專利名稱：頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶突變體及用其制備7－aca的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)SE83來源的頭孢菌素C(CPC)?；D(zhuǎn)移酶突變體多肽；編碼該多肽的基因；含有該基因的表達(dá)載體；轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體的微生物；制備所述CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的方法；以及利用該CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體制備7-ACA的方法。
背景技術(shù)：
頭孢菌素C(下文稱為“CPC”)是由絲狀真菌(如產(chǎn)黃頭孢(Acremonium chrysogenum))產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺類抗生素中的一員℃PC能夠阻斷細(xì)胞壁的合成，具有抗革蘭氏陰性菌的抗生素活性；但其活性不足以抑制革蘭氏陰性菌的生長。因此，CPC主要用于制備生產(chǎn)半合成頭孢菌素類抗生素的中間產(chǎn)物。特別是，去除CPC上的D-α-氨基己二酰側(cè)鏈而制備的7-氨基頭孢烷酸(7-aminoacephalosporanic，下文稱為“7-ACA”)，已被用于生產(chǎn)大部分半合成頭孢菌素類抗生素，后者占據(jù)了全世界抗生素市場超過40％的份額。
有兩種已知的由CPC制備7-ACA的方法，化學(xué)和酶方法。由CPC合成7-ACA的化學(xué)法使用甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)氨基和羧基，得率可達(dá)90％以上。然而，這一方法復(fù)雜、不經(jīng)濟(jì)且不利于環(huán)境。因而，化學(xué)法已被酶法合成7-ACA所取代，后者是一種環(huán)境可接受的方法。
目前市場上廣泛采用的兩步酶合成法包括以下兩步通過D-氨基酸氧化酶(下文稱為“DAO”)將CPC轉(zhuǎn)變?yōu)槲於?7-氨基頭孢烷酸(下文稱為“GL-7-ACA”)(第一步)以及通過GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶將GL-7-ACA轉(zhuǎn)變?yōu)?-ACA(第二步)(見

圖1)。但是，由于第一步產(chǎn)生的過氧化氫與DAO底物或反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，這一方法得到的7-ACA得率低于化學(xué)法。因此，需要發(fā)展一種有效的一步酶合成法，通過使用改良的CPC?；D(zhuǎn)移酶(該酶能夠破壞CPC第7位上的酰胺鍵，并去除其氨基己二酰側(cè)鏈)，直接將CPC轉(zhuǎn)化為7-ACA。
已在若干微生物中發(fā)現(xiàn)了對于CPC有活性的CPC?；D(zhuǎn)移酶(亦可與CPC酰胺酶或CPC酰胺水解酶合稱)，這些微生物例如假單胞菌屬、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas sp.)、粘性節(jié)桿菌(Arthrobacter viscous)等。而有些CPC?；D(zhuǎn)移酶的基因已經(jīng)被克隆并測序假單胞菌屬SE83來源的acyII基因(Matsuda等，J.Bacteriol.1695821-5829，1987)；假單胞菌屬N176來源的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因(USP5,192,678)；假單胞菌屬V22來源的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶基因(Aramori等，J.Ferment.Bioeng.72232-243，1991)；泡囊假單胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965來源的CPC酰胺水解酶基因(USP 6,297,032)；巨大芽胞桿菌來源的CPC酰胺酶基因(USP 5,229,274)；；以及假單胞菌屬130來源的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因(Li等，Eur.J.Biochem.262713-719，1999)。然而，這些CPC?；D(zhuǎn)移酶基因不具備足夠的水解活性以裂解CPC第7位上的酰胺鍵，因此，不適用于由CPC制備7-ACA的一步酶法。
一些基因工程研究已嘗試提高CPC酰基轉(zhuǎn)移酶對CPC的酶活性。例如，F(xiàn)ujisawa Pharmaceutical Co.(Japan)從假單胞菌屬N176中獲得了一種CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，具有比野生型高約2.5倍的CPC比活性(USP 5,804,429；USP 5,336,613，日本專利出版號No.1995-222587；日本專利出版號No.1996-098686；以及日本專利出版號No.1996-205864)。然而，這樣的突變體對CPC仍然不具備從CPC直接生產(chǎn)7-ACA的足夠比活性，其還受到7-ACA的終產(chǎn)物抑制。因此，它不能實(shí)際應(yīng)用于將CPC直接轉(zhuǎn)化為7-ACA。
為了研制出能用于一步酶法制備7-ACA的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，本發(fā)明的發(fā)明者們研究了GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶的三級結(jié)構(gòu)，他不曾首次鑒定了脫輔基酶(Kim等，Structure 81059-1068，2000)和與假單胞菌屬KAC-1來源的GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶(Kim等，Biotech.Lett.231067-1071，2001；此下稱為“CAD”)相關(guān)的CAD-GL-7-ACA復(fù)合物(Kim等，Chem.Biol.81253-1264，2001；Kim等，J.Biol.Chem.27648376-48381，2001)的三級結(jié)構(gòu)(見圖2)。這兩種CAD二元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)提示，GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶和底物間最廣泛的相互作用發(fā)生在GL-7-ACA的戊二酰部分。因此，提示底物側(cè)鏈及其結(jié)合口袋間發(fā)生的親水與疏水反應(yīng)是GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶識別底物的決定因素。當(dāng)把結(jié)合底物親和力特別低的CPC化學(xué)結(jié)構(gòu)與GL-7-ACA進(jìn)行比較時，它們具有相同的β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，但在側(cè)鏈上有所差異(見圖3)。即與戊二酸組成的GL-7-ACA的側(cè)鏈不同，CPC的側(cè)鏈為D-α-氨基己二酸。因而CAD-CPC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模擬提示，與D-α-氨基己二酸的側(cè)鏈末端的羧基和D-型氨基基團(tuán)相比，GL-7-ACA的戊二酸側(cè)鏈及與結(jié)合相關(guān)的CAD關(guān)鍵殘基在空間上更擁擠(見圖4)。因此，認(rèn)為若能保證CAD的底物結(jié)合位點(diǎn)上有可容納CPC側(cè)鏈(內(nèi)含比GL-7-ACA側(cè)鏈和D-氨基基團(tuán)更大的碳主鏈)的足夠空間，那么就可以提高GL-7-ACA對CPC的比活性。據(jù)此，對CAD的“酶-底物”復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，可能提供開發(fā)CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的重要信息，該突變體通過在假單胞菌屬來源的底物結(jié)合親和力相對較低的GL-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)引入突變，增強(qiáng)CPC比活性。
因此，本發(fā)明發(fā)明者致力于開發(fā)一種CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，該突變體對CPC的反應(yīng)性增強(qiáng)，可以用于由CPC制備7-ACA的一步酶法。
發(fā)明概述據(jù)此，本發(fā)明的目的之一在于，提供CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，該突變體對CPC的反應(yīng)性增強(qiáng)，可以方便地用于將CPC轉(zhuǎn)化7-ACA或其功能等效的衍生物。
本發(fā)明的另一目的在于提供編碼所述CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體或其功能等效衍生物的核苷酸序列。
本發(fā)明的又一目的在于提供含有所述核苷酸序列的表達(dá)載體，以及轉(zhuǎn)染該核苷酸序列或該表達(dá)載體的微生物。
本發(fā)明的又一目的在于提供利用所述轉(zhuǎn)染微生物制備CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供利用所述CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體、含有該CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體或經(jīng)加工的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的組合物，從CPC制備7-ACA或其鹽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體或其功能等效衍生物，其特征在于選自以下的至少一個氨基酸被另一氨基酸所取代，包括SEQ ID NO4的CPC?；D(zhuǎn)移酶α-亞基中的Val121α、Gly139α和Phe169α，以及SEQ ID NO5的CPC?；D(zhuǎn)移酶β-亞基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β。
在本發(fā)明的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體中，優(yōu)選下列突變體，其中Val121α為丙氨酸所取代；Gly139α為絲氨酸所取代；Phe169α為酪氨酸所取代；Met31β為亮氨酸所取代；Phe58β為丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代；His70β為絲氨酸或亮氨酸所取代；Ile75β為蘇氨酸所取代；Ile176β為纈氨酸所取代；或Ser471β為半胱氨酸所取代。
附圖簡述本發(fā)明的上述及其他目的及特征，在下面結(jié)合附圖對該發(fā)明的描述中顯而易見，這些附圖分別顯示了圖1由CPC制備7-ACA的一步及兩步酶合成法的圖示程序；圖2假單胞菌屬KAC-1來源的CAD-GL-7-ACA復(fù)合物的三級結(jié)構(gòu)(A)，以及鄰近其活性位點(diǎn)的結(jié)合殘基的概要圖解(B)；
圖3假單胞菌屬KAC-1來源的CAD與GL-7-ACA的結(jié)合模式；圖4假單胞菌屬KAC-1來源的CAD-CPC復(fù)合物的模型；圖5本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體制備程序的圖示表示；圖6比較野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶(-●-，Sem)、F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(H70)，以及F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(-○-，mI176)中7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用；圖7比較F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-◇-，H70)、V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(-○-，#213)、G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-■-，#120)，以及V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(-●-，TnS5)的CPC反應(yīng)性；圖8比較V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(--，mF58)、V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV五重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-■-)、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-○-，TnS5αβ)、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(--)，及V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-●-，TnS5)的CPC反應(yīng)性；圖9比較V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(--，F(xiàn)169)、V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV五重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(--，#59)、V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC五重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(-■-，#76)、V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-○-，mF58)，以及V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV六重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(-●-，TnS5αβ)的CPC反應(yīng)性；
圖10a和10b比較下列突變體中觀察到的CPC反應(yīng)性(A)和7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用(B)V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(--，S12)、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(-●-，TnS5αβ)，以及V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC六重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(-○-，#76)；圖11a至11c假單胞菌屬SE83來源的野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶分子量；11aSDS-PAGE(M分子大小標(biāo)記物；1無細(xì)胞提取物；2純化酶)11b非變性PAGE(M分子大小標(biāo)記物；1純化酶)11cMALDI-TOF質(zhì)譜分析；圖12從含有pE729-TnS5質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)培養(yǎng)物溶液中分離的粗制酶的凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；M標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)記物， 10％乳糖，培養(yǎng)48小時；20.02％乳糖，培養(yǎng)48小時； 30.2％乳糖，培養(yǎng)48小時；42％乳糖，培養(yǎng)4 8小時；52％乳糖，培養(yǎng)72小時。
圖13觀察的野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶、TnS5及S12酰基轉(zhuǎn)移酶突變體將CPC轉(zhuǎn)化為7-ACA的轉(zhuǎn)化率比較；圖14測定通過本發(fā)明S12 CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的作用下從CPC產(chǎn)生的7-ACA的HPLC分析結(jié)果。
發(fā)明詳述此處使用的術(shù)語“對CPC的反應(yīng)性增強(qiáng)”是指，對CPC的比活性增強(qiáng)和/或7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用減弱。
此處使用的術(shù)語“功能等效衍生物”是指保留與本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體相同功能特性的CPC?；D(zhuǎn)移酶衍生物。即功能等效衍生物包括所有可能的變體，如天然、合成或重組多肽，其可能經(jīng)過修飾(即通過序列突變、缺失、插入、替代、一個或幾個核苷酸的倒置或其組合)并能夠行使CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的功能。
此處使用的術(shù)語“經(jīng)加工的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體”是指，固定化而不僅僅是游離的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法(如共價鍵、離子鍵、親水鍵、物理鍵以及微囊化等)將CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體固定在本領(lǐng)域中通常使用的常規(guī)載體中。此外，可以通過固定化整個細(xì)胞的方法固定生產(chǎn)CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的微生物，從而制備經(jīng)加工的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體而不需進(jìn)一步純化。
此處使用的術(shù)語“GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶”一般是指能夠?qū)L-7-ACA轉(zhuǎn)化為7-ACA的酶。此處使用的術(shù)語“CPC?；D(zhuǎn)移酶”是指在GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶中對CPC具有比活性的酶，其能夠通過裂解CPC第7位上的酰胺鍵去除氨基己二酰側(cè)鏈而直接從CPC產(chǎn)生7-ACA。此處使用的術(shù)語“CAD”是指假單胞菌屬KAC-1來源的GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明提供了CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列、編碼該CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體及其功能等效衍生物的核苷酸序列，該突變體具有對假單胞菌屬SE83來源的CPC及其功能等效衍生物增強(qiáng)的反應(yīng)性。
假單胞菌屬SE83來源的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶基因(“acyII基因”)已被用于開發(fā)本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的起始基因，其中acyII基因是使用DNA合成儀根據(jù)Matsuda等鑒定的CPC?；D(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(J.Bacteriol.1695821-5826，1987；GenBank M18278)新合成的。為了提高使用E.coli進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的效率，對已知的AcyII氨基酸序列加以修飾，使之與E.coli介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成中優(yōu)選使用的密碼子相容。例如，已知的acyII基因編碼的氨基酸序列中，苯丙氨酸的唯一密碼子為TTC，而精氨酸的密碼子主要是CGC或CGG，因此，本發(fā)明中合成的由acyII基因編碼的氨基酸序列中，苯丙氨酸及精氨酸分別使用TTT和CGT密碼子。本發(fā)明中合成的acyII基因由具有SEQ ID NO1核苷酸序列的2,325個堿基對組成。在SEQ ID NO1中，對應(yīng)于堿基數(shù)1至2,322(2,323-2,325終止密碼子)的開放閱讀框架是一個編碼全長蛋白質(zhì)的區(qū)域，SEQ ID NO2中顯示了預(yù)測由其產(chǎn)生的氨基酸序列，其由774個氨基酸序列組成。本發(fā)明中合成的acyII基因所編碼的SEQ ID NO2氨基酸序列與已知的CPC?；D(zhuǎn)移酶相同，但SEQ ID NO1核苷酸序列中18％的堿基對與存在的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因中的不同。
大多數(shù)GL-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶(或CPC?；D(zhuǎn)移酶)基因推繹的氨基酸序列依次由α-亞基、間隔肽和β-亞基組成。假單胞菌屬SE83來源的野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶以無活性單鏈多肽的形式產(chǎn)生，該單多肽鏈在宿主細(xì)胞中經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯后大小約為84kDa。隨后，在SEQ ID NO2氨基酸序列的第230位與231位氨基酸間以及第239位與240位氨基酸間進(jìn)行兩次自消化，從而去除9個氨基酸組成的間隔肽，并分成25kDa的α-亞基和約58kDa的β-亞基。上述分開的α-亞基之一與β-亞基之一通過疏水作用耦連，生成具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性的約83kDa的二聚體。眾所周知，在原核生物的蛋白質(zhì)合成中，需要甲硫氨酸作為起始密碼子開始翻譯，此第一個氨基酸在翻譯后會被去除。因此，本發(fā)明使用的野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶的活性形式包含由229個氨基酸組成的α-亞基(SEQ ID NO4)和由535個氨基酸組成的β-亞基(SEQ ID NO5)。
如果在相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯后，宿主細(xì)胞中并未發(fā)生恰當(dāng)?shù)淖韵?，GL-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶(或CPC?；D(zhuǎn)移酶)就會以非活性多肽的形式產(chǎn)生。因此，宿主細(xì)胞中的自消化效率對于獲得活性蛋白質(zhì)具有重要作用。也已有報道稱有若干原因可能造成自消化效率的降低，如宿主細(xì)胞內(nèi)過量產(chǎn)生?；D(zhuǎn)移酶，或間隔肽或成熟蛋白質(zhì)中某一特定氨基酸的突變導(dǎo)致產(chǎn)生無活性的蛋白質(zhì)(Li等，Eur.J.Biochem.262713-719，1999；Kim等，J.Biol.Chem.27648376-48381，2001)。因此，希望改善CPC?；D(zhuǎn)移酶的反應(yīng)特性時，必須適當(dāng)?shù)仃P(guān)注為提高酶反應(yīng)性在某一特定氨基酸位點(diǎn)引入的突變是否會影響自消化的效率的問題。即，由于CPC?；D(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄/翻譯后在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的非活性多肽自消化效率的改變與活性CPC的產(chǎn)率直接相關(guān)，在不清楚純化的活性CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的反應(yīng)性特征的情況下，選擇一種對CPC反應(yīng)性提高的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體是困難的。為解決這一問題，本發(fā)明的發(fā)明者設(shè)計(jì)了一種CPC?；D(zhuǎn)移酶基因，該基因含有基于SEQ ID NO1核苷酸序列的SEQ ID NO3核苷酸序列，其通過在翻譯中獨(dú)立合成α-和β-亞基而不需經(jīng)過自消化的步驟就能夠產(chǎn)生活性的CPC?；D(zhuǎn)移酶。除了編碼對應(yīng)于SEQ ID NO2中第231位至239位區(qū)域的間隔肽的核苷酸序列有所改變外，由SEQ ID NO3的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列與CPC?；D(zhuǎn)移酶基因acyII編碼的SEQ ID NO2序列相同。即在編碼α-亞基最后一個氨基酸的甘氨酸密碼子后插入了一個翻譯終止子并在編碼β-亞基的第一個氨基酸的絲氨酸密碼子前面插入了一段核苷酸序列，其中依次含有隨機(jī)核苷酸序列(其內(nèi)含一個限制性酶切位點(diǎn))、編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列-AGGA-、另一個隨機(jī)核苷酸序列，以及翻譯起始密碼子(甲硫氨酸)。通過使編碼α-亞基和β-亞基的核苷酸序列各自獨(dú)立地保持其自身結(jié)構(gòu)基因，本發(fā)明的發(fā)明者們?yōu)闃?gòu)建這一CPC酰基轉(zhuǎn)移酶基因設(shè)計(jì)了一個操縱子結(jié)構(gòu)。具有SEQID NO3核苷酸序列，同時又獨(dú)立表達(dá)α-亞基和β-亞基的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶基因被命名為sem。因此，可以預(yù)期如果發(fā)明的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因sem被插入合適的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，α-亞基和β-亞基將在宿主細(xì)胞中被獨(dú)立合成并相互耦連，從而得到活性CPC?；D(zhuǎn)移酶的二聚體形式。將從含有SEQ ID NO3的sem基因的E.coli轉(zhuǎn)化體純化的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶和從含有SEQ ID NO1的acyII基因的E.coli轉(zhuǎn)化體純化酶的特性進(jìn)行比較，顯示sem來源CPC?；D(zhuǎn)移酶的特性(如分子量、比活性、底物特異性、最適反應(yīng)溫度和pH)與acyII來源的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶相同。因此，分開表達(dá)α-亞基和β-亞基可以去除了影響非活性多肽自消化效率的原因，易于檢測在某一特定氨基酸殘基引入突變所誘導(dǎo)的特性改變。因此，本發(fā)明采用SEQ ID NO3的acyII基因作為開發(fā)CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的起始DNA。
本發(fā)明中使用的假單胞菌屬SE83來源的CPC?；D(zhuǎn)移酶(AcyII，SEQ ID NO2)的氨基酸序列的文獻(xiàn)命名采用了自α-亞基N-末端的甲硫氨酸為首至β-亞基C-末端的丙氨酸為末尾的連續(xù)編號系統(tǒng)。然而，由于第一個氨基酸(甲硫氨酸)和間隔肽在CPC?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯后從宿主細(xì)胞中去除，它們在成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列中并不存在。即活性蛋白質(zhì)的氨基酸序列由α-亞基的氨基酸序列和β-亞基的氨基酸序列組成。據(jù)此，本發(fā)明采用的編號系統(tǒng)是對成熟CPC?；D(zhuǎn)移酶活性形式中的每一α-和β-亞基連續(xù)編號。對CPC?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列中某一特定殘基的命名是通過以下的常規(guī)命名法蘇氨酸(SEQ ID NO4氨基酸序列中α-亞基的第1位氨基酸殘基)被標(biāo)為Thr1α；而絲氨酸(SEQ ID NO5氨基酸序列中β-亞基的第1位氨基酸殘基)被標(biāo)為Ser1β。據(jù)此，Thr1α和Ser1β分別表示SEQ ID NO2氨基酸序列中第2位殘基蘇氨酸和第240位殘基絲氨酸。
對于在CPC?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列突變中引入的特定殘基的命名，也遵循以下常規(guī)命名法替代α-亞基中第169位殘基苯丙氨酸的酪氨酸用F169αY表示，而替代β-亞基第176位異亮基酸殘基的纈氨酸用I176βV表示。
本發(fā)明的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體是采用SEQ ID NO3的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因sem作為起始DNA，通過常規(guī)點(diǎn)突變的方法和基因工程技術(shù)如下制備(見圖5)。
首先，為了提高CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的比活性，根據(jù)計(jì)算機(jī)程序得到的CAD-CPC復(fù)合物三級結(jié)構(gòu)模型中實(shí)際誘變的結(jié)果，從AcyII的氨基酸序列中選擇將突變的氨基酸殘基。合成含有對應(yīng)以上所選氨基酸序列的核苷酸序列的人工寡核苷酸，并對其進(jìn)行PCR，以在CPC?；D(zhuǎn)移酶基因中誘導(dǎo)定點(diǎn)誘變。用突變后的基因轉(zhuǎn)化微生物并在合適的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，以產(chǎn)生CPC?；D(zhuǎn)移酶。接下來，測量此法產(chǎn)生的CPC?；D(zhuǎn)移酶的酶活性，選擇對CPC反應(yīng)性有所提高的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體。分析編碼所選CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因的核苷酸序列。結(jié)果顯示，引入突變發(fā)生在以一個或多個氨基酸殘基者，增強(qiáng)CPC?；D(zhuǎn)移酶對CPC的反應(yīng)性，這些氨基酸殘基包括SEQ ID NO4和5的AcyII氨基酸序列中的Phe169α、Met31β、Phe58β、His70β和Ile176β。
為了進(jìn)一步提高CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體對CPC的反應(yīng)性，將所選的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體基因進(jìn)行易錯PCR，以在隨機(jī)位點(diǎn)上誘導(dǎo)點(diǎn)突變。用突變的基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以構(gòu)建突變體文庫，從中篩選出含有對CPC反應(yīng)性增強(qiáng)的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的宿主細(xì)胞。測量由此產(chǎn)生的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的酶活性，選擇對CPC反應(yīng)性有所提高的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，并分析編碼以上所選CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體基因的核苷酸序列。結(jié)果顯示，引入突變發(fā)生在以下一個或多個氨基酸殘基者，增強(qiáng)了CPC?；D(zhuǎn)移酶將CPC轉(zhuǎn)化為7-ACA的效率，這些氨基酸殘基包括SEQID NO4和5的AcyII氨基酸序列中的Val121α、Gly139α、Ile75β和Ser471β。
因此，本發(fā)明的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體優(yōu)選具有以下氨基酸序列，其特征在于選自以下的至少一個氨基酸被另一氨基酸所取代，這些氨基酸包括CPC酰基轉(zhuǎn)移酶α-亞基(SEQ ID NO4)中的Val121α、Gly139α和Phe169α，以及CPC?；D(zhuǎn)移酶β-亞基(SEQ ID NO5)中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β。
在上述為提高CPC酰基轉(zhuǎn)移酶對CPC反應(yīng)性的氨基酸替代中，優(yōu)選選自下組中的另一氨基酸替代特定的氨基酸殘基，包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸以及精氨酸。更優(yōu)選丙氨酸取代Val121α；絲氨酸取代Gly139α；酪氨酸取代Phe169α；亮氨酸取代Met31β；天冬酰氨、甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸或半胱氨酸取代Phe58β；絲氨酸或亮氨酸取代His70β；蘇氨酸取代Ile75β；纈氨酸取代Ile176β；以及半胱氨酸取代Ser471β。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案制備了名為S12的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體基因，其中丙氨酸取代Val121α；絲氨酸取代Gly139α；天冬酰胺取代Phe58β；蘇氨酸取代Ile75β；纈氨酸取代Ile176β；以及半胱氨酸取代Ser471β。S12突變體基因?qū)PC的比活性增強(qiáng)，而7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用減弱。S12突變體基因具有SEQ ID NO6的核苷酸序列，而S12突變體基因編碼的活性CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體由SEQ ID NO7的α-亞基和SEQ ID NO8的β-亞基組成。
本發(fā)明也包括CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的功能等效衍生物。本發(fā)明中的功能等效衍生物指保留與本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶基本特征的CPC?；D(zhuǎn)移酶衍生物。即功能等效衍生物包括所有可能的變體，如天然、合成或重組多肽，其經(jīng)過修飾(即如序列突變、缺失、插入、替代、一個或幾個核苷酸的倒置或其組合)并能夠行使CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的功能。
此外，本發(fā)明包括編碼所述對CPC反應(yīng)性提高的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的多核苷酸或其功能等效衍生物。優(yōu)選該多核苷酸具有SEQ ID NO6的核苷酸序列。本發(fā)明中的功能等效衍生物是指，保留編碼CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體α-亞基和/或β-亞基的多核苷酸的關(guān)鍵功能特性的多核苷酸及其衍生物。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)不僅僅包括編碼CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的多核苷酸(其內(nèi)含有通過間隔肽與β-亞基相連的α-亞基)，也包括編碼CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體α-亞基和β-亞基而無間隔肽的多核苷酸。此外，僅編碼CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體α-亞基的多核苷酸和僅編碼CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體β-亞基的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明范圍內(nèi)也包括含有下列核苷酸序列的多核苷酸，包括本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因的核苷酸序列，或由CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體氨基酸序列推繹出的核苷酸序列，以及通過對本發(fā)明CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體基因的核苷酸序列的遺傳密碼進(jìn)行簡并而生成的核苷酸序列。
此外，本發(fā)明包括含有本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體編碼基因的重組表達(dá)載體?？梢岳贸Ｒ?guī)方法(Sambrook等，《Molecular Cloning》，ColdSpring Harbor Laboratory，1989)將含有CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因的DNA片斷以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)節(jié)序列插入合適的表達(dá)載體中，制備所述重組表達(dá)載體。本發(fā)明中可以使用任何能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體。例如，優(yōu)選表達(dá)載體包括(但不限于)質(zhì)粒、噬菌體載體以及整合載體。
上述制備的重組表達(dá)載體可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法(Sambrook等，同上)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。細(xì)菌、放線菌、酵母、真菌、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞以及植物細(xì)胞均可用作適合表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞。在這些宿主細(xì)胞中，優(yōu)選細(xì)菌(如E.coli或芽孢桿菌屬(Bacillus sp.))、放線菌(如鏈霉菌屬(Streptomyces sp.))、酵母(如Scaaharomyces sp.、腐質(zhì)酶屬(Humicola sp.)或畢赤酵母屬(Pichia sp.))、真菌(如曲霉屬(Aspergillus sp.)或口蘑屬(Trichoderma sp.))、以及產(chǎn)生CPC的微生物(如頭孢霉屬(Cephalosporium sp.)或頂孢霉屬(Acremonium sp.))。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用含有本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因S12(SEQ ID NO6)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，以獲得E.coli轉(zhuǎn)化體，稱為E.coli BL21(DE3)/pET-S12，根據(jù)關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，將該轉(zhuǎn)化體于2003年7月30日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic of Korea)，登陸號KCTC 10503BP。
可以通過在適當(dāng)?shù)臈l件、合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化微生物(該微生物中引入含有CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體編碼基因或其功能等效衍生物的表達(dá)載體)來制備CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體。
另外，也可以通過在適當(dāng)?shù)臈l件、合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過只含有CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體α-亞基編碼基因或其功能等效衍生物的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，以及經(jīng)過只含有CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體β-亞基編碼基因或其功能等效衍生物的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物，分別在各自轉(zhuǎn)化微生物中產(chǎn)生α-亞基蛋白質(zhì)及β-亞基蛋白質(zhì)，并在體外混合這兩種純化的亞基蛋白質(zhì)，以制備CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。
可以使用由此制備的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體或其純化形式以一步酶法生產(chǎn)所需的7-ACA產(chǎn)物。可以，采用常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法，根據(jù)CPC?；D(zhuǎn)移酶的特點(diǎn)使用不同的柱層析技術(shù)(依據(jù)特定目的對該法加或不加以輕微改動)純化CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。此外，也可以利用結(jié)合親和力(如組胺肽與鎳柱間的、或纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)與纖維素間的結(jié)合親和力)，使用親和層析純化CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。
本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體也可以在固定化形式下使用?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法使用載體進(jìn)行CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的固定化，載體例如天然多聚物(如纖維素、淀粉、葡聚糖以及瓊脂糖)、合成多聚物(如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸以及Eupergit C)，或礦物質(zhì)(如硅、膨潤土及金屬)?？梢酝ㄟ^常規(guī)固定化方法(如共價鍵、離子鍵、親水鍵、物理吸附或微囊化)將CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體與上述載體耦連。此外，也可以在載體和酶之間通過戊二醛或溴化氰的作用形成共價鍵從而固定化CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。優(yōu)選地，可以通過固定化整個細(xì)胞的方法固定化產(chǎn)生CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的微生物細(xì)胞而無需純化CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。為了提高微生物產(chǎn)生的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的反應(yīng)性，也可以在細(xì)胞壁上穿孔或?qū)ζ鋺?yīng)用細(xì)胞表面表達(dá)技術(shù)。
此外，本發(fā)明提供了使用所述CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，從式I的CPC制備式II的7-ACA或其鹽的方法。
在以下的式中，R為乙酸基(-OCOCH3)、羥基(-OH)、氫(-H)或其鹽。優(yōu)選地，R為乙酸基(-OCOCH3)，而鹽為堿性金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽或鋰鹽。
<式I>
<式II>
可以將CPC(I)與本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體相接觸來產(chǎn)生7-ACA(II)，其中CPC?；D(zhuǎn)移酶可能以CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體產(chǎn)生株培養(yǎng)物溶液的形式或組合物(其中含有CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體、純化的游離酶自身或該酶的固定化形式)的形式使用。優(yōu)選地，CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體與CPC(I)之間的接觸反應(yīng)可以在液體溶液中進(jìn)行。優(yōu)選的CPC(I)濃度為1至500mM；加入的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體量為0.1至100U/ml；反應(yīng)混合物的pH值為7至10；反應(yīng)時間為0.1至24小時；而反應(yīng)溫度為4至40℃℃。可以通過常規(guī)方法將以上酶反應(yīng)制備的7-ACA(II)從反應(yīng)混合物中分離和純化出來。
此外，可以在體內(nèi)將本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體與CPC(I)相接觸，以產(chǎn)生7-ACA(II)。具體而言，可以通過以下步驟產(chǎn)生7-ACA(II)將CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體編碼基因或其功能等效衍生物導(dǎo)入具有CPC生物合成活性的微生物(如Acremonium crysozenum)中；在恰當(dāng)?shù)臈l件下、合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體；自發(fā)地將CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體與所述轉(zhuǎn)化體中生物合成的CPC(I)接觸。
本發(fā)明在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步定義。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅用于說明。根據(jù)以上討論及這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠明確本發(fā)明的基本特點(diǎn)，并在不背離其精神和范圍的前提下對本發(fā)明進(jìn)行多種修飾和改變，以適應(yīng)不同的用法和條件。
實(shí)施例1制備對CPC反應(yīng)性增強(qiáng)的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體<1-1>根據(jù)結(jié)構(gòu)信息，制備CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體<1-1-1>根據(jù)結(jié)構(gòu)信息，選擇進(jìn)行突變的AcyII氨基酸殘基最近確定了CAD-GL-7-ACA復(fù)合物的三級結(jié)構(gòu)(Kim等，Chem.Biol.81253-1264，2001；Kim等，J.Biol.Chem.27648376-48381，2001)。如圖3所示，位于CAD底物結(jié)合位點(diǎn)上的Arg57β、Tyr33β、Tyr149α和Arg155α與GL-7-ACA直接形成氫鍵，而Phe177β、Leu24β和Val170β則通過疏水相互作用與GL-7-ACA結(jié)合。此外，盡管Gln50β與GL-7-ACA之間沒有直接的相互作用，它與Arg57β和Tyr149α之間形成氫鍵從而使這些殘基處于進(jìn)行催化反應(yīng)的合適位置上。同時，在CAD與GL-7-ACA的耦連中，GL-7-ACA含有乙酸基基團(tuán)、六元環(huán)以及四元β-內(nèi)酰胺環(huán)的β-內(nèi)酰胺核，并不會顯著影響與活性位點(diǎn)殘基之間的結(jié)合。如果要算，與Arg57β、Tyr33β、Tyr149α和Phe177β的精確耦連，戊二酸區(qū)域(如GL-7-ACA側(cè)鏈)對底物結(jié)合的影響最大(圖2和3)。此外，有設(shè)想認(rèn)為Leu24β和Val170通過使底物處于合適的位置，在激活Ser1β的催化反應(yīng)中發(fā)揮作用。
同時，CAD-GL-7-ACA復(fù)合物與CAD-CPC復(fù)合物的三級結(jié)構(gòu)重疊，使得與GL-7-ACA戊二酸側(cè)鏈耦連有關(guān)的CAD關(guān)鍵殘基(如Arg57β、Tyr33β、Phe177β和Tyr149α)和CPC D-α-氨基己二酰側(cè)鏈末端區(qū)域的羧基和D-型氨基團(tuán)相碰撞(圖4)。根據(jù)這些模擬結(jié)果，如果在CAD的底物結(jié)合位點(diǎn)上能保證有足夠的空間容納CPC側(cè)鏈(即與GL-7-ACA側(cè)鏈相比，CPC側(cè)鏈上還存在所述的碳主鏈和D-型氨基基團(tuán))，預(yù)計(jì)可提高GL-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶對CPC的比活性。
同時，通過比較CAD、青霉素G?；D(zhuǎn)移酶以及假單胞菌屬來源的GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)的結(jié)果，認(rèn)為假單胞菌屬來源的GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶具有與其他兩種相似的底物結(jié)合和反應(yīng)類型(Kim等，Chem.Biol.81253-1264，2001；Fritz-Wolf等，Protein Sci.1192-103，2002)。此外有報道稱，盡管CAD對CPC沒有活性，與GL-7-ACA相比，假單胞菌屬來源的GL-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶(AcyII)仍可顯示對CPC約5％的?；D(zhuǎn)移酶活性(Matsuda等，J.Bacteriol.1695815-5820，1987)。因此，在對CPC具有恒定水平酶活性的AcyII基礎(chǔ)上開發(fā)CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，比在不具備CPC酶活性的CAD基礎(chǔ)上開發(fā)更有優(yōu)勢。據(jù)此，本發(fā)明使用假單胞菌屬SE83來源的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因(acyII)作為基礎(chǔ)基因，研制CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。
本發(fā)明致力于制備CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其對與CPC的比活性比野生型AcyII更好，所述制備是通過根據(jù)CAD-CPC復(fù)合物的三級結(jié)構(gòu)以及實(shí)際的誘變信息選擇AcyII活性位點(diǎn)，接著對在所選活性位點(diǎn)中與干擾CPC結(jié)合有關(guān)的AcyII殘基實(shí)施定點(diǎn)誘變。表1顯示了經(jīng)受定點(diǎn)誘變的相應(yīng)于CAD活性位點(diǎn)殘基的AcyII殘基。
<表1>
根據(jù)CAD-CPC復(fù)合物的三級結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果，對AcyII的Phe58β、Met31β、Ile176β以及Phe169α殘基進(jìn)行定點(diǎn)誘變(分別對應(yīng)于CAD的Phe58β、Tyr33β、Phe177β和Tyr149α殘基)，這些殘基被認(rèn)為會嚴(yán)重抑制CPC側(cè)鏈的結(jié)合；激活Ser1β活性位點(diǎn)催化反應(yīng)的AcyII的His70β殘基(對應(yīng)于CAD的Val70β)也進(jìn)行了定點(diǎn)誘變(圖5)。
<1-1-2>制備pBCPC和pBSEM質(zhì)粒如下將SEQ ID NO1的acyII結(jié)構(gòu)基因DNA片斷插入pBC KS(+)載體(Stratagene，USA)的XhoI/XbaI位點(diǎn)中，構(gòu)建pBCPC質(zhì)粒。首先根據(jù)假單胞菌屬SE83來源的CPC?；D(zhuǎn)移酶基因(acyII)的DNA核苷酸序列以及由其編碼的蛋白AcyII的氨基酸序列，使用DNA合成儀合成acyII結(jié)構(gòu)基因(GenBank登錄號M18278)。此時，acyII基因編碼的氨基酸序列與文獻(xiàn)發(fā)表的相同，但其核苷酸序列在合成中經(jīng)過一些修飾，使acyII基因中可能含有一個或多個E.coli優(yōu)選密碼子。
進(jìn)行PCR以在acyII結(jié)構(gòu)基因中引入限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。PCR反應(yīng)溶液(100μl)含有合成的acyII基因DNA 10ng、CPC-F引物(SEQ ID NO13)和CPC-R引物(SEQ ID NO14)各50pmol、dNTP混合物0.2mM、Taq緩沖溶液(5mM KCl，5mM Tris-HCl，(pH 8.3)、1.5mMMgCl2)，以及ExTaq聚合酶2.5單位(Takara，Japan)。反應(yīng)起始，在95℃、程控?zé)嵫h(huán)儀(Peltier Thermal Cycler PTC-200；MJResearch，USA)內(nèi)預(yù)變性5分鐘。PCR條件由25個循環(huán)的95℃/1分鐘(變性)，58℃/30秒鐘(退火)、72℃/1分30秒(聚合)，以及最后的延伸72℃/10分鐘(聚合后)所組成。PCR擴(kuò)增后，約2.5kb PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI/XhoI消化，并通過純化試劑盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)純化，以獲得插入DNA。此外，pBC KS(+)載體DNA經(jīng)XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，從而獲得載體DNA。插入DNA和載體DNA通過T4 DNA連接酶(Roche，Germany)在16℃下反應(yīng)12至16小時連接起來，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以選擇轉(zhuǎn)化體。從選擇的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒，并分析插入DNA的核苷酸序列。經(jīng)此過程制備含有SEQ ID NO1的acyII結(jié)構(gòu)基因的pBCPC質(zhì)粒，含有該pBCPC質(zhì)粒的E.coli轉(zhuǎn)化體被命名為E.coli MC1061(pBCPC)。
將SEQ ID NO3的sem結(jié)構(gòu)基因DNA片斷插入pBC KS(+)載體(Stratagene，USA)的XhoI/XbaI位點(diǎn)中，構(gòu)建pBSEM質(zhì)粒。如下進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增以pBCPC質(zhì)粒為模板、M13-R引物(SEQ ID NO11)以及αORF-R引物(SEQ ID NO15)獲得0.8kb的PCR產(chǎn)物；以pBCPC質(zhì)粒為模板、βORF-R引物(SEQ ID NO16)以及HindIII-R引物(SEQID NO18)獲得約0.96kb的PCR產(chǎn)物；及以pBCPC質(zhì)粒為模板、HindIII-F引物(SEQ ID NO17)以及M13-F引物(SEQ ID NO12)獲得0.75kb的PCR產(chǎn)物。將以上獲得的0.8kb、0.96kb和0.75kb PCR產(chǎn)物混合，除不加引物外，在上述相同的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR，得到將三種PCR產(chǎn)物連接在一起的PCR產(chǎn)物約2.5kb。隨后，使用T3引物(SEQID NO9)以及T7引物(SEQ ID NO10)對該約2.5kb的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增大約為2.5kb大小的sem基因DNA片斷。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，約2.5kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI/XhoI消化，并通過純化試劑盒(QIAEX II GelExtraction Kit；Qiagen，Germany)純化并用獲得插入DNA。此外，pBCKS(+)載體DNA經(jīng)XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，從而獲得載體DNA。插入DNA和載體DNA通過T4 DNA連接酶(Roche，Germany)在16℃下反應(yīng)16小時連接起來，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以選擇轉(zhuǎn)化體。從選擇的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒，并分析插入DNA的核苷酸序列。這樣，制備含有sem結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO3)的pBSEM質(zhì)粒，含有該pBSEM質(zhì)粒的E.coli轉(zhuǎn)化體被命名為E.coliMC1061(pBSEM)。
為了比較E.coli轉(zhuǎn)化體來源的pBCPC質(zhì)粒和E.coli轉(zhuǎn)化體來源的pBSEM質(zhì)粒的CPC?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)率，從各自E.coli轉(zhuǎn)化體中獲得的CPC?；D(zhuǎn)移酶粗酶溶液制備如下。將每一種E.coli轉(zhuǎn)化體注入含有25μg/ml氯霉素的3ml LB培養(yǎng)基中(1％ Bacto-Tryptone、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)，并在30℃、200rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)16小時。將50μl培養(yǎng)溶液轉(zhuǎn)移到50ml含25μg/ml氯霉素的新LB培養(yǎng)基，并在25℃、200rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)48小時。將該培養(yǎng)溶液在4℃、8,000rpm下離心10分鐘分離沉淀物，用0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)將沉淀物洗滌兩次。將該沉淀物懸浮于5ml的相同緩沖溶液中，并在4℃超聲波破碎10分鐘。隨后在4℃、15,000rpm下離心該懸浮液20分鐘分離上清液，該上清液可用作CPC?；D(zhuǎn)移酶粗酶溶液。
根據(jù)Park等描述的方法(Park等，Kor.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.23559-564，1995)，加以輕微改動，如下測定CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體對CPC的酶活性。將CPC(純度74.2％；CJ Corp.，Korea)溶解于0.1MTris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)至濃度為20mg/ml，并用1N NaOH調(diào)節(jié)pH至8，以制備底物溶液。將20μl該CPC溶液與以上制備的20μl CPC?；D(zhuǎn)移酶粗酶溶液混合，反應(yīng)混合物在37℃孵育5分鐘。反應(yīng)后，向其中加入50mM NaOH和20％冰醋酸(1∶2)混合物(200μl)終止反應(yīng)。通過離心從反應(yīng)混合物中分離出來的200μl上清液，與40μl溶解于甲醇中的0.5％(w/v)PDAB(對二甲氨基苯甲醛；Sigma，USA)混合，反應(yīng)混合物在37℃孵育10分鐘。反應(yīng)后，在415nm處測定反應(yīng)混合物的吸光度，并通過與標(biāo)準(zhǔn)材料的校準(zhǔn)曲線相比較進(jìn)行定量。這里，1單位定義為每分鐘能從CPC產(chǎn)生1微摩爾7-ACA的酶量。同時，根據(jù)Bradford描述的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72248-254，1976)測定酶溶液中剩下的蛋白質(zhì)量，由此確定CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的比活性，并將其表示為對應(yīng)于1mg蛋白質(zhì)的活性單位。通過下列步驟確定CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的反應(yīng)性在反應(yīng)混合物中加入相同量的蛋白質(zhì)，在固定的時間內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)，測量反應(yīng)混合物中生成的7-ACA量并將其表示為相對值。通過以下步驟確定7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用在反應(yīng)混合物中加入對應(yīng)于相同活性單位的蛋白質(zhì)，在固定的時間內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)，測量反應(yīng)混合物中生成的7-ACA量，并將其表示為相對值。
測定對CPC的酶活性的結(jié)果表明，E.coli轉(zhuǎn)化體MC1061(pBCPC)產(chǎn)生CPC酰基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)率為約97單位/l，而E.coli轉(zhuǎn)化體MC1061(pBSEM)的產(chǎn)率僅為11單位/l。
<1-1-3>制備Met31β/Phe58β雙突變體為了開發(fā)對CPC反應(yīng)性增強(qiáng)的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，如下制備Met31β/Phe58β雙突變體。如CAD-CPC復(fù)合物的三級結(jié)構(gòu)模擬所示，由于與GL-7-ACA側(cè)鏈相比，CPC側(cè)鏈另含有碳主鏈和D型氨基基團(tuán)，CAD與CPC結(jié)合比GL-7-ACA需要更大的空間。為了保證有足夠空間與CPC結(jié)合，將AcyII底物結(jié)合位點(diǎn)中的兩個殘基進(jìn)行自發(fā)突變。AcyII的His 57β(對應(yīng)于CAD的Arg57β)作為結(jié)合CPC側(cè)鏈最重要的殘基保留下來，AcyII的Met31β因與CPC側(cè)鏈末端的羧基和D型氨基發(fā)生碰撞，以亮氨酸替代之。同時，為了進(jìn)一步保證通過在AcyII的His 57β側(cè)鏈處誘發(fā)扭曲旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的與CPC側(cè)鏈結(jié)合的空間，AcyII的Phe58β被另一種側(cè)鏈相對較小的氨基酸殘基所取代，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺。因此，通過重疊PCR(Ho等，Gene 1551-59，1989)制備得M31βL/F58βM、M31βL/F58βC、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA、M31βL/F58βV以及M31βL/F58βN雙突變體。制備這些雙突變體的步驟將于下文詳述。
用于定點(diǎn)誘變的PCR反應(yīng)溶液(100μl)含有10ng模板DNA、正向及反向引物各50pmol、0.2mM dNTP混合物、Taq緩沖溶液(5mM KCl、5mM Tris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2)，以及2.5單位ExTaq聚合酶(Takara，Japan)。在95℃、程控?zé)嵫h(huán)儀(Peltier Thermal CyclerPTC-200；MJ Research，USA)內(nèi)預(yù)變性5分鐘起始反應(yīng)。PCR條件由25個循環(huán)的95℃/1分鐘，58℃/30秒鐘、72℃/60-90秒，以及最后72℃/10分鐘的延伸組成。
特別地，為制備M31βL/F58βM雙突變體而進(jìn)行的一系列PCR擴(kuò)增，通過使用以下模板及引物實(shí)施以pBSEM質(zhì)粒為模板、M13-R引物(SEQID NO11)以及M31βL-R引物(SEQ ID NO19)獲得1.0kb的PCR產(chǎn)物；以pBSEM質(zhì)粒為模板、F58βM-F引物(SEQ ID NO20)以及M13-F引物(SEQ ID NO12)獲得1.6kb的PCR產(chǎn)物。
將以上獲得的1.0kb和1.6kb PCR產(chǎn)物混合，除不加引物外，在上述相同的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR，得到將兩種PCR產(chǎn)物連接在一起的約2.5kb PCR產(chǎn)物。隨后，使用T3引物(SEQ ID NO9)以及T7引物(SEQID NO10)對該約2.5kb的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增大約為2.5kb大小的雙突變體基因DNA片斷。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，約2.5kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI/XhoI消化并用通過純化試劑盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)純化，以獲得插入DNA。此外，pBC KS(+)載體DNA經(jīng)XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，從而獲得載體DNA。插入DNA和載體DNA通過T4 DNA連接酶(Roche，Germany)在16℃下反應(yīng)16小時連接起來，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli系涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以選擇含有雙重突變基因的轉(zhuǎn)化體。從所選的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒，并分析插入DNA的核苷酸序列以正實(shí)突變殘基。
根據(jù)與上述相同的方法制備M31βL/F58βC、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA、M31βL/F58βV以及M31βL/F58βN雙突變體。此處，對于M31βL/F58βC，M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQID NO19)，F(xiàn)58βC-F引物(SEQ ID NO21)及M13-F引物(SEQ ID NO12)用于重疊PCR擴(kuò)增；對于M31βL/F58βL，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO19)，F(xiàn)58βL-F引物(SEQ ID NO24)及M13-F引物(SEQ ID NO12)；對于M31βL/F58βA，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO19)，F(xiàn)58βA-F引物(SEQ ID NO22)及M13-F引物(SEQ ID NO12)；對于M31βL/F58βV，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO19)，F(xiàn)58βV-F引物(SEQ ID NO23)及M13-F引物(SEQ ID NO12)；而對于M31βL/F58βN，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQID NO19)，F(xiàn)58βN-F引物(SEQ ID NO25)及M13-F引物(SEQ ID NO12)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每種CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的粗酶溶液測量以上獲得的雙突變體對CPC的比活性，結(jié)果證實(shí)，M31βL/F58βM、M31βL/F58βC、M31βL/F58βN、M31βL/F58βL、M31βL/F58βA以及M31βL/F58βV雙突變體的比活性分別比野生型AcyII高2.4、2.3、2.0、1.8、1.6及1.6倍。
<1-1-4>制備Met31β/Phe58β/His70β三重突變體為了進(jìn)一步提高6種雙突變體中比活性增加最高的M31βL/F58βM的比活性，用絲氨酸或亮氨酸替代能刺激活性位點(diǎn)S1β的催化反應(yīng)的AcyIIHis70β(對應(yīng)于CAD的Val70β)，制備三重突變體。
遵循生產(chǎn)廠商的說明，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，USA)，制備M31βL/F58βM/H70βS三重突變體。PCR反應(yīng)溶液(50μl)含有M31βL/F58βM雙突變體DNA 40ng、H70βS-F引物(SEQID NO26)和H70βS-R引物(SEQ ID NO27)各100pmol、dNTP混合物1μl、5μl緩沖溶液(100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、200mM Tris-HCl、(pH 8.8)、20mM MgSO4、1％ Triton X-100以及1mg/ml BSA)，以及2.5單位的pfuTurboTM聚合酶(Stratagene，USA)。在95℃、程控?zé)嵫h(huán)儀(Peltier Thermal Cycler PTC-200；MJ Research，USA)內(nèi)預(yù)變性5分鐘起始反應(yīng)。PCR條件由16個循環(huán)的95℃/30秒鐘，55℃/1分鐘、68℃/12分鐘組成。PCR擴(kuò)增后，向PCR反應(yīng)溶液中加入10單位DpnI限制性內(nèi)切酶并在37℃下孵育1小時，以除去未發(fā)生任何突變的模板DNA。通過純化試劑盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)純化突變DNA，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以選擇轉(zhuǎn)化體。從所選的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒，并分析插入DNA的核苷酸序列以正實(shí)突變殘基。
除了改用H70βL-F引物(SEQ ID NO28)和H70βL-R引物(SEQ IDNO29)以外，根據(jù)與上述相同的方法，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，USA)，可制備M31βL/F58βM/H70βL三重突變體。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每種CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的粗酶溶液測量三重突變體對CPC的比活性，結(jié)果證實(shí)，M31βL/F58βM/H70βS和M31βL/F58βM/H70βL三重突變體的比活性分別比M31βL/F58βM雙突變體高3.2及2.4倍。
<1-1-5>制備Phe169α/Met31β/Phe58β/His70β四重突變體為了進(jìn)一步提高2種三重突變體中比活性增加最高的M31βL/F58βM/H70βS的比活性，以酪氨酸替代AcyII的Phe169α(對應(yīng)于CAD的Tyr149α)而制備四重突變體，F(xiàn)169αY/M31βL/F58βM/H70βS，Phe169α幫助CPC定位在恰當(dāng)位置，使活性位點(diǎn)S1β發(fā)生有效催化反應(yīng)。因?yàn)槔野彼醾?cè)鏈相對于苯丙氨酸側(cè)鏈另有一個羥基(-OH)，它能夠與CPC側(cè)鏈和/或其鄰近殘基形成氫鍵，從而激活S1β的催化反應(yīng)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-4>中描述的相同方法，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，USA)制備F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體；只是改用M31βL/F58βM/H70βS三重突變體為模板，并采用F169αY-F引物(SEQ ID NO30)和F169αY-R引物(SEQ ID NO31)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用四重突變體的粗酶溶液測量F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體對CPC的比活性，結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體的比活性比M31βL/F58βM/H70βS三重突變體高2.1倍。
<1-1-6>制備Phe169α/Met31β/Phe58β/His70β/Ile176β五重突變體為了進(jìn)一步提高F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體對CPC的比活性，用纈氨酸替代與干擾CPC側(cè)鏈結(jié)合有關(guān)的AcyII的Ile176β(對應(yīng)于CAD的Phe177β)制備五重突變體F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/Ile176βV。在實(shí)施例<1-1-3>中，AcyII的Phe58β已經(jīng)被甲硫氨酸所取代。同時，AcyII的Ile176β與AcyII的Phe58β位置十分接近，也被認(rèn)為干擾了與CPC的結(jié)合。因此，為達(dá)到與CPC底物側(cè)鏈更有效的結(jié)合，用纈氨酸代替Ile176β，前者的側(cè)鏈與異亮氨酸結(jié)構(gòu)相似但大小更小。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-4>中描述的相同方法，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，USA)制備F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體，只是改用F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體為模板，并采用I176βV-F引物(SEQ ID NO32)和I176βV-R引物(SEQ ID NO33)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用五重突變體的粗酶溶液測量F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體對CPC的比活性，結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體的比活性比F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體高2.4倍。
<1-2>制備對CPC反應(yīng)性增強(qiáng)的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體<1-2-1>制備Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β四重突變體難以將已有的CPC?；D(zhuǎn)移酶大規(guī)模應(yīng)用于一步酶合成法制備7-ACA的原因在于由于7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用以及CPC酰基轉(zhuǎn)移酶對CPC的低比活性，將CPC轉(zhuǎn)化為7-ACA的轉(zhuǎn)化效率很低。同時，通過實(shí)施例<1-1>中一系列為提高CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體比活性而做的定點(diǎn)誘變可以得知，His70β的突變顯著提高了CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體對CPC的比活性，但也嚴(yán)重增加了7-ACA的終產(chǎn)物抑制水平。因此，將實(shí)施例<1-1-6>中的F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體進(jìn)行反向誘變，使H70βS變?yōu)橐吧蜌埢M氨酸，制備F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體(圖5)。根據(jù)實(shí)施例<1-1-4>中描述的相同方法，使用QuickChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，USA)制備F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體，只是改用F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體為模板，并采用H70βS-F引物(SEQ ID NO34)和H70βS-R引物(SEQ ID NO35)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，在制備每種野生型、F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體和F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體各自的粗酶溶液后，使用對應(yīng)于相同活性單位的酶溶液測量終產(chǎn)物抑制。結(jié)果證實(shí)，將F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體中H70βS突變?yōu)橐吧蜌埢M氨酸的反突變將7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用降至與野生型酶相同的水平(圖6)。
<1-2-2>制備Gly139α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β和Val121α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β五重突變體為了進(jìn)一步提高F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體對CPC的反應(yīng)性，將該四重突變體的DNA進(jìn)行易錯PCR，以構(gòu)建一個在隨機(jī)位點(diǎn)點(diǎn)突變的突變體文庫。此處，調(diào)整所述易錯PCR的差錯發(fā)生率為平均一個四重突變體基因發(fā)生一個氨基酸殘基突變。構(gòu)建突變體文庫的具體過程如下。
用于易錯PCR的PCR反應(yīng)溶液(100μl)含有5ngF169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體DNA、T3引物(SEQ IDNO9)以及T7引物(SEQ ID NO10)各50pmol、dATP和dGTP各0.2mM、dCTP和dTTP各1.0mM、5mM KCl、5mM Tris-HCl(pH 8.3)、3.5mM MgCl2、0.025mM MnCl2以及rTaq聚合酶2.5單位(Takara，Japan)。在95℃、程控?zé)嵫h(huán)儀(Peltier Thermal Cycler PTC-200；MJResearch，USA)內(nèi)變性3分鐘起始反應(yīng)。PCR條件由20個循環(huán)的95℃/1分鐘，58℃/30秒鐘、72℃/90秒，以及最后72℃/10分鐘的延伸組成。經(jīng)過易錯PCR擴(kuò)增，約2.5kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI/XhoI消化，并通過純化試劑盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)純化，以獲得插入DNA。此外，pBSEM質(zhì)粒DNA經(jīng)XbaI/XhoI消化，以獲得3.4kb的DNA片斷作為載體DNA。插入DNA和載體DNA通過T4 DNA連接酶(Roche，Germany)在16℃下反應(yīng)16小時連接起來，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以構(gòu)建突變體文庫。
從上述獲得的突變體文庫中，如下篩選出對CPC反應(yīng)性增強(qiáng)的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。
用含有CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因(該基因通過易錯PCR在隨機(jī)位點(diǎn)上引入點(diǎn)突變)的E.coli MC1061轉(zhuǎn)化體，接種填入200μl含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂的96孔平板，在30℃、180rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)60-70小時。從孔板上取每種培養(yǎng)溶液100μl轉(zhuǎn)移到新的96孔平板上。向其中加入100μl細(xì)胞裂解溶液(含有2mg/ml溶菌酶、4mM EDTA、0.4％ TritonX-100的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0))，30℃放置兩小時。隨后，將50μl2.5％(w/v)CPC的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶液和5mM 7-ACA的混合物加入每一孔中，將孔板在28℃下保持14至16個小時，以誘發(fā)CPC的水解反應(yīng)。此處，將7-ACA加入CPC溶液，是為了幫助篩查對CPC比活性增強(qiáng)，和/或7-ACA終產(chǎn)物抑制作用減弱的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體℃PC水解反應(yīng)過后，將反應(yīng)混合物在4,200rpm下離心20分鐘分離上清液，50μl該上清液被轉(zhuǎn)移至新的96孔平板。將160μl終止溶液(醋酸250mM NaOH，2∶1)加入每一孔中終止酶促反應(yīng)后，向其中加入40μl顯影劑(溶于甲醇的0.5％(w/v)PDAB溶液)，孔板在室溫下放置10分鐘。隨后將該孔板置于酶標(biāo)測定儀上，在415nm處測定反應(yīng)混合物的吸光度，并通過比較測得的吸光度選擇對CPC反應(yīng)性增強(qiáng)的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。
在所述隨機(jī)突變體文庫中隨機(jī)篩選約25,000個克隆，結(jié)果選擇了2個突變體(#120和#213)，其吸光度比用作隨機(jī)誘變模板的F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體更高。序列分析證實(shí)了#120突變體中Gly139α被絲氨酸所替代(G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重突變體)，而#213突變體中Val121α被丙氨酸所替代(V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV五重突變體)(圖5)。
進(jìn)一步，根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每種突變體的粗酶溶液，測量#120和#213突變體對CPC的反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，#120和#213突變體對CPC的反應(yīng)性遠(yuǎn)高于實(shí)施例<1-2-1>中的F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體(圖7)。
<1-2-3>制備Val121α/Gly139α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β六重突變體根據(jù)實(shí)施例<1-2-2>的結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，在F169αY/M31βL/F58βM/I176βV四重突變體中引入G139αS或V121αA提高了CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的反應(yīng)性。因此，為了進(jìn)一步提高對CPC的反應(yīng)性，通過將#120突變體中的G139αS突變引入#213突變體，制備V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體(圖5)。根據(jù)實(shí)施例<1-1-4>中描述的相同方法制備發(fā)明的六重突變體，只是改用#213突變體DNA為模板，并采用G139αS-F引物(SEQ ID NO36)和G139αS-R引物(SEQ ID NO37)進(jìn)行PCR。本發(fā)明已將編碼V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因命名為TnS5。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用六重突變體的粗酶溶液，測量V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體對CPC的反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，與#213和#120突變體相比，V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體(TnS5)對CPC的反應(yīng)性有所提高(圖7)。
<1-3>制備pBC-TnS5αβ質(zhì)粒編碼V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的TnS5基因是設(shè)計(jì)來在宿主細(xì)胞中分別表達(dá)α-亞基和β-亞基并通過這兩個亞基的自發(fā)接觸而產(chǎn)生CPC?；D(zhuǎn)移酶活性形式的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因(例如sem基因)。
TnS5基因產(chǎn)生的活性CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體由α-和β-亞基各一個組成，其亞基是在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因(如野生型酰基轉(zhuǎn)移酶基因(acyII))后，通過自消化的過程獲得。為了誘發(fā)上述突變體的形成，本發(fā)明制備了編碼該六重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的TnS5αβ基因，其中在V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的α-亞基和β-亞基(圖5)之間，插入了野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶的間隔肽(AcyII)。制備TnS5αβ基因的方法詳述如下。
將TnS5基因插入pBC KS(+)載體的XhoI/XbaI位點(diǎn)中以制備pBC-TnS5質(zhì)粒。進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，以pBC-TnS5質(zhì)粒為模板，M13-R引物(SEQ ID NO11)以及αCPC-R引物(SEQ ID NO38)獲得0.8kb的PCR產(chǎn)物；以pBC-TnS5質(zhì)粒為模板、βCPC-F引物(SEQ ID NO39)以及M13-F引物(SEQ ID NO12)獲得約1.7kb的PCR產(chǎn)物。將以上獲得的0.8kb和1.7kb PCR產(chǎn)物混合，除不加引物外，在上述相同的PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR，得到將兩種PCR產(chǎn)物連接在一起的約2.5kb PCR產(chǎn)物。隨后，使用T3引物(SEQ ID NO9)以及T7引物(SEQ ID NO10)對該約2.5kb的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增含有TnS5αβ基因的DNA片斷。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，約2.5kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI/XhoI消化，并通過純化試劑盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)純化，以獲得插入DNA。此外，pBC KS(+)載體DNA經(jīng)XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，從而獲得載體DNA。插入DNA和載體DNA通過T4 DNA連接酶(Roche，Germany)在16℃下反應(yīng)16小時連接起來，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli株涂布在含有25μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以選擇轉(zhuǎn)化體。從所選的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒，并分析插入DNA的核苷酸序列。通過這一過程，制備了含有TnS5αβ基因的pBC-TnS5αβ質(zhì)粒。
為了檢測TnS5αβ基因CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的產(chǎn)率，將編碼V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的TnS5和TnS5αβ基因分別插入pBC KS(+)載體中，以分別制備pBC-TnS5和pBC-TnS5αβ重組質(zhì)粒，而每一重組質(zhì)粒均用于轉(zhuǎn)化E.coli MC1061以獲得E.coli轉(zhuǎn)化體MC1061(pBC-TnS5)和MC1061(pBC-TnS5αβ)。將每一E.coli轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在50ml含有25μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25℃、200rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)48小時并根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用從轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)溶液中制備的粗酶溶液，測量對CPC的酶活性。結(jié)果顯示，E.coli轉(zhuǎn)化體MC1061(pBC-TnS5)和MC1061(pBC-TnS5αβ)各自產(chǎn)生CPC酰基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)率，分別為約78單位/l和162單位/l。這些結(jié)果證實(shí)，在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因后進(jìn)行自消化形成的六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(如TnS5αβ)，與α-亞基和β-亞基在宿主細(xì)胞中分別表達(dá)后自發(fā)接觸形成的六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(如TnS5)相比，其產(chǎn)率高約2倍。
進(jìn)一步將由E.coli轉(zhuǎn)化體MC1061(pBC-TnS5αβ)的培養(yǎng)溶液制備的粗酶溶液進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(12％ SDS-PAGE)，以檢測蛋白質(zhì)表達(dá)類型。結(jié)果表明，不存在大小約83kDa的無活性前體條帶，這表示在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)錄和翻譯TnS5αβ基因生成的大部分無活性前體形式，都通過有效的自消化轉(zhuǎn)化為CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的活性形式(圖7)。因此，以下將TnS5αβ基因作為研制CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的模板DNA。
<1-4>制備對CPC具有額外增強(qiáng)的反應(yīng)性的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體<1-4-1>制備Val121α/Gly139α/Phe169α/Phe58β/Ile176β五重突變體本發(fā)明通過實(shí)施例<1-1>至<1-3>中的一系列定點(diǎn)誘變和一個隨機(jī)誘變，制備編碼V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因TnS5和TnS5αβ。在這些制備TnS5αβ六重突變體的誘變過程中，認(rèn)為Met31β與CPC側(cè)鏈末端的羧基和D型氨基發(fā)生碰撞，故以亮氨酸替代之；同時用甲硫氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺取代Phe58β，以在His 57β側(cè)鏈處誘發(fā)扭曲旋轉(zhuǎn)，從而保證有足夠的空間與CPC側(cè)鏈結(jié)合。因此，本發(fā)明如下優(yōu)化了V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的Met31β和Phe58β殘基，以進(jìn)一步提高對CPC反應(yīng)性。
本發(fā)明以TnS5αβ六重突變體DNA為模板，將M31βL反向誘變?yōu)橐吧蜌埢琢虬彼幔58βM替換為天冬酰胺或半胱氨酸，制備四種突變體(V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV、V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV、V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV)。這些突變體是根據(jù)實(shí)施例<1-3>中描述的制備M31βL/F58βM雙突變體的相同方法制備的。此處，重疊PCR使用下列引物對于V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO19)，和F58βC-F引物(SEQ ID NO21)及M13-F引物(SEQ ID NO12)；對于V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31βL-R引物(SEQ ID NO19)，和F58βN-F引物(SEQ ID NO25)及M13-F引物(SEQ ID NO12)；對于V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31β-R引物(SEQ ID NO42)，和F58βC-F引物(SEQ ID NO21)及M13-F引物(SEQ ID NO12)；對于V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV，用M13-R引物(SEQ ID NO11)及M31β-R引物(SEQ ID NO42)，和F58βN-F引物(SEQ ID NO25)及M13-F引物(SEQ ID NO12)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每種突變體的粗酶溶液，測量其對CPC的酶反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，TnS5αβ六重突變體中F58βM為天冬酰胺所替代的突變體對CPC的反應(yīng)性大幅度提高；而TnS5αβ六重突變體中M31βL反向誘變?yōu)榧琢虬彼岬耐蛔凅w，盡管其比活性有所降低，能更有效地從CPC生產(chǎn)7-ACA(圖8)。根據(jù)這些結(jié)果，本發(fā)明選擇了對CPC反應(yīng)性比TnS5αβ六重突變體更高的V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重突變體(mF58)(圖5)。
<1-4-2>制備Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile176β四重突變體在實(shí)施例<1-1-5>中，本發(fā)明已用酪氨酸代替了M31βL/F58βM/H70βS三重突變體中的Phe169α，以進(jìn)一步提高CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的比活性。同時，在實(shí)施例<1-2-1>中，F(xiàn)169αY/M31βL/F58βN/H70βS/I176βV五重突變體中的H70βS殘基經(jīng)反向誘變?yōu)榻M氨酸，以降低7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用。而在實(shí)施例<1-4-1>中，V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的M31βL殘基也經(jīng)反向誘變?yōu)橐吧图琢虬彼釟埢?。此外，V121αA/G139αSF169αY/F58βM/I176βV五重突變體中的F58βM突變殘基和I176β殘基分別為天冬酰胺和纈氨酸所替代。因此，通過將F169αY突變殘基反向誘變?yōu)橐吧蜌埢奖彼幔苽銿121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體(F169)(圖5)。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-4>中描述的制備M31βL/F58βM/H70βS三重突變體DNA的相同方法制備V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體，只是改用V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重突變體DNA為模板，并采用F169αY-F引物(SEQ ID NO45)和F169αY-R引物(SEQ ID NO46)進(jìn)行PCR。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用突變酶的粗酶溶液，測量V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體對CPC的酶反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，在V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV五重突變體中將F169αβ反問突變野生型殘基苯丙氨酸，進(jìn)一步提高了CPC酰基轉(zhuǎn)移酶對CPC的反應(yīng)性(圖9)。
<1-4-3>制備Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile75β/Ile176β和Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile176β/Ser471β五重突變體為了進(jìn)一步提高V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體對CPC的反應(yīng)性，對V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體進(jìn)行易錯PCR，以構(gòu)建隨機(jī)突變體文庫。從上述構(gòu)建的隨機(jī)突變體文庫中，篩選出對CPC的反應(yīng)性比V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體更強(qiáng)的突變體。此處，易錯PCR的反應(yīng)條件、制備所述突變體文庫以及從中篩選突變體的方法都與實(shí)施例<1-2-2>中所述相同，只是一旦從突變體文庫中篩選出對CPC反應(yīng)性更強(qiáng)的突變體，向反應(yīng)混合物中加入5mM 7-ACA(終濃度)。
在所述隨機(jī)突變體文庫中隨機(jī)篩選約15,000個克隆，結(jié)果選擇了2個其吸光度比用作隨機(jī)誘變模板的V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體更高的突變體(#59和#76)。序列分析證實(shí)了#59突變體中Ile75β被蘇氨酸所替代(V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV五重突變體)，而#76突變體中Ser471β被半胱氨酸所替代(V121αA/F169αY/F58βN/I176βV/S471βC五重突變體)(圖5)。
此外，根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用每種突變體的粗酶溶液，測量#59和#76突變體對CPC的反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，#59和#76突變體對CPC的反應(yīng)性高于V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體(F169)(圖9)。
<1-4-4>制備Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile75β/Ile176β/Ser471β六重突變體上文已經(jīng)確認(rèn)，通過向V121αA/G139αS/F58βN/I176βV四重突變體中引入Ile75βT或S471βC突變，提高了其對CPC的反應(yīng)性。因此，為了進(jìn)一步提高對CPC的反應(yīng)性，本發(fā)明將#59突變體的Ile75βT突變引入#76突變體中，制備V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突變體(圖5)。根據(jù)實(shí)施例<1-1-4>中描述的相同方法制備本發(fā)明的六重突變體，只是改以#76突變體DNA為模板，使用I75βT-F引物(SEQ ID NO43)和I75βT-R引物(SEQ ID NO44)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明將編碼V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突變體的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因命名為S12。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中所述的相同方法，使用六重突變體的粗酶溶液，測量V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突變體對CPC的反應(yīng)性。結(jié)果證實(shí)，V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突變體(S12)對CPC的反應(yīng)性高于#76突變體(V121αA/F169αY/F58βN/I176βV/SβC五重突變體)(圖1 0)。
實(shí)施例2純化CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體并分析其反應(yīng)特性<2-1>純化對CPC比活性增強(qiáng)的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體將含有重組質(zhì)粒(其內(nèi)引入野生型或本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因)的E.coli MC1061轉(zhuǎn)化體，在含有25μg/ml氯霉素的1l terrific液體培養(yǎng)基(1.2％ Bacto-Trypton、2.4％酵母提取液、0.4％甘油、0.17MKH2PO4、0.72M K2HPO4)中于30℃下培養(yǎng)16小時以獲得培養(yǎng)前溶液(pre-culture)。將10ml該培養(yǎng)前溶液注入相同的培養(yǎng)基中，然后在25℃、200rpm下劇烈振蕩48小時。將培養(yǎng)溶液在4℃、8,000rpm下離心10分鐘分離沉淀物，用20mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)將沉淀洗滌物兩次。將該沉淀物懸浮于100ml的相同緩沖溶液中。將該懸浮液在4℃超聲波破碎20分鐘以破壞其細(xì)胞壁，隨后于4℃、15,000rpm下離心20分以除去不可溶的材料和細(xì)胞碎片，從而獲得在以下用作粗酶溶液的上清液。
向粗酶溶液中加入硫酸銨，調(diào)節(jié)其最終飽和度為30％，將反應(yīng)混合物在4℃攪拌1小時使其飽和。然后，將反應(yīng)混合物在4℃、12,000rpm下離心15分鐘，以除去沉淀物；向上清液中加入硫酸銨，調(diào)節(jié)其最終飽和度為60％。將反應(yīng)混合物在4℃攪拌1小時使其飽和，并在4℃、12,000rpm下離心15分鐘，以重新獲得沉淀物。將該沉淀物懸浮于20mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)中，并用含有50mM NaCl的20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)透析過夜。
將透析得到的蛋白質(zhì)溶液通過DEAE-瓊脂糖陰離子交換柱層析(5×18.5cm)，后者已用含有50mM NaCl的20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH8.0)平衡；再以三倍體積的相同緩沖溶液沖洗該柱，以除去未吸附其上的蛋白質(zhì)分子。通過將NaCl的濃度逐漸從50提高至200mM，洗脫被吸附的蛋白質(zhì)。收集具有CPC?；D(zhuǎn)移酶活性的級分，并以聚乙二醇(分子量20,000)濃縮在透析袋中。用含有25％硫酸銨的20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)對濃縮的蛋白質(zhì)進(jìn)行透析。
將上述獲得的滲出液通過Phenyl-Toyoperl柱層析(2.5×6cm)，后者已用含有25％硫酸銨的20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)平衡，以將蛋白質(zhì)吸附上柱；通過將硫酸銨的濃度從25減少至0，洗脫被吸附的蛋白質(zhì)。確定每一級分的CPC?；D(zhuǎn)移酶活性后，再收集具有酶活性的級分，以聚乙二醇濃縮，并用20mM Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)對之進(jìn)行透析，以純化野生型和本發(fā)明CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。
酶活性根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中描述的相同方法測量。
<2-2>分析野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶的物理性質(zhì)和反應(yīng)特性根據(jù)實(shí)施例<2-1>中描述的相同方法，從E.coli MC1061轉(zhuǎn)化體中純化野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)化體中含有實(shí)施例<1-1-2>制備的pBCPC或pBSEM質(zhì)粒。分別分析pBCPC質(zhì)粒來源的野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶(AcyII)和pBSEM質(zhì)粒來源的野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶(Sem)的物理性質(zhì)及反應(yīng)特性，結(jié)果表明，它們具有相同的物理性質(zhì)(如分子量)以及反應(yīng)特性(如，比活性、最適溫度、最適pH)。
進(jìn)一步將實(shí)施例<2-1>中得到的野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶的活性級分，進(jìn)行非變性的PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果只在對應(yīng)分子量為約83kDa處檢測到一個條帶，說明野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶純化完全(圖11a至11c)。結(jié)合非變性PAGE的結(jié)果，MALDI-TOF質(zhì)譜分析證實(shí)，純化酶(即活性?；D(zhuǎn)移酶)的分子量為約83kDa。另外，通過變性SDS-PAGE，檢測到對應(yīng)于α-亞基的約25kDa條帶和對應(yīng)于β-亞基的約58kDa條帶。這些結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明的CPC?；D(zhuǎn)移酶是由約25kDa的α-亞基和一個約58kDa的β-亞基依次組成的二聚體。
分別從變性SDS-PAGE凝膠純化α-和β-亞基，每個亞基片段的分子量則通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析測量。根據(jù)其結(jié)果已經(jīng)認(rèn)為，分別發(fā)生在SEQ ID NO2氨基酸序列中第230位和231位氨基酸間，以及第239位和240位氨基酸間的兩處自消化，能夠去除一個由9個氨基酸組成的間隔肽，從而可將pBCPC質(zhì)粒來源的野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶(AcyII)分為約25kDa的α-亞基和約58kDa的β-亞基。
測定野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶比活性的結(jié)果表明，野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶對GL-7-ACA具有約23.1單位/mg蛋白質(zhì)的比活性，對CPC的比活性則為約0.33單位/mg蛋白質(zhì)。因此，已知假單胞菌屬SE83來源的AcyII對CPC的比活性僅相當(dāng)于對GL-7-ACA比活性的約1.4％。
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中描述的相同方法進(jìn)行酶促反應(yīng)后，通過Lineweaver-Burk作圖法確定純化酶的動力參數(shù)。結(jié)果野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶AcyII的Km、Kcat和催化效率(即Kcat/Km)分別為50mM、0.9/秒和0.02/秒/mM。
此外，測定野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶AcyII的最適反映溫度和pH的結(jié)果表明其最適反映溫度和pH分別為40℃和9.0。
<2-3>分析比活性增強(qiáng)的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的反應(yīng)特性根據(jù)實(shí)施例<2-1>中描述的相同方法，從質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組E.coli中純化各CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒分別含有編碼M31βL/F58βM雙突變體、M31βL/F58βM/H70βS三重突變體、F169αY/M31βL/F58βM/H70βS四重突變體及F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體的各CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因。
分析每種純化突變酶反應(yīng)特性的結(jié)果表明，它們具有與野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶相同的反應(yīng)特性(如最適溫度和pH)以及物理性質(zhì)(如分子量)。不過，測定各種突變酶比活性的結(jié)果提示，各種突變酶對CPC的比活性隨著誘變的穩(wěn)步增加而逐漸提高(表2)。在這些連續(xù)的誘變中，F(xiàn)169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的比活性比野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶高約11.2倍。
<表2>
根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中描述的相同方法進(jìn)行酶促反應(yīng)后，通過Lineweaver-Burk作圖法確定F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變酶的動力參數(shù)。結(jié)果其Km、Kcat和催化效率(即Kcat/Km)分別為8mM、2.4/秒和0.30/秒/mM。F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV五重突變體與野生型酶相比，其Km值低約6.3倍、對CPC的反應(yīng)效率高約15倍。這些結(jié)果證實(shí)，根據(jù)CAD三級結(jié)構(gòu)信息，通過一系列定點(diǎn)誘變得到的本發(fā)明CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體對CPC的結(jié)合親和力和比活性均有所增高。
<2-4>純化對CPC反應(yīng)性增加的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體并分析其反應(yīng)特征根據(jù)實(shí)施例<2-1>中描述的相同方法，從質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組E.coli中純化各六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其轉(zhuǎn)化質(zhì)粒含有實(shí)施例<1-3>中編碼V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重突變體的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因(TnS5αβ)，或?qū)嵤├?amp;lt;1-4-4>中編碼V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突變體的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因(S12)。
分析純化突變酶TnS5αβ和S12反應(yīng)特性的結(jié)果表明，它們具有與野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶相同的反應(yīng)特性(如，比活性、最適溫度、最適pH)以及物理性質(zhì)(如分子量)。
為了測定各種CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體對CPC的比活性和7-ACA的終產(chǎn)物抑制作用，根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中描述的相同方法進(jìn)行酶促反應(yīng)，只是將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)為8.5。結(jié)果TnS5αβ和S12突變酶對CPC的比活性分別為1.5單位/mg蛋白質(zhì)和5.8單位/mg蛋白質(zhì)，相當(dāng)于比野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶高2.3和8.5倍。另外，測定S12突變酶的7-ACA抑制常數(shù)(Ki)的結(jié)果表明，野生型酶的Ki值為0.4mM，S12突變酶的Ki值為1.9mM，提示S12突變酶的7-ACA終產(chǎn)物抑制作用比野生型酶大為減弱。這些結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的S12突變酶(V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重突變體)對CPC的比活性增強(qiáng)，而其7-ACA終產(chǎn)物抑制作用減弱。
實(shí)施例3E.coli中CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的產(chǎn)生<3-1>使用pBC KS(+)載體產(chǎn)生CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體將V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體編碼基因TnS5和TnS5αβ，以及V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體編碼基因S12，插入pBC KS(+)載體中，以分別獲得pBC-TnS5、pBC-TnS5αβ和pBC-S12重組質(zhì)粒，再用各種生成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliMC1061。
將每一種E.coli MC1061轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在50ml含有25μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，25℃、200rpm下劇烈振蕩48小時，并根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中描述的相同方法，使用從培養(yǎng)溶液中制備的粗酶溶液測定CPC酰基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)率。此處，使用重組質(zhì)粒pBSEM和pBCPC為對照，它們分別含有野生型酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因acyII和sem。結(jié)果含有pBC-S12質(zhì)粒的E.coli轉(zhuǎn)化體顯示出最高的CPC?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)率，為712單位/l的水平。
<表3>
<3-2>使用pET29-a(+)載體產(chǎn)生CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體<3-2-1>制備pET29-TnS5αβ和pET29-S12質(zhì)粒分別使用pET29-F引物(SEQ ID NO40)和pET29-R引物(SEQ IDNO41)，將重組質(zhì)粒pBC-TnS5αβ和pBC-S12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各獲得2.5kb的PCR產(chǎn)物。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)XbaI/XhoI消化，并通過純化試劑盒(QIAEX II Gel Extraction Kit；Qiagen，Germany)純化，以獲得插入DNA。此外，pET29-a(+)載體DNA(Novagen，USA)經(jīng)XbaI/XhoI消化并用CIP去磷酸化，從而獲得載體DNA。插入DNA和載體DNA通過T4 DNA連接酶(Roche，Germany)在16℃下反應(yīng)16小時連接起來，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli MC1061株。將該E.coli株涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜以選擇含有突變基因的轉(zhuǎn)化體。從所選的轉(zhuǎn)化體中純化質(zhì)粒，并分析插入DNA的核苷酸序列，獲得pET29-TnS5αβ和pET29-S12質(zhì)粒。
<3-2-2>利用含有pET29-TnS5αβ或pET29-S12質(zhì)粒的E.coli轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體通過電穿孔法將pET29-TnS5αβ和pET29-S12質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，分別制備含有pET29-TnS5αβ和pET29-S12質(zhì)粒的重組E.coli，測量每一重組E.coli中六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的產(chǎn)率。這些重組質(zhì)粒中的TnS5αβ和S12 CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因在T7啟動子的作用下轉(zhuǎn)錄，后者則由存在于pET29-a(+)載體中的LacI操縱子所控制。
將含有pET-TnS5αβ質(zhì)粒的重組E.coli接種含有20μg/ml卡那霉素的3ml LB培養(yǎng)基中，并在30℃、200rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)1 6小時。將50μl該培養(yǎng)物溶液轉(zhuǎn)移到50ml含20μg/ml卡那霉素并各含0、0.02、0.2及2％乳糖的新LB培養(yǎng)基上，并在25℃、200rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)80小時。此時，為了根據(jù)培養(yǎng)的時間進(jìn)程測定CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的產(chǎn)率，分別在培養(yǎng)的24、36、48、72和80小時從培養(yǎng)燒瓶中取出5μl培養(yǎng)基。每一培養(yǎng)溶液均在4℃、8,000rpm下離心10分鐘分離沉淀物，并用0.1M的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)將沉淀物洗滌兩次。將沉淀物懸浮于500μl的相同緩沖溶液中后，用超聲波在4℃降解1分鐘，并在4℃、15,000rpm下離心20分鐘分離上清液，該上清液可作為六重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶粗酶溶液使用。根據(jù)實(shí)施例<1-1-2>中描述的相同方法，使用所述粗酶溶液測定六重CPC酰基轉(zhuǎn)移酶對CPC的活性。
由于通常用于在pET29載體及E.coli BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)外源基因高表達(dá)的IPTG太過昂貴，難以將其應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)。因此，本發(fā)明采用一種低價誘導(dǎo)物——乳糖(DIFCO，USA)，以代替IPTG大規(guī)模生產(chǎn)CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。此外，本領(lǐng)域中眾所周知，通過在培養(yǎng)的早期階段不加誘導(dǎo)物培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體一定時間以使其增殖，再于某一固定點(diǎn)加入誘導(dǎo)物以進(jìn)一步培養(yǎng)，可使pET29載體及E.coli BL21(DE3)的表達(dá)系統(tǒng)在短時期內(nèi)高度表達(dá)外源基因。不過，由于已知用上述誘導(dǎo)性表達(dá)方法生產(chǎn)CPC?；D(zhuǎn)移酶時，會產(chǎn)生大量的無活性多肽副產(chǎn)物，本發(fā)明培養(yǎng)E.coli轉(zhuǎn)化體時，在早期培養(yǎng)階段加入乳糖以誘導(dǎo)組成性表達(dá)。根據(jù)培養(yǎng)的時間過程，結(jié)果在使用2％乳糖培養(yǎng)時，在乳糖的誘導(dǎo)物作用下CPC?；D(zhuǎn)移酶的產(chǎn)率有所提高(表4)。
此外，從培養(yǎng)48小時的含有3種不同濃度乳糖(0.02、0.2及2％)的培養(yǎng)液中制備各種粗酶溶液，并將其進(jìn)行SDS-PAGE(12％SDS聚丙烯酰胺凝膠)，以測定某一蛋白質(zhì)的表達(dá)模式。結(jié)果在用2％乳糖培養(yǎng)時，產(chǎn)生了大量的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體(圖12)。此外，不存在對應(yīng)于分子量約83kDa的無活性前體條帶，從而證實(shí)，大部分無活性前體形式都經(jīng)過有效的自消化轉(zhuǎn)變?yōu)镃PC酰基轉(zhuǎn)移酶的活性形式。
<表4>
根據(jù)，根據(jù)上述相同的方法測定E.coli BL21(DE3)轉(zhuǎn)化體(含有pET29-S12重組質(zhì)粒)中S12突變體產(chǎn)生CPC酰基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)率，只是主要使用50ml含20μg/ml卡那霉素和2％乳糖的LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并將E.coli轉(zhuǎn)化體在25℃、200rpm下劇烈振蕩培養(yǎng)72小時。結(jié)果顯示V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體(S12)的產(chǎn)率為1,207單位/l。
將經(jīng)過pET29-S12質(zhì)粒(其中含有本發(fā)明的V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC六重CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體基因S12)轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3)轉(zhuǎn)化體命名為E.coli BL21(DE3)/pET-S12，根據(jù)關(guān)于國際承認(rèn)的用于專利目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，將該轉(zhuǎn)化體于2003年7月30日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，Republic ofKorea)，登陸號KCTC 10503BP。
實(shí)施例4使用CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體將CPC一步轉(zhuǎn)化為7-ACA將實(shí)施例<3-2>中分別含有pET29-TnS5αβ和pET29-S12質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)在5l含20μg/ml卡那霉素和2％乳糖的5l LB培養(yǎng)基中，于25℃、200rpm下劇烈振蕩72小時。另外，含有野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶基因的E.coli MC1061(pBCPC)，也被培養(yǎng)在含25μg/ml氯霉素的10l LB培養(yǎng)基中，于25℃、200rpm下劇烈振蕩48小時。隨后，根據(jù)如實(shí)施例<2-1>中描述的相同方法，分別從各培養(yǎng)基中純化野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶、TnS5αβ和S12 CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體。得到的純化蛋白質(zhì)經(jīng)過50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.5)透析，透析所得的滲出液被用于CPC轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
將CPC溶解于50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.5)，使最終濃度為50mM后，將溶解于相同緩沖溶液中的純化酶溶液加入上述得到的CPC溶液中，使最終濃度為5單位/ml，以制備50ml反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物在25℃下攪拌1小時以誘導(dǎo)CPC轉(zhuǎn)化反應(yīng)。此時，為了防止在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中反應(yīng)混合物的pH降低，當(dāng)反應(yīng)混合物的pH降至8.4時，通過pH調(diào)節(jié)器自動將0.2N NaOH溶液注入反應(yīng)混合物內(nèi)以恒定保持反應(yīng)混合物pH為8.5。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的某一固定時間取出100μl反應(yīng)混合物，并立即對其進(jìn)行HPLC分析以定量反應(yīng)混合物中的CPC和7-ACA。在HPLC分析中，使用Symmetry C18柱(Waters，USA)，以20mM醋酸胺緩沖溶液(pH 5.0)和乙腈的混合物(90∶10)為流動相。此外，流動相的流速為0.6ml/分鐘，用50mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.5)適當(dāng)稀釋反應(yīng)混合物，以制備將注入的樣品(20μl)，在UV250nm處測量其吸收度。
結(jié)果顯示，在上述反應(yīng)條件下野生型CPC酰基轉(zhuǎn)移酶的CPC轉(zhuǎn)化率水平為60％，而本發(fā)明TnS5αβ和S12 CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的CPC轉(zhuǎn)化率水平則分別為86％和98％(圖13)。尤其是本發(fā)明S12 CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，能夠有效地將CPC轉(zhuǎn)化為7-ACA，并具有高水平的7-ACA產(chǎn)率(90％或以上)(圖13和14)。
雖然對本發(fā)明的實(shí)施方案已進(jìn)行了描述和說明，但顯然在不背離其精神的前提下，可以對之進(jìn)行多種修飾和改造，本發(fā)明的精神僅為附屬權(quán)利要求的范圍所定。
序列表<110>桑多斯股份公司<120>頭胞菌素C?；D(zhuǎn)移酶突變體及用其制備7-ACA的方法<130>PCA30855/AMI<160>44<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>2325<212>DNA<213>野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶acyII基因<400>1atgaccatgg cggcgaaaac cgatcgtgaa gcgctgcagg cggcgctgcc gccgctgagc 60ggcagcctga gcatcccggg cctgagcgcg ccggtgcgtg tgcagcgtga tggctggggc120atcccgcata tcaaagcgag cggcgaagcg gatgcgtatc gtgcgttggg ctttgtgcat180gcgcaggatc gtctgtttca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg240gaatggctgg gcgcggaagc ggcggaagcg gatatcctgg tgcgtcgtct gggcatggaa300aaagtgtgcc gtcgtgattt tgaagcgctg ggcgcggaag cgaaagatat gctgcgtgcg360tatgtggcgg gcgtgaacgc gtttctggcg agcggcgcgc cgctgccgat cgaatatggc420ctgctgggcg cggaaccgga accgtgggaa ccgtggcata gcatcgcggt gatgcgtcgt480ctgggcctgc tgatgggcag cgtgtggttt aaactgtggc gtatgctggc gctgccggtg540gtgggcgcgg cgaacgcgct gaaactgcgt tatgatgatg gcggccagga tctgctgtgc600atcccgccgg gcgtggaagc ggaacgtctg gaagcggatc tggcggcgct gcgtccggcg660gtggatgcgc tgctgaaagc gatgggcggc gatgcgagcg atgcggcggg cggcggcagc720aacaactggg cggtggcgcc gggccgtacc gcgaccggcc gtccgatcct ggcgggcgat780
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Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu165 170 175Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp180 185 190Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu195 200 205Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu210 215 220Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile245 250 255Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala260 265 270Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val275 280 285Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala290 295 300Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu305 310 315 320Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe Glu325 330 335Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp340 345 350Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly355 360 365Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala370 375 380Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser385 390 395 400
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Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly Glu645 650 655Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ser Ala Gln Phe Pro Ala660 665 670Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly675 680 685Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Glu Ala690 695 700Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp705 710 715 720Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser725 730 735Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val740 745 750Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser755 760 765Gln Glu Leu Val Pro Ala770<210>3<211>2334<212>DNA<213>野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶sem基因<400>3atgaccatgg cggcgaaaac tgatcgtgaa gcgctgcagg cggcgctgcc gccgctgagc 60ggcagcctga gcatcccggg cctgagcgcg ccggtgcgtg tgcagcgtga tggctggggc120atcccgcata tcaaagcgag cggcgaagcg gatgcgtatc gtgcgttggg ctttgtgcat180gcgcaggatc gtctgtttca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg240gaatggctgg gcgcggaagc ggcggaagcg gatatcctgg tgcgtcgtct gggcatggaa300aaagtgtgcc gtcgtgattt tgaagcgctg ggcgcggaag cgaaagatat gctgcgtgcg360
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Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg Leu85 90 95Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala Glu100 105 110Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe Leu115 120 125Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala Glu130 135 140Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg Leu145 150 155 160Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu Ala165 170 175Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp Asp180 185 190Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu Arg195 200 205Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu210 215 220Lys Ala Met Gly Gly225<210>5<211>535<212>PRT<213>CPC酰基轉(zhuǎn)移酶AcyII蛋白的β亞基<400>5Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro1 5 10 15Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr20 25 30
Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr35 40 45Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val50 55 60Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu65 70 75 80Glu Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe85 90 95Glu Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala100 105 110Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala115 120 125Gly Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe130 135 140Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile165 170 175Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu180 185 190Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro195 200 205Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His210 215 220Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Leu Ile Val Thr225 230 235 240Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr245 250 255Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val260 265 270
Ala Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp275 280 285Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu290 295 300Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile305 310 315 320Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr325 330 335Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Gly340 345 350Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val355 360 365Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asn370 375 380Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Glu Ala Leu Ser385 390 395 400Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly405 410 415Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ser Ala Gln Phe Pro420 425 430Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp435 440 445Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Glu450 455 460Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp465 470 475 480Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala485 490 495Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met500 505 510
Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr515 520 525Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala530 535<210>6<211>2325<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變的CPC?；D(zhuǎn)移酶S12基因<400>6atgaccatgg cggcgaaaac tgatcgtgaa gcgctgcagg cggcgctgcc gccgctgagc 60ggcagcctga gcatcccggg cctgagcgcg ccggtgcgtg tgcagcgtga tggctggggc120atcccgcata tcaaagcgag cggcgaagcg gatgcgtatc gtgcgttggg ctttgtgcat180gcgcaggatc gtctgtttca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg240gaatggctgg gcgcggaagc ggcggaagcg gatatcctgg tgcgtcgtct gggcatggaa300aaagtgtgcc gtcgtgattt tgaagcgctg ggcgcggaag cgaaagatat gctgcgtgcg360tatgcggcgg gcgtgaacgc gtttctggcg agcggcgcgc cgctgccgat cgaatatagc420ctgctgggcg cggaaccgga accgtgggaa ccgtggcata gcatcgcggt gatgcgtcgt480ctgggcctgc tgatgggcag cgtgtggttt aaactgtggc gtatgctggc gctgccggtg540gtgggcgcgg cgaacgcgct gaaactgcgt tatgatgatg gcggccagga tctgctgtgc600atcccgccgg gcgtggaagc ggaacgtctg gaagcggatc tggcggcgct gcgtccggcg660gtggatgcgc tgctgaaagc gatgggcggc gatgcgagcg atgcggcggg cggcggcagc720aacaactggg cggtggcgcc gggccgtacc gcgaccggcc gcccgatcct ggcgggcgat780ccgcatcgtg tgtttgaaat cccgggcatg tatgcgcagc atcatctggc gtgcgatcgt840
tttgatatga tcggcctgac cgtgccgggc gtgccgggct ttccgcataa tgcgcataac 900ggcaaagtgg cgtattgcgt gacccatgcg tttatggata cccatgatct gtatctggaa 960cagtttgcgg aagatggccg taccgcgcgt tttggcaacg aatttgaacc ggtggcttgg1020cgtcgtgatc gtatcgcggt gcgtggcggc gcggatcgtg aatttgatat cgtggaaacc1080cgtcatggcc cggtgatcgc gggcgatccg ctggaaggcg cggcgctgac cctgcgtagc1140gtgcagtttg cggaaaccga tctgagcttt gattgcctga cccgtatgcc gggcgcgagc1200accgtggcgc agctgtatga tgcgacccgt ggctggggcc tggttgatca taacctggtg1260gcgggcgatg tggcgggcag catcggccat ctggtgcgtg cgcgtgtgcc gagccgtccg1320cgtgaaaacg gctggctgcc ggtgccgggc tggagcggcg aacatgaatg gcgtggctgg1380attccgcatg aagcgatgcc gcgtgtgatc gatccgccgg gcggcctgat cgtgaccgcg1440aacaaccgtg tggtggcgga tgatcatccg gattatctgt gcaccgattg ccatccgccg1500tatcgtgcgg aacgtatcat ggaacgtctg gtggcgagcc cggcgtttgc ggtggatgat1560gcggcggcga tccatgcgga taccctgagc ccgcatgtgg gcctgctgcg tgcgcgtctg1620gaagctttgg gcatccaggg cagcctgccg gcggaagaac tgcgtcagac cctgatcgcg1680tgggatggcc gtatggatgc gggcagccag gcggcgagcg cgtataacgc gtttcgtcgt1740gcgctgaccc gtctggtgac cgcgcgtagc ggcctggaac aggcgatcgc gcatccgttt1800gcggcggtgc cgccgggcgt gagcccgcag ggccaggtgt ggtgggcggt gccgaccctg1860ctgcgtaacg atgatgcggg catgctgaaa ggctggagct gggatgaagc gctgagcgaa1920gcgctgagcg tggcgaccca gaacctgacc ggccgtggct ggggcgaaga acatcgtccg1980cgttttaccc atccgctgag cgcgcagttt ccggcgtggg cggcgctgct gaacccggtg2040agccgtccga tcggcggcga tggcgatacc gtgctagcga acggcctggt gccgagcgcg2100ggcccggaag cgacttatgg cgcgctgtgc cgttatgtgt ttgatgtggg caactgggat2160aacagccgtt gggtggtgtt tcatggcgcg agcggccatc cggcgagccc gcattatgcg2220
gatcagaacg cgccgtggag cgattgcgcg atggtgccga tgctgtatag ctgggatcgt2280atcgcggcgg aagcggtgac cagccaggaa ctggtgccgg cgtaa2325<210>7<211>229<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶S12蛋白的α亞基<400>7Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro1 5 10 15Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val Arg20 25 30Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly Glu35 40 45Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg Leu50 55 60Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala Glu65 70 75 80Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg Leu85 90 95Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala Glu100 105 110Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Gly Val Asn Ala Phe Leu115 120 125Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Glu130 135 140Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg Leu145 150 155 160
Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu Ala165 170 175Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp Asp180 185 190Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu Arg195 200 205Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu210 215 220Lys Ala Met Gly Gly225<210>8<211>535<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突變的CPC?；D(zhuǎn)移酶S12蛋白的β亞基<400>8Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro1 5 10 15Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr20 25 30Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr35 40 45Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Asn Ala His Asn Gly Lys Val50 55 60Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Thr His Asp Leu Tyr Leu65 70 75 80Glu Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe85 90 95Glu Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala100 105 110
Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala115 120 125Gly Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe130 135 140Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala145 150 155 160Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Val165 170 175Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu180 185 190Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro195 200 205Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His210 215 220Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Leu Ile Val Thr225 230 235 240Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr245 250 255Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val260 265 270Ala Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp275 280 285Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu290 295 300Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile305 310 315 320Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr325 330 335Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Gly340 345 350
Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Gly Val355 360 365Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Ash370 375 380Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Glu Ala Leu Ser385 390 395 400Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr Gly Arg Gly Trp Gly405 410 415Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ser Ala Gln Phe Pro420 425 430Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp435 440 445Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Glu450 455 460Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Cys Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp465 470 475 480Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala485 490 495Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met500 505 510Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr515 520 525Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala530 535<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T3引物
<400>9aattaaccct cactaaaggg a21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7引物<400>10taatacgact cactataggg 20<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13-R引物<400>11ggaaacagct atgaccatg 19<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13-F引物<400>12gtaaaacgac ggccagt 17<210>13<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CPC-F引物
<400>13ataccgctcg aggtcctaga aaaaaccaag gaggtaataa ataatgacca tggcggcg58<210>14<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CPC-R引物<400>14ctagctctag agatcctcat tacgccggca ccagttc 37<210>15<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>αORF-R引物<400>15ttattacctc cttgaattca ctagtcatta gccgcccatc gctttc 46<210>16<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>βORF-F引物<400>16ctagtgaatt caaggaggta ataaataatg agcaacaact gggcgg 46<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HindIII-F引物
<400>17gcgtgcgcgt ctggaagctt tgggcatcca gggc 34<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HindIII-R引物<400>18gccctggatg cccaaagctt ccagacgcgc acgc 34<210>19<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M31βL-R引物<400>19gtcaggccga tcatatcaaa acgatcgcac gccagatgat gctgcgcata aaggcccggg 60atttc 65<210>20<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F58βM-F引物<400>20gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat atggcgcata 60acggc 65<210>21<211>65<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>F58βC-F引物<400>21gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat tgcgcgcata 60acggc 65<210>22<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F58βA-F引物<400>22gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat gcggcgcata 60acggc 65<210>23<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F58βV-F引物<400>23gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat gtggcgcata 60acggc 65<210>24<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F58βL-F引物<400>24
gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat ctggcgcata 60acggc 65<210>25<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F58βN-F引物<400>25gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat aatgcgcata 60acggc 65<210>26<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>H70βS-F引物<400>26ggcgtattgc gtgaccagcg cgtttatgga tatcc 35<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>H70βS-R引物<400>27ggatatccat aaacgcgctg gtcacgcaat acgcc 35<210>28<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>H70βL-F引物<400>28ggcgtattgc gtgaccctgg cgtttatgga tatcc 35<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>H70βL-R引物<400>29ggatatccat aaacgccagg gtcacgcaat acgcc 35<210>30<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F169αY-F引物<400>30gatgggcagc gtgtggtata aactgtggcg tatg 34<210>31<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F169αY-R引物<400>31catacgccac agtttatacc acacgctgcc catc 34
<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>I176βV-F引物<400>32cgtggctggg gcctggttga tcataacctg gtg 33<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>I176βV-R引物<400>33caccaggtta tgatcaacca ggccccagcc acg 33<210>34<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>H70β-F引物<400>34ggcgtattgc gtgacccatg cgtttatgga tatcc 35<210>35<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>H70β-R引物<400>35ggatatccat aaacgcatgg gtcacgcaat acgcc 35<210>36<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G139αS-F引物<400>36cgctgccgat cgaatatagc ctgctgggcg cggaac36<210>37<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G139αS-R引物<400>37gttccgcgcc cagcaggcta tattcgatcg gcagcg36<210>38<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>αCPC-R引物<400>38gctgccgccg cccgccgcat cgctcgcatc gccgcccatc gctttcagc 49<210>39<211>47<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>βCPC-F引物<400>39gcgatgcgag cgatgcggcg ggcggcggca gcaacaactg ggcggtg47<210>40<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pET29-F引物<400>40tcccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg accatggcgg 60cgaaaactg 69<210>41<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pET29-R引物<400>41gtggtgctcg agtcattacg ccggcaccag ttc 33<210>42<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M31β-R引物<400>42gtcaggccga tcatatcaaa acgatcgcac gccagatgat gctgcgcata catgcccggg 60atttc 65
<210>43<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>I75βT-F引物<400>43cgtgacccat gcgtttatgg atacccatga tctgtatctg gaacagtttg 50<210>44<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>I75βT-R引物<400>44caaactgttc cagatacaga tcatgggtat ccataaacgc atgggtcacg 50<210>45<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F169α-F引物<400>45gatgggcagc gtgtggttta aactgtggcg tatg 34<210>46<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>F169α-R引物<400>46catacgccac agtttaaacc acacgctgcc catc 3權(quán)利要求
1.CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體或其功能等效衍生物，其特征在于選自下組中的至少一個氨基酸被另一氨基酸所取代，這些氨基酸包括SEQ ID NO4的CPC?；D(zhuǎn)移酶α-亞基中的Val121α、Gly139α和Phe169α和SEQ IDNO5的CPC?；D(zhuǎn)移酶β-亞基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β。
2.如權(quán)利要求1的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Val121α為丙氨酸所取代；Gly139α為絲氨酸所取代；Phe169α為酪氨酸所取代；Met31β為亮氨酸所取代；Phe58β為丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代；His70β為絲氨酸或亮氨酸所取代；Ile75β為蘇氨酸所取代；Ile176β為纈氨酸所取代；或Ser471β為半胱氨酸所取代。
3.如權(quán)利要求2的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Met31β為亮氨酸所取代，而Phe58β為丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代。
4.如權(quán)利要求3的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其中His70β進(jìn)一步為絲氨酸或亮氨酸所取代。
5.如權(quán)利要求4的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Phe169α進(jìn)一步為酪氨酸所取代。
6.如權(quán)利要求5的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Ile176β進(jìn)一步為纈氨酸所取代。
7.如權(quán)利要求3的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其中Phe169α進(jìn)一步為酪氨酸所取代，而Ile176β進(jìn)一步為纈氨酸所取代。
8.如權(quán)利要求7的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Val121α進(jìn)一步為丙氨酸所取代。
9.如權(quán)利要求7的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其中Gly139α進(jìn)一步為絲氨酸所取代。
10.如權(quán)利要求7的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Val121α進(jìn)一步為丙氨酸所取代，而Gly139α進(jìn)一步為絲氨酸所取代。
11.如權(quán)利要求2的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Val121α為丙氨酸所取代；Gly139α為絲氨酸所取代；Phe58β為丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺所取代；而Ile176β為纈氨酸所取代。
12.如權(quán)利要求11的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其中Phe169α進(jìn)一步為酪氨酸所取代。
13.如權(quán)利要求11的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Ile75β進(jìn)一步為蘇氨酸所取代。
14.如權(quán)利要求11的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體，其中Ser471β進(jìn)一步為半胱氨酸所取代。
15.如權(quán)利要求11的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其中Ile75β進(jìn)一步為蘇氨酸所取代，而Ser471β進(jìn)一步為半胱氨酸所取代。
16.如權(quán)利要求15的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體，其含有SEQ ID NO7的包括CPC?；D(zhuǎn)移酶α-亞基和SEQ ID NO8的CPC?；D(zhuǎn)移酶β-亞基的氨基酸序列。
17.編碼權(quán)利要求1的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體或其功能等效衍生物的基因。
18.如權(quán)利要求17的基因，其具有如SEQ ID NO6描述的核苷酸序列。
19.含有權(quán)利要求17的基因的重組表達(dá)載體。
20.如權(quán)利要求19的重組表達(dá)載體，其是pET29-S12。
21.用權(quán)利要求19的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物。
22.如權(quán)利要求21的微生物，其是E.coli BL21(DE3)(pET29-S12)(登陸號KCTC 10503BP)。
23.制備權(quán)利要求1的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的方法，其包括在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)權(quán)利要求21的微生物，并從液體培養(yǎng)基中回收CPC?；D(zhuǎn)移酶的步驟。
24.如權(quán)利要求23的方法，其進(jìn)一步包括向液體培養(yǎng)基中加入乳糖作為培養(yǎng)早期階段的誘導(dǎo)物的步驟。
25.含有權(quán)利要求1的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的組合物，其用于一步酶合成法制備7-ACA。
26.制備式II的化合物的方法，其包括將式I的化合物與權(quán)利要求1的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體相接觸的步驟<式I> <式II> 其中，R為乙酸基(-OCOCH3)、羥基(-OH)、氫(-H)或其鹽。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中使用的CPC酰基轉(zhuǎn)移酶包括下列形式權(quán)利要求21的微生物的液體培養(yǎng)基、權(quán)利要求25的組合物、從培養(yǎng)物溶液中純化的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的游離形式或CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的固定化形式。
28.如權(quán)利要求26的方法，其中式I化合物與CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的接觸反應(yīng)在水性溶液中進(jìn)行。
29.如權(quán)利要求26的方法，式I化合物的濃度為1至500mM，而加入CPC酰基轉(zhuǎn)移酶突變體的量為0.1至100U/ml。
30.如權(quán)利要求26的方法，其中式I化合物與CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體的接觸反應(yīng)在pH 7-10、4至40℃下進(jìn)行0.1至24小時。
全文摘要
本發(fā)明的CPC?；D(zhuǎn)移酶突變體對CPC的反應(yīng)性和比活性均有提高，其能夠有效用于由CPC經(jīng)一步酶法直接制備7－ACA。
文檔編號C12N9/14GK1836044SQ200480023205
公開日2006年9月20日 申請日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月11日
發(fā)明者Y·C·辛, J·Yj·曾, K·H·容, M·R·帕克, Y·金 申請人:桑多斯股份公司