑)，其多肽產(chǎn)物與PemI編碼序列有大于60％的序列一致性，和/或其基因產(chǎn)物與PemI有相似的三維結(jié)構(gòu)和/或生化活性。示例性的PemI的直向同源物/同源物包括，但不止限于，MazE(抗毒素)蛋白質(zhì)家族中的已知成員，包括MazE(ChpAI)，ChpBI以及其他MazE的同源物。術(shù)語(yǔ)″直向同源物″和“同源物”可以用來(lái)指任何物種的PemI核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。這里涉及了在本發(fā)明的方法中使用這些同源物編碼的核酸酶調(diào)節(jié)性分子。這里涉及了在本發(fā)明的方法中使用這些同源物/直向同源物編碼的核酸酶調(diào)節(jié)性分子(抗毒素)。正如在這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“功能性的”意味著核酸或者氨基酸序列對(duì)于所述的試驗(yàn)或者目的是有功能的。正如在這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“功能性片段”意味著核酸或者氨基酸序列是全長(zhǎng)多肽的一部分或者亞結(jié)構(gòu)域，并且對(duì)于所述的試驗(yàn)或者目的是有功能的。在指一個(gè)特定的核苷酸或者氨基酸時(shí)，短語(yǔ)“基本由……組成”的意思是具有給定SEQ ID NO序列性質(zhì)的序列。例如在用來(lái)指一個(gè)氨基酸序列時(shí)，該短語(yǔ)包括了該序列本身以及不會(huì)影響該序列基本性質(zhì)和新性質(zhì)的分子修飾?！皬?fù)制子”是能夠主要在自身的控制下復(fù)制的任何遺傳元件，例如質(zhì)粒、粘粒、桿粒、噬菌體或者病毒。復(fù)制子可以是RNA或者DNA，可以是單鏈或者雙鏈?！拜d體”是一個(gè)復(fù)制子，例如質(zhì)粒、粘粒、桿粒、噬菌體或者病毒，另外的遺傳序列或者元件(DNA或者RNA)可以與其相連，使得連接的序列或者元件也能復(fù)制?！氨磉_(dá)載體”或者“表達(dá)操縱子”指的是可能具有轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、翻譯起始信號(hào)(例如ATG或者AUG密碼子)、多聚腺苷酸化信號(hào)、終止子等等)的核酸片段，其有助于多肽編碼序列在宿主細(xì)胞或者生物體中的表達(dá)。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“有效連接”指的是能夠介導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)控序列，它被放在DNA分子(例如表達(dá)載體)中相對(duì)于編碼序列的適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，使得編碼序列被表達(dá)。同樣的定義有時(shí)應(yīng)用在表達(dá)載體中的編碼序列和轉(zhuǎn)錄控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止元件)的排列上。當(dāng)產(chǎn)生了雜合核酸分子時(shí)，該定義有時(shí)還應(yīng)用在雜合分子中第一個(gè)第二個(gè)核酸序列的核酸序列的排列上。正如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指的是本發(fā)明的引物和探針，其定義為由兩個(gè)或者更多核糖或者脫氧核糖核苷酸、優(yōu)選是三個(gè)以上核苷酸組成的核酸分子。寡核苷酸的準(zhǔn)確大小取決于各種不同的因素、特定的應(yīng)用以及寡核苷酸的使用。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“探針”指的是寡核苷酸，多核苷酸或者核酸，可以是RNA或者是DNA，可以是天然存在的(如從限制性酶消化產(chǎn)物純化得到的)或者合成產(chǎn)生的，能夠與序列同探針互補(bǔ)的核酸退火或者特異雜交。探針可以是單鏈或者雙鏈的。探針的準(zhǔn)確長(zhǎng)度取決于許多因素，包括溫度、探針的來(lái)源以及使用方法。例如對(duì)于診斷應(yīng)用，根據(jù)靶向序列的復(fù)雜程度，寡核苷酸探針通常含有15-25或者更多的核苷酸，盡管它可能含有更少的核苷酸。在這里，選擇探針，使其與特定的靶核酸序列的不同鏈“基本”互補(bǔ)。這意味著探針必須充分互補(bǔ)，才能夠在一系列預(yù)先設(shè)置的條件下與它們各自的靶鏈“特異雜交”或者退火。因此，探針的序列不需要是靶標(biāo)的精確互補(bǔ)序列。例如，一個(gè)非互補(bǔ)的核苷酸片段可以連接在探針的5′或者3′端，探針序列的剩余部分與靶鏈互補(bǔ)。另外，在探針序列同與探針特異退火的靶核酸序列有充分互補(bǔ)性的條件下，可以將非互補(bǔ)堿基或者更長(zhǎng)的序列分散到探針中。術(shù)語(yǔ)“特異雜交”指的是充分互補(bǔ)序列的兩個(gè)單鏈核酸分子之間的結(jié)合使得在本領(lǐng)域內(nèi)一般使用的預(yù)先設(shè)定的條件下這種雜交可以進(jìn)行(有時(shí)稱為“基本互補(bǔ)”)。特別地，該術(shù)語(yǔ)指的是寡核苷酸與本發(fā)明的單鏈DNA或者RNA內(nèi)部含有的基本互補(bǔ)序列之間的雜交，基本排除了寡核苷酸與非互補(bǔ)序列單鏈核酸之間的雜交。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“引物”指的是寡核苷酸，可以是RNA或者DNA，單鏈或者雙鏈，可以來(lái)源于生物系統(tǒng)，由限制性酶切產(chǎn)生或者合成產(chǎn)生，當(dāng)所述的寡核苷酸置于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中時(shí)，就能夠作為依賴于模板進(jìn)行核酸合成的起始物而起作用。在提供了正確的核酸模板、核酸的適宜的核苷三磷酸前體、聚合酶、適宜的輔助因子和條件(如適宜的溫度和pH)時(shí)，引物就可以在其3′端通過(guò)聚合酶的作用或者類似的活性，通過(guò)加入核苷酸而得到延伸，產(chǎn)生引物延伸的產(chǎn)物。引物的長(zhǎng)度根據(jù)特定的條件和應(yīng)用的需要可以有所不同。例如，在診斷應(yīng)用中，寡核苷酸引物的長(zhǎng)度通常是15-25或者更多的核苷酸。引物必須與所要求的模板充分互補(bǔ)，才能引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成，即引物應(yīng)能夠與所要求的模板鏈退火，退火的方式足以將引物的3′羥基部分置于正確的鄰近位置，用于在聚合酶或者類似的酶作用下引發(fā)合成。并不需要引物的序列是所要求模板的完全互補(bǔ)序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸序列可以連接在互補(bǔ)引物的5′端。另外，在引物序列與所要求的模板鏈有充分互補(bǔ)性，能夠有功能地提供一個(gè)模板-引物復(fù)合物用于延伸產(chǎn)物合成的前提下，可以將非互補(bǔ)堿基分散到寡核苷酸引物序列中。引物可以用6-羧基熒光素(6-FAM)進(jìn)行熒光標(biāo)記?；蛘咭锟梢杂?，7，2′，7′-四氯-6-羧基熒光素(TET)進(jìn)行標(biāo)記。其他的DNA標(biāo)記方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且被認(rèn)為是在本發(fā)明范疇內(nèi)的。這里有時(shí)使用術(shù)語(yǔ)“分離的蛋白質(zhì)”或者“分離和純化的蛋白質(zhì)”。該術(shù)語(yǔ)主要是指通過(guò)表達(dá)本發(fā)明的分離核酸分子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；蛘咴撔g(shù)語(yǔ)所指的蛋白質(zhì)已經(jīng)同在天然狀態(tài)下與該蛋白質(zhì)聯(lián)系在一起的蛋白質(zhì)充分地分離開來(lái)，以“基本純”的形式存在了?！胺蛛x的”并不意味著排除與其他化合物或者材料形成人工或者合成混合物，以及不干擾基本活性的不純物質(zhì)的存在，這些物質(zhì)可能由于例如不完全的純化、穩(wěn)定劑的加入或者配置成為如免疫原性制劑或藥物上可以接受的制劑而存在。術(shù)語(yǔ)“基本純”指的是一種制劑包含至少50-60％重量的給定材料(例如核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)等等)。更為優(yōu)選地，制劑包含至少75％重量，最優(yōu)選90-95％重量的給定化合物。純度是由適合于給定化合物的方法來(lái)量度的(例如色譜法、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC分析等等)?！俺墒斓牡鞍踪|(zhì)”或者“成熟的多肽”所指的多肽是具有任何加工事件之后的多肽序列，這些加工事件在多肽產(chǎn)生的過(guò)程中通常就出現(xiàn)，例如多肽前體的蛋白酶水解加工過(guò)程。在確定成熟蛋白質(zhì)的序列或者界限時(shí)，成熟蛋白質(zhì)序列的第一個(gè)氨基酸被稱為氨基酸殘基1。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽”、“標(biāo)簽序列”或者“蛋白質(zhì)標(biāo)簽”指的是化學(xué)部分，可以是核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或者氨基酸、肽或者蛋白質(zhì)或者其他化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)這些物質(zhì)加入到另一個(gè)序列中，則提供了額外的用處或者使序列具有了有用的性質(zhì)，特別是關(guān)于檢測(cè)或者分離該序列的方法的有用性質(zhì)。因此，例如可以將與捕獲寡核苷酸互補(bǔ)的同聚核酸序列或者核酸序列加到引物或者探針序列上，促進(jìn)接下來(lái)對(duì)延伸產(chǎn)物或者雜交產(chǎn)物的分離。如果是蛋白質(zhì)標(biāo)簽，可以將組氨酸殘基(例如4-8個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基)加在蛋白質(zhì)的氨基或者羧基端，通過(guò)金屬螯合層析促進(jìn)蛋白質(zhì)的分離。或者將代表與特異抗體分子或其他分子有反應(yīng)性的表位或結(jié)合決定簇的氨基酸序列、肽、蛋白質(zhì)或融合伴侶(例如flag表位、c-myc表位、流感A病毒血凝素蛋白跨膜表位、蛋白A、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等等)加到蛋白質(zhì)之上，促進(jìn)蛋白質(zhì)通過(guò)親和或者免疫親和層析的步驟被分離?；瘜W(xué)標(biāo)簽分子包括如生物素的分子，它們可以加在核酸或者蛋白質(zhì)上，有助于通過(guò)與抗生物素蛋白試劑等等的相互作用對(duì)核酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和檢測(cè)。受過(guò)訓(xùn)練的技術(shù)人員知道并且可以設(shè)想出許多其他的標(biāo)簽分子，它們也被認(rèn)為是這一定義范疇內(nèi)的。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)導(dǎo)”所指的是核酸引入到細(xì)胞或者宿主生物體中的方法或者手段，可以交換使用表達(dá)相同的含義。這些方法包括，但是不止限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、PEG融合等等。被引入的核酸可以整合(共價(jià)連接)或者不整合到受體細(xì)胞或者生物體的核酸中。例如在細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，引入的核酸可以作為附加體元件或者獨(dú)立復(fù)制子如質(zhì)粒的形式維持?；蛘弑灰氲暮怂峥梢哉系绞荏w細(xì)胞或者生物體的核酸中，穩(wěn)定地維持在那個(gè)細(xì)胞或者生物體中，進(jìn)一步傳遞或者遺傳到受體細(xì)胞或生物體的子代細(xì)胞或生物體中。在其他應(yīng)用中，引入的核酸在受體細(xì)胞或者宿主生物體中可能僅僅短暫存在?！翱寺　被蛘摺翱寺〖?xì)胞群”是一群從單一細(xì)胞或者共同祖先通過(guò)有絲分裂形成的細(xì)胞?！凹?xì)胞系”是能夠在體外穩(wěn)定生長(zhǎng)多代的原代細(xì)胞或細(xì)胞群的克隆。含有本發(fā)明的分子或者化合物的組合物可以進(jìn)行給藥，用于預(yù)防和/或治療性治療。在一個(gè)治療性應(yīng)用中，例如，將組合物施用給已經(jīng)患有過(guò)度增生性疾病(例如癌癥)的患者，施用的量足以治愈或者至少部分停止疾病及其并發(fā)癥的癥狀。足以完成這一目的的量被確定為“治療上有效的量或者劑量”。對(duì)于這一用途有效的量取決于疾病的嚴(yán)重性以及患者的體重和一般狀況。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”指的是由于細(xì)胞不可控制的持續(xù)增殖導(dǎo)致的組織的異常生長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療的癌癥的示例包括，但不止限于，肉瘤，母細(xì)胞瘤和癌例如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內(nèi)皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內(nèi)皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌，腦膜癌病(最常見與擴(kuò)散的乳腺或者肺癌相伴)，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，基底細(xì)胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，髓樣癌，肺癌，腎細(xì)胞癌，肝癌，肝癌轉(zhuǎn)移，膽管癌，絨毛膜癌，精原細(xì)胞瘤，胚胎性癌，甲狀腺癌例如未分化甲狀腺癌，腎母細(xì)胞瘤，宮頸癌，睪丸癌，肺癌例如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，膀胱癌，上皮細(xì)胞癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星型細(xì)胞瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細(xì)胞瘤，聽神經(jīng)瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，腦脊膜瘤，黑色素瘤，母細(xì)胞胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療的血液惡性腫瘤的示例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多發(fā)性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤(NHL)，何杰金疾病和淋巴瘤(HD)，幼淋巴細(xì)胞白血病(PLL)，和骨髓增生異常綜合征(MDS)?！懊庖邞?yīng)答”表示的是任何抗原例如蛋白質(zhì)抗原在具有正常功能免疫系統(tǒng)的宿主中產(chǎn)生的反應(yīng)。免疫應(yīng)答可以是體液的，涉及免疫球蛋白或者抗體的產(chǎn)生，或者是細(xì)胞的，涉及多種不同類型的B和T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞等等，或者既有體液免疫又有細(xì)胞免疫。免疫應(yīng)答還可能涉及多種不同的效應(yīng)分子的產(chǎn)生和修飾，例如細(xì)胞因子、淋巴因子等。免疫應(yīng)答可以在體外以及在各種不同的細(xì)胞或者動(dòng)物系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)量?！翱贵w”或者“抗體分子”是任何與特異抗原結(jié)合的免疫球蛋白，包括抗體和抗體片段。該術(shù)語(yǔ)包括了多克隆、單克隆、嵌合以及雙特異性抗體。正如這里所使用的，抗體或抗體分子涉及完整無(wú)缺的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分例如那些在本領(lǐng)域內(nèi)已知的部分，如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2和F(v)。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞底物”指的是細(xì)胞內(nèi)的分子，它是酶或者相關(guān)酶家族的酶促靶標(biāo)。就mRNA干擾酶而言，“細(xì)胞底物”包括了細(xì)胞內(nèi)由內(nèi)源或者外源核酸序列表達(dá)的多聚核糖核苷酸。正如這里所使用的，短語(yǔ)“在促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下”包括了細(xì)胞內(nèi)(在細(xì)胞培養(yǎng)中或者在體內(nèi))或者體外(在試管中或者其他類似的容器中)的任何條件，其中本發(fā)明的mRNA干擾酶表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。這些條件在這里提出的實(shí)施例中有所描述。類似地，“與mRNA干擾酶相容的緩沖劑”是一種緩沖劑，本發(fā)明的mRNA干擾酶在其中表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。正如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“mRNA干擾酶調(diào)節(jié)劑”指的是一種能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶的核糖核酸內(nèi)切酶活性(例如提高或者降低)的因子。篩選或者鑒別這種因子的方法在以下提出。示例性的內(nèi)源mRNA干擾酶調(diào)節(jié)劑包括MazE(抑制MazF的活性)以及PemI(抑制PemK的活性)。這里也描述了MazE和PemI的功能性片段，它們能夠分別抑制MazF和PemK的活性。除非另有定義，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)一個(gè)具有普通技術(shù)的人員通常理解的含義相同。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或者試驗(yàn)中可以使用任何與這里描述的相似或者相同的方法和材料，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。這里提到的所有出版物在這里被引用，以公開和描述被引用的出版物與其有關(guān)的方法和材料。I.編碼mRNA干擾酶的核酸分子以及mRNA干擾酶的制備核酸分子可以通過(guò)兩種一般的方法制備編碼本發(fā)明核糖核酸內(nèi)切酶(例如MazF或PemK)的核酸分子(1)從適當(dāng)?shù)暮塑账崛姿岷铣?；或?2)從生物來(lái)源中分離，兩種方法使用的試驗(yàn)方案是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。核苷酸序列信息，例如SEQ ID NO1或者3的全長(zhǎng)cDNA(見圖20A和31A)，使得通過(guò)寡核苷酸合成制備本發(fā)明的分離核酸分子成為可能。合成的寡核苷酸可以通過(guò)亞磷酰胺方法制備，使用Applied Biosystems 380A DNA合成儀或者類似的裝置。產(chǎn)生的構(gòu)建體可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法例如高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行純化。由于目前的寡核苷酸合成方法中固有的大小限制，長(zhǎng)的雙鏈多核苷酸，例如本發(fā)明的DNA分子，必須分步合成。然后，通過(guò)這種方法構(gòu)建的合成DNA分子可以被克隆并擴(kuò)增到適當(dāng)?shù)妮d體中。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，可以從適當(dāng)?shù)纳飦?lái)源中分離編碼mRNA干擾酶的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從一個(gè)細(xì)菌來(lái)源的cDNA表達(dá)文庫(kù)中分離出cDNA克隆。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用該cDNA序列提供的序列信息，可以分離出編碼mRNA干擾酶的基因組克隆。或者，可以使用mRNA干擾酶基因內(nèi)部預(yù)先確定的序列對(duì)應(yīng)的寡核苷酸探針，從其他物種中分離出與mRNA干擾酶具有同源性的cDNA或者基因組克隆。根據(jù)本發(fā)明，可以使用適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交以及漂洗條件，鑒定出與SEQ ID NO1或3的蛋白編碼區(qū)域具有適當(dāng)同源性水平的核酸。例如，可以使用包含下列的雜交溶液進(jìn)行雜交5XSSC，5XDenhardt′s試劑，0.5-1.0％SDS，100微克/毫升變性的片段化的鮭精DNA，0.05％焦磷酸鈉以及至多50％的甲酰胺。一般在37-42攝氏度進(jìn)行雜交，至少6小時(shí)。雜交之后，按照下面的步驟漂洗濾膜(1)2XSSC，0.5-1％SDS中室溫下漂洗5分鐘；(2)在2XSSC，0.1％SDS中室溫下漂洗15分鐘；(3)在1XSSC，1％SDS中37攝氏度下漂洗30分鐘到1小時(shí)；(4)在1XSSC，1％SDS中42-65攝氏度下漂洗2小時(shí)，每30分鐘更換一次溶液。
一個(gè)計(jì)算在兩個(gè)具有特定序列同源性的核酸分子之間雜交所需的嚴(yán)謹(jǐn)性條件的通用公式(Sambrook et al.，1989)是Tm＝81.5℃16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/雙鏈中的堿基對(duì)數(shù)目。
為了說(shuō)明以上公式，使用[Na+]＝
和50％的甲酰胺，GC含量是42％，平均的探針大小是200bp，則Tm是57攝氏度。同源性每降低1％，DNA雙鏈的Tm降低1-1.5攝氏度。這樣，使用42攝氏度的雜交溫度可以觀察到具有大于約75％序列一致性的靶標(biāo)。這樣的一個(gè)序列被認(rèn)為與本發(fā)明的核酸序列具有顯著的同源性。
從上可以看出，雜交和漂洗的嚴(yán)謹(jǐn)性主要取決于溶液的鹽濃度和溫度。一般地，為了使兩個(gè)核酸分子的退火比率最大化，通常在計(jì)算出來(lái)的雜合分子的Tm值以下20-25攝氏度下進(jìn)行雜交。對(duì)于探針同靶標(biāo)一致性的程度而言，漂洗條件應(yīng)該盡可能的嚴(yán)謹(jǐn)。一般地，漂洗條件應(yīng)該選擇低于雜合分子Tm大約12-20攝氏度。就本發(fā)明的核酸而言，中度的嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件確定為6XSSC，5XDenhardt′s溶液，0.5％SDS，100微克/毫升變性的鮭精DNA，42攝氏度下雜交。漂洗條件是2XSSC，0.5％SDS，55攝氏度15分鐘。高度的嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件確定為6XSSC，5XDenhardt′s溶液，0.5％SDS，100微克/毫升變性的鮭精DNA，42攝氏度。漂洗條件是1XSSC，0.5％SDS，65攝氏度15分鐘。非常高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件確定為6XSSC，5XDenhardt′s溶液，0.5％SDS，100微克/毫升變性的鮭精DNA，42攝氏度。漂洗條件是0.1XSSC，0.5％SDS，65攝氏度15分鐘。
本發(fā)明的核酸可以作為DNA，在任何方便的克隆載體中保存。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，克隆在質(zhì)?？寺?表達(dá)載體中保存，例如在pBluescript(Stratagene，La Jolla，Calif.)中，其可以在適宜的大腸桿菌宿主細(xì)胞中增殖。本發(fā)明中編碼mRNA干擾酶基因的基因組克隆可以在lambda噬菌體FIX II(Stratagene)中保存。
本發(fā)明中編碼mRNA干擾酶的核酸分子包括cDNA、基因組DNA、RNA及其片段，它們可以是單鏈或者雙鏈的。這樣，本發(fā)明提供了寡核苷酸(DNA的有義或者無(wú)義鏈或者RNA)，它們具有的序列能夠與至少一個(gè)本發(fā)明的核酸分子序列(例如SEQ ID NO1或者3的cDNA中選出的片段)進(jìn)行雜交。這種寡核苷酸在檢測(cè)或分離mRNA干擾酶基因的探針時(shí)是有用的。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在細(xì)菌的群體和/或物種中存在這些序列的變異體(例如等位變異體)，而且在設(shè)計(jì)和/或使用本發(fā)明的寡核苷酸時(shí)必須考慮到變異體。因此，本發(fā)明的范疇也包括了這樣的變異體，涉及這里公開的mRNA干擾酶序列或者靶向于各自基因或RNA轉(zhuǎn)錄本上特定位置的寡核苷酸。就這種變異體的包括而言，這里使用術(shù)語(yǔ)“天然的等位變異體”，指在一個(gè)給定的DNA群體中可能出現(xiàn)的多種不同的特異核苷酸序列及其變異體。在被編碼的蛋白中引起保守或者中性氨基酸替代的遺傳多態(tài)性是這種變異體的實(shí)例。
此外，術(shù)語(yǔ)“基本互補(bǔ)的”指的是與靶序列不完全匹配的寡核苷酸，但是這些錯(cuò)配沒(méi)有在實(shí)質(zhì)上影響該寡核苷酸在描述的條件下與其靶序列雜交的能力。
這樣，編碼序列可能是在例如SEQ ID NO1或3中顯示的或者可能是這兩個(gè)序列中一個(gè)的突變體、變異體、衍生物或者等位基因。該序列可能與所示的序列有所不同，區(qū)別在于所示序列的一個(gè)或者更多的核苷酸出現(xiàn)一個(gè)或者更多的添加、插入、刪除以及替代。核苷酸序列的改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平上由遺傳密碼確定的氨基酸的改變或者不變。
因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸可能包括與SEQ ID NO1或3所示的序列不同的序列，但是它編碼的多肽與SEQ ID NO1或3編碼的多肽具有相同的氨基酸序列。
另一方面，編碼的多肽包含的氨基酸序列可能與SEQ ID NO2或者4所示的氨基酸序列有一個(gè)或者更多氨基酸殘基的差異。參見圖20B和31B。本發(fā)明還提供了編碼多肽的核酸序列，所述多肽是SEQ ID NO2或者4所示氨基酸序列的突變體、變異體、衍生物或者等位基因。編碼這種多肽的核酸與SEQ ID NO1或3所示的編碼序列可能有大于60％的一致性，大于約70％的一致性，大于約80％的一致性，大于約90％的一致性或者大于約95％的一致性。
本發(fā)明提供了獲得目標(biāo)核酸的方法，該方法包括將具有部分或者全部SEQ ID NO1或3所示序列或者其互補(bǔ)序列的探針與靶核酸雜交。成功的雜交可以使與探針雜交上的核酸被分離出來(lái)，這可能涉及一個(gè)或者更多的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增步驟。
這種寡核苷酸探針或者引物，以及全長(zhǎng)的序列(以及突變體、等位基因、變異體和衍生物)在篩選含有核酸的檢測(cè)樣品中是否存在mRNA干擾酶的等位基因、突變體或者變異體時(shí)是有用的，探針與從待測(cè)的細(xì)胞、組織或者生物體獲得的樣品中的靶序列雜交?？梢钥刂齐s交的條件，使非特異結(jié)合最小化。優(yōu)選地使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)街卸葒?yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。在教科書例如Sambrook et al(1989)和Ausubel et al(1992)的幫助下，技術(shù)人員能夠容易地設(shè)計(jì)這種探針、標(biāo)記它們并且設(shè)計(jì)適宜的雜交反應(yīng)條件。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸(是SEQ ID NO1或3所示序列的片段或者任何與核糖核酸內(nèi)切酶活性相關(guān)的等位基因)，其長(zhǎng)度至少大約10個(gè)核苷酸，更為優(yōu)選至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更為優(yōu)選至少大約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)。這些片段各自代表了本發(fā)明的方面。片段和其他寡核苷酸可以用作所討論的引物或者探針，但是也可以通過(guò)與確定檢測(cè)樣品中是否存在編碼mRNA干擾酶的同源物或者直向同源物序列有關(guān)的方法產(chǎn)生(例如通過(guò)PCR)。
B.蛋白質(zhì)MazF是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)以高度特異性在特異的核酸序列(即ACA)處切割RNA的核酸酶。PemK是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)以高度特異性在特異的核酸序列(即UAX，其中X是C、A或U)處切割RNA的核酸酶。本發(fā)明的全長(zhǎng)mRNA干擾酶蛋白(例如MazF或者PemK)可以根據(jù)已知的方法，以多種不同方式制備。蛋白質(zhì)可以從適當(dāng)?shù)膩?lái)源中純化。但這不是一個(gè)優(yōu)選的方法，原因是在任何時(shí)刻一個(gè)給定的細(xì)胞中存在的蛋白量可能很少。編碼MazF和PemK的核酸分子的可獲得性使得用本領(lǐng)域內(nèi)已知的體外表達(dá)方法生產(chǎn)這兩個(gè)蛋白成為可能。例如可以將cDNA或者基因克隆到適當(dāng)?shù)捏w外轉(zhuǎn)錄載體例如pSP64或者pSP65中，用于體外轉(zhuǎn)錄，之后在適宜的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(例如小麥胚芽或者兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物)中進(jìn)行無(wú)細(xì)胞翻譯。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)是商品化的，可以從例如Promega Biotech，Madison，Wis.或者BRL，Rockville，Md獲得。
或者，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，可以通過(guò)在適宜的原核或者真核系統(tǒng)中表達(dá)生產(chǎn)大量的mRNA干擾酶。例如，DNA分子的部分或者全部，例如SEQ ID NO1或3的cDNA，可以插入到適合于在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒載體中。這種載體包含DNA在宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)中表達(dá)所需的調(diào)控元件，調(diào)控元件的位置允許DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)。這種表達(dá)所需的調(diào)控元件包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列以及可選擇地，增強(qiáng)子序列。
在重組原核或者真核系統(tǒng)中基因表達(dá)產(chǎn)生的mRNA干擾酶可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法進(jìn)行純化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用商品化的表達(dá)/分泌系統(tǒng)，通過(guò)它重組蛋白表達(dá)之后從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)，容易地從周圍的培養(yǎng)基中純化出來(lái)。如果不使用表達(dá)/分泌載體，另外一種方式涉及用親和分離純化重組蛋白，例如與特異結(jié)合重組蛋白的抗體發(fā)生免疫相互作用或者用鎳層析柱，用于分離在N端或者C端添加6-8個(gè)組氨酸的標(biāo)簽的重組蛋白。其他的標(biāo)簽可能包括FLAG表位或者血凝素表位。這些方法是技術(shù)人員通常使用的。
通過(guò)以上提到的方法制備的本發(fā)明的mRNA干擾酶，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的步驟進(jìn)行分析。例如，可以根據(jù)已知的方法，對(duì)這些蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析。
本發(fā)明還提供了是氨基酸序列變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽。屬于變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽可能具有與SEQ ID NO2給出的序列不同的序列，有一個(gè)或者更多氨基酸的一個(gè)或多個(gè)添加、替換、刪除以及插入。優(yōu)選的這些多肽具有MazF的功能，即具有一個(gè)或者更多以下性質(zhì)在RNA中切割A(yù)CA序列的能力；與抗體的交叉反應(yīng)性，該抗體與具有SEQ ID NO2序列的多肽具有反應(yīng)性；與SEQ ID NO2給出的序列所示的多肽具有共同表位(根據(jù)例如兩個(gè)多肽之間的免疫交叉反應(yīng)確定)?；蛘邔儆谧儺愺w、等位基因、衍生物或者突變體的多肽可能具有與SEQ ID NO4給出的序列不同的氨基酸序列，有一個(gè)或者更多氨基酸的一個(gè)或多個(gè)添加、替換、刪除以及插入。優(yōu)選的這些多肽具有PemK的功能，即具有一個(gè)或者更多以下性質(zhì)在RNA中切割UAX序列(其中X是C、A或者U)的能力；與抗體的交叉反應(yīng)性，該抗體與具有SEQ ID NO4序列的多肽具有反應(yīng)性；與SEQ ID NO4給出的序列所示的多肽具有共同表位(根據(jù)例如兩個(gè)多肽之間的免疫交叉反應(yīng)確定)。屬于SEQ ID NO2或者4所示氨基酸序列的氨基酸序列變異體、等位基因、衍生物或者突變體的多肽可能包含的氨基酸序列與所示的序列有大約35％以上的序列一致性、大約40％以上的一致性、大約50％以上的一致性、大約60％以上的一致性、大約70％以上的一致性、大約80％以上的一致性、大約90％以上的一致性或者大約95％以上的一致性。特定的氨基酸序列變異體與SEQ ID NO2或者4所示的序列之間，通過(guò)插入、添加、替換或者刪除1個(gè)氨基酸、2，3，4，5-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-100，100-150，或者150個(gè)以上的氨基酸而可能有差異。氨基酸的“同源性”可以被理解為一致性或者相似性(根據(jù)確定的氨基酸相似性原則，例如，使用算法GAP(GeneticsComputer Group，Madison，Wis.)確定的相似性原則)。GAP使用Needleman和Wunsch算法比對(duì)兩個(gè)完整序列，使匹配的數(shù)目最大化，使缺口數(shù)目最小化。一般地，使用缺省參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分＝12以及缺口延伸罰分＝4。使用GAP可能是優(yōu)選的但是也可以使用其他算法，包括，但不止限于，BLAST(Altschul et al.(1990 J.Mol.Biol.215405-410)；FASTA(Pearson and Lipman(1998)PNAS USA852444-2448)或者Smith Waterman算法(Smith and Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)，一般使用缺省參數(shù)。在這里使用術(shù)語(yǔ)“同源性”或者“同源的”并不意味著所比較的兩個(gè)序列之間有任何必然的進(jìn)化關(guān)系。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)的使用與短語(yǔ)“同源重組”的使用類似，即術(shù)語(yǔ)僅僅要求兩個(gè)核苷酸序列充分相似，以在適當(dāng)?shù)臈l件下重組。
根據(jù)本發(fā)明的多肽可以用于篩選影響或者調(diào)節(jié)其活性或功能的分子。這些分子可以用于研究目的。
本發(fā)明還提供了能夠免疫特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體。針對(duì)mRNA干擾酶(例如MazF或者PemK)的多克隆抗體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備了單克隆抗體，它們與mRNA干擾酶的各種不同的表位發(fā)生免疫特異反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)Kohler和Milstein的一般方法，使用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案制備單克隆抗體。與mRNA干擾酶發(fā)生免疫特異反應(yīng)的多克隆或者單克隆抗體可以用于鑒定和純化這些蛋白質(zhì)。例如，抗體可以用于親和分離與其發(fā)生免疫特異相互作用的蛋白質(zhì)。還可以使用抗體從含有蛋白質(zhì)和其他生物分子混合物的樣品中將蛋白質(zhì)免疫沉淀出來(lái)。以下描述了抗mRNA干擾酶的抗體的其他用途。
根據(jù)本發(fā)明的抗體可以通過(guò)多種方式進(jìn)行修飾。的確術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)當(dāng)被理解為任何具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合性物質(zhì)。因此，本發(fā)明包括了抗體片段、抗體的衍生物、功能性等價(jià)物以及同源物，包括合成的分子和形狀模擬了抗體使其能夠結(jié)合抗原或者表位的分子。
示例性的能夠結(jié)合抗原或者其他結(jié)合伴侶的抗體片段有由VL，VH，C1和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體一個(gè)單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段；分離的CDR區(qū)域以及F(ab′)2片段，它是包括了兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段，這兩個(gè)Fab片段在鉸鏈區(qū)由一個(gè)二硫橋連接。還包括了單鏈的Fv片段。
II編碼mRNA干擾酶的核酸、mRNA干擾酶及其抗體的使用例如MazF和PemK是RNA核酸內(nèi)切酶，可以用于降低或者抑制細(xì)胞、組織或者生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成。而且，本發(fā)明的mRNA干擾酶可以特異地靶向于受試對(duì)象的特定組織，以特異降低或者抑制在靶向組織中的蛋白質(zhì)合成。對(duì)于一些應(yīng)用，有利的是靶向特異的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用于MazF的核酸內(nèi)切酶切割。這種序列可能包含升高頻率的ACA序列，因此是MazF活性的天然優(yōu)選靶標(biāo)?；蛘呖梢酝ㄟ^(guò)改變MazF多肽使其特異地或者優(yōu)先結(jié)合和/或切割用于切割的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而靶向RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于MazF的切割?；蛘?，可能有利的是靶向特異的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PemK的核酸內(nèi)切酶切割。這種序列可能包含升高頻率的UAX序列(其中X是C、A或者U)，因此是PemK活性的天然優(yōu)選靶標(biāo)。或者可以通過(guò)改變PemK多肽使其特異地或者優(yōu)先結(jié)合和/或切割用于切割的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而靶向RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PemK的切割。特別地，mRNA干擾酶分子(例如MazF和PemK)以及本發(fā)明的組合物可以有利地用于治療具有過(guò)度增生性疾病的患者。這些疾病包括，但不止限于，不同組織的發(fā)育異常和組織變形、炎性病癥、自體免疫疾病、過(guò)度增生性皮膚疾病、牛皮癬、過(guò)敏/哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形手術(shù)后的再狹窄以及癌癥。mRNA干擾酶分子(例如MazF和PemK)以及本發(fā)明的組合物可以有利地用于治療具有細(xì)菌感染的患者。此外，根據(jù)本發(fā)明的mRNA干擾酶核酸、蛋白質(zhì)及其抗體，可以用作研究工具，鑒定其他密切參與RNA識(shí)別和切割反應(yīng)的蛋白質(zhì)。A.編碼mRNA干擾酶的核酸編碼MazF和PemK的核酸可以用于根據(jù)本發(fā)明的各種不同的目的。編碼MazF和PemK的DNA、RNA或者其片段可以用作探針，以檢測(cè)編碼類MazF以及類PemK蛋白質(zhì)的基因的存在和/或表達(dá)。編碼MazF和PemK的核酸可以用于這種檢測(cè)的探針的方法包括，但是不止限于，(1)原位雜交；(2)Southern雜交；(3)northern雜交；以及(4)各種擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR。本發(fā)明的編碼mRNA干擾酶的核酸還可以用作探針，鑒定來(lái)自其他細(xì)菌、植物或者動(dòng)物物種的相關(guān)基因。本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的是，可以調(diào)整雜交嚴(yán)謹(jǐn)性，使核酸探針與具有不同程度同源性的互補(bǔ)序列之間發(fā)生雜交。因此，編碼MazF和PemK的核酸可以用于鑒定和表征其他與MazF和/或PemK有不同程度相關(guān)性的基因，這樣使得進(jìn)一步表征RNA降解系統(tǒng)的性質(zhì)成為可能。此外，它們可以用于鑒定編碼與MazF和/或PemK相互作用的蛋白質(zhì)的基因(例如通過(guò)“相互作用陷阱”技術(shù))，這應(yīng)該會(huì)進(jìn)一步加快對(duì)參與RNA切割的組分的鑒定。編碼MazF或者PemK的核酸分子或者其片段還可以用于控制MazF或者PemK的生產(chǎn)，這樣調(diào)控參與RNA切割反應(yīng)的蛋白質(zhì)的量。生理量的MazF或者PemK蛋白的改變可能顯著影響參與RNA切割的其他蛋白質(zhì)因子的活性。B.mRNA干擾酶及其抗體通過(guò)編碼本發(fā)明MazF或者PemK的核酸的表達(dá)制備的純化mRNA干擾酶，例如分離的MazF或者PemK蛋白，或者其片段，可以用于制備多克隆或者單克隆抗體，所述抗體可以在檢查細(xì)菌細(xì)胞中MazF(或者含有MazF的復(fù)合物)或者PemK(或者含有PemK的復(fù)合物)的存在和累積時(shí)作為敏感的檢測(cè)試劑。重組技術(shù)使得表達(dá)含有部分或者全部MazF或者PemK蛋白質(zhì)的融合蛋白成為可能。全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段可以用于產(chǎn)生一系列對(duì)于蛋白質(zhì)表位特異的單克隆抗體，這樣就在檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí)提供了更高的敏感性。對(duì)于mRNA干擾酶(例如MazF或者PemK)免疫特異的多克隆或者單克隆抗體可以用于多種不同的檢測(cè)中，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和定量。這些檢測(cè)包括，但是不止限于(1)流式細(xì)胞儀分析；(2)在例如細(xì)菌細(xì)胞中mRNA干擾酶的免疫化學(xué)定位；以及(3)各種細(xì)胞的提取物的免疫印跡分析(例如，點(diǎn)印跡、Western印跡)。此外，如上面所描述，例如抗MazF和抗PemK抗體可以用于純化MazF及其直向同源物或者PemK及其直向同源物(例如親和柱純化、免疫沉淀)。mRNA干擾酶，例如MazF或者PemK蛋白，還可以用于降低或者抑制細(xì)胞、組織或者生物體中蛋白質(zhì)的合成，如上面所討論的。從前面的討論中，可以看出本發(fā)明中編碼mRNA干擾酶的核酸、表達(dá)mRNA干擾酶的表達(dá)載體以及抗mRNA干擾酶的抗體，可以用于制備大量的mRNA干擾酶、檢測(cè)mRNA干擾酶的基因表達(dá)以及改變mRNA干擾酶的積累，目的是確定參與RNA切割的遺傳和蛋白質(zhì)相互作用。本發(fā)明的發(fā)明者令人驚奇的發(fā)現(xiàn)來(lái)自細(xì)菌的穩(wěn)定毒素MazF是一種核糖核酸內(nèi)切酶。正如這里所描述的，MazF被作為稱作“RNA干擾酶”的新型酶家族的第一個(gè)成員。而且，MazF是這個(gè)新型“RNA干擾酶”家族的示例。重要的是，在本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)之前，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MazF的細(xì)胞靶標(biāo)。如這里所顯示的，MazF的作用是高度序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，它們?cè)贏CA位點(diǎn)處切割細(xì)胞的mRNA。這種活性可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生部分或者全部的抑制。依據(jù)四種核苷酸中的任何一種摻入到三個(gè)核苷酸位置的每一個(gè)位置的可能性是相同的原理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算，ACA序列出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的預(yù)測(cè)頻率是1/64。應(yīng)當(dāng)理解，與預(yù)測(cè)頻率比較，一些RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含較低或者較高頻率的ACA序列。因此，特異RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物家族被MazF核糖核酸內(nèi)切酶切割的敏感性取決于ACA序列或者M(jìn)azF靶序列在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的頻率。而且，本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員能夠根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)于MazF介導(dǎo)的切割的敏感性。本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)PemK是這里被稱為“RNA干擾酶”的新型酶家族的一個(gè)成員。如這里所顯示的，PemK的作用是高度序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，它們?cè)赨AX位點(diǎn)處切割細(xì)胞的mRNA，其中X是C、A或U。這種活性可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生部分或者全部的抑制。依據(jù)四種核苷酸中的任何一種摻入到三個(gè)核苷酸位置的每一個(gè)位置的可能性是相同的原理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算，UAX序列(其中X是C、A或U)出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的預(yù)測(cè)頻率是3/64。應(yīng)當(dāng)理解，與預(yù)測(cè)頻率比較，一些RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含較低或者較高頻率的UAX序列。因此，特異RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物家族被PemK核糖核酸內(nèi)切酶切割的敏感性取決于UAX序列(其中X是C、A或者U)或者PemK靶序列在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的頻率。而且，本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員能夠根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)于PemK介導(dǎo)的切割的敏感性。因此本發(fā)明發(fā)明者的新發(fā)現(xiàn)提出了mRNA干擾酶(例如MazF和PemK)的核酸和氨基酸序列及其組合物新的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括，但是不止限于，如這里描述的各種不同的研究和治療性應(yīng)用。還提供了包含MazF和PemK核酸和/或氨基酸序列、MazF和/或PemK活性相容緩沖劑以及用法說(shuō)明材料的試劑盒。III.編碼mRNA干擾酶抑制劑的核酸分子以及mRNA干擾酶抑制劑蛋白質(zhì)的制備編碼MazE和PemI的核酸分子以及MazE和PemI多肽、及其功能性片段基本上按照上面描述的制備編碼MazF和PemK的核酸分子以及MazF和PemK多肽的方法產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼MazE蛋白質(zhì)、包含SEQ ID NO5的核酸序列。參見圖21A。還提供了包含SEQ ID NO6的氨基酸序列及其功能性片段。參見圖21B。相應(yīng)地提供了編碼PemI蛋白、包含SEQ ID NO7的核酸序列。參見圖32A。還提供了包含SEQID NO8的氨基酸序列及其功能性片段。參見圖32B。IV.編碼mRNA干擾酶抑制劑的核酸以及mRNA干擾酶抑制劑蛋白質(zhì)的使用本發(fā)明包括了SEQ ID NO5編碼的MazE多肽、編碼包含SEQ ID NO6的MazE多肽的核酸序列及其功能性片段，以及包含SEQID NO6的MazE多肽及其功能性片段。正如這里描述的，MazE多肽及其功能性片段表現(xiàn)出調(diào)節(jié)MazF活性的能力。參見實(shí)施例III和下面的總結(jié)。簡(jiǎn)而言之，正如這里所表明的，純化的(His)6MazE與mazEF啟動(dòng)子DNA的結(jié)合被MazF增強(qiáng)。在MazE N端區(qū)域的保守氨基酸殘基定點(diǎn)突變(K7A，R8A，S12A和R16A)破壞了(His)6MazE和MazE-MazF(His)6復(fù)合物的DNA結(jié)合能力，提示MazE通過(guò)N端結(jié)構(gòu)域與mazEF啟動(dòng)子DNA結(jié)合。在溶液中，MazE-MazF(His)6復(fù)合物中，MazE和MazF(His)6的比例是大約1∶2。由于MazE和MazF(His)6均以同二聚體形式存在，所以預(yù)測(cè)MazE-MazF(His)6復(fù)合物(76.9kDa)是由一個(gè)MazE二聚體和兩個(gè)MazF(His)6二聚體組成的。還使用酵母雙雜交系統(tǒng)研究了MazE和MazF之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)MazE的殘基38到75區(qū)域?qū)τ谂cMazF的結(jié)合是必需的。該區(qū)域的定點(diǎn)誘變顯示Leu55和Leu58在MazE-MazF復(fù)合物的形成中，而不是在MazE與mazEF啟動(dòng)子DNA的結(jié)合中起重要作用?，F(xiàn)在的結(jié)果證明MazE由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域即一個(gè)N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端MazF相互作用結(jié)構(gòu)域組成。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MazE多肽和MazE功能性片段抑制了MazF的活性。在一個(gè)特殊方面中，本發(fā)明的MazE多肽或MazE功能性片段抑制了MazF核糖核酸內(nèi)切酶的活性或者使核糖核酸內(nèi)切酶的活性降低。的確，MazE及其功能性片段是本發(fā)明首先研究的分子，這里證明其能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的降低，因而實(shí)現(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶底物切割的下降。示例性的能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶底物切割下降的MazE功能性片段包括，但是止限于，C端MazF相互作用結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，C端MazF相互作用結(jié)構(gòu)域包含MazE的38-75號(hào)殘基區(qū)域。正如這里描述的，在這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵殘基包括Leu55和Leu58。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C端MazF相互作用結(jié)構(gòu)域包含MazE分子的Hp-Box以及其中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵殘基。在本發(fā)明的一個(gè)特定方面，MazE的兩個(gè)C端肽可以通過(guò)化學(xué)合成，一個(gè)肽是T54-K77(24個(gè)氨基酸殘基；TLAELVNDITPENLHENIDWGEPK；SEQ ID NO9)，另一個(gè)是N60-K77(18個(gè)氨基酸殘基；NDITPENLHENIDWGEPK；SEQ ID NO10)。根據(jù)MazE-MazF復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)，這些多肽預(yù)計(jì)與MazF二聚體形成穩(wěn)定的抑制復(fù)合物。前一個(gè)肽含有螺旋2以及C端的酸性尾巴，后一個(gè)肽沒(méi)有螺旋2。使用合成的30堿基RNA(5′-UAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAUCAAAUC-3′；SEQ ID NO11)作為底物，檢查這些肽抑制MazF mRNA干擾酶活性的能力。使用完好的MazE作為對(duì)照，比較它們的抑制活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MazE多肽和MazE功能性片段增加或者提高M(jìn)azF的活性。在一個(gè)特殊的方面，本發(fā)明的MazE多肽或MazE功能性片段提高M(jìn)azF核糖核酸內(nèi)切酶的活性或者實(shí)現(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的升高。的確，MazE多肽突變體及其功能性片段是第一個(gè)本發(fā)明表征出能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶活性增加并且實(shí)現(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶底物切割增加的分子。示例性的能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶底物切割增加的MazE多肽包括，但是不止限于，在C端MazF相互作用結(jié)構(gòu)域、MazE 38到75號(hào)殘基、Hp-Box或者Leu55或Leu68(或者其同源位置)包含突變的MazE多肽，其中這樣的突變降低或者抑制了MazE結(jié)合MazF的能力。示例性的能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶底物切割提高的MazE片段包括，但是不止限于，包含突變的MazE片段，所述突變降低或者抑制了MazE片段結(jié)合MazF的能力。這些包含這種突變的MazE片段包括，但是不止限于，C端MazF相互作用結(jié)構(gòu)域或MazE的38-75號(hào)殘基區(qū)域。已知降低或者抑制MazE片段結(jié)合MazF能力的示例性的殘基突變包括在Leu55和Leu58的突變。這種MazE突變體多肽和片段在這里可以被稱為具有顯性失活活性。一般地，顯性失活多肽用于降低或者抑制相應(yīng)的野生型多肽的活性，因?yàn)樗鼈內(nèi)匀荒軌蚪Y(jié)合并因此競(jìng)爭(zhēng)底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到了部分削弱。本發(fā)明還包含了SEQ ID NO7編碼的PemI多肽、編碼包含SEQ ID NO8的PemI多肽的核酸序列以及它們的功能性片段，以及包含SEQ ID NO8的PemI多肽及其功能性片段。正如這里所描述的，PemI多肽及其功能性片段顯示了調(diào)節(jié)PemK活性的能力。能夠調(diào)節(jié)PemI活性以及PemK活性的示例性的PemI功能性片段包括N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及C端PemK相互作用結(jié)構(gòu)域。參見這里下面的實(shí)施例IV。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PemI多肽和PemI功能性片段抑制了PemK的活性。在一個(gè)特別的方面，本發(fā)明的PemI多肽或者PemI功能性片段抑制了PemK核糖核酸內(nèi)切酶活性或者實(shí)現(xiàn)了核糖核酸內(nèi)切酶活性的降低。的確，PemI及其功能性片段是本發(fā)明首先研究的分子，這里表明其能夠?qū)崿F(xiàn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的降低，因而實(shí)現(xiàn)了核糖核酸內(nèi)切酶底物切割的降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，涉及了能夠抑制PemI活性的突變形式的PemI多肽或者其衍生物或者其片段。這種PemI突變體多肽以及片段可以在這里被稱為具有顯性失活活性。一般地，顯性失活多肽用于降低或者抑制相應(yīng)的野生型多肽的活性，因?yàn)樗鼈內(nèi)匀荒軌蚪Y(jié)合并因此競(jìng)爭(zhēng)底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到部分削弱。由于PemI通常與PemK結(jié)合，因此抑制了其毒性作用，阻止PemI介導(dǎo)的對(duì)PemK的抑制可以將PemK從這個(gè)負(fù)調(diào)控中釋放出來(lái)。因此，抑制PemI活性導(dǎo)致PemK活性的增加。C.鑒定能夠調(diào)節(jié)MazF活性的化合物的一般方法大腸桿菌染色體MazE/MazF上癮組件的結(jié)構(gòu)被確定到1.7埃的分辨率(Kamada et al.，Mol Cell 11，875-884(2003))。正如這里所描述的，上癮組件由控制細(xì)菌細(xì)胞死亡的穩(wěn)定的毒素和不穩(wěn)定的解毒劑蛋白組成。MazE(解毒劑)和MazF(毒素)形成一個(gè)線形的異六聚體，由毒素和解毒劑同二聚體交替組成(MazF2-MazE2-MazF2)。Kamada et al.表明MazE同二聚體含有一個(gè)β桶，從β桶延伸出兩個(gè)C端，與兩側(cè)的MazF同二聚體相互作用。這種相互作用與質(zhì)粒編碼的毒素CcdB和Kid之間的相互作用相似。MazE/MazF異六聚體結(jié)構(gòu)證明了染色體和質(zhì)粒攜帶的上癮組件具有共同的解毒劑-毒素識(shí)別機(jī)制，對(duì)毒素作用、在沒(méi)有毒素時(shí)解毒劑的降解以及解毒劑/毒素復(fù)合物與啟動(dòng)子DNA的結(jié)合提供了一般的分子認(rèn)識(shí)。根據(jù)這里提出的信息，MazE中適宜的肽靶標(biāo)包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區(qū)域。MazE中適宜的肽靶標(biāo)包括N-box，MazE中高度保守的N端區(qū)域(它從殘基7到殘基18，介導(dǎo)與DNA結(jié)合)，以及其中的關(guān)鍵殘基。MazE的N-box中的關(guān)鍵殘基包括K7A，R8A，S12A和R16A，這些殘基的突變破壞了MazE和MazE-MazF復(fù)合物的DNA結(jié)合能力。MazE中從殘基53到64的保守C端區(qū)域Hp-Box，富含疏水殘基，也是適宜的用于基于肽的治療法的靶標(biāo)。Hp-box區(qū)域參與了MazE和MazF之間看起來(lái)最穩(wěn)定的界面。Hp-box中疏水氨基酸殘基的側(cè)鏈(Leu55，Leu58，Val59和Ile62)與MazF同二聚體中的一簇疏水殘基相互作用。根據(jù)這里提出的信息，MazF中適宜的肽靶標(biāo)包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區(qū)域。MazF中適宜的肽靶標(biāo)包括R29S，N40D，T52K，Q77H，R86G，I110N，E24A和K79A殘基以及包含這些關(guān)鍵殘基的小肽(例如包含這些殘基以及其側(cè)翼殘基的5-10個(gè)殘基的肽)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，2∶4 MazE/MazF復(fù)合物及其結(jié)構(gòu)組分的晶體結(jié)構(gòu)(Kamada et al.，同上)，以及在MazE和MazF之間發(fā)現(xiàn)的界面，被作為靶標(biāo)，在一個(gè)虛擬的配基篩選步驟中，通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)駁方法，從一個(gè)龐大的化合物文庫(kù)中鑒定出能夠以高度親和性結(jié)合靶位點(diǎn)的候選化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MazE/MazF復(fù)合物(Kamada et al.，同上)及其組分的結(jié)構(gòu)信息以及在MazE和MazF之間發(fā)現(xiàn)的界面，被用于設(shè)計(jì)化合物，這些化合物預(yù)計(jì)與MazF和/或MazE/MazF的界面結(jié)合，并檢測(cè)這些化合物是否具有高的親和結(jié)合性。在特定的實(shí)施方案中，選擇對(duì)MazF與RNA的結(jié)合有調(diào)節(jié)作用的候選化合物和“設(shè)計(jì)的化合物”。這些化合物可以提高或者抑制MazF與RNA的結(jié)合。這種化合物可以實(shí)現(xiàn)底物(即RNA)切割的增加或者減少。然后對(duì)來(lái)源于任意一種方法并在對(duì)駁步驟中評(píng)分最高的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞的和無(wú)細(xì)胞的試驗(yàn)(在下面描述)，以確定其調(diào)節(jié)MazF活性的效力。然后將任何在生物試驗(yàn)中顯示效力的化合物與MazF共結(jié)晶，以發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合MazF的候選化合物被本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法修飾，進(jìn)一步提高特異性質(zhì)，例如提高效力和/或特異性和/或可溶性。選出的顯示最合需要性質(zhì)的化合物被指定為先導(dǎo)化合物，在例如具有過(guò)度增生性疾病的動(dòng)物模型中進(jìn)一步檢測(cè)其效力。D.鑒定能夠調(diào)節(jié)PemK活性的化合物的一般方法根據(jù)這里提出的信息，PemI中適宜的肽靶標(biāo)包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區(qū)域。PemI中適宜的肽靶標(biāo)包括在PemI多肽家族的成員中保守的區(qū)域。根據(jù)這里提出的信息，PemK中適宜的肽靶標(biāo)包括，但是不止限于，那些下面列出的殘基和區(qū)域。在β鏈S1和S2之間的保守環(huán)(命名為S1-S2環(huán))以及其中的殘基是適宜的肽靶標(biāo)。參見圖33和34獲得保守區(qū)域的氨基酸序列比對(duì)以及其中的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，2∶4 MazE/MazF復(fù)合物及其結(jié)構(gòu)組分的晶體結(jié)構(gòu)(Kamada et al.，同上)，以及在MazE和MazF之間發(fā)現(xiàn)的界面，可以用于檢查PemI/PemK復(fù)合物。因此，這些推斷可以在一個(gè)虛擬的配基篩選步驟中，通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)駁方法，從一個(gè)龐大的化合物文庫(kù)中鑒定出能夠以高度親和性結(jié)合靶位點(diǎn)的候選化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MazE/MazF復(fù)合物(Kamada et al.，同上)及其組分的結(jié)構(gòu)信息以及在MazE和MazF之間發(fā)現(xiàn)的界面，可以用于檢查PemI/PemK復(fù)合物。因此，這些推斷可以用于設(shè)計(jì)化合物，這些化合物預(yù)計(jì)與PemK和/或PemI/PemK界面結(jié)合，并檢測(cè)這些化合物是否具有高的親和結(jié)合性。在特定的實(shí)施方案中，選擇對(duì)PemK與RNA的結(jié)合有調(diào)節(jié)作用的候選化合物和“設(shè)計(jì)的化合物”。這些化合物可以提高或者抑制PemK與RNA的結(jié)合。這種化合物可以實(shí)現(xiàn)底物(即RNA)切割的增加或者減少。然后對(duì)來(lái)源于任意一種方法并且在對(duì)駁步驟中評(píng)分最高的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞的和無(wú)細(xì)胞的試驗(yàn)(在下面描述)，以確定其調(diào)節(jié)PemK活性的效力。然后可將任何在生物試驗(yàn)中顯示效力的化合物與PemK共結(jié)晶，以鑒定結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠結(jié)合PemK的候選化合物被本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法修飾，進(jìn)一步提高特異性質(zhì)，例如提高效力和/或特異性和/或可溶性。選出的顯示最合需要性質(zhì)的化合物被指定為先導(dǎo)化合物，在例如具有過(guò)度增生性疾病的動(dòng)物模型中進(jìn)一步檢測(cè)其效力。通過(guò)彈性對(duì)駁技術(shù)(Flexible Docking Technology)進(jìn)行的虛擬配基篩選目前的對(duì)駁和篩選方法可以使用一個(gè)特異的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從大的化合物文庫(kù)中選擇少量可能的先導(dǎo)候選配基。這種方法在例如Abagyan和Totrov(2001)Current Opinion Chemical Biology 5375-382中有所描述，這里將其全部引用作為參考。基于高通量彈性對(duì)駁的虛擬配基篩選(VLS)在設(shè)計(jì)和鑒定能夠與某個(gè)特定蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合的化合物時(shí)是有用的。VLS可以用于虛擬地從大量化學(xué)分子中取樣而不需要合成和在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)每一個(gè)化學(xué)分子。一般地，該方法從多肽建模開始，它使用通過(guò)常規(guī)方式例如X射線晶體衍射、NMR、同源建模選擇的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。然后使用任何一種現(xiàn)有的對(duì)駁程序，例如MCDOCK(Liu et al.(1999)J.Comput.AidedMol.Des.13435-451)，SEED(Majeux et al.(1999)Proteins 3788-105；DARWIN(Taylor et al.(2000)Proteins 41173-191；MM(David et al.(2001)J.Comput.Aided Mol.Des.15157-171，將一組化合物和/或分子片段對(duì)駁到選擇的結(jié)合位點(diǎn)中。將化合物按照配基評(píng)分，產(chǎn)生一系列預(yù)計(jì)具有最高結(jié)合親和性的候選化合物，用于在體外和體內(nèi)進(jìn)一步檢測(cè)和/或化學(xué)修飾。在VLS的一種方法中，在化學(xué)制備之前，將分子“建造”到選擇的結(jié)合口袋中。設(shè)計(jì)了大量的程序用于一個(gè)原子接著一個(gè)原子“生長(zhǎng)”配基[參見例如GENSTAR(Pearlman et al.L(1993)J.Comput.Chem.141184)，LEGEND(Nishibata et al.(1993)J.Med.Chem.362921-2928)，MCDNLG(Rotstein et al.(1993)J.Comput-AidedMol.Des.723-43)，CONCEPTS(Gehlhaar et al.(1995)J.MedChem 38466-472]或者一個(gè)片段接著一個(gè)片段“生長(zhǎng)”配基[參見例如GROUPBUILD(Rotsein et al.(1993)J.Med.Chem.361700-1710)，SPROUT(Gillet et al.(1993)J.Comput.Aided Mol.Des.7127-153)，LUDI(Bohm(1992)J.Comput.Aided Mol.Des.661-78)，BUILDER(Roe(1995)J.Comput.Aided Mol.Des.9269-282)，和SMOG(DeWitte et al.(1996)J.Am.Chem.Soc.11811733-11744]。對(duì)于一個(gè)特定蛋白的配基的評(píng)分方法是已知的，其可以將少量的能夠結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子與大量的非結(jié)合物區(qū)別開來(lái)。參見，例如，Agagyan et al.(2001)同上，關(guān)于通過(guò)虛擬配基對(duì)駁和篩選方法鑒定出的大量成功配基的報(bào)告。例如，Nishibata et al.(1993)J.Med.Chem 362921-2928描述了一個(gè)結(jié)構(gòu)構(gòu)建程序根據(jù)一個(gè)分子(二氫葉酸還原酶)活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生抑制性分子的能力。該程序能夠預(yù)測(cè)具有與四個(gè)已知的酶抑制劑相似結(jié)構(gòu)的分子，提供有力的支持，即為使用靶三維結(jié)構(gòu)的知識(shí)獲得新型先導(dǎo)化合物提供了有力支持。類似地，Gilletet al.(1993)J.Computer Aided Mol.Design 7127-153描述了通過(guò)基于空間限制的人工智能技術(shù)(SPROUT)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)。通過(guò)本發(fā)明的篩選方法鑒定的因子本發(fā)明提供了鑒定以高度親和性與mRNA干擾酶(例如MazF或PemK)或mRNA干擾酶抑制劑(例如MazE或PemI)結(jié)合的因子(例如候選化合物或者測(cè)試化合物)的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定出的因子可以作為抗過(guò)度增生性疾病和抗細(xì)菌治療方法的候選因子。因子、候選化合物或者測(cè)試化合物的示例包括，但是不止限于，核酸(例如DNA和RNA)、糖、脂、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、小分子以及其他藥物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的組合庫(kù)中多種方法中的任何一種方法得到因子，包括生物文庫(kù)，空間可定位平行固相或者液相文庫(kù)；需要進(jìn)行反卷積的合成文庫(kù)方法；“一珠一化合物(one-head one-compound)”文庫(kù)方法；以及使用親和層析選擇的合成文庫(kù)方法。生物文庫(kù)方法限于肽文庫(kù)，而其他四種方法可以用于肽、非肽寡聚物或者小分子化合物文庫(kù)(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12145；美國(guó)專利編號(hào)5,738,996；和美國(guó)專利編號(hào)5,807,683,在這里分別以其整體引用作為參考)合成分子文庫(kù)的方法的示例可以在本領(lǐng)域內(nèi)找到，例如在DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erbet al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermannet al.(1994)J.Med.Chem.372678；Cho et al.(1993)Science2611303；Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.371233中，每一個(gè)文獻(xiàn)在這里以其整體引用作為參考?；衔镂膸?kù)可以存在于例如溶液中(例如Houghten(1992)Bio/Techniques 13412-421)，或存在于珠上(Lam(1991)Nature35482-84)、存在于芯片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)、存在于細(xì)菌中(美國(guó)專利編號(hào)5,223,409)、存在于孢子中(美國(guó)專利編號(hào)5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、存在于質(zhì)粒中(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或者存在于噬菌體中(Scott and Smith(19900 Science249386-390；Devlin(1990)Science 249404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382；and Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)，每一個(gè)文獻(xiàn)在這里以其整體引用作為參考。篩選試驗(yàn)通過(guò)上面描述的虛擬配基對(duì)駁和篩選方法鑒定的小分子，進(jìn)一步進(jìn)行體外和體內(nèi)試驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)基于細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)鑒定出與mRNA干擾酶(例如MazF或PemK)或者mRNA干擾酶抑制劑如MazE或PemI相互作用(即結(jié)合)的因子。為了清楚和簡(jiǎn)潔的目的，使用MazF和MazF片段描述這些檢測(cè)的剩余部分，但是應(yīng)當(dāng)理解這些檢測(cè)/方法還可以應(yīng)用于其他的mRNA干擾酶及其片段，例如MazE和MazE片段，PemK和PemK片段，以及PemI和PemI片段。根據(jù)該實(shí)施方案，表達(dá)MazF或者其功能性片段的細(xì)胞與候選化合物或者對(duì)照化合物接觸，測(cè)定候選化合物與MazF相互作用的能力。如果需要，可以用這種檢測(cè)來(lái)篩選多個(gè)(例如一個(gè)文庫(kù))的候選化合物。細(xì)胞可以是原核來(lái)源的(例如大腸桿菌)或者真核來(lái)源的(例如酵母或者哺乳動(dòng)物)。而且，細(xì)胞可以內(nèi)源表達(dá)MazF或者其片段，或者經(jīng)過(guò)基因工程改造表達(dá)MazF或者其片段。在某些情況中，MazF或者M(jìn)azF片段被標(biāo)記，例如使用放射性標(biāo)記(例如32P，35S或者125I)，或者使用熒光標(biāo)記(例如異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅素、藻藍(lán)素、別藻藍(lán)素、鄰苯二醛或者熒光胺)，使得MazF和候選化合物之間的相互作用能夠被檢測(cè)到。候選化合物與MazF的相互作用使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行測(cè)定。例如候選化合物與MazF的相互作用可以使用細(xì)胞流式儀、閃爍檢測(cè)法、免疫沉淀或者Western印跡分析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用無(wú)細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，鑒定與MazF或者其相關(guān)片段相互作用(即結(jié)合)的因子。根據(jù)該實(shí)施方案，天然或者重組的MazF或者其片段與候選化合物或者對(duì)照化合物接觸，測(cè)定候選化合物與MazF相互作用的能力。如果需要，可以用這種檢測(cè)來(lái)篩選多個(gè)(例如一個(gè)文庫(kù))候選化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，首先將MazF或者其片段固定化(通過(guò)例如與特異識(shí)別并且結(jié)合MazF或者其片段的固定化抗體接觸，或者通過(guò)使純化的MazF或者其片段的制備物與一個(gè)設(shè)計(jì)用于結(jié)合蛋白的表面接觸)。MazF或者其片段可以部分或者完全純化(即部分或者完全沒(méi)有其他多肽)或者是細(xì)胞裂解物。此外，MazF或者其片段可以是融合蛋白，該融合蛋白包含MazF或者其生物活性部分以及結(jié)構(gòu)域例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶?；蛘進(jìn)azF或其生物活性部分可以使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行生物素化(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals；Rockford，IL)。候選化合物結(jié)合MazF的能力使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在動(dòng)物模型中鑒定調(diào)節(jié)MazF活性的因子。適宜動(dòng)物的示例包括，但是不止限于，小鼠、大鼠、兔、猴子、豚鼠、狗以及貓。優(yōu)選地，使用的動(dòng)物代表過(guò)度增生性疾病的模型。根據(jù)該實(shí)施方案，向適宜的動(dòng)物給服待測(cè)化合物或者對(duì)照化合物(例如口服、直腸給藥、非腸道給藥例如腹膜內(nèi)或者靜脈內(nèi))，測(cè)定對(duì)活性水平的效果。E.能夠結(jié)合mRNA干擾酶的因子或者mRNA干擾酶抑制劑的治療性用途本發(fā)明提供了通過(guò)給予使用以上描述的方法鑒定的治療性化合物，治療過(guò)度增生性疾病。這種化合物包括，但是不止限于，蛋白質(zhì)、肽、蛋白質(zhì)或肽的衍生物或者類似物、抗體、核酸和小分子。本發(fā)明提供了治療受到過(guò)渡增殖疾病困擾的患者的方法，該方法包括向受試對(duì)象施用有效量的通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定的化合物。在一個(gè)優(yōu)選的方面，化合物是基本純化的(例如基本沒(méi)有限制該化合物的作用或者產(chǎn)生不希望的副作用的物質(zhì))。受試對(duì)象優(yōu)選是動(dòng)物，包括但是不止限于，奶牛、豬、馬、雞、貓、狗等等，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選是人。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，非人的哺乳動(dòng)物是受試對(duì)象。當(dāng)化合物包含核酸時(shí)可以使用的制劑和給藥方法如上面所描述；其他適當(dāng)?shù)闹苿┖徒o藥途徑在下面描述。已知各種不同的遞送系統(tǒng)可以用于施用本發(fā)明的化合物，例如包裹在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊中，能夠表達(dá)化合物的重組細(xì)胞，受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用(參見例如Wu and Wu(1987)J.Biol.Chem.2624429-4432)，以及將核酸構(gòu)建為逆轉(zhuǎn)錄病毒或者其他載體的一部分。導(dǎo)入方法可以是腸內(nèi)或者腸胃外的途徑，包括但是不止限于，皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑?；衔锟梢酝ㄟ^(guò)任何方便的途徑進(jìn)行施用，例如灌注或者彈丸式注射，通過(guò)經(jīng)上皮或者粘膜層(例如口腔粘膜、直腸粘膜和小腸粘膜等)的吸收，也可以與其他的生物活性因子一同施用的。給藥可以是全身或者局部的。此外，可能需要將本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)任何適宜的途徑引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；可以通過(guò)例如與一個(gè)貯器(如Ommaya貯器)相連的心室內(nèi)導(dǎo)管幫助心室內(nèi)注射。也可以使用肺部給藥，例如通過(guò)使用吸入器或者霧化器，和具有氣溶膠化試劑的制劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，可能需要將本發(fā)明的藥物組合物局部給藥，例如通過(guò)在手術(shù)中的局部灌注，局部應(yīng)用，例如通過(guò)注射，借助于導(dǎo)管，借助于移植物，所述的移植物是多孔的、非多孔的或者明膠狀的材料，包括膜如sialastic膜，或者纖維)。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥可以通過(guò)直接注射到CSF中或者在腫瘤部位(例如，在CNS組織中)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用載體，特別是脂質(zhì)體遞送化合物(參見Langer(1990)Science 2491527-1533；Treat等人，Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；參見一般的，同上)在另一個(gè)實(shí)施方案中，化合物可以在受控釋放系統(tǒng)中遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(參見Langer，見前；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等人(1980)Surgery 88507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料(參見MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(eds.)，CRCPres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；還參見Levy等人(1985)Science 228190；During等人(1989)Ann.Neurol.25351；Howard等人(1989)J.Neurosurg.71105)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將受控釋放系統(tǒng)置于治療靶(即靶組織或者腫瘤)附近，這樣需要的劑量只是全身劑量的一部分(參見例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，見前，vol.2，pp.115-138(1984))。其他的受控釋放系統(tǒng)在Langer的綜述(1990，Science 2491527-1533)中有討論。F.藥物組合物本發(fā)明還提供了藥物組合物。這種組合物包含治療有效量的因子以及藥物上可以接受的載體。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥物上可以接受的”意思是由聯(lián)邦或者州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者在美國(guó)藥典或者其他一般承認(rèn)的藥典中列出用于動(dòng)物，更為特別地用于人類。術(shù)語(yǔ)“載體”指的是與治療藥物一同施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者載體(Vehide)。這些藥物載體可以是無(wú)菌的液體，例如水或者油，包括石油、動(dòng)物油、植物油或者合成來(lái)源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)藥物組合物通過(guò)靜脈內(nèi)施用時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和含水的葡萄糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是對(duì)于注射用的溶液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉，干的脫脂奶、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。如果需要的話，組合物還可以含有少量的潤(rùn)濕劑或者乳化劑或者pH緩沖劑。這些組合物的形式可以是溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋制劑等等。組合物還可以配制為栓劑，帶有傳統(tǒng)的粘合劑和載體如三甘油酯?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)的載體，例如藥物級(jí)別的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。適宜的藥物載體的示例在E.W.Martin的″Remington′s PharmaceuticalSciences″中有所描述，在這里以其整體引用作為參考。這些組合物含有藥物有效量的組合物，優(yōu)選以純化的形式，以及適宜量的載體，以提供用于向受試對(duì)象正確給藥的形式。制劑應(yīng)當(dāng)適合于給藥的方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物根據(jù)常規(guī)的步驟配制為適于向人進(jìn)行靜脈注射的藥物組合物。通常用于靜脈給藥的組合物是在無(wú)菌等滲含水緩沖劑中的溶液。在必要的時(shí)候，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因以緩解注射部位的疼痛。一般的，這些成分分開供應(yīng)或者混合在一起以單位劑量形式供應(yīng)，例如以密封在標(biāo)明活性因子量的氣密型容器(如安瓿或者小藥囊(sachette))的干燥凍干粉末或者無(wú)水濃縮物的形式。如果組合物通過(guò)灌注給藥時(shí)，可以使用含有無(wú)菌的藥物級(jí)別的水或者鹽水的輸液瓶進(jìn)行配藥。如果組合物通過(guò)注射給藥時(shí)，可以提供一安瓿的注射用無(wú)菌水或者鹽水，以使成分可在給藥前混合。本發(fā)明的化合物可以配制成中性或者鹽的形式。藥物上可以接受的鹽包括那些由游離氨基基團(tuán)形成的鹽，例如鹽酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽等等，以及那些由游離羧基基團(tuán)形成的鹽，其例如為源自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺，2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的鹽?？梢酝ㄟ^(guò)基于本描述的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定對(duì)于治療過(guò)度增生性疾病(例如癌癥)有效的本發(fā)明化合物的量。此外，還可以可選地進(jìn)行體外測(cè)定，幫助確定最佳的劑量范圍。在制劑中使用的精確劑量還取決于給藥途徑以及疾病或者病癥的嚴(yán)重程度，應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師的判斷以及每一個(gè)受試對(duì)象的情況確定。但是，用于靜脈內(nèi)給藥的適宜劑量范圍一般是每千克體重大約20-500微克的活性化合物。用于鼻內(nèi)給藥的適宜劑量范圍一般是每千克體重大約0.01皮克-1毫克。栓劑含有的活性成分的范圍一般是0.5重量％-10重量％；口服制劑優(yōu)選地含有10％-95％的活性成分。可以根據(jù)來(lái)自體外或者動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-響應(yīng)曲線外推出有效的劑量。核酸本發(fā)明提供了鑒定能夠結(jié)合mRNA干擾酶(例如MazF或者PemK)的因子以實(shí)現(xiàn)mRNA干擾酶的核糖核酸內(nèi)切酶活性增加的方法。因此，本發(fā)明包括施用核酸，該核酸編碼mRNA干擾酶或者其直向同源物的肽或蛋白質(zhì)激活劑，以及能夠干擾mRNA干擾酶(例如MazE或PemI)或者其直向同源物的內(nèi)源抑制劑表達(dá)的反義序列或者催化性RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所施用的核酸包含的序列編碼能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合mRNA干擾酶的肽或者蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域內(nèi)可利用的任何用于施用核酸序列的適宜方法都可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用。施用和表達(dá)核酸序列的方法在基因治療領(lǐng)域中一般是已知的。對(duì)于基因治療方法的一般性綜述，參見Goldspiel et al.(1993)Clinical Pharmacy 12488-505；Wu and Wu(1991)Biotherapy 387-95；Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan(1993)Science 260926-932；以及Morgan andAnderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62191-217；May(1993)TIBTECH 11(5)155-215.重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中通常已知的、可以用于本發(fā)明的方法在Ausubel et al.(eds.)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY；和Kriegler(1990)Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY，中予以描述。在一個(gè)特殊方面，化合物包含的核酸編碼能夠結(jié)合mRNA干擾酶以實(shí)現(xiàn)mRNA干擾酶核糖核酸內(nèi)切酶活性增加的肽或者蛋白質(zhì)，這種核酸是在適宜的宿主中表達(dá)肽或者蛋白質(zhì)的表達(dá)載體的一部分。特別地，這種核酸具有與編碼區(qū)域有效連接的啟動(dòng)子，所述的啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或者是組成型的(以及選擇性地，組織特異的)。在另一個(gè)特別的實(shí)施方案中，使用了核酸分子，其中的編碼序列和任何其他所需的序列被促進(jìn)在染色體中的所需位點(diǎn)處發(fā)生同源重組的區(qū)域包圍，這樣提供了核酸的染色體內(nèi)表達(dá)(Koller和Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra et al.(1989)Nature 342435-438)。可以直接將核酸遞送到受試對(duì)象的體內(nèi)，這時(shí)受試對(duì)象與核酸或者攜帶核酸的載體直接接觸，這種方式被稱為體內(nèi)基因治療。可選擇地，核酸遞送到受試對(duì)象的體內(nèi)是間接的，這時(shí)首先在體外用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植到受試對(duì)象體內(nèi)，這被稱為“離體基因治療”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸在體內(nèi)直接施用，在體內(nèi)其表達(dá)產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。這可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種方法中的任何一種來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)將核酸構(gòu)建為適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)載體的一部分并施用之，這樣核酸就成為細(xì)胞內(nèi)的，例如通過(guò)使用缺陷的或者減毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒或者其他病毒載體感染(參見美國(guó)專利號(hào)4,980,286)；通過(guò)使用裸露的DNA直接感染；通過(guò)使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)；通過(guò)使用脂類、細(xì)胞表面受體或者轉(zhuǎn)染劑包被；通過(guò)使用脂質(zhì)體、微?；蛘呶⒛z囊包裹；通過(guò)將核酸連接在已知進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)的肽上；或者將核酸與配基連接，該配基會(huì)經(jīng)歷受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，這可以用于靶向特異表達(dá)該受體的細(xì)胞類型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以形成核酸-配基復(fù)合物，其中的配基包含融合病毒肽，以破壞內(nèi)體，使核酸避免被溶酶體降解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)靶向一個(gè)特異的受體，在體內(nèi)使得核酸能夠達(dá)到細(xì)胞特異的攝取和表達(dá)(參見例如PCT出版物WO 92/06180，1992-4-16(Wu et al.)；WO92/22635，1992-12-23(Wilson et al.)；WO92/20316，1992-11-26(Findeis et al.)；WO93/14188，1993-7-22(Clarke et al.)，WO93/20221，1993-10-14(Young))?？蛇x擇地，將核酸引入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)同源重組整合在宿主細(xì)胞DNA中以用于表達(dá)(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra et al.(1989)Nature 342435-438)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller et al.(1993)Meth.Enzymol.217581-599)。已經(jīng)對(duì)這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行了修飾，刪除了病毒基因組包裝和整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中不必需的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。編碼將要在基因治療中使用的mRNA干擾酶的核酸被克隆到載體中，這有利于將基因遞送到受試對(duì)象中。關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的更多細(xì)節(jié)可以在Boesen et al.(1994)Biotherapy 6291-302中找到，它描述了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdr1基因遞送到造血干細(xì)胞中，目的是使干細(xì)胞對(duì)化療更有抵抗力。闡釋逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在基因治療中的用途的其他參考文獻(xiàn)有Clowes et al.(1994)J.Clin.Invest.93644-651；Kiem et al.(1994)Blood831467-1473；Salmons和Gunzberg(1993)Human Gene Therapy 4129-141；以及Grossman和Wilson(1993)Curr.Opin.in Geneticsand Devel.3110-114。還可以在基因治療中有效地使用腺病毒。腺病毒在將基因遞送到呼吸道上皮方面是有特別有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮并導(dǎo)致輕度疾病?；谙俨《镜倪f送系統(tǒng)的其他靶標(biāo)有肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，上皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒的優(yōu)點(diǎn)是能夠感染非分裂細(xì)胞。Kozarsky和Wilson(1993)Current Opinion in Genetics andDevelopment 3499-503綜述了基于腺病毒的基因治療。Bout et al.(1994)Human Gene Therapy 53-10證明了腺病毒載體對(duì)于將基因轉(zhuǎn)移到恒河猴的呼吸道上皮中的用途。在基因治療中使用腺病毒的其他實(shí)例可以在以下文獻(xiàn)中找到Rosenfeld et al.(1991)Science 252431-434；Rosenfeld et al.(1992)Cell 68143-155；Mastrangeliet al.(1993)J.Clin.Invest.91225-234；PCT出版物WO94/12649；和Wang，et al.(1995)Gene Therapy 2775-783。已經(jīng)有人建議將腺伴隨病毒(AAV)用于基因治療(Walsh et al.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美國(guó)專利號(hào)5,436,146)。另一個(gè)基因治療的適宜方式包含通過(guò)諸如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者病毒感染的方法將轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)的細(xì)胞中。通常，轉(zhuǎn)移的方法包括將選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然后將細(xì)胞置于選擇壓力下，以分離那些攝取并表達(dá)了轉(zhuǎn)移的基因的細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞遞送到受試對(duì)象中。在該實(shí)施方案中，將核酸引入到細(xì)胞中，然后將得到的重組細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)施用。這種核酸的引入可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法進(jìn)行，包括但是不止限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、使用含有核酸序列的病毒或者噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等等。對(duì)于將外源基因引入細(xì)胞中，在本領(lǐng)域內(nèi)已知有許多技術(shù)(參見例如Loeffler和Behr(1993)Meth.Enzymol.217599-618；Cohen et al.(1993)Meth.Enzymol.217618-644；Cline(1985)Pharmac.Ther.2969-92)，它們可以根據(jù)本發(fā)明使用，條件是受體細(xì)胞必需的發(fā)育和生理功能不受到破壞。該技術(shù)應(yīng)該將核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，這樣核酸可以被細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)選地，可被該細(xì)胞的后代繼承和表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種不同方法將產(chǎn)生的重組細(xì)胞遞送到受試對(duì)象中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如通過(guò)皮下注射上皮細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將重組皮膚細(xì)胞作為皮膚移植物施加到受試對(duì)象上；重組血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或者始祖細(xì)胞)優(yōu)選地通過(guò)靜脈內(nèi)施用。預(yù)計(jì)使用的細(xì)胞量取決于所需的作用、受試對(duì)象的狀況等等，并且可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定?？梢詫⒑怂嵋胍杂糜诨蛑委煹募?xì)胞包括任何所需的，可獲得的細(xì)胞類型，包括但是不止限于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種不同的干細(xì)胞或者始祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或者始祖細(xì)胞，例如從骨髓、臍帶血、外周血或者胎兒肝臟中獲得的那些。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是接受治療的受試對(duì)象的自體細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將要引入以用于基因治療的核酸可以包含與編碼區(qū)域有效連接的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，使得核酸的表達(dá)可以通過(guò)調(diào)整適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的濃度來(lái)控制。直接注射編碼能夠結(jié)合mRNA干擾酶的肽或蛋白質(zhì)的DNA或者能夠干擾mRNA干擾酶(例如，MazE或PemI，或其直向同源物)的內(nèi)源抑制劑表達(dá)的因子，可以根據(jù)例如美國(guó)專利號(hào)5,589,466中描述的技術(shù)進(jìn)行。這些技術(shù)包括注射“裸露的DNA”，即除了適宜的載體以外沒(méi)有脂質(zhì)體、細(xì)胞或者任何其他材料的分離的DNA分子。注射編碼蛋白質(zhì)并與適宜的啟動(dòng)子有效連接的DNA，使該蛋白質(zhì)在鄰近注射部位的細(xì)胞中產(chǎn)生。G.試劑盒本發(fā)明還提供了藥物包或者試劑盒，該藥物包或者試劑盒包含一個(gè)或者多個(gè)容器，容器中裝有本發(fā)明藥物組合物的一種或者多種成分。這種容器可選地附帶的可以是管理藥物或者生物制品的生產(chǎn)、使用或者銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的通告，通告上表明(a)經(jīng)過(guò)生產(chǎn)、使用和銷售的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，用于人體施用，(b)使用說(shuō)明，或兩者。提出以下的實(shí)施例，為本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員提供關(guān)于如何制備和使用本發(fā)明的檢測(cè)、篩選以及治療方法的完整的公開和描述，并不是要限制發(fā)明者所認(rèn)為的他們的發(fā)明的范圍。已經(jīng)投入力量確保所用數(shù)目(例如量，溫度等等)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)當(dāng)解釋一些實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差出現(xiàn)的原因。除非有其他說(shuō)明，份是重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，壓力為大氣壓或者接近大氣壓。提供以下的實(shí)驗(yàn)方案，以有助于本發(fā)明的實(shí)施。
實(shí)施例I正如這里描述的，使用甲苯處理使大腸桿菌細(xì)胞通透化，并將這些細(xì)胞用于證明MazF抑制翻譯，但是對(duì)RNA合成或者DNA復(fù)制沒(méi)有抑制。而且顯示出，MazF在ACA序列的A和C殘基之間以不依賴于核糖體的方式特異切割mRNA。因此，本發(fā)明證明了MazF通過(guò)在特異位點(diǎn)切割mRNA而干擾mRNA的功能。因此，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)MazF是新型的核糖核酸內(nèi)切酶，在這里將其命名為“mRNA干擾酶”。材料和方法菌株和質(zhì)粒。使用了大腸桿菌BL21(DE3)、BW25113(Datsenko和Wanner，Proc Natl Acad Sci USA 97，6640-5(2000))和MRE600(Swaney et al.，Antimicrob Agents Chemother 42，3251-5(1998))。從質(zhì)粒pET-21cc(Novagen)構(gòu)建質(zhì)粒pET-21cc-MazEF，其被修飾成在T7啟動(dòng)子的控制下表達(dá)MazE和MazF(His)6。但是Shine-Dalgarno(SD)序列來(lái)自mazEF操縱子。使用pET-28a(Novagen)構(gòu)建質(zhì)粒pET-28a-MazE，以表達(dá)(His)6MazE。使用pBAD(Guzman et al.，J Bacteriol 177，4121-30(1995))構(gòu)建pBAD-MazF，以在加入0.2％阿拉伯糖后嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣{(diào)控mazF的表達(dá)。甲苯處理的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成的檢測(cè)。50毫升含有質(zhì)粒pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113培養(yǎng)物在甘油-M9培養(yǎng)基中于37攝氏度生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入阿拉伯糖使終濃度為0.2％。于37攝氏度孵育10分鐘后，用1％甲苯處理細(xì)胞(Halegoua et al.，Eur J Biochem 69，163-7(1976))。根據(jù)以前的描述使用35S-甲硫氨酸進(jìn)行蛋白質(zhì)合成(Halegoua et al.，JBacteriol 126，183-91(1976))。甲苯處理的細(xì)胞在室溫下用0.05M磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)洗一次，然后重懸于同一緩沖液中，以根據(jù)以前的描述用[α-32P]dTTP檢查DNA的合成(Moses和Richardson，ProcNatl Acad Sci USA 67，674-81(1970))。對(duì)于RNA合成的檢測(cè)，甲苯處理的細(xì)胞在室溫下用0.05M Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗一次，然后重懸于同一緩沖液中，以根據(jù)以前的描述測(cè)量[α-32P]UTP向RNA中的摻入(Peterson et al.，J Bacteriol 107，585-8(1971))。體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的檢測(cè)。含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細(xì)胞生長(zhǎng)在甘油-M9培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.6時(shí)，將其分成兩等份。其中一份中加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％，第二份中加入水。以在圖2D中所示的不同時(shí)間間隔，取出1毫升的培養(yǎng)物至含有2μCi35S-甲硫氨酸的試管中，混合物在37攝氏度孵育1分鐘。然后將50微升反應(yīng)混合物施加于一個(gè)濾紙盤(Whatman 3mm，2.3厘米直徑)上。根據(jù)以前的描述(Hirashima和Inouye，Nature 242，405-7(1973))用5％TCA溶液處理濾紙，并用液閃計(jì)數(shù)器定量測(cè)定放射性。剩余的500微升反應(yīng)混合物加入到含有25微升100％TCA溶液和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的冷卻的試管中。混合物在冰浴上孵育60分鐘。離心后收集沉淀，通過(guò)將混合物在沸水浴中孵育30分鐘而溶解在50微升的SDS-PAGE上樣緩沖液中。除去不溶的物質(zhì)以后，將上清液(10微升)通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。MazF(His)6和(His)6MazE蛋白的純化。從攜帶pET-21cc-MazEF的菌株BL21(DE3)中純化C末端標(biāo)記的MazF(His)6。首先用Ni-NTA樹脂純化MazF(His)6和MazE復(fù)合物。用6M鹽酸胍將MazE從MazF(His)6上解離下來(lái)以后，在Ni-NTA樹脂上重新純化，并通過(guò)逐步透析而使蛋白質(zhì)重折疊。從攜帶pET-28a-MazE的菌株BL21(DE3)中純化N端標(biāo)記的(His)6MazE。MazF對(duì)于原核和真核無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白質(zhì)合成的影響。使用大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行原核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。反應(yīng)混合物由10微升S30預(yù)混合物、7.5微升S30提取物和2.5微升的氨基酸混合物(除甲硫氨酸以外，每種氨基酸1mM)。1微升35S-甲硫氨酸、以及不同量的MazF(His)6和(His)6MazE組成，終體積為24微升。反應(yīng)混合物在37攝氏度孵育10分鐘，通過(guò)加入1微升pET-11a-MazG質(zhì)粒-DNA(0.16微克/微升)開始檢測(cè)(Zhang和Inouye，J Bacteriol 184，5323-9(2002))。反應(yīng)在37攝氏度進(jìn)行1小時(shí)，用丙酮沉淀蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。使用用于PCR DNA兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)TNT T7 Quick(Promega)進(jìn)行真核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成。使用編碼人蛋白并在T7啟動(dòng)子控制下的DNA片段作為mRNA轉(zhuǎn)錄的模板。反應(yīng)在37攝氏度進(jìn)行1小時(shí)，用丙酮沉淀蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。多核糖體分布圖。含有pBAD-MazF質(zhì)粒的大腸桿菌BW25113的過(guò)夜培養(yǎng)物用新鮮的甘油-M9培養(yǎng)基稀釋50倍。37攝氏度孵育5小時(shí)后，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％。誘導(dǎo)MazF10分鐘后加入氯霉素至終濃度為100微克/毫升。離心收集細(xì)胞沉淀，重懸于含有10mM MgCl2、60mM NH4Cl、1mM DTT和1毫克/毫升溶菌酶的1毫升10mM Tris-HCl(pH 7.8)中。液氮凍融兩次后，在Beckman TLA100.3轉(zhuǎn)子中以24000rpm將裂解物離心20分鐘。上清液(300微升)加入到5-40％蔗糖梯度中以獲得多核糖體分布圖。不加阿拉伯糖進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)OD280檢查核糖體圖譜(pattern)，梯度從左(40％)到右(5％)。所指示處加入春日霉素至終濃度為500微克/毫升。大腸桿菌70S核糖體的制備。根據(jù)以前的描述(Aoki etal.，Antimicrob Agents Chemother 46，1080-5(2002)；Du和Babitzke，J Biol Chem 273，20494-503(1998)；Hesterkamp et al.，JBiol Chem 272，21865-71(1997))從大腸桿菌MRE 600中制備70S核糖體，有少量改動(dòng)。細(xì)菌細(xì)胞(2克)懸浮于緩沖液A[10mM Tris-HCl(pH 7.4)，含有10mM MgCl2，60mM NH4Cl和6mM 2-巰基乙醇]中。用弗氏壓碎器裂解細(xì)胞。與無(wú)RNA酶的DNA酶孵育(0攝氏度30分鐘)之后，在Beckman 50Ti轉(zhuǎn)子中以30000rpm于4攝氏度離心30分鐘兩次以去除細(xì)胞碎片。上清液(上面的3/4)加入到等體積的緩沖液B(含有0.5M NH4Cl的緩沖液A)中的1.1M蔗糖中，在Beckman50Ti轉(zhuǎn)子中以45000rpm于4攝氏度離心15小時(shí)。核糖體沉淀用緩沖液A漂洗之后，重懸于緩沖液A中，并施加至緩沖液A制備的10-30％(重量/體積)線性蔗糖梯度中，在Beckman SW40Ti轉(zhuǎn)子中以20000rpm于4攝氏度離心15小時(shí)。將梯度按級(jí)分離，混合70S核糖體級(jí)分，并在Beckman 50Ti轉(zhuǎn)子中以45000rpm于4攝氏度離心20小時(shí)以使其沉淀。70S核糖體沉淀重懸于緩沖液A中，-80攝氏度儲(chǔ)存。引物延伸抑制(趾紋法)檢測(cè)。根據(jù)以前的描述(Moll和Blasi，Biochem Biophys Res Commun 297，1021-1026(2002))進(jìn)行趾紋法，有小的調(diào)整。用于引物模板退火的混合物含有mazG mRNA和32P-末端標(biāo)記的DNA引物，它與mazG mRNA的65-85堿基互補(bǔ)。將該混合物在65攝氏度孵育5分鐘，然后緩慢冷卻至室溫。核糖體結(jié)合混合物含有2微升10×緩沖液[100mM Tris-HCl(pH 7.8)，含有100mM MgCl2，600mM NH4Cl和10mM DTT]，不同量的MazF(His)6，0.375mMdNTP，0.5μM 70S核糖體亞基，2.5μM tRNAfMet和2微升的退火混合物，終體積為20微升。最終的mRNA濃度為0.05μM。核糖體結(jié)合混合物在37攝氏度孵育10分鐘，然后加入2U逆轉(zhuǎn)錄酶。cDNA的合成于37攝氏度進(jìn)行15分鐘。加入12微升測(cè)序上樣緩沖液來(lái)終止反應(yīng)。樣品在90攝氏度孵育5分鐘，然后在6％聚丙烯酰胺測(cè)序凝膠上進(jìn)行電泳。使用T7 RNA聚合酶從含有T7啟動(dòng)子的173-bp DNA片段中體外合成mazGmRNA。由T7啟動(dòng)子和從+1至+153的mazG mRNA構(gòu)成的DNA片段通過(guò)使用pET-11a-MazG質(zhì)粒作為DNA模板的PCR擴(kuò)增而得到。酚抽提后的mazG mRNA的趾紋法。實(shí)驗(yàn)按照以上描述的方法進(jìn)行，唯一區(qū)別是省掉了70S核糖體和tRNAfMet。在引物延伸之前用酚抽提反應(yīng)混合物以除去蛋白質(zhì)。突變體質(zhì)粒的構(gòu)建。使用pET-11a-MazG質(zhì)粒作為DNA模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變。通過(guò)DNA序列分析對(duì)突變進(jìn)行確證。RNA分離和Northern印跡分析。含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113在甘油-M9培養(yǎng)基中于37攝氏度生長(zhǎng)。OD600值達(dá)到0.8時(shí)，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％。以如圖4D所示的不同間隔取樣。根據(jù)以前的描述(Sarmientos et al.，Cell 32，1337-46(1983))，使用熱酚法分離總RNA。根據(jù)以前的描述(Baker和Mackie，MolMicrobiol 47，75-88(2003))進(jìn)行Northern印跡分析。有關(guān)附圖的具體的方法學(xué)細(xì)節(jié)如圖1A所示，MazF的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性作用。使用質(zhì)粒pBAD-MazF，pBAD-MazF R29S或pBAD-MazF R86G分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25113(ΔaraBAD)細(xì)胞。細(xì)胞涂布在含有和沒(méi)有阿拉伯糖(0.2％)的甘油-M9平板上，接種了的平板在37攝氏度孵育24小時(shí)。圖1B顯示了大腸桿菌(Escherichi coli)(NP_289336.1)的MazF和耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)(NP_244588.1)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(AAG23809.1)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(NP_372592.1)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(1NE8_A)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(NP_266040.1)，摩氏摩根氏菌(Morganella morgani)(AAC82516.1)以及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(NP_217317.1)的MazF的序列比對(duì)。圖2A顯示MazF的表達(dá)對(duì)35S-Met向甲苯處理的細(xì)胞中摻入的影響。具體地，含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113于37攝氏度在甘油-M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％。37攝氏度孵育10分鐘后，細(xì)胞用甲苯處理(Halegoua et al.，J Bacteriol 126，183-91(1976))。根據(jù)以前的描述(Halegoua et al.，Eur J Biochem 69，163-7(1976))，使用甲苯處理的細(xì)胞，用35S-甲硫氨酸進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。圖2B顯示了MazF對(duì)[α-32P]dTTP向甲苯處理的細(xì)胞中摻入的影響(Moses和Richardson，Proc Natl Acad Sci USA 67，674-81(1970))。圖2C顯示了MazF對(duì)[α-32P]UTP向甲苯處理的細(xì)胞中摻入的影響(Peterson et al.，J Bacteriol 107，585-8(1971))。圖2D顯示了MazF對(duì)35S-Met體內(nèi)摻入的影響。根據(jù)所標(biāo)明的、在MazF誘導(dǎo)后的不同時(shí)刻，測(cè)量35S-Met向含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細(xì)胞中的摻入。圖2E顯示MazF誘導(dǎo)后體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的SDS-PAGE分析。在圖2E中使用的培養(yǎng)物與圖2D中使用的相同。圖3A顯示了MazF對(duì)多核糖體分布圖的影響。通過(guò)OD260檢測(cè)核糖體圖譜，梯度從左(40％)到右(5％)。70、50和30S核糖體的位置予以標(biāo)明。圖3B闡明了MazF(His)6對(duì)原核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響，使用的是大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)(Promega)。泳道C，沒(méi)有MazF(His)6；泳道1-5分別加入77、154、231、308和384nM的MazF(His)6；泳道6-10384nM MazF(His)6，(His)6MazE和MazF(His)6的比例分別是0.1、0.2、0.4、0.8和1.2。圖3C顯示MazF(His)6對(duì)真核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響，使用的是用于PCR DNA的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)TNT T7 Quick(Promega)。泳道1，沒(méi)有(His)6MazE和MazF(His)6；泳道2，0.66μM MazF(His)6；泳道3，0.9μM(His)6MazE和0.66μM MazF(His)6，(His)6MazE和MazF(His)6的比例是1.2∶1。圖4A顯示MazF存在時(shí)的mazG mRNA的趾紋分析。mRNA從含有T7啟動(dòng)子的173-bp DNA片段，使用T7 RNA聚合酶體外合成。使用pET-11a-MazG質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得所述DNA片段(T7啟動(dòng)子和從+1至+153的mazG mRNA)。泳道1，沒(méi)有MazF(His)6和70S核糖體；泳道2，有2.6μM MazF(His)6，沒(méi)有70S核糖體；泳道3，有0.5μM 70S核糖體，沒(méi)有MazF(His)6；泳道4-8，0.5μM 70S核糖體以及分別含有0.35μM、0.7μM、1.4μM、2.1μM和2.6μM的MazF(His)6。圖4B顯示了酚抽提后的mazG mRNA的趾紋分析。實(shí)驗(yàn)方法與圖4A的泳道1和泳道2中描述的方法相同，區(qū)別在于反應(yīng)產(chǎn)物使用酚抽提，以便在引物延伸之前去除蛋白質(zhì)。泳道1，沒(méi)有MazF(His)6；泳道2，有2.6μM MazF(His)6。圖4C顯示了MazE對(duì)對(duì)mazG mRNA的MazF切割的影響。泳道1，沒(méi)有MazF(His)6和(His)6MazE；泳道2，有8.8μM(His)6MazE；泳道3，有2.2μM MazF(His)6；泳道4-7，有2.2μM MazF(His)6，(His)6MazE與MazF(His)6的比例分別為0.25，0.4，0.8和1.0。圖4D顯示MazF在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞mRNA的影響。在加入阿拉伯糖后的不同時(shí)刻(如所標(biāo)明的)從含有pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細(xì)胞中提取總細(xì)胞RNA，并進(jìn)行Northern印跡分析，使用放射性標(biāo)記的ompA和lpp ORF DNA作為探針。圖5表明了春日霉素對(duì)多核糖體分布圖的影響。根據(jù)以上的描述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)OD260檢測(cè)核糖體圖譜，梯度從左(40％)到右(5％)。70、50和30S核糖體的位置予以標(biāo)明。圖6顯示核糖體對(duì)mazG mRNA的MazF切割的抑制。反應(yīng)根據(jù)以上的描述進(jìn)行。泳道1，沒(méi)有MazF(His)6和70S核糖體；泳道2，有2.6μM MazF(His)6，但是沒(méi)有70S核糖體；泳道3，有0.5μM 70S核糖體，但是沒(méi)有MazF(His)6；泳道4，mazG mRNA和70S核糖體在37攝氏度孵育10分鐘，然后向該混合物中加入2.2μMMazF(His)6，并在37攝氏度再孵育10分鐘，之后進(jìn)行引物延伸；泳道5，首先混合70S核糖體和MazF(His)6，并在37攝氏度孵育10分鐘，之后加入mazG mRNA，繼續(xù)在37攝氏度孵育10分鐘，之后進(jìn)行引物延伸；泳道6，mazG mRNA和MazF(His)6混合并在37攝氏度孵育10分鐘后，向混合物中加入70S核糖體，繼續(xù)在37攝氏度孵育10分鐘，之后進(jìn)行引物延伸。FL，全長(zhǎng)的mazG mRNA；TP(s)，由于二級(jí)結(jié)構(gòu)暫停的位置；TP(F)，由于MazF切割的趾紋位置；TP(r)，由于核糖體與mazG mRNA的結(jié)合造成的趾紋位置。圖7闡明了mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列發(fā)生GGAG到UUUG的突變對(duì)MazF功能的影響。反應(yīng)根據(jù)上面的描述進(jìn)行。泳道1-4，野生型mazG mRNA；泳道5-8，突變體mazG mRNA，在Shine-Dalgarno序列發(fā)生GGAG到UUUG的突變。泳道1和5，沒(méi)有MazF(His)6和70S核糖體；泳道2和6，2.6μM MazF(His)6，但是沒(méi)有70S核糖體；泳道3和7，0.5μM 70S核糖體，沒(méi)有MazF(His)6；泳道4和8，0.5μM 70S核糖體和2.2μM MazF(His)6。標(biāo)記的注釋在左側(cè)，同圖6。圖8顯示mazG mRNA起始密碼子的突變對(duì)MazF功能的影響。反應(yīng)根據(jù)以上的描述進(jìn)行。泳道1-4，野生型mazG mRNA；泳道5-8，突變體mazG mRNA，其起始密碼子變?yōu)镚UG；泳道9-12，突變體mazG mRNA，其起始密碼子變?yōu)锳GG。泳道1、5和9，沒(méi)有MazF(His)6和70S核糖體；泳道2、6和10，2.6μM MazF(His)6，但是沒(méi)有70S核糖體；泳道3、7和11，0.5μM 70S核糖體，但是沒(méi)有MazF(His)6；泳道4、8和120.5μM 70S核糖體和2.2μM MazF(His)6。標(biāo)記的注釋在左側(cè)，同圖6。圖9顯示UACAU(U1A2C3A4U5)切割序列的突變對(duì)MazF功能的影響。反應(yīng)混合物根據(jù)以上的描述進(jìn)行。泳道1和2使用野生型mazGmRNA作為對(duì)照。所有的突變由箭頭標(biāo)明。泳道1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29和31，沒(méi)有MazF(His)6；泳道2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30和32，有2.6μM的MazF(His)6。標(biāo)記的注釋在左側(cè)，同圖6。圖10顯示MazF和MazE對(duì)16S和23S rRNA的切割的影響。反應(yīng)在以下的體系中進(jìn)行10mM Tris-HCl(pH 7.8)，含有10mMMgCl2，60mM NH4Cl，1mM DTT，0.5微升人胎盤RNA酶抑制劑(Roche)，5.6μM MazF(His)6和/或17.6μM(His)6MazE，總體積是10微升。37攝氏度孵育10分鐘后，加入2微升上樣緩沖液以終止反應(yīng)。樣品在3.5％的丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析。泳道1，沒(méi)有MazF(His)6；泳道2，有5.2μM MazF(His)6；泳道3，有17.6μM(His)6MazE；泳道4，有5.2μM MazF(His)6和17.6μM(His)6MazE.23S和16S rRNA和tRNA的位置用箭頭表示。結(jié)果mazF基因被克隆到可以用阿拉伯糖誘導(dǎo)的pBAD質(zhì)粒(Guzman et al.，J Bacteriol 177，4121-30(1995))中。攜帶pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113在阿拉伯糖(0.2％)存在的條件下在甘油-M9平板上不生長(zhǎng)(參見圖1A)。當(dāng)MazF同源物中高度保守的殘基Arg29或Arg86被分別替換為Ser或Gly后(圖1B)，對(duì)阿拉伯糖的敏感性被消除了(圖1A)。結(jié)果表明觀察到的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制是由于野生型MazF的生存力成的。在液體培養(yǎng)基中，加入阿拉伯糖5分鐘后，細(xì)胞的生存力降低了104。為了確定被MazF抑制的細(xì)胞功能，使用了由攜帶pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113制備的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，細(xì)菌經(jīng)甲苯處理而被通透化(Halegoua et al.，J Bacteriol 126，183-91(1976)；Halegoua et al.，Eur J Biochem 69，163-7(1976)。當(dāng)在甲苯處理以前，細(xì)胞在阿拉伯糖存在的條件下預(yù)孵育10分鐘時(shí)，ATP依賴的35S_甲硫氨酸摻入被完全抑制(圖2A)。但是在類似的條件下，[α-32P]dTTP(Moses和Richardson，Proc Natl Acad Sci USA 67，674-81(1970))(圖2B)和[α-32P]UTP(Peterson et al.，J Bacteriol 107，585-8(1971))(圖2C)的摻入?yún)s沒(méi)有受到影響。這些結(jié)果表明MazF抑制了蛋白質(zhì)合成，但是不抑制DNA復(fù)制或者RNA合成。使用沒(méi)有經(jīng)過(guò)甲苯處理的細(xì)胞，加入阿拉伯糖后，35S-甲硫氨酸的體內(nèi)摻入(Hirashima和Inouye，Nature 242，405-7(1973)被顯著地抑制(圖2D)。加入阿拉伯糖后不同時(shí)刻對(duì)總細(xì)胞蛋白合成所進(jìn)行的SDS-PAGE分析(圖2E)顯示，MazF是蛋白質(zhì)合成的一個(gè)一般性的抑制劑，它基本上影響所有的細(xì)胞蛋白質(zhì)。有趣的是，較大的蛋白比較小的蛋白更易受到MazF的毒害。阿拉伯糖誘導(dǎo)10分鐘后，使用蔗糖密度梯度對(duì)攜帶pBAD-MazF的大腸桿菌BW25113細(xì)胞進(jìn)行多核糖體圖譜的分析。如圖3A所示，在這種細(xì)胞中，多核糖體完全消失了，同時(shí)70S核糖體級(jí)分升高，30S或50S核糖體級(jí)分沒(méi)有顯著改變。當(dāng)使用春日霉素處理細(xì)胞時(shí)，多核糖體圖譜出現(xiàn)了類似的改變(圖5)，春日霉素是抑制翻譯起始的抗生素。這些發(fā)現(xiàn)提示MazF通過(guò)抑制翻譯起始或者通過(guò)降解mRNA而導(dǎo)致核糖體從mRNA上釋放。還在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞RNA/蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中檢查了純化的MazF(His)6對(duì)候選蛋白質(zhì)MazG合成的影響。從共同表達(dá)MazE和MazF(His)6的細(xì)胞中純化出MazF(His)6。使用大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)(Promega)從質(zhì)粒pET-11a-MazG合成MazG(30kD)(Hirashimaand Inouye，Nature 242，405-7(1973))，合成在37攝氏度下進(jìn)行1小時(shí)，并在沒(méi)有MazF(His)6存在或者有濃度逐步升高的MazF(His)6存在的情況下(圖3B)。MazF(His)6濃度在231nM以上時(shí)，MazG的合成被完全抑制。同時(shí)研究了MazE抗毒素對(duì)這個(gè)觀察到的由MazF介導(dǎo)的對(duì)MazG合成的抑制的作用。有趣的是，同時(shí)加入抗毒素(His)6MazE，以劑量依賴的方式挽救了MazG的合成(圖3B)。MazF(His)6還能夠抑制真核無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(圖3C，泳道2)，蛋白質(zhì)的合成在同時(shí)加入(His)6MazE時(shí)也得到恢復(fù)(泳道3)。由于MazF抑制了MazG的合成(圖3B)，對(duì)抑制發(fā)生的時(shí)間進(jìn)行了分析。為了確定抑制是否影響了翻譯起始步驟，采用了趾紋(TP)技術(shù)，其使用70S核糖體和MazG mRNA(Moll和Blasi，BiochemBiophys Res Commun 297，1021-1026(2002))。只對(duì)mazG mRNA進(jìn)行趾紋分析產(chǎn)生了全長(zhǎng)的條帶(FL)和可能是由于mazG mRNA的5′末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)而形成的條帶TP(s)(圖4A，泳道1)。在70S核糖體存在下，檢測(cè)到了起始密碼子下游的趾紋條帶[TP(r)](泳道3)。當(dāng)MazF(His)6與70S核糖體一同加入時(shí)，出現(xiàn)了一個(gè)新的條帶TP(F)，它對(duì)應(yīng)的是Shine-Dalgarno(SD)序列和起始密碼子之間的區(qū)域(泳道4-8)。隨著MazF(His)6濃度的升高，TP(r)條帶的強(qiáng)度逐漸降低，在MazF(His)6濃度為3.75μM時(shí)，TP(r)條帶幾乎完全消失了(泳道7)。令人驚奇的是，甚至在沒(méi)有70S核糖體時(shí)也檢測(cè)到了TP(F)條帶(泳道2)，這表明MazF能夠不依賴于70S核糖體與mRNA結(jié)合，或者M(jìn)azF是在A和C殘基之間切割的核糖核酸內(nèi)切酶(圖4A)。為了區(qū)別這些可能性，mazG mRNA與經(jīng)過(guò)酚抽提除去蛋白質(zhì)的MazF(His)6共同孵育，用于圖4B所示的引物延伸。即使在酚抽提以后還能夠觀察到TP(F)條帶(泳道2)，表明MazF(His)6的確切割mazG mRNA。當(dāng)MazE共同加入時(shí)，mazG mRNA的切割被再次阻斷(圖4C，泳道4-7)。注意(His)6MazE單獨(dú)地對(duì)于mRNA沒(méi)有可檢測(cè)到的作用(泳道2)。該結(jié)果表明MazE的抗毒性作用是由于對(duì)MazF核糖核酸內(nèi)切酶活性的抑制。在MazF(His)6之前加入70S核糖體，抑制了MazF(His)6對(duì)mRNA的切割，很可能是由于mazG mRNA中SD序列和ACA序列位置接近(圖6)。相反，RelE的毒性作用需要核糖體(Pedersen et al.，見前，(2003))。表I顯示了在檢查的不同mRNA轉(zhuǎn)錄物中的MazF切割序列。保守的切割序列加上了下劃線。 (YeeW第一行SEQ ID NO84；YeeW第二行SEQ ID NO90；EnvZSEQ ID NO91；lacZSEQ ID NO92)為了測(cè)定MazF切割的特異性，將mazG-mRNA的SD序列從GGAG突變?yōu)閁UUG，將起始密碼子AUG突變?yōu)镚UG或AGG。這些突變中沒(méi)有一個(gè)影響MazF(His)6對(duì)mazG mRNA的切割(圖7和圖8)。當(dāng)yeeW，envZ和lacZ的mRNA被用作底物時(shí)，每一個(gè)都在預(yù)期的mRNA轉(zhuǎn)錄物的ACA序列處被切割，而與SD序列和起始密碼子無(wú)關(guān)(表I)。在這些mRNA中，ACA序列的5′端是G、A或T，3′端是C或者T?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，對(duì)切割位點(diǎn)處具有UACAU序列的mazG mRNA進(jìn)行突變，使5′和3′端的U殘基突變?yōu)镚、A或C。這些突變中沒(méi)有一個(gè)影響切割(圖9)。但是，當(dāng)中央的ACA序列被改變?yōu)镚CA，CCA，TCA；AGA，ATA，AAA；ACC，ACG或ACT時(shí)，沒(méi)有觀察到切割(圖9)，表明MazF是一個(gè)高度序列特異的、識(shí)別ACA序列的核糖核酸內(nèi)切酶?？傊陨系慕Y(jié)果表明MazF作為高度序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶起作用，它在ACA位點(diǎn)處切割細(xì)胞mRNA，因而阻斷了細(xì)胞中全部蛋白質(zhì)的合成(圖2E)。為了進(jìn)一步測(cè)試這一發(fā)現(xiàn)，使用以阿拉伯糖誘導(dǎo)MazF之后的不同時(shí)間間隔提取的總細(xì)胞RNA進(jìn)行Northern印跡分析(Baker和Mackie，Mol Microbiol 47，75-88(2003)；Sarmientos et al.，Cell 32，1337-46(1983))。ompA和lpp mRNA都被降解(圖4C)。觀察到的這兩個(gè)mRNA的半壽期的差異與mRNA中存在的ACA序列的總數(shù)以及mRNA的長(zhǎng)度有關(guān)。例如322bp的lpp mRNA(Nakamura和Inouye，Cell 18，1109-17(1979))只有一個(gè)ACA序列，而1229bp的ompA mRNA(Movva et al.，J Mol Biol 143，317-28(1980))有21個(gè)ACA序列。這一相關(guān)性提示較長(zhǎng)的mRNA比較短的mRNA對(duì)MazF介導(dǎo)的切割更為敏感。有趣的是，在mazF ORF內(nèi)總共有9個(gè)ACA序列，其中4個(gè)簇集于ORF的中央，這提示mazF的表達(dá)可能被其自身的基因產(chǎn)物負(fù)地自調(diào)控。應(yīng)當(dāng)注意MazF(His)6能夠?qū)?6S和23S rRNA切割為較小的片段，而在(His)6MazE存在時(shí)此切割不能發(fā)生(圖10)。結(jié)論是，MazF是一個(gè)新型的核糖核酸內(nèi)切酶，它通過(guò)切割獨(dú)特的三聯(lián)體序列ACA而特異地抑制mRNA的功能。由于其干擾mRNA功能的能力，這類核糖核酸內(nèi)切酶在這里被命名為“mRNA干擾酶”。正如這里給出的結(jié)果所強(qiáng)調(diào)的，其他具有不同序列特異性的mRNA干擾酶也有可能存在。除了新發(fā)現(xiàn)的這類核糖核酸內(nèi)切酶，已知還有一些其他機(jī)制對(duì)mRNA的功能有干擾。這些機(jī)制中的一個(gè)涉及了micRNA(mRNA干擾性互補(bǔ)RNA)，它原來(lái)被作為是大腸桿菌中特異基因表達(dá)的RNA阻遏物(Mizuno et al，Proc Natl Acad Sci USA 81，1966-70(1984))。更近來(lái)一段時(shí)間，在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了類似的RNA元件，稱為miRNA(Zeng和Cullen，RNA 9，112-23(2003)和siRNA(Billy etal.，Proc Natl Acad Sci USA 98，14428-33(2001))。存在引人興趣的可能性，即這種通過(guò)mRNA干擾酶破壞mRNA功能的新機(jī)制(正如在本研究中對(duì)于大腸桿菌所證實(shí)的)也可能與真核生物有關(guān)。這對(duì)于許多(如果不是全部的)活的生物體的細(xì)胞生理學(xué)而言將有許多意義。而且，高度序列特異的mRNA干擾酶可以作為治療工具，用于治療人類疾病，以及作為生化工具進(jìn)行RNA的結(jié)構(gòu)研究。引人注意的是，2∶4MazE/MazF復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)最近被發(fā)表了(Kamada et al.，Mol Cell11，875-884(2003))。晶體結(jié)構(gòu)中儲(chǔ)存的信息可能幫助確定MazF如何特異地識(shí)別ACA序列并且切割之。
實(shí)施例II重要的是，在本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)之前，MazF的細(xì)胞靶標(biāo)還沒(méi)有被鑒定。正如這里所顯示的，MazF作為高度序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶起作用，它在ACA位點(diǎn)處切割細(xì)胞mRNA。這種活性可能在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)合成的部分或者全部抑制。依據(jù)四種核苷酸中的任何一種摻入到ACA序列中三個(gè)核苷酸位置的每一個(gè)位置的可能性是相同的原理進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算，基于這一標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算，ACA序列出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄物中的預(yù)測(cè)頻率是1/64。應(yīng)當(dāng)理解，與預(yù)測(cè)頻率比較，一些RNA轉(zhuǎn)錄物中包含較低或者較高頻率的ACA序列。因此，特定RNA轉(zhuǎn)錄物或者相關(guān)的RNA轉(zhuǎn)錄物家族對(duì)于被MazF核糖核酸內(nèi)切酶切割的敏感性取決于ACA序列或者M(jìn)azF靶序列在轉(zhuǎn)錄物中的頻率。而且，本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員能夠根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄物的序列預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄物對(duì)于MazF介導(dǎo)的切割的敏感性。
實(shí)施例III正如以上描述的，在大腸桿菌中，程序性細(xì)胞死亡被認(rèn)為是通過(guò)“上癮組件”系統(tǒng)介導(dǎo)的，所述組件系統(tǒng)的每一個(gè)由一對(duì)共同表達(dá)的基因組成，這對(duì)基因編碼穩(wěn)定的毒素和不穩(wěn)定的抗毒素。它們的表達(dá)通過(guò)毒素/抗毒素復(fù)合物或者只通過(guò)抗毒素自動(dòng)調(diào)控。當(dāng)共表達(dá)被抑制時(shí)，抗毒素被蛋白酶迅速降解，使毒素作用于其靶標(biāo)。在大腸桿菌中，染色體外元件是細(xì)菌程序性細(xì)胞死亡的主要遺傳系統(tǒng)。研究最多的染色體外上癮組件是噬菌體P1上的phd-doc(Lehnherr et al.(1993)J Mol Biol 233，414-428；Lehnherr和Yarmolinsky(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，3274-3277；Magnuson和Yarmolinsky(1998)J Bacteriol 180，6342-6351；Gazit和Sauer(1999)J BiolChem 274，16813-16818；Gazit和Sauer(1999)J Biol Chem274，2652-2657)，F(xiàn)因子上的ccdA-ccdB(Tam和Kline(1989)JBacteriol 171，2353-2360；Van Melderen et al.(1994)MolMicrobiol 11，1151-1157；Bahassi et al.(1999)J Biol Chem274，10936-10944；Loris et al.(1999)J Mol Biol 285，1667-1677；Afif et al.(2001)Mol Microbiol 41，73-82；Dao-Thi et al.(2002)J Biol Chem 277，3733-3742；Van Melderen(2002)Int J MedMicrobiol 291，537-544)，以及質(zhì)粒R100上的pemI-pemK(Tsuchimotoet al.(1988)J Bacteriol 170，1461-1466；Tsuchimoto和Ohtsubo.(1989)Mol Gen Genet 215，463-468；Tsuchimoto et al.(1992)JBacteriol 174，4205-4211；Tsuchimoto and Ohtsubo.(1993)MolGen Genet 237，81-88)。有趣的是，大腸桿菌染色體也含有幾種上癮組件系統(tǒng)，例如relBE系統(tǒng)和mazEF系統(tǒng)，它們?cè)谶@里以上有所描述。mazEF系統(tǒng)由兩個(gè)相鄰的基因mazE和mazF組成，位于大腸桿菌染色體上relA基因的下游。序列分析顯示它們與位于質(zhì)粒pR100上的pemI和pemK基因部分同源(Masuda et al.(1993)JBacteriol 175，6850-6856)。如上面的描述，mazEF系統(tǒng)表現(xiàn)出上癮組件的性質(zhì)MazF具有毒性而MazE具有抗毒性；MazF是穩(wěn)定的而MazE是在體內(nèi)被ATP依賴的ClpA絲氨酸蛋白酶降解的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(Aizenman et al.(1996)見前)；MazE和MazF共同表達(dá)，相互作用形成一個(gè)復(fù)合物；mazEF的表達(dá)被MazE和MazE-MazF復(fù)合物負(fù)地自調(diào)控(Marianovsky et al.(2001)J Biol Chem 276，5975-5984)。如這里上面所描述的，mazEF介導(dǎo)的細(xì)胞死亡可以被極端的氨基酸饑餓以及胸腺嘧啶饑餓所引發(fā)(Sat et al.(2003)見前)，被毒性蛋白Doc引發(fā)(Hazan et al.(2001)J Bacteriol 183，2046-2050)，以及被一些抗生素所引發(fā)，這些抗生素是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的一般性抑制劑，例如利福平、氯霉素和壯觀霉素(Sat et al.(2001)見前)。如下面所述，對(duì)MazE、MazF以及mazEF啟動(dòng)子DNA之間的相互作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了MazE中負(fù)責(zé)結(jié)合mazEF啟動(dòng)子DNA以及負(fù)責(zé)與MazF相互作用的功能性結(jié)構(gòu)域。證明，MazE在其N端具有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，MazE中的從38到75的區(qū)域?qū)τ诮Y(jié)合MazF是需要的，其中Leu55和Leu58殘基是必需的。這里給出的數(shù)據(jù)還提示溶液中的MazE-MazF復(fù)合物可以包含一個(gè)MazE二聚體和兩個(gè)MazF二聚體。材料和方法試劑和酶——核苷酸、氨芐青霉素以及卡那霉素來(lái)自Sigma。用于克隆的限制性內(nèi)切酶和DNA修飾酶來(lái)自New EnglandBiolabs。Pfu DNA聚合酶來(lái)自Stratagene。放射性的核苷酸來(lái)自Amersham Pharmacia Biotech。質(zhì)粒的構(gòu)建——使用大腸桿菌基因組DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出mazEF基因(包括其Shine-Dalgarno序列區(qū)域)，將其克隆到pET11a的XbaI-NheI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pET11a-EF。通過(guò)PCR擴(kuò)增出mazEF基因(包括其Shine-Dalgarno序列區(qū)域)，將其克隆到pET21cc的XbaI-XhoI位點(diǎn)中，形成按照閱讀框的翻譯，在MazF的C端有一個(gè)(His)6標(biāo)簽。該質(zhì)粒命名為pET21cc-EF(His)6。通過(guò)PCR擴(kuò)增出mazE基因，將其克隆到pET28a的NdeI-Hind III位點(diǎn)中。該質(zhì)粒命名為pET28a-(His)6E。MazE作為一個(gè)融合蛋白表達(dá)，N端有一個(gè)(His)6標(biāo)簽(命名為(His)6MazE)，之后有一個(gè)凝血酶切割位點(diǎn)。通過(guò)PCR產(chǎn)生全長(zhǎng)的mazE基因和各種不同的mazE基因N端與C端缺失構(gòu)建體(參見圖17)，并且克隆到pGAD-C1載體的EcoRI-PstI位點(diǎn)中，與Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域形成按照閱讀框的翻譯融合。這些質(zhì)粒被命名為pGAD-MazE，pGAD-MazEΔ(1-13)，pGAD-MazEΔ(1-24)，pGAD-MazEΔ(1-37)，pGAD-MazEΔ(1-46)，pGAD-MazEΔ(68-82)和pGAD-MazEΔ(76-82)。通過(guò)PCR產(chǎn)生全長(zhǎng)mazF基因以及各種不同的mazF基因N端與C端缺失構(gòu)建體，并且克隆到pGBD-C1載體的EcoRI-BglII位點(diǎn)中，與Gal4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成按照閱讀框的翻譯融合。這些質(zhì)粒被命名為pGBD-MazF，pGBD-MazFΔ(1-14)，pGBD-MazFΔ(1-25)，pGBD-MazFΔ(72-111)和pGBD-MazFΔ(97-111)。蛋白質(zhì)純化——將pET11a-EF引入到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。使用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)MazE和MazF的共表達(dá)4小時(shí)。離心收集細(xì)胞并使用弗氏壓碎器裂解。細(xì)胞裂解物在37攝氏度保存30分鐘以最大程度地降解MazE，8000g離心10分鐘以沉淀細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，之后10000g超速離心1小時(shí)以去除膜和不溶性級(jí)分。接下來(lái)通過(guò)硫酸銨分級(jí)、Sephadex G-100柱上的凝膠過(guò)濾、DEAE-Sepharose和羥基磷灰石柱層析來(lái)純化MazF?；旌喜饪s含有MazF蛋白的級(jí)分。通過(guò)使用SuperduxTM200柱(Pharmacia Biotech)的凝膠過(guò)濾使MazF進(jìn)一步純化。對(duì)于(His)6MazE的純化，將pET28a-(His)6E引入到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，并使用1mM IPTG誘導(dǎo)(His)6MazE表達(dá)4小時(shí)。立即用Ni-NTA(QIAGEN)親和層析純化(His)6MazE蛋白。也將pET21cc-EF(His)6引入到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。使用1mM IPTG誘導(dǎo)MazE和MazF(His)6的共表達(dá)4小時(shí)。MazE-MazF(His)6復(fù)合物立即用Ni-NTA(QIAGEN)親和層析純化，并進(jìn)一步用凝膠過(guò)濾純化。為了從純化的MazE-MazF(His)6復(fù)合物中純化MazF(His)6，在6M鹽酸胍中將純化的MazE-MazF(His)6復(fù)合物中的MazE與MazF(His)6解離。通過(guò)Ni-NTA樹脂(QIAGEN)重新捕獲MazF(His)6，并通過(guò)分步透析進(jìn)行重折疊。重折疊的產(chǎn)率大約是80％。使用大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)(Promega))，就蛋白質(zhì)合成抑制，測(cè)定MazF(His)6的生化活性。電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)——合成兩個(gè)單鏈的寡核苷酸，5′-GCTCGTATCTACAATGTAGATTGATATATACTGTATCTACATATGA TAGC-3′(SEQ ID NO12)和3′-CGAGCATAGATGTTACATCTAACTATATATGACATAGATGTATACTATCG-5′(SEQ ID NO13)，將其退火產(chǎn)生含有mazEF啟動(dòng)子序列的50-bp雙鏈DNA。該50-bpDNA片段經(jīng)T4多核苷酸激酶用[γ-32P]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，用于在EMSA中檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。結(jié)合反應(yīng)在4攝氏度進(jìn)行30分鐘，反應(yīng)體系20微升，含有純化的蛋白質(zhì)，2微升100微克/毫升的poly(dI-dC)和2微升標(biāo)記的DNA片段，結(jié)合緩沖液是50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇和5％甘油。在TAE緩沖液中，于100V，在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。電泳后，干燥凝膠，對(duì)X光片曝光。非變性PAGE——在結(jié)合緩沖液[50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2，1mM DTT和5％甘油]中，于4攝氏度混合不同量的(His)6MazE和MazF30分鐘，然后加入2×上樣溶液[40mM Tris-HCl(pH7.5)，80mM β-巰基乙醇，0.08％溴酚藍(lán)和8％甘油]至混合物中，然后上樣于非變性膠上。濃縮膠的組成是5％丙烯酰胺-雙丙烯酰胺(acrylamide-bis)(29∶1)，在62.5mM Tris-HCl(pH 7.5)中；分離膠的組成是10％丙烯酰胺-雙丙烯酰胺(29∶1)，在187.5mMTris-HCl(pH8.9)中。走樣緩沖液含有82.6mM Tris-HCl(pH 9.4)和33mM甘氨酸。于4攝氏度在恒定電壓(150V)下進(jìn)行電泳。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。通過(guò)tricine SDS-PAGE分辨低分子量的蛋白——根據(jù)以前描述的方法(Schagger和von Jagow，G.(1987)Anal Biochem166，368-379)進(jìn)行tricine SDS-PAGE，略有改動(dòng)如下濃縮膠，5％丙烯酰胺-雙丙烯酰胺(48∶1.5)，在0.75M Tris-HCl(pH 8.45)中，以及0.075％SDS；成層膠，10％丙烯酰胺-雙丙烯酰胺(48∶1.5)，在1.0M Tris-HCl(pH 8.45)中，以及0.1％SDS；分離膠，16.5％丙烯酰胺-雙丙烯酰胺(48∶1.5)，在1.0M Tris-HCl(pH 8.45)中，以及0.1％SDS。陽(yáng)極走樣緩沖液是0.2M Tris-HCl(pH 8.9)，陰極走樣緩沖液是0.1M Tris堿、0.1M tricine和0.1％SDS。在恒定電流(20毫安)下于室溫電泳后，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)呈現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。在酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測(cè)MazE-MazF相互作用——使用酵母雙雜交報(bào)告菌株P(guān)J69-4A[MATa trp1-901 leu2-3，112 ura3-52his3-200 gal4 gal80LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met::GAL7-lacZ]以及載體pGAD-C1和pGBD-C1，用于雙雜交分析(James et al.(1996)Genetics 144，1425-1436)。為了在MazE中定位MazF結(jié)合區(qū)域，在pGAD-C1中構(gòu)建了一系列的N端和C端缺失的mazE基因，并與pGBD-MazF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到PJ69-4A細(xì)胞中。參見圖17。為了在MazF中定位MazE結(jié)合區(qū)域，在pGBD-C1中構(gòu)建了一系列的N端和C端缺失的mazF基因，并與pGAD-MazE質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到PJ69-4A細(xì)胞中。通過(guò)監(jiān)測(cè)共轉(zhuǎn)化子在合成的dropout(SD)基本培養(yǎng)基(Clontech)(沒(méi)有Trp、Leu、His和腺嘌呤(Ade))上的生長(zhǎng)情況來(lái)進(jìn)行相互作用的檢測(cè)。該培養(yǎng)基中添加1mM 3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)，并于30攝氏度孵育5天。
0303]有關(guān)附圖的具體的方法學(xué)細(xì)節(jié)在圖11中，泳道的上樣如下泳道1，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2，MazE-MazF(His)6復(fù)合物；泳道3，MazF；泳道4，(His)6MazE。在圖12A和12B中，(His)6MazE和MazF按照所示的摩爾比混合。混合物在4攝氏度孵育30分鐘，然后進(jìn)行非變性PAGE。將對(duì)應(yīng)于復(fù)合物的凝膠切下來(lái)，在還原性緩沖液[20mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl和50mM β-巰基乙醇]中于室溫孵育30分鐘，然后進(jìn)行第二維的15％SDS-PAGE電泳。如下方的圖中的凝膠所顯示的，復(fù)合物中的(His)6MazE和MazF被分開。每一個(gè)泳道中相對(duì)蛋白量通過(guò)光密度測(cè)定法確定，使用(His)6MazE和MazF作為對(duì)照。在圖12A中，向20微升的2μM MazF溶液中加入不同量的(His)6MazE。泳道1-5，(His)6MazE∶MazF的比例分別是1∶1，2∶1，4∶1，6∶1和8∶1。在圖12B中，向20微升的2μM(His)6MazE溶液中加入不同量的MazF。泳道1-5，(His)6MazE∶MazF的比例分別是1∶2，1∶4，1∶6和1∶8。圖12A和12B上方的圖顯示了非變性PAGE的結(jié)果。箭頭a表明了(His)6MazE-MazF復(fù)合物的位置。圖12A和12B下方的圖顯示了第二維電泳的SDS-PAGE結(jié)果。純化的(His)6MazE(40pmol)和MazF(40pmol)上樣于第一和第二泳道作為對(duì)照。在圖13中，通過(guò)使用Superdex 200柱的凝膠過(guò)濾確定了MazF和MazE-MazF(His)6復(fù)合物的分子量。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線包括了甲狀腺球蛋白(669kDa)，脫鐵鐵蛋白(443kDa)，β-淀粉酶(200kDa)，BSA(66kDa)，卵清蛋白(45kDa)和碳酸酐酶(29kDa)。標(biāo)準(zhǔn)曲線上的垂直箭頭表明了MazF和MazE-MazF(His)6復(fù)合物的位置。在圖14A，14B，和14C中，將含有mazEF啟動(dòng)子區(qū)域的[32P]-標(biāo)記的50-bp DNA片段與濃度不斷增加的(His)6MazE共同孵育(圖14A)，與濃度不斷增加的MazF共同孵育(圖14B)，或者以1∶2的恒定(His)6MazE/MazF比例與濃度不斷增加的(His)6MazE和MazF共同孵育(圖14C)。在圖15中，使用ClustalW程序進(jìn)行比對(duì)分析。在8個(gè)不同的蛋白質(zhì)中，相同的殘基用黑框表示。相似的殘基用灰框表示。引入了間隙(用長(zhǎng)劃號(hào)表示)，以使比對(duì)最優(yōu)化。序列有耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)的MazE(GenBank登錄編號(hào)NP_294139)；耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)的MazE(GenBank登錄號(hào)NP_244587)；質(zhì)粒R100上的PemI(GenBank登錄號(hào)NP_052993)；質(zhì)粒R466b上的PemI(GenBank登錄號(hào)AAC82515)；大腸桿菌的MazE(GenBank登錄號(hào)NP_289337)；大腸桿菌的ChpB(GenBank登錄號(hào)NP_290856)；惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)KT2440的MazE(GenBank登錄號(hào)NP_742931)；Photobacterium profundum的MazE(GenBank登錄號(hào)AAG34554)。數(shù)字對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基的位置。在圖16A和16B中，通過(guò)EMSA，使用50bp的[32P]標(biāo)記的含有mazEF啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段測(cè)定蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。在圖16A中，DNA片段與1μM所示的每一種復(fù)合物在20μl的混合物中于4攝氏度孵育30分鐘。泳道1，無(wú)蛋白的對(duì)照；泳道2，MazE-MazF(His)6復(fù)合物；泳道3，MazE(K7A)-MazF(His)6復(fù)合物；泳道4，MazE(R8A)-MazF(His)6復(fù)合物；泳道5，MazE(S12A)-MazF(His)6復(fù)合物；泳道6，MazE(R16A)-MazF(His)6復(fù)合物；泳道7，MazE(I43N)-MazF(His)6復(fù)合物；泳道8，MazE(E57Q)-MazF(His)6復(fù)合物。在圖16B中，DNA片段與4μM所示的(His)6MazE或者(His)6MazE突變體在20μl的混合物中于4攝氏度孵育30分鐘。泳道1，無(wú)蛋白的對(duì)照；泳道2，野生型(His)6MazE蛋白；泳道3，(His)6MazE(K7A)突變體；泳道4，(His)6MazE(R8A)突變體；泳道5，(His)6MazE(S12A)突變體；泳道6，(His)6MazE(R16A)突變體。在圖17中，在pGAD-C1中構(gòu)建全長(zhǎng)的mazE基因和截短的mazE基因。數(shù)字指的是MazE中氨基酸的位置，這些質(zhì)粒與pGBD-MazF共同轉(zhuǎn)化酵母PJ69-4A細(xì)胞。在SD培養(yǎng)基(Clontech)平板(含有1mM3-AT，沒(méi)有Trp、Leu、His和Ade)上檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。+，表示在5天內(nèi)形成的可見的菌落；-表示5天內(nèi)沒(méi)有形成可見的菌落。在圖18A中，通過(guò)非變性PAGE測(cè)定了MazF和(His)6MazE或者(His)6MazE突變體之間的相互作用。泳道1，野生型(His)6MazE；泳道2，MazF；泳道3，野生型(His)6MazE和MazF；泳道4，(His)6MazE L55A/L58A突變體和MazF；泳道5，(His)6MazER48A突變體和MazF；泳道6，(His)6MazE E57Q突變體和MazF；泳道7，(His)6MazE F53A突變體和MazF。在圖18B中，通過(guò)EMSA，使用50bp的[32P]標(biāo)記的含有mazEF啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段測(cè)定MazF和(His)6MazE或者(His)6MazE L55A/L58A突變體之間的相互作用。泳道1，無(wú)蛋白的對(duì)照；泳道2，4μM野生型(His)6MazE；泳道3，4μM(His)6MazEL55A/L58A突變體；泳道4，2μM野生型(His)6MazE和4μM MazF；泳道5，2μM(His)6MazE L55A/L58A突變體和4μM MazF。圖19描繪了MazE-MazF復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)，在該圖中顯示了對(duì)于MazE功能必需的保守氨基酸殘基。只顯示了MazF2-MazE2-MazF2復(fù)合物的一部分，其中一個(gè)MazE分子(藍(lán)色)與MazF同源二聚體的兩個(gè)MazF分子(紫色和紅色)相互作用。在MazE分子中，N-box和Hp-box分別用綠色和黃色表示。顯示出N-box中的Lys7、Arg8、Ser12和Arg16的位置，以及Hp-box中的Leu55和Leu58的位置。正如這里所顯示的，這些替代突變導(dǎo)致了MazE功能的喪失。結(jié)果MazE和MazF可以以1∶2的比例形成復(fù)合物。純化的MazE-MazF(His)6，MazF和(His)6MazE的tricine SDS-PAGE圖樣分別在圖11的泳道2、3和4中顯示。(His)6MazE和MazF的大小分別與理論分子量11.4kDa和12.0kDa相符(圖11，泳道3和4)。MazE-MazF(His)6復(fù)合物分開成了9.3kDa的MazE和13.2kDa的MazF(His)6(圖11，泳道2)，使用光密度測(cè)定儀確定MazF(His)6與MazE的比例約為2。將(His)6MazE和MazF混合在一起進(jìn)行非變性PAGE時(shí)，在靠近膠頂部的位置出現(xiàn)了一個(gè)新的條帶(圖12中的位置a)。將對(duì)應(yīng)于新條帶的凝膠切下來(lái)，在還原緩沖液[20mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM NaCl和50mM β-巰基乙醇]中于室溫孵育30分鐘，然后將膠置于SDS-PAGE凝膠的頂部，進(jìn)行第二維的電泳，以分析蛋白質(zhì)組分。在使用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色之后，觀察到對(duì)應(yīng)于(His)6MazE和MazF的兩條帶，在SDS-PAGE上(His)6MazE的遷移比MazF的遷移要慢。這些結(jié)果證明新的條帶是包含(His)6MazE和MazF的復(fù)合物。如果從非變性PAGE上切下來(lái)的凝膠沒(méi)有在還原緩沖液中處理，則SDS-PAGE后觀察到3個(gè)蛋白質(zhì)條帶，即(His)6MazE，MazF和MazF二聚體(數(shù)據(jù)未顯示)。在非變性PAGE中，經(jīng)純化的MazF有三條帶，但是使用HPLC檢測(cè)純化的MazF蛋白只觀察到一個(gè)峰(數(shù)據(jù)未顯示)。進(jìn)行其他的實(shí)驗(yàn)以確定在復(fù)合物中(His)6MazE與MazF的比例是否是穩(wěn)定的。如圖12A所示，向含有恒定濃度的MazF(2μM)的相同溶液中加入不同量的(His)6MazE，產(chǎn)生一系列溶液，其中(His)6MazE∶MazF的比例從1∶1，到2∶1，到4∶1，到6∶1，到8∶1。如圖12B所示，向含有恒定濃度的(His)6MazE(2μM)的相同溶液中加入不同量的MazF，產(chǎn)生一系列溶液，其中(His)6MazE∶MazF的比例是1∶1，1∶2，1∶4，1∶6和1∶8。以上混合物在4攝氏度孵育30分鐘，用非變性PAGE進(jìn)行分析。將對(duì)應(yīng)于新條帶(位置a)的凝膠切下來(lái)，在還原緩沖液中于室溫孵育30分鐘，然后進(jìn)行15％SDS-PAGE。第二維的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色以檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。每一個(gè)泳道中的相對(duì)蛋白質(zhì)含量使用光密度儀測(cè)定，純化的(His)6MazE和MazF作為對(duì)照。當(dāng)所述混合物中(His)6MazE或者M(jìn)azF過(guò)量時(shí)，復(fù)合物中MazF與(His)6MazE的比例幾乎保持恒定在1.8(圖12)。如上提及，MazE-MazF(His)6復(fù)合物通過(guò)tricine SDS-PAGE分離為MazE和MazF(His)6，MazF(His)6對(duì)MazE的比例大約為2(圖11，泳道2)。通過(guò)使用SuperduxTM200柱(Pharmacia Biotech)的凝膠過(guò)濾測(cè)定純化的MazE-MazF(His)6復(fù)合物和MazF的分子量為76.9kDa和27.1kDa(圖13)。從MazE-MazF(His)6復(fù)合物中純化出MazF(His)6。MazF(His)6能夠抑制大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)，Promega)中的蛋白質(zhì)合成，而蛋白質(zhì)的合成通過(guò)同時(shí)加入(His)6MazE而被拯救(數(shù)據(jù)未顯示)。使用光散射測(cè)定MazF(His)6的分子量為28.3kDa，提示MazF(His)6以二聚體形式存在。MazE的結(jié)構(gòu)被證明是二聚體(Lah et al.(2003)J Biol Chem278，14101-14111)。因此，MazE-MazF(His)6復(fù)合物(76.9kDa)可能由一個(gè)MazE二聚體(預(yù)測(cè)分子量為18.6kDa，因?yàn)镸azE的分子量是9.3kDa)和兩個(gè)MazF(His)6二聚體(56.6kDa)組成。MazF提高了MazE與mazEF啟動(dòng)子的結(jié)合——根據(jù)這里的描述制備50bP的mazEF啟動(dòng)子片段，通過(guò)T4多核苷酸激酶用[γ-32p]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記。使用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)，分別測(cè)定(His)6MazE、MazF和MazE-MazF(His)6復(fù)合物與mazEF啟動(dòng)子DNA片段結(jié)合的能力。2μM或者更高濃度的(His)6MazE能夠使mazEF啟動(dòng)子片段發(fā)生移動(dòng)(圖14A，泳道7)。(His)6MazE濃度為0.4-1.0μM時(shí)，未觀察到不連續(xù)的遷移率改變的條帶，盡管DNA片段的信號(hào)向上開始變得模糊不清(圖14A，泳道3-6)，表明在這些濃度下形成了一些不穩(wěn)定的(His)6MazE-DNA復(fù)合物。(His)6MazE濃度為2-20μM時(shí)，觀察到不連續(xù)的遷移率改變的復(fù)合物，它們?cè)诟邼舛鹊?His)6MazE下移動(dòng)更為緩慢(圖14A，泳道7-12)，提示在較高濃度的MazE存在下與DNA片段結(jié)合的(His)6MazE分子的數(shù)目增加。很可能在50bp的mazEF啟動(dòng)子片段中有一個(gè)以上的(His)6MazE結(jié)合位點(diǎn)。與此相反，即使在20μM的濃度時(shí)，MazF蛋白也不能夠結(jié)合50bp的mazEF啟動(dòng)子DNA(圖14B)。增加(His)6MazE和MazF蛋白的量，同時(shí)將(His)6MazE/MazF的比例保持恒定為1∶2。與(His)6MazE單獨(dú)加入相比，MazF顯著提高了(His)6MazE與mazEF啟動(dòng)子的結(jié)合。在這些條件下，50bp的mazEF啟動(dòng)子片段在(His)6MazE的濃度低到0.2μM時(shí)發(fā)生移動(dòng)(圖14C)，更高濃度的(His)6MazE-MazF復(fù)合物存在下觀察到超級(jí)遷移，這表明在較高的濃度下更多的(His)6MazE-MazF復(fù)合物結(jié)合到DNA片段上，證明在mazEF啟動(dòng)子中有多個(gè)(His)6MazE-MazF復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)。MazE同源物中的保守氨基酸序列——通過(guò)BLAST搜索找到了MazE的同源物，它們氨基酸序列的比對(duì)在圖15中顯示。盡管通常，MazE在細(xì)菌中并不是高度保守的，但是在MazE同源物中仍有保守的區(qū)域。首先，MazE的N端區(qū)域比MazE中的其他區(qū)域更為保守。MazE是一個(gè)pI為4.7的酸性蛋白，但是其N端區(qū)域仍有少許幾個(gè)保守的堿性殘基(K7，R8和R16)，被稱為N-box(圖15)。因?yàn)镸azE能夠結(jié)合mazEF啟動(dòng)子DNA，所以N-box可能負(fù)責(zé)DNA的結(jié)合。第二，有一個(gè)保守的C端區(qū)域，稱為Hp-box(圖15)，它含有幾個(gè)保守的疏水殘基。MazE的N-box負(fù)責(zé)MazE以及MazE-MazF復(fù)合物與DNA的結(jié)合——在質(zhì)粒pET21cc-EF(His)6中的mazE基因中構(gòu)建多種不同的定點(diǎn)突變，將N-box中的保守氨基酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)锳la。純化由MazE突變體蛋白和MazF(His)6形成的復(fù)合物。通過(guò)EMSA分別檢測(cè)這些復(fù)合物與mazEF啟動(dòng)子結(jié)合的能力。如圖16A所示，由在N-box中具有突變(K7A，R8A，S12A或者R16A)的MazE突變體與MazF(His)6形成的復(fù)合物不能結(jié)合mazEF啟動(dòng)子DNA(圖16A，泳道3，4，5和6)。但是在N-box以外的保守氨基酸的替換突變，例如MazE，不影響包含這些突變蛋白的復(fù)合物與DNA結(jié)合的能力(圖16A，分別是泳道7和8)。在質(zhì)粒pET28a-(His)6E中的mazE基因中還構(gòu)建了其他替換突變。所有在N-box中具有替換突變(K7A，R8A，S12A或者R16A)的(His)6MazE突變體喪失了其結(jié)合DNA的能力(分別對(duì)應(yīng)于圖16B，泳道3，4，5和6)，而野生型的(His)6MazE保持了其結(jié)合mazEF啟動(dòng)子的能力(圖16B，泳道2)。相反，在N-Box以外發(fā)生替換突變(R48A，F(xiàn)53A，L55A/L58A和E57Q)的(His)6MazE突變體能夠與mazEF啟動(dòng)子DNA結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明MazE-MazF復(fù)合物的DNA結(jié)合能力是由于復(fù)合物中的MazE蛋白，而N-box負(fù)責(zé)MazE與DNA的結(jié)合。MazE和MazF之間的相互作用——進(jìn)行酵母雙雜交檢測(cè)檢查MazE和MazF之間的相互作用。為了證明MazE中哪一個(gè)區(qū)域?qū)τ谄渑cMazF的相互作用是必需的，通過(guò)PCR產(chǎn)生全長(zhǎng)的mazE基因和mazE基因的各種不同的N端及C端缺失構(gòu)建體(參見圖17)，將它們克隆到pGAD-C1載體的EcoRI-PstI位點(diǎn)中，與Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域形成按照閱讀框的翻譯融合，這些質(zhì)粒中的每一個(gè)都與pGBD-MazF共轉(zhuǎn)化到PJ69-4A酵母細(xì)胞中。帶有pGAD-MazE，pGAD-MazEΔ(1-13)，pGAD-MazEΔ(1-24)，pGAD-MazEΔ(1-37)或pGAD-MazEΔ(76-82)與pGBD-MazF的共轉(zhuǎn)化子能夠在缺少Trp、Leu、His和Ade的合成培養(yǎng)基(SD培養(yǎng)基，Clontech)上生長(zhǎng)，而帶有pGAD-MazEΔ(1-46)或pGAD-MazEΔ(68-82)與pGBD-MazF的共轉(zhuǎn)化子不能夠生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)證明全長(zhǎng)的MazE、MazEΔ(1-13)、MazEΔ(1-24)、MazEΔ(1-37)和MazEΔ(76-82)能夠與MazF相互作用，而進(jìn)一步的N端缺失突變體MazEΔ(1-46)和進(jìn)一步的C端缺失突變體MazEΔ(68-82)不能。這些結(jié)果表明MazE的38-75殘基的區(qū)域負(fù)責(zé)與MazF的相互作用。在pGBD-C1中構(gòu)建一系列從MazF的C末端和N末端的截短突變體，并與pGAD-MazE共轉(zhuǎn)化到PJ69-4A細(xì)胞中。所有的這些共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞都不能在在缺少Trp、Leu、His和Ade的完全合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明所有這些MazF突變體都不能與MazE相互作用。因此MazF的N端和C端區(qū)域可能都參與了與MazE的相互作用，或者產(chǎn)生的缺失突變破壞了對(duì)與MazE相互作用有利的MazF的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。在質(zhì)粒pET28a-(His)6E中還產(chǎn)生了定點(diǎn)突變，以構(gòu)建(His)6MazE R48A、F53A、L55A/L58A和E57Q突變體。用非變性PAGE檢查用這些(His)6MazE突變體和MazF的復(fù)合物形成。如圖18A所示，(His)6MazE突變體R48A、F53A和E57Q能夠與MazF形成復(fù)合物(分別如圖18A泳道5，6和7所示)，而(His)6MazE L55A/L58A突變體不能與MazF形成復(fù)合物(圖18A泳道4)。使用EMSA證明野生型(His)6MazE和(His)6MazE L55A/L58A突變體能夠結(jié)合mazEF啟動(dòng)子DNA(分別示于圖18B，泳道2和3)。加入MazF時(shí)，野生型(His)6MazE能夠與MazF相互作用形成復(fù)合物，與僅僅使用野生型(His)6MazE的游道(圖18B，泳道2)相比在靠近凝膠頂部的位置產(chǎn)生了超級(jí)移動(dòng)的條帶(圖18B，泳道4)。但是向(His)6MazE L55A/L58A中加入MazF不能造成出現(xiàn)超級(jí)移動(dòng)的DNA片段，確證了(His)6MazE L55A/L58A突變體不能與MazF相互作用形成復(fù)合物。討論大腸桿菌中的mazEF上癮系統(tǒng)由兩個(gè)基因mazE和mazF組成，它們分別編碼不穩(wěn)定的抗毒素MazE和穩(wěn)定的毒素MazF。MazF的毒性作用由ppGpp激活，ppGpp是應(yīng)對(duì)氨基酸饑餓(Aizenman et al.(1996)見前)，由于某些抗生素(Sat et al.(2001)見前)，以及由于毒性蛋白Doc(Hazan et al.(2001)見前)而由RelA蛋白產(chǎn)生的信號(hào)。在這些情況下，不穩(wěn)定的MazE的降解導(dǎo)致了游離的穩(wěn)定MazF的出現(xiàn)，MazF可以對(duì)細(xì)胞施加毒性作用。因此對(duì)MazE的細(xì)胞濃度的調(diào)控是細(xì)胞死亡的主要決定因素。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)與MazF形成復(fù)合物，MazE抑制了MazF的毒性作用。而且，MazE還通過(guò)與mazEF啟動(dòng)子的結(jié)合，參與mazEF表達(dá)的自調(diào)控(Marianovsky et al.(2001)見前)。正如這里所示的，MazE包含至少兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和MazF結(jié)合結(jié)構(gòu)域。融合蛋白(His)6MazE能夠與MazF相互作用并且結(jié)合在mazEF啟動(dòng)子上。與MazF相似，MazF(His)6形成二聚體，抑制體外蛋白質(zhì)合成，這種蛋白質(zhì)合成的抑制通過(guò)同時(shí)加入(His)6MazE而被挽救(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在體外，與野生型MazE和MazF相比，His標(biāo)記的融合蛋白看起來(lái)表現(xiàn)出相似的功能活性。使用高度純化的(His)6MazE和MazF，證明了(His)6MazE能夠自身結(jié)合mazEF啟動(dòng)子，這個(gè)相互作用通過(guò)加入MazF而被增強(qiáng)。實(shí)際上，MazF使(His)6MazE與mazEF啟動(dòng)子DNA的結(jié)合增強(qiáng)了10倍以上。在更高濃度的(His)6MazE或者(His)6MazE-MazF復(fù)合物下，在電泳遷移率變動(dòng)分析中觀察到超級(jí)移動(dòng)的包含mazEF啟動(dòng)子DNA的復(fù)合物，表明(His)6MazE和(His)6MazE-MazF復(fù)合物在mazEF啟動(dòng)子DNA上都有一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)。值得注意的是，以前的研究提示在mazEF啟動(dòng)子區(qū)域中可能有三個(gè)MazE結(jié)合位點(diǎn)(Lah et al.(2003)J Biol Chem 278，14101-14111)。有趣的是，由EMSA觀察到的條帶并不是逐步移動(dòng)的。在MazE的保守N-box中的定點(diǎn)突變(K7A、R8A、S12A和R16A)破壞了(His)6MazE和MazE-MazF(His)6復(fù)合物的DNA結(jié)合能力(圖16)，提示MazE負(fù)責(zé)MazE-MazF(His)6復(fù)合物的DNA結(jié)合能力，而且在MazE中的高度保守的N端區(qū)域是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。進(jìn)行酵母雙雜交檢測(cè)以確定負(fù)責(zé)MazE-MazF相互作用的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)與MazF結(jié)合需要MazE C端的殘基38到75。值得注意的是，MazE中有一個(gè)保守的C端區(qū)域，稱為Hp-box，它富含疏水殘基。MazEHp-box中保守氨基酸Leu55和Leu58的突變(L55A/L58A)破壞了(His)6MazE和MazF之間的相互作用。酵母雙雜交試驗(yàn)還表明MazF蛋白的整個(gè)結(jié)構(gòu)對(duì)于其與MazE的相互作用可能是必需的，因?yàn)閺腗azF的N末端或者C末端的缺失破壞了MazE和MazF之間的相互作用。通過(guò)凝膠過(guò)濾測(cè)定出MazE-MazF(His)6復(fù)合物的分子量為76.9kD。純化的MazE-MazF(His)6復(fù)合物進(jìn)行tricine SDS-PAGE電泳時(shí)，發(fā)現(xiàn)MazE與MazF(His)6的比例大約是1∶2(圖11，泳道2)。即使在過(guò)量(His)6MazE或MazF的存在下，在(His)6MazE-MazF復(fù)合物中MazE與MazF的比例仍然穩(wěn)定地保持在大約1∶1.8(圖12)。由于MazE(Lah et al.(2003)見前)和MazF(His)6均以二聚體形式存在，所以MazE-MazF(His)6復(fù)合物(76.9kDa)可能由一個(gè)MazE二聚體(預(yù)測(cè)其大小約為18.6kD，因?yàn)镸azE的分子量是9.3kD)和兩個(gè)MazF(His)6二聚體(預(yù)測(cè)其大小約為56.6kDa，因?yàn)镸azF(His)6二聚體的分子量是28.3kDa)組成。如上所述，Kamada等人((2003)見前)測(cè)定了MazE-MazF復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。MazE-MazF復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)在幾個(gè)方面確證了這里所列的結(jié)果，包括1)發(fā)現(xiàn)MazE和MazF形成一個(gè)2∶4的異源六聚體，由交替的MazF和MazE同源二聚體組成(MazF2-MazE2-MazF2)。重要的是注意，MazE和MazF之間按照2∶4的化學(xué)計(jì)量形成的復(fù)合物看上去是非常穩(wěn)定的，因?yàn)樵?His)6MazE-MazF復(fù)合物中(His)6MazE和MazF的比例不因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)中哪個(gè)大大過(guò)量而發(fā)生改變(圖12)。2)MazE的C端區(qū)域與MazE-MazF復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的MazF同源二聚體相互作用。本研究中發(fā)現(xiàn)的Hp-box參與了表面上看來(lái)最穩(wěn)定的MazE和MazF之間的界面(圖19)。3)根據(jù)MazE和其他上癮組件解毒劑的相似性，以及MazE和MazF的靜電表面上堿性區(qū)域的分布，Kamada等人((2003)見前)提出MazE中的Lys7和Arg8是MazE-MazF復(fù)合物中的首要DNA錨定位點(diǎn)。正如這里所證明的，(His)6MazE以及MazE-MazF(His)6復(fù)合物的DNA結(jié)合能力不僅僅由于Lys7和Arg8的定點(diǎn)突變而被破壞，而且還因?yàn)镹-box內(nèi)的其他保守氨基酸殘基(Ser12和Arg16)的突變而被破壞(圖19)。很可能的是，由于MazE以二聚體存在，因而MazE二聚體中的兩個(gè)N-box一同參與了與DNA的結(jié)合。
實(shí)施例IV如這里所示，由“pemI-pemK上癮組件”編碼的毒素--純化的PemK蛋白，抑制了大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的合成，而加入抗PemK的抗毒素PemI恢復(fù)了蛋白質(zhì)的合成。進(jìn)一步的研究顯示PemK是一個(gè)序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，它切割mRNA，抑制蛋白質(zhì)合成，而PemI阻斷了PemK的核糖核酸內(nèi)切酶活性。正如這里所描述的，PemK對(duì)單鏈RNA的切割優(yōu)選出現(xiàn)在UAX序列(其中X是C、A或U)中A核苷酸的5′或3′端。在誘導(dǎo)之后，PemK切割細(xì)胞mRNA，有效地阻斷了大腸桿菌中蛋白質(zhì)的合成。因此，本發(fā)明證明了PemK通過(guò)在特異位點(diǎn)切割mRNA，干擾mRNA的作用。因此，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了PemK是一個(gè)新型的核糖核酸內(nèi)切酶，在這里將其命名為“mRNA干擾酶”。已經(jīng)在許多細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了PemK同源物。
提出PemK及其同源物形成一個(gè)新型核糖核酸內(nèi)切酶家族，它們通過(guò)序列特異的方式切割細(xì)胞mRNA，而干擾mRNA的功能。還請(qǐng)參見圖33和34。材料和方法菌株和質(zhì)粒根據(jù)這里的描述使用大腸桿菌BL21(DE3)和BW25113細(xì)胞。使用質(zhì)粒R100作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增pemIK基因，將其克隆到pET21cc(Novagen)的NdeI-XhoI位點(diǎn)中，在PemK的C端與(His)6標(biāo)簽融合產(chǎn)生按照閱讀框的翻譯。將該質(zhì)粒命名為pET21cc-IK(His)6。將pemI基因克隆到pET28a(Novagen)的NdeI-BamHI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pET28a-(His)6I。PemI作為一個(gè)融合蛋白表達(dá)，其N端有(His)6標(biāo)簽，之后是凝血酶切割位點(diǎn)，其被稱為(His)6PemI。pemK基因被克隆到pBAD(Guzman et al.(1995)JBacteriol 177，4121-4130)，產(chǎn)生質(zhì)粒pBAD-K。大腸桿菌mazG基因克隆到pET11a(New England Biolabs)的NdeI-BamHI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pET11a-MazG。mazG基因克隆到pINIII載體(Nakano et al.(1987)J Virol 61，302-307)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pIN-MazG。大腸桿菌era基因克隆到pET28a的ScaI-XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pET28a-Era。era基因也克隆到pINIII載體中產(chǎn)生質(zhì)粒pIN-Era。蛋白質(zhì)純化對(duì)于(His)6PemI的純化，將pET28a-(His)6I引入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，使用1mM IPTG誘導(dǎo)(His)6PemI的表達(dá)4小時(shí)。使用Ni-NTA(QIAGEN)純化(His)6PemI蛋白。將pET21cc-IK(His)6也引入到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。在1mM IPTG誘導(dǎo)下，PemI和PemK(His)6共表達(dá)4小時(shí)。使用Ni-NTA(QIAGEN)純化PemI-PemK(His)6復(fù)合物。為了從PemI-PemK(His)6復(fù)合物中純化PemK(His)6，將PemI-PemK(His)6復(fù)合物在5M鹽酸胍中解離，從PemK(His)6上釋放PemI。用Ni-NTA樹脂(QIAGEN)重新捕獲PemK(His)6，然后洗脫并且通過(guò)分步透析重折疊。體內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA合成的檢測(cè)含有pBAD-K的大腸桿菌BW25113在改良的M9培養(yǎng)基(加入0.5％甘油，沒(méi)有葡萄糖，以及每種1mM的氨基酸混合物，沒(méi)有甲硫氨酸)中生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％，誘導(dǎo)PemK的表達(dá)。在所示的時(shí)刻取出細(xì)胞培養(yǎng)物(1毫升)，與5uCi[35S]-甲硫氨酸混合(用于分析蛋白質(zhì)的合成)或者與2uCi甲基-3H-胸腺嘧啶(用于分析DNA的合成)混合。37攝氏度摻入1分鐘后，根據(jù)以前的描述測(cè)定DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的速率(Pedersen et al.(2002)Mol Microbiol45，501510)。為了制備用于分析總細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的SDS-PAGE分析的樣品，在所示的不同時(shí)刻取出500微升[35S]-甲硫氨酸摻入反應(yīng)混合物，加入到含有25微升100％TCA和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的預(yù)冷試管中。離心收集細(xì)胞沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE后自顯影。引物延伸分析使用T7引物(5′-AGATCTCGATCCCGCAAATTAAT-3′)(SEQ ID NO14)和G6引物(5′-TTAGAGATCAATTTCCTGCCGTTTTAC-3′)(SEQ ID NO15)，以pET11a-MazG作為模板，PCR擴(kuò)增出含有T7啟動(dòng)子和mazG基因的DNA片段。使用同上的T7引物和E5引物(5′-TTAAAGATCGTCAACGTAACCG-3′)(SEQ IDNO16)，以pET28a-Era為模板，PCR擴(kuò)增出包含T7啟動(dòng)子和era基因的另一個(gè)DNA片段。使用T7大規(guī)模轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)，從這兩個(gè)DNA片段中分別制備mazG mRNA和era mRNA。使用PemK(His)6，部分切割RNA底物，37攝氏度作用15分鐘。切割反應(yīng)混合物(20微升)含有4微克RNA底物，0.2微克PemK(His)6，1微升RNA酶抑制劑，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl和1mM DTT。部分切割產(chǎn)物使用RNAeasy柱(QIAGEN)純化，去除PemK(His)6蛋白。使用引物G1(5′-TGCTCTTTATCCCACGGGCAGC-3′)(SEQ ID NO17)，G2(5′-GCCCAGTTCACCGCGAAGATC GTC-3′)(SEQ ID NO18)，G3(5′-GGTTTTGATTTGCTCCCAACGGGCAAG-3′)(SEQ ID NO19)，G4(5′-CATTTCCT CCTCCAGTTTAGCCTGGTC-3′)(SEQ ID NO20)，和G5(5′-TTGCCAGACTTCTTCCATTGTTTCG AG-3′)(SEQ ID NO21)進(jìn)行mazG RNA的引物延伸分析；使用引物E1(5′-GATCCCCACAATGCGGTGACGAGT-3′)(SEQ ID NO22)，E2(5′-CACGTTGTCCACTTTGTTCACC GC-3′)(SEQ IDNO23)，E3(5′-CAGTTCAGCGCCGAGGAAACGCAT-3′)(SEQ ID NO24)，和E4(5′-GCGTTCGTCG TCGGCCCAACCGGA-3′)(SEQ ID NO25)進(jìn)行era RNA的引物延伸分析。使用T4多核苷酸激酶，對(duì)引物的5′端標(biāo)記[γ-32P]ATP。引物延伸反應(yīng)在42攝氏度進(jìn)行1小時(shí)。除了PemK(His)6不加入到切割反應(yīng)混合物中以外，使用相同條件進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。引物延伸產(chǎn)物在6％的測(cè)序凝膠上分析，在產(chǎn)物的旁邊是使用相同引物制備的DNA測(cè)序梯度條帶。合成的RNA被PemK切割30個(gè)堿基的RNA 5′-UAAGAAGGAGAUA UACAUAUGAAUCAAAUC-3′(SEQID NO11)，反義RNA 5′-GAUUUGAUUCAUAUGUAUAU CUCCUUCUUA-3′(SEQID NO26)以及互補(bǔ)DNA5′-GATTTGATTCATATGTATATC TCCTTCTTA-3′(SEQ ID NO27)商業(yè)合成。使用T4多核苷酸激酶，對(duì)30堿基的RNA5′端標(biāo)記[γ-32P]ATP，將其作為PemK(His)6的底物。30個(gè)堿基的RNA切割產(chǎn)物上樣于20％測(cè)序膠上(含有7M尿素)，同時(shí)上一個(gè)RNA梯度條帶，它是根據(jù)以前的描述(Smith and Roth.(1992)J Biol Chem267，15071-15079)，通過(guò)對(duì)5′端標(biāo)記的30堿基RNA進(jìn)行部分堿性水解得到的。根據(jù)以前的描述(Zhang et al.(2003)同上)，測(cè)定RNA-RNA雙鏈和RNA-DNA雙鏈的形成對(duì)PemK介導(dǎo)的RNA切割的影響。PemK在體內(nèi)對(duì)mRNA的作用的Northern印跡和引物延伸分析將pIN-MazG和pIN-Era質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到包含pBAD-K的大腸桿菌BW25113細(xì)胞中，分別產(chǎn)生BW25113/pBAD-K/pIN-MazG和BW25113/pBAD-K/pIN-Era菌株。細(xì)胞在含有氨芐青霉素(50ug/ml)和氯霉素(20ug/ml)的LB培養(yǎng)基上37攝氏度生長(zhǎng)。OD600數(shù)值達(dá)到0.4時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)mazG或者era mRNA的合成。在37攝氏度繼續(xù)孵育30分鐘后，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％，誘導(dǎo)PemK的表達(dá)。PemK誘導(dǎo)后在不同的時(shí)間間隔取樣。根據(jù)以前的描述(Sarmientos et al.(1983)Cell 32，1337-1346)，使用熱苯酚法提取總細(xì)胞RNA。使用含有全長(zhǎng)mazG或者era基因ORF的DNA片段分別制備兩個(gè)放射性標(biāo)記的探針，將其用于Northern印跡分析。使用引物G2(用于mazG mRNA)或者E1(用于era mRNA)進(jìn)行引物延伸分析。為了檢測(cè)lpp mRNA，加入阿拉伯糖以后不同時(shí)刻從大腸桿菌BW25113/pBAD-K中提取總細(xì)胞RNA，進(jìn)行Northern印跡分析，使用放射性標(biāo)記的lpp ORF DNA片段作為探針。使用引物lpp-C(5′-AGAATGTGCGCC ATTTTTCACT-3′)(SEQ ID NO28)進(jìn)行l(wèi)pp mRNA的引物延伸分析。關(guān)于附圖的特定方法學(xué)細(xì)節(jié)圖26，PemK對(duì)體內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)合成的影響。(A)PemK對(duì)DNA合成的影響。含有pBAD-K的大腸桿菌BW25113細(xì)胞于37攝氏度生長(zhǎng)在M9培養(yǎng)基中，甘油作為碳源。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入阿拉伯糖至終濃度為0.2％，誘導(dǎo)PemK的表達(dá)。通過(guò)在PemK誘導(dǎo)后不同時(shí)刻檢測(cè)甲基-3H-胸腺嘧啶的摻入，測(cè)定DNA的復(fù)制速率，根據(jù)材料和方法中的描述進(jìn)行。(B)PemK對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響。通過(guò)在PemK誘導(dǎo)后不同時(shí)刻檢測(cè)[35S]-甲硫氨酸的摻入，測(cè)定蛋白質(zhì)的合成速率，根據(jù)材料和方法中的描述進(jìn)行。(C)PemK誘導(dǎo)后總細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的SDS-PAGE分析。在PemK誘導(dǎo)后所示的時(shí)刻取出細(xì)胞培養(yǎng)物(1毫升)，與5uCi[35S]-甲硫氨酸混合。37攝氏度摻入1分鐘后，將[35S]-甲硫氨酸摻入反應(yīng)混合物(500微升)加入到含有25微升100％TCA溶液和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的預(yù)冷試管中。離心收集細(xì)胞沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE后自顯影。用箭頭表示的條帶是PemK。圖27，PemK和PemI對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響。(A)PemK對(duì)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制。蛋白質(zhì)合成在大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)(Promega)中37攝氏度進(jìn)行1小時(shí)。從pET11a-MazG中表達(dá)MazG，從質(zhì)粒pET28a-Era中表達(dá)(His)6Era。泳道1，未加入PemK的對(duì)照；泳道2-5，分別加入0.125，0.25，0.5，和1微克PemK(His)6。(B)PemI對(duì)由PemK介導(dǎo)的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白質(zhì)合成抑制的解除。泳道1，沒(méi)有加入PemK(His)6的對(duì)照；泳道2，加入1微克PemK(His)6；泳道3-5，1微克PemK(His)6與0.5，1，2微克(His)6PemI分別共同加入。(C)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)與PemK預(yù)孵育對(duì)于蛋白質(zhì)合成的影響。在加入pET28a-Era質(zhì)粒以前，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)與PemK(His)6或者不加入PemK(His)6，37攝氏度預(yù)孵育15分鐘。在37℃孵育下，使蛋白質(zhì)合成再進(jìn)行1小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物使用SDS-PAGE進(jìn)行分析，之后進(jìn)行自顯影。泳道1，不與PemK(His)6預(yù)孵育的對(duì)照；泳道2，與1微克的PemK(His)6預(yù)孵育，之后加入pET28a-Era質(zhì)粒；泳道3，與1微克的PemK(His)6預(yù)孵育，之后一起加入pET28a-Era質(zhì)粒和1微克(His)6PemI；泳道4，與1微克的PemK(His)6和1微克的(His)6PemI一起共同孵育，之后加入pET28a-Era質(zhì)粒。圖28，PemK的核糖核酸內(nèi)切酶活性。(A)PemK對(duì)mazG mRNA的切割以及PemI對(duì)PemK介導(dǎo)的RNA切割的抑制作用。泳道1，對(duì)照，僅有mazG mRNA；泳道2，mazG mRNA(1.5微克)與0.2微克PemK(His)6共同孵育；泳道3-6，mazG mRNA(1.5微克)與0.2微克PemK(His)6以及0.05，0.1，0.2和0.4微克(His)6PemI分別共同孵育；泳道7，mazG mRNA(1.5微克)與0.4微克(His)6PemI共同孵育。反應(yīng)在37攝氏度進(jìn)行15分鐘，之后反應(yīng)產(chǎn)物用3.5％的非變性PAGE進(jìn)行分析，使用TAE緩沖液。(B)，(C)，(D)和(E)，mazG mRNA和era mRNA中PemK切割位點(diǎn)的引物延伸分析。根據(jù)材料和方法中的描述進(jìn)行引物延伸實(shí)驗(yàn)。每一個(gè)引物延伸產(chǎn)物在6％的測(cè)序凝膠上分析，在產(chǎn)物的旁邊是使用相同引物制備的DNA測(cè)序梯度條帶。與PemK(His)6切割位點(diǎn)周圍的DNA序列梯度條帶互補(bǔ)的RNA序列在右側(cè)顯示，切割位點(diǎn)由箭頭顯示。在本圖中顯示的是使用引物G1(B)和G2(C)檢測(cè)到的mazG mRNA中的PemK(His)6切割位點(diǎn)，以及使用引物E1(D)和E4(E)檢測(cè)到的era mRNA中的PemK(His)6切割位點(diǎn)。圖29，通過(guò)RNA/RNA的形成抑制PemK核糖核酸內(nèi)切酶活性。合成一個(gè)30堿基的RNA，其序列與mazG mRNA中PemK(His)6切割位點(diǎn)周圍的序列相同(表II，第二行)。(A)30堿基RNA上的PemK切割位點(diǎn)。使用T4多核苷酸激酶用[γ-32P]-ATP對(duì)30堿基RNA的5′端標(biāo)記，然后與PemK(His)6在37攝氏度下孵育15分鐘。切割產(chǎn)物在20％的測(cè)序膠上分析。泳道1，5′端標(biāo)記[32P]的11堿基RNA大小標(biāo)記；泳道2，根據(jù)以前的描述(Smith and Roth.(1992)J Biol Chem267，15071-15079)，使用部分堿性水解從5′端標(biāo)記[32P]的30堿基RNA制備的RNA梯度條帶；泳道3，未使用PemK(His)6處理的5′端標(biāo)記[32P]的30堿基RNA；泳道4，5′端標(biāo)記[32P]的30堿基RNA使用PemK(His)6切割的切割產(chǎn)物。泳道1和4中的每一個(gè)條帶的大小以其總核苷酸的數(shù)目表示。(B)RNA-RNA雙鏈的形成對(duì)PemK核糖核酸內(nèi)切酶活性的影響。泳道1，僅有標(biāo)記[32P]的30堿基RNA(1pmol)；泳道2，標(biāo)記[32P]的30堿基RNA(1pmol)與0.2微克PemK(His)6在37攝氏度孵育15分鐘；泳道3-7，標(biāo)記[32P]的30堿基RNA(1pmol)與其30堿基的反義RNA按照所示的不同比例發(fā)生退火，然后與0.2微克PemK(His)6在37攝氏度孵育15分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物使用15％的PAGE進(jìn)行分析，然后進(jìn)行自顯影。圖30，Northern印跡和引物延伸分析PemK對(duì)體內(nèi)各種不同mRNA的作用。(A)Northern印跡分析PemK在體內(nèi)對(duì)mazG，era和lpp mRNA的作用。在1mM IPTG存在下，分別從pIN-MazG和pIN-Era制備mazG mRNA和era mRNA，30分鐘后加入阿拉伯糖(至終濃度0.2％)，以誘導(dǎo)PemK的表達(dá)。從大腸桿菌染色體上轉(zhuǎn)錄lpp mRNA。PemK誘導(dǎo)之后，在所示的不同時(shí)刻提取總細(xì)胞RNA，用于Northern印跡分析。對(duì)照實(shí)驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行，沒(méi)有PemK的誘導(dǎo)。(B)，(C)和(D)，在體內(nèi)mazG、era和lpp mRNA中PemK切割位點(diǎn)的引物延伸分析。在所示的不同時(shí)刻提取總細(xì)胞RNA，用于引物延伸實(shí)驗(yàn)。引物延伸產(chǎn)物在6％的測(cè)序凝膠上分析，在產(chǎn)物的旁邊是使用相同引物制備的DNA測(cè)序梯度。與PemK切割位點(diǎn)周圍的DNA序列梯度互補(bǔ)的RNA序列在右側(cè)顯示，切割位點(diǎn)由箭頭顯示。在本圖中顯示的是使用引物G2(B)檢測(cè)到的mazG mRNA中的PemK切割位點(diǎn)；使用引物E1(C)檢測(cè)到的eramRNA中的PemK切割位點(diǎn)，以及使用引物lpp-C(D)檢測(cè)到的lpp mRNA中的PemK切割位點(diǎn)。結(jié)果PemK對(duì)體內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)合成的影響pemK基因被克隆到pBAD載體(Guzman et al.(1995)J Bacteriol 177，4121-4130)中產(chǎn)生質(zhì)粒pBAD-K，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW25113中。通過(guò)加入阿拉伯糖至終濃度0.2％誘導(dǎo)PemK在BW25113/pBAD-K中的表達(dá)。PemK誘導(dǎo)之后，如圖26A和B所示，在不同時(shí)刻測(cè)定DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的速率。DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成都因?yàn)镻emK的誘導(dǎo)而受到影響，但是DNA復(fù)制受到的影響程度顯著低于蛋白質(zhì)合成受到的影響。PemK被誘導(dǎo)10分鐘之后，蛋白質(zhì)的合成被迅速地降低大約50％，而DNA復(fù)制的抑制達(dá)到類似的水平需要大約100分鐘。如圖26C所示，PemK誘導(dǎo)之后不同時(shí)刻總細(xì)胞蛋白合成的SDS-PAGE分析表明，PemK是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的一般抑制劑。PemK誘導(dǎo)之后0-30分鐘條帶(由箭頭指明)的深度增加，然后降低。根據(jù)其分子量和誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，這個(gè)條帶代表的是被誘導(dǎo)的PemK蛋白質(zhì)。PemK抑制無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)合成根據(jù)材料和方法的描述，從共表達(dá)PemI和PemK(His)6的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/pET21cc-IK(His)6中純化PemK(His)6(C端有標(biāo)簽)。從大腸桿菌菌株BL21(DE3)/pET28a-(His)6I中純化(His)6PemI(N端有標(biāo)簽)。在以下的體外實(shí)驗(yàn)中，PemK(His)6和(His)6PemI被分別稱為PemK和PemI。為了確定PemK是否抑制蛋白質(zhì)的合成，對(duì)純化的PemK對(duì)大腸桿菌無(wú)細(xì)胞RNA/蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中MazG和(His)6Era合成的作用進(jìn)行了檢測(cè)。MazG從質(zhì)粒pET11a-MazG合成，(His)6Era從質(zhì)粒pET28a-Era合成，兩個(gè)合成均在37攝氏度下進(jìn)行1小時(shí)，使用大腸桿菌T7 S30提取物系統(tǒng)(Promega)，在沒(méi)有PemK(圖27A，泳道1)或者PemK含量不斷增加(圖27A，泳道2-5)的條件下進(jìn)行。PemK以劑量依賴的形式抑制了MazG和(His)6Era的合成(圖27A)。這些結(jié)果表明PemK抑制了蛋白質(zhì)合成，這與在體內(nèi)觀察到的PemK介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的抑制(圖26B和26C)是一致的。在體內(nèi)觀察到的PemK介導(dǎo)的DNA復(fù)制抑制的延遲則被推測(cè)是由于細(xì)胞蛋白質(zhì)合成受到抑制的次級(jí)效應(yīng)。有趣的是，加入抗毒素PemI阻斷了PemK介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的抑制，恢復(fù)了MazG和(His)6Era的合成，這也是以PemI劑量依賴的形式出現(xiàn)的(圖27B)。應(yīng)當(dāng)注意的是，如果PemI和質(zhì)粒DNA在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)與PemK在37攝氏度預(yù)孵育15分鐘后一起加入反應(yīng)體系，則預(yù)孵育對(duì)(His)6Era的合成沒(méi)有顯著的負(fù)面影響(比較圖27C中的泳道1和3)。但是在沒(méi)有PemI的情況下，沒(méi)有蛋白質(zhì)產(chǎn)生(圖27C，泳道2)。顯然，不論P(yáng)emI是在與PemK在體系內(nèi)預(yù)孵育15分鐘后加入(圖27C，泳道3)，還是PemI與PemK在預(yù)孵育時(shí)一同加入(圖27C，泳道4)，(His)6Era的合成都被恢復(fù)了。這些結(jié)果提示PemK的第一靶標(biāo)是mRNA，而不是tRNA、核糖體以及在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中蛋白質(zhì)合成所需要的其他因子。PemK的核糖核酸內(nèi)切酶活性使用質(zhì)粒pET11a-MazG作為模板，根據(jù)材料和方法中的描述，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到包含T7啟動(dòng)子和mazG基因的DNA片段。類似地，使用pET28a-Era作為模板，得到另一個(gè)含有T7啟動(dòng)子和era基因的DNA片段。使用T7大規(guī)模轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)，從這兩個(gè)DNA片段中分別制備mazG mRNA和era mRNA。與PemK在37攝氏度下孵育15分鐘，將mazG mRNA消化成小片段(圖28A，泳道2)，而PemI的加入以劑量依賴的方式抑制了mazG mRNA的切割(圖28A，泳道3-6)。PemI自身對(duì)于mazG mRNA沒(méi)有作用(圖28A，泳道7)。使用era mRNA作為底物得到類似的結(jié)果。這些結(jié)果證明PemK是切割mRNA抑制蛋白質(zhì)合成的核糖核酸內(nèi)切酶，PemI的作用是抗毒素，它阻斷了PemK的核糖核酸內(nèi)切酶活性。mazG mRNA被PemK切割的產(chǎn)物在3.5％聚丙烯酰胺凝膠上形成清楚的條帶(圖28A)，這一事實(shí)表明PemK在RNA的特異位點(diǎn)上發(fā)生切割。根據(jù)材料和方法，用PemK部分切割mazG mRNA，然后進(jìn)行引物延伸，使用了5個(gè)不同的寡脫氧核糖核苷酸引物，G1到G5。與進(jìn)行平行處理但是沒(méi)有用PemK處理的對(duì)照相比，使用PemK處理的產(chǎn)物在6％的測(cè)序膠上電泳檢測(cè)出沿著mazG mRNA有許多特異的切割位點(diǎn)。根據(jù)材料和方法，部分被PemK消化的era mRNA也進(jìn)行了引物延伸反應(yīng)，使用4個(gè)不同的引物，E1到E4，以檢測(cè)沿著era mRNA的PemK切割位點(diǎn)。為了確定PemK切割位點(diǎn)周圍的確切序列，每一個(gè)引物延伸的產(chǎn)物都在6％的測(cè)序膠上進(jìn)行分析，使用用相同引物制備的DNA測(cè)序梯度條帶(圖28B-E)。表II顯示了在PemK切割位點(diǎn)周圍的mRNA序列。顯示了mazG mRNA(來(lái)自pET11a-MazG)，era mRNA(來(lái)自pET28a-Era)以及l(fā)pp mRNA(來(lái)自大腸桿菌染色體DNA，參見圖30D)上PemK切割位點(diǎn)(用箭頭表示)周圍的mRNA序列。保守的UA 核苷酸用粗體顯示。將起始密碼子AUG中的A殘基編號(hào)為+1，則編號(hào)顯示的是mRNA中核苷酸的位置。 表II顯示了在mazG mRNA、era mRNA以及l(fā)pp mRNA(lppmRNA參見圖30D)的主要切割位點(diǎn)周圍的序列，這由引物延伸實(shí)驗(yàn)測(cè)定。這些發(fā)現(xiàn)表明UA二核苷酸在除了一個(gè)切割位點(diǎn)以外的所有切割位點(diǎn)中是共有的，且主要的切割出現(xiàn)在UAX(X是C、A或者U)序列中A殘基的5′或者3′端，只有一個(gè)例外，即切割出現(xiàn)在UGC序列中U和G殘基之間(表II，第七行)。在18個(gè)測(cè)定的切割位點(diǎn)中，UAC序列出現(xiàn)在其中的11個(gè)中。根據(jù)mazG mRNA中一個(gè)PemK切割位點(diǎn)周圍的序列設(shè)計(jì)了一個(gè)30堿基的RNA底物，包含UAC序列(表II，第二行)。使用T4多核苷酸激酶，用[γ-32P]ATP對(duì)RNA的5′端進(jìn)行標(biāo)記。在使用全長(zhǎng)mazGmRNA的引物延伸實(shí)驗(yàn)中，UAC序列只在A殘基的5′端切割(圖28B)。但是30堿基的RNA在其中的UAC序列中A殘基(在30堿基中第15號(hào)堿基)的5′和3′端都切割得很好(圖29A)。在15％的非變性PAGE中，30堿基RNA底物的切割產(chǎn)物其遷移是一條帶(圖29B，泳道2)。如果在加入PemK之前，用反義RNA與30堿基RNA底物以不同比例退火，則反義RNA以劑量依賴的方式抑制了RNA的切割(圖29B，泳道3-7)。當(dāng)使30堿基RNA與其互補(bǔ)DNA形成雙鏈時(shí)，得到相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明30堿基RNA底物的PemK的切割位點(diǎn)在RNA-RNA以及RNA-DNA雙鏈中得到保護(hù)。因此可以得出結(jié)論，PemK是針對(duì)單鏈RNA的序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶。PemK誘導(dǎo)之后的體內(nèi)mRNA切割為了檢查PemK在體內(nèi)對(duì)mRNA的作用，根據(jù)材料和方法的描述，在PemK誘導(dǎo)之后的不同時(shí)刻提取總細(xì)胞RNA，進(jìn)行Northern印跡和引物延伸分析。16S和23S rRNA在體內(nèi)對(duì)PemK是穩(wěn)定的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)1％瓊脂糖凝膠檢查總細(xì)胞RNA樣品，在PemK誘導(dǎo)以后的60分鐘時(shí)間內(nèi)，沒(méi)有觀察到它們條帶深淺的顯著改變。這表明在體內(nèi)16S和23S rRNA都受到很好的保護(hù)，沒(méi)有被PemK切割。圖30A顯示了PemK誘導(dǎo)或者未誘導(dǎo)下，在不同時(shí)刻mazG、era和lpp mRNA Northern印跡的結(jié)果。mazG和era mRNA分別從pIN-MazG和pIN-Era制備，用1mM的IPTG誘導(dǎo)30分鐘，之后加入阿拉伯糖(終濃度是0.2％)以誘導(dǎo)PemK的表達(dá)。lpp mRNA從大腸桿菌染色體轉(zhuǎn)錄。所有這三個(gè)mRNA在PemK表達(dá)誘導(dǎo)后10分鐘都被降解了，而在沒(méi)有PemK誘導(dǎo)的情況下，在60分鐘的孵育時(shí)間內(nèi)沒(méi)有觀察到任何的變化(圖30A)，與mazG和lpp mRNA相比，era mRNA大部分被轉(zhuǎn)化為更小的清楚的條帶，該條帶在PemK誘導(dǎo)后的60分鐘內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。這一穩(wěn)定的mRNA切割產(chǎn)物的性質(zhì)還未知。還進(jìn)行了引物延伸實(shí)驗(yàn)，確定了體內(nèi)mRNA中的PemK切割位點(diǎn)。mazG、era和lpp mRNA中的各一個(gè)切割位點(diǎn)分別示于圖30B、C和D中。在所有的情況下，PemK誘導(dǎo)后10分鐘就出現(xiàn)了一個(gè)條帶(圖30B、C和D的泳道2)，其深度在PemK誘導(dǎo)后60分鐘的孵育時(shí)間內(nèi)逐步增強(qiáng)(泳道2-6)。值得注意的是，該條帶在0分鐘時(shí)幾乎無(wú)法檢測(cè)到(泳道1)，清楚地表明觀察到的切割是由于PemK的誘導(dǎo)造成的。mazG和lpp mRNA的切割是在UAC序列中的A和C殘基之間發(fā)生的，而era mRNA的切割是在U和A殘基之間發(fā)生的。mazG mRNA在體內(nèi)和體外的切割位點(diǎn)相同(比較圖28C和圖30B)。在體外使用相同的引物檢測(cè)時(shí)在相同的位點(diǎn)也出現(xiàn)了era的體內(nèi)切割(比較圖28D和圖30C)。mazG和era mRNA中被切割的UAC序列是在兩個(gè)ORF的閱讀框之內(nèi)的，分別編碼Try41(MazG)和Tyr7(Era)，而在lpp mRNA中被切割的UAC序列位于兩個(gè)相鄰的密碼子即編碼Ala73的GCU和編碼Thr74的ACU之間。PemK在體內(nèi)對(duì)mRNA的切割是非常特異的，因?yàn)闆](méi)有檢測(cè)到其他切割事件，如圖30B、C和D所示。因此，與RelE(它促進(jìn)密碼子特異的mRNA切割，發(fā)生在核糖體的A位點(diǎn)上)(Pedersen et al.(2003)Cell 112，131-140；Hayes and Sauer.(2003)Mol Cell 12，903-911)不同的是，PemK是序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，能夠通過(guò)切割mRNA抑制蛋白質(zhì)的合成，切割的方式與核糖體和密碼子的閱讀無(wú)關(guān)。結(jié)論本發(fā)明部分地涉及了一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)，即由pemI-pemK上癮組件編碼的毒素PemK，是一個(gè)序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶。體外和體內(nèi)的研究表明PemK通過(guò)在特異位點(diǎn)處切割mRNA，抑制了蛋白質(zhì)的合成。在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，純化的PemK抑制了蛋白質(zhì)的合成，而加入PemI能夠阻斷PemK的抑制作用，恢復(fù)蛋白質(zhì)的合成。而且，在這里證明了mRNA是被PemK降解的，且PemK介導(dǎo)的mRNA切割被PemI抑制。因此PemI的作用是抗毒素，它通過(guò)與PemK形成復(fù)合物，抑制了PemK的核糖核酸內(nèi)切酶活性。就核糖核酸內(nèi)切酶活性而言，PemI-PemK復(fù)合物是沒(méi)有活性的。這里顯是PemK對(duì)于單鏈RNA是高度特異的，因?yàn)楫?dāng)RNA底物與其反義RNA或者互補(bǔ)DNA形成RNA-RNA或者RNA-DNA雙鏈時(shí)，PemK介導(dǎo)的RNA的切割被阻斷。這里的結(jié)果還表明PemK優(yōu)選在UAX序列(X是C、A或者U)中A殘基的5′或者3′端切割。這里提出的結(jié)果還顯示PemK對(duì)RNA的切割與核糖體無(wú)關(guān)，這與由relBE上癮組件編碼的RelE顯然不同。RelE不能切割游離的RNA，而是以高度的密碼子特異性促進(jìn)核糖體A位點(diǎn)處mRNA的降解(Christensen and Gerdes.(2003)Mol Microbiol 48，1389-1400；Pedersen et al.(2003)Cell112，131-140；Hayes and Sauer.(2003)Mol Cell 12，903-911)。在前面在kis-kid系統(tǒng)(它是一個(gè)與pemI-pemK相同的上癮組件)中進(jìn)行的研究中，有報(bào)導(dǎo)顯示Kid(PemK)在體外抑制了ColE1起始階段的復(fù)制，但是對(duì)于P4DNA的復(fù)制則沒(méi)有顯著影響。DnaB被認(rèn)為是Kid(PemK)抑制作用的靶標(biāo)(Ruiz-Echevarria et al.(1995)JMol Biol 247，568-577)。但是沒(méi)有數(shù)據(jù)支持Kid(PemK)和DnaB之間的相互作用。有趣的是，注意到ColE1復(fù)制是由RNAII起始而被RNAI抑制的(Cesareni et al.(1991)Trends Genet 7，230-235；Davison.(1984)Gene 28，1-15)，而P4DNA的復(fù)制主要受到α蛋白質(zhì)的調(diào)控(Briani et al.(2001)Plasmid 45，1-17)。參與RNAI和RNA II代謝的RNA酶預(yù)計(jì)在控制ColE1質(zhì)粒的復(fù)制中起到重要作用(Jung andLee.(1995)Mol Biol Rep 22，195-200)。RNA II含有多個(gè)UAC序列，其中兩個(gè)存在于第一和第二莖環(huán)的環(huán)區(qū)(Tomizawa and Itoh.(1982)Cell 31，575-583；Tomizawa.(1984)Cell 38，861-870)。因此ColE1 DNA復(fù)制被Kid(PemK)的抑制可能是由于RNA II被Kid(PemK)的核糖核酸內(nèi)切酶活性降解所致。而且，細(xì)菌內(nèi)的毒素Kid(PemK)抑制各種不同真核細(xì)胞生長(zhǎng)的事實(shí)(de la Cueva-Mendezet al.(2003)Embo J22，246-251)，可以通過(guò)其針對(duì)細(xì)胞mRNA的核糖核酸內(nèi)切酶活性，而不是其與DnaB的相互作用而容易地得到解釋。在許多細(xì)菌中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PemK的同源物。MazF(ChpAK)和ChpBK是大腸桿菌中的兩個(gè)類PemK蛋白(Santos Sierra et al.(1998)FEMS Microbiol Lett 168，51-58；Masuda et al.(1993)JBacteriol 175，6850-6856；Christensen et al.(2003)J Mol Biol332，809-819)。由mazEF上癮組件編碼的毒素MazF(ChpAK)，與PemK有25％的一致性；由chpB上癮組件編碼的毒素ChpBK，與PemK有41％的一致性。值得注意的是，已知MazF(ChpAK)和ChpBK通過(guò)與RelE類似的方式切割mRNA，抑制翻譯(Christensen et al.(2003)同上)。但是本發(fā)明的發(fā)明者最近證明，MazF是核糖核酸內(nèi)切酶，它通過(guò)在特異序列處切割單鏈mRNA抑制蛋白質(zhì)的合成(Zhang et al.(2003)MolCell 12，913-923)，其作用不依賴于核糖體。MazF優(yōu)選地在ACA序列的A和C殘基之間切割mRNA(Zhang et al.(2003)同上)。Kid(PemK)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定為同源二聚體(Hargreaves等人(2002)Structure(Camb)10，1425-1433；Hargreaves et al.(2002)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr58，355-358)。盡管MazF的結(jié)構(gòu)還沒(méi)有被確定，Kamada et al(2003)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了MazE-MazF復(fù)合物(MazF2-MazE2-MazF2)的晶體結(jié)構(gòu)，復(fù)合物是由兩個(gè)MazF同二聚體和一個(gè)MazE同二聚體形成的。有趣的是，Kid(PemK)同二聚體的結(jié)構(gòu)與MazE-MazF復(fù)合物中MazF同二聚體的結(jié)構(gòu)相似。但是在結(jié)合了MazE的MazF同二聚體中，β鏈S1和S2之間的保守環(huán)(稱為S1-S2環(huán))伸向溶劑中，大部分無(wú)規(guī)排列，而在Kid(PemK)同二聚體中兩個(gè)相應(yīng)的環(huán)形成“緊密的”構(gòu)象(Kamada etal.(2003)Mol Cell 11，875-884)。在Kid(PemK)同二聚體結(jié)構(gòu)中的S1-S2環(huán)，形成了一個(gè)類似空洞的結(jié)構(gòu)，包括了堿性的表面和保守的疏水口袋。保守的疏水口袋在MazE-MazF復(fù)合物的形成中對(duì)于MazE的識(shí)別起重要所用(Kamada et al.(2003)同上)。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)提出，攜帶大量負(fù)電荷的MazE的C端延伸可能模擬了單鏈RNA，它結(jié)合在MazF同二聚體中的S1-S2環(huán)之間(Zhang et al.(2003)同上)。PemI被認(rèn)為以非常類似的方式與PemK結(jié)合，阻斷了PemK的核糖核酸內(nèi)切酶活性。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)對(duì)PemK和MazF進(jìn)行了性質(zhì)研究，它們被確定為對(duì)單鏈RNA序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，但是它們的生理功能看起來(lái)仍然與其他已知的核糖核酸內(nèi)切酶，如RNA酶E，A和T1有明顯區(qū)別。PemK和MazF通過(guò)干擾細(xì)胞mRNA的功能而成為一般的蛋白質(zhì)合成抑制劑。眾所周知小的RNA，如micRNA(mRNA-干擾互補(bǔ)RNA)(Mizuno et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81，1966-1970)，miRNA(Ambros.(2001)Cell 107，823-826)和siRNA(Billy et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，14428-14433)，干擾特異靶標(biāo)RNA的功能。核酶也特異地作用于靶標(biāo)RNA上，干擾其功能(Puerta-Fernandez et al.(2003)FEMS Microbiol Rev 27，75-97)。本發(fā)明的發(fā)明者提出PemK及PemK的同源物(包括MazF)形成一個(gè)新的核糖核酸內(nèi)切酶家族，它們具有新的mRNA干擾機(jī)制，使得mRNA在特異的序列處被切割。因此它們?cè)谶@里被命名為“mRNA干擾酶”。如以前所報(bào)導(dǎo)的，Kid(PemK)引發(fā)人類癌細(xì)胞的凋亡，而Kis(PemI)抑制Kid(PemK)的毒性作用(de la Cueva-Mendez et al.(2003)同上)。因此，這一新的可調(diào)控mRNA干擾系統(tǒng)，有可能會(huì)在人類疾病的治療性處理(例如基因治療)中發(fā)揮作用。
實(shí)施例V正如這里所顯示的，PemK的功能是高度序列特異的核糖核酸內(nèi)切酶，它在UAX序列處切割細(xì)胞mRNA，其中X是C、A或者U。這種活性可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成部分或者完全的抑制。依據(jù)四種核苷酸中的任何一種摻入到前兩個(gè)核苷酸位置的每一個(gè)位置的可能性是相同的原理以及所示的三個(gè)核苷酸中的任一個(gè)將會(huì)整合到第三個(gè)核苷酸位置，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算，UAX序列(其中X是C、A、U)出現(xiàn)在RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的預(yù)測(cè)頻率是3/64。應(yīng)當(dāng)理解，與預(yù)測(cè)頻率比較，一些RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中包含較低或者較高頻率的UAX序列。因此，特異RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被PemK核糖核酸內(nèi)切酶切割的敏感性取決于UAX序列或者PemK靶標(biāo)序列在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的頻率。而且，本領(lǐng)域內(nèi)具有普通技術(shù)的人員能夠根據(jù)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)于PemK介導(dǎo)的切割的敏感性。
實(shí)施例VI一般地，RNA干擾酶以及本發(fā)明的特異RNA干擾酶還可以有利地用于體內(nèi)和體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)的組分，在這些生產(chǎn)系統(tǒng)中背景(非特異的)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生大大降低或者被去除，這樣產(chǎn)生了“單一蛋白”合成系統(tǒng)。使用“單一蛋白”合成系統(tǒng)表達(dá)的蛋白基本上沒(méi)有污染的蛋白，因此對(duì)于最好或者必須使用“純化”蛋白制備物的應(yīng)用而言是有用的。這些應(yīng)用包括，但是不止限于，無(wú)需純化的蛋白質(zhì)的核磁共振(NMR)分析以及其他蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定，包括涉及膜蛋白的結(jié)構(gòu)測(cè)定。關(guān)于膜蛋白的結(jié)構(gòu)分析，使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)制備物對(duì)于涉及固態(tài)NMR的實(shí)驗(yàn)方案是非常適宜的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的方法可以有利地用于使用放射性同位素在細(xì)胞背景中專門標(biāo)記特異的膜蛋白。被標(biāo)記的膜蛋白接下來(lái)通過(guò)內(nèi)源細(xì)胞機(jī)制摻入到適當(dāng)?shù)募?xì)胞膜中，在那里被標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以很容易地根據(jù)其標(biāo)記的性質(zhì)被檢測(cè)到。為了構(gòu)建用于體內(nèi)或者體外應(yīng)用的單一蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，使用mRNA干擾酶(例如PemK和/或MazF)對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理，所述mRNA干擾酶切割內(nèi)源mRNA，阻斷蛋白質(zhì)從這些mRNA的合成。為了在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)這種預(yù)處理，將mRNA干擾酶的可調(diào)控基因引入細(xì)胞或者組織中，誘導(dǎo)其表達(dá)。將外源基因引入細(xì)胞和/或組織中并表達(dá)的方法，在以上有所描述，并且是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。為了實(shí)現(xiàn)體外的mRNA干擾酶預(yù)處理，將純化的mRNA干擾酶加入到體外的翻譯系統(tǒng)中。在本領(lǐng)域中已知各種不同的體外翻譯系統(tǒng)，包括，但是不止限于，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、小麥胚芽以及大腸桿菌的提取物。對(duì)于在這些體內(nèi)或者體外系統(tǒng)的任何一個(gè)中生產(chǎn)“單一蛋白”，對(duì)編碼所需蛋白的遺傳構(gòu)建體進(jìn)行工程化，轉(zhuǎn)錄出其中所有mRNA干擾酶靶序列都已經(jīng)被去除的mRNA。該步驟產(chǎn)生的mRNA對(duì)于向“單一蛋白”表達(dá)系統(tǒng)中加入的mRNA干擾酶的核糖核酸內(nèi)切酶活性不敏感。這樣經(jīng)過(guò)工程化的本發(fā)明mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在這里可以被稱為“抗干擾酶的mRNA”。通過(guò)從例如工程化的構(gòu)建體中誘導(dǎo)其表達(dá)，從而表達(dá)抗干擾酶的mRNA。抗干擾酶的mRNA被翻譯為蛋白質(zhì)，而基本上沒(méi)有其他對(duì)mRNA干擾酶活性敏感的蛋白質(zhì)的翻譯，這樣實(shí)際上產(chǎn)生的是單一蛋白質(zhì)樣品。該方法可以用于原核或者真核系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)理解使用mRNA干擾酶處理也可以同時(shí)與抗干擾酶mRNA的表達(dá)/誘導(dǎo)或者添加同時(shí)進(jìn)行。這種方法可以與涉及單一蛋白合成的本發(fā)明的體外或者體內(nèi)(基于細(xì)胞的)系統(tǒng)共同使用?；诩?xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)镸azF是一個(gè)序列特異(ACA)的核糖核酸內(nèi)切酶，它只對(duì)單鏈RNA起作用(zhang et al.2003，同上)，所以開發(fā)基于細(xì)胞的“單一蛋白質(zhì)”合成系統(tǒng)，示例MazF在這些應(yīng)用中的用途。這樣，開發(fā)出單一蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，以在細(xì)菌細(xì)胞中合成成熟的人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白。為了達(dá)到這一目的，合成編碼野生型嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白氨基酸序列的新型核酸序列。從該新型核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子沒(méi)有ACA序列。參見圖35，SEQ ID NO30-31(分別是成熟的人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的核酸和氨基酸序列)。這個(gè)編碼成熟人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的核酸被克隆到冷激載體(pCOLDI)中，該載體在低溫下孵育，在IPTG存在時(shí)表達(dá)蛋白。參見圖36。該表達(dá)系統(tǒng)的顯著優(yōu)勢(shì)是低的非特異性蛋白表達(dá)背景。應(yīng)當(dāng)理解編碼目標(biāo)多肽的核酸序列可以使用各種不同的方法產(chǎn)生。這些方法包括設(shè)計(jì)和產(chǎn)生能夠編碼目的多肽的合成核酸序列，其中的核酸序列沒(méi)有ACA序列；以及分離能夠編碼目的多肽的核酸序列和將其中的每一個(gè)ACA序列突變?yōu)榱硪粋€(gè)三聯(lián)體序列，其中這些突變就改變核酸所編碼的氨基酸序列而言是沉默突變。材料和方法使用pCold I載體進(jìn)行冷激誘導(dǎo)由于pCold I載體包含lac操縱子，所以加入1mM IPTG誘導(dǎo)由這個(gè)調(diào)控元件控制的基因的表達(dá)。對(duì)于一些蛋白，優(yōu)選在細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)中期(OD600＝0.4-0.7)時(shí)在15攝氏度誘導(dǎo)，以提高蛋白質(zhì)的折疊。為了確定適于最佳蛋白質(zhì)產(chǎn)量的條件，在誘導(dǎo)后不同的時(shí)間間隔取樣，用SDS-PAGE分析。一般地，在表達(dá)被誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但是在需要使用放射性同位素，例如15N或者13C標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，要使用M9或者M(jìn)J9培養(yǎng)基。在這里下面顯示了從pColdI載體的SD位點(diǎn)到多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。表達(dá)的蛋白質(zhì)在N端包含15個(gè)殘基的可刪除序列，它由一個(gè)下游盒子(DB，它是翻譯增強(qiáng)順式元件)、His6標(biāo)簽和Xa因子位點(diǎn)組成，之后是多克隆位點(diǎn)。
GAGG SDTAATACACC SD下游的序列(SEQ ID NO29)ATGAATCACAAAGTGDB(SEQ ID NO30)CATCATCATCATCATCAT His6(SEQ ID NO31)ATCGAAGGTAGG 因子Xa位點(diǎn)(SEQ ID NO32)CATATGGAGCTCGGTACCCTCGAG GGATCCNdeI SacI KpnI XhoI BamHIGAATTCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAGA 多克隆位點(diǎn)(SEQ ID NO33)EcoRI □HindIII SalI PstI XbaI為了構(gòu)建pCold(SP)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(這里也稱為pSPSeotaxin)，以上所示的兩個(gè)用粗斜體顯示的ACA序列被改變?yōu)锳TA，以去除MazF干擾酶的識(shí)別位點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法能夠用于任何表達(dá)載體或者表達(dá)載體系統(tǒng)(例如pET載體)。pCold I載體作為示例性載體提出，且以上實(shí)施例的目的不是限制本發(fā)明的范疇。關(guān)于附圖的特異方法學(xué)細(xì)節(jié)圖37，包含pACYCmazF的大腸桿菌BL21(DE3)或者包含pACYCmazF和pCold(SP)eotaxin的大腸桿菌BL21(DE3)在含有適當(dāng)抗生素的M9-葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.5時(shí)，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到15攝氏度中培養(yǎng)15分鐘，向其中加入1mM IPTG。在所示的時(shí)間間隔，取出1毫升培養(yǎng)物，加入到含有10uCi35S-甲硫氨酸的試管中，在15分鐘孵育(脈沖)之后，加入0.2毫升50毫克/毫升甲硫氨酸，孵育5分鐘(追蹤)。使用M9-葡萄糖培養(yǎng)基漂洗標(biāo)記的細(xì)胞，然后重懸于100微升的SDS-PAGE上樣緩沖液中。每個(gè)樣品取10微升用SDS-PAGE進(jìn)行分析，之后進(jìn)行自顯影。結(jié)果包含編碼成熟人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的新型核酸序列的pCOLDI被用作模板。參見圖36。產(chǎn)生的質(zhì)粒被命名為pCold(SP)eotaxin。使用包含T7啟動(dòng)子控制下的mazF基因的質(zhì)粒pACYCmazF，誘導(dǎo)MazF的表達(dá)。包含pACYCmazF自身或者pACYCmazF以及pCold(SP)eotaxin的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞在含有適當(dāng)抗生素的M9-葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.5時(shí)，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到15攝氏度中培養(yǎng)15分鐘，向其中加入1mM IPTG。在所示的時(shí)間間隔，取出1毫升培養(yǎng)物，加入到含有10uCi35S-甲硫氨酸的試管中，在標(biāo)記存在下孵育(脈沖)15分鐘之后，加入0.2毫升50毫克/毫升甲硫氨酸，孵育5分鐘(追蹤)。使用M9-葡萄糖培養(yǎng)基漂洗標(biāo)記的細(xì)胞，然后重懸于100微升的SDS-PAGE上樣緩沖液。每個(gè)樣品中取10微升用SDS-PAGE進(jìn)行分析，之后進(jìn)行自顯影。正如以前所報(bào)導(dǎo)的(Zhang et al.2003，同上)，mazF基因的表達(dá)抑制了BL21(DE3)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。但是成熟人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(由不包含ACA序列的mRNA編碼)的合成不被mazF的表達(dá)抑制。參見圖37。該結(jié)果證明可以使用本發(fā)明的單一蛋白制備方法獲得大量的單一蛋白。重要的是，進(jìn)行了平行的實(shí)驗(yàn)，其中只包含pCold(SP)eotaxin的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞在含有適當(dāng)抗生素的M9-葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這些實(shí)驗(yàn)顯示了MazF表達(dá)在該系統(tǒng)中的作用。當(dāng)攜帶pCold(SP)eotaxin的細(xì)胞在沒(méi)有MazF誘導(dǎo)而被冷激時(shí)，與人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白同時(shí)產(chǎn)生了大量的背景大腸桿菌蛋白。正如這里所描述的，當(dāng)MazF與嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白一同被誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞蛋白質(zhì)背景被顯著降低。在3小時(shí)MazF誘導(dǎo)之后，背景蛋白質(zhì)的表達(dá)幾乎被完全去除了，產(chǎn)生了能夠持續(xù)只表達(dá)單一蛋白即人類嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的細(xì)胞。嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的表達(dá)持續(xù)至少72小時(shí)，在前36小時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的產(chǎn)生速率沒(méi)有改變，表明細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的能力在幾乎3天中沒(méi)有受到MazF表達(dá)的影響。這證明，蛋白質(zhì)合成所需要的核糖體、tRNA、所有其他細(xì)胞組分都沒(méi)有受到MazF誘導(dǎo)的影響。這些結(jié)果還意味著能量代謝和核苷酸合成以及氨基酸的生物合成，基本上不受MazF表達(dá)的影響。還值得注意的是，在MazF表達(dá)被誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物的72小時(shí)孵育過(guò)程中，OD600(0.5)沒(méi)有增加，表明在MazF誘導(dǎo)之后細(xì)胞的生長(zhǎng)被完全抑制，而細(xì)胞保持了完好的蛋白質(zhì)合成能力。但是在沒(méi)有MazF誘導(dǎo)的情況下，OD600在15攝氏度的72小時(shí)孵育時(shí)間中從0.5升高到1.2，這可以從背景細(xì)胞蛋白的產(chǎn)生看出。為了確定在以上表達(dá)系統(tǒng)中嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的產(chǎn)生水平，分離相同量的培養(yǎng)物，用SDS-PAGE進(jìn)行分析。冷激后36小時(shí)，出現(xiàn)了一條清晰染色的嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白條帶，占總細(xì)胞蛋白的大約5％。這些結(jié)果是使用以上描述的M9基本培養(yǎng)基獲得的。使用M9培養(yǎng)基對(duì)于使用13C葡萄糖和15N氯化銨進(jìn)行蛋白質(zhì)的同位素富集是重要的。但是如果需要的是大量生產(chǎn)未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以使用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，例如LB培養(yǎng)基。的確，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在LB培養(yǎng)基中孵育的培養(yǎng)物，嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的產(chǎn)量可以高達(dá)總細(xì)胞蛋白的20％或者40毫克/升培養(yǎng)物(1克每25升培養(yǎng)物)。重要的是注意到在M9或者LB培養(yǎng)基中孵育的細(xì)胞產(chǎn)生的嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白是完全可溶的，沒(méi)有形成包含體。如上面所表明的，在孵育過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)量沒(méi)有增加，因?yàn)樵诶浼し跤屑?xì)胞生長(zhǎng)被完全抑制了。因此細(xì)胞機(jī)器被完全用于本發(fā)明的單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)(SPP)中冷激之后pCold載體中克隆的基因的生產(chǎn)。因此，在MazF誘導(dǎo)之后，可以將細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮到在出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下與細(xì)胞維持存活不一致的程度。的確，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)測(cè)定，可以將指數(shù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物濃縮至少4倍(OD600從0.7到2.8)而不影響克隆基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。這意味著可以使用出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的正常培養(yǎng)物所用培養(yǎng)基25％的培養(yǎng)基。換言之，有可能僅僅使用6.5升的LB培養(yǎng)基生產(chǎn)出1克的人嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白。這是本發(fā)明的SPP系統(tǒng)有特別重大意義的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@個(gè)特點(diǎn)明顯降低了表達(dá)大量蛋白或者用于NRM結(jié)構(gòu)研究的富集了同位素的蛋白所需的成本。無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、小麥胚芽和大腸桿菌的提取物包括最常使用的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。所有的提取物都制備為粗提取物，包含外源RNA翻譯所必需的大分子組分(70S或者80S核糖體、tRNA、氨酰tRNA合成酶、起始、延伸和終止因子等等)。一般向每一種提取物中補(bǔ)充氨基酸、能量來(lái)源(ATP，GTP)、能量再生系統(tǒng)(對(duì)于真核系統(tǒng)是磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶，對(duì)于大腸桿菌裂解物為磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶)以及其他的輔助因子(例如Mg2+，K+，等)以保證有效的翻譯。所使用的遺傳物質(zhì)(例如RNA或者DNA)決定了兩種體外蛋白質(zhì)合成的方法中哪一種是有用的。標(biāo)準(zhǔn)的翻譯系統(tǒng)，例如網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物使用RNA作為模板，而“偶聯(lián)的”和“連接的”系統(tǒng)使用DNA模板轉(zhuǎn)錄為RNA，然后再翻譯RNA。兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物是用于外源RNA(天然的或者工程化的)翻譯的有效的體外真核蛋白合成系統(tǒng)。網(wǎng)織紅細(xì)胞是高度特化的具核細(xì)胞，它們的體內(nèi)功能主要是血紅蛋白的合成，而血紅蛋白占據(jù)網(wǎng)織紅細(xì)胞合成蛋白的90％以上。這些未成熟的紅細(xì)胞具有制備大量球蛋白所必需的所有機(jī)器，包括足量的球蛋白mRNA和細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的組分(這里以上詳述并且在本領(lǐng)域內(nèi)已知的)。可以通過(guò)與Ca2+依賴的微球菌核酸酶共同孵育，去除內(nèi)源球蛋白mRNA，之后通過(guò)加入EGTA螯合Ca2+使微球菌核酸酶失活。這種核酸酶處理的裂解物表現(xiàn)出低的背景和即使在低濃度下對(duì)外源RNA的有效利用。外源蛋白合成的速率與在完整的網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)觀察到的合成速率相近?？梢允褂锰幚砘蛘呶刺幚淼木W(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物，從加帽或者未加帽的RNA(真核的或者病毒的)合成更大的蛋白質(zhì)。小麥胚芽提取物由于內(nèi)源mRNA水平低，使得小麥胚芽提取物具有最低的背景整合，因此它是兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物的一個(gè)便利的代替。小麥胚芽提取物有效地翻譯來(lái)自各種不同生物體的外源RNA，包括那些來(lái)源于病毒、酵母、高等植物以及哺乳動(dòng)物的RNA。在翻譯含有雙鏈RNA小片段或者抑制兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的氧化硫醇的RNA時(shí)，它是優(yōu)選的系統(tǒng)。加帽或者未加帽的RNA模板網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物和小麥胚芽提取物是翻譯體外轉(zhuǎn)錄的RNA或者從細(xì)胞或組織中提取的RNA的有效系統(tǒng)。在使用體外合成的RNA時(shí)，5′帽子結(jié)構(gòu)的存在可能提高翻譯活性。與網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物提取物相比，使用小麥胚芽提取物的翻譯一般更依賴于帽子。如果認(rèn)為RNA帽子是必需的，則可以將編碼序列亞克隆到原核載體中，其可以直接從大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的DNA模板直接表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)RNA加帽。在標(biāo)準(zhǔn)的翻譯反應(yīng)中，純化的RNA用作翻譯的模板。而另一方面，“連接的”或者“偶聯(lián)的”系統(tǒng)使用DNA作為模板。RNA轉(zhuǎn)錄自DNA，并且隨后被翻譯而無(wú)需任何純化。這種系統(tǒng)通常需要模板DNA以及原核的噬菌體聚合酶啟動(dòng)子(T7，T3，或SP6)。RNA聚合酶(例如原核噬菌體的RNA聚合酶)將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，真核或者原核的提取物將RNA翻譯為蛋白質(zhì)。用于轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)的DNA模板可以克隆到質(zhì)粒載體中或者通過(guò)PCR產(chǎn)生。“連接的”系統(tǒng)是一個(gè)兩步反應(yīng)，包括使用噬菌體聚合酶的轉(zhuǎn)錄和接下來(lái)在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞或者小麥胚芽裂解物中的翻譯。轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)可以分別進(jìn)行或者相偶聯(lián)。大腸桿菌提取物與轉(zhuǎn)錄和翻譯連續(xù)進(jìn)行的真核系統(tǒng)不同的是，在大腸桿菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)發(fā)生。因此體外的大腸桿菌翻譯系統(tǒng)涉及的是一步反應(yīng)。在轉(zhuǎn)錄中，RNA的5′端可以用于核糖體的結(jié)合，然后用于翻譯，而其3′端仍然在被轉(zhuǎn)錄。早先結(jié)合到RNA上的核糖體保持了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性，并且促進(jìn)了有效的翻譯。因此，細(xì)菌的翻譯系統(tǒng)非常適于快速表達(dá)原核或者真核的基因產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Shine-Dalgarno核糖體結(jié)合位點(diǎn)被包括在所用的DNA模板起始密碼子的上游，以引發(fā)高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量以及最佳的起始保真性。大腸桿菌翻譯系統(tǒng)不需要真核RNA加帽子。大腸桿菌提取物還具有其他的益處，即交叉反應(yīng)性或者其他與真核裂解物中的內(nèi)源蛋白有關(guān)的問(wèn)題被減少或者去除。而且，大腸桿菌S30提取物系統(tǒng)能夠從包含天然大腸桿菌啟動(dòng)子序列(例如lac或者tac)的DNA載體中進(jìn)行表達(dá)。大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)由富含內(nèi)源mRNA的粗提取物組成。為了制備這一提取物用于轉(zhuǎn)錄/翻譯，將其孵育，以翻譯內(nèi)源mRNA，接下來(lái)內(nèi)源mRNA被降解。在這種制備的裂解物中產(chǎn)生的低水平內(nèi)源mRNA使得能夠發(fā)現(xiàn)外源合成的產(chǎn)物。真核翻譯信號(hào)原核和真核mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之間存在一些顯著的區(qū)別，應(yīng)該予以考慮。真核mRNA一般具有兩種轉(zhuǎn)錄后的修飾5′的7-甲基GTP帽子和3′poly(A)尾巴。這兩種修飾的目的都是通過(guò)阻止未成熟降解而使mRNA穩(wěn)定。5′的帽子結(jié)構(gòu)還通過(guò)促進(jìn)mRNA與真核核糖體的結(jié)合使mRNA的翻譯增強(qiáng)，并且保證正確的AUG起始密碼子被識(shí)別。保守序列，或者“Kozak”序列一般被認(rèn)為是真核mRNA中最強(qiáng)的核糖體結(jié)合信號(hào)。為了有效地起始翻譯，關(guān)鍵的元件是Kozak序列+1位的G殘基和-3位的A殘基。缺乏Kozak一致序列的mRNA在真核無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中有可能被有效翻譯，如果該mRNA包含沒(méi)有穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的中等長(zhǎng)度的5′非翻譯區(qū)(UTR)。原核翻譯信號(hào)在細(xì)菌中，通過(guò)被稱為Shine-Dalgarno(SD)序列的富含嘌呤的區(qū)域?qū)⒑颂求w引到AUG起始位點(diǎn)上。該序列與30S核糖體亞基中的16S rRNA的3′端互補(bǔ)。SD區(qū)域，位于AUG起始密碼子的上游，包含本領(lǐng)域中已知的一致序列。特異的mRNA在與16S rRNA的抗Shine-Dalgarno序列互補(bǔ)的核苷酸的數(shù)目上有很大的差異，從少至2個(gè)到9個(gè)或者更多。核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)相對(duì)于AUG起始密碼子的位置(通常從起始位點(diǎn)A開始的-6到-10)對(duì)于翻譯的效率而言是非常重要的。
實(shí)施例VII本發(fā)明還包含了制備大量小的單鏈RNA的方法，該方法涉及簡(jiǎn)單的生化步驟。開發(fā)這一方法使得例如不需要昂貴化學(xué)合成步驟的大量siRNA或者miRNA的生產(chǎn)成為可能。簡(jiǎn)而言之，使用T7RNA聚合酶合成包含多個(gè)串聯(lián)的小的相同序列的RNA。RNA中的串聯(lián)重復(fù)序列被三聯(lián)體序列隔開，三聯(lián)體序列可以被本發(fā)明的mRNA干擾酶，例如MazF(特異切割A(yù)CA序列)或者PemK(特異切割例如UAC序列)特異切割。接下來(lái)使用mRNA干擾酶對(duì)包含由干擾酶識(shí)別序列(即特異的三聯(lián)體序列)隔開的串聯(lián)重復(fù)序列的RNA進(jìn)行處理，干擾酶識(shí)別摻入的位點(diǎn)，這樣就會(huì)產(chǎn)生相同的小RNA。
實(shí)驗(yàn)方法21堿基的CAGGAGAUACCUCAAUGAUCA(SEQ ID NO34)的制備步驟1合成以下兩個(gè)21堿基的DNA片段(5′端被磷酸化)11211 105′p-CTCAATGATCACAGGAGATAC-3′(SEQ ID NO35)3′-TCCTCTATGGAGTTACTAGTG-p 5′(SEQ ID NO36)步驟2連接以獲得多聚體步驟3使用以下兩個(gè)引物進(jìn)行PCR1 12#1 5′-(T7啟動(dòng)子)-GGGACAGGAGATACCT-3′(SEQ ID NO37)#2 3′-TGTCCTCTATGGAGTTACTAGTG-5′(SEQ ID NO38)步驟4使用T7RNA聚合酶從步驟3的DNA片段產(chǎn)生RNA步驟5用MazF處理反應(yīng)步驟4的RNA產(chǎn)物并且純化21堿基的產(chǎn)物。對(duì)于一些應(yīng)用，較好的可能是使用帶His標(biāo)簽的T7RNA聚合酶和/或MazF，這樣可以使用鎳層析柱將它們從反應(yīng)混合物中分離出來(lái)。技術(shù)人員會(huì)理解在目標(biāo)RNA序列內(nèi)部存在ACA三聯(lián)體阻礙了使用MazF作為干擾酶消化RNA。在這種情況下，可以使用例如對(duì)于UAC(U或A)三聯(lián)體序列特異的PemK，而不是MazF?？傊?，應(yīng)該對(duì)所研究的RNA序列進(jìn)行分析以確定存在什么樣的(如果有的話)已知RNA干擾酶的識(shí)別位點(diǎn)。這樣的分析對(duì)于評(píng)價(jià)何種RNA干擾酶能夠用于涉及某一RNA的應(yīng)用時(shí)是有用的。因此本發(fā)明描述了使用簡(jiǎn)單的生化方法制備大量高質(zhì)量小RNA(例如siRNA或者miRNA)的方法。同樣，該方法為昂貴且技術(shù)上復(fù)雜的化學(xué)合成小RNA的方法提供了成本劃算的代替方法。
實(shí)施例VIII使用mRNA干擾酶誘導(dǎo)細(xì)胞死亡MazF和PemK在被誘導(dǎo)時(shí)以序列特異的方式切割細(xì)胞mRNA，并且有效地抑制蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制和細(xì)胞的死亡。已經(jīng)證明在酵母、非洲爪蟾和人細(xì)胞中PemK(Kid)的表達(dá)抑制了細(xì)胞的增殖。在這些細(xì)胞中共表達(dá)PemI(Kis)恢復(fù)了細(xì)胞增殖，因而將細(xì)胞從PemK的抑制中釋放出來(lái)(dela Cueva-Mendez et al.，2003，同上)。如這里以下所描述的，檢查了MazF誘導(dǎo)對(duì)人細(xì)胞的作用。盡管在該實(shí)施例中使用了T-Rex系統(tǒng)(Invitrogen)控制MazF的誘導(dǎo)，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解任何可誘導(dǎo)系統(tǒng)都可以用于本發(fā)明中?？烧T導(dǎo)系統(tǒng)的選擇取決于許多實(shí)驗(yàn)考慮，包括，但是不止限于，誘導(dǎo)要起作用的細(xì)胞類型，所需的表達(dá)水平以及誘導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)。質(zhì)粒和細(xì)胞系大腸桿菌mazF基因克隆到pcDNA4/TO載體(Invitrogen)中，在四環(huán)素操縱子TetO2的控制下，產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA4/TO-MazF。質(zhì)粒pcDNA4/TO-MazF轉(zhuǎn)化到T-Rex-293細(xì)胞(Invitrogen)中，產(chǎn)生T-Rex 293/MazF細(xì)胞系，在該細(xì)胞系中，加入四環(huán)素可誘導(dǎo)MazF的表達(dá)。大腸桿菌mazE基因克隆到pcDNA3載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3-MazE。將pcDNA3-MazE轉(zhuǎn)化到T-Rex 293/MazF細(xì)胞中，產(chǎn)生T-Rex 293/MazF/MazE細(xì)胞系。MazF對(duì)人類細(xì)胞的毒性作用在四環(huán)素的存在下誘導(dǎo)MazF在T-Rex 293/MazF細(xì)胞中的表達(dá)。在不同的時(shí)刻，通過(guò)使用細(xì)胞活性染色劑(0.4％臺(tái)盼蘭溶液，Sigma)染色的方法對(duì)細(xì)胞群中的死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)在相同條件下平行進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，但是沒(méi)有四環(huán)素。如圖38所示，與對(duì)照(未誘導(dǎo))細(xì)胞的形態(tài)相比較，被誘導(dǎo)表達(dá)MazF的T-Rex 293/MazF細(xì)胞的形態(tài)在MazF誘導(dǎo)的第一天就有顯著改變。引人注意的是，大約有50％的被誘導(dǎo)表達(dá)MazF的細(xì)胞到第五天時(shí)已死亡，到第七天時(shí)有80％的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(圖38)。這些結(jié)果表明MazF對(duì)于人細(xì)胞是有毒性的。本發(fā)明包括了對(duì)任何適宜的mRNA干擾酶的使用，這些mRNA干擾酶的表達(dá)對(duì)可誘導(dǎo)調(diào)控元件產(chǎn)生響應(yīng)或者被這些元件調(diào)控。適宜的mRNA干擾酶包括那些在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠介導(dǎo)毒性作用的mRNA干擾酶。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，表達(dá)mRNA干擾酶的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明示例性的mRNA干擾酶包括大腸桿菌MazF的直向同源物和同源物。因此，本發(fā)明還包含在涉及基因治療的應(yīng)用中使用本發(fā)明的mRNA干擾酶?？梢詫⒈还こ袒磉_(dá)某分子(該分子在受試對(duì)象例如人受試者中有缺陷或者缺失)的細(xì)胞設(shè)計(jì)為通過(guò)本發(fā)明的mRNA干擾酶的摻入而自毀的細(xì)胞，干擾酶的表達(dá)被可誘導(dǎo)的調(diào)控元件控制。用于在基因治療應(yīng)用中破壞細(xì)胞的可誘導(dǎo)手段的整合提供了自動(dòng)防故障的機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制，在這些細(xì)胞對(duì)受試對(duì)象產(chǎn)生了有益的作用后和/或在它們可能產(chǎn)生有害作用之前即被清除。
實(shí)施例IXMazF突變體的產(chǎn)生已經(jīng)產(chǎn)生了MazF突變體(E24A)，其中的24位谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代。這個(gè)突變的結(jié)果是由合成底物測(cè)定的mRNA干擾酶活性降低了大約10倍?；诟鞣N原因，MazF活性的降低是重要的。第一，由于突變，MazF(E24A)突變體對(duì)表達(dá)它的宿主細(xì)胞的毒性顯著降低。毒性降低使細(xì)胞內(nèi)MazF突變體的表達(dá)水平提高。在使用例如pET 28a系統(tǒng)時(shí)，已經(jīng)得到了相當(dāng)高的MazF產(chǎn)量(純化后大約15毫克/升)。這一高表達(dá)水平對(duì)于得到相當(dāng)大量的MazF是非常重要的，MazF可以被15N和13C進(jìn)行雙標(biāo)記用于NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定。第二，突變體MazF的低mRNA干擾酶活性對(duì)于測(cè)定MazF二聚體上的RNA相互作用位點(diǎn)是重要的，通過(guò)將RNA底物加入到15N和13C標(biāo)記的MazF樣品中進(jìn)行這一測(cè)定。第三，因?yàn)橥蛔凅wMazF保持了mRNA干擾酶活性，突變體MazF的結(jié)構(gòu)可能與野生型MazF二聚體的三維結(jié)構(gòu)相似，其與RNA復(fù)合的結(jié)構(gòu)預(yù)期會(huì)對(duì)MazF的mRNA干擾酶功能的分子機(jī)制提供信息。突變體MazF的表達(dá)使用pET 28a進(jìn)行，這樣產(chǎn)物含有N端20個(gè)殘基的延伸(圖39A)，延伸含有His標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)。可以從融合蛋白上將N端延伸切下來(lái)，如圖39B所示。圖39A中的箭頭顯示了凝血酶切割位點(diǎn)。為了切割全長(zhǎng)的MazF(E24A)融合蛋白，將0.04單位的凝血酶加入到10微克Ni-NTA純化的(His)6MazF(E24A)中，在4攝氏度孵育8小時(shí)。使用Ni-NTA層析柱除去切下來(lái)的N端片段。圖39顯示了成功切割和切割的MazF融合蛋白的分離(泳道1，純化的(His)6MazF(E24A)；泳道2，凝血酶切割后的(His)6MazF(E24A))。N端延伸去除前和去除后的異核單量子相關(guān)(heteronuclear single quantum coherence)(HSQC)譜線顯示蛋白質(zhì)在室溫下一周內(nèi)都是穩(wěn)定的。此外，已經(jīng)制備了Arg29被Ala替代的MazF突變體。發(fā)現(xiàn)該突變體(R29A)與野生型MazF相比毒性也有降低，這使其可以被過(guò)量表達(dá)。例如純化的15N標(biāo)記的MazF(R29A)已經(jīng)制備出來(lái)，表達(dá)水平是10毫克/升。該突變體也得到了非常好的HSQC譜線。
實(shí)施例X致病細(xì)菌中的MazF同源物的鑒定和性質(zhì)研究來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的MazF同源物的鑒定和性質(zhì)研究結(jié)核病是慢性傳染性疾病，它每年導(dǎo)致200萬(wàn)以上的死亡。它可能是人類最古老的疾病之一，是由結(jié)核分枝桿菌引起的。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌的染色體上鑒定出了一個(gè)基因(rv2801c)，該基因編碼的蛋白與大腸桿菌MazF高度同源。特別地，本發(fā)明的發(fā)明者克隆了rv2801c基因并且確定該基因編碼的含有118個(gè)氨基酸的蛋白與大腸桿菌MazF有40％的一致性。參見圖41A。結(jié)核分枝桿菌MazF基因(這里命名為MazF-mt1)已經(jīng)被克隆到pBAD中；對(duì)于阿拉伯糖誘導(dǎo)的響應(yīng)，從pBAD載體中表達(dá)的MazF-mt1對(duì)于大腸桿菌是有毒性的。重要的是，在MazF-mt1誘導(dǎo)60分鐘后細(xì)胞的菌落形成單位(CFU)減少了大約104倍。MazF-mt1還被克隆到pET28a中，并且成功表達(dá)了帶有(His)6標(biāo)簽的MazF-mt1，并在Ni-NTA層析柱上純化。如圖40所示，MazF-mt1表現(xiàn)出在UAC序列處切割RNA的特異性，這與PemK的特異性相似。因此，MazF-mt1的確是mRNA干擾酶家族蛋白的一個(gè)成員。簡(jiǎn)而言之，使用T7RNA聚合酶合成era mRNA，根據(jù)本發(fā)明中上面的描述進(jìn)行切割反應(yīng)。使用相同的引物得到引物延伸和DNA梯度。MazF-mt1的切割位點(diǎn)用箭頭表示。除了MazF-mt1基因以外，本發(fā)明的發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了另外四個(gè)由結(jié)核分枝桿菌染色體編碼的MazF同源物，其基因組命名分別是Rv0456A，Rv1991C，Rv0659C和Rv1942C。參見圖41B。這些基因與MazF的序列比對(duì)顯示，這些序列中每一個(gè)都是大腸桿菌MazF的同源物，因此被鑒定為結(jié)核分枝桿菌的MazF同源物。由Rv1991c，Rv0456a，Rv0659c和Rv1942c編碼的MazF同源物被分別命名為MazF-mt2，-mt3，-mt4和-mt5。MazF-mt1，mt2，-mt3，-mt4和-mt5的核酸和氨基酸序列在圖43A-E和圖44A-E中示出。編碼MazF-mt2，-mt3，-mt4和-mt5的基因?qū)⒈豢寺〉絧BAD載體中，也將會(huì)根據(jù)前面對(duì)于MazF-mt1的描述進(jìn)行檢查在阿拉伯糖存在下誘導(dǎo)它們表達(dá)之后它們對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響。也會(huì)根據(jù)以上的詳述，使用Northern印跡和引物延伸分析檢查在結(jié)核分枝桿菌MazF同源物誘導(dǎo)后的體內(nèi)mRNA切割。也會(huì)檢查結(jié)核分枝桿菌MazF同源物存在下的體外和體內(nèi)蛋白質(zhì)合成。五個(gè)結(jié)核分枝桿菌MazF基因中的每一個(gè)都會(huì)被克隆到分枝桿菌表達(dá)載體pMIP12(Picardeau et al.(2003)FEMS MicrobiolLett 229，277-281)中，使它們?cè)趷u垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)(一個(gè)非致病菌、生長(zhǎng)迅速的模型，屬于分枝桿菌屬)中表達(dá)，檢測(cè)它們?cè)诓煌L(zhǎng)條件下在該細(xì)菌中的毒性作用。特別有趣的是闡釋MazF-mt的基因在結(jié)核分枝桿菌中是如何被調(diào)控的。結(jié)核桿菌的致病取決于肺部肉芽腫的形成，肉芽腫是結(jié)核菌在處于由于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制所導(dǎo)致的非生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)存在的位置。理解結(jié)核菌在這個(gè)潛伏期的生理對(duì)于改進(jìn)這種破壞性疾病的診斷和治療是非常重要的。在不同生長(zhǎng)條件下進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌基因的DNA微陣列分析，以確定在對(duì)這些條件產(chǎn)生應(yīng)答時(shí)MazF-mt基因是如何被調(diào)控的。細(xì)菌的毒素-抗毒素對(duì)的冗余性提示它們?cè)诩?xì)胞生理中起著重要作用。已經(jīng)研究了各種不同的生長(zhǎng)條件，以發(fā)現(xiàn)編碼這些分子的基因被誘導(dǎo)表達(dá)的體外條件。許多研究提示mazF被誘導(dǎo)的條件之一取決于ppGppp和嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答。例如，一個(gè)最早期的觀察結(jié)果是大腸桿菌mazEF缺失突變體在人為升高ppGppp的水平之后并沒(méi)有死亡(Aizenman et al.，1996，同上)。編碼ppGpp合成酶的結(jié)核分枝桿菌的relA基因已經(jīng)被克隆并且進(jìn)行了性質(zhì)研究，顯示其在體外的長(zhǎng)期存活中起作用(Primm et al.，2000，J Bacteriol 182，4889-4898)。那些研究人員證明在所有以下列舉的條件下ppGpp(p)的水平升高。為了延伸這些發(fā)現(xiàn)，以研究MazF同源物對(duì)各種不同生長(zhǎng)條件的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，從毒性結(jié)核分枝桿菌(菌株H37Rv)中制備RNA，用以下列出的條件對(duì)RNA進(jìn)行處理，進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)研究MazF同源物的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。生長(zhǎng)條件穩(wěn)定期H37Rv細(xì)胞在通常的分枝桿菌培養(yǎng)基(Middlebrook 7H9，添加了0.2％葡萄糖，0.2％甘油，0.5％BSA第五級(jí)分以及0.1％Tween80)。在達(dá)到OD600后，(結(jié)核分枝桿菌的倍增時(shí)間是大約24小時(shí))，是3天的穩(wěn)定期，之后制備細(xì)胞的總RNA。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照是對(duì)數(shù)中期生長(zhǎng)的細(xì)胞的RNA。
疊氮化物中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H37Rv細(xì)胞分成兩個(gè)培養(yǎng)物一份使用5mM疊氮化鈉處理2小時(shí)。
碳饑餓用無(wú)碳源的7H9培養(yǎng)基漂洗早期到中期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H37Rv細(xì)胞，并用該培養(yǎng)基重懸24小時(shí)。
氨基酸下調(diào)H37Rv細(xì)胞在添加20種氨基酸的7H9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期。培養(yǎng)物用無(wú)氨基酸的培養(yǎng)基充分漂洗，分成兩份，分別加入新鮮的含有氨基酸和沒(méi)有氨基酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)。
氨基酸饑餓使用絲氨酸hydroxymate處理的大腸桿菌細(xì)胞使其對(duì)L-絲氨酸饑餓，已經(jīng)顯示這樣的大腸桿菌被誘導(dǎo)表達(dá)mazEF基因座(Christensen et al.，2003，同上)。使用絲氨酸hydroxymate處理的結(jié)核分枝桿菌沒(méi)有顯示ppGpp(p)的升高，提示該物種可能對(duì)這個(gè)氨基酸類似物的毒性不敏感(Primm et al.，2000，同上)。將會(huì)對(duì)具有已經(jīng)鑒定的毒性作用的氨基酸類似物誘導(dǎo)MazF-mt同源物的能力進(jìn)行檢測(cè)。
抗生素處理檢測(cè)已知在結(jié)核分枝桿菌中影響蛋白質(zhì)合成(鏈霉素)和RNA轉(zhuǎn)錄(利福平)的抗生素，在H37Rv中誘導(dǎo)MazF同源物的能力。
在全世界三分之一的人口中，結(jié)核分枝桿菌以潛伏狀態(tài)存在，被封閉在肉芽腫中，推測(cè)其不能接觸到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或者氧氣(Flynn andChan，2001，Annu Rev Immunol 19，93-129)。如果宿主的免疫系統(tǒng)由于某種原因受到損害(例如HIV狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)不良等)則疾病就會(huì)被重新激活。
引起警醒的是，在世界上受到HIV困擾的區(qū)域，潛伏的結(jié)核病例逐漸增多，這些病例對(duì)許多藥物具有抗性，因此很難或者不可能治療。因此，了解駕馭這些直接細(xì)菌生長(zhǎng)控制內(nèi)源機(jī)制的機(jī)制，對(duì)于開發(fā)出治療這一破壞性疾病的新型療法提供了巨大的希望。
因此，確定內(nèi)源MazF-mt基因在潛伏和激活/重新激活狀態(tài)中的作用，會(huì)為設(shè)計(jì)和/或發(fā)現(xiàn)替代性治療因子提供有用的信息。本發(fā)明的發(fā)明者還使用了BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)MazF同源物存在于許多原核生物體中，包括其他的病原體例如金黃色葡萄球菌和炭疽芽孢桿菌。參見圖41。特別地，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了MazF的同源物MV1993(MazF-sal)。參見圖41B。金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，它是導(dǎo)致在醫(yī)院中醫(yī)源性感染的最為常見的革蘭氏陽(yáng)性病原體。大腸桿菌MazF和MazF-sal顯示25％的一致性和44％的相似性。
此外，MazF同源物還在炭疽芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中被發(fā)現(xiàn)。參見圖41B。大腸桿菌MazF與其枯草芽孢桿菌中的同源物(MazF-bsl)顯示32％的一致性和48％的相似性，與其炭疽芽孢桿菌中的同源物(MazF-bal)顯示32％的一致性和48％的相似性。炭疽芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌都是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。MazF-bsl和MazF-bal之間只有7個(gè)氨基酸替代。圖41B中顯示了氨基酸序列和位置的差異，且在這里予以詳述首先顯示的是MazF-bsl殘基的單字母縮寫，然后是數(shù)字表示的位置，然后是MazF-bal殘基的單字母縮寫(A42V，R66K，D97E，E98V，D101I，K102R和A112G)。金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，炭疽芽孢桿菌中的MazF(類Pem)同源物的核酸和氨基酸序列，以及大腸桿菌ChpBK序列示于圖45A-D和圖46A-D中。
實(shí)施例XI大腸桿菌中SPP系統(tǒng)的優(yōu)化可以通過(guò)改變不同的生長(zhǎng)條件(以及其他的實(shí)驗(yàn)參數(shù))，對(duì)本發(fā)明的大腸桿菌SPP系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，用于表達(dá)不同蛋白質(zhì)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，關(guān)于這方面要達(dá)到的目標(biāo)包括(a)MazF誘導(dǎo)后細(xì)胞蛋白質(zhì)合成能力維持期的延長(zhǎng)；(b)降低或者去除背景細(xì)胞蛋白的合成以及(c)所需蛋白表達(dá)水平的提高。還應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的SPP系統(tǒng)可能包括非MazF的mRNA干擾酶的表達(dá)。也可以在SPP的背景下考慮可能有助于表達(dá)和/或產(chǎn)物穩(wěn)定性的共表達(dá)因子，以使目標(biāo)多肽獲得改善或者優(yōu)化的表達(dá)水平。
本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)改變了MazF誘導(dǎo)之后的許多培養(yǎng)條件，以優(yōu)化目標(biāo)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。盡管這些實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是優(yōu)化人嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的表達(dá)，但是這些原理也同樣很好地適用于其他蛋白的表達(dá)。開始，使用大腸桿菌偏好的密碼子合成嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的基因，但是去除了基因中所有的ACA序列。合成的基因克隆到pColdI載體中，使得在冷激或者溫度下移至15攝氏度誘導(dǎo)后能夠表達(dá)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白。使用這個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白系統(tǒng)，改變條件，延長(zhǎng)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白在MazF誘導(dǎo)之后的表達(dá)，如下面的描述。
本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)確定在37攝氏度誘導(dǎo)MazF之后15攝氏度誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白顯著影響了嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的生產(chǎn)。特別地，15攝氏度誘導(dǎo)MazF和37攝氏度誘導(dǎo)MazF的比較顯示，在較高溫度下誘導(dǎo)MazF顯著降低了由于一般細(xì)胞蛋白合成而造成的背景。這個(gè)發(fā)現(xiàn)的證據(jù)是幾乎沒(méi)有可以檢測(cè)到的對(duì)應(yīng)于細(xì)胞蛋白表達(dá)的蛋白條帶。但是在這些實(shí)驗(yàn)條件下，嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的合成卻顯著下降。在更高的溫度下，MazF可能會(huì)因?yàn)?，例如在更高溫度下核糖體/tRNA對(duì)MazF的核糖核酸酶活性更為敏感；和/或37攝氏度下蛋白質(zhì)合成、核苷酸和氨基酸生物合成所需要的其他細(xì)胞組分穩(wěn)定性的降低，以及37攝氏度下的能量產(chǎn)生等原因?qū)?xì)胞產(chǎn)生破壞。
由于這些因素不能在MazF誘導(dǎo)之后的細(xì)胞中產(chǎn)生，它們的喪失或者減少將導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白生產(chǎn)能力的下降。
為了優(yōu)化蛋白表達(dá)，可以改變一系列的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括以下描述的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解以下條件的描述涉及的是MazF和嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白，但是也同樣很好地適用于其他mRNA干擾酶和所需多肽的組合。攜帶pACYCmazF和pCold(SP)eotaxin的大腸桿菌BL21(DE3)在M9基本培養(yǎng)基(每一管15毫升培養(yǎng)物)中培養(yǎng)，37攝氏度生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600＝0.5到0.8)。然后在5個(gè)不同的溫度37，30，25，20和15攝氏度下誘導(dǎo)MazF。在這些不同的溫度下預(yù)孵育10分鐘后，加入1mM IPTG誘導(dǎo)MazF表達(dá)5，10和15分鐘。然后在15攝氏度下維持培養(yǎng)物，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白。在冷激后的0，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，72和96小時(shí)用35S-甲硫氨酸標(biāo)記細(xì)胞15分鐘?？偧?xì)胞蛋白的SDS-PAGE分析揭示了考慮到背景細(xì)胞蛋白合成、嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白生產(chǎn)速率和嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白生產(chǎn)持續(xù)性后的SPP系統(tǒng)的優(yōu)選條件。對(duì)于這次檢測(cè)和其他多肽的類似的分析，使用考馬斯亮藍(lán)染色估計(jì)在每一時(shí)刻產(chǎn)生的嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白或者其他多肽的實(shí)際量。
細(xì)胞內(nèi)蛋白酶例如Lon和ClpP的活性，也可以影響蛋白質(zhì)的積累和穩(wěn)定性。已經(jīng)證明，例如clpP和lon中的突變(單突變或者雙突變)顯著降低了大腸桿菌菌株中細(xì)胞蛋白的降解(Kandror et al.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 94，4978-4981)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，將這些突變轉(zhuǎn)導(dǎo)入BL21(DE3)細(xì)胞中，構(gòu)建具有這些突變(lon，clpP和lon-clpP)的菌株，改進(jìn)SPP系統(tǒng)。因此，檢查BL21(DE3)細(xì)胞中多肽的積累(在該細(xì)胞中這些蛋白酶基因的一個(gè)或者多個(gè)已經(jīng)被刪除)，可以發(fā)現(xiàn)在SPP系統(tǒng)中嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)之后3-4天，蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提高。這樣，可以建立用于大腸桿菌SPP系統(tǒng)的特定條件，以得到嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白的最高生產(chǎn)和最低背景的細(xì)胞蛋白合成。而且，如這里以上所描述的，這種實(shí)驗(yàn)方案同樣很好地適用于使用了不同mRNA干擾酶和多肽的其他SPP系統(tǒng)。
另外一個(gè)降低背景細(xì)胞蛋白合成的措施是提高M(jìn)azF的生產(chǎn)。這個(gè)目的可以通過(guò)去除mazF基因中的ACA序列達(dá)到，ACA序列的存在可能導(dǎo)致MazF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解。令人驚奇的是，在編碼111個(gè)殘基蛋白的mazF ORF中總共有9個(gè)ACA序列。就根據(jù)隨機(jī)可能性預(yù)測(cè)的頻率而言，這一ACA序列的頻率是非常高的。
這些ACA序列可能在MazF的自我調(diào)控中起作用，在自我調(diào)控中，MazF在其自身mRNA的這些ACA位點(diǎn)處切割，這樣導(dǎo)致MazF蛋白產(chǎn)量的顯著下降。根據(jù)這些考慮，設(shè)想將mazF ORF中的一些或者所有的ACA序列除去。參見圖42。重要的是，在MazF中設(shè)想的堿基改變不會(huì)改變MazF的氨基酸序列。開始，使用基于PCR的方法改變MazF N端的前6個(gè)殘基，產(chǎn)生的基因被命名為mazFa。
獨(dú)立地改變C端的三個(gè)ACA序列，以及將編碼Leu99的密碼子從UUA改變?yōu)镃UG，CUG是大腸桿菌更為偏好的亮氨酸密碼子。產(chǎn)生的基因被命名為mazFb。mazFa和mazFb突變的組合產(chǎn)生了所有ACA序列都被除去的mazFa.b。
使用野生型mazF、mazFa(-6ACA)，mazFb(-3ACA)和mazFab(-9ACA)，可以在SPP系統(tǒng)中測(cè)定ACA序列從MazF中去除所產(chǎn)生的作用。在實(shí)驗(yàn)中，將pACYC mazF中的野生型mazF基因替換為mazFa，mazFb或mazFab。使用這四個(gè)質(zhì)粒，就有可能檢查從mazF中去除ACA序列如何有效地降低背景蛋白的合成。
為了使用SPP系統(tǒng)獲得更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，優(yōu)選地使用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基例如LB，而不使用M9培養(yǎng)基。因此，實(shí)驗(yàn)參數(shù)的調(diào)整是用于優(yōu)化在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的條件?？梢愿鶕?jù)這里以上的描述，優(yōu)化各種不同的生長(zhǎng)條件用于在LB培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。這些條件包括，但是不止限于，MazF誘導(dǎo)的最佳條件，MazF誘導(dǎo)的最佳時(shí)間長(zhǎng)度，嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白生產(chǎn)的最適溫度以及得到最大嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白產(chǎn)量的最佳孵育時(shí)間。
盡管對(duì)這些實(shí)驗(yàn)的描述是以它們使用嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白生產(chǎn)作為模型系統(tǒng)，但是不同蛋白達(dá)到最高產(chǎn)量的最佳條件可能有所不同。因此對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)蛋白可能需要小的實(shí)驗(yàn)調(diào)整以獲得最佳的表達(dá)水平。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他生長(zhǎng)培養(yǎng)基與SPP系統(tǒng)聯(lián)合使用，并且根據(jù)以上對(duì)M9和LB培養(yǎng)基的描述對(duì)在其他培養(yǎng)基中的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。
正如以上所描述的，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)來(lái)自質(zhì)粒R100的mRNA干擾酶稱為PemK，它在UAC/A/U序列處切割mRNA。參見實(shí)施例IV。已經(jīng)鑒定出了許多其他的mRNA干擾酶，包括大腸桿菌的ChpBK、來(lái)自結(jié)核分枝桿菌的5個(gè)不同的mRNA干擾酶以及來(lái)自炭疽芽孢桿菌的一個(gè)mRNA干擾酶。
所有上面列出的mRNA干擾酶是可能有用的候選者，可以有利地用于改善SPP系統(tǒng)。一旦它們的RNA切割特異性被研究清楚，可以測(cè)定它們?cè)赟PP系統(tǒng)中的有效性，并且與MazF的效果進(jìn)行比較。因?yàn)檫@些mRNA干擾酶預(yù)期具有不同的RNA切割特異性，它們可能在降低背景細(xì)胞蛋白合成方面更為有效，因此比MazF對(duì)細(xì)胞的破壞要小。這些mRNA干擾酶不僅僅對(duì)于大腸桿菌中SPP系統(tǒng)的開發(fā)，而且對(duì)于在其他生物體包括酵母中SPP系統(tǒng)的開發(fā)也是有用的工具。
這里描述的大腸桿菌SPP系統(tǒng)使用了pColdI載體，它在低溫下誘導(dǎo)蛋白的生產(chǎn)。低溫下的蛋白生產(chǎn)對(duì)于許多蛋白來(lái)講是有益的，因?yàn)樵谳^低的溫度下它們通常折疊得更為有效且穩(wěn)定。
而且，共表達(dá)分子伴侶可以在SPP系統(tǒng)中進(jìn)一步提高正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。對(duì)于這個(gè)目的，被稱為觸發(fā)因子(Kandror andGoldberg，1997，同上)的冷激分子伴侶的基因已經(jīng)被克隆并且用于本發(fā)明的SPP系統(tǒng)中。因?yàn)橛|發(fā)因子被認(rèn)為在低溫下幫助蛋白的折疊，可以在SPP系統(tǒng)中利用共表達(dá)觸發(fā)因子對(duì)于所需蛋白表達(dá)的影響。觸發(fā)因子的基因以及GroEL和GroES(熱激分子伴侶)也將被克隆到pColdI載體中，檢查蛋白質(zhì)的產(chǎn)量以及對(duì)所表達(dá)的蛋白質(zhì)可溶性的影響。
盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了以上詳細(xì)的描述和特別的闡釋，但是目的不是將本發(fā)明限制在這些實(shí)施方案中。在不偏離如下面的權(quán)利要求所提出的本發(fā)明范疇和精神的情況下可以進(jìn)行各種不同的改動(dòng)。
序列表<110>Inouye，MasayoriZhang，JunjieZhang，Yong LongQing，GuoliangSuzuki，Motoo<120>mRNA干擾酶及其使用方法<130>University of Medicine & Dentistry of New Jersey(601-1-131PCT)<140>Not yet assigned<141>2004-06-14<150>60/543,693<151>2004-02-11<150>60/478,515<151>2003-06-13<160>92<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>336<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336<210>2<211>111<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp1 5 10 15Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val20 25 30Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys35 40 45Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu50 55 60Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser65 70 75 80Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro85 90 95Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly100 105 110
<210>3<211>333<212>DNA<213>大腸桿菌<400>3atggaaagag gggaaatctg gcttgtctcg cttgatccta ccgcaggtca tgagcagcag 60ggaacgcggc cggtgctgat tgtcacaccg gcggccttta atcgcgtgac ccgcctgcct 120gttgttgtgc ccgtaaccag cggaggcaat tttgcccgca ctgccggctt tgcggtgtcg 180ttggatggtg ttggcatacg taccacaggt gttgtacgtt gcgatcaacc ccggacaatt 240gatatgaaag cacggggcgg aaaacgactc gaacgggttc cggagactat catgaacgaa 300gttcttggcc gcctgtccac tattctgact tga 333<210>4<211>110<212>PRT<213>大腸桿菌<400>4Met Glu Arg Gly Glu Ile Trp Leu Val Ser Leu Asp Pro Thr Ala Gly1 5 10 15His Glu Gln Gln Gly Thr Arg Pro Val Leu Ile Val Thr Pro Ala Ala20 25 30Phe Asn Arg Val Thr Arg Leu Pro Val Val Val Pro Val Thr Ser Gly35 40 45Gly Asn Phe Ala Arg Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Asp Gly Val50 55 60Gly Ile Arg Thr Thr Gly Val Val Arg Cys Asp Gln Pro Arg Thr Ile65 70 75 80Asp Met Lys Ala Arg Gly Gly Lys Arg Leu Glu Arg Val Pro Glu Thr85 90 95Ile Met Asn Glu Val Leu Gly Arg Leu Ser Thr Ile Leu Thr100 105 110<210>5<211>249<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5atgatccaca gtagcgtaaa gcgttgggga aattcaccgg cggtgcggat cccggctacg 60ttaatgcagg cgctcaatct gaatattgat gatgaagtga agattgacct ggtggatggc 120aaattaatta ttgagccagt gcgtaaagag cccgtattta cgcttgctga actggtcaac 180gacatcacgc cggaaaacct ccacgagaat atcgactggg gagagccgaa agataaggaa 240gtctggtaa 249<210>6<211>82<212>PRT<213>大腸桿菌<400>6Met Ile His Ser Ser Val Lys Arg Trp Gly Asn Ser Pro Ala Val Arg1 5 10 15Ile Pro Ala Thr Leu Met Gln Ala Leu Asn Leu Asn Ile Asp Asp Glu20 25 30Val Lys Ile Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg35 40 45Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro50 55 60Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu65 70 75 80Val Trp
<210>7<211>258<212>DNA<213>大腸桿菌<400>7atgcatacca cccgactgaa gagggttggc ggctcagtta tgctgaccgt cccaccggca 60ctgctgaatg cgctgtctct gggcacagat aatgaagttg gcatggtcat tgataatggc 120cggctgattg ttgagccgta cagacgcccg caatattcac tggctgagct actggcacag 180tgtgatccga atgctgaaat atcagctgaa gaacgagaat ggctggatgc accggcgact 240ggtcaggagg aaatctga 258<210>8<211>85<212>PRT<213>大腸桿菌<400>8Met His Thr Thr Arg Leu Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr1 5 10 15Val Pro Pro Ala Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu20 25 30Val Gly Met Val Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro Tyr Arg35 40 45Arg Pro Gln Tyr Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn50 55 60Ala Glu Ile Ser Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Thr65 70 75 80Gly Gln Glu Glu Ile85<210>9<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T54 to K77 fragment of E.coli MazE<400>9Thr Leu Ala Glu Leu Val Asn AspIle Thr Pro Glu Asn Leu His Glu1 5 10 15Asn Ile Asp Trp Gly Glu Pro Lys20<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大腸桿菌MazE的N60-K77片段<400>10Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp Gly Glu1 5 10 15Pro Lys
<210>11<211>30<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>合成的RNA底物<400>11uaagaaggag auauacauau gaaucaaauc 30<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>12gctcgtatct acaatgtaga ttgatatata ctgtatctac atatgatagc50<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>13cgagcataga tgttacatct aactatatat gacatagatg tatactatcg50<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14agatctcgat cccgcaaatt aat 23<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>15ttagagatca atttcctgcc gttttac 27<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>16ttaaagatcg tcaacgtaac cg 22
<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>17tgctctttat cccacgggca gc 22<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>18gcccagttca ccgcgaagat cgtc 24<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>19ggttttgatt tgctcccaac gggcaag 27<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>20catttcctcc tccagtttag cctggtc27<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>21ttgccagact tcttccattg tttcgag27<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>22gatccccaca atgcggtgac gagt 24
<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>23cacgttgtcc actttgttca ccgc 24<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>24cagttcagcg ccgaggaaac gcat 24<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>25gcgttcgtcg tcggcccaac cgga 24<210>26<211>30<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>反義RNA<400>26gauuugauuc auauguauau cuccuucuua 30<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>互補(bǔ)DNA<400>27gatttgattc tatgtatat ctccttctta 30<210>28<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>28agaatgtgcg ccatttttca ct 22
<210>29<211>9<212>DMA<213>人工序列<220>
<223>DNA片段<400>29taatacacc 9<210>30<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>30atgaatcaca aagtg 15<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA片段<400>31catcatcatc atcatcat18<210>32<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA片段<400>32atcgaaggta gg 12<210>33<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>多克隆位點(diǎn)<400>33catatggagc tcggtaccct cgagggatcc gaattcaagc ttgtcgacct gcagtctaga 60<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>34caggagauac cucaaugauc a21
<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>35ctcaatgatc acaggagata c21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>36tcctctatgg agttactagt g21<210>37<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>37gggacaggag atacc t 16<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>38tgtcctctat ggagttacta gtg 23<210>39<211>330<212>DNA<213>耐鹽芽孢桿菌<400>39atgccagtac cggatagagg gaatcttgtt tatgtagact ttaacccaca atcgggtcat 60gaccaagccg ggacacgacc ggctattgtt ttgtccccta aattatttaa taaaaacaca 120ggttttgcgg tggtttgtcc aattaccaga caacaaaaag gttatccttt tgaaatagaa 180ataccaccgg ggttacctat tgaaggggtt attcttactg accaagtaaa aagtctggat 240tggagagcaa gaaactttca cattaaagga caagcaccag aggaaactgt tactgattgt 300ttacaactta ttcatacatt tttatcttaa 330<210>40<211>363<212>DNA<213>表皮葡萄球菌<400>40atgattagaa gaggagatgt ttatttagcg gatttatcac cagttcaagg gtctgaacaa 60gggggagtaa gacctgtagt tatcattcaa aatgatactg gtaataaata tagtccaact 120gtaattgtag ctgcgattac tgatgggatt aataaagcga aaataccaac ccacgtagaa 180
attgaaaaga aaaagtataa attagacaaa gattcagtta ttcttcttga acaaattaga 240acactagata aaaagcgttt aaaagaaaaa ttaacatttt tatcagagag taaaatgata 300gaggttgata atgccttaga tattagtttg ggattaaata actttgatca tcataaatct 360taa 363<210>41<211>411<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>41atgattagac gaggagatgt ttatttagca gatttatcac cagtacaggg atctgaacaa 60gggggagtca gacctgtagt cataattcaa aatgatactg gtaataaata tagtcctaca 120gttattgttg cggcaataac tggtaggatt aataaagcga aaataccgac acatgtagag 180attgaaaaga aaaagtataa gttggataaa gactcagtta tattattaga acaaattcgt 240acacttgata aaaaacgatt gaaagaaaaa ctgacgtact tatccgatga taaaatgaaa 300gaagtagata atgcactaat gattagttta gggctgaatg cagtagctca accagaaaaa 360ttaggcgtct attatatgta tttttcagag ataaataaaa tattgatata a 411<210>42<211>351<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<400>42ttgattgtga aacgcggcga tgtttatttt gctgatttat ctcctgttgt tggctcagag 60caaggcgggg tgcgcccggt tttagtgatc caaaatgaca tcggaaatcg cttcagccca 120actgctattg ttgcagccat aacagcacaa atacagaaag cgaaattacc aacccacgtc 180gaaatcgatg caaaacgcta cggttttgaa agagattccg ttattttgct ggagcaaatt 240cggacgattg acaagcaaag gttaacggat aagattactc atctggatga tgaaatgatg 300gataaggttg atgaagcctt acaaatcagt ttggcactca ttgattttta g 351<210>43<211>324<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>43atggatatgg tagtacgcgg cggaatctat ctggtctcct tagacccgac cgtaggaagc 60gaaatcaaaa agacacgtcc ttgtgtcgta gtctctcctc ctgaaataca caactatctc 120aagactgtgc tgatcgttcc catgacgagc ggaagccgtc ctgccccgtt ccgcgtcaat 180gtccgctttc aggataaaga cggtttgctt ttgcccgaac agattagggc tgtggataaa 240gccggattgg tcaaacatct tggcaattta gacaacagta cggctgaaaa actgtttgca 300gtattgcagg agatgtttgc ctga324<210>44<211>366<212>DNA<213>摩氏摩根氏菌<400>44atgcgccggc ggctggtcag gaggaaatct gacatggaaa gaggggaaat ctggcttgtc 60tcgcttgacc ctaccgcagg tcatgagcag cagggaacgc ggccggtact gattgtcacg 120ccggctgctt ttaaccgcgt gacccgcctg cctgttgttg tgcccgtgac cagcggaggt 180aattttgccc gcacagcagg ctttgctgtg tcgcttgacg gcgccggcat acgtaccacc 240ggcgttgtgc gttgcgatca accccggacg atcgatatga aagcccgcgg cggcaaacga 300ctcgaacggg tgccagagac tatcatggac gacgttcttg gccgtctggc caccatcctg 360acctga366<210>45<211>321<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>45gtggtgattc ggggagcggt ctacagggtc gacttcggcg atgcgaagcg aggccacgag 60
caacgcgggc ggcgctacgc cgtggtcatc agccccggct cgatgccgtg gagtgtagta 120accgtggtgc cgacgtcgac aagcgcccaa cctgcggttt tccgaccaga gctggaagtc 180atgggaacaa agacacggtt cctggtggat cagatccgga cgatcggcat cgtctatgtg 240cacggcgatc cggtcgacta tctggaccgt gaccaaatgg ccaaggtgga acacgccgtg 300gcacgatacc ttggtctgtg a 321<210>46<211>109<212>PRT<213>耐鹽芽孢桿菌<400>46Met Pro Val Pro Asp Arg Gly Asn Leu Val Tyr Val Asp Phe Asn Pro1 5 10 15Gln Ser Gly His Asp Gln Ala Gly Thr Arg Pro Ala Ile Val Leu Ser20 25 30Pro Lys Leu Phe Asn Lys Asn Thr Gly Phe Ala Val Val Cys Pro Ile35 40 45Thr Arg Gln Gln Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Ile Glu Ile Pro Pro Gly50 55 60Leu Pro Ile Glu Gly Val Ile Leu Thr Asp Gln Val Lys Ser Leu Asp65 70 75 80Trp Arg Ala Arg Asn Phe His Ile Lys Gly Gln Ala Pro Glu Glu Thr85 90 95Val Thr Asp Cys Leu Gln Leu Ile His Thr Phe Leu Ser100 105<210>47<211>120<212>PRT<213>表皮葡萄球菌<400>47Met Ile Arg Arg Gly Asp Val Tyr Leu Ala Asp Leu Ser Pro Val Gln1 5 10 15Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Val Ile Ile Gln Asn Asp20 25 30Thr Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr Asp35 40 45Gly Ile Asn Lys Ala Lys Ile Pro Thr His Val Glu Ile Glu Lys Lys50 55 60Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile Arg65 70 75 80Thr Leu Asp Lys Lys Arg Leu Lys Glu Lys Leu Thr Phe Leu Ser Glu85 90 95Ser Lys Met Ile Glu Val Asp Asn Ala Leu Asp Ile Ser Leu Gly Leu100 105 110Asn Asn Phe Asp His His Lys Ser115 120<210>48<211>136<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>48Met Ile Arg Arg Gly Asp Val Tyr Leu Ala Asp Leu Ser Pro Val Gln1 5 10 15Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Val Ile Ile Gln Asn Asp20 25 30Thr Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr Gly35 40 45Arg Ile Asn Lys Ala Lys Ile Pro Thr His Val Glu Ile Glu Lys Lys50 55 60
Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile Arg65 70 75 80Thr Leu Asp Lys Lys Arg Leu Lys Glu Lys Leu Thr Tyr Leu Ser Asp85 90 95Asp Lys Met Lys Glu Val Asp Asn Ala Leu Met Ile Ser Leu Gly Leu100 105 110Asn Ala Val Ala Gln Pro Glu Lys Leu Gly Val Tyr Tyr Met Tyr Phe115 120 125Ser Glu Ile Asn Lys Ile Leu Ile130 135<210>49<211>116<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>49Met Ile Val Lys Arg Gly Asp Val Tyr Phe Ala Asp Leu Ser Pro Val1 5 10 15Val Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Asn20 25 30Asp Ile Gly Asn Arg Phe Ser Pro Thr Ala Ile Val Ala Ala Ile Thr35 40 45Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Leu Pro Thr His Val Glu Ile Asp Ala50 55 60Lys Arg Tyr Gly Phe Glu Arg Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile65 70 75 80Arg Thr Ile Asp Lys Gln Arg Leu Thr Asp Lys Ile Thr His Leu Asp85 90 95Asp Glu Met Met Asp Lys Val Asp Glu Ala Leu Gln Ile Ser Leu Ala100 105 110Leu Ile Asp Phe115<210>50<211>115<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>50Met Tyr Ile Pro Asp Lys Gly Asp Ile Phe His Leu Asn Phe Asp Pro1 5 10 15Ser Ser Gly Lys Glu Ile Lys Gly Gly Arg Phe Ala Leu Ala Leu Ser20 25 30Pro Lys Ala Phe Asn Arg Ala Thr Gly Leu Val Phe Ala Cys Pro Ile35 40 45Ser Gln Gly Asn Ala Ala Ala Ala Arg Ser Ser Gly Met Ile Ser Thr50 55 60Leu Leu Gly Ala Gly Thr Glu Thr Gln Gly Asn Val His Cys His Gln65 70 75 80Leu Lys Ser Leu Asp Trp Gln Ile Arg Lys Ala Ser Phe Lys Glu Thr85 90 95Val Pro Asp Tyr Val Leu Asp Asp Val Leu Ala Arg Ile Gly Ala Val100 105 110Leu Phe Asp115
<210>51<211>121<212>PRT<213>摩氏摩根氏菌<400>51Met Arg Arg Arg Leu Val Arg Arg Lys Ser Asp Met Glu Arg Gly Glu1 5 10 15Ile Trp Leu Val Ser Leu Asp Pro Thr Ala Gly His Glu Gln Gln Gly20 25 30Thr Arg Pro Val Leu Ile Val Thr Pro Ala Ala Phe Asn Arg Val Thr35 40 45Arg Leu Pro Val Val Val Pro Val Thr Ser Gly Gly Asn Phe Ala Arg50 55 60Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Ile Arg Thr Thr65 70 75 80Gly Val Val Arg Cys Asp Gln Pro Arg Thr Ile Asp Met Lys Ala Arg85 90 95Gly Gly Lys Arg Leu Glu Arg Val Pro Glu Thr Ile Met Asp Asp Val100 105 110Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ile Leu Thr115 120<210>52<211>118<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>52Met Met Arg Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg1 5 10 15Gly Ser Glu Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ala Val Val Val Ser Asn Asp20 25 30Arg Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Leu Gly Arg Gly Val Ile Thr Val35 40 45Val Pro Val Thr Ser Asn Ile Ala Lys Val Tyr Pro Phe Gln Val Leu50 55 60Leu Ser Ala Thr Thr Thr Gly Leu Gln Val Asp Cys Lys Ala Gln Ala65 70 75 80Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ala Thr Glu Arg Leu Leu Arg Pro Ile Gly85 90 95Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu100 105 110His Leu Asp Leu Trp Ser115<210>53<211>243<212>DNA<213>耐放射異常球菌<400>53atgacgagtc aaattcagaa atggggcaac agcctcgcgc tccgcattcc caaagctctg 60gcgcagcagg tgggactgac gcagagttca gaagtggagc tgcttcttca ggacggtcag 120attgtcatcc ggccagttcc tgctcggcag tacgatctcg ccgcgctgct ggccgaaatg 180acacctgaaa atctgcatgg ggaaacagac tggggcgcac tggaaggacg cgaggaatgg 240taa 243
<210>54<211>246<212>DNA<213>耐鹽芽孢桿菌<400>54gtgacactca tgactactat acaaaagtgg ggaaatagtt tagctgttcg tattccgaac 60cattatgcta aacatattaa cgttacgcaa ggatctgaaa ttgaactaag cttagggagt 120gatcaaacga ttattttaaa gcctaaaaaa agaaagccaa cattagagga attagtggca 180aaaatcactc ctgaaaacag acataacgaa attgatttcg ggagaacagg aaaggaattg 240ttgtaa246<210>55<211>258<212>DNA<213>大腸桿菌質(zhì)粒R100<400>55atgcatacca cccgactgaa gagggttggc ggctcagtta tgctgaccgt cccaccggca 60ctgctgaatg cgctgtctct gggcacagat aatgaagttg gcatggtcat tgataatggc 120cggctgattg ttgagccgta cagacgcccg caatattcac tggctgagct actggcacag 180tgtgatccga atgctgaaat atcagctgaa gaacgagaat ggctggatgc accggcgact 240ggtcaggagg aaatctga 258<210>56<211>294<212>DNA<213>大腸桿菌質(zhì)粒R466b<400>56atgttatatt taaatataac ttttatggag ggaaaaatgc ataccactcg actgaagaag 60gttggcggct cagtcatgct gaccgtccca ccggcactgc tgaatgcgct gtcgctgggt 120acagataatg aagttggcat ggtcattgat aatggccggc tgattgtgga gccgcacaga 180cgcccgcagt attcactggc tgagctgttg gcacagtgcg atccgaacgc tgaaatctcg 240gcagaagaac gtgaatggct ggatgcgccg gcggctggtc aggaggaaat ctga 294<210>57<211>258<212>DNA<213>大腸桿菌<400>57gtgcagatgc gtattaccat aaaaagatgg gggaacagtg caggtatggt cattcccaat 60atcgtaatga aagaacttaa cttacagccg gggcagagcg tggaagtgca ggtgagcaac 120aaccaactga ttctgacacc catctccagg cgctactcgc ttgatgaact gctggcacag 180tgtgacatga acgccgcgga acttagcgag caggatgtct ggggtaaatc cacccctgcg 240ggtgacgaaa tatggtaa 258<210>58<211>255<212>DNA<213>惡臭假單孢菌<400>58atgcagatca agattcaaca gtggggcaac agcgccgcga tccgcttgcc cgccgcagta 60ctcaagcaga tgcgcctcgg tgtcggctcc accctgagcc ttgacacaac gggtgagacg 120atggtgctca aacccgtcag gtcgaaaccc aagtacaccc ttgaggaact gatggcccag 180tgtgacctga gtgcaccgga gccagaggac atggccgact ggaatgccat gcgcccagtg 240gggcgtgaag tgtga 255
<210>59<211>260<212>DNA<213>Photobacterium profundum<400>59gtgcaatgag aactcagata agaaagatcg gtaactcact tggttcaatt attcctgcca 60cttttattcg tcagcttgaa ctggcagagg gcgcagaaat tgatgttaaa acggttgatg 120gaaaaattgt gattgagcca attagaaaaa tgaaaaaacg tttcccattc agtgagcgtg 180aattactaag tggattggat gcacacactg ctcatgctga cgaactggtt gtaatttcta 240cccaggagct aggcgaataa 260<210>60<211>80<212>PRT<213>耐放射異常球菌<400>60Met Thr Ser Gln Ile Gln Lys Trp Gly Asn Ser Leu Ala Leu Arg Ile1 5 10 15Pro Lys Ala Leu Ala Gln Gln Val Gly Leu Thr Gln Ser Ser Glu Val20 25 30Glu Leu Leu Leu Gln Asp Gly Gln Ile Val Ile Arg Pro Val Pro Ala35 40 45Arg Gln Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Met Thr Pro Glu Asn50 55 60Leu His Gly Glu Thr Asp Trp Gly Ala Leu Glu Gly Arg Glu Glu Trp65 70 75 80<210>61<211>81<212>PRT<213>耐鹽芽孢桿菌<400>61Met Thr Leu Met Thr Thr Ile Gln Lys Trp Gly Asn Ser Leu Ala Val1 5 10 15Arg Ile Pro Asn His Tyr Ala Lys His Ile Asn Val Thr Gln Gly Ser20 25 30Glu Ile Glu Leu Ser Leu Gly Ser Asp Gln Thr Ile Ile Leu Lys Pro35 40 45Lys Lys Arg Lys Pro Thr Leu Glu Glu Leu Val Ala Lys Ile Thr Pro50 55 60Glu Asn Arg His Asn Glu Ile Asp Phe Gly Arg Thr Gly Lys Glu Leu65 70 75 80Leu<210>62<211>85<212>PRT<213>大腸桿菌PemI質(zhì)粒R100<400>62Met His Thr Thr Arg Leu Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr15 10 15Val Pro Pro Ala Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu20 25 30Val Gly Met Val Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro Tyr Arg35 40 45Arg Pro Gln Tyr Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn50 55 60Ala Glu Ile Ser Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Thr65 70 75 80
Gly Gln Glu Glu Ile85<210>63<211>97<212>PRT<213>大腸桿菌PemI質(zhì)粒R466b<400>63Met Leu Tyr Leu Asn Ile Thr Phe Met Glu Gly Lys Met His Thr Thr15 10 15Arg Leu Lys Lys Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr Val Pro Pro Ala20 25 30Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu Val Gly Met Val35 40 45Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro His Arg Arg Pro Gln Tyr50 55 60Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn Ala Glu Ile Ser65 70 75 80Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Ala Gly Gln Glu Glu85 90 95Ile<210>64<211>85<212>PRT<213>大腸桿菌<400>64Met Gln Met Arg Ile Thr Ile Lys Arg Trp Gly Asn Ser Ala Gly Met1 5 10 15Val Ile Pro Asn Ile Val Met Lys Glu Leu Asn Leu Gln Pro Gly Gln20 25 30Ser Val Glu Ala Gln Val Ser Asn Asn Gln Leu Ile Leu Thr Pro Ile35 40 45Ser Arg Arg Tyr Ser Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Met Asn50 55 60Ala Ala Glu Leu Ser Glu Gln Asp Val Trp Gly Lys Ser Thr Pro Ala65 70 75 80Gly Asp Glu Ile Trp85<210>65<211>84<212>PRT<213>惡臭假單孢菌<400>65Met Gln Ile Lys Ile Gln Gln Trp Gly Asn Ser Ala Ala Ile Arg Leu1 5 10 15Pro Ala Ala Val Leu Lys Gln Met Arg Leu Gly Val Gly Ser Thr Leu20 25 30Ser Leu Asp Thr Thr Gly Glu Thr Met Val Leu Lys Pro Val Arg Ser35 40 45Lys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Glu Leu Met Ala Gln Cys Asp Leu Ser50 55 60Ala Pro Glu Pro Glu Asp Met Ala Asp Trp Asn Ala Met Arg Pro Val65 70 75 80Gly Arg Glu Val
<210>66<211>85<212>PRT<213>Photobacterium profundum<400>66Ala Met Arg Thr Gln Ile Arg Lys Ile Gly Asn Ser Leu Gly Ser Ile1 5 10 15Ile Pro Ala Thr Phe Ile Arg Gln Leu Glu Leu Ala Glu Gly Ala Glu20 25 30Ile Asp Val Lys Thr Val Asp Gly Lys Ile Val Ile Glu Pro Ile Arg35 40 45Lys Met Lys Lys Arg Phe Pro Phe Ser Glu Arg Glu Leu Leu Ser Gly50 55 60Leu Asp Ala His Thr Ala His Ala Asp Glu Leu Val Val Ile Ser Thr65 70 75 80Gln Glu Leu Gly Glu85<210>67<211>228<212>DNA<213>智人<400>67atgggtccag catctgttcc gactacctgt tgctttaacc tggcgaaccg caaaattccg 60ctgcagcgcc tggaaagcta tcgccgtatt acctctggca aatgcccgca gaaagcggtg 120atctttaaaa ccaaactggc gaaagatatt tgcgcggatc cgaaaaaaaa atgggtgcag 180gattctatga aatatctgga tcagaaatct ccgaccccga aaccgtaa 228<210>68<211>73<212>PRT<213>智人<400>68Gly Pro Ala Ser Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys1 5 10 15Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly Lys20 25 30Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp Ile35 40 45Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu50 55 60Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70<210>69<211>357<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>69gtgatgcgcc gcggtgagat ttggcaggtc gatctcgacc ccgctcgagg tagcgaagcg 60aacaaccagc gccccgccgt cgtcgtcagc aacgaccggg ccaacgcgac cgccacgcgt 120cttgggcgcg gcgtcatcac cgtcgtgccg gtgacgagca acatcgccaa ggtctatccg 180tttcaggtgt tgttgtcggc caccactact ggtctccagg tcgactgcaa ggcgcaggcc 240gagcaaatca gatcgattgc taccgagcgg ttgctccggc caatcggccg agtttcagcc 300gccgaacttg cccagctcga tgaggctttg aaactgcatc tcgacttatg gtcgtag357
<210>70<211>282<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>70atgctgcgcg gtgagatctg gcaggtcgac ctggatccgg cccgcggcag cgcggcaaat 60atgcggcggc cagcggtaat tgtcagcaac gacagggcca acgctgccgc gatacgtctc 120gaccgaggcg tggtgccggt tgtcccggtt accagcaaca ccgaaaaggt ccccattcca 180ggtgttgttg ccggcagcga gcggtggcct ggccgtcgat tcgaaggcgc aggcccagca 240ggttggatcc gtcgctgcgc aacgtctccc ctgccgagct ga282<210>71<211>345<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>71gtggtgatta gtcgtgccga gatctactgg gctgacctcg ggccgccatc aggcagtcag 60ccggcgaagc gccgcccggt gctcgtaatc cagtcagatc cgtacaacgc aagtcgcctt 120gccactgtga tcgcagcggt gatcacgtcc aatacggcgc tggcggcaat gcccggcaac 180gtgttcttgc ccgcgaccac aacgcgactg ccacgtgact cggtcgtcaa cgtcacggcg 240attgtcacgc tcaacaagac tgacctcacc gaccgagttg gggaggtgcc agcgagcttg 300atgcacgagg ttgaccgagg acttcgtcgc gtactggacc tttga 345<210>72<211>309<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>72atgcggcgcg gtgaattgtg gtttgccgcc acacctggtg gtgacagacc agtacttgtc 60cttaccagag atccggtggc agaccgcatc ggcgcggtcg ttgtggtggc cctaacccgc 120acccgccgag gcctggtgtc ggaattggag ctcacggccg tcgaaaaccg tgttccgagc 180gactgcgtcg tcaacttcga caacattcat acgttgccac gcaccgcatt ccgacgccgc 240atcacccggc tgtccccggc ccgcctgcac gaagcctgtc aaacactccg ggcgagcacg 300gggtgttga 309<210>73<211>330<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<400>73gtgaccgcac ttccggcgcg cggagaggtg tggtggtgtg agatggctga gatcggtcgg 60cgaccagtcg tcgtgctgtc gcgcgatgcc gcgatccctc ggctgcgacg cgcacttgtc 120gcgccctgca ccacgaccat ccgagggcta gccagtgagg ttgttcttga acccggttcc 180gacccgatcc cgcgccgttc cgcggtgaat ttggactcag tcgaaagtgt ctcggtcgcg 240gtattggtga atcggcttgg ccgcctcgcc gacatccgga tgcgcgccat ctgcacggcc 300ctcgaggtcg ccgtcgattg ctctcgatga 330<210>74<211>118<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>74Met Met Arg Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg1 5 10 15Gly Ser Glu Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ala Val Val Val Ser Asn Asp20 25 30Arg Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Leu Gly Arg Gly Val Ile Thr Val35 40 45Val Pro Val Thr Ser Asn Ile Ala Lys Val Tyr Pro Phe Gln Val Leu50 55 60
Leu Ser Ala Thr Thr Thr Gly Leu Gln Val Asp Cys Lys Ala Gln Ala65 70 75 80Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ala Thr Glu Arg Leu Leu Arg Pro Ile Gly85 90 95Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu100 105 110His Leu Asp Leu Trp Ser115<210>75<211>93<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>75Met Leu Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg Gly1 5 10 15Ser Ala Ala Asn Met Arg Arg Pro Ala Val Ile Val Ser Asn Asp Arg20 25 30Ala Asn Ala Ala Ala Ile Arg Leu Asp Arg Gly Val Val Pro Val Val35 40 45Pro Val Thr Ser Asn Thr Glu Lys Val Pro Ile Pro Gly Val Val Ala50 55 60Gly Ser Glu Arg Trp Pro Gly Arg Arg Phe Glu Gly Ala Gly Pro Ala65 70 75 80Gly Trp Ile Arg Arg Cys Ala Thr Ser Pro Leu Pro Ser85 90<210>76<211>114<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>76Met Val Ile Ser Arg Ala Glu Ile Tyr Trp Ala Asp Leu Gly Pro Pro1 5 10 15Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Arg Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Ser20 25 30Asp Pro Tyr Asn Ala Ser Arg Leu Ala Thr Val Ile Ala Ala Val Ile35 40 45Thr Ser Asn Thr Ala Leu Ala Ala Met Pro Gly Asn Val Phe Leu Pro50 55 60Ala Thr Thr Thr Arg Leu Pro Arg Asp Ser Val Val Asn Val Thr Ala65 70 75 80Ile Val Thr Leu Asn Lys Thr Asp Leu Tht Asp Arg Val Gly Glu Val85 90 95Pro Ala Ser Leu Met His Glu Val Asp Arg Gly Leu Arg Arg Val Leu100 105 110Asp Leu<210>77<211>102<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>77Met Arg Arg Gly Glu Leu Trp Phe Ala Ala Thr Pro Gly Gly Asp Arg1 5 10 15Pro Val Leu Val Leu Thr Arg Asp Pro Val Ala Asp Arg Ile Gly Ala20 25 30Val Val Val Val Ala Leu Thr Arg Thr Arg Arg Gly Leu Val Ser Glu35 40 45
Leu Glu Leu Thr Ala Val Glu Asn Arg Val Pro Ser Asp Cys Val Val50 55 60Asn Phe Asp Asn Ile His Thr Leu Pro Arg Thr Ala Phe Arg Arg Arg65 70 75 80Ile Thr Arg Leu Ser Pro Ala Arg Leu His Glu Ala Cys Gln Thr Leu85 90 95Arg Ala Ser Thr Gly Cys100<210>78<211>109<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<400>78Met Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Glu Val Trp Trp Cys Glu Met Ala1 5 10 15Glu Ile Gly Arg Arg Pro Val Val Val Leu Ser Arg Asp Ala Ala Ile20 25 30Pro Arg Leu Arg Arg Ala Leu Val Ala Pro Cys Thr Thr Thr Ile Arg35 40 45Gly Leu Ala Ser Glu Val Val Leu Glu Pro Gly Ser Asp Pro Ile Pro50 55 60Arg Arg Ser Ala Val Asn Leu Asp Ser Val Glu Ser Val Ser Val Ala65 70 75 80Val Leu Val Asn Arg Leu Gly Arg Leu Ala Asp Ile Arg Met Arg Ala85 90 95Ile Cys Thr Ala Leu Glu Val Ala Val Asp Cys Ser Arg100 105<210>79<211>351<212>DNA<213>炭疽芽孢桿菌<400>79ttgattgtaa aacgcggcga cgtgtatttt gcagaccttt ccccagttgt tggttctgag 60caaggaggtg ttcgtccggt tcttgtcatt caaaatgaca tcggaaatcg ttttagtcca 120acggtgattg tagcggctat tactgcacag attcaaaaag cgaaattacc cactcatgtg 180gaaattgatg cgaaaaagta cggttttgag agagattctg ttattttact tgagcagatt 240cgaacaatcg ataagcagcg cttaacggac aaaatcactc acttagatga agtgatgatg 300attcgtgtag atgaagcgct acaaattagt ttaggactaa tagattttta a 351<210>80<211>116<212>PRT<213>炭疽芽孢桿菌<400>80Met Ile Val Lys Arg Gly Asp Val Tyr Phe Ala Asp Leu Ser Pro Val1 5 10 15Val Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Asn20 25 30Asp Ile Gly Asn Arg Phe Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr35 40 45Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Leu Pro Thr His Val Glu Ile Asp Ala50 55 60Lys Lys Tyr Gly Phe Glu Arg Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile65 70 75 80Arg Thr Ile Asp Lys Gln Arg Leu Thr Asp Lys Ile Thr His Leu Asp85 90 95Glu Val Met Met Ile Arg Val Asp Glu Ala Leu Gln Ile Ser Leu Gly100 105 110
Leu Ile Asp Phe115<210>81<211>348<212>DMA<213>惡臭假單孢菌<400>81gtgaaacggt tgaaattcgc caggggtgat attgttcgcg tcaacctgga cccaacagtc 60gggcgggaac agcagggctc cggccgacct gcactggtac ttactccggc tgcgttcaat 120gcttcaggcc tggctgtaat catcccgatc actcaaggtg gggatttcgc gaggcatgcg 180ggtttcgctg tcacgctcag cggtgcgggc acgcagactc agggggtgat gctttgcaac 240caggtgcgca cagtcgacct tgaagcacga tttgccaagc gcatagagtc ggtgcctgaa 300gctgtcatcc tggatgcact ggcgcgtgtg caaaccctat tcgattaa 348<210>82<211>345<212>DNA<213>隱藏分枝桿菌<400>82tgaattgctc tgacggaacg cggcgacatc tacatcgttt cgcttgaccc gacgtcggga 60catgagcaga gcggcacgcg cccagtattg gtcgtgtccc cgggcgcgtt taatcgcctg 120acgaaaacac cggtcgtgct acctataaca cgcggcggga actttgcccg aacggcaggg 180ttcgctgtct cgctgaccga tgcgggtact cgcaccgccg gcgtaatacg ctgcgatcag 240cctcgctcga ttgatatccg cgcccgtaaa ggccgcaagg ttgaacgtgt gccgtctggg 300gttcttgacg aagcgttggc caagctcgcc acgatcttga cttga 345<210>83<211>366<212>DNA<213>弗氏志賀氏菌2a st.301<400>83atggtaaagg cacggacgcc acatcgtggt gagatctggt attttaaccc tgatccggtt 60gccgggcatg aacttcaggg gccacattat tgcattgtgg taacggacaa aaaactcaac 120aatgttttaa aagttgctat gtgctgcccg atttcaacag gggcaaatgc agcacgttcc 180acaggggtga cggtgaacgt cctcccccgt gatacgcaaa ccggtaacct gcatggcgtt 240gtactttgtc accagctaaa agccgtcgat cttattgccc gtggcgctaa atttcatacc 300gttgccgatg aaaaattgat tagtgaagtt atcagtaaac tggtgaattt aatcgaccca 360caataa366<210>84<211>351<212>DNA<213>大腸桿菌<400>84atggtaaaga aaagtgaatt tgaacgggga gacattgtgc tggttggctt tgatccagca 60agcggccatg aacagcaagg tgctggtcga cctgcgcttg tgctctccgt tcaagccttt 120aatcaactgg gaatgacgct ggtggccccc attacgcagg gcggaaattt tgcccgttat 180gccggattta gcgttccttt acattgcgaa gaaggcgatg tgcacggcgt ggtgctggtg 240aatcaggtgc ggatgatgga tctacacgcc cggctggcaa agcgtattgg tctggctgcg 300gatgaggtgg tggaagaggc gttattacgc ttgcaggcgg tggtggaata a 351<210>85<211>115<212>PRT<213>惡臭假單孢菌<400>85Met Lys Arg Leu Lys Phe Ala Arg Gly Asp Ile Val Arg Val Asn Leu1 5 10 15
Asp Pro Thr Val Gly Arg Glu Gln Gln Gly Ser Gly Arg Pro Ala Leu20 25 30Val Leu Thr Pro Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Leu Ala Val Ile Ile35 40 45Pro Ile Thr Gln Gly Gly Asp Phe Ala Arg His Ala Gly Phe Ala Val50 55 60Thr Leu Ser Gly Ala Gly Thr Gln Thr Gln Gly Val Met Leu Cys Asn65 70 75 80Gln Val Arg Thr Val Asp Leu Glu Ala Arg Phe Ala Lys Arg Ile Glu85 90 95Ser Val Pro Glu Ala Val Ile Leu Asp Ala Leu Ala Arg Val Gln Thr100 105 110Leu Phe Asp115<210>86<211>111<212>PRT<213>隱藏分枝桿菌<400>86Met Thr Glu Arg Gly Asp Ile Tyr Ile Val Ser Leu Asp Pro Thr Ser1 5 10 15Gly His Glu Gln Ser Gly Thr Arg Pro Val Leu Val Val Ser Pro Gly20 25 30Ala Phe Asn Arg Leu Thr Lys Thr Pro Val Val Leu Pro Ile Thr Arg35 40 45Gly Gly Asn Phe Ala Arg Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Thr Asp50 55 60Ala Gly Thr Arg Thr Ala Gly Val Ile Arg Cys Asp Gln Pro Arg Ser65 70 75 80Ile Asp Ile Arg Ala Arg Lys Gly Arg Lys Val Glu Arg Val Pro Ser85 90 95Gly Val Leu Asp Glu Ala Leu Ala Lys Leu Ala Thr Ile Leu Thr100 105 110<210>87<211>121<212>PRT<213>弗氏志賀氏菌2a str.301<400>87Met Val Lys Ala Arg Thr Pro His Arg Gly Glu Ile Trp Tyr Phe Asn1 5 10 15Pro Asp Pro Val Ala Gly His Glu Leu Gln Gly Pro His Tyr Cys Ile20 25 30Val Val Thr Asp Lys Lys Leu Asn Asn Val Leu Lys Val Ala Met Cys35 40 45Cys Pro Ile Ser Thr Gly Ala Asn Ala Ala Arg Ser Thr Gly Val Thr50 55 60Val Asn Val Leu Pro Arg Asp Thr Gln Thr Gly Asn Leu His Gly Val65 70 75 80Val Leu Cys His Gln Leu Lys Ala Val Asp Leu Ile Ala Arg Gly Ala85 90 95Lys Phe His Thr Val Ala Asp Glu Lys Leu Ile Ser Glu Val Ile Ser100 105 110Lys Leu Val Asn Leu Ile Asp Pro Gln115 120
<210>88<211>116<212>PRT<213>大腸桿菌<400>88Met Val Lys Lys Ser Glu Phe Glu Arg Gly Asp Ile Val Leu Val Gly1 5 10 15Phe Asp Pro Ala Ser Gly His Glu Gln Gln Gly Ala Gly Arg Pro Ala20 25 30Leu Val Leu Ser Val Gln Ala Phe Asn Gln Leu Gly Met Thr Leu Val35 40 45Ala Pro Ile Thr Gln Gly Gly Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Gly Phe Ser50 55 60Val Pro Leu His Cys Glu Glu Gly Asp Val His Gly Val Val Leu Val65 70 75 80Asn Gln Val Arg Met Met Asp Leu His Ala Arg Leu Ala Lys Arg Ile85 90 95Gly Leu Ala Ala Asp Glu Val Val Glu Glu Ala Leu Leu Arg Leu Gln100 105 110Ala Val Val Glu115<210>89<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA轉(zhuǎn)錄本<400>89aatgatgaca ctggaag17<210>90<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA轉(zhuǎn)錄本<400>90gtcgttgaca ttgatgg17<210>91<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA轉(zhuǎn)錄本<400>91atctcgaaca cgcagcc17<210>92<211>17<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>mRNA轉(zhuǎn)錄本<400>92tcgttttaca cccttga1權(quán)利要求
1.檢測(cè)mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(dá)所述的核酸序列；(c)將步驟(b)表達(dá)的核酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；以及(d)測(cè)定所述底物的切割，其中所述底物的切割表明了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。
2.鑒定能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的因子的篩選方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(dá)所述的核酸序列；(c)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(b)中表達(dá)的核酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(d)加入至少一種因子，測(cè)定其是否能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性；以及(e)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段，其中在所述至少一種因子存在的條件下被切割底物量的改變鑒定出了能夠調(diào)節(jié)修飾所述mRNA干擾酶或者其功能性片段活性的因子。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的方法在體外進(jìn)行或者在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
4.權(quán)利要求2的方法，其中能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子使底物的切割增加。
5.權(quán)利要求2的方法，其中能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子使底物的切割降低。
6.調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供編碼所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表達(dá)所述的核酸序列；(c)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(b)中表達(dá)的核酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(d)加入權(quán)利要求2的因子，所述的因子能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性；以及(e)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸酶活性的手段，其中在所述因子存在的條件下被切割底物量的改變提供了調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。
7.檢測(cè)mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供所述mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(a)中的氨基酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；以及(c)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。
8.鑒定能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的因子的篩選方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供所述mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(c)加入至少一種因子，確定其是否能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性；以及(d)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段，其中在所述至少一種因子存在時(shí)被切割底物量的改變鑒定出了能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法在體外或者在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
10.權(quán)利要求8的方法，其中能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子使底物的切割增加。
11.權(quán)利要求8的方法，其中能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的因子使底物的切割減少。
12.調(diào)節(jié)mRNA干擾酶或者其功能性片段的活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸內(nèi)切酶活性，所述的方法包含(a)提供所述mRNA干擾酶的氨基酸序列；(b)在能夠促進(jìn)核糖核酸內(nèi)切酶活性的條件下將步驟(a)的氨基酸序列與核糖核酸內(nèi)切酶底物共同孵育；(c)加入權(quán)利要求8的因子，所述的因子能夠調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性；以及(d)測(cè)量所述底物的切割，其中所述底物的切割顯示了核糖核酸內(nèi)切酶活性并且提供了檢測(cè)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段，其中在所述因子存在的條件下被切割底物量的改變提供了調(diào)節(jié)所述mRNA干擾酶或者其功能性片段的核糖核酸內(nèi)切酶活性的手段。
13.用于治療具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治療上有效量的組合物以減輕所述疾病的癥狀，所述組合物包含至少一個(gè)編碼mRNA干擾酶或者其功能性片段的核酸序列以及藥物上可以接受的緩沖劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物的至少一個(gè)核酸序列的表達(dá)使核糖核酸內(nèi)切酶底物的切割增加，以緩解所述疾病的癥狀。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的疾病是細(xì)菌感染，所述的向所述的患者施用所述的治療有效量的組合物，通過(guò)降低在所述患者體內(nèi)細(xì)菌的數(shù)目而緩解細(xì)菌感染的癥狀。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的細(xì)菌感染包含至少一種抗生素抗性細(xì)菌菌株。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述的疾病是過(guò)度增生性疾病，所述的向所述的患者施用所述的治療有效量的組合物通過(guò)降低所述患者體內(nèi)過(guò)度增生性疾病細(xì)胞的數(shù)目而緩解所述過(guò)度增生性疾病的癥狀。
18.治療具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治療有效量的組合物以緩解所述疾病的癥狀，所述組合物包含mRNA干擾酶或者其功能性片段以及藥物上可以接受的緩沖劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物中的mRNA干擾酶或者其功能性片段提高了核糖核酸內(nèi)切酶底物的切割，以緩解所述疾病的癥狀。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的疾病是細(xì)菌感染，所述的向所述的患者施用所述的治療有效量的組合物通過(guò)降低所述患者體內(nèi)細(xì)菌的數(shù)目而緩解細(xì)菌感染的癥狀。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述的細(xì)菌感染包含至少一種抗生素抗性細(xì)菌菌株。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述的疾病是過(guò)度增生性疾病，所述的向所述的患者施用所述的治療有效量的組合物通過(guò)降低所述患者體內(nèi)過(guò)度增生性疾病細(xì)胞的數(shù)目而緩解所述過(guò)度增生性疾病的癥狀。
23.權(quán)利要求17或者22的方法，其中所述的增生性疾病選自以下疾病組成的組不同組織的發(fā)育異常和組織變形、炎性病癥、自體免疫疾病、過(guò)度增生性皮膚疾病、牛皮癬、過(guò)敏/哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化以及血管成形手術(shù)后的再狹窄。
24.在細(xì)胞中制備多肽的方法，所述的方法包含(a)用編碼所述多肽的核酸序列轉(zhuǎn)染所述的細(xì)胞，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，以使用另外的三聯(lián)體密碼子替換mRNA干擾酶識(shí)別序列，其中由所述的突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒(méi)有因?yàn)樗龅耐蛔兌淖儯?b)用編碼mRNA干擾酶的核酸序列轉(zhuǎn)染所述的細(xì)胞，其中所述的mRNA干擾酶識(shí)別所述的mRNA干擾酶識(shí)別序列；以及(c)在所述的細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列提供了在所述細(xì)胞中制備多肽的手段。
25.權(quán)利要求24的方法，其中mRNA識(shí)別序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)序列，mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段。
26.權(quán)利要求24的方法，其中的mRNA識(shí)別序列是尿嘧啶-腺嘌呤-X(UAX)序列，其中X是胞嘧啶(C)、A或者U，mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。
27.權(quán)利要求25的方法，其中步驟(b)的核酸的表達(dá)降低或者抑制了由包含ACA序列的核酸序列編碼的細(xì)胞多肽的合成。
28.權(quán)利要求26的方法，其中步驟(b)的核酸的表達(dá)降低或者抑制了由包含UAX序列的核酸序列編碼的細(xì)胞多肽的合成。
29.權(quán)利要求24的方法，其中步驟(a)和(b)同時(shí)進(jìn)行。
30.權(quán)利要求24的方法，還包含將所述的細(xì)胞在(c)步驟之前或者在(c)步驟中，在包含至少一種放射性標(biāo)記同位素的培養(yǎng)基中孵育。
31.制備多肽的方法，所述的方法包含(a)提供編碼所述多肽的核酸序列，其中編碼所述多肽的核酸序列被突變，以用另外的三聯(lián)體密碼子替代mRNA干擾酶識(shí)別序列，其中由所述突變核酸序列編碼的所述多肽的氨基酸序列沒(méi)有由于所述的突變而被改變；(b)提供編碼mRNA干擾酶的核酸序列，其中所述的mRNA干擾酶識(shí)別所述的mRNA干擾酶識(shí)別序列；以及(c)表達(dá)步驟(a)和(b)的核酸序列，其中步驟(a)和(b)的核酸序列的表達(dá)提供了生產(chǎn)該多肽的方法。
32.權(quán)利要求31的方法，其中mRNA識(shí)別序列是ACA序列，mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段；或者其中的mRNA識(shí)別序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。
33.制備多個(gè)多核糖核苷酸序列的方法，所述的方法包含(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一個(gè)區(qū)域與所述的第二核酸序列的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)，且所述的第一和第二核酸序列的兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)域都不包含與mRNA干擾酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它們的5′末端都被磷酸化；(b)通過(guò)所述的第一和第二核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成雙鏈的核酸序列，其包含側(cè)翼為單鏈突出端的互補(bǔ)區(qū)域，其中每一個(gè)所述單鏈突出端包含至少一個(gè)與mRNA干擾酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，且所述的單鏈突出端互相互補(bǔ)；(c)通過(guò)互補(bǔ)的單鏈突出端連接已經(jīng)退火的第一和第二核酸序列，形成包含多個(gè)退火的第一和第二核酸序列串聯(lián)重復(fù)序列的多聯(lián)體；(d)使用包含T7啟動(dòng)子以及與所述的第一核酸序列互補(bǔ)的區(qū)域的第一引物和與所述的第二核酸序列互補(bǔ)的第二引物擴(kuò)增所述的多聯(lián)體，其中所述的擴(kuò)增產(chǎn)生多個(gè)包含T7啟動(dòng)子的多聯(lián)體； (e)使用T7 RNA聚合酶從所述的多個(gè)多聯(lián)體轉(zhuǎn)錄出RNA分子，其中每一個(gè)所述的RNA分子包含多個(gè)側(cè)翼為mRNA干擾酶識(shí)別位點(diǎn)的多核糖核苷酸序列的串聯(lián)重復(fù)序列；以及(f)使用能夠在所述的干擾酶識(shí)別位點(diǎn)處切割RNA的mRNA干擾酶消化所述的RNA分子，其中所述的消化產(chǎn)生多個(gè)所述多核糖核苷酸序列。
34.權(quán)利要求33的方法，其中mRNA識(shí)別序列是ACA序列，mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO2的MazF或者其功能性片段；或者其中的mRNA識(shí)別序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，mRNA干擾酶是包含SEQ ID NO4的PemK或者其功能性片段。
35.分離的核酸序列，該序列編碼與mRNA干擾酶或者其功能性片段具有序列和/或結(jié)構(gòu)同源性的多肽，其中所述的多肽能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性；包含所述分離核酸序列的表達(dá)載體以及包含所述表達(dá)載體的細(xì)胞；包含所述分離核酸序列的表達(dá)載體，其中所述的核酸序列與調(diào)控序列有效連接，以及包含所述表達(dá)載體的細(xì)胞；包含所述分離核酸序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中核酸序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)；分離的氨基酸序列，該序列包含的多肽與mRNA干擾酶或者其功能性片段具有序列和/或結(jié)構(gòu)同源性，其中所述的多肽能夠表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性；編碼所述多肽的表達(dá)載體，以及包含所述表達(dá)載體的細(xì)胞；編碼所述多肽的表達(dá)載體，其中所述多肽的表達(dá)在調(diào)控序列的控制下，以及包含所述表達(dá)載體的細(xì)胞；表達(dá)所述多肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中多肽在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)；包含所述分離核酸序列或者所述多肽和藥物上可以接受的緩沖劑的組合物，以及所述兩種組合物中任何一種的用途，用于治療具有疾病的患者，以緩解所述疾病的癥狀；以及包含所述分離核酸序列、包含所述的多肽或者其功能性片段的分離氨基酸序列、與mRNA干擾酶活性相容的緩沖劑以及使用說(shuō)明材料的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是新型酶家族的發(fā)現(xiàn)，該家族在這里被命名為mRNA干擾酶家族，它們表現(xiàn)出核糖核酸內(nèi)切酶活性。因此，本發(fā)明發(fā)明者的新發(fā)現(xiàn)，提出了新的應(yīng)用，其中mRNA干擾酶核酸和氨基酸序列以及其組合物可以被有利地使用。本發(fā)明還包括篩選方法以鑒定能夠調(diào)節(jié)mRNA干擾酶活性的化合物/因子以及使用這些化合物/因子的方法。還提供了包含mRNA干擾酶核酸和/或氨基酸序列、與mRNA干擾酶活性相容的緩沖液以及使用說(shuō)明材料的試劑盒。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1839206SQ200480023092
公開日2006年9月27日 申請(qǐng)日期2004年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月13日
發(fā)明者M·伊諾耶, J·張, Y·L·張 申請(qǐng)人:新澤西內(nèi)科與牙科大學(xué)