專利名稱：含有莫納甜的飲料組合物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有莫納甜(monatin)的新型飲料組合物以及制造這種組合物的方法。本發(fā)明還涉及含有莫納甜的特定立體異構(gòu)體、莫納甜立體異構(gòu)體的特定混合物和/或含有通過(guò)生物合成途徑在體內(nèi)(例如細(xì)胞內(nèi))或體外生產(chǎn)的莫納甜的飲料組合物。
背景技術(shù)：
由于對(duì)兒童肥胖、II型糖尿病和相關(guān)疾病產(chǎn)生的健康顧慮，無(wú)熱量高強(qiáng)度甜味劑的使用正在增加。因此，需要有甜度明顯高于砂糖(蔗糖)等常規(guī)甜味劑的甜味劑。許多高強(qiáng)度甜味劑有令人不愉快的異味和/或意外的低于期望值的甜度表現(xiàn)。為克服這些問(wèn)題，工業(yè)上在繼續(xù)研究苦味抑制劑、掩味技術(shù)和甜味劑混合物，以期獲得類似于蔗糖的甜度表現(xiàn)。
莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸)是一種天然存在的高強(qiáng)度甜味劑，它分離自在南非德蘭士瓦地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種植物Sclerochiton ilicifolius。在相等甜度下，與蔗糖或其它營(yíng)養(yǎng)甜味劑不同，莫納甜不含碳水化合物或蔗糖且?guī)缀醪缓防铩?br> 概述本發(fā)明涉及一種飲料組合物，該組合物含有莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸—也稱為4-氨基-2-羥基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者采用另一種編號(hào)系統(tǒng)，叫做4-羥基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸)，該化合物具有下式
莫納甜是一種天然存在的高強(qiáng)度甜味劑。莫納甜有四種立體異構(gòu)形式2R，4R(“R，R立體異構(gòu)體”或“R，R莫納甜”)；2S，4S(“S，S立體異構(gòu)體”或“S，S莫納甜”)；2R，4S(“R，S立體異構(gòu)體”或“R，S莫納甜”)以及2S，4R(“S，R立體異構(gòu)體”或“S，R莫納甜”)。本文中，除非另有說(shuō)明，“莫納甜”是指莫納甜的所有四種立體異構(gòu)體，以及莫納甜立體異構(gòu)體任意組合的任何混合物(例如莫納甜的R，R和S，S立體異構(gòu)體的混合物)。
莫納甜具有極好的甜度特性。莫納甜的甜度曲線與已知高強(qiáng)度甜味劑一樣清楚或更加清楚。莫納甜的劑量反應(yīng)曲線更加呈線性，因此相比糖精等其它高強(qiáng)度甜味劑更類似于蔗糖。莫納甜出色的甜度特性使莫納甜可理想地用于桌面甜味劑、食品、飲料和其它產(chǎn)品。
莫納甜的不同立體異構(gòu)體，其中包括R，R和S，S立體異構(gòu)體，有可能用于甜味劑工業(yè)，無(wú)論是作為單獨(dú)的成分或在混合物中。莫納甜單獨(dú)或與碳水化合物混合時(shí)具有優(yōu)良的味道特性。相比其它高強(qiáng)度甜味劑，莫納甜以及莫納甜的立體異構(gòu)體與其它甜味劑如碳水化合物的混合物被認(rèn)為具有優(yōu)良的味道特性和/或物理性質(zhì)。例如，莫納甜比阿斯巴特(也稱為“APM”)穩(wěn)定，相比糖精有更加清楚的味道，并且一種立體異構(gòu)體(R，R莫納甜)比三氯蔗糖更甜。同時(shí)，莫納甜甜味劑不會(huì)有糖精那樣苦的后味，或者像其它高強(qiáng)度甜味劑那樣有金屬味道、酸味、澀味或使用之后感覺(jué)喉嚨發(fā)干。此外，莫納甜甜味劑不具有某些天然甜味劑(如甜菊糖和甘草甜素)那種甘草后味。
此外，不同于阿斯巴特甜味劑，莫納甜甜味劑不需要告誡苯并酮尿癥患者注意苯丙氨酸。同時(shí)，預(yù)計(jì)莫納甜不會(huì)致齲齒(即不引起蛀牙)，因?yàn)樗缓砂l(fā)酵的碳水化合物。也預(yù)計(jì)莫納甜與唾液混合時(shí)不會(huì)使pH降低到～5.7(可傷害牙齒的pH)，如pH降低測(cè)試中所測(cè)定。由于其強(qiáng)烈甜味，R，R立體異構(gòu)體相比其它高強(qiáng)度甜味劑更具有商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供含有莫納甜或其鹽，如R，R、S，S、R，S或S，R莫納甜或不同立體異構(gòu)體的混合物的飲料組合物。本文所用的“飲料組合物”指直接可飲用組合物(即不需稀釋或“即飲型”)或可被稀釋或與液體混合形成可飲用飲料的濃縮液。例如，飲料組合物可以是，可與例如水或牛奶混合形成可飲用飲料的無(wú)水飲料混合物(如巧克力飲料混合物、水果飲料混合物、加麥芽飲料或檸檬水飲料)。作為另一例子，飲料組合物可以是可用，例如碳酸水稀釋形成碳酸軟飲料的飲料糖漿。作為另一例子，可用水/冰和一種或多種其它成分(如龍舌蘭酒)稀釋飲料糖漿或混合物，形成酒精飲料(如瑪格麗塔酒)?？捎帽疚乃龅哪{甜替代其它常見(jiàn)的大散裝(bulk)甜味劑，而在味道上沒(méi)有明顯不同。含有莫納甜的碳酸飲料比用阿斯巴特增甜的可樂(lè)型碳酸軟飲料的甜味特性有所提高。在酸性軟飲料條件下莫納甜比阿斯巴特更穩(wěn)定，預(yù)計(jì)莫納甜具有較長(zhǎng)的保存期限。本文所用術(shù)語(yǔ)“碳酸”指含有溶解的和分散的二氧化碳的飲料。
在一些實(shí)施方式中，飲料組合物包括莫納甜和甜味劑(如蔗糖或高果糖玉米糖漿)的混合物。在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物包括調(diào)味品、咖啡因和/或散裝甜味劑。散裝甜味劑可以是，例如蔗糖甜味劑、無(wú)蔗糖甜味劑和低升糖指數(shù)碳水化合物(即升糖指數(shù)低于葡萄糖的碳水化合物)。在其它實(shí)施方式中，含莫納甜的飲料組合物包括高強(qiáng)度甜味劑和/或低升糖指數(shù)碳水化合物。在其它實(shí)施方式中，含莫納甜的飲料組合物包括甜味增強(qiáng)劑。
在一些實(shí)施方式中，飲料組合物含有基本上由S，S或R，R莫納甜組成的莫納甜。其它實(shí)施方式中，該組合物主要含有S，S或R，R莫納甜?！爸饕笔侵附M合物中存在的莫納甜的立體異構(gòu)體，該莫納甜所含的一種特定立體異構(gòu)體的比例超過(guò)90％。一些實(shí)施方式中，該組合物基本上不含S，S或R，R莫納甜。“基本上不含”是指組合物中存在莫納甜的立體異構(gòu)體，其中該組合物所含的一種特定立體異構(gòu)體的比例低于2％。此外，或另選的，當(dāng)用來(lái)描述用生物合成途徑制造的莫納甜時(shí)，“基本上不含”包含在生物合成途徑中作為副產(chǎn)物制造的一定量的立體異構(gòu)體(例如，S，S莫納甜)，所述生物合成途徑涉及采用手性特異性酶(例如D-氨基酸脫氫酶或D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶)和/或手性特異性底物(例如具有一個(gè)R立體構(gòu)型的碳原子)以制造不同的特定立體異構(gòu)體(例如，R，R莫納甜)。
在本發(fā)明的另一方面，飲料組合物包括在生物合成途徑中產(chǎn)生的富含莫納甜立體異構(gòu)體的混合物?！案缓Ⅲw異構(gòu)體的莫納甜混合物”是指該混合物含有一種以上莫納甜立體異構(gòu)體，且混合物中至少60％的莫納甜立體異構(gòu)體為一種特定的立體異構(gòu)體，如R，R、S，S、S，R或R，S。其它實(shí)施方式中，該混合物中一種特定的莫納甜立體異構(gòu)體的含量超過(guò)65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。另一實(shí)施方式中，飲料組合物是富含R，R或S，S莫納甜的混合物?！案缓Ⅲw異構(gòu)體的”R，R莫納甜是指含有至少60％R，R莫納甜的莫納甜混合物?！案缓Ⅲw異構(gòu)體的”S，S莫納甜是指含有至少60％S，S莫納甜的莫納甜混合物。其它實(shí)施方式中，“富含立體異構(gòu)體的”莫納甜含有超過(guò)65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的R，R或S，S莫納甜。
可從植物Sclerochiton ilicifolius的根皮中分離莫納甜。例如，可磨碎該皮，用水抽提，過(guò)濾并凍干，獲得茶褐色無(wú)定形團(tuán)塊。可將該團(tuán)塊再溶于水，與酸形式的陽(yáng)離子樹(shù)脂，如“Biorad”AG50W×8的HCl形式(Bio-Rad LaboratorieS，Richmond，CA)發(fā)生反應(yīng)?？捎盟礈煸摌?shù)脂，用氨水溶液洗脫結(jié)合于樹(shù)脂的化合物?？蓛龈上疵撐?，并進(jìn)行水性凝膠過(guò)濾，參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,128,164?；蛘撸赏ㄟ^(guò)化學(xué)方法合成莫納甜。參見(jiàn)例如，Holzapfel和OlivieR，Synth。Commun。232511(1993)；Holzapfel等，Synth.Commun.387025(1994)；美國(guó)專利號(hào)5,128,164；美國(guó)專利號(hào)4,975,298；和美國(guó)專利號(hào)5,994,559中的方法。也可用重組方法生產(chǎn)莫納甜。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了制造含有莫納甜的飲料組合物的方法。該方法包括在體內(nèi)和體外用生物合成方法生產(chǎn)莫納甜。“生物合成途徑”包括至少一個(gè)生物轉(zhuǎn)化步驟。在一些實(shí)施方式中，生物合成途徑是多步驟方法，至少一步是生物轉(zhuǎn)化步驟。在其他實(shí)施方式中，生物合成途徑是包括生物和化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟的多步驟方法。在一些實(shí)施方式中，所產(chǎn)生的莫納甜是富含立體異構(gòu)體的混合物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含有用生物合成方法生產(chǎn)的莫納甜的飲料組合物。雖然可以用化學(xué)方法合成莫納甜，但是在飲料應(yīng)用中用生物合成方法生產(chǎn)的莫納甜比化學(xué)合成的莫納甜具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榛瘜W(xué)合成的莫納甜可包括不良污染物。
在本發(fā)明的另一方面，存在一些從選自以下的底物制造莫納甜的生物合成途徑葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、以及吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(也稱為“莫納甜前體”、“MP”或莫納甜的α-酮式)。用來(lái)制造或產(chǎn)生莫納甜或其中間體的生物合成途徑的例子示于

圖1-3和11-13，這些圖以框顯示了可能的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物。例如，在這些途徑中發(fā)生一種產(chǎn)物到另一種產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到莫納甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。
這些轉(zhuǎn)化可用化學(xué)方法或生物學(xué)方法促進(jìn)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指在將第一種中間體轉(zhuǎn)化成第2種中間體的反應(yīng)中使用化學(xué)方法或多肽。術(shù)語(yǔ)“化學(xué)轉(zhuǎn)化”指不由多肽活性促進(jìn)的反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“生物轉(zhuǎn)化”指由多肽活性促進(jìn)的反應(yīng)。轉(zhuǎn)化可體內(nèi)或體外發(fā)生。當(dāng)使用生物轉(zhuǎn)化時(shí)，多肽和/或細(xì)胞能固定于支持物如化學(xué)附著于聚合物支持物上。轉(zhuǎn)化可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何反應(yīng)器完成，例如在分批或連續(xù)反應(yīng)器中。
用來(lái)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的多肽及其編碼序列的實(shí)例示于圖1-3和11-13。具有一個(gè)或多個(gè)改變多肽的底物特異性和/或活性的點(diǎn)突變的多肽可用來(lái)制造莫納甜。表達(dá)這種多肽的分離和重組細(xì)胞可用來(lái)制造莫納甜。這些細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，如植物、動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、藻類、古菌或真菌細(xì)胞。
例如，制造莫納甜的細(xì)胞可具有一種或多種(如兩種或多種、或者三種或多種)以下活性色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)、多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無(wú)EC號(hào)，Hadar等，J.Bacteriol 1251096-1104，1976和Furuya等，Biosci Biotechnol Biochem641486-93，2000)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國(guó)際維生素B6和羰基催化討論會(huì)會(huì)議錄》(Proceedings of 8thInternational Symposium on維生素B6和Carbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，如4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。
在另一個(gè)例子中，細(xì)胞包括一種或多種(例如2種或多種或者3種或多種)下列活性吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)，R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)，3-(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)，乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)，合酶/裂解酶(4.1.3.-)，例如4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)，合酶/裂解酶(4.1.2.-)，色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.5)，色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)，谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)，多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)，D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，D-氨基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)，和/或D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，細(xì)胞可包括一種或多種(例如2種或多種或者3種或多種)下列活性色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)，酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.5)，色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)，谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2，1.4.1.3，1.4.1.4)，苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)，色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)，多底物轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.-)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.1)，L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)，色氨酸氧化酶，D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)，D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)，D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.21)，吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)，R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)，3-(4)-羥基苯丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)，乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27，1.1.1.28，1.1.2.3)，(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)，乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)，合酶/裂解酶(EC 4.1.3.-)，如4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC 4.1.3.16)或4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)，和/或合酶/裂解酶(4.1.2.-)。
進(jìn)一步的例子是，細(xì)胞可包含一種或多種以下醛縮酶活性KHG醛縮酶、ProA醛縮酶、KDPG醛縮酶和/或相關(guān)多肽(KDPH)、轉(zhuǎn)羧基苯丙酮酸水合酶-醛縮酶、4-(2-羧苯基)-2-氧丁-3-烯醇鹽醛縮酶、反式-O-羥基苯亞甲基丙酮酸水合酶-醛縮酶、3-羥基天冬氨酸醛縮酶、苯偶姻醛縮酶、二氫新蝶呤醛縮酶、L-蘇-3-苯基絲氨酸苯甲醛-裂解酶(苯基絲氨酸醛縮酶)、4-羥基-2-氧戊酸醛縮酶、1、2-二羥基芐基丙酮酸醛縮酶、和/或2-羥基苯丙酮酸醛縮酶。
能生成莫納甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨酸和/或吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸；本領(lǐng)域技術(shù)人員理解選擇用于此步驟的多肽理想地表現(xiàn)出適當(dāng)特異性)，所得吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽，其中第2種多肽將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接觸第3種多肽，其中第3種多肽將MP轉(zhuǎn)化成莫納甜。能用于這些轉(zhuǎn)化的示范多肽示于圖2和3。
通過(guò)一步或多步生物轉(zhuǎn)化利用生物合成途徑制造莫納甜有一些優(yōu)點(diǎn)。例如，通過(guò)在該生物合成途徑中使用特定的多肽和/或某些底物能夠制得富含某種立體異構(gòu)體的混合物，和/或制得基本上不含一種或多種立體異構(gòu)體的莫納甜混合物。
用莫納甜合成法產(chǎn)生的莫納甜組合物中可能含有一些雜質(zhì)。僅用合成方法(即不包括至少一步生物轉(zhuǎn)化)制得的莫納甜組合物中所含的雜質(zhì)不同于通過(guò)生物合成途徑制得的莫納甜組合物。例如，基于所用原料，僅用合成法制得的莫納甜組合物可含有石油化學(xué)的、有毒的和/或?qū)θ祟愊M(fèi)不利的其它危險(xiǎn)污染物。這種污染物的例子包括危險(xiǎn)化學(xué)品，如LDA、氫-Pd/C、重氮甲烷、KCN、格氏試劑和Na/Hg。另一方面，希望通過(guò)生物合成途徑制造的莫納甜組合物可含有可食用或可飲用的雜質(zhì)，但不含石油化學(xué)的、有毒的和/或其它有害物質(zhì)。
希望在通過(guò)一個(gè)或多個(gè)生物轉(zhuǎn)化的生物合成途徑中制造莫納甜的方法相比單純的合成方法能夠產(chǎn)生較少的有毒或有害污染物，和/或可提供較高百分比的特定立體異構(gòu)體。例如，希望當(dāng)用D-氨基酸脫氫酶、D-丙氨酸(天冬氨酸)轉(zhuǎn)氨酶、D-芳基轉(zhuǎn)氨酶或D-甲硫氨酸轉(zhuǎn)氨酶制造莫納甜時(shí)，可以獲得至少60％的R，R莫納甜和少于40％的S，S、S，R和/或R，S莫納甜。例如，當(dāng)用上述D-酶類以及至少一種具有R-立體構(gòu)型的碳原子的底物(例如莫納甜前體)制造莫納甜時(shí)還希望獲得至少95％的R，R莫納甜和少于5％的S，S、S，R和/或R，S莫納甜。相反，當(dāng)僅通過(guò)合成法制造莫納甜時(shí)，我們只獲得約25％-50％所需立體異構(gòu)體。
一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)生物合成途徑制造莫納甜的方法，例如包括一步或多步生物轉(zhuǎn)化，不產(chǎn)生石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物?！笆突瘜W(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物”是指任何石油化學(xué)的、有毒的、有害的和/或?qū)θ祟愊M(fèi)者不利的物質(zhì)，包括原料帶來(lái)的污染物或在僅用合成法制造莫納甜時(shí)產(chǎn)生的污染物。另一實(shí)施方式中，通過(guò)生物合成途徑制造莫納甜的方法，例如包括一步或多步生物轉(zhuǎn)化，僅產(chǎn)生可食用或可飲用的物質(zhì)?！翱墒秤没蚩娠嬘玫奈镔|(zhì)”是指適合人類食用或飲用或?qū)θ祟愊M(fèi)者安全的一種或多種化合物或物質(zhì)?？墒秤没蚩娠嬘玫奈镔|(zhì)的例子包括莫納甜、色氨酸、丙酮酸、谷氨酸、其它氨基酸以及人體內(nèi)天然存在的其它化合物或物質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，甜度相當(dāng)時(shí)，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物比相同量的用蔗糖或高果糖玉米糖漿替換莫納甜或其鹽的飲料組合物所含熱量和碳水化合物少?！疤鸲认喈?dāng)”或“相當(dāng)?shù)奶鸲取敝赣薪?jīng)驗(yàn)的感覺(jué)鑒定者平均測(cè)定出，第一種組合物中呈現(xiàn)的甜度是第二種組合物中呈現(xiàn)的甜度的80％-120％。
在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物還含有柑橘調(diào)味品，其中，莫納甜或其鹽以能夠增強(qiáng)柑橘調(diào)味品所提供的味道的量存在。在另一實(shí)施方式中，飲料組合物還含有柑橘調(diào)味品和碳水化合物，其中莫納甜或其鹽和碳水化合物的存在量能夠增強(qiáng)柑橘調(diào)味品所提供的味道。碳水化合物可選自但不限于赤蘚醇、麥芽糊精、蔗糖及其組合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，碳酸飲料含有糖漿組合物，含量范圍約為該碳酸飲料重量的15％-25％，其中該糖漿組合物含有莫納甜或其鹽。
在另一實(shí)施方式中，飲料組合物約含3-10000ppm的莫納甜或其鹽。在其它實(shí)施方式中，該飲料組合物約含3-小于30ppm的莫納甜，或約含大于2500-10000ppm的莫納甜。在另一實(shí)施方式中，飲料組合物是糖漿或無(wú)水飲料混合物，其中該組合物約含10-10000ppm的莫納甜或其鹽。例如，該飲料組合物可以是適于約以1份糖漿3份飲料至1份糖漿5.5份飲料稀釋于飲料的濃縮液糖漿。在一個(gè)實(shí)施方式中，該糖漿約含有18-300ppm的R，R莫納甜或其鹽。或者，該糖漿約含有0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含有0-300ppm的R，R莫納甜或其鹽。
在另一實(shí)施方式中，飲料組合物是約含10-10000ppm莫納甜或其鹽的無(wú)水飲料混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，無(wú)水飲料混合物約含600-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽。在另一實(shí)施方式中，該無(wú)水飲料混合物約含10-450ppm的R，R莫納甜或其鹽?；蛘撸摕o(wú)水飲料混合物約含0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含有0-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
在其它實(shí)施方式中，飲料組合物是約含3-10000ppm莫納甜或其鹽，該組合物基本不含R，R莫納甜或其鹽，或基本不含S，S莫納甜或其鹽。在另一實(shí)施方式中，該飲料組合物約含3-450ppm的R，R莫納甜或其鹽(如約含6-225ppm的R，R莫納甜或其鹽)。在另一實(shí)施方式中，飲料組合物約含3-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽(如約含60-4600ppm的S，S莫納甜或其鹽)。在另一實(shí)施方式中，飲料組合物約含0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含有0-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，飲料組合物是約含3-2000ppm莫納甜或其鹽的即飲型組合物。在另一實(shí)施方式中，該即飲型組合物約含5-50ppm的R，R莫納甜或其鹽，或約含60-2000ppmS，S莫納甜或其鹽。
在另一實(shí)施方式中，飲料組合物約含450或以下ppm的R，R莫納甜或其鹽，并基本不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽?；蛘撸嬃辖M合物約含10000或以下ppm的S，S莫納甜或其鹽，并基本不含R，R、S，R或R，S莫納甜或其鹽。在一些實(shí)施方式中，飲料組合物中的莫納甜或其鹽主要由R，R莫納甜或其鹽組成，或主要由S，S莫納甜或其鹽組成。在其它實(shí)施方式中，飲料組合物中的莫納甜或其鹽是富含R，R立體異構(gòu)體的莫納甜或其鹽，或者是富含S，S立體異構(gòu)體的莫納甜或其鹽。在其它實(shí)施方式中，飲料組合物中的莫納甜或其鹽至少含有95％R，R莫納甜或其鹽，或至少含有95％S，S莫納甜或其鹽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該飲料組合物含有由生物合成途徑生產(chǎn)的莫納甜或其鹽。在另一實(shí)施方式中，飲料組合物含有富含立體異構(gòu)體的莫納甜混合物，其中莫納甜混合物是通過(guò)生物合成途徑生產(chǎn)的。在一個(gè)實(shí)施方式中，該生物合成途徑是多步驟途徑，多步驟途徑中至少一步是化學(xué)轉(zhuǎn)化。在其它實(shí)施方式中，通過(guò)生物合成途徑生產(chǎn)的莫納甜混合物主要是R，R莫納甜或其鹽，或主要是S，S莫納甜或其鹽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，飲料組合物含有由生物合成途徑生產(chǎn)的莫納甜組合物，其中莫納甜組合物不含石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物。在另一實(shí)施方式中，飲料組合物含有莫納甜或其鹽，其中莫納甜混合物由生物合成途徑生產(chǎn)，從重組細(xì)胞中分離，其中重組細(xì)胞不含石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物是不致齲齒的。在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物還含有赤蘚醇、海藻糖、環(huán)磺酸鹽、D-塔格糖或其組合。
在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物還含有散裝甜味劑、高強(qiáng)度甜味劑、低升糖指數(shù)碳水化合物、調(diào)味品、抗氧化劑、咖啡因、甜味增強(qiáng)劑或其組合。例如，調(diào)味品可選自可樂(lè)調(diào)味品、柑橘調(diào)味品及其組合。例如，散裝甜味劑可選自玉米甜味劑、蔗糖、右旋糖、轉(zhuǎn)化糖、麥芽糖、糊精、麥芽糖糊精、果糖、左旋糖、高果糖玉米糖漿、玉米糖漿固體、左旋糖、半乳糖、海藻糖、異麥芽酮糖、果糖-寡糖及其組合。例如，高強(qiáng)度甜味劑可選自三氯蔗糖、阿斯巴特、糖精、安賽蜜K、阿力甜(alitame)、奇異果甜蛋白(thaumatin)、雙氫查耳酮、紐甜(neotame)、環(huán)磺酸鹽、甜菊糖、羅漢果甙(mogroside)、甘草甜素(glycyrrihizin)、葉甜素、莫內(nèi)林、馬檳榔甜蛋白、布那珍(brazzein)、多肽菌素、倍他丁(pentadin)及其組合。例如，低升糖指數(shù)碳水化合物可選自D-塔格糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、乳糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、氫化淀粉水解物、異麥芽糖(isomalt)、D-阿洛酮糖、1，5脫水D-果糖及其組合。例如，甜味增強(qiáng)劑可選自仙茅甜蛋白、非洲奇果蛋白、洋薊酸、綠原酸、咖啡酸、叉柱花素(strogins)、阿拉伯半乳聚糖、麥芽酚、二羥苯甲酸及其組合。
在另一實(shí)施方式中，飲料組合物含有作為R，R莫納甜或其鹽和S，S莫納甜或其鹽的混合物的莫納甜或其鹽。此外，飲料組合物可含有莫納甜或其鹽和非莫納甜甜味劑的混合物。非莫納甜甜味劑可選自例如蔗糖和高果糖玉米糖漿。
在一些實(shí)施方式中，制造含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的方法包括從選自葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫納甜前體的至少一種基材生產(chǎn)莫納甜或其鹽。該方法還可包括將莫納甜或其鹽與至少一種不是莫納甜或其鹽的其它成分(例如赤蘚醇、海藻糖、環(huán)磺酸鹽、D-塔格糖、麥芽糖糊精或其組合)混合。在一些實(shí)施方式中，其它成分可選自例如填充劑、散裝甜味劑、液體甜味劑、低升糖指數(shù)碳水化合物、高強(qiáng)度甜味劑、增稠劑、脂肪、油、乳化劑、抗氧化劑、甜味增強(qiáng)劑、著色劑、調(diào)味劑、咖啡因、酸、粉末、助流動(dòng)劑、緩沖液、蛋白來(lái)源、味道增強(qiáng)劑、味道穩(wěn)定劑及其組合。散裝甜味劑可選自例如糖甜味劑、無(wú)糖甜味劑、低升糖指數(shù)碳水化合物及其組合。在其它實(shí)施方式中，由這種方法制得的飲料組合物約含0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含0-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的制造方法包括用生物合成途徑生產(chǎn)莫納甜或其鹽。在一些實(shí)施方式中，含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的制造方法包括用至少一步生物轉(zhuǎn)化或僅用生物轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)莫納甜或其鹽。在另一實(shí)施方式中，含有莫納甜組合物的飲料組合物的制造方法包括(a)用生物合成途徑在重組細(xì)胞中生產(chǎn)莫納甜或其鹽；(b)從重組細(xì)胞中分離莫納甜組合物，其中莫納甜組合物包含莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用物質(zhì)。
在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜組合物的飲料組合物的制造方法包括用生物合成途徑生產(chǎn)莫納甜組合物，其中莫納甜組合物不含石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物。在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜組合物的飲料組合物的制造方法包括在多步驟途徑中從基材生產(chǎn)莫納甜組合物，多步驟途徑中一個(gè)或多個(gè)步驟是生物轉(zhuǎn)化，其中莫納甜組合物不含石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物。
在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜組合物的飲料組合物的制造方法包括用生物合成途徑生產(chǎn)莫納甜組合物，其中莫納甜組合物包含莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用物質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，含有莫納甜組合物的飲料組合物的制造方法包括在多步驟途徑中從基材生產(chǎn)莫納甜組合物，多步驟途徑中一個(gè)或多個(gè)步驟是生物轉(zhuǎn)化，其中莫納甜組合物包含莫納甜或其鹽以及其它可食用或可飲用物質(zhì)。
除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的涵義與本發(fā)明所涉及技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同。雖然在實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明的過(guò)程中可采用與本文所述內(nèi)容相似或相同的方法和材料，但下面描述了合適的方法和材料。本文提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)都被全文納入作為參考。在沖突情況下，本說(shuō)明書(shū)，包括定義將控制(本發(fā)明范圍)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為示范性，不旨在限制。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)本文內(nèi)容將明白，本發(fā)明的特定實(shí)施方式可指向上述一個(gè)方面或其組合，以及其它方面。通過(guò)以下詳述將明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示用于生成莫納甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑。一種途徑通過(guò)色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一種通過(guò)吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。隨后通過(guò)MP中間體生成莫納甜。
框中所示化合物是底物和生物合成途徑中生成的產(chǎn)物。與箭頭相鄰的組合物是輔因子或可在底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物期間使用的反應(yīng)物。所用輔因子或反應(yīng)物取決于生物合成途徑的特定步驟使用的多肽。輔因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不依賴于多肽的反應(yīng)，因此僅提供PLP可從底物進(jìn)行到產(chǎn)物。
圖2是使用MP中間體的生物合成途徑的更詳細(xì)圖。框中顯示了途徑中各步驟的底物。實(shí)現(xiàn)底物間轉(zhuǎn)化的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過(guò)其常用名稱和酶分類(EC)號(hào)描述。
圖3顯示將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑的更詳細(xì)圖?？蛑酗@示了途徑中各步驟的底物。實(shí)現(xiàn)底物間轉(zhuǎn)化的多肽列于底物間的箭頭附近。各多肽通過(guò)其常用名稱和酶分類(EC)號(hào)描述圖4顯示一種經(jīng)化學(xué)方法產(chǎn)生MP的可能反應(yīng)。
圖5A和5B是色譜圖，顯示酶法生成的莫納甜的LC/MS鑒定。
圖6是酶法合成的莫納甜的電噴射質(zhì)譜。
圖7A和7B是酶混合物中生成的莫納甜的LC/MS/MS子離子分析色譜圖。
圖8是色譜圖，顯示酶法生成莫納甜的高分辨質(zhì)譜測(cè)量。
圖9A-9C是色譜圖，顯示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成莫納甜的手性分離。
圖10是柱狀圖，顯示IPTG誘導(dǎo)后細(xì)菌細(xì)胞中生成的莫納甜的相對(duì)量。(-)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。
圖11-12是示意圖，顯示用于增加莫納甜產(chǎn)量的途徑，莫納甜產(chǎn)生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
圖13是示意圖，顯示能用于增加莫納甜產(chǎn)量的途徑，莫納甜產(chǎn)生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
圖14表示用莫納甜的R，R立體異構(gòu)體獲得的用量反應(yīng)曲線。
圖15表示用莫納甜的R，R/S，S立體異構(gòu)體獲得的用量反應(yīng)曲線。
圖16比較了莫納甜的R，R/S，S立體異構(gòu)體混合物與糖精的用量反應(yīng)曲線。
圖17顯示了用合成法制造的莫納甜標(biāo)準(zhǔn)品的反相色譜。
圖18顯示了莫納甜標(biāo)準(zhǔn)品的手性色譜。
發(fā)明詳述提供下列術(shù)語(yǔ)和方法的解釋以更好地描述本說(shuō)明書(shū)并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。如本文所用，“含有”指“包括”。此外，單數(shù)形式也指復(fù)數(shù)，除非上下文另有明確規(guī)定。術(shù)語(yǔ)“約”包括發(fā)生于任何測(cè)定中的實(shí)驗(yàn)誤差的范圍。除非另有說(shuō)明，認(rèn)為所有的測(cè)定數(shù)字前面都有“約”字，即使沒(méi)有明白地使用“約”字。術(shù)語(yǔ)“％重量/體積”或“％w/v”指每體積的重量百分?jǐn)?shù)，其中100％重量/體積是1g/mL。因此，例如，1g/100mL是1％重量/體積(在液體組合物中)。術(shù)語(yǔ)“ppm”指每百萬(wàn)分之一份。例如，8ppm的莫納甜指一百萬(wàn)克中有80克(g)莫納甜。同樣，1ppm＝0.0001％w/w，或者對(duì)于水溶液而言，＝1mg/L＝1μg/mL＝0.0001％重量/體積。
如圖1-3和11-13所示，許多生物合成途徑能用于生成莫納甜或其中間體(如吲哚-3-丙酮酸或MP)。為將各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)轉(zhuǎn)化成各產(chǎn)物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫納甜)，可使用幾種不同多肽。此外，這些反應(yīng)可在體內(nèi)、體外完成，或通過(guò)體內(nèi)反應(yīng)和體外反應(yīng)的組合，如包括非酶化學(xué)反應(yīng)的體外反應(yīng)。因此，圖1-3和11-13是示范性的，顯示能用于獲得所需產(chǎn)物的多種不同途徑。
葡萄糖到色氨酸許多生物體能從葡萄糖合成色氨酸。可將含從葡萄糖和/或色氨酸生成莫納甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的構(gòu)建物克隆入這種生物體中。本文顯示色氨酸可轉(zhuǎn)化成莫納甜。
在其它例子中，用已知多肽改造生物體以生成色氨酸或超量產(chǎn)生色氨酸。例如，美國(guó)專利號(hào)4,371,614描述用含野生型色氨酸操縱子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株。
美國(guó)專利號(hào)4,371,614所述色氨酸的最大效價(jià)約為230ppm。類似地，WO8701130描述遺傳改造大腸桿菌菌株以生成色氨酸并討論增加L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到能從葡萄糖生成色氨酸的生物體也能利用其它可轉(zhuǎn)化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，結(jié)果類似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纖維素或甘油。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸可用一些多肽將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶種類(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。這些種類包括但不限于稱為色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的多肽(也稱為L(zhǎng)-苯丙氨酸-2-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、5-羥基色氨酸-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、羥基色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、L-色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、L-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶、和L-色氨酸2-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶)，它將L-色氨酸和2-氧戊二酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酰胺；D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，它將D-色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脫氫酶(也稱為NAD(P)-L-色氨酸脫氫酶、L-色氨酸脫氫酶、L-Trp-脫氫酶、TDH和L-色氨酸NAD(P)氧化還原酶(脫氨))，它將L-色氨酸和NAD(P)轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脫氫酶，它使D-氨基酸和FAD轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(也稱為L(zhǎng)-色氨酸-α-酮異己酸轉(zhuǎn)氨酶和L-色氨酸苯基丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶)，它將L-色氨酸和苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也稱為蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸氧氧化還原酶(脫氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成2-含氧酸和NH3以及H2O2；D-氨基酸氧化酶(也稱為蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸氧氧化還原酶(脫氨))，它將D-氨基酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成2-含氧酸和NH3以及H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H2O2。這些種類也含有酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)轉(zhuǎn)氨酶和有多種轉(zhuǎn)氨酶活性的廣(多底物)轉(zhuǎn)氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
轉(zhuǎn)氨酶種類中有這種活性的11個(gè)成員描述于下面的實(shí)施例1，包括SEQ IDNOS11和12所示的新轉(zhuǎn)氨酶。因此，本發(fā)明提供分離的核酸和氨基酸序列，與SEQID NOS11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本發(fā)明也涵蓋SEQ ID NOS11和12的片段和融合體，它們保持轉(zhuǎn)氨酶活性或編碼有轉(zhuǎn)氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000個(gè)SEQ ID NO11的毗連核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350個(gè)SEQ ID NO12的毗連核苷酸。所示序列(和其變體、片段和融合)可以是載體的一部分。載體能用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而生成重組細(xì)胞，重組細(xì)胞可從色氨酸產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能進(jìn)一步生成MP和/或莫納甜。
已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分離自一些不同來(lái)源，如地中海蝰(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、紅口蝮(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、西部菱斑響尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepaica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄桿菌(Caulobactercresentus)、萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假單胞菌(P.Syringae)、和紅球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文獻(xiàn)且能分離自例如鬼傘屬(Coprinus)SF-1、有根腫病的大白菜、擬南芥和哺乳動(dòng)物的肝。能將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的1個(gè)L-氨基酸氧化酶類成員討論于下面的實(shí)施例3以及分子克隆的另外來(lái)源。許多D-氨基酸氧化酶基因在分子克隆的數(shù)據(jù)庫(kù)中是有用的。
已知色氨酸脫氫酶，且可分離自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黃花牧豆樹(shù)(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆樹(shù)、小麥、玉米、番茄、煙草、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)和乳桿菌(Lactobacilli)。已知許多D-氨基酸脫氫酶基因序列。
如圖11-13所示，如果用氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸，能加入過(guò)氧化氫酶以減少或甚至去除過(guò)氧化氫的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的反應(yīng)可通過(guò)多種多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽類的成員。1.1.1.110多肽類包括吲哚乳酸脫氫酶(也稱為吲哚乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3類包括乳酸脫氫酶(也稱為乳酸脫氫酶、乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.1.222類包含(R)-4-羥苯基乳酸脫氫酶(也稱為D-芳族乳酸脫氫酶、R-芳族乳酸脫氫酶和R-3-(4-羥苯基)乳酸NAD(P)+2-氧化還原酶)且1.1.1.237類包含3-(4-羥苯基丙酮酸)還原酶(也稱為羥苯基丙酮酸還原酶和4-羥苯基乳酸NAD+氧化還原酶)。1.1.3.-類包含乳酸氧化酶，1.1.1.111類包含(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(也稱為(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸NAD(P)+氧化還原酶)?？赡苓@些種類中的一些多肽能從吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此轉(zhuǎn)化的例子提供于實(shí)施例2。
化學(xué)反應(yīng)也能用于將吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸。這種化學(xué)反應(yīng)包括能用一些方法完成的氧化步驟，例如使用B2催化劑的空氣氧化(China ChemicalReporter，13卷，28期，18頁(yè)(1)，2002)，金屬催化劑存在時(shí)稀釋高錳酸鹽和高氯酸鹽或過(guò)氧化氫。
吲哚-3-丙酮酸到2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP。示范多肽種類包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。這些種類包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2種羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC 4.1.3.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電體，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作為親電體。
例如，EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也稱為4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶、2-氧-4-羥基戊二酸醛縮酶或KHG醛縮酶)將乙醛酸和丙酮酸轉(zhuǎn)化成4-羥基-2-酮戊二酸，多肽4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17，也稱為4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛縮酶)縮合2種酮酸如2個(gè)丙酮酸到4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用這些裂合酶的反應(yīng)。
圖1-2和11-13顯示這些反應(yīng)的示意圖，其中3-碳(C3)分子結(jié)合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的許多成員特別是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如絲氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇縮合需要此途徑的3個(gè)碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作為C3碳源且可轉(zhuǎn)化成丙酮酸?？赏ㄟ^(guò)許多利用PLP的轉(zhuǎn)氨酶來(lái)轉(zhuǎn)氨以產(chǎn)生丙酮酸，包括許多上述的轉(zhuǎn)氨酶?？赏ㄟ^(guò)β消除反應(yīng)(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)獲得丙酮酸和氨，反應(yīng)用于L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有足夠離去基團(tuán)的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介導(dǎo)的β-裂合酶反應(yīng)中用作丙酮酸的來(lái)源，如色氨酸酶(EC 4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也稱為酪氨酸-酚裂合酶)催化的反應(yīng)。通過(guò)在(4.1.99.1-2)多肽上進(jìn)行定點(diǎn)突變可增加β-裂合酶反應(yīng)速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem 2741320-5，1999)和實(shí)施例8所述。這些修飾使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸鹽也能用作丙酮酸的來(lái)源，且通過(guò)加入乳酸脫氫酶和氧化輔因子或乳酸氧化酶和氧來(lái)氧化成丙酮酸。這些反應(yīng)的例子描述于下。例如，如圖2和圖11-13所示，當(dāng)丙酮酸用作C3分子時(shí)，ProA醛縮酶能接觸吲哚-3-丙酮酸。
MP可用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，如實(shí)施例5提供的醛醇縮合。
MP到莫納甜MP到莫納甜的轉(zhuǎn)化可由下列1個(gè)或多個(gè)催化色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脫氫酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.28)或更多轉(zhuǎn)氨酶家族(2.6.1.-)的一般成員如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)轉(zhuǎn)氨酶(圖2)。轉(zhuǎn)氨酶類的11個(gè)成員描述于下(實(shí)施例1)，包括SEQ ID NOS11和12所示新的種類成員，實(shí)施例7提供證明轉(zhuǎn)氨酶和脫氫酶活性的反應(yīng)。
此反應(yīng)也能用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。酮酸(MP)胺化通過(guò)還原性胺化用氨和氰硼氫化鈉進(jìn)行。
圖11-13顯示另外的多肽，它們能用于使MP轉(zhuǎn)化成莫納甜，以及增加來(lái)自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫納甜產(chǎn)量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供體，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶能用于使天冬氨酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸(圖11)。草酰乙酸通過(guò)脫羧酶(如草酰乙酸脫羧酶)轉(zhuǎn)化成丙酮酸和二氧化碳(圖11)。此外，如果賴氨酸用作氨基供體，賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶可用于使賴氨酸轉(zhuǎn)化成ε-醛基賴氨酸(圖12)。ε-醛基賴氨酸自發(fā)轉(zhuǎn)化成1-哌啶6-羧酸鹽(圖12)。如果能催化還原性胺化反應(yīng)的多肽(如谷氨酸脫氫酶)用于將MP轉(zhuǎn)化成莫納甜，可使用能再循環(huán)NAD(P)H和/或生成揮發(fā)性產(chǎn)物的多肽，如甲酸脫氫酶。
設(shè)計(jì)生物合成途徑中的另外考慮取決于哪種多肽用于產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜，能提供輔因子、底物和/或另外多肽給生產(chǎn)細(xì)胞以提高產(chǎn)物形成。此外，可設(shè)計(jì)遺傳修飾來(lái)提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜等產(chǎn)物的產(chǎn)量。類似的，使用宿主細(xì)胞可使莫納甜生產(chǎn)最優(yōu)化。
去除過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫(H2O2)是一種產(chǎn)物，如果產(chǎn)生，會(huì)對(duì)生產(chǎn)細(xì)胞、多肽或產(chǎn)生的產(chǎn)物(如中間體)有損害。上述L-氨基酸氧化酶產(chǎn)生H2O2作為產(chǎn)物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平減少以降低對(duì)細(xì)胞或產(chǎn)物的潛在損傷。
過(guò)氧化氫酶能用于降低細(xì)胞中的H2O2水平(圖11-13)。生產(chǎn)細(xì)胞可表達(dá)編碼過(guò)氧化氫酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化過(guò)氧化氫降解成水和氧氣。例如，過(guò)氧化氫酶可從轉(zhuǎn)染入生產(chǎn)細(xì)胞的載體中表達(dá)。能使用的過(guò)氧化氫酶例子包括但不限于tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐鹽桿菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天蘭色鏈霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黃單胞菌)(SwissProt登錄號(hào))。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反應(yīng)也能包含過(guò)氧化氫酶多肽。
吡哆醛5’-磷酸(PLP)有效性的調(diào)節(jié)如圖1所示，PLP可用于本文所述1個(gè)或多個(gè)生物合成步驟。能補(bǔ)充PLP濃度，從而PLP不成為對(duì)反應(yīng)總效率的限制。
充分研究大腸桿菌中維生素B6(PLP的前體)的生物合成途徑且已結(jié)晶一些蛋白(Laber等，F(xiàn)EBS Letters，44945-8，1999)。其它代謝途徑中需要2個(gè)基因(epd或gapB和serC)，而3個(gè)基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成獨(dú)有的。大腸桿菌途徑中的起始物質(zhì)之一是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。從共同的2和3碳中心代謝物合成此前體是由多肽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前體是來(lái)自4-碳糖，D-赤蘚糖4-磷酸的蘇氨酸衍生物。轉(zhuǎn)化到磷酸-4-羥基-L蘇氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一個(gè)反應(yīng)是DXP與HTP間的復(fù)雜分子內(nèi)縮合和閉環(huán)反應(yīng)，由pdxA和pdxJ的基因產(chǎn)物催化。
如果PLP成為發(fā)酵生產(chǎn)莫納甜期間的限制營(yíng)養(yǎng)物，可增加1個(gè)或多個(gè)途徑中的基因在生產(chǎn)宿主細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)提高莫納甜產(chǎn)量。宿主生物體可包含多個(gè)其天然途徑基因的拷貝，或非天然途徑基因的拷貝可摻入生物體基因組中。另外，可在宿主生物體內(nèi)克隆入拯救途徑基因的多個(gè)拷貝。
1個(gè)在所有生物體中保守的拯救途徑使多種維生素B6的衍生物再循環(huán)成活性PLP形式。參與此途徑的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。過(guò)量表達(dá)1個(gè)或多個(gè)這些基因可增加PLP可得性。
可通過(guò)去除或阻抑宿主生物體中天然生物合成途徑基因的代謝調(diào)節(jié)提高維生素B6水平。PLP阻抑參與黃桿菌屬(Flavobacterium)菌株238-7中前體蘇氨酸衍生物的生物合成的多肽。此細(xì)菌菌株無(wú)代謝控制，過(guò)度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以類似方式遺傳操作產(chǎn)生莫納甜的宿主生物體可增加PLP生成而不過(guò)度表達(dá)生物合成途徑基因。
銨利用能驅(qū)動(dòng)色氨酸酶反應(yīng)趨向合成方向(從吲哚生成色氨酸)，這是通過(guò)制備更能利用的氨或去除水。還原性胺化反應(yīng)如由谷氨酸氫化酶催化的反應(yīng)，也能通過(guò)銨過(guò)量來(lái)驅(qū)動(dòng)。
氨可作為碳酸或磷酸緩沖系統(tǒng)中的碳酸銨或磷酸銨鹽而得到。氨也能作為丙酮酸銨或甲酸銨提供。另外，如果反應(yīng)偶聯(lián)產(chǎn)生氨的反應(yīng)如谷氨酸脫氫酶或色氨酸脫氫酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能產(chǎn)生氨，底物會(huì)水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通過(guò)酶水解其優(yōu)選底物也能使增加的合成產(chǎn)物的產(chǎn)量超過(guò)正常平衡量。
除去產(chǎn)物和副產(chǎn)物色氨酸經(jīng)色氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影響吲哚-3-丙酮酸的產(chǎn)率，因?yàn)榉磻?yīng)生成谷氨酰胺并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酰胺可引起轉(zhuǎn)氨酶的抑制，反應(yīng)會(huì)消耗大量共底物。此外，高谷氨酸濃度對(duì)下游分離過(guò)程有害。
多肽谷氨酸脫氫酶(GLDH)將谷氨酸轉(zhuǎn)化成2-氧戊二酸，從而在反應(yīng)中再循環(huán)共底物，反應(yīng)由色氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化。GLDH也產(chǎn)生還原性等價(jià)物(NADH或NADPH)，能用于在需氧條件下產(chǎn)生細(xì)胞所用能量(ATP)。通過(guò)GLDH利用谷氨酸也減少副產(chǎn)物形成。另外，反應(yīng)產(chǎn)生氨，它能用作細(xì)胞的氮源或作為圖1所示最后步驟中還原性胺化的底物。因此，過(guò)度表達(dá)GLDH多肽的生產(chǎn)細(xì)胞能用于增加產(chǎn)量和降低培養(yǎng)基和/或分離方法的成本。
在色氨酸到莫納甜的途徑中，如果使用來(lái)自適當(dāng)酶類的轉(zhuǎn)氨酶，步驟3的氨基供體(如谷氨酸或天冬氨酸)可反轉(zhuǎn)化成步驟1所需的氨基受體(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途徑的2種獨(dú)立的轉(zhuǎn)氨酶能提高此途徑的效率，其中1種轉(zhuǎn)氨酶的底物非競(jìng)爭(zhēng)性抑制其它轉(zhuǎn)氨酶的活性。
所述途徑中的許多反應(yīng)是可逆的且因此會(huì)到達(dá)底物和產(chǎn)物間的平衡?？赏ㄟ^(guò)從多肽中連續(xù)取出產(chǎn)物來(lái)增加此途徑的產(chǎn)量。例如，用通透酶或其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使莫納甜分泌入發(fā)酵液或者從生物催化反應(yīng)器流中選擇性結(jié)晶莫納甜并伴隨底物再循環(huán)會(huì)提高反應(yīng)產(chǎn)量。
另一種增加反應(yīng)產(chǎn)量的方法是通過(guò)另外的酶反應(yīng)或氨基供體基團(tuán)的取代來(lái)去除副產(chǎn)物。實(shí)施例13討論了一些例子且示于圖11-13。例如，可產(chǎn)生不能在反方向中反應(yīng)的副產(chǎn)品，這是通過(guò)相變(蒸發(fā))或自發(fā)轉(zhuǎn)化成惰性的終產(chǎn)物如二氧化碳實(shí)現(xiàn)的。
底物庫(kù)的調(diào)節(jié)可通過(guò)增加色氨酸前體生成和/或改變包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代謝途徑調(diào)節(jié)吲哚庫(kù)。例如，可通過(guò)宿主細(xì)胞中編碼EC 4.1.1.74的基因功能性缺失來(lái)減少或去除從吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸?？赏ㄟ^(guò)功能性缺失宿主細(xì)胞中編碼EC4.1.99.1的基因減少或去除從色氨酸生成吲哚。另外，過(guò)量吲哚能用作體外或體內(nèi)過(guò)程中的底物，結(jié)合增加量的編碼EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，82604-6，1996)。此外，可進(jìn)行遺傳修飾以增加中間體，如D-赤蘚糖4-磷酸和分支酸的水平。
在大部分生物體中調(diào)節(jié)色氨酸生成。一種機(jī)制是通過(guò)反饋抑制途徑中的某些酶；隨著色氨酸水平增加，色氨酸的產(chǎn)率減少。因此，當(dāng)使用經(jīng)色氨酸中間體生成莫納甜的經(jīng)工程改造的宿主細(xì)胞時(shí)，可使用對(duì)色氨酸濃度不敏感的生物體。例如，通過(guò)反復(fù)暴露于高濃度5-甲基色氨酸，選擇抗多種色氨酸類似物的生長(zhǎng)抑制的玫瑰長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)品系(Schallenberg和Berlin，ZNaturforsch 34541-5，1979)?？赡苡捎诨蛲蛔?，所得品系的色氨酸合酶活性受到產(chǎn)物抑制的影響小。類似地，可優(yōu)化用于莫納甜生成的宿主細(xì)胞。
可使用定向進(jìn)化，以形成對(duì)產(chǎn)物抑制不太敏感的多肽來(lái)優(yōu)化色氨酸生成。例如，篩選能在培養(yǎng)基中不含色氨酸，但具有高水平的不可代謝的色氨酸類似物的平板上進(jìn)行。美國(guó)專利號(hào)5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加發(fā)酵生物體中色氨酸產(chǎn)率的方法。色氨酸生物合成的最后步驟是在吲哚中加入絲氨酸；因此能提高絲氨酸的有效性以增加色氨酸生成。
可通過(guò)增加宿主生物體產(chǎn)生的丙酮酸量來(lái)提高發(fā)酵生物體產(chǎn)生的莫納甜量。一些酵母如絲孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.35338-42，2002)和光滑球擬酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.57451-9，2001)超量產(chǎn)生丙酮酸且能用于實(shí)踐本文所述方法。此外，可對(duì)生物體進(jìn)行遺傳修飾以促進(jìn)丙酮酸生成，如在大腸桿菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.82604-6，1996)中。
控制手性通過(guò)控制立體化學(xué)(手性)能改變莫納甜的味覺(jué)分布。例如，不同食物系統(tǒng)的濃度不同的混合物中需要不同的莫納甜異構(gòu)體。手性可通過(guò)pH和多肽的組合控制。
通過(guò)α碳的去質(zhì)子化和再質(zhì)子化可在莫納甜的C-4位置(見(jiàn)上面編號(hào)的分子)外消旋，這能通過(guò)pH變化或與酶(例如外消旋酶)結(jié)合或在溶液中游離的輔因子PLP反應(yīng)來(lái)發(fā)生。在微生物中，pH不太可能變化到足以引起外消旋，但PLP是豐富的?？刂贫嚯氖中缘姆椒ㄈQ于用于生成莫納甜的生物合成途徑。
當(dāng)莫納甜用圖2所示途徑形成時(shí)，可考慮下列各項(xiàng)。在生物催化反應(yīng)中，碳-2的手性由酶確定，該酶將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP。多種酶(如來(lái)自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP，因此可選擇形成所需立體異構(gòu)體的酶。另外，可用定向進(jìn)化改變將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP的酶的對(duì)映特異性，或能改造催化抗體以催化所需反應(yīng)。一旦生成MP(通過(guò)酶法或化學(xué)縮合)，可用轉(zhuǎn)氨酶立體特異性加入氨基，如本文所述的轉(zhuǎn)氨酶。能產(chǎn)生碳-4的R或S構(gòu)象，這取決于使用D-還是L-芳族酸轉(zhuǎn)氨酶。大部分轉(zhuǎn)氨酶對(duì)L-立體異構(gòu)體特異，然而，在一些植物中也存在D-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國(guó)際維生素B6和羰基催化討論會(huì)會(huì)議錄》，日本大阪，1990)。此外，鑒定了D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.22)。一些轉(zhuǎn)氨酶僅接受在C2碳有特定構(gòu)象的此反應(yīng)的底物。因此，即使轉(zhuǎn)化成MP不是立體定向的，可通過(guò)適當(dāng)選擇轉(zhuǎn)氨酶控制終產(chǎn)物的立體化學(xué)。由于反應(yīng)是可逆的，未反應(yīng)MP(不需要的立體異構(gòu)體)可再循環(huán)回到其組分且可再形成MP的外消旋混合物。
底物的激活磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸鹽(PEP)可用于本文所示反應(yīng)。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反應(yīng)速度和/或產(chǎn)量。在醛醇縮合中，加入磷酸基團(tuán)穩(wěn)定親核底物的烯醇相互轉(zhuǎn)化異構(gòu)體，使它更具反應(yīng)性。在其它反應(yīng)中，磷酸化底物通常提供更好的離去基團(tuán)。類似地，可通過(guò)轉(zhuǎn)化成CoA衍生物或焦磷酸鹽衍生物激活底物。
莫納甜在飲料組合物中的用途按重量計(jì)，莫納甜的S，S立體異構(gòu)體比蔗糖甜約50-200倍。按重量計(jì)，莫納甜的R，R立體異構(gòu)體比蔗糖甜約2000-2400倍。莫納甜的甜度是由有經(jīng)驗(yàn)的感覺(jué)鑒定員在甜度比較過(guò)程中計(jì)算的，該過(guò)程將測(cè)試甜味劑溶液與一系列參考溶液之一的甜度進(jìn)行比較。例如，溶液可用含有0.16％(v/w)檸檬酸和0.02％(v/w)檸檬酸鈉的緩沖液(pH 3.0)制備。
具體的，可采用受過(guò)訓(xùn)練熟悉甜味估計(jì)方法的一組感覺(jué)鑒定者評(píng)價(jià)甜味劑相對(duì)于蔗糖的甜度。在22℃±1℃的溫度下一式兩份測(cè)試所有樣品(在相同緩沖液中)。例如，可用含有0.16％(w/v)檸檬酸和0.02％(w/v)檸檬酸鈉～pH 3.0制備樣品溶液。用3位隨機(jī)數(shù)字號(hào)碼編碼測(cè)試溶液，將該溶液隨機(jī)分給各小組成員。提供蔗糖范圍在2.0-10.0％(w/v)的蔗糖參比標(biāo)準(zhǔn)，相鄰濃度的增加值為0.5％(w/v)蔗糖。要求小組成員通過(guò)比較測(cè)試溶液與蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品的甜度來(lái)估計(jì)甜度。通過(guò)下述方法進(jìn)行該測(cè)試吸啜3小口測(cè)試溶液，然后吸啜一口水，吸啜水后吸啜3小口蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品等。小組成員把甜度估計(jì)到一位小數(shù)位，如6.8、8.5。在評(píng)價(jià)測(cè)試溶液之間休息5分鐘時(shí)間。也要求小組成員徹底地嗽口并食用餅干以降低任何可能的后遺作用。
將由一組受過(guò)訓(xùn)練的感覺(jué)鑒定者確定的蔗糖等價(jià)值(SEV)(如％蔗糖)作為莫納甜濃度的函數(shù)作圖，獲得劑量反應(yīng)曲線。對(duì)劑量反應(yīng)曲線應(yīng)用多項(xiàng)式曲線擬合，通過(guò)用蔗糖等價(jià)值(SEV)除以莫納甜濃度(如％莫納甜)來(lái)計(jì)算具體點(diǎn)上的甜度強(qiáng)度或效能，如8％SEV。參見(jiàn)例如圖15(R，R/S，S莫納甜劑量反應(yīng)曲線)；圖14(R，R莫納甜劑量反應(yīng)曲線)。測(cè)定上述S，S和R，R莫納甜的甜度強(qiáng)度(即分別比相同重量的蔗糖甜約50-200倍和約2000-2400倍)約為8％SEV。
莫納甜可以消費(fèi)者喜歡的濃度溶于含水溶液。在某些基料中或與其它甜味劑混合時(shí)莫納甜立體異構(gòu)體混合物的質(zhì)量可能較好。將莫納甜與其它甜味劑混合可使甜味強(qiáng)度和/或特性最大且成本最低。莫納甜可與其它甜味劑和/或其它成分組合以產(chǎn)生類似于蔗糖的暫時(shí)特性，或獲得其它益處。
例如，莫納甜可與其它營(yíng)養(yǎng)和非營(yíng)養(yǎng)甜味劑混合以獲得特定的味道或卡路里目標(biāo)。因此，甜味劑組合物可包括莫納甜與一種或多種以下甜味劑類型的組合(1)糖醇(如赤蘚醇、山梨醇、麥芽糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、異麥芽糖、低糖糖漿等)；(2)其它高強(qiáng)度甜味劑(如阿斯巴特、三氯蔗糖、糖精、安賽蜜、甜菊糖、環(huán)磺酸鹽、紐甜、奇異果甜蛋白、阿力甜、雙氫查耳酮、莫尼糖蛋白、甘草甜素、羅漢果甙、葉甜素、馬檳榔甜蛋白、布那珍、多肽菌素、倍他丁等)，以及(3)營(yíng)養(yǎng)甜味劑(如蔗糖、D-塔格糖、轉(zhuǎn)化糖、果糖、玉米糖漿、高果糖玉米糖漿(HFCS)、葡萄糖/右旋糖、海藻糖、異麥芽酮糖等)。莫納甜可作為味道修飾劑用于這種混合物以抑制后味、強(qiáng)化其它味道，如檸檬味，或改善暫時(shí)味道特征。數(shù)據(jù)還顯示，莫納甜與環(huán)磺酸鹽(在歐洲使用)有協(xié)同作用，但與阿斯巴特、糖精、安賽蜜、三氯蔗糖或碳水化合物甜味劑的協(xié)同作用不明顯。
由于莫納甜不是碳水化合物，可用其降低飲料組合物中的碳水化合物含量。在一個(gè)實(shí)施方式中，一定量的含有莫納甜的飲料組合物所含的熱量和碳水化合物比相同量的用糖(如蔗糖和/或高果糖玉米糖漿)替代莫納甜的飲料組合物少。在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜(如含有莫納甜和一種或多種碳水化合物)的飲料組合物隨時(shí)間提供的口感、味道和甜度與僅含碳水化合物作為甜味劑的類似飲料組合物所提供的相當(dāng)。
莫納甜在干燥形式下穩(wěn)定，并在單獨(dú)或與碳水化合物混合物時(shí)具有所需味道表現(xiàn)。它未顯示出不可逆轉(zhuǎn)的分解，但在低pH時(shí)傾向于形成內(nèi)酯和/或內(nèi)酰胺(在含水緩沖液中)并達(dá)到平衡。在溶液中，它可在4位緩慢外消旋，但這通常在高pH下發(fā)生。通常，莫納甜的穩(wěn)定性比得上或好于阿斯巴特，莫納甜的味道表現(xiàn)比得上或好于其它品質(zhì)的甜味劑，如阿斯巴特、阿力甜和三氯蔗糖。相比糖精和甜菊糖等其它高強(qiáng)度甜味劑，莫納甜沒(méi)有不好的后味。
在一些實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物也包括以下物質(zhì)的一種或多種緩沖液、填充劑、增稠劑、脂肪、調(diào)味劑、著色劑(也稱為染料或顏料)、甜味劑和助流動(dòng)劑。可配制飲料組合物，如通過(guò)調(diào)整飲料中存在的莫納甜或其它甜味劑的量，或通過(guò)調(diào)整組合物中存在的其它類型添加劑包括調(diào)味劑或酸的量，使飲料組合物具有特定甜度特性。在其它實(shí)施方式中，用于飲料組合物的所有成分都是食品級(jí)的，通常認(rèn)為是安全的。
在一些實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物還包含食品級(jí)的抗氧化劑。這種抗氧化劑的例子包括維生素C(如抗壞血酸、抗壞血酸磷酸鎂)、異抗壞血酸鹽(異抗壞血酸)，類胡羅卜素如葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素，生育酚(如α-生育酚(天然維生素E)、γ-生育酚、δ-生育酚)，羥基肉桂酸(如新綠原酸和綠原酸)，谷胱甘肽，酚醛類(如可可酚、紅酒酚、李子中的酚醛類物質(zhì))，丁基化羥基苯甲醚(BHA)，丁基化羥基甲苯(BHT)，叔丁基氫醌(TBHQ)，沒(méi)食子酸丙酯，乳酸鏈球菌肽，綠茶萃取物和迷迭香萃取物。在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物還含有某種防腐劑，如苯甲酸鈉和/或山梨酸鉀。
在其它實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物還含有一種或多種防止非酶褐變反應(yīng)(如由美拉德反應(yīng)引起的褐變)的成分。這種成分可包括但不限于亞硫酸鹽和亞硫酸鹽化劑(如二氧化硫、亞硫酸鈉、亞硫酸氫納或亞硫酸氫鉀、偏亞硫酸氫鹽、含巰基的氨基酸)、氯化鈣和其它無(wú)機(jī)鹵化物、抗氧化劑和影響水化活性的化合物(如甘油、山梨醇和海藻糖)。
在一些實(shí)施方式中，可以容易地分散含有莫納甜的飲料濃縮物如無(wú)水飲料混合物，制備巧克力飲料、水果飲料、加麥芽飲料或檸檬水。在其它實(shí)施方式中，飲料濃縮物是可用于制備碳酸軟飲料的飲料糖漿?？赏ㄟ^(guò)，例如用碳酸水稀釋含水的飲料糖漿、莫納甜和調(diào)味劑來(lái)制備碳酸飲料。在一些實(shí)施方式中，該飲料糖漿也含有其它甜味劑和/或添加劑?？赏ㄟ^(guò)，例如將所有成分混合并加熱溶解來(lái)制備飲料糖漿。飲料糖漿可包括例如至少80％的水(如至少85％、90％或95％的水)。
在某些實(shí)施方式中，所存在的莫納甜的范圍約為飲料組合物的0.0003-1％(即約3-10,000ppm)(如約0.0005-0.2％)，包括該范圍中任何特定值(如飲料組合物的0.0003％、0.005％、0.06％或0.2％)。例如，飲料組合物可含有0.0005-0.005％(如0.001-0.0045％)的R，R莫納甜，或0.005-0.2％(如0.01-0.175％)的S，S莫納甜。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，可用甜味劑組合為飲料組合物提供所需味道和熱量。因此，飲料組合物中甜味劑的量取決于所選擇的甜味劑和所需的甜度強(qiáng)度。甜味劑可從市場(chǎng)上購(gòu)得，如從Cargill Inc.(Wayzata，MN)和McNeil Specialty(Fort Washington，PA)購(gòu)得。在一個(gè)實(shí)施方式中，飲料組合物包括莫納甜和甜味劑(如蔗糖或高果糖玉米糖漿)的混合物。例如，飲料組合物可包括莫納甜和散裝甜味劑散裝甜味劑。
散裝甜味劑可選自，例如，糖甜味劑、無(wú)糖甜味劑、低升糖指數(shù)碳水化合物及其組合。糖甜味劑可包括例如玉米甜味劑、蔗糖、右旋糖(如工業(yè)葡萄糖右旋糖)、麥芽糖、糊精、麥芽糖糊精、轉(zhuǎn)化糖、果糖、高果糖玉米糖漿、左旋糖、半乳糖、玉米糖漿固體、半乳糖、海藻糖、異麥芽酮糖、果糖-寡聚糖(如蔗果三糖或霉菌赤蘚醛糖)、高分子量果糖-寡聚糖或其組合。例如，高果糖玉米糖漿(HFCS)和其它玉米衍生的甜味劑是右旋糖(葡萄糖)和果糖的組合。此外，糖甜味劑包括水果糖、槭糖漿和蜂蜜，或其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將0.0003-0.15％莫納甜(如0.0006-0.004％的R，R莫納甜)和2-10％(如3-10％或4-6％)的蔗糖或高果糖玉米糖漿用于飲料組合物。
在另一實(shí)施方式中，飲料組合物包括無(wú)糖甜味劑和/或低升糖指數(shù)碳水化合物(即比葡萄糖的升糖指數(shù)低的化合物)。無(wú)糖甜味劑或低升糖指數(shù)碳水化合物包括但不限于D-塔格糖、山梨醇(包括無(wú)定形山梨醇和結(jié)晶山梨醇)、甘露醇、木糖醇、乳糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、氫化淀粉水解物、異麥芽糖、D-阿洛酮糖、1，5脫水D-果糖或其組合。
在某些實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物也含有高強(qiáng)度甜味劑。在一些實(shí)施方式中，高強(qiáng)度甜味劑比蔗糖至少甜20倍(即20×蔗糖)。這種高強(qiáng)度甜味劑包括但不限于單獨(dú)或組合的三氯蔗糖、阿斯巴特、糖精及其鹽、乙酰舒泛鹽(如安賽蜜)、阿力甜、奇異果甜蛋白、雙氫查耳酮(如雙氫查耳酮新橙皮素)、紐甜、環(huán)磺酸及其鹽(即環(huán)磺酸鹽)、甜菊糖(從甜菊(Stevia rebaudiana)葉中萃取)、羅漢果甙(從羅漢果果實(shí)中萃取)、甘草甜素、葉甜素(從繡球(Hydrangea macropylla)葉中萃取、約400-600×蔗糖)、莫內(nèi)林、馬檳榔甜蛋白、布那珍、多肽菌素、倍他丁。
僅在其它化合物如酸存在的情況下表現(xiàn)出甜味的甜味增強(qiáng)劑也可用于飲料組合物。甜味增強(qiáng)劑(也稱為甜味增效劑)的非限制性例子包括仙茅甜蛋白、非洲奇果蛋白、洋薊酸、綠原酸、咖啡酸、叉柱花素(strogins)、阿拉伯半乳聚糖、麥芽酚和二羥苯甲酸。在某些實(shí)施方式中，含有莫納甜的飲料組合物也包括味道增強(qiáng)劑或味道穩(wěn)定劑，如SucramaskTM或海藻糖。
飲料組合物中可任選地包括食品級(jí)天然或人工著色劑。這些著色劑可選自本領(lǐng)域通常所知和可用的著色劑，包括合成顏料(如偶氮染料、三苯基甲烷、黃嘌呤素、奎寧和靛類染料)、焦糖色、二氧化鈦、紅色#3、紅色#40、藍(lán)色#1和黃色#5。也可采用天然著色劑如甜菜汁(甜菜紅)、洋紅、姜黃素、葉黃素、胡蘿卜汁、漿果汁、調(diào)味料(姜黃、胭脂樹(shù)和/或紅辣椒)萃取物和類胡羅卜素。所選著色劑的類型和量將取決于最終產(chǎn)品和消費(fèi)者偏好。
在一些實(shí)施方式中，飲料組合物也包括一種或多種天然或合成調(diào)味劑。合適的調(diào)味劑包括柑橘和非柑橘水果調(diào)味劑；香料；藥草；植物性藥材；巧克力、可可或巧克力利口酒；咖啡；獲自香草豆的調(diào)味劑；堅(jiān)果萃取物；利口酒和利口酒萃取物；水果白蘭地酒蒸餾物；芳香化學(xué)品、仿制調(diào)味劑；以及上述任何物質(zhì)的濃縮物、萃取物或香精。柑橘香料包括例如檸檬、酸橙、橙、橘子、柚子、香櫞或金橘。許多調(diào)味劑可從市場(chǎng)上購(gòu)得，如從Rhodia USA(Cranbury，NJ)；IFF(South Brunswick，NJ)；Wild Flavors，Inc.(Erlanger，KY)；Silesia Flavors，Inc.(Hoffman Estates，IL)，Chr.Hansen(Milkwaukee，WI)和Firmenisch(Princeton，NJ)購(gòu)得。
例如，用于制備碳酸軟飲料的飲料糖漿可包括可用于將可樂(lè)味道賦予飲料的天然可樂(lè)調(diào)味劑(如來(lái)自可樂(lè)果萃取物)。在一些實(shí)施方式中，可讓調(diào)味劑形成乳劑，然后再分散到飲料糖漿中。乳劑小滴通常具有比水小的特定重力，因此可形成不同相。增重劑、乳化劑和乳劑穩(wěn)定劑可用于使乳劑小滴穩(wěn)定。這種乳化劑和乳劑穩(wěn)定劑的例子包括樹(shù)膠、果膠、纖維素、聚山梨醇酯、山梨聚糖酯和丙二醇藻酸鹽。在一些實(shí)施方式中，可樂(lè)味乳劑占飲料糖漿的0.8-1.5％。在其它實(shí)施方式中，可用于增強(qiáng)可樂(lè)味道的附加調(diào)味劑包括柑橘香料如檸檬、酸橙、橙、橘子、柚子、香櫞或金橘，以及調(diào)味品香料如丁香和香草。在其它實(shí)施方式中，柑橘香料(如天然檸檬或酸橙香料)約占飲料糖漿的0.03-0.06％，調(diào)味品香料(如香草)占飲料糖漿的0.5-1.5％。
可通過(guò)加入酸(如無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸)控制飲料糖漿的pH。一般地，飲料糖漿的pH范圍在2.5-約5(如2.5-約4.0)之間。特別有用的無(wú)機(jī)酸包括可以其未離解形式或作為堿金屬鹽(如磷酸氫鉀或磷酸氫鈉，或者磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉)存在的磷酸?？刹捎玫挠袡C(jī)酸的非限制性例子包括檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、己二酸、葡糖酸、葡糖醛酸內(nèi)酯、羥基檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸、乙酸或其混合物。這些酸可以其非解離形式存在或作為它們各自的鹽存在。
在一些實(shí)施方式中，飲料糖漿還含有咖啡因(如來(lái)自天然可樂(lè)香料)。也可單獨(dú)加入咖啡因。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)用碳酸水稀釋飲料糖漿使產(chǎn)生的飲料含有15-25％的糖漿和75-85％的水，來(lái)制備碳酸飲料?；蛘撸捎梅翘妓崴♂屧撎菨{來(lái)制備飲料，然后將二氧化碳引入該飲料以實(shí)現(xiàn)碳酸化。在另一實(shí)施方式中，一般將碳酸飲料置于容器，如瓶或罐中，然后密封。可采用任何常規(guī)碳酸化方法來(lái)制造本發(fā)明的碳酸飲料。
在一些實(shí)施方式中，飲料組合物可以是脫水的飲料混合物。需要注意的是，“脫水”材料可含有殘留水平的液體。例如，飲料混合物可以是加麥芽飲料混合物、巧克力味的飲料混合物或粉末水果飲料混合物如Kool-Aid或Crystal Light。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)下述方法制備脫水的飲料混合物在溶液中濕混合各液體成分，然后真空干燥這些成分，產(chǎn)生干燥塊，然后將該干燥塊研磨成粉基?？捎贸煞秩缬汀⑷榛瘎┖退c其它干成分混合，如將可可粉加入粉基中。
在另一實(shí)施方式中，可將一般不含有甜味劑，而消費(fèi)者一般會(huì)將其與蔗糖混合的飲料粉基，如檸檬水小包，與高強(qiáng)度甜味劑如莫納甜混合。例如，可用稀釋劑或填充劑如麥芽糖糊精、水解淀粉、右旋糖、聚糊精和菊粉幫助混合。
在其它實(shí)施方式中，加麥芽飲料混合物包括脫水飲料成分，例如粉末蛋白來(lái)源如奶粉、脫脂奶粉，雞蛋蛋白粉，植物或谷物蛋白分離物如大豆蛋白分離物、麥芽粉、水解谷物粉、淀粉、其它碳水化合物粉、維生素、礦物質(zhì)、可可粉和粉末調(diào)味劑，或這些成分的任何組合。液體加麥芽飲料成分可包括，例如一種或多種脂肪或油，液體麥芽萃取物，液體甜味劑如蜂蜜和葡萄糖漿，以及液體蛋白來(lái)源如蔬菜蛋白濃縮物，或其任何組合。合適的脂肪包括但不限于部分或完全氫化的植物油，如棉花籽油、大豆油、玉米油、葵花油、棕櫚油、菜籽油，棕櫚仁油、花生油、米糠油，紅花油，椰子油，菜籽油，以及它們的中等油酸和高油酸對(duì)應(yīng)物；或其任何組合。也可采用動(dòng)物脂肪如乳脂。各加麥芽飲料成分的量可根據(jù)所需配方而不同。在一些實(shí)施方式中，可將莫納甜與上述散裝甜味劑混合。
在一些實(shí)施方式中，水果飲料預(yù)混合物包括檸檬酸(如60-70％)、調(diào)味劑(如2-4％)、著色劑(如0.001-1％)、莫納甜、磷酸鈣(如0-25％)、濁化劑(如0-5％)和抗壞血酸(如0-2％)。例如，水果飲料混合物可包括64.9％檸檬酸、20.5％磷酸鈣、3.9％濁化劑、0.78抗壞血酸、2.7％香料、0.1％顏料和莫納甜。在一些實(shí)施方式中，可將莫納甜與上述散裝甜味劑混合。在另一實(shí)施方式中，為制備水果飲料，可用水重新構(gòu)建該預(yù)混合物，使產(chǎn)生的飲料約含0.5-1.5％(如0.75％)的混合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，干巧克力飲料組合物可包括脫脂奶粉(如約20-30％)、乳清粉(如35-45％)、咖啡調(diào)白油(如10-15％)、低脂可可粉(如15-20％)、碳酸氫鉀(如0.1-10％)、瓜爾膠(如0.06-2％)、角叉聚糖(如0.05-5％)、香料(如巧克力和/或香草)以及莫納甜。例如，干巧克力飲料組合物可包括26％脫脂奶粉、40％乳清粉、12％咖啡調(diào)白油、18％低脂可可粉、1％碳酸氫鉀、0.6％瓜爾膠、0.5％角叉聚糖、巧克力香料、香草香料以及莫納甜。在另一實(shí)施方式中，為制備巧克力飲料，可用水或牛奶重新構(gòu)建預(yù)混合物，使產(chǎn)生的飲料約含0.5-1.5％(如0.8％)的混合物。
在一些實(shí)施方式中，以組合物形式提供了用于制備飲料組合物的干成分混合物，用于制備飲料組合物的濕成分混合物，或干成分和濕成分的液體混合物(分散體)?？梢灾破沸问教峁┻@種組合物，也可將其包裝到合適的容器(如包、桶、盒)中，以易于運(yùn)輸至銷售點(diǎn)和制備，也易于傾倒和/或混合。該制品可含有任選物體，如器皿；用于混合的容器；或其它任選成分。該制品可包括制備飲料組合物的說(shuō)明書(shū)。
預(yù)計(jì)與飲料中的其它甜味劑相比，飲料中所含的莫納甜的保存期限更長(zhǎng)，熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性更高，味道特征和市場(chǎng)前景也更好。下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例不限制所述的本發(fā)明范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的克隆和表達(dá)該實(shí)施例描述用于克隆色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的方法，它可用于使色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸。
實(shí)驗(yàn)概述11個(gè)編碼轉(zhuǎn)氨酶的基因克隆入大腸桿菌中。這些基因是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(dat，Genbank登錄號(hào)Y14082.1 bp 28622-29470和Genbank登錄號(hào)NP 388848.1分別為核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti也稱為Rhizobium meliloti)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tatA，SEQ ID NOS1和2分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株2.4.1酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tatA通過(guò)同源性確定，SEQ ID NOS3和4分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌35053酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(通過(guò)同源性確定，SEQ ID NOS5和6，分別為核酸序列和氨基酸序列)碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)廣底物轉(zhuǎn)氨酶(bsat，通過(guò)與來(lái)自墨西哥利什曼原蟲(chóng)(L.mexicana)的肽片段的同源性確定，SEQ ID NO7和8分別為核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢桿菌芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT，通過(guò)同源性確定，SEQ ID NOS9和10分別為核酸序列和氨基酸序列)、食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)芳族轉(zhuǎn)氨酶(araT，通過(guò)同源性確定，SEQ ID NOS11和12，分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌35053多底物轉(zhuǎn)氨酶(通過(guò)同源性確定，SEQ ID NOS13和14分別為核酸序列和氨基酸序列)、類球紅細(xì)菌菌株2.4.1多底物轉(zhuǎn)氨酶(msa，通過(guò)同源性確定，Genbank登錄號(hào)AAAE01000093.1，bp 14743-16155和Genbank登錄號(hào)ZP00005082.1分別為核酸序列和氨基酸序列)、大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspC，Genbank登錄號(hào)AE000195.1 bp 2755-1565和Genbank登錄號(hào)AAC74014.1分別為核酸序列和氨基酸序列)和大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrB，SEQ ID NOS31和32分別為核酸序列和氨基酸序列)?？寺?、表達(dá)了基因并與可商業(yè)購(gòu)買的酶一起測(cè)試它將色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的活性。所有11個(gè)克隆有活性。
鑒定可包含具有所需活性的多肽的細(xì)菌菌株NCBI(全國(guó)生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有基因命名為色氨酸轉(zhuǎn)氨酶。然而，鑒定了有此酶活性的生物體。在細(xì)胞提取物或從純化蛋白中測(cè)量到L-色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)活性，來(lái)源如下羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分離物、豌豆線粒體和細(xì)胞溶質(zhì)、向日葵冠癭細(xì)胞、豌豆根瘤菌三葉草生物變種(R.leguminosarum biovar trifoli)、草生歐文氏菌石頭花致病變種(E.herbicola pv.gypsophilae)、丁香假單胞菌薩氏致病變種(P.syringae pv.savastanio)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、團(tuán)聚腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、麥芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠腦、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳桿菌(L.Helveticus)、小麥苗、大麥、金色菜豆(Phaseolus aureus)(綠豆)、葡萄狀酵母(卡爾斯伯根糖酵母)、利什曼原蟲(chóng)屬、玉米、番茄莖、豌豆植物、煙草、豬、生孢梭菌(Clostridium Sorogenes)和灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)。
實(shí)施例2吲哚-3-乳酸轉(zhuǎn)化成哚-3-丙酮酸如圖1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸間的轉(zhuǎn)化是可逆反應(yīng)，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸間的轉(zhuǎn)化也是這樣。由于在340nm來(lái)自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通?？筛欉胚?乳酸的氧化。
0.1mL標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定混合物含有100mM磷酸鉀，pH8.0、0.3mM NAD+、7單位乳酸脫氫酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。測(cè)定在UV-透明微量滴定板中進(jìn)行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus板閱讀器?；旌隙嚯暮途彌_液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暫混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒間隔閱讀。反應(yīng)在25℃保持5分鐘。從NAD+生成NADH后，在340nm的吸光度增加。不用NAD+以及不用底物進(jìn)行單獨(dú)的負(fù)對(duì)照。來(lái)自腸膜明串珠菌(LeuconostocMesenteroides)的D-LDH(Sigma目錄號(hào)L2395)似乎顯示與吲哚衍生物底物的活性大于來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目錄號(hào)L5275)的活性。
用類似方法，使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸還原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸與D-LDH氧化反應(yīng)的Vmax約為乳酸的五分之一。也通過(guò)使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸鈉的50mM硼酸鈉緩沖液，跟蹤在327(烯醇-硼酸鹽衍生物)的吸光度變化測(cè)量吲哚-3-丙酮酸的存在。與用于L和D-LDH多肽的負(fù)對(duì)照相比，觀察到小但可重復(fù)的吸光度變化。
此外，可克隆廣特異性乳酸脫氫酶(酶活性與EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC1.1.2.3相關(guān))并用于從吲哚-3-乳酸產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸。廣特異性脫氫酶的來(lái)源包括大腸桿菌、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。
另外，可通過(guò)吲哚-3-乳酸接觸來(lái)自生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)的細(xì)胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.110)；或接觸克氏表鞭毛型錐蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi epimastigotes)細(xì)胞提取物，提取物含有已知對(duì)吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羥苯基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)；或食酸假單胞菌(Pseudomonas Acidovorans)或大腸桿菌細(xì)胞提取物，提取物含有咪唑-5-基乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.111)；或錦紫蘇(Coleus blumei)，它含有羥苯基丙酮酸還原酶(EC 1.1.1.237)；或麥芽念珠菌(Candida maltosa)，它含有D-芳族乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.222)來(lái)生成吲哚-3-丙酮酸。描述這種活性的參考文獻(xiàn)包括Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，71119-24，1992)、Jean和DeMoss(Canadian J. Microbiol.14 1968、Coote和Hassall(Biochem.J.111237-9，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil.162390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.CBiosci. 43 501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol135353-60，1989)。此外，乳酸氧化酶，如來(lái)自假單胞菌屬(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.Catalysis BEnzymatic18299-305，2002)可用于將吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
實(shí)施例3用L-氨基酸氧化酶將L-色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸該實(shí)施例描述的方法用于經(jīng)氧化酶(EC 1.4.3.2)將L-色氨酸轉(zhuǎn)化成吲哚-3-丙酮酸的方法，作為實(shí)施例1所述使用色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的另一種選擇。L-氨基酸氧化酶純化自南美響尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目錄號(hào)A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸氧化酶的登錄號(hào)包括CAD21325.1、AAL14831、NP_490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反應(yīng)在微離心管中進(jìn)行，總體積1mL，37℃振蕩孵育10分鐘。反應(yīng)混合物含有5mM L-色氨酸、100mM磷酸鈉緩沖液pH6.6、0.5mM砷酸鈉、0.5mM EDTA、25mM四硼酸鈉、0.016mg過(guò)氧化氫酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125單位的L-氨基酸氧化酶。負(fù)對(duì)照含有色氨酸之外的所有成分，空白含有氧化酶之外的所有成分。過(guò)氧化氫酶用于去除在氧化脫氨期間形成的過(guò)氧化氫。四硼酸鈉和砷酸鈉用于穩(wěn)定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸鹽形式，吲哚-3-丙酮酸在327nm顯示最大吸光度。在反應(yīng)混合物中制備0.1-1mM濃度的吲哚-3-丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)。
購(gòu)得的L-氨基酸氧化酶具有每分鐘每毫克蛋白形成540μg吲哚-3-丙酮酸的比活。這與色氨酸轉(zhuǎn)氨酶的比活是相同的數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例4用醛縮酶將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸該實(shí)施例描述的方法可用于將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP，使用醛縮酶(裂合酶)(圖2)。醛醇縮合是在一種醛的β-碳或酮與另一種醛或酮的羰基碳間形成碳-碳鍵的反應(yīng)。在一個(gè)底物的羰基相鄰碳上形成碳負(fù)離子，并用作親核體攻擊第2個(gè)底物的羰基碳(親電碳)。最通常地，親電底物是醛，因此大部分醛縮酶屬于EC 4.1.2.-類別。親核底物通常是丙酮酸。醛縮酶不常催化2個(gè)酮酸或2個(gè)醛間的縮合。
然而，鑒定了催化2個(gè)羧酸縮合的醛縮酶。例如，EP 1045-029描述從乙醛酸和丙酮酸使用假單胞菌培養(yǎng)物(EC 4.1.3.16)生成L-4-羥基-2-酮戊二酸。此外，4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC 4.1.3.17)能催化2個(gè)酮酸的縮合。因此，類似的醛縮酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸與丙酮酸的縮合。
克隆4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛縮酶，EC 4.1.3.17)和4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛縮酶，EC 4.1.3.16)催化與圖2的醛縮酶反應(yīng)非常相似的反應(yīng)。設(shè)計(jì)引物的突出端與pET30 Xa/LIC載體(Novagen，Madison，WI)相容。
proA基因產(chǎn)物的活性結(jié)果當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni) proA和苜蓿根瘤菌(S.meliloti)SMc00502基因構(gòu)建物有高水平表達(dá)。重組蛋白是高度可溶的，如通過(guò)SDS-PAGE分析總蛋白和細(xì)胞提取物樣品所確定的。睪丸酮叢毛單胞菌基因產(chǎn)物純化至＞95％純度。由于用His-結(jié)合柱體親和純化后苜蓿根瘤菌基因產(chǎn)物的產(chǎn)量很低，細(xì)胞提取物用于酶測(cè)定。
兩種重組醛縮酶都催化從吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二價(jià)鎂和磷酸鉀的同時(shí)存在。當(dāng)缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸鉀時(shí)，沒(méi)有明顯產(chǎn)物。缺乏酶時(shí)也形成少量產(chǎn)物(通常比當(dāng)酶存在時(shí)少1個(gè)數(shù)量級(jí))。
從反相C18柱洗脫的產(chǎn)物峰稍遲于吲哚-3-丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)，此峰的質(zhì)譜顯示292.1的碰撞誘導(dǎo)母離子([M+H]+)，產(chǎn)物MP預(yù)期的母離子。質(zhì)譜中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳離子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。產(chǎn)物也表現(xiàn)出其它含吲哚的化合物的UV光譜特征，如色氨酸，λmax為279-280且有約290nm的小肩。
隨著反應(yīng)溫度從室溫增加到37℃、底物量和鎂量的增加，睪丸酮叢毛單胞菌醛縮酶法生成的MP量增加。酶的合成活性隨著pH增加而減少，在pH7觀察到最多產(chǎn)物。在色氨酸標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，用20μg純化的蛋白在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定下生成的MP量約為每毫升反應(yīng)物10-40μg。
由于苜蓿根瘤菌和睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶編碼序列與上述其它基因的高度同源性，預(yù)期所有重組基因產(chǎn)物能催化此反應(yīng)。此外，預(yù)期有類似活性的醛縮酶在59位和87位有蘇氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有組氨酸(H)的醛縮酶(以睪丸酮叢毛單胞菌的編號(hào)系統(tǒng)為基礎(chǔ))。
khg基因產(chǎn)物的活性結(jié)果當(dāng)用IPTG誘導(dǎo)時(shí)，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌khg基因構(gòu)建物有高水平表達(dá)，而苜蓿根瘤菌khg的表達(dá)水平較低。重組蛋白高度可溶，如通過(guò)SDS-PAGE分析總蛋白和細(xì)胞提取物樣品判斷的?？莶菅挎邨U菌和大腸桿菌khg基因產(chǎn)物純化到＞95％純度；用His-結(jié)合柱體親和純化后，苜蓿根瘤菌基因產(chǎn)物的產(chǎn)量不高。
沒(méi)有跡象證明此酶活性需要鎂和磷酸鹽。然而，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)在磷酸鈉緩沖液中進(jìn)行測(cè)定，報(bào)導(dǎo)的酶是雙功能并對(duì)磷酸化底物如2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶測(cè)定如上所述進(jìn)行，在一些情況中省略磷酸鹽。結(jié)果表明重組KHG醛縮酶產(chǎn)生MP，但活性不如ProA醛縮酶。在一些情況中，KHG產(chǎn)生的MP水平幾乎與鎂和磷酸鹽單獨(dú)產(chǎn)生的量相同。磷酸鹽似乎不增加KHG活性。桿菌酶活性最高，比單獨(dú)鎂和磷酸鹽的活性約高20-25％，如SRM所確定(見(jiàn)實(shí)施例10)。根瘤菌酶活性量最低，這可能與表達(dá)中注意到的折疊和溶解度問(wèn)題相關(guān)。所有3種酶有活性位點(diǎn)谷氨酰胺(枯草芽孢桿菌編號(hào)系統(tǒng)中的43位)以及與丙酮酸形成Shiff堿基所需的賴氨酸(130位)；然而，枯草芽孢桿菌酶在47位含有活性位點(diǎn)殘基蘇氨酸，而不是精氨酸?？莶菅挎邨U菌KHG較小且似乎在簇中不同于苜蓿根瘤菌和大腸桿菌酶，其它酶有活性位點(diǎn)蘇氨酸?；钚晕稽c(diǎn)的差異可能是枯草芽孢桿菌酶活性增加的原因。
改進(jìn)醛縮酶活性催化抗體可與天然醛縮酶一樣有效，接受廣范圍的底物，并能用于催化圖2所示反應(yīng)。
也能通過(guò)定向進(jìn)化改進(jìn)醛縮酶，例如上述用于KDPG醛縮酶的例子(與上述KHG高度同源)，KDPG醛縮酶通過(guò)DNA改組和易錯(cuò)PCR去除對(duì)磷酸鹽的需求和反轉(zhuǎn)對(duì)映選擇性。KDPG醛縮酶多肽用于生化反應(yīng)，因?yàn)樗鼈兏叨忍禺愑诠w底物(本文是丙酮酸)，但對(duì)于受體底物(即吲哚-3-丙酮酸)相對(duì)靈活(Koeller和Wong，Nature409232-9，2001)。KHG醛縮酶有縮合丙酮酸與許多羧酸的活性。認(rèn)為KHG醛縮酶的哺乳動(dòng)物形式的特異性比細(xì)菌形式更廣，包括對(duì)4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸活性較高和接受4-羥基-2-酮戊二酸的2種立體異構(gòu)體。細(xì)菌來(lái)源似乎對(duì)R立體異構(gòu)體有10倍的偏好?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)中存在將近100個(gè)KHG同系物，在假單胞菌、副球菌、普羅威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大腸桿菌和哺乳動(dòng)物組織中證明活性。這些酶能用作修改對(duì)映特異性的起始點(diǎn)，這是莫納甜生成需要的。
利用丙酮酸和另一底物的醛縮酶能“進(jìn)化”以修改多肽特異性、速度和選擇性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基團(tuán)，像吲哚。除了本文證明的KHG和ProA醛縮酶之外，這些酶的例子包括但不限于KDPG醛縮酶和相關(guān)多肽(KDPH)；來(lái)自類諾卡氏菌屬(Nocardioides sp)的轉(zhuǎn)羧基亞芐基丙酮酸水合酶-醛縮酶；4-(2-羧苯基苯基)-2-氧丁-3-烯醇鹽醛縮酶(2’-羧基亞芐基丙酮酸醛縮酶)，它縮合丙酮酸與2-羧基苯甲醛(一種含芳環(huán)的底物)；來(lái)自惡臭假單胞菌(P.Putida)和食芳香物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)的反式-O-羥基苯亞甲基丙酮酸水合酶-醛縮酶，它也利用丙酮酸和含芳族的醛作為底物；3-羥基天冬氨酸醛縮酶(赤-3-羥基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶)，它使用2-含氧酸作為底物且被認(rèn)為在生物體脫氮微球菌(Micrococcusdenitrificans)中；苯偶姻醛縮酶(苯甲醛裂合酶)，它利用含芐基的底物；二氫新蝶呤醛縮酶；L-蘇-3-苯基絲氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基絲氨酸醛縮酶)，它縮合甘氨酸與苯甲醛；4-羥基-2-氧戊酸醛縮酶；1，2-二羥基芐基丙酮酸醛縮酶和2-羥基亞芐基丙酮酸醛縮酶。
通過(guò)篩選感興趣的克隆可選擇有所需活性的多肽，使用下列方法。用表達(dá)盒上攜帶感興趣克隆的載體轉(zhuǎn)化色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型且生長(zhǎng)于含少量莫納甜或MP的培養(yǎng)基。由于轉(zhuǎn)氨酶和醛縮酶反應(yīng)是可逆的，細(xì)胞能從莫納甜的外消旋混合物生成色氨酸。類似地，通過(guò)利用MP或莫納甜作為碳源和能源的能力可篩選生物體(重組和野生型)。靶醛縮酶的一個(gè)來(lái)源是多種假單胞菌和根瘤菌菌株的表達(dá)文庫(kù)。假單胞菌有許多不尋常的分解代謝途徑用于降解芳族分子，它們也含有許多醛縮酶；而根瘤菌含有醛縮酶，已知在植物根瘤中生長(zhǎng)，有許多描述用于構(gòu)建莫納甜生物合成途徑的基因。
實(shí)施例5化學(xué)合成莫納甜前體實(shí)施例4描述的方法使用醛縮酶將吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成MP。該實(shí)施例描述另一種化學(xué)合成MP的方法。MP可用典型的醛醇類型縮合形成(圖4)。簡(jiǎn)言之，典型的醛醇類型反應(yīng)包括用強(qiáng)堿，如LDA(二異丙基酰胺鋰)、六甲基二硅氮烷鋰或丁基鋰產(chǎn)生丙酮酸酯的碳負(fù)離子。產(chǎn)生的碳負(fù)離子與吲哚-丙酮酸反應(yīng)以形成偶聯(lián)產(chǎn)物。
可用于保護(hù)吲哚氮的保護(hù)基團(tuán)包括但不限于叔丁氧基羰基(Boc)和芐氧基羰基(Cbz)。羧酸的封閉基團(tuán)包括但不限于烷基酯(例如甲基、乙基、芐基酯)。當(dāng)使用這些保護(hù)基團(tuán)時(shí)，不可能控制所形成產(chǎn)物的立體化學(xué)。然而，如果R2和/或R3是手性保護(hù)基團(tuán)(圖4)，如(S)-2-丁醇、薄荷醇或手性胺，可使一種MP對(duì)映異構(gòu)體的形成優(yōu)于另一種。
實(shí)施例6色氨酸或吲哚-3-丙酮酸轉(zhuǎn)化成莫納甜體外方法使用轉(zhuǎn)氨酶和醛縮酶2種酶，從色氨酸和丙酮酸生成莫納甜。在第1步中，α-酮戊二酸是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中來(lái)自色氨酸氨基的受體，反應(yīng)產(chǎn)生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛縮酶催化第2個(gè)反應(yīng)，其中丙酮酸在Mg2+和磷酸鹽存在時(shí)與吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)，產(chǎn)生莫納甜(MP)的α-酮衍生物，2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。轉(zhuǎn)移第1個(gè)反應(yīng)中形成的谷氨酸的氨基生成所需產(chǎn)物莫納甜。純化和表征產(chǎn)物確定形成的立體異構(gòu)體是S，S-莫納甜。描述另外的底物、酶和條件以及對(duì)此方法進(jìn)行的改進(jìn)。
酶克隆、表達(dá)和純化來(lái)自睪丸酮叢毛單胞菌的醛縮酶、4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛縮酶，proA基因)(EC 4.1.3.17)，如實(shí)施例4所述?？寺　⒈磉_(dá)和純化來(lái)自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和苜蓿根瘤菌的4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛縮酶)(EC 4.1.3.16)，如實(shí)施例4所述。
用于結(jié)合醛縮酶以生成莫納甜的轉(zhuǎn)氨酶是大腸桿菌aspC基因編碼的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、大腸桿菌tyrB基因編碼的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶、苜蓿根瘤菌TatA酶、碩大利什曼原蟲(chóng)bsat基因編碼的廣底物轉(zhuǎn)氨酶或來(lái)自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(IIa型)。如實(shí)施例1描述克隆、表達(dá)和純化非哺乳動(dòng)物蛋白。來(lái)自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(IIa型)獲得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛縮酶和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的方法1升反應(yīng)混合物中含有50mM醋酸銨，pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸鉀、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸銨、50mM色氨酸、10mMα-酮戊二酸、160mg重組睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶(未純化細(xì)胞提取物，～30％醛縮酶)、233mg重組大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(未純化細(xì)胞提取物，～40％醛縮酶)。除了酶，所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。隨后加入酶，反應(yīng)溶液30℃孵育并溫和振蕩(100rpm)3.5小時(shí)。酶加入后0.5和1小時(shí)，在反應(yīng)中加入固體色氨酸等分樣品(各50微摩爾)。所有加入的色氨酸不溶解，但濃度維持于50mM或更高。3.5小時(shí)后，濾去固體色氨酸。使用確定的色氨酸量作為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)LC/MS分析反應(yīng)混合物顯示溶液中的色氨酸濃度為60.5mM且莫納甜濃度為5.81mM(1.05g)。
下列方法用于純化終產(chǎn)物。90％的澄清溶液加到BioRad AG50W-X8樹(shù)脂柱(225mL；結(jié)合力為1.7meq/mL)上。柱用水洗，收集300mL部分，直到280nm的吸光度＜5％首先流過(guò)部分的組分。然后柱用1M醋酸銨，pH8.4洗脫，收集4個(gè)300-mL部分。所有4個(gè)部分含有莫納甜并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)到105mL，蒸發(fā)器裝有溫水浴。隨著體積減小形成沉淀且在蒸發(fā)過(guò)程中濾去。
通過(guò)LC/MS分析柱部分顯示99％色氨酸和莫納甜結(jié)合于柱。蒸發(fā)過(guò)程中形成的沉淀含有＞97％色氨酸和＜2％莫納甜。上清中色氨酸與產(chǎn)物的比例約為2∶1。
上清(7ml)應(yīng)用于100mLFast Flow DEAE瓊脂糖(Amersham Biosciences)柱，柱預(yù)先用0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸銨，pH8.4和0.5L水洗轉(zhuǎn)化成醋酸鹽形式。上清以＜2mL/分鐘上樣，柱用3-4mL/分鐘的水洗直到280nm的吸光度約為0。莫納甜用100mM醋酸銨，pH8.4洗脫，收集4個(gè)100-mL部分。
部分的分析顯示流過(guò)部分的色氨酸與莫納甜比例為85∶15且洗脫部分的比例為7∶93。假定莫納甜在280nm的消光系數(shù)與色氨酸相同，洗脫部分含有0.146毫摩爾產(chǎn)物。對(duì)于68％的回收，推斷總共1L的反應(yīng)會(huì)生成約2.4毫摩爾(約710mg)莫納甜。
來(lái)自DEAE瓊脂糖柱的洗脫部分蒸發(fā)到＜20mL。通過(guò)用C8制備級(jí)反相柱進(jìn)一步純化等分產(chǎn)物，所用色譜條件與實(shí)施例10所述用于分析-規(guī)模莫納甜特征的條件相同。Waters FractionlynxTM軟件用于在檢測(cè)m/z＝293離子基礎(chǔ)上觸發(fā)自動(dòng)分部收集莫納甜。收集來(lái)自莫納甜的相應(yīng)質(zhì)子化分子離子的C8柱的部分，蒸發(fā)到干燥，隨后溶于小體積水。此部分用于產(chǎn)物的表征。
所得產(chǎn)物用下列方法確定特征。
UV/可見(jiàn)光譜學(xué).UV/可見(jiàn)光譜測(cè)量酶法生成的莫納甜用Cary 100 Bio UV/可見(jiàn)光分光光度計(jì)完成。溶于水的純化產(chǎn)物顯示280nm的最大吸收，肩部在288nm，是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析用于莫納甜的混合物分析如實(shí)施例10所述完成，莫納甜獲得自體外生化反應(yīng)。圖5描述體外酶合成混合物中莫納甜的典型LC/MS分析。圖5的下面一組闡明莫納甜的質(zhì)子化分子離子在m/z＝293的所選離子色譜。混合物中的此莫納甜鑒定通過(guò)圖6所述質(zhì)譜確證。LC/MS分析純化產(chǎn)物顯示293的分子離子單峰和280nm的吸光度。質(zhì)譜與圖6所示相同。
MS/MS分析.如實(shí)施例10所述，也對(duì)莫納甜進(jìn)行LC/MS/MS子離子實(shí)驗(yàn)。圖7闡述莫納甜的子離子質(zhì)譜。對(duì)圖7中標(biāo)記的所有片段離子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性結(jié)構(gòu)分配。這些包括m/z＝275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳離子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳離子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳離子)、130(3-亞甲基-1H-吲哚-正碳離子)和118(吲哚正碳離子)的片段離子。如預(yù)料的，如果獲得自分子的吲哚部分，許多這些情況與MP獲得的(實(shí)施例4)相同。由于存在氨基而不是酮，一些比MP所見(jiàn)高1個(gè)質(zhì)量單位。
莫納甜的精確質(zhì)量測(cè)量.圖8闡明使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star雜合四極/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀獲得的純化莫納甜的質(zhì)譜。使用色氨酸作為內(nèi)部質(zhì)量校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)子化莫納甜的測(cè)量質(zhì)量是293.1144。在C14H17N2O5元素組成的基礎(chǔ)上，質(zhì)子化莫納甜的計(jì)算質(zhì)量是293.1137。此質(zhì)量測(cè)量誤差小于每百萬(wàn)分二(2ppm)，提供酶法生成莫納甜的元素組成的確證。
NMR光譜學(xué).NMR實(shí)驗(yàn)在Varian Inova 500MHz儀器上進(jìn)行。莫納甜樣品(～3mg)溶于0.5ml D2O。溶劑(D2O)起初用作4.78ppm的內(nèi)部參考。由于水的峰大，運(yùn)行1H-NMR，同時(shí)抑制水峰。隨后，由于水峰寬，莫納甜的C-2質(zhì)子用作參考峰，設(shè)在7.192ppm的發(fā)表值。
對(duì)于13C-NMR，幾百次掃描的初始運(yùn)行表明樣品太稀釋不能在規(guī)定時(shí)間獲得適當(dāng)13C譜。因此，進(jìn)行異核多級(jí)量子相干(HMQC)實(shí)驗(yàn)，它能使其附著的氫和碳相關(guān)，也提供碳化學(xué)位移的信息。
表1和2顯示1H和HMQC數(shù)據(jù)的概括。通過(guò)與發(fā)表值比較，NMR數(shù)據(jù)表明酶法生成的莫納甜是(S，S)、(R，R)或兩者的混合物。
手性LC/MS分析.為確定體外生成的莫納甜是一種立體異構(gòu)體而不是(R，R)和(S，S)對(duì)映異構(gòu)體的混合物，用實(shí)施例10所述儀器完成手性LC/MS分析。
用Chirobiotic T(高級(jí)分離技術(shù))手性色譜柱在室溫進(jìn)行手性LC分離。在供應(yīng)商發(fā)表的方案基礎(chǔ)上，對(duì)色氨酸的R-(D)和S-(L)立體異構(gòu)體優(yōu)化分離和檢測(cè)。LC流動(dòng)相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水；B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脫在70％A和30％b為等度。流速為1.0mL/分鐘，從200nm到400nm監(jiān)控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和莫納甜的儀器參數(shù)與實(shí)施例10所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400區(qū)的質(zhì)譜。質(zhì)子化分子離子的所選離子色譜(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+＝205且用于莫納甜的[M+H]+＝293)可直接鑒定混合物中的這些分析物。
圖9顯示R-和S-色氨酸和莫納甜的色譜，它們由手性色譜分離并通過(guò)MS監(jiān)控。莫納甜色譜中的單峰表明該化合物是一種立體異構(gòu)體，保留時(shí)間幾乎與S-色氨酸相同。
表11H-NMR數(shù)據(jù)
1Veleggaar等(J.C.S.Perrkin Trans.13095-8，1992).
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382，2002-02-26).
表213C-NMR數(shù)據(jù)(來(lái)自HMQC譜)
1Veleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.13095-8，1992).
旋光測(cè)定.在Rudolph Autopol III旋光儀上測(cè)量旋光性。莫納甜制備為14.6mg/mL的水溶液。對(duì)于1g/mL水溶液，S，S莫納甜(鹽形式)的預(yù)期比旋光([α]D20)是-49.6(Veleggaar等)。觀察到純化、酶法生成莫納甜的[α]D20為-28.1，表明它是S，S異構(gòu)體。
改進(jìn)優(yōu)化包括試劑和酶濃度的反應(yīng)條件，5-10mg/mL的產(chǎn)量用下列試劑混合物產(chǎn)生50mM醋酸銨，pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸(鈉或銨鹽)、5mMα-酮戊二酸(鈉鹽)、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達(dá)到1mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀、50μg/mL重組ProA醛縮酶(細(xì)胞提取物；總蛋白濃度為167μg/mL)、1000μg/mL大腸桿菌aspC基因編碼的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(細(xì)胞提取物；總蛋白濃度為2500μg/mL)和使?jié)舛龋?0mM的固體色氨酸(飽和；一些在整個(gè)反應(yīng)中未溶解)?；旌衔镌?0℃孵育4小時(shí)并溫和攪拌或混合。
取代α-酮戊二酸的濃度可減少到1mM并補(bǔ)充9mM天冬氨酸，莫納甜的產(chǎn)量相等。另外的氨基酸受體可用于第1個(gè)步驟，如草酰乙酸。
當(dāng)用重組碩大利什曼原蟲(chóng)廣底物轉(zhuǎn)氨酶取代大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，獲得類似的莫納甜產(chǎn)量。然而，分子量為292的第2種未鑒定產(chǎn)物(主要產(chǎn)物的3-10％)也通過(guò)LC-MS分析檢測(cè)。當(dāng)大腸桿菌tyrB編碼的酶、苜蓿根瘤菌tatA編碼的酶或來(lái)自豬心的谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(IIa型)作為轉(zhuǎn)氨酶加入時(shí)，產(chǎn)生0.1-0.5mg/mL的莫納甜濃度。當(dāng)反應(yīng)從吲哚-3-丙酮酸開(kāi)始時(shí)，還原性胺化可用于最后步驟，此步有谷氨酸脫氫酶和NADH(如實(shí)施例7)。
來(lái)自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和苜蓿根瘤菌的KHG醛縮酶也與大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶一起使用以酶法生成莫納甜。使用下列反應(yīng)條件50mM NH4-OAc pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達(dá)到0.5mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀、20μg/mL重組枯草芽孢桿菌KHG醛縮酶(純化的)、大約400μg/mL來(lái)自細(xì)胞提取物的未純化大腸桿菌L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反應(yīng)在30℃振蕩孵育30分鐘。用枯草芽孢桿菌酶法生成的莫納甜量為80ng/mL，隨著醛縮酶量增加而提高。如果用飽和量的色氨酸和5mMα-酮戊二酸取代吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸，莫納甜產(chǎn)量增加到360ng/mL。用50mMTris pH8.3中的3種30μg/mL KHG酶和飽和量的色氨酸重復(fù)反應(yīng)，進(jìn)行1小時(shí)以增加檢測(cè)。如實(shí)施例4，桿菌酶活性最高，產(chǎn)生約4000ng/mL莫納甜。大腸桿菌KHG產(chǎn)生3000ng/mL莫納甜，苜蓿根瘤菌酶產(chǎn)生2300ng/mL。
實(shí)施例7MP和莫納甜間的相互轉(zhuǎn)化MP的胺化以形成莫納甜可通過(guò)如實(shí)施例1和6鑒定的轉(zhuǎn)氨酶，或通過(guò)需要還原輔因子如NADH或NADPH的脫氫酶催化。這些反應(yīng)是可逆的且能以任何一個(gè)方向測(cè)量。當(dāng)使用脫氫酶時(shí)，方向性主要通過(guò)銨鹽的濃度控制。
脫氫酶活性。隨著NAD(P)+轉(zhuǎn)化成更發(fā)色的NAD(P)H，通過(guò)跟蹤340nm吸光度增加來(lái)監(jiān)控莫納甜的氧化脫氨。如實(shí)施例6所述酶法生成和純化莫納甜。
典型的0.2mL測(cè)定混合物含有50mM Tris-HCl，pH8.0到8.9、0.33mM NAD+或NADP+、2到22單位的谷氨酸脫氫酶(Sigma)和10-15mM底物。測(cè)定在UV-透明微量滴定板中進(jìn)行2次，用Molecular Devices SpectraMax Plus板閱讀器讀數(shù)。將酶、緩沖液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔，短暫混合后，以10秒間隔監(jiān)控340nm的吸光度增加。反應(yīng)在25℃孵育10分鐘。不加入底物作為負(fù)對(duì)照，谷氨酸用作正對(duì)照。來(lái)自牛肝的III型谷氨酸脫氫酶(Sigma #G-7882)催化莫納甜轉(zhuǎn)化為莫納甜前體，轉(zhuǎn)化率約為谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸的百分之一。
轉(zhuǎn)氨活性.用來(lái)自大腸桿菌的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)、來(lái)自大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrB)、來(lái)自碩大利什曼原蟲(chóng)的廣底物轉(zhuǎn)氨酶(BSAT)和2個(gè)實(shí)施例1所述可商業(yè)購(gòu)買的豬谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行莫納甜轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作為氨基受體測(cè)試。實(shí)驗(yàn)混合物含有(0.5mL中)50mM Tris-HCl，pH8.0、0.05mM PLP、5mM氨基受體、5mM莫納甜和25μg轉(zhuǎn)氨酶。實(shí)驗(yàn)物在30℃孵育30分鐘，通過(guò)加入0.5mL異丙醇終止反應(yīng)。莫納甜損失通過(guò)LC/MS監(jiān)控(實(shí)施例10)。注意到以草酰乙酸作為氨基受體的碩大利什曼原蟲(chóng)BSAT活性量最高，接著是以α-酮戊二酸作為氨基受體的相同酶。草酰乙酸的相對(duì)活性是BSAT＞AspC＞豬IIa型＞豬I型＝TyrB。α-酮戊二酸的相對(duì)活性是BSAT＞AspC＞豬I型＞豬IIa型＞TyrB。
實(shí)施例8從色氨酸和除了丙酮酸的C3來(lái)源生成莫納甜如上面實(shí)施例6所述，吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能轉(zhuǎn)化成莫納甜，使用丙酮酸作為C3分子。然而，在一些情況中，丙酮酸可能不是理想的原料。例如，丙酮酸可能比其它C3碳源昂貴，或如果加入培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵有不利影響。
丙氨酸可通過(guò)許多PLP-酶轉(zhuǎn)氨以產(chǎn)生丙酮酸。
色氨酸酶樣酶進(jìn)行β-消除反應(yīng)的速度快于其它PLP酶如轉(zhuǎn)氨酶。來(lái)自此類別(4.1.99.-)的酶能從氨基酸(如L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有良好離去基團(tuán)的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-絲氨酸、O-芐基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-芐基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-?；?L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸)產(chǎn)生氨和丙酮酸。
可通過(guò)根據(jù)Mouratou等(J.Biol.Chem 2741320-5，1999)的方法使β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶突變，改進(jìn)用EC 4.1.99.-多肽生成莫納甜的方法。Mouratou等描述將β-酪氨酸酶轉(zhuǎn)化成二羧氨基酸β-裂合酶的能力，此裂合酶沒(méi)有報(bào)導(dǎo)在自然界中產(chǎn)生。通過(guò)使纈氨酸(V)283轉(zhuǎn)化成精氨酸(R)和精氨酸(R)100變成蘇氨酸(T)來(lái)完成特異性變化。這些氨基酸變化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脫氨反應(yīng)(如天冬氨酸)。因此，天冬氨酸也能用作丙氨酸的來(lái)源用于隨后的醛醇縮合反應(yīng)。
另外，能提供乳酸和將乳酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸的酶的細(xì)胞或酶反應(yīng)器。能催化此反應(yīng)的酶的例子包括乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶。
反應(yīng)混合物包括50mM Tris-Cl pH8.3、2mM MgCl2、200mM C3碳源、5mMα-酮戊二酸、鈉鹽、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后達(dá)到0.5mL終體積的脫氣水、3mM磷酸鉀pH7.5、25μg如實(shí)施例4制備的粗重組睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶、500μg如實(shí)施例1制備的粗L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)、使?jié)舛龋?0mM的固體色氨酸(飽和；一些在整個(gè)反應(yīng)中未溶解)。反應(yīng)混合物在30℃混合孵育30分鐘。提供絲氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作為3-碳源。用或不用能進(jìn)行β-消除反應(yīng)和β-裂合酶反應(yīng)(色氨酸酶(TNA)的二級(jí)PLP酶(純化的)、雙突變體色氨酸酶、β-酪氨酸酶(TPL))進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果示于表3
表3用另外的C3-碳源產(chǎn)生莫納甜
從作為3-碳源的丙氨酸和絲氨酸產(chǎn)生的莫納甜通過(guò)LC/MS/MS子掃描分析確認(rèn)，與實(shí)施例6中產(chǎn)生的莫納甜特征相同。丙氨酸是測(cè)試的最佳選擇之一，通過(guò)AspC酶轉(zhuǎn)氨。產(chǎn)生的莫納甜量通過(guò)加入色氨酸酶而增加，色氨酸酶能作為二級(jí)活性轉(zhuǎn)氨。通過(guò)加入色氨酸酶，用絲氨酸作為碳源產(chǎn)生的莫納甜量幾乎加倍，即使與轉(zhuǎn)氨酶相比僅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC可有一些單獨(dú)的β-消除活性的量。天冬氨酸的結(jié)果表明色氨酸酶對(duì)天冬氨酸的活性不隨著定點(diǎn)誘變?cè)黾?，定點(diǎn)誘變與前面β-酪氨酸酶提示的相同。預(yù)期突變體β-酪氨酸酶具有產(chǎn)生莫納甜的較高活性。
實(shí)施例9化學(xué)合成莫納甜丙氨酸與吲哚-3-丙酮酸加成生成莫納甜，此反應(yīng)能用Grignard或有機(jī)鋰試劑合成進(jìn)行。
例如，鎂在無(wú)水條件下加入3-氯-或3-溴-丙氨酸，3-氯或3-溴-丙氨酸在羧基和氨基被適當(dāng)封閉。隨后加入吲哚-3-丙酮酸(適當(dāng)封閉)以形成結(jié)合產(chǎn)物，接著去除保護(hù)基團(tuán)以形成莫納甜。特別有用的保護(hù)基團(tuán)包括THP(四氫吡喃醚)，它易附著和去除。
實(shí)施例10檢測(cè)色氨酸莫納甜和MP
該實(shí)施例描述的方法用于檢測(cè)莫納甜或其前體2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸的存在。
LC/MS分析用Waters/Micromass液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)儀器進(jìn)行用于體外或體內(nèi)生化反應(yīng)獲得的莫納甜、MP和/或色氨酸的混合物分析，該儀器包括Waters 2690液相色譜，裝有Waters 996光電二極管陣列(PDA)吸光度監(jiān)控器，串聯(lián)置于色譜與Micromass Quattro Ultima三重四極質(zhì)譜儀間。用Supelco Discovery C18反相色譜柱，2.1mm×150mm或Xterra MS C8反相色譜柱，2.1mm×250mm室溫進(jìn)行LC分離。LC流動(dòng)相包括A)含0.05％(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05％(v/v)三氟醋酸的甲醇。
梯度洗脫是從5％B到35％B線性，0-9分鐘，從35％B到90％B線性，9-16分鐘，在90％B等度，16-120分鐘，從90％B到5％B線性，20-22分鐘，運(yùn)行間有10分鐘再平衡階段。流速是0.25mL/分鐘，從200nm到4000nm監(jiān)控PDA吸光度。所有ESI-MS參數(shù)是基于產(chǎn)生感興趣分析物的質(zhì)子化分子離子([M+H]+)、生成特征性片段離子基礎(chǔ)上優(yōu)化和選擇的。
下列儀器參數(shù)用于莫納甜的LC/MS分析毛細(xì)管3.5kV；圓錐40V；六角形(Hex)120V；孔徑0V；六角形(Hex) 20V；來(lái)源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質(zhì)量分辨率(Q1)15.0；高質(zhì)量分辨率(Q1)15.0；離子能量0.2；進(jìn)入50V；碰撞能量2；出口50V；低質(zhì)量分辨(Q2)15；高質(zhì)量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。報(bào)導(dǎo)的質(zhì)量/電荷比(m/z)和分子量的不確定性為±0.01％?；旌衔镏心{甜α-酮酸形式(MP)和莫納甜的初始檢測(cè)用LC/MS監(jiān)控完成，收集m/z150-400區(qū)的質(zhì)譜。質(zhì)子化分子離子的所選離子色譜(用于MP的[M+H]+292，用于莫納甜的[M+H]+＝293)可直接鑒定混合物中的這些分析物。
MS/MS分析如下對(duì)莫納甜進(jìn)行LC/MS/MS子離子實(shí)驗(yàn)。子離子分析包括將感興趣的母離子(如對(duì)于莫納甜，m/z＝293)從第1個(gè)質(zhì)量分析器(Q1)傳送到質(zhì)譜的碰撞細(xì)胞，其中導(dǎo)入氬并使母離子化學(xué)解離成片段(子)離子。隨后用第2個(gè)質(zhì)量分析器(Q2)檢測(cè)這些片段離子，它們可用于確證母離子結(jié)構(gòu)分配。
下列儀器參數(shù)用于LC/MS/MS分析莫納甜毛細(xì)管3.5kV；圓錐40V；Hex 120V；孔徑0V；Hex 20V；來(lái)源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體50L/h；低質(zhì)量分辨(Q1)15.0；高質(zhì)量分辨(Q1)15.0；離子能量0.2；進(jìn)入-5V；碰撞能量14；出口1V；低質(zhì)量分辨(Q2)15；高質(zhì)量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)3.5；倍增器650。
高通量測(cè)定莫納甜和色氨酸用上述儀器高通量分析(＜5分鐘/樣品)莫納甜和色氨酸的混合物，莫納甜和色氨酸來(lái)源于體外和體內(nèi)反應(yīng)，參數(shù)與LC/MS/MS所述相同。LC分離用4.6mm×50mmAdvanced Separation Technologies Chirobiotic T柱在室溫進(jìn)行。LC流動(dòng)相為A)含0.25％乙酸的水；B)含0.25％乙酸的甲醇。用50％B等度洗脫0-5分鐘。流速為0.6mL/min。優(yōu)化ESI-MS/MS系統(tǒng)的所有參數(shù)，并基于色氨酸和內(nèi)標(biāo)2H5-色氨酸的質(zhì)子化分子離子的最佳來(lái)源產(chǎn)生、以及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)實(shí)驗(yàn)中碰撞誘導(dǎo)的氨基酸特異性片段離子的產(chǎn)生進(jìn)行選擇。下列儀器參數(shù)用于LC/MS/MS分析莫納甜和色氨酸毛細(xì)管3.5kV；圓錐20V；Hex 115V；孔徑1V；Hex 20V；來(lái)源溫度100℃；去溶劑化溫度350℃；去溶劑化氣體500L/h；圓錐氣體40L/h；低質(zhì)量分辨(Q1)12.0；高質(zhì)量分辨(Q1)12.0；離子能量0.2；進(jìn)入-5V；碰撞能量14；出口1V；低質(zhì)量分辨(Q2)15；高質(zhì)量分辨(Q2)15；離子能量(Q2)0.5；倍增器650。MRM參數(shù)信道間延遲0.03s；中間掃描延遲0.03s；停留0.05s。
莫納甜的精確質(zhì)量測(cè)量使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star雜合四極/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行高分辨MS分子。使用色氨酸作為內(nèi)部質(zhì)量校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量質(zhì)子化莫納甜的質(zhì)量。在C14H17N2O5元素組成的基礎(chǔ)上，質(zhì)子化莫納甜的計(jì)算質(zhì)量是293.1137。用實(shí)施例A描述的生物催化法制得的莫納甜的測(cè)量質(zhì)量為293.1144。此質(zhì)量測(cè)量誤差小于每百萬(wàn)分二(2ppm)，提供酶法生成莫納甜的元素組成的確證。
實(shí)施例11在細(xì)菌中產(chǎn)生莫納甜該實(shí)施例描述的方法用于在大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生莫納甜。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解類似方法可用于在其它細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生莫納甜。此外，可使用含莫納甜合成途徑中其它基因(圖2)的載體。
極限培養(yǎng)基Trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基用于增加大腸桿菌細(xì)胞中的色氨酸產(chǎn)量(Zeman等，F(xiàn)olia Microbiol.35200-4，1990)，此培養(yǎng)基如下制備。在700mL納米純水中加入下列試劑2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO47H2O、0.01g CaCl2*2H2O和0.5mg FeSO4*7H2O。pH調(diào)至7.0，體積增加到850mL，培養(yǎng)基高壓滅菌。單獨(dú)制備50％葡萄糖溶液并無(wú)菌過(guò)濾。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(850mL)中加入40ml，終體積1L。
在0.1M磷酸鈉pH7中制備10g/L L-色氨酸溶液并無(wú)菌過(guò)濾。通常加入十分之一體積到下面特定的培養(yǎng)物中。還制備了10％丙酮酸鈉溶液并無(wú)菌過(guò)濾。每升培養(yǎng)物通常使用10mL等分樣品。制備氨芐青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)貯存液，無(wú)菌過(guò)濾，使用前-20℃貯存。吐溫20(聚氧乙烯20-單月桂酸山梨聚糖)以0.2％(體積/體積)終濃度使用。氨芐青霉素以非致死濃度使用，通常為1-10μg/mL終濃度。
在含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上制備大腸桿菌BL21(DE3)睪丸酮叢毛單胞菌proA/pET30 Xa/LIC的新鮮平板(實(shí)施例4中描述)。從單菌落中接種過(guò)夜培養(yǎng)物(5mL)且30℃在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通常，1到50個(gè)接種物用于trp-1+葡萄糖培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)。加入新鮮抗生素到50mg/L的終濃度。誘導(dǎo)前，搖瓶在37℃生長(zhǎng)。
每小時(shí)細(xì)胞取樣，直到獲得0.35-0.8的OD600。隨后用0.1mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞，溫度降到34℃。誘導(dǎo)前(0時(shí)間點(diǎn))收集樣品(1ml)并5000xg離心。上清在-20℃冷凍用于LC/MS分析。誘導(dǎo)后4小時(shí)，收集另外的1mL樣品，離心以從細(xì)胞沉淀中分離培養(yǎng)液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸鈉、氨芐青霉素和吐溫。
誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)48小時(shí)，另取1mL樣品且如上制備。在48小時(shí)，加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生長(zhǎng)約70小時(shí)后(誘導(dǎo)后)，3500rpm 4℃離心整個(gè)培養(yǎng)物體積20分鐘。輕輕倒出上清，培養(yǎng)液和細(xì)胞都在-80℃冷凍。過(guò)濾培養(yǎng)液部分并通過(guò)LC/MS分析。如實(shí)施例10所述監(jiān)控[M+H]+＝293峰的高度和面積。減去培養(yǎng)基的背景水平。數(shù)據(jù)也對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)化，這是通過(guò)繪出[M+H]+＝293峰的高度圖，峰高除以培養(yǎng)物在600nm的光密度。
當(dāng)丙酮酸、氨芐青霉素和吐溫在誘導(dǎo)后4小時(shí)而不是誘導(dǎo)時(shí)加入時(shí)，產(chǎn)生較高水平的莫納甜。其它添加物如PLP、另外的磷酸鹽或MgCl2不增加莫納甜產(chǎn)量。當(dāng)使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸時(shí)且當(dāng)色氨酸在誘導(dǎo)后而不是接種或誘導(dǎo)時(shí)加入時(shí)，獲得較高效價(jià)的莫納甜。誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后4小時(shí)(底物加入時(shí))，發(fā)酵液或細(xì)胞提取物中通常沒(méi)有可檢測(cè)水平的莫納甜。負(fù)對(duì)照僅用有pET30a載體的細(xì)胞以及培養(yǎng)物進(jìn)行，培養(yǎng)物中不加入色氨酸和丙酮酸。母體(parent)MS掃描證明(m+1)/z＝293的化合物不來(lái)源于較大分子，子掃描(如實(shí)施例10進(jìn)行)類似于體外產(chǎn)生的莫納甜。
用0、0.2％(體積/體積)和0.6％終濃度吐溫-20研究吐溫的效果。0.2％吐溫?fù)u瓶產(chǎn)生最高量的莫納甜。氨芐青霉素濃度在0和10μg/mL間變化。在0-1μg/mL間細(xì)胞培養(yǎng)液中的莫納甜量迅速增加(2.5倍)，當(dāng)氨芐青霉素濃度從1增加到10μg/mL時(shí)，莫納甜量增加1.3倍。
顯示典型結(jié)果的時(shí)程實(shí)驗(yàn)示于圖10。甚至當(dāng)值對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液的莫納甜量增加。通過(guò)使用色氨酸的摩爾消光系數(shù)，培養(yǎng)液中的莫納甜量估計(jì)小于10μg/mL。用不含proA插入的載體的細(xì)胞重復(fù)相同實(shí)驗(yàn)。許多數(shù)字為負(fù)，表明這些培養(yǎng)物中m/z＝293的峰高度小于單獨(dú)培養(yǎng)基中的峰高度(圖10)。當(dāng)色氨酸和丙酮酸缺乏時(shí)，數(shù)字一致較低，證明莫納甜生成是醛縮酶催化酶反應(yīng)的結(jié)果。
在800mL搖瓶實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐中重復(fù)細(xì)菌細(xì)胞中的莫納甜體內(nèi)生成。通過(guò)陰離子交換層析和制備級(jí)反相液相色譜純化250mL莫納甜樣品(在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液中)。蒸發(fā)此樣品，用于高分辨質(zhì)量分析(如實(shí)施例6所述)。高分辨MS表明生成的代謝物是莫納甜。
體外測(cè)定說(shuō)明轉(zhuǎn)氨酶需要以高于醛縮酶的水平存在(參見(jiàn)實(shí)施例6)，因此來(lái)自大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)合醛縮酶基因超量表達(dá)，以增加產(chǎn)生的莫納甜量。設(shè)計(jì)引物以將睪丸酮叢毛單胞菌proA導(dǎo)入有aspC/pET30 Xa/LIC的操縱子，引物如下5’引物ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO67)和3’引物CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQ ID NO68)。5’引物包含BamHI位點(diǎn)，3’引物包含SalI位點(diǎn)，用于克隆。PCR如實(shí)施例4所述進(jìn)行并凝膠純化。aspC/pET30 Xa/LIC構(gòu)建物用BamHI和SalI消化，PCR產(chǎn)物也如此。消化物用Qiagen自旋柱純化。根據(jù)廠商說(shuō)明用RocheRapid DNA連接試劑盒(Indianapolis，IN)將proA PCR產(chǎn)物連接到載體。用Novablues Singles(Novagen)進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，如實(shí)施例1所述。菌落在含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)且質(zhì)粒DNA用Qiagen spin miniprep試劑盒純化。通過(guò)限制酶消化分析篩選克隆并由Seqwright(Houston，TX)確定序列。構(gòu)建物亞克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。proA/pET30Xa/LIC構(gòu)建物也轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)pLysS。
在上述標(biāo)準(zhǔn)條件下初始比較BLR(DE3)搖瓶樣品，證明加入第2個(gè)基因(aspC)使產(chǎn)生的莫納甜量提高7倍。為加速生長(zhǎng)，使用BL21(DE3)-衍生宿主菌株。proA克隆和2個(gè)基因操縱子克隆在上面的Trp-1培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，pLysS宿主也有加入培養(yǎng)基的氯霉素(34mg/L)。加入或不加入0.2％吐溫-20和1mg/L氨芐青霉素，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。用體外生成的純化莫納甜作為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算培養(yǎng)液中的莫納甜量。SRM分析如實(shí)施例10所述進(jìn)行。在0、4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞取樣。
結(jié)果示于表4，顯示培養(yǎng)液中生成的最大量。在大多數(shù)情況下，2個(gè)基因構(gòu)建物產(chǎn)生的值高于單獨(dú)proA構(gòu)建物。細(xì)胞包膜更易滲漏的pLysS菌株分泌的莫納甜水平較高，盡管這些菌株通常以較慢的速度生長(zhǎng)。加入吐溫和氨芐青霉素是有益的。
表4大腸桿菌產(chǎn)生的莫納甜量
實(shí)施例12酵母中莫納甜的產(chǎn)生該實(shí)施例描述用于在真核細(xì)胞中生成莫納甜的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解類似方法可用于在任何感興趣細(xì)胞中生成莫納甜。此外，除了該實(shí)施例所述的那些基因，還可另外或額外使用其它基因(例如圖2所列)。
pESC酵母抗原表位標(biāo)記載體系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)用于克隆和表達(dá)大腸桿菌aspC和睪丸酮叢毛單胞菌proA基因入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC載體含有相反鏈上的GAL1和GAL10啟動(dòng)子，有2個(gè)不同多克隆位點(diǎn)，可同時(shí)表達(dá)2個(gè)基因。pESC-His載體也含有His3基因用于互補(bǔ)宿主(YPH500)中的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。GAL1和GAL10啟動(dòng)子受葡萄糖抑制且由半乳糖誘導(dǎo)；Kozak序列用于在酵母中最佳表達(dá)。pESC載體是穿梭載體，能在大腸桿菌中產(chǎn)生初始構(gòu)建物(具有bla基因用于選擇)；然而，多克隆位點(diǎn)中沒(méi)有細(xì)菌核糖體結(jié)合部位。
設(shè)計(jì)下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位點(diǎn)加下劃線，Kozak序列粗體顯示)aspC(BamHI/SalI)，GAL15’CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3’(SEQ ID NO69)和5’-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ IDNO70)。proA(EcoRI/NotI)，GAL105’-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO71)和5’GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3’(SEQ ID NO72)。
由于導(dǎo)入Kozak序列，兩種成熟蛋白的第2個(gè)密碼子從芳族氨基酸變成纈氨酸。用來(lái)自實(shí)施例1和實(shí)施例4所述克隆的pET30Xa/LIC miniprep DNA作為模板擴(kuò)增感興趣的基因。使用Eppendorf Master循環(huán)梯度熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR，和下列用于50μL反應(yīng)的方案1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U擴(kuò)增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1X ExpandTM緩沖液。所用熱循環(huán)儀程序包括94℃5分鐘的熱啟動(dòng)，接著是29個(gè)下列步驟的重復(fù)94℃30秒，50℃1分鐘45秒，72℃2分鐘15秒。29個(gè)重復(fù)后，樣品在72℃維持10分鐘，隨后于4℃貯存。純化PCR產(chǎn)物是通過(guò)在1％TAE-瓊脂糖凝膠上分離，接著用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)回收。
pESC-His載體DNA(2.7μg)如上用BamHI/SalI消化并凝膠純化。用BamHI/SalI消化aspC PCR產(chǎn)物并用QIAquick PCR純化柱純化。用Roche迅速DNA連接試劑盒根據(jù)廠商的方案進(jìn)行連接。根據(jù)廠商的說(shuō)明，使用附加脈沖控制器的Biorad基因脈沖器II在0.2cm Biorad一次性小杯中將脫鹽的連接物電穿孔入40μl ElectromasxDH10B感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)中。在1mL SOC培養(yǎng)基中恢復(fù)1小時(shí)后，轉(zhuǎn)化子平板培養(yǎng)于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。用于克隆的質(zhì)粒DNA制品用QIAprepSpin Miniprep試劑盒完成。質(zhì)粒DNA通過(guò)限制酶切消化篩選，用設(shè)計(jì)用于載體的引物測(cè)序(Seqwright)以確認(rèn)。
aspC/pESC-His克隆用EcoRI和NotI消化，proA PCR產(chǎn)物也如此。DNA如上純化和連接。2個(gè)基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入DH10B細(xì)胞中并通過(guò)限制酶切消化和DNA測(cè)序篩選。
使用S.c.EasyCompTM轉(zhuǎn)化試劑盒(Invitrogen)將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化入釀酒酵母菌株YPH500。轉(zhuǎn)化反應(yīng)物鋪在含2％葡萄糖的SC-His極限培養(yǎng)基(Invitrogen pYES2手冊(cè))上。通過(guò)菌落PCR用上面的PCR引物篩選單獨(dú)酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀細(xì)胞(2μl)懸浮于20μL含1μl酶解酶的Y-裂解緩沖液(Zymo Research)并于37℃加熱10分鐘。隨后4μL此懸浮液用于50μL PCR反應(yīng)，使用上述PCR反應(yīng)混合物和程序。
5mL培養(yǎng)物在SC-His+葡萄糖中30℃和225rpm生長(zhǎng)過(guò)夜。逐步調(diào)整細(xì)胞在棉子糖上生長(zhǎng)以便將半乳糖誘導(dǎo)前的延滯期減至最小。生長(zhǎng)約12小時(shí)后，測(cè)量600nm的吸光度，旋下適當(dāng)體積的細(xì)胞且重懸浮于新鮮SC-His培養(yǎng)基中產(chǎn)生0.4的OD。連續(xù)使用下列碳源1％棉子糖+1％葡萄糖，0.5％葡萄糖+1.5％棉子糖，2％棉子糖和最后的1％棉子糖+2％半乳糖用于誘導(dǎo)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)約16小時(shí)后，50mL培養(yǎng)物分成雙份25mL培養(yǎng)物，下列僅加入其中一份(終濃度)1g/L L-色氨酸、5mM磷酸鈉pH7.1、1g/L丙酮酸鈉、1mMMgCl2。來(lái)自非誘導(dǎo)培養(yǎng)基和來(lái)自加入莫納甜途徑的底物之前16小時(shí)培養(yǎng)液和細(xì)胞沉淀的樣品保存作為負(fù)對(duì)照。此外，僅含功能性aspC基因(和截短的proA基因)的構(gòu)建物用作另一種負(fù)對(duì)照。細(xì)胞可在誘導(dǎo)后總共生長(zhǎng)69小時(shí)。酵母細(xì)胞偶爾在較低OD誘導(dǎo)，僅在加入色氨酸和丙酮酸前生長(zhǎng)4小時(shí)。然而，這些莫納甜底物似乎抑制生長(zhǎng)且在較高OD加入更有效。
來(lái)自培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀用5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)每克(濕重)細(xì)胞遵循廠商的方案裂解，加入前面例子所述的蛋白酶抑制劑和benzonase核酸酶。過(guò)濾培養(yǎng)液和細(xì)胞提取物并通過(guò)SRM分析，如實(shí)施例10所述。使用此方法，培養(yǎng)液樣品中沒(méi)有檢測(cè)到莫納甜，表明細(xì)胞不能在這些條件下分泌莫納甜。這些條件下的質(zhì)子動(dòng)力可能不足或一般的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)子可用色氨酸飽和。蛋白表達(dá)水平不能用SDS-PAGE檢測(cè)變化。
當(dāng)色氨酸和丙酮酸加入培養(yǎng)基時(shí)，可在具有2個(gè)功能基因的培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物中短暫檢測(cè)到莫納甜(約60μg/mL)。任何負(fù)對(duì)照細(xì)胞提取物中不能檢測(cè)到莫納甜。用4.4mg/mL總蛋白(約為通常用于大腸桿菌細(xì)胞提取物的兩倍)進(jìn)行2次莫納甜的體外測(cè)定，使用實(shí)施例6所述的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。加入32μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶或400μg/mL AspC轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)，以確定哪個(gè)酶在細(xì)胞提取物中是限制性的。不加入酶或僅加入AspC轉(zhuǎn)氨酶(沒(méi)有酶時(shí)在某種程度上可發(fā)生醛醇縮合)作為負(fù)對(duì)照。正對(duì)照用部分純化的酶(30-40％)進(jìn)行，使用16μg/mL醛縮酶和400μg/mL轉(zhuǎn)氨酶。
SRM分析體外結(jié)果。細(xì)胞提取物分析顯示當(dāng)色氨酸在誘導(dǎo)后加入培養(yǎng)基時(shí)，它被有效轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞中，使色氨酸水平比沒(méi)有另外加入色氨酸的高2個(gè)數(shù)量級(jí)。體外莫納甜的分析結(jié)果示于表5(數(shù)字表示ng/mL)。
表5用酵母細(xì)胞提取物產(chǎn)生莫納甜
用加入或不加入底物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的全二基因構(gòu)建物細(xì)胞提取物獲得陽(yáng)性結(jié)果。這些結(jié)果與正對(duì)照相比，表明酶表達(dá)水平接近酵母中1％的總蛋白。當(dāng)aspC構(gòu)建物(截短的proA)的細(xì)胞提取物用醛縮酶測(cè)定時(shí)，產(chǎn)生的莫納甜量顯著大于單獨(dú)細(xì)胞提取物測(cè)定，表明重組AspC轉(zhuǎn)氨酶包含約1-2％酵母總蛋白。由于細(xì)胞中存在天然轉(zhuǎn)氨酶，用醛縮酶測(cè)定時(shí)未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的細(xì)胞提取物有小量活性。當(dāng)用AspC轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定時(shí)，來(lái)自未誘導(dǎo)細(xì)胞的提取物活性增加到用AspC的負(fù)對(duì)照生成的莫納甜量(大約200ng/ml)。相反，補(bǔ)充轉(zhuǎn)氨酶時(shí)二基因構(gòu)建物細(xì)胞提取物測(cè)定中觀察到的活性增加大于加入醛縮酶時(shí)觀察到的活性。由于2個(gè)基因都應(yīng)以相同水平表達(dá)，表明當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶水平高于醛縮酶水平時(shí)，產(chǎn)生的莫納甜量最大，與實(shí)施例6所示結(jié)果一致。
加入丙酮酸和色氨酸不僅抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而且也明顯抑制蛋白表達(dá)。加入pESC-Trp質(zhì)粒可用于糾正YPH500宿主細(xì)胞的色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，是一種提供色氨酸而對(duì)生長(zhǎng)、表達(dá)和分泌效果更少的方法。
實(shí)施例13采用偶聯(lián)反應(yīng)改進(jìn)酶方法理論上，如果沒(méi)有副反應(yīng)或底物降解或產(chǎn)生中間體，從圖1所述酶反應(yīng)中形成的最大產(chǎn)物量直接與各反應(yīng)的平衡常數(shù)、色氨酸和丙酮酸的濃度成比例。色氨酸不是高度可溶的底物，大于200mM的丙酮酸濃度似乎對(duì)產(chǎn)量有負(fù)作用(參見(jiàn)實(shí)施例6)。
理想地，莫納甜濃度相對(duì)于底物最大化以降低分離成本?？蛇M(jìn)行物理分離，這樣莫納甜從反應(yīng)混合物中取出，防止逆反應(yīng)發(fā)生。原料和催化劑可隨后再生。由于莫納甜的大小、電荷和疏水性與一些試劑和中間體類似，物理分離困難，除非對(duì)莫納甜的親和性高(如親和層析技術(shù))。然而，莫納甜反應(yīng)可偶聯(lián)其它反應(yīng)，這樣系統(tǒng)的平衡向莫納甜生成移動(dòng)。以下是改進(jìn)莫納甜產(chǎn)量的方法的例子，莫納甜獲得自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
采用草酰乙酸脫羧酶(EC 4.1.1.3)的偶聯(lián)反應(yīng)圖11是反應(yīng)的說(shuō)明。色氨酸氧化酶和過(guò)氧化氫酶用于在吲哚-3-丙酮酸生成的方向驅(qū)動(dòng)反應(yīng)。過(guò)氧化氫酶過(guò)量使用，因而過(guò)氧化氫不能在逆方向中起作用或者損害酶或中間體。氧在過(guò)氧化氫酶反應(yīng)期間再生。另外，吲哚-3-丙酮酸可用作底物。
天冬氨酸用作MP胺化的氨基供體，使用天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。理想地，與MP對(duì)莫納甜反應(yīng)相比，使用對(duì)色氨酸/吲哚-3-丙酮酸反應(yīng)特異性低的轉(zhuǎn)氨酶，這樣天冬氨酸不用于再胺化吲哚-3-丙酮酸?？杉尤氩蒗Ｒ宜崦擊让?來(lái)自假單胞菌屬)以將草酰乙酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸和二氧化碳。由于CO2是揮發(fā)性的，它不能用于與酶反應(yīng)，減少或防止逆反應(yīng)。此步驟中產(chǎn)生的丙酮酸也能用于醛醇縮合反應(yīng)?？墒褂闷渌擊让?，已知同系物存在于伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、風(fēng)產(chǎn)液菌(Aquifex aeolicus)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、幾種博德特氏菌(Bordetella)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、微溫綠菌(Chlorobium tepidum)、橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)、糞腸球菌(Enterococcus.faecalis)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、磁球菌(Magnetocuccus)MC-1、溶血曼海米亞菌(Mannheimiahaemolytica)、鞭毛甲基桿菌KT(Methylobacillus flagellatus KT)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella Multocida)Pm70、微熱石袍菌(Petrotoga miotherma)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、幾種假單胞菌、幾種火球菌(Pyrococcus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、幾種沙門氏菌(Salmonella)、幾種鏈球菌(Streptococcus)、微溫?zé)嶂?Thermochromatium tepidum)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、梅毒密螺旋體(Treponema pallidum)和幾種弧菌(Vibrio)。
用來(lái)自大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspC)、來(lái)自大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrB)、來(lái)自碩大利什曼原蟲(chóng)的廣底物轉(zhuǎn)氨酶(BSAT)和2個(gè)實(shí)施例1所述可商業(yè)購(gòu)買的豬谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行色氨酸轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作為氨基受體測(cè)試。比較用莫納甜的活性(實(shí)施例7)相對(duì)用色氨酸的活性的比例，用于確定哪一個(gè)酶對(duì)莫納甜轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的特異性最高。這些結(jié)果表明莫納甜反應(yīng)相對(duì)于色氨酸反應(yīng)特異性最高的酶是豬II-A型谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶GOAT(Sigma G7005)。此特異性不取決于使用的氨基受體。因此，此酶用于具有草酰乙酸脫羧酶的偶聯(lián)反應(yīng)。
從吲哚-3-丙酮酸起始的典型反應(yīng)包括(終濃度)50mM Tris-Cl pH7.3、6mM吲哚-3-丙酮酸、6mM丙酮酸鈉、6mM天冬氨酸、0.05mM PLP、3mM磷酸鉀、3mM MgCl2、25μg/mL轉(zhuǎn)氨酶、50μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶和3單位/mL脫羧酶(SigmaO4878)。反應(yīng)可在26℃進(jìn)行1小時(shí)。在一些情況中，省略脫羧酶或用α-酮戊二酸取代天冬氨酸(作為負(fù)對(duì)照)。也測(cè)試上述取代GOAT的轉(zhuǎn)氨酶以證實(shí)早期特異性實(shí)驗(yàn)。過(guò)濾樣品并通過(guò)LC/MS分析，如實(shí)施例10所述。結(jié)果證明GOAT酶法生成最高量的莫納甜每mg蛋白，而產(chǎn)生最少量的色氨酸作為副產(chǎn)物。此外，加入脫羧酶可增加2-3倍。與其它轉(zhuǎn)氨酶相比，大腸桿菌AspC酶也生成大量莫納甜。
提高莫納甜產(chǎn)量是通過(guò)1)定期加入2mM吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和天冬氨酸(每半小時(shí)到1小時(shí))，2)在厭氧環(huán)境中或用脫氣緩沖液進(jìn)行反應(yīng)，3)允許反應(yīng)過(guò)夜進(jìn)行和4)使用沒(méi)有多次凍融的新鮮制備的脫羧酶。丙酮酸濃度＞12mM會(huì)抑制脫羧酶。吲哚-3-丙酮酸濃度高于4mM時(shí)，與吲哚-3-丙酮酸的副反應(yīng)加速。如果也增加醛縮酶量，用于反應(yīng)的吲哚-3-丙酮酸量可增加。發(fā)現(xiàn)高水平的磷酸鹽(50mM)和天冬氨酸(50mM)抑制脫羧酶。在1小時(shí)反應(yīng)中，加入的脫羧酶量能減少到0.5U/mL，而莫納甜產(chǎn)量沒(méi)有降低。當(dāng)溫度從26℃提高到30℃和從30℃提高到37℃時(shí)，產(chǎn)生的莫納甜量增加；然而，37℃時(shí)吲哚-3-丙酮酸的副反應(yīng)也加速。生成的莫納甜量隨著pH從7增加到7.3而增大，且從pH 7.3-7.8相對(duì)穩(wěn)定。
從色氨酸起始的典型反應(yīng)包括(終濃度)50mM Tris-Cl pH7.3、20mM色氨酸、6mM天冬氨酸、6mM丙酮酸鈉、0.05mM PLP、3mM磷酸鉀、3mM MgCl2、25μg/mL轉(zhuǎn)氨酶、50μg/mL睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶和4單位/mL脫羧酶、5-200mU/mL L-氨基酸氧化酶(Sigma A-2805)、168U/mL過(guò)氧化氫酶(Sigma C-3515)和0.008mg FAD。反應(yīng)可在30℃進(jìn)行30分鐘。加入脫羧酶觀察到改進(jìn)。當(dāng)使用50mU/mL氧化酶時(shí)，產(chǎn)生最大量的莫納甜。改進(jìn)類似于當(dāng)吲哚-3-丙酮酸用作底物時(shí)觀察到的。此外，當(dāng)1)色氨酸水平低(即低于轉(zhuǎn)氨酶的Km且因此不能與MP競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn))和2)氧化酶與醛縮酶和轉(zhuǎn)氨酶的比例維持在不能積聚吲哚-3-丙酮酸的水平時(shí)，產(chǎn)生的莫納甜量增加。
無(wú)論從吲哚-3-丙酮酸還是色氨酸起始，當(dāng)使用2-4倍的所有酶量且同時(shí)維持相同酶比例時(shí)，孵育時(shí)間為1-2小時(shí)的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的莫納甜量增加。使用任一底物，都達(dá)到約1mg/mL莫納甜濃度。如果從吲哚-3-丙酮酸起始，產(chǎn)生的色氨酸量通常低于20％的產(chǎn)物量，顯示出使用偶聯(lián)反應(yīng)的益處。隨著中間體濃度和副反應(yīng)的進(jìn)一步最優(yōu)化和控制，產(chǎn)率和產(chǎn)量能大幅提高。
采用賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.36)的偶聯(lián)反應(yīng)在一些生物體中發(fā)現(xiàn)賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶(L-賴氨酸6-轉(zhuǎn)氨酶)，包括紅球菌、分枝桿菌(Mycobacterium)、鏈霉菌(Streptomyces)、諾卡氏菌(Nocardia)、黃桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)和鏈霉菌。生物體利用此酶作為生成一些β-內(nèi)酰胺抗生素中的和一步驟(Rius和Demain，J.Microbioiol.Biotech.，795-100，1997)。此酶將賴氨酸轉(zhuǎn)化成L-2-氨基己二酸6-半醛(ε-醛賴氨酸)，這是通過(guò)PLP-介導(dǎo)的賴氨酸的C-6轉(zhuǎn)氨，α-酮戊二酸用作氨基受體。ε-醛賴氨酸不穩(wěn)定且自發(fā)經(jīng)歷分子內(nèi)脫水以形成環(huán)狀分子1-哌啶6-羧酸鹽。這有效抑制任何逆反應(yīng)發(fā)生。圖12描述反應(yīng)流程。也能使用另外的酶賴氨酸-丙酮酸6-轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.71)。
1mL典型反應(yīng)包含50mM Tris-Cl pH7.3、20mM吲哚-3-丙酮酸、0.05mM PLP、6mM磷酸鉀pH8、2-50mM丙酮酸鈉、1.5mM MgCl2、50mM賴氨酸、100μg轉(zhuǎn)氨酶(賴氨酸ε轉(zhuǎn)氨酶LAT-101，BioCatalytics Pasadena，CA)和200μg睪丸酮叢毛單胞菌ProA醛縮酶。產(chǎn)生的莫納甜量隨著丙酮酸濃度增加而增加。用這些反應(yīng)條件(50mM丙酮酸)的最大量比用草酰乙酸脫羧酶(約0.1mg/mL)的偶聯(lián)反應(yīng)觀察到的低10倍。+＝293的峰在莫納甜預(yù)期時(shí)間洗脫且質(zhì)譜包含一些用其它酶方法觀察到的相同片段。第2個(gè)有正確質(zhì)量與電荷比(293)洗脫的峰稍早于實(shí)施例6中生成的S，S莫納甜通常觀察到的，可能表明存在另一種莫納甜的立體異構(gòu)體。此酶法生成的色氨酸很少。然而，可能對(duì)丙酮酸有一些活性(產(chǎn)生丙氨酸作為副產(chǎn)物)。同樣，已知酶不穩(wěn)定?？赏ㄟ^(guò)定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)以增加穩(wěn)定性，減少與丙酮酸的活性并提高與MP的活性。這些反應(yīng)也能與上述L-氨基酸氧化酶/過(guò)氧化氫酶偶聯(lián)。
其它偶聯(lián)反應(yīng)圖13顯示另一種能提高來(lái)自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸的莫納甜產(chǎn)量的偶聯(lián)反應(yīng)。甲酸脫氫酶(EC 1.2.1.2或1.2.1.43)是普通酶。一些甲酸脫氫酶需要NADH而另一些能利用NADPH。谷氨酸脫氫酶在前面的例子中催化莫納甜前體和莫納甜間的相互轉(zhuǎn)化，使用以銨為基礎(chǔ)的緩沖液。甲酸銨和甲酸脫氫酶的存在是輔因子再生的有效系統(tǒng)，二氧化碳生成是降低逆反應(yīng)速度的有效方法(Bommarius等，Biocatalysis 1037，1994和Galkin等，Appl.Environ.Microbiol.634651-6，1997)。此外，大量甲酸銨能溶于反應(yīng)緩沖液。加入甲酸脫氫酶和甲酸銨可改進(jìn)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)(或類似的還原性胺化)生成的莫納甜產(chǎn)量。
其它方法能用于驅(qū)動(dòng)平衡趨向莫納甜生成。例如，如果在用Ω-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(EC2.6.1.18)(如美國(guó)專利5,360,724和5,300,437所述)使MP轉(zhuǎn)化成莫納甜中，使用氨丙烷用作氨基酸供體，所得產(chǎn)物之一將會(huì)是丙酮，它是比底物氨丙烷更易揮發(fā)的產(chǎn)物?？芍芷谛远唐谔岣邷囟纫约斌E蒸發(fā)丙酮，從而緩解平衡。丙酮的沸點(diǎn)為47℃，如果使用短時(shí)間段，此溫度不可能降解中間體。大部分對(duì)α-酮戊二酸有活性的轉(zhuǎn)氨酶也對(duì)莫納甜前體有活性。類似地，如果乙醛酸/芳族酸轉(zhuǎn)氨酶(EC 2.6.1.60)與作為氨基供體的甘氨酸一起使用，生成的乙醛酸相對(duì)不穩(wěn)定且沸點(diǎn)比甘氨酸低很多。
實(shí)施例14劑量反應(yīng)曲線在pH 3.2的含有0.14％(w/v)檸檬酸和0.04％(w/v)檸檬酸鈉的模型軟飲料系統(tǒng)中制備15、30、45、60、75和90ppm莫納甜溶液(約96％的2R，4R/2S，4S對(duì)應(yīng)異構(gòu)體對(duì)和4％的2R，4S/2S，4R對(duì)應(yīng)異構(gòu)體對(duì)的混合物-也稱為莫納甜的“外銷旋混合物”)。用下述甜度估計(jì)方法測(cè)定莫納甜相對(duì)于蔗糖的甜度。由一組(n＝6-8)受過(guò)訓(xùn)練具有甜度測(cè)定方法經(jīng)驗(yàn)的小組成員重復(fù)進(jìn)行所有評(píng)價(jià)。使所有樣品的溫度在20℃±1℃。
編碼莫納甜溶液，以隨機(jī)順序分給各小組成員。也提供范圍在2.0-11.0％(w/v)蔗糖，相鄰濃度的增加值為0.5％(w/v)蔗糖蔗糖的參比標(biāo)準(zhǔn)。要求小組成員通過(guò)比較測(cè)試溶液與蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品的甜度來(lái)估計(jì)甜度。通過(guò)下述方法進(jìn)行該測(cè)試吸啜3小口測(cè)試溶液，然后吸啜一口水，然后吸啜3小口蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，然后吸啜一口水等。小組成員把甜度估計(jì)到一位小數(shù)位，如6.8、8.5。在評(píng)價(jià)測(cè)試溶液之間休息5分鐘時(shí)間。也要求小組成員徹底地嗽口并食用餅干以降低任何可能的后遺作用。表6中小結(jié)了蔗糖等價(jià)值(SEV)和標(biāo)準(zhǔn)差。
經(jīng)判斷，所有混合物都具有迅速開(kāi)始的甜味和建立到最大強(qiáng)度的甜度。甜度也迅速衰減。經(jīng)判斷，大部分混合物的果香不及蔗糖，除了莫納甜/葡萄糖混合物。注意到有輕微的持續(xù)甜后味，非常輕微的苦味/金屬味。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)甘草或冰涼后味。
表6莫納甜劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)
實(shí)施例15將莫納甜與碳水化合物甜味劑混合制備與10.0％(w/v)蔗糖等甜的莫納甜(如實(shí)施例14所述)與蔗糖、HFCS(55％果糖)和葡萄糖糖漿(63右旋糖等價(jià)物，DE)的混合物。對(duì)于各碳水化合物甜味劑而言，調(diào)整莫納甜甜味劑比，使莫納甜產(chǎn)生總甜度的25、50和75％。用實(shí)施例14中所述的甜度估計(jì)方法測(cè)定與10.0％(w/v)蔗糖相同的甜度。如實(shí)施例14所述，用6-8個(gè)小組成員在pH 3.2的模型軟飲料系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)各樣品的重復(fù)辨味進(jìn)行所有評(píng)價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表7-9。莫納甜與三氯蔗糖相比類似，莫納甜的甜味開(kāi)始有輕微延遲。
表7莫納甜和蔗糖的等甜混合物
表8納甜和HFCS的等甜混合物
表9莫納甜和葡萄糖糖漿的等甜混合物
然后，由一小組受過(guò)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)者來(lái)評(píng)價(jià)等甜莫納甜/碳水化合物(50∶50)混合物相對(duì)于蔗糖的質(zhì)量。以“雙盲法”進(jìn)行此評(píng)價(jià)。將蔗糖增甜系統(tǒng)作為對(duì)照，隨機(jī)編號(hào)所有其它產(chǎn)品。要求小組成員相對(duì)于對(duì)照評(píng)價(jià)隨機(jī)編號(hào)的樣品的以下性質(zhì)甜度特性開(kāi)始，建立和衰減；味道特性酸、苦和其它特征；口感；以及后味。也要求小組成員為甜味劑系統(tǒng)的質(zhì)量指定一個(gè)分?jǐn)?shù)(1；差-5；優(yōu))。所作評(píng)論和所給分?jǐn)?shù)的小結(jié)見(jiàn)表10。
表10莫納甜/碳水化合物混合物的味覺(jué)特性
實(shí)施例16莫納甜在軟飲料系統(tǒng)中的時(shí)間強(qiáng)度特性在實(shí)施例14所述的pH 3.2模型軟飲料系統(tǒng)中制備80ppm莫納甜(實(shí)施例14所述的莫納甜外消旋混合物)、10.0％(w/v)蔗糖和200ppm三氯蔗糖的溶液。然后用以下方法評(píng)價(jià)這些溶液的時(shí)間強(qiáng)度特性。該研究中包括六個(gè)小組成員。根據(jù)這些小組成員的總感覺(jué)敏度對(duì)他們進(jìn)行篩選，并根據(jù)他們對(duì)甜味強(qiáng)度和甜味質(zhì)量差異的敏感度進(jìn)行選擇。所有成員都有甜度評(píng)價(jià)方法的經(jīng)驗(yàn)，并接受過(guò)時(shí)間強(qiáng)度評(píng)價(jià)的特殊訓(xùn)練。一開(kāi)始先進(jìn)行訓(xùn)練過(guò)程，使該小組熟悉用計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)輸入系統(tǒng)隨時(shí)間評(píng)價(jià)樣品和對(duì)樣品打分的方法。
對(duì)各溶液樣品(13mL)編號(hào)，以隨機(jī)順序分給各小組成員。對(duì)各小組成員，咽下后，計(jì)算機(jī)迅速以每秒0-100次，至高達(dá)60秒一次記錄時(shí)間強(qiáng)度讀數(shù)。重復(fù)評(píng)價(jià)各溶液。表11小結(jié)了時(shí)間強(qiáng)度特性的結(jié)果。
表11時(shí)間強(qiáng)度研究結(jié)果
這些結(jié)果說(shuō)明了莫納甜的時(shí)間味覺(jué)屬性與蔗糖相當(dāng)，這說(shuō)明它是高質(zhì)量的甜味劑。此外，相比而言莫納甜比常用的高強(qiáng)度甜味劑三氯蔗糖更優(yōu)。
實(shí)施例17制備含有莫納甜的可樂(lè)和檸檬/酸橙飲料用以下配方制備可樂(lè)和檸檬/酸橙飲料，用蔗糖、HFCS(55％果糖)、阿斯巴特、三氯蔗糖、莫納甜(實(shí)施例14所述的外消旋混合物)、莫納甜/蔗糖或莫納甜/HFCS增甜。將一份糖漿加入5.5份碳酸水中并評(píng)價(jià)。
檸檬/酸橙糖漿配方
成分 ％重量/體積檸檬酸2.400檸檬酸鈉 0.500苯甲酸鈉 0.106香料 0.450(檸檬/酸橙香料730301-H ex.Givaudan Roure)甜味劑見(jiàn)下水至 100.000可樂(lè)糖漿配方成分 ％重量/體積磷酸 0.650(75％溶液)檸檬酸0.066檸檬酸鈉 0.300苯甲酸鈉 0.106可樂(lè)香料A 1.100(A01161ex.Givaudan Roure)可樂(lè)香料B 1.100(B01161ex.Givaudan Roure)甜味劑見(jiàn)下水至 100.000檸檬/酸橙或可樂(lè)碳酸水中甜味劑的濃度成分 ％重量/體積蔗糖 10％HFCS(55％果糖)10％(固體)阿斯巴特 500ppm三氯蔗糖 200ppm莫納甜67ppm(檸檬/酸橙碳酸水中)；80ppm(可樂(lè)碳酸水中)莫納甜/蔗糖 30.8ppm/5.0％莫納甜/HFCS 30.8ppm/5.0％(固體)由一組受過(guò)訓(xùn)練的品嘗者進(jìn)行“雙盲”評(píng)價(jià)。將蔗糖增甜產(chǎn)品作為對(duì)照，隨機(jī)編號(hào)所有其它產(chǎn)品。要求小組成員相對(duì)于對(duì)照評(píng)價(jià)隨機(jī)編號(hào)的樣品的以下性質(zhì)
味道特性酸苦其它特征甜度特性開(kāi)始建立強(qiáng)度衰減口感后味也要求小組成員為甜味劑系統(tǒng)的質(zhì)量指定一個(gè)分?jǐn)?shù)(1；差-5；優(yōu))。分別對(duì)檸檬/酸橙碳酸水和可樂(lè)所作評(píng)論以及所給平均分的小結(jié)見(jiàn)表12和13。在檸檬/酸橙香料中，莫納甜在味道上相當(dāng)于阿斯巴特。莫納甜/碳水化合物混合物的分?jǐn)?shù)較高?？蓸?lè)香料中，莫納甜與阿斯巴特類似。
表12檸檬/酸橙碳酸水的味覺(jué)特性
表12續(xù)檸檬/酸橙碳酸水的味覺(jué)特性
表13可樂(lè)的味覺(jué)特性
表13續(xù)可樂(lè)的味覺(jué)特性
討論用于本實(shí)施例的莫納甜具有清潔的甜味特性，基本無(wú)天然高強(qiáng)度甜味劑中常見(jiàn)的苦味、冷味和甘草味。用于本實(shí)施例莫納甜立體異構(gòu)體產(chǎn)生平滑、規(guī)則的劑量反應(yīng)曲線，其相對(duì)甜味強(qiáng)度比10.0％(w/v)SEV的蔗糖甜1250倍。
時(shí)間強(qiáng)度研究的結(jié)果顯示，莫納甜具有的時(shí)間/甜味強(qiáng)度特性很寬，類似于蔗糖和三氯蔗糖。與蔗糖相比，莫納甜需要稍長(zhǎng)時(shí)間來(lái)達(dá)到最大強(qiáng)度，且衰減速率較慢，評(píng)價(jià)(60秒)結(jié)束時(shí)達(dá)到較高甜度。然而，所觀察到的差異不是統(tǒng)計(jì)顯著的。
當(dāng)與碳水化合物甜味劑混合時(shí)，莫納甜產(chǎn)生的甜味強(qiáng)度是蔗糖的1500-2000倍。所得混合物的甜味和香味特性的質(zhì)量非常優(yōu)良。觀察到甜味開(kāi)始幾乎沒(méi)有延遲，且僅可檢測(cè)到低水平的持續(xù)甜味?？刹捎媚{甜和碳水化合物甜味劑的混合物，例如，以制備中等熱量的飲料。
所評(píng)價(jià)的莫納甜作為單獨(dú)的甜味劑和與碳水化合物混合時(shí)，性能良好。在檸檬/酸橙碳酸水中，僅用莫納甜增甜的產(chǎn)品的味覺(jué)特性與阿斯巴特和三氯蔗糖增甜的飲料非常相似。莫納甜/蔗糖飲料尤其優(yōu)良，實(shí)際上通過(guò)判斷比蔗糖對(duì)照產(chǎn)品更可接受。預(yù)計(jì)莫納甜與其它碳水化合物甜味劑混合后將增強(qiáng)檸檬/酸橙香味。在可樂(lè)體系中，將莫納甜與HFCS混合產(chǎn)生的飲料與HFCS對(duì)照一樣可以接受。
實(shí)施例18莫納甜的水溶液的感覺(jué)穩(wěn)定性在室溫下儲(chǔ)存0-6小時(shí)后研究莫納甜(如實(shí)施例14所述的外消旋混合物)的水溶液(8％SEV)的感覺(jué)穩(wěn)定性。制備莫納甜溶液0-1小時(shí)后或5-6小時(shí)后監(jiān)測(cè)SEV(如實(shí)施例14所述)。室溫下6小時(shí)后，沒(méi)有檢測(cè)到莫納甜SEV下降；用LC/MS進(jìn)行的分析研究證實(shí)了這些數(shù)據(jù)(如沒(méi)有觀察到內(nèi)酯化)。
實(shí)施例19制備加麥芽飲料預(yù)混合物用表14中所列成分制備加麥芽飲料預(yù)混合物。
表14
實(shí)施例20制備巧克力味的飲料預(yù)混合物用表15中所列成分制備巧克力味的飲料預(yù)混合物。無(wú)奶奶油可包括植物油、增稠劑、卵磷脂、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、乳化劑(如卵磷脂、DATEM和甘油單酯和甘油二酯)和填充劑(如玉米糖漿固體、低熱量填充劑)。
表15
實(shí)施例21制備橙味飲料預(yù)混合物用表16中所列成分制備橙味飲料預(yù)混合物。
表16
可通過(guò)將約1盎司干混合物溶于8盎司水，然后攪拌或振蕩直到充分水合來(lái)制備橙味飲料。因此，最終的即飲型飲料約含有66-440ppm的S，S莫納甜，6-13ppm的R，R或其混合物。
實(shí)施例22用莫納甜甜味劑制備檸檬水人們可制備含有莫納甜的甜味劑的方便的單用途小包裝，其中配制甜味劑，使其提供的甜度相當(dāng)于2茶匙(～8克)砂糖。因?yàn)镾，S比蔗糖甜50-200倍，40-160毫克S，S莫納甜產(chǎn)生的甜度相當(dāng)于8克砂糖。因此，例如，考慮到+/-25％甜度優(yōu)化，單用途小包裝中1克莫納甜配方約可含有40-200毫克S，S莫納甜。
同樣，因?yàn)镽，R比蔗糖甜2000-2400倍，3.3-4.0毫克R，R莫納甜產(chǎn)生的甜度相當(dāng)于8克砂糖。因此，在另一實(shí)施方式中，考慮到+/-25％甜度優(yōu)化，單用途小包裝中1克莫納甜配方約可含有3.3-5.0毫克R，R莫納甜。在另一實(shí)施方式中，在每克總重中量相同或較少的情況下，小包裝配方可含有40-200毫克S，S莫納甜、3.3-5.0毫克R，R莫納甜或其組合f，以提供與2茶匙砂糖相當(dāng)?shù)奶鸲取?br> 為制作檸檬水，在高玻璃杯中將2大湯匙的檸檬汁和3包(3克)莫納甜小包裝配方與3/4杯水混合，直到溶解。加入冰。莫納甜增甜的檸檬水與用6茶匙(24克)蔗糖增甜的檸檬水甜度幾乎相等并且同等優(yōu)選，而且它的熱量顯著較低(約0卡路里與96卡路里)。
實(shí)施例23在咖啡和冰茶中評(píng)價(jià)含有R，R莫納甜的甜味劑。
在咖啡和冰茶中，相對(duì)于其它已知甜味劑(阿斯巴特和三氯蔗糖)來(lái)評(píng)價(jià)莫納甜甜味劑配方，它含有R，R莫納甜或R，R莫納甜/赤蘚醇組合。評(píng)價(jià)的關(guān)鍵感受參數(shù)包括甜味質(zhì)量、后味、苦味及其后味。進(jìn)行定性評(píng)價(jià)。
產(chǎn)品配方(i)咖啡使用標(biāo)準(zhǔn)咖啡來(lái)評(píng)價(jià)甜味劑性能(表17)。
表17.咖啡配方
按照以下濃度在咖啡中加入甜味劑阿斯巴特 0.025％(w/v)三氯蔗糖 0.0082％(w/v)R，R莫納甜 0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克麥芽糊精R，R莫納甜/赤蘚醇 0.0020、0.0025、0.0030％(w/v)加1克赤蘚醇(ii)冰茶用冰茶制品來(lái)評(píng)價(jià)甜味劑性能(表18)。
表18.冰茶配方
按照以下濃度在咖啡中加入甜味劑阿斯巴特 0.0450％(w/v)三氯蔗糖 0.0170％(w/v)R，R莫納甜* 0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克麥芽糊精R，R莫納甜/赤蘚醇0.0030、0.0035、0.0040％(w/v)加1克赤蘚醇感常評(píng)價(jià)采用一小組(n＝6)有經(jīng)驗(yàn)的感覺(jué)鑒定員來(lái)評(píng)價(jià)這些咖啡和茶飲品，這些鑒定員將先品嘗咖啡產(chǎn)品然后再品嘗茶產(chǎn)品。這些評(píng)定的結(jié)果總結(jié)在表19中。
表19.咖啡和茶的感覺(jué)評(píng)價(jià)(每份200ml)
討論莫納甜能給甜味劑制品帶來(lái)意想不到的好處，其中包括明顯的感官益處。當(dāng)把莫納甜加入咖啡時(shí)，感覺(jué)到咖啡的香味水平明顯提高。加入低濃度赤蘚醇進(jìn)一步增強(qiáng)了這種益處，赤蘚醇能夠平衡并緩和香味同時(shí)縮短甜味開(kāi)始的時(shí)間。在冰茶尤其是酸化的茶中，莫納甜增強(qiáng)了檸檬的香味。同時(shí)，將赤蘚醇與莫納甜混合能帶來(lái)其它的香味益處。
在通常消費(fèi)的飲料如茶和咖啡中，莫納甜具有改進(jìn)的感覺(jué)特性(例如較少的后味、較少的怪味、沒(méi)有味道遮蔽作用)。莫納甜增甜的咖啡含有的熱量接近于0卡路里，相比之下用2茶匙(～8克)蔗糖增甜的咖啡中含有32卡路里的熱量。
預(yù)計(jì)與阿斯巴特或三氯蔗糖相比，莫納甜在飲料組合物中能增強(qiáng)所有柑橘味，以及使甜度的時(shí)間/強(qiáng)度特性更適宜。還預(yù)計(jì)與阿斯巴特或三氯蔗糖相比，莫納甜和赤蘚醇的混合物在飲料組合物中能夠進(jìn)一步增強(qiáng)柑橘味，并使甜度特性更適宜。預(yù)計(jì)莫納甜和赤蘚醇在維持于低溫的任何飲料組合物，如軟飲料、碳酸飲料、糖漿、干飲料混合物和糖漿飲料中都具有這些益處。
實(shí)施例24在飲料中評(píng)價(jià)R，R莫納甜配制飲料(可樂(lè)、檸檬-酸橙和橙飲料)，用阿斯巴特、三氯蔗糖或R，R莫納甜增甜。進(jìn)行定性評(píng)價(jià)。
產(chǎn)品配方表20中列出了開(kāi)發(fā)和評(píng)價(jià)的軟飲料配方。術(shù)語(yǔ)“投”指溶于水。例如，投“1+4”指將1份濃縮物配制在4份水中。因此，如果濃縮液配方中包括0.021％重量/體積(即210ppm)的R，R莫納甜，例如，投1+4使稀釋的飲料含有42ppm(210ppm/5)R，R莫納甜。
表20軟飲料配方(濃縮物)
最終即飲型飲料(投后)所含的甜味劑濃度如下檸檬/酸橙 阿斯巴特 500ppm三氯蔗糖 200ppmR，R莫納甜42ppm橙汁 阿斯巴特 550ppm三氯蔗糖 220ppmR，R莫納甜45ppm可樂(lè) 阿斯巴特 550ppm三氯蔗糖 220ppmR，R莫納甜45ppm飲料的感覺(jué)評(píng)價(jià)由一組(n＝6)評(píng)價(jià)者對(duì)這些軟飲料進(jìn)行評(píng)價(jià)，他們通過(guò)單獨(dú)品嘗來(lái)評(píng)價(jià)各組飲料。評(píng)價(jià)結(jié)果小結(jié)在表21中。
表21.軟飲料的感覺(jué)評(píng)價(jià)
討論在檸檬/酸橙、橙汁和可樂(lè)飲料中，莫納甜產(chǎn)生了質(zhì)量上類似于阿斯巴特并稍優(yōu)于三氯蔗糖的甜味，這兩種物質(zhì)都是高質(zhì)量甜味劑。在檸檬/酸橙飲料中，莫納甜配方比阿斯巴特配方的后味少。而且，R，R莫納甜的效能比阿斯巴特和三氯蔗糖強(qiáng)。
實(shí)施例25莫納甜和糖精的甜度劑量反應(yīng)曲線用20個(gè)受過(guò)訓(xùn)練的感覺(jué)評(píng)價(jià)者來(lái)評(píng)價(jià)莫納甜和糖精的甜度，判斷重復(fù)2次。在pH 3.2的檸檬酸/檸檬酸鹽緩沖液中制備測(cè)試和參比溶液。參見(jiàn)圖16。與糖精相比，R，R/S，S莫納甜的線性反應(yīng)更好，這與產(chǎn)生更類似于糖的味覺(jué)特征相一致。10％SEV以上的平臺(tái)說(shuō)明缺少異味和后味的“混合抑制”/其水平低。莫納甜的劑量反應(yīng)曲線形狀與阿斯巴特、三氯蔗糖和阿力甜相似，他們都是“質(zhì)量”甜味劑。
在模型系統(tǒng)(pH 3.2)中用R，R/S，S莫納甜作為單獨(dú)甜味劑，觀察到以下特征(1)甜味開(kāi)始有輕微延遲；(2)甜味衰退相當(dāng)迅速；(3)輕微的“阿斯巴特樣”后味，輕微的甜后味，后味中沒(méi)有苦味；和(4)在未調(diào)味的系統(tǒng)中殘留有冰涼感覺(jué)。
實(shí)施例26莫納甜隨溫度增加在pH 3時(shí)的穩(wěn)定性將合成的莫納甜樣品置于pH 3，25℃、50℃和100℃的環(huán)境下。室溫pH 3時(shí)，觀察到48小時(shí)內(nèi)損失14％莫納甜。這種損失是由于形成內(nèi)酯。50℃pH 3時(shí)，48小時(shí)內(nèi)損失23％莫納甜。這種損失是由于形成內(nèi)酯并在約15.5分鐘后有未知化合物聚集。100℃pH 3時(shí)，24小時(shí)內(nèi)幾乎所有莫納甜都損失了。主要的可檢測(cè)成分是15.5分鐘時(shí)出現(xiàn)的未知物質(zhì)。
實(shí)施例2740℃ pH 2.5、3.0、4.0時(shí)莫納甜和阿斯巴特的感覺(jué)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)在pH 2.5、3.0和4.0制備并儲(chǔ)藏于40℃的莫納甜溶液100天內(nèi)的感覺(jué)穩(wěn)定性。將這些溶液損失的甜味與在相同條件下制造并儲(chǔ)存的阿斯巴特溶液損失的甜味進(jìn)行比較。
在40℃儲(chǔ)存之后測(cè)量莫納甜(8％SEV，約55ppm，含有約96％2R，4R/2S，4S對(duì)映體對(duì)和4％2R，4S/2S，4R對(duì)映體對(duì)的合成混合物)在pH值為2.5、3.0和4.0的磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性。比較莫納甜和相同緩沖液中阿斯巴特(400ppm)的穩(wěn)定性。用與莫納甜和阿斯巴特溶液相同的磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液制備三種蔗糖參考溶液。所有制備的溶液避光儲(chǔ)存。
緩沖液組成pH2.5 磷酸(75％溶液)0.127％(w/v)一水合檸檬酸三鈉0.005％(w/v)pH3.0 磷酸(75％溶液)0.092％(w/v)一水合檸檬酸三鈉0.031％(w/v)pH4.0 磷酸(75％溶液)0.071％(w/v)
一水合檸檬酸三鈉0.047％(w/v)通過(guò)一小組(n＝8)經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的熟悉甜味評(píng)定過(guò)程的感覺(jué)鑒定員來(lái)評(píng)估每種甜味劑相對(duì)蔗糖的甜度，該過(guò)程一式兩份進(jìn)行。所有樣品(用同樣的緩沖液配制)在22℃±1℃下一式兩份。莫納甜(測(cè)試)溶液用3個(gè)隨機(jī)數(shù)字編號(hào)，并分別隨機(jī)給予鑒定員。還提供了以0.5％(w/v)蔗糖遞增的蔗糖參考標(biāo)準(zhǔn)(4.0-10.0％(w/v)蔗糖)。要求鑒定員通過(guò)比較測(cè)試溶液和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)的甜度來(lái)評(píng)價(jià)甜度。評(píng)定時(shí)吸啜3口測(cè)試溶液，然后吸啜1口水，再吸啜3口蔗糖標(biāo)準(zhǔn)，然后在吸啜1口水，依此類推。鑒定員用1位小數(shù)評(píng)價(jià)甜度，例如6.8、8.5。在評(píng)價(jià)測(cè)試溶液之間休息5分鐘。要求鑒定員徹底漱口并食用一些餅干以降低任何可能的附帶結(jié)果。
表22和23顯示了在磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行的穩(wěn)定性研究的結(jié)果。在每個(gè)pH下40℃避光儲(chǔ)存100天后，莫納甜甜度的殘留百分比大于阿斯巴特的殘留百分比。在pH 4.0時(shí)，莫納甜溶液甜味的損失幾乎穩(wěn)定，因?yàn)樵诘?7-100天測(cè)得的甜度變化很小，而阿斯巴特溶液的甜味卻繼續(xù)損失。
表22莫納甜的感覺(jué)穩(wěn)定性40℃儲(chǔ)存100天后的甜度A.
B.
C.
表23穩(wěn)定性在規(guī)定pH于40℃儲(chǔ)存100天后剩余甜度的量
如表24所見(jiàn)，各種緩沖液可有效維持pH。
表24
如果假設(shè)有偽第一順序中斷反應(yīng)，用logn保留百分比對(duì)時(shí)間作圖(logn％RTN v.t)以估算任何給定條件下甜度損失的半衰期(t)和速度常數(shù)(k)。如此便可得出如下表25總結(jié)的莫納甜和阿斯巴特甜度損失動(dòng)力學(xué)。
表25
每個(gè)pH于40℃儲(chǔ)存100天后，莫納甜甜度的保留百分比大于阿斯巴特的保留百分比。在pH 4.0時(shí)，莫納甜溶液甜味的損失幾乎穩(wěn)定，因?yàn)樵诘?7-100天測(cè)得的甜度變化很小，而阿斯巴特溶液的甜味卻繼續(xù)損失。
莫納甜和阿斯巴特估計(jì)的半衰期說(shuō)明，莫納甜的甜度損失速度低于阿斯巴特。在pH 2.5、3.0和4.0時(shí)估算的莫納甜甜度的半衰期分別為65天、115天和230天。相同條件下估算的阿斯巴特的半衰期為55天、75天和140天。
因此，在酸性條件并于40℃儲(chǔ)存的條件下，莫納甜可比阿斯巴特產(chǎn)生的甜味更加穩(wěn)定。在具有低pH的可樂(lè)和其它飲料以及高溫中莫納甜的穩(wěn)定性優(yōu)于阿斯巴特。因?yàn)槟{甜的穩(wěn)定性優(yōu)于阿斯巴特，并達(dá)到平衡，在pH 3時(shí)不會(huì)不可逆地分解，所以預(yù)計(jì)莫納甜能夠在低pH飲料，如可樂(lè)飲料中提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的甜味。
還發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)，當(dāng)暴露于紫外光(UV)時(shí)，莫納甜在pH 3的磷酸/檸檬酸鹽緩沖液(環(huán)境溫度)中的穩(wěn)定性類似于或稍高于阿斯巴特。某種味道系統(tǒng)可加速UV不穩(wěn)定性。UV吸收性包裝材料、著色劑和/或抗氧化劑可保護(hù)含莫納甜的飲料防止其中發(fā)生UV光誘導(dǎo)的香料相互作用。
實(shí)施例28莫納甜立體異構(gòu)體的層析樣品制備—在微離心管中放入約50-75μg凍干物質(zhì)。在其中加入1.0mL HPLC級(jí)甲醇。將溶液渦漩攪拌30分鐘，離心并取出等分量上清進(jìn)行分析。
反相HPLC—用2.1×250mm XterraTMMS C85μm(Waters Corporation)HPLC柱進(jìn)行層析獲得兩個(gè)分離的非對(duì)映體峰(R，R/S，S和R，S/S，R)。用Micromass的UltimaTM三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相進(jìn)行以下梯度時(shí)間(分鐘) 091620210.05％TFAA％ 95 65 101095甲醇，0.05％TFA B％ 535 90905流速mL/min 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25手性HPLC—用250×4.6mm Chirobiotic T(Advanced Separations Technologies，Inc.)HPLC柱進(jìn)行層析獲得兩個(gè)清楚的莫納甜立體異構(gòu)體(R，R和S，S)。用Micromass的UltimaTM三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相由甲醇和0.2％乙酸以及0.05％氨水構(gòu)成。
質(zhì)譜(MS/MS)—通過(guò)選擇反應(yīng)監(jiān)控(SRM，Selected Reaction Monitoring)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)莫納甜的存在。莫納甜的質(zhì)子化分子離子([M+H]+)的m/z＝293.3。斷裂該分子離子產(chǎn)生m/z＝257.3的顯著離子，這是將分子離子多次脫水得到的。這種躍遷是莫納甜特有的，并選擇(293.3至257.3)在SRM實(shí)驗(yàn)過(guò)程中作為躍遷加以監(jiān)測(cè)。這種檢測(cè)方法可用于莫納甜的反相和手性分離。
結(jié)果—用反相HPLC評(píng)價(jià)R，S/S，R和S，S/R，R標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過(guò)衍生和酶法拆分制備樣品。標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖示于圖17。反相分析之后進(jìn)行手性層析以評(píng)估樣品內(nèi)存在的特定異構(gòu)體。標(biāo)準(zhǔn)S，S和R，R莫納甜溶液的手性層析示于圖18。
實(shí)施例29莫納甜在高溫(80℃)和中性pH下的穩(wěn)定性使用pH7下的100毫升75ppm的莫納甜溶液作為原料溶液。所述合成的莫納甜樣品包含約96％的2R，4R/2S，4S對(duì)映體對(duì)和4％的2R，4S/2S，4R對(duì)映體對(duì)。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，將所述樣品保溫在80℃和pH7的條件下，在0、1、2、3、4小時(shí)和1、2、4、7、14、21和35天時(shí)抽取樣品。所有試驗(yàn)條件均一式兩份進(jìn)行。
使用LC-MS并使用反相色譜法進(jìn)行分離和定量—建立合成莫納甜的兩個(gè)檢測(cè)到的非對(duì)映體峰的響應(yīng)曲線。用溶解在去離子水中的合成莫納甜標(biāo)準(zhǔn)物納入(bracketed)5-150ppm的范圍。使用3.9×150mm的Novapak C18(Waters Corporation)HPLC柱來(lái)完成兩個(gè)非對(duì)映體峰的分離。串聯(lián)使用紫外-可見(jiàn)(UV)和質(zhì)譜儀(MS)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)和定量。莫納甜及其內(nèi)酯的峰各自在279nm處具有Uvmax，這有助于精確檢測(cè)。通過(guò)正離子電噴模式獲得293.3m/z和275.3m/z的選擇性離子監(jiān)控(SIM)掃描來(lái)進(jìn)行定量。
結(jié)果—在中性pH下，即使在7-35天之后，莫納甜的降解程度也不明顯。莫納甜隨時(shí)間變化而消失的程度取決于pH，這是因?yàn)樗鲋饕碑a(chǎn)物是環(huán)化以及可能出現(xiàn)的很少量的外消旋作用。在80℃和pH7的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在使用LC-MS進(jìn)行定量檢測(cè)所達(dá)到的精確度范圍內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到外消旋RR/SS莫納甜或其內(nèi)酯的濃度出現(xiàn)變化。
由于莫納甜在中性pH時(shí)的耐熱性，預(yù)計(jì)莫納甜的穩(wěn)定性適用于中性pH飲料(如乳制品或粉末化的飲料組合物)。也預(yù)計(jì)與其它高強(qiáng)度甜味劑(如阿斯巴特)相比，莫納甜在這些飲料組合物中的保存限期更長(zhǎng)。此外，預(yù)計(jì)莫納甜在處理?xiàng)l件，如加熱填充過(guò)程中更穩(wěn)定。
實(shí)施例30其它軟飲料配方(濃縮物)
配方A
投1+4。該稀釋的即飲型飲料含有1980ppm S，S莫納甜。
配方B
投1+4。該稀釋的即飲型飲料含有80ppm莫納甜外消旋混合物。
配方C
投1+4。該稀釋的即飲型飲料含有550ppm S，S莫納甜和32ppm R，R莫納甜。
考慮到應(yīng)用本文所述原理的許多可能實(shí)施方式，應(yīng)意識(shí)到所述實(shí)施方式僅是本公開(kāi)的具體實(shí)施例，而不應(yīng)限制本公開(kāi)的范圍。
序列表<110>嘉吉有限公司(CARGILL，INC.)<120>多肽和生物合成途徑<130>023829-0364<140>PCT/US2004/027454<141>2004-08-25<150>60/497,627<151>2003-08-25<160>74<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1170<212>DNA<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)<400>1atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc 60aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc 120ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag 180gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa 240ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc 300tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg 360ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc 420gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc 480gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg 540accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc 600ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct cgaccaggat 660gtcgcgggcc tccggcatct tctcggcgtg gtcccggaag cgctcgtcgc ggtttcctgc 720tcgaagtcct tcgggcttta tcgcgagcgc gcgggcgcga tcttcgcgcg gaccagctcg 780actgcctcgg cggacagggt gcgctcaaac ctcgcgggcc tcgcacgcac cagctattcc 840atgccgccgg atcacggcgc agccgtcgtg cggacgatcc ttgacgaccc ggaactcagg 900cgcgactgga cggaggagct cgagacgatg cggctcagga tgacgggcct ccggcggtcg 960cttgccgagg gactccgcac ccgctggcag agcctcggcg cagtcgccga tcaggagggc 1020atgttctcca tgctgccgct ttccgaagcg gaggttatgc ggctcaggac cgagcacggc 1080atctatatgc cggcatccgg ccgcatcaac atcgccgggc tgaagacggc ggaagccgcc 1140gagattgccg gcaagttcac cagtctctga 1170
<210>2<211>389<212>PRT<213>苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)<400>2Met Phe Asp Ala Leu Ala Arg Gln Ala Asp Asp Pro Leu Leu Phe Leu1 5 10 15Ile Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Val Asp Leu Gly20 25 30Val Gly Val Tyr Arg Asp Glu Thr Gly Arg Thr Pro Ile Phe Arg Ala35 40 45Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg Leu Leu Glu Thr Gln Asp Ser Lys Ala50 55 60Tyr Ile Gly Pro Glu Gly Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu65 70 75 80Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gln85 90 95Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala100 105 110Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn115 120 125His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp130 135 140Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser145 150 155 160Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser165 170 175Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu180 185 190Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu195 200 205Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu210215 220Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys225 230 235 240Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala245 250 255Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala260 265 270Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala275 280 285Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr290 295 300
Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser305 310 315 320Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala325 330 335Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val340 345 350Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg355 360 365Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly370 375 380Lys Phe Thr Ser Leu385<210>3<211>1260<212>DNA<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>3atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg 240ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat 300gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 360gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc 660gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg 840atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg1020acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc1080ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag1140cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg1200ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga1260<210>4<211>419<212>PRT
<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>4Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile1 5 10 15Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro20 25 30Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp35 40 45Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro50 55 60Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg65 70 75 80Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu85 90 95Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val100 105 110Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala115 120 125Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr130 135 140Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys145 150 155 160Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr165 170 175Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys180 185 190Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly195 200 205Ala Asn Pro Ash Pro Val Gln Trp Leu Ala Ile Cys Glu Ser Leu Ala210 215 220Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly225 230 235 240Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg245 250 255Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile260 265 270Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly275 280 285Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr290 295 300Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu305 310 315 320Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
325 330 335Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala340 345 350Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met355 360 365Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr370 375 380Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly385 390 395 400Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val405 410 415Leu Arg Gly<210>5<211>1260<212>DNA<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>5atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg 240ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat 300gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcaggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 360gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420cccgaggcca ctgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540gccgagggct tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc 660gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgaac gggcatcctg 840atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg1020acgctgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc1080ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag1140cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg1200ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga1260<210>6<211>419
<212>PRT<213>類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>6Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile1 5 10 15Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro20 25 30Gln Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gln Leu Ile Gln Met Phe Arg Glu Asp35 40 45Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro50 55 60Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg65 70 75 80Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Gly Glu85 90 95Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val100 105 110Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala115 120 125Val Arg Gln Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr130 135 140Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys145 150 155 160Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr165 170 175Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys180 185 190Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly195 200 205Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Val Cys Glu Ser Leu Ala210 215 220Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gln Gly Phe Gly225 230 235 240Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg245 250 255Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile260 265 270Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly275 280 285Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr290 295 300Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu305 310 315 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg325 330 335Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala340 345 350Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met355 360 365Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr370 375 380Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly385 390 395 400Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val405 410 415Leu Arg Gly<210>7<211>1239<212>DNA<213>碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)<400>7atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct 60cccgatgtca tcttcgatct cgcaaaacgc gccgccgctg ccaagggccc caaggccaac 120ctcgtcattg gtgcctaccg cgacgagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc 180aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc 240taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag 300aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg 360ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc 420aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac 480gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg 540gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg 600caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc 660gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc 720ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc 780ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg 840gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac 900ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca 960gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg1020ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc1080ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca1140gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag1200acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga 1239<210>8
<211>412<212>PRT<213>碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)<400>8Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys Ile1 5 10 15Gln Ala Gln Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala20 25 30Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Val Ile Gly Ala Tyr Arg Asp35 40 45Glu Gln Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Val Val Arg Lys Ala Glu Gln50 55 60Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ile Ser Gly65 70 75 80Tyr Gln Pro Phe Ile Asp Glu Ala Val Lys Ile Ile Tyr Gly Asn Thr85 90 95Val Glu Leu Glu Asn Leu Val Ala Val Gln Thr Leu Ser Gly Thr Gly100 105 110Ala Val Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Thr Arg Val Phe Asp Ala Glu115 120 125Thr Thr Pro Ile Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Trp Pro Asn His Tyr Gly130 135 140Val Val Lys Ala Ala Gly Trp Lys Asn Ile Cys Thr Tyr Ala Tyr Tyr145 150 155 160Asp Pro Lys Thr Val Ser Leu Asn Phe Glu Gly Met Lys Lys Asp Ile165 170 175Leu Ala Ala Pro Asp Gly Ser Val Phe Ile Leu His Gln Cys Ala His180 185 190Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Ser Gln Glu Gln Trp Asn Glu Ile Ala195 200 205Ser Leu Met Leu Ala Lys His His Gln Val Phe Phe Asp Ser Ala Tyr210 215 220Gln Gly Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp Ala Tyr Ala Ala Arg225 230 235 240Leu Phe Ala Arg Arg Gly Ile Glu Val Leu Leu Ala Gln Ser Phe Ser245 250 255Lys Asn Met Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu260 265 270Leu Lys Asp Lys Thr Lys Arg Ala Asp Val Lys Ser Val Met Asp Ser275 280 285Leu Ile Arg Glu Glu Tyr Thr Cys Pro Pro Ala His Gly Ala Arg Leu290 295 300Ala His Leu Ile Leu Ser Asn Asn Glu Leu Arg Lys Glu Trp Glu Ala
305 310 315 320Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg Ile Arg Thr Met Arg Arg Thr Val325 330 335Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Val340 345 350Ile Asn Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln355 360 365Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn Ile Phe Ile Thr Val Ser Gly Arg370 375 380Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln385 390 395 400Thr Ile Asn Asp Ala Val Arg Asn Val Asn Arg Glu405 410<210>9<211>1182<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>9atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc 60tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt 120ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca 180tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa 240aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa 300gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg 360cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt 420gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc 480aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa 540gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat 600gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg 660gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt 720ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat 780gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt 840gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt 900cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct 960attaaatcat ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc1020gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct1080tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta1140aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa 1182<210>10<211>393<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)<400>10Met Glu His Leu Leu Asn Pro Lys Ala Arg Glu Ile Glu Ile Ser Gly1 5 10 15Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gln His Glu Asp Val Ile Ser20 25 30Leu Thr Ile Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala35 40 45Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn50 55 60Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Val Gln Leu Tyr Met Lys Lys65 70 75 80Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr85 90 95Gly Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro100 105 110Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro115 120 125Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser130 135 140His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro145 150 155 160Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val165 170 175Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly180 185 190Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr195 200 205Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr Ile210 215 220Val Ile Asn Gly Leu Ser Lys Ser His Ser Met Thr Gly Trp Arg Ile225 230 235 240Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp Ile Ala Lys His Ile Leu Lys Val245 250 255His Gln Tyr Asn Val Ser Cys Ala Ser Ser Ile Ser Gln Lys Ala Ala260 265 270Leu Glu Ala Val Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu Ile Met Arg Glu275 280 285Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Val Ser Met290 295 300Gly Leu Asp Val Val Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Ser305 310 315 320Ile Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu
325 330 335Glu Asp Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr340 345 350Gly Glu Gly Tyr Val Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu355 360 365Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Val Leu Lys Lys Arg Glu370 375 380Ala Met Gln Thr Ile Asn Asn Gly Val385 390<210>11<211>1176<212>DNA<213>嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)<400>11atgccagaat tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca 60ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgactttg120ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca180gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt240aaatatttga aaaagattac tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca300gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag360gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc420gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa480gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca540actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat600catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt660tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat720gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt780ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt840gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt900cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt960gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc 1020ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt 1080ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg 1140aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa 1176<210>12<211>391<212>PRT<213>嗜淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)<400>12Met Pro Glu Leu Ala Asn Asp Leu Gly Leu Ser Lys Lys Ile Thr Asp
1 5 10 15Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile20 25 30Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro35 40 45Glu His Val Lys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser50 55 60His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser65 70 75 80Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu85 90 95Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe100 105 110Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe115 120 125Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu130 135 140Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu145 150 155 160Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr165 170 175Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala180 185 190Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu195 200 205Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Val Lys His Phe Ser Ile Ala Ser210 215 220Leu Ile Pro Glu Arg Ala Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Lys Ser His225 230 235 240Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Val Ala Gly Pro Ala Lys Ile245 250 255Met Ala Glu Ile Gly Lys Val His Gly Leu Met Val Thr Thr Thr Thr260 265 270Asp Ser Ser Gln Ala Ala Ala Ile Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp275 280 285Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Val Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Val290 295 300Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Glu Met Gln Ala Val Lys Pro Glu Gly305 310 315 320Ala Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Ile Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp325 330 335Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Val Gly Ile Thr340 345 350Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His Ile Arg Leu Ser
355 360 365Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys370 375 380Lys Val Leu Gln Glu Asp Glu385 390<210>13<211>1413<212>DNA<213>類球紅細(xì)菌(R.sphaeroides)<400>13atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc60atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg 120cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc 180tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg 240gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg 300gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc 360gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga 420gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc 480gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag 540atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag 600gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc 660gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat 720ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg 780ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc 840gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc 900cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc 960ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg 1020cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc 1080cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg 1140gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg 1200gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa 1260gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg 1320gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg 1380gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga 1413<210>14<211>470<212>PRT<213>類球紅細(xì)菌(R.sphaeroides)<400>14Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro
1 5 10 15Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly20 25 30Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg35 40 45Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu50 55 60Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val65 70 75 80Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala85 90 95Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly100 105 110Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe115 120 125Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly130 135 140Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu145 150 155 160Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala165 170 175Arg Gly Ser Gln Met Ala Leu Phe Leu Val Ala Arg Ala Ala Leu Ala180 185 190Pro Gly Glu Ala Ile Ala Val Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp195 200 205Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Val Arg Gly Val Pro Val Asp210 215 220Gly Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp225 230 235 240Pro Arg Ile Arg Ala Val Tyr Val Thr Pro His His Gln Tyr Pro Thr245 250 255Thr Val Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ala260 265 270Glu Arg His Arg Leu Ala Leu Ile Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr275 280 285Arg Phe Glu Gly Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu290 295 300Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Val Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro305 310 315 320Gly Ile Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg325 330 335Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gln Gly Asp Ala Pro Leu340 345 350Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ile Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His
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<211>397<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400>32Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu1 5 10 15Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser20 25 30Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala35 40 45Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser50 55 60Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala65 70 75 80Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val85 90 95Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala100 105 110Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp115 120 125Pro Thr Trp Glu AsnArg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu130135 140Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe145 150 155 160Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val165 170 175Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn180 185 190Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile195 200 205Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu210 215 220Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu225 230 235 240Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val245 250 255Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val260 265 270Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro275 280 285Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu290 295 300Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu
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<210>40<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag36<210>41<211>1416<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>41atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa 60cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg 120ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg 180cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac 240tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac 300cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa 360aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag 420ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat1020ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca1080ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg1140ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg1200ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta1260accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa1320catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta1380ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416<210>42
<211>1371<212>DNA<213>弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)<400>42atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg60cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg 540gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg 600cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a 1371<210>43<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35<210>44<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>44agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37<210>45<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35<210>46<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg 37<210>47<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31<210>48<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>48tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt 30<210>49<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt32<210>50<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca 30<210>51<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg29<210>52<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>52tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at32<210>53<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat29<210>54<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54gtagacgcgg actaactctt tggcagaag29<210>55<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35<210>56<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>56agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc 37<210>57<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>57ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35<210>58<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>58agaggagagt tagagcc tca gacatatttc agtccca 37<210>59<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>59ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 35<210>60<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>60agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca 37<210>61<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>61ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35<210>62<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>62agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37<210>63<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>63ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35<210>64<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>64agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37<210>65<211>684<212>DNA<213>睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)<400>65atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc 240gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660gccggcctga aatatattga ctaa684<210>66<211>227<212>PRT<213>睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni)<400>66Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg1 5 10 15Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu20 25 30Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr35 40 45Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro50 55 60Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly65 70 75 80Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe85 90 95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu100 105 110Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp115 120 125Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala130 135 140Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val145 150 155 160Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val165 170 175Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu180 185 190Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly195 200 205Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys210 215 220Tyr Ile Asp225<210>67<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct42<210>68<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc 33<210>69<211>31<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>69cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>70acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg 30<210>71<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>71ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt32<210>72<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>72gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc 33<210>73<211>15<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>73ggtattgagg gtcgc 15<210>74<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>74agaggagagt tagagcc 1權(quán)利要求
1.一種含有莫納甜或其鹽的飲料組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，一定量的組合物比相同量的、用甜度相當(dāng)?shù)恼崽腔蚋吖怯衩滋菨{替換莫納甜或其鹽的飲料組合物所含熱量和碳水化合物少。
3.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物還含有柑橘調(diào)味品，其中，莫納甜或其鹽以能夠增強(qiáng)柑橘調(diào)味品所提供的味道的量存在。
4.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物還含有柑橘調(diào)味品和碳水化合物，其中莫納甜或其鹽和碳水化合物的存在量能夠增強(qiáng)柑橘調(diào)味品所提供的味道。
5.如權(quán)利要求4所述的飲料組合物，其特征在于，所述碳水化合物選自赤蘚醇、麥芽糖糊精、蔗糖及其組合。
6.一種含有糖漿組合物的碳酸飲料，含量范圍約為該碳酸飲料重量的15％-25％，其中該糖漿組合物含有莫納甜或其鹽。
7.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含3-10000ppm的莫納甜或其鹽。
8.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物是糖漿或無(wú)水飲料混合物，其中該組合物約含10-10000ppm的莫納甜或其鹽。
9.如權(quán)利要求8所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物是糖漿，其中該糖漿是適于約以1份糖漿∶3份飲料至1份糖漿∶5.5份飲料稀釋于飲料的濃縮液。
10.如權(quán)利要求9所述的飲料組合物，其特征在于，所述糖漿約含有600-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽。
11.如權(quán)利要求9所述的飲料組合物，其特征在于，所述糖漿約含有18-300ppm的R，R莫納甜或其鹽。
12.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物是約含有0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含有0-300ppm的R，R莫納甜或其鹽的糖漿。
13.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物約含10-10000ppm莫納甜或其鹽的無(wú)水飲料混合物。
14.如權(quán)利要求13所述的飲料組合物，其特征在于，所述無(wú)水飲料混合物約含600-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽。
15.如權(quán)利要求13所述的飲料組合物，其特征在于，所述該無(wú)水飲料混合物約含10-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
16.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物是約含0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽、約含有0-450ppm的R，R莫納甜或其鹽的無(wú)水飲料混合物。
17.如權(quán)利要求7所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物基本不含R，R莫納甜或其鹽
18.如權(quán)利要求7所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物基本不含S，S莫納甜或其鹽。
19.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含3-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
20.如權(quán)利要求19所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含6-225ppm的R，R莫納甜或其鹽。
21.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含3-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽。
22.如權(quán)利要求21所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含60-4600ppm的S，S莫納甜或其鹽。
23.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含有0-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
24.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含3-2000ppm莫納甜或其鹽的即飲型組合物。
25.如權(quán)利要求24所述的即飲型組合物，其特征在于，所述即飲型組合物約含5-50ppm的R，R莫納甜或其鹽。
26.如權(quán)利要求24所述的即飲型組合物，其特征在于，所述即飲型組合物約含60-2000ppm的S，S莫納甜或其鹽。
27.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含450或以下ppm的R，R莫納甜或其鹽，并基本不含S，S、S，R或R，S莫納甜或其鹽。
28.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物約含10000或以ppm的S，S莫納甜或其鹽，并基本不含R，R、S，R或R，S莫納甜或其鹽。
29.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽主要由R，R莫納甜或其鹽組成。
30.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽主要由S，S莫納甜或其鹽組成。
31.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽是富含R，R立體異構(gòu)體的莫納甜或其鹽。
32.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽是富含S，S立體異構(gòu)體的莫納甜或其鹽。
33.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽至少含有95％R，R莫納甜或其鹽。
34.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽少含有95％S，S莫納甜或其鹽。
35.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽是由生物合成途徑生產(chǎn)的。
36.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物還含有赤蘚醇、海藻糖、環(huán)磺酸鹽、D-塔格糖或其組合。
37.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物不會(huì)致齲齒。
38.一種含有富含莫納甜立體異構(gòu)體的混合物的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜混合物是通過(guò)生物合成途徑生產(chǎn)的。
39.如權(quán)利要求38所述的飲料組合物，其特征在于，所述生物合成途徑是多步驟途徑，多步驟途徑中至少一步是化學(xué)轉(zhuǎn)化。
40.如權(quán)利要求38所述的飲料組合物，其特征在于，所述混合物主要是R，R莫納甜或其鹽。
41.如權(quán)利要求38所述的飲料組合物，其特征在于，所述混合物主要是S，S莫納甜或或其鹽。
42.一種含有用生物合成途徑生產(chǎn)的莫納甜組合物的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜組合物不含石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)污染物。
43.一種含有莫納甜或其鹽的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽由生物合成途徑生產(chǎn)，從重組細(xì)胞中分離，其中重組細(xì)胞不含石油化學(xué)、有毒或危險(xiǎn)的污染物。
44.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述莫納甜或其鹽是R，R莫納甜和S，S莫納甜或其鹽的混合物。
45.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述組合物還含有散裝甜味劑、高強(qiáng)度甜味劑、低升糖指數(shù)碳水化合物、調(diào)味品、抗氧化劑、咖啡因、甜味增強(qiáng)劑或其組合。
46.如權(quán)利要求45所述的飲料組合物，其特征在于，所述調(diào)味品選自可樂(lè)調(diào)味品、柑橘調(diào)味品及其組合，所述散裝甜味劑選自玉米甜味劑、蔗糖、右旋糖、轉(zhuǎn)化糖、麥芽糖、糊精、麥芽糖糊精、果糖、左旋糖、高果糖玉米糖漿、玉米糖漿固體、左旋糖、半乳糖、海藻糖、異麥芽酮糖、果糖-寡糖及其組合，所述高強(qiáng)度甜味劑可選自三氯蔗糖、阿斯巴特、糖精、安賽蜜K、阿力甜、奇異果甜蛋白、雙氫查耳酮、紐甜、環(huán)磺酸鹽、甜菊糖、羅漢果甙、甘草甜素、葉甜素、莫內(nèi)林、馬檳榔甜蛋白、布那珍、多肽菌素、倍他丁及其組合。所述低升糖指數(shù)碳水化合物可選自D-塔格糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、乳糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、氫化淀粉水解物、異麥芽糖、D-阿洛酮糖、1，5脫水D-果糖及其組合，以及所述甜味增強(qiáng)劑可選自仙茅甜蛋白、非洲奇果蛋白、洋薊酸、綠原酸、咖啡酸、叉柱花素、阿拉伯半乳聚糖、麥芽酚、二羥苯甲酸及其組合。
47.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述飲料組合物含有莫納甜或其鹽和非莫納甜甜味劑的混合物。
48.如權(quán)利要求1所述的飲料組合物，其特征在于，所述非莫納甜甜味劑選自蔗糖和高果糖玉米糖漿。
49.一種制造含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括從選自葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和莫納甜前體的至少一種基材生產(chǎn)莫納甜或其鹽。
50.一種制造含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括通過(guò)生物合成途徑生產(chǎn)莫納甜或其鹽。
51.一種制造含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括用至少一步生物轉(zhuǎn)化來(lái)生產(chǎn)莫納甜或其鹽。
52.一種制造含有莫納甜或其鹽的飲料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括僅用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)莫納甜或其鹽。
53.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與至少一種不是莫納甜或其鹽的其它成分混合。
54.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將莫納甜或其鹽與赤蘚醇、海藻糖、環(huán)磺酸鹽、D-塔格糖、麥芽糖糊精或其組合混合。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述至少一種其它成分選自填充劑、散裝甜味劑、液體甜味劑、低升糖指數(shù)碳水化合物、高強(qiáng)度甜味劑、增稠劑、脂肪、油、乳化劑、抗氧化劑、甜味增強(qiáng)劑、著色劑、調(diào)味劑、咖啡因、酸、粉末、助流動(dòng)劑、緩沖液、蛋白來(lái)源、味道增強(qiáng)劑、味道穩(wěn)定劑及其組合。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述飲料組合物約含0-10000ppm的S，S莫納甜或其鹽，約含0-450ppm的R，R莫納甜或其鹽。
57.一種制造含有莫納甜組合物的飲料組合物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)用生物合成途徑在重組細(xì)胞中生產(chǎn)莫納甜或其鹽；(b)從重組細(xì)胞中分離莫納甜組合物，其中所述莫納甜組合物由莫納甜或其鹽及其它可食用或可飲用的物質(zhì)構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有莫納甜的新型飲料組合物以及制造這種組合物的方法。本發(fā)明也涉及含有特定的莫納甜立體異構(gòu)體、莫納甜立體異構(gòu)體的特定混合物和/或通過(guò)生物合成途徑在體內(nèi)(如細(xì)胞內(nèi))或體外生產(chǎn)的莫納甜的飲料組合物。
文檔編號(hào)A23L1/236GK1849078SQ200480024563
公開(kāi)日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2004年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者P·M·西克斯, T·W·阿布拉罕, D·C·卡梅隆, M·J·古森, M·G·林德利, S·C·麥克法蘭, J·R·米利斯, J·羅薩扎, 趙利山, D·P·維那 申請(qǐng)人:嘉吉有限公司