專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)蛋白－蛋白相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于確定目標(biāo)分子之間相互作用的方法。更具體的，其涉及確定一種被稱(chēng)為檢測(cè)化合物的特定物質(zhì)能否調(diào)節(jié)兩種或更多特異的目標(biāo)蛋白的相互作用，其是通過(guò)確定一種在細(xì)胞中的報(bào)道基因的活性是否受調(diào)節(jié)或其缺失而導(dǎo)致活化或失活。利用轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行確定，如同轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染他們所用的試劑一樣其也是本發(fā)明的特征之一。
背景技術(shù)：
蛋白/蛋白相互作用的研究是很熱門(mén)的領(lǐng)域，例如通過(guò)鑒別用于受體的配體。甚至當(dāng)給定受體的一種配體或配體是已知的時(shí)候，仍有必要研究更有效或更具選擇性的配體。GPCRs在這里將作為非窮舉的被這樣研究的蛋白的例子而進(jìn)行討論。
G-蛋白偶聯(lián)受體，或者下文中的″GPCRs″，是已知的人類(lèi)細(xì)胞表面受體最大的種類(lèi)。在被GPCRs識(shí)別的配體之中有激素，神經(jīng)遞質(zhì)，多肽，糖蛋白，脂質(zhì)，核苷酸和離子。他們也作為光線，氣味，外激素，和味道的受體。在這些各種各樣的角色中，也許不會(huì)驚奇它們可以是緊張度研究的主體，以試圖在鑒別各種條件下有用的藥物。成功率是顯著的。事實(shí)上，Howard等在Trends Pharmacol.Sci.，22132-140(2001)評(píng)價(jià)說(shuō)有超過(guò)50％的商品化藥物是這樣的受體。這里所用的″GPCRs″，指的是任何GPCR受體超家族成員，其特征在于七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(7TM)的構(gòu)建子。這些受體的例子包括但不限于，種類(lèi)A或者″視紫紅質(zhì)樣″受體；種類(lèi)B或者″分泌激素樣″受體；種類(lèi)C或者″代謝型谷氨酸樣″受體；卷曲的和平滑的相關(guān)受體；粘附受體家族或者EGF-7TM/LNB-7TM受體；脂聯(lián)素受體以及相關(guān)受體；和化學(xué)感覺(jué)受體包括味覺(jué)，嗅覺(jué)，鼻骨的和外激素受體。例如，在人類(lèi)中
GPCR超家族包括但不限于那些由Vassilatis，等，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004903-4908(2003)公開(kāi)的受體分子；Takeda，等，F(xiàn)EBS Letters，52097-101(2002)；Fredricksson等，Mol.Pharmacol.，631256-1272(2003)；Glusman等，Genome Res.，11685-702(2001)；以及Zozulya等，GenomeBiol.，20018.1-0018.12(2001)，所有這些在此引入作為參考。
GPCRs功能的作用機(jī)制已經(jīng)在某種程度上得以闡明。簡(jiǎn)言之，當(dāng)一種GPCR結(jié)合一種配體時(shí)，構(gòu)型改變的結(jié)果，刺激一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞生理學(xué)的變化。據(jù)認(rèn)為GPCRs通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，雜三聚體的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，或者″G蛋白″的活性來(lái)轉(zhuǎn)換信號(hào)。配體和受體復(fù)合物刺激鳥(niǎo)嘌呤核苷酸變化并且將G蛋白雜三聚體分離成a和βγ亞基。
GTP結(jié)合的a亞基和βγ二聚體都能調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的效應(yīng)蛋白，包括腺苷酰環(huán)化酶和磷脂酶C(PLC)。在傳統(tǒng)的細(xì)胞基礎(chǔ)上的GPCRs檢測(cè)中，受體活性通過(guò)測(cè)量一種G-蛋白調(diào)節(jié)效應(yīng)通路的輸出而被監(jiān)控，例如由腺苷酰環(huán)化酶產(chǎn)生的cAMP的積累，或者由PLC活性刺激的細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。
傳統(tǒng)的G-蛋白基礎(chǔ)上的信號(hào)傳導(dǎo)檢測(cè)受兩個(gè)主要因素的影響很難向某些目標(biāo)發(fā)展。
第一，不同的GPCRs與不同的G蛋白調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)通路相偶聯(lián)，而且G-蛋白基礎(chǔ)上的檢測(cè)取決于認(rèn)識(shí)目標(biāo)受體的特異性G-蛋白，或要求細(xì)胞系統(tǒng)的操縱，以迫使目標(biāo)受體偶聯(lián)至特異的效應(yīng)或通路。第二，所有的細(xì)胞表達(dá)大量的內(nèi)源GPCRs，以及其他信號(hào)因子。結(jié)果，被檢測(cè)的效應(yīng)子通路可能是被除目標(biāo)GPCR之外的其他內(nèi)部分子所調(diào)節(jié)，可能導(dǎo)致假的結(jié)果。
在拮抗劑結(jié)合到GPCR的情況下，GPCR分子C末端絲氨酸和蘇氨酸殘基被磷酸化。這種磷酸化是由GPCR激酶或者″GRK″家族引起的。拮抗劑復(fù)合的C末端磷酸化GPCRs與抑制蛋白家族成員相互作用，其“捕獲”受體信號(hào)。這種結(jié)合抑制受體與G蛋白的偶聯(lián)，因而將受體定為內(nèi)在化目標(biāo)，伴隨著降解和/或回收。因此，配體與GPCR的結(jié)合可以被說(shuō)成是″調(diào)節(jié)″GPCR和抑制蛋白之間的相互作用，因?yàn)榕潴w與GPCR的結(jié)合導(dǎo)致抑制蛋白與GPCR的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)它的活性。至此以后，無(wú)論采用“調(diào)節(jié)″或任何形式，其僅僅指的是本發(fā)明的兩種蛋白的相互作用在檢測(cè)化合物存在時(shí)與該化合物不存在時(shí)這兩種蛋白相或作用比較而得出的變化。例如，檢測(cè)化合物的存在可能加強(qiáng)或提高兩種蛋白的相互作用，能檢測(cè)在某種方面，方式或形式減弱它，抑制它或減少它。
這種背景信息導(dǎo)致檢測(cè)GPCRs活化和抑制的方法的改變。這些方法涉及監(jiān)控與抑制蛋白的相互作用。該方法的主要優(yōu)勢(shì)在于不需要了解G-蛋白通路。
Oakley，等，Assay Drug Dev.Technol.，121-30(2002)和U.S.專(zhuān)利Nos.5,891,646和6,110,693，在此引入作為參考，公開(kāi)了檢測(cè)方法，其檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中激活細(xì)胞表面受體的熒光標(biāo)記的抑制蛋白分子的再分布。這些方法為了檢測(cè)抑制蛋白的再定位和受體活性而對(duì)細(xì)胞圖像分析的依賴(lài)程度很高。對(duì)本領(lǐng)域人員而言，這是一個(gè)涉及復(fù)雜過(guò)程的復(fù)合物。
涉及這些問(wèn)題的各種其他的U.S.專(zhuān)利及專(zhuān)利申請(qǐng)已被登記。例如Bohn等人的U.S.專(zhuān)利No.6,528,271涉及用于篩選疼痛控制藥物的篩選，其中檢測(cè)了β-抑制蛋白的抑制劑。出版的U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)，例如2004/0002119，2003/0157553，2003/0143626，和2002/0132327，全都公開(kāi)了不同的涉及GPCRs的檢測(cè)形式。出版的申請(qǐng)2002/0106379公開(kāi)了一種隨后例子中所用的構(gòu)型；然而，它并沒(méi)有教導(dǎo)或建議這里公開(kāi)的本發(fā)明。
本發(fā)明的目的之一是研發(fā)一種更為簡(jiǎn)單的檢測(cè)，其監(jiān)控和/或確定特異蛋白/蛋白相互作用的調(diào)節(jié)，其中蛋白包括但不限于，膜結(jié)合蛋白，例如受體，尤其是GPCRs。這是如何實(shí)現(xiàn)的將在隨后的例子中得以體現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于確定是否檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)特異目標(biāo)蛋白/蛋白相互作用的方法，其包括使所述化合物與已經(jīng)用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接觸(a)核酸分子其包含，(i)編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，以及(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)核酸分子其包含，(i)編碼在要被檢測(cè)的所述檢測(cè)化合物存在的情況下與所述第一檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，以及(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，并且確定所述報(bào)道基因的活性以確定是否所述化合物調(diào)節(jié)所述蛋白/蛋白的相互作用。
第一檢測(cè)蛋白可以是膜結(jié)合蛋白，例如跨膜受體，特別是GPCR。具體的跨膜受體包括β2-腎上腺素受體(ADRB2)，精氨酸血管加壓素受體2(AVPR2)，血清素受體1a(HTR1A)，m2毒蕈堿性乙酰膽堿受體(CHRM2)，趨化因子(C-C模序)受體5(CCR5)，多巴胺D2受體(DRD2)，卡巴阿片樣物質(zhì)受體(OPRK)，或者ala-腎上腺素受體(ADRA1A)，但是要理解的是在所有情況下本發(fā)明并不限于這些特異的實(shí)施例。例如，例諸胰島素生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1R)，其為酪氨酸激酶，以及不是一般的膜結(jié)合的蛋白比如雌激素受體1(ESR1)和雌激素受體2(ESR2)的分子。蛋白酶或者蛋白酶片段可以是核內(nèi)包涵體A蛋白酶的煙草蝕紋病毒。激活所述報(bào)道基因的蛋白可以是轉(zhuǎn)錄因子，例如tTA或GAL4。第二蛋白可以是抑制性蛋白，例如抑制蛋白。細(xì)胞可以是真核或原核的。報(bào)道基因可以是外源基因，例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶. 編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列可以被修飾以增強(qiáng)與第二檢測(cè)蛋白的相互作用。這樣的修飾包括但不限于采用編碼相比原始序列與所述第二檢測(cè)蛋白具有更高親和性的氨基酸序列的核苷酸序列替換所述第一檢測(cè)蛋白的C-末端區(qū)域的全部或部分核苷酸序列。例如，C-末端區(qū)域可以被編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2RL1，CXCR2/IL-8b，CCR4或GRPR的C-末端區(qū)域的核苷酸序列替換。
該方法可以包含使多于一個(gè)的檢測(cè)化合物與多個(gè)細(xì)胞樣本接觸，每個(gè)所述樣本與一個(gè)或更多所述檢測(cè)化合物相接觸，其中每個(gè)所述細(xì)胞樣本已經(jīng)用前述核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并且在所述多個(gè)所述樣本中確定報(bào)道基因的活性從而確定是否任何所述的檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)特異的蛋白/蛋白相互作用。該方法可以包含使每種所述樣本與一種檢測(cè)化合物接觸，每一種都與其他的不一樣，或者包含使所述檢測(cè)化合物的混合物與每種所述樣本接觸。
在另一實(shí)施方案中，提供了一種用于確定是否檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)一種或更多感興趣的多種蛋白相互作用的方法，其包含使所述檢測(cè)化合物與多個(gè)細(xì)胞樣本接觸，這些細(xì)胞中的每種已經(jīng)采用如下物質(zhì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染(a)第一核酸分子，其包含，(i)編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，編碼蛋白酶剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(ii)編碼激活在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)第二核酸分子，其包含，(i)編碼在感興趣的將被檢測(cè)的所述檢測(cè)化合物存在的情況下與所述第一檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶的核苷酸序列，其中所述第一檢測(cè)蛋白與在所述多個(gè)樣本的每個(gè)中的其他第一檢測(cè)蛋白不同，并且在一個(gè)或更多所述多個(gè)樣本中確定所述報(bào)道基因的活性作為調(diào)節(jié)感興趣的一個(gè)或更多蛋白相互作用的調(diào)節(jié)測(cè)定(結(jié)果)。
第二檢測(cè)蛋白在每種樣本中可以相同也可以不同。所有所述的樣本可以放置于(combine)普通的容器中，并且每種樣本包含不同的第一和第二檢測(cè)蛋白?；蛘呤?，每種樣本可以在不同的容器中檢測(cè)。在給定的樣本中的報(bào)道基因可以與其它樣本中的報(bào)道基因不同。檢測(cè)化合物的混合物可以包含或存在于生物樣本中，例如腦髓液，尿液，血液，血清，膿液，腹水，滑液，組織提取物，或分泌物。
在另一實(shí)施方案中，提供了采用核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞，該核酸分子包含，(a)核酸分子，其包含(i)編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶或蛋白酶片段所識(shí)別的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，以及(iii)編碼在所述細(xì)胞中活化報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，以及(b)核酸分子，其包含，(i)編碼在要檢測(cè)的所述檢測(cè)化合物存在的情況下與第一所述檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，以及(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
所述核酸分子中的一個(gè)或兩者能夠穩(wěn)定整合到所述細(xì)胞的基因組中。細(xì)胞也可以已經(jīng)被所述報(bào)道基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。第一檢測(cè)蛋白可以是膜結(jié)合蛋白，例如跨膜受體，特別是GPCR。特別是跨膜受體包括ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2，OPRK，或ADRA1A。
蛋白酶或蛋白酶片段可以是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。激活所述報(bào)道基因的蛋白可以是轉(zhuǎn)錄因子，例如tTA或GAL4。第二蛋白可以是抑制蛋白。細(xì)胞可以是真核或原核。報(bào)道基因可以是外源基因，例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶。編碼所述第一檢測(cè)蛋白核苷酸序列可以被修飾以增強(qiáng)與所述第二檢測(cè)蛋白的相互作用，例如通過(guò)采用編碼相比于原始序列與所述第二檢測(cè)蛋白具有更高親和性的氨基酸序列的核苷酸序列替換所述第一檢測(cè)蛋白C-末端區(qū)域的全部或部分核苷酸序列。C-末端區(qū)域可以被編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2RL1，CXCR2/IL-8B，CCR4或GRPR的C-末端區(qū)域的核苷酸序列替換。
在另一實(shí)施方案中，提供了分離的核酸分子，其包含，(i)編碼檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，以及(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列。檢測(cè)蛋白可以是膜結(jié)合蛋白，例如跨膜受體?？缒さ鞍椎囊粋€(gè)具體例子是GPCR。具體的跨膜受體包括ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2，OPRK，或ADRA1A。
蛋白酶或蛋白酶片段可以是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。激活所述報(bào)道基因的蛋白可以是轉(zhuǎn)錄因子，例如tTA或GAL4。如上所述，本發(fā)明不能被視為僅僅限于這些具體的實(shí)施方案。
在另一實(shí)施方案中，提供了包含分離的核酸分子的表達(dá)載體，其包含，(i)編碼檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，以及(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，并且其進(jìn)而可被連接至一個(gè)啟動(dòng)子上。
在另一實(shí)施方案中，提供了分離的核酸分子，其包含，(i)編碼在要被檢測(cè)的檢測(cè)化合物存在的情況下與另一種檢測(cè)蛋白相互作用的檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，以及(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。檢測(cè)蛋白可以是抑制蛋白，例如抑制蛋白。
還提供了包含分離的核酸分子的表達(dá)載體，其包含，(i)編碼在要被檢測(cè)的檢測(cè)化合物存在的情況下與另一種檢測(cè)蛋白相互作用的檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，以及(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，所述核酸進(jìn)而可被連接至一個(gè)啟動(dòng)子。
另一實(shí)施方案包括由以下核酸分子表達(dá)的融合蛋白 分離的核酸分子，其包含，(i)編碼檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，以及(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，并且其進(jìn)而可被連接至一個(gè)啟動(dòng)子；或 分離的核酸分子，其包含，(i)編碼在要被檢測(cè)的檢測(cè)化合物存在的情況下與另一種檢測(cè)蛋白相互作用的檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，以及(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
在另一實(shí)施方案中，提供了用于測(cè)定是否檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)感興趣的蛋白/蛋白相互作用的試劑盒，其包含分離的各部分a)核酸分子，其包含編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(i)編碼用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(ii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，以及(b)核酸分子，其包含，(i)編碼在要被檢測(cè)的檢測(cè)化合物存在的情況下與另一種檢測(cè)蛋白相互作用的檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，以及(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異性的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，以及用于分別容納每種(a)和(b)的容器裝置。
第一檢測(cè)蛋白可以是膜結(jié)合蛋白，例如跨膜受體。跨膜受體的具體類(lèi)型可以是GPCR。具體的跨膜蛋白是GPCR。具體的跨膜受體包括ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2，OPRK，或ADRA1A。蛋白酶或蛋白酶的片段可以是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。激活所述報(bào)道基因的蛋白可以是轉(zhuǎn)錄因子，例如tTA或GAL4。第二蛋白可以是抑制蛋白，例如抑制蛋白。試劑盒可進(jìn)一步包含分離的編碼報(bào)道基因的核酸分子的獨(dú)立的部分。報(bào)道基因可以編碼β-半乳糖苷酶或熒光素酶。編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列可以被修飾以增強(qiáng)與所述第二檢測(cè)蛋白的相互作用，例如通過(guò)采用編碼相比于原始序列與所述第二檢測(cè)蛋白具有更高親和性的氨基酸序列的核苷酸序列替換所述第一檢測(cè)蛋白C-末端區(qū)域的全部或部分核苷酸序列。所述C-末端區(qū)域核苷酸序列可以被編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2RL1，CXCR2/IL-8B，CCR4，或GRPR的C-末端區(qū)域的核苷酸序列替換。
要考慮到這里所描述的任何方法或組合物可以被這里所描述的任何其它方法或組合物實(shí)現(xiàn)。單詞“a”在權(quán)利要求或說(shuō)明書(shū)中與術(shù)語(yǔ)“包含”連用時(shí)意味著“一個(gè)”，但是它也意味著“一個(gè)或更多”，“至少一個(gè)”以及“一個(gè)或多于一種”。
本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案結(jié)合下文中的說(shuō)明書(shū)和相應(yīng)的附圖將被更好的領(lǐng)會(huì)。應(yīng)該被理解的是，以下的說(shuō)明書(shū)揭示了各種本發(fā)明的實(shí)施方案和大量具體的細(xì)節(jié)，其是通過(guò)說(shuō)明而并非限制的方式給出。許多取代，修飾，添加和/或重排可以在不脫離本發(fā)明精神的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出，因此本發(fā)明包括所有這樣的替代，修飾，添加和/或重排。


以下的附圖形成了本說(shuō)明書(shū)的一部分并且被包括以進(jìn)一步展示本發(fā)明的特定方面。通過(guò)這些附圖中的一個(gè)或更多與具體實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明相結(jié)合可以更好的理解本發(fā)明。
圖I以圖畫(huà)的形式顯示了本發(fā)明的概念基礎(chǔ)，采用配體-受體結(jié)合作為一個(gè)例子。
圖2a和2b顯示了在根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)中目標(biāo)對(duì)激活劑和拮抗劑劑量依賴(lài)的應(yīng)答。
圖3顯示了不同的目標(biāo)和不同激活劑的劑量應(yīng)答曲線。
圖4描述了根據(jù)本發(fā)明采用D2多巴胺受體獲得的結(jié)果。
圖5a和5b示例了檢測(cè)結(jié)果，該檢測(cè)顯示可以同時(shí)研究?jī)煞N分子。
圖6表明另一“多個(gè)”檢測(cè)的結(jié)果，即，在其中有兩種分子被同時(shí)研究。
圖8代表從根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)中獲得的數(shù)據(jù)，被設(shè)計(jì)成檢測(cè)人I型干擾素受體的活性。
圖9詳細(xì)說(shuō)明圖7中的結(jié)果，顯示被用于產(chǎn)生圖7的細(xì)胞中的IFN-a劑量應(yīng)答曲線。
圖10顯示補(bǔ)充試驗(yàn)的結(jié)果，其中采用不同的轉(zhuǎn)錄因子和不同的細(xì)胞系。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及方法，其用于確定是否感興趣的物質(zhì)調(diào)節(jié)第一檢測(cè)蛋白，例如膜結(jié)合蛋白，象受體，例如跨膜受體，與第二檢測(cè)蛋白，象抑制蛋白家族的成員之間的相互作用。該方法涉及用兩個(gè)構(gòu)建子共轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)染真核或原核細(xì)胞。第一構(gòu)建子包括，一段序列，其編碼(i)第一檢測(cè)蛋白，例如跨膜受體，(ii)蛋白酶識(shí)別的剪切位點(diǎn)，以及(iii)編碼激活報(bào)道基因的蛋白的序列。第二構(gòu)建子包括，(i)編碼與第一檢測(cè)蛋白相互作用的被檢測(cè)和/或被確定的第二檢測(cè)蛋白的一段序列，以及(ii)編碼充分作用于是第一構(gòu)建子一部分的剪切位點(diǎn)的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些構(gòu)建子被穩(wěn)定整合入細(xì)胞中。
在圖1中以圖表示了本發(fā)明實(shí)施方案的特點(diǎn)。簡(jiǎn)言之，首先，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA融合到編碼第一檢測(cè)蛋白的DNA中，例如要研究的跨膜受體分子。這種融合的實(shí)現(xiàn)包括在實(shí)驗(yàn)中采用不能被宿主細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的蛋白酶識(shí)別和裂解位點(diǎn)。
編碼這種第一融合蛋白的DNA被導(dǎo)入并且在依賴(lài)于被融合到第一檢測(cè)蛋白(例如受體)的轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子元件的控制下，被還包含報(bào)道基因序列的細(xì)胞表達(dá)。如果外源蛋白酶不存在，轉(zhuǎn)錄因子仍然維系在第一檢測(cè)蛋白上并且不能進(jìn)入核以刺激報(bào)道基因的表達(dá)。
重組技術(shù)也可以被用于生產(chǎn)第二融合。在所述的實(shí)施方案中，編碼抑制蛋白家族成員的DNA被融合到編碼外源蛋白酶的DNA分子上，結(jié)果在第二融合蛋白中包含第二檢測(cè)蛋白，即抑制蛋白家族成員。
然后進(jìn)行檢測(cè)，其中第二融合蛋白與第一融合蛋白一起被表達(dá)，并且檢測(cè)化合物與細(xì)胞接觸，優(yōu)選特異的時(shí)間長(zhǎng)度。如果檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)兩種檢測(cè)蛋白的相互作用，例如通過(guò)刺激，提高或增強(qiáng)第一和第二檢測(cè)蛋白的聯(lián)系，這會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的釋放，其轉(zhuǎn)而移動(dòng)到核中，并且誘導(dǎo)報(bào)道基因的表達(dá)。報(bào)道基因的活性被檢測(cè)。
在可替代的系統(tǒng)中，兩種檢測(cè)蛋白可以在缺乏檢測(cè)化合物的情況下相互作用，并且檢測(cè)化合物可以導(dǎo)致兩種檢測(cè)蛋白解離，減弱或抑制其相互作用。在這樣的情況下，在檢測(cè)化合物存在時(shí)自由的有功能的活性轉(zhuǎn)錄因子的水平會(huì)降低，導(dǎo)致蛋白水解的下降，并且可檢測(cè)到報(bào)道基因活性的降低。
在所述的實(shí)施方案中，為第二檢測(cè)蛋白的抑制蛋白，在激活劑存在的情況下結(jié)合至受體；然而，要理解的是由于受體僅是類(lèi)型的蛋白，檢測(cè)不依賴(lài)于受體分子的使用，也不取決于僅僅結(jié)合能被涉及的相互作用結(jié)合的激活劑。雖然明顯感興趣的跨膜蛋白，但是任何蛋白都將是可行的。而且，結(jié)合到受體的激活劑不是能被檢測(cè)的結(jié)合的唯一類(lèi)型。人們可以確定激活劑，以及確定根據(jù)本發(fā)明的不同拮抗劑和/或激活劑的相對(duì)強(qiáng)度。
本發(fā)明的其他細(xì)節(jié)包括制造和使用其中主要物質(zhì)的具體方法和技術(shù)，將在下文中描述。
I.表達(dá)構(gòu)建子和轉(zhuǎn)化 術(shù)語(yǔ)″載體″被用來(lái)指載體核酸分子，在其中能夠插入核苷酸序列以便將其導(dǎo)入能被復(fù)制的細(xì)胞。核苷酸序列可以是“外源”的，即意味著其對(duì)于載體被導(dǎo)入的細(xì)胞來(lái)說(shuō)是外來(lái)的或與細(xì)胞中的序列同源的但是在宿主細(xì)胞核酸的位置通常并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該序列。載體包括質(zhì)粒，粘粒，病毒(噬菌體，動(dòng)物病毒和植物病毒)，以及人工染色體(例如YACs)。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)構(gòu)建載體(例如，參見(jiàn)Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor，1990)以及Ausubel，等，1994，Current Protocols InMolecular Biology(John Wiley & Sons，1996)，兩者都引入作為參考)。
術(shù)語(yǔ)″表達(dá)載體″指的是任何類(lèi)型的遺傳構(gòu)建子，其包含編碼能夠翻譯的RNA的核酸。在某些情況下，RNA分子隨后被翻譯成蛋白，多肽或肽。在其他情況下，這些序列不被翻譯，例如，反義分子或核酶的產(chǎn)物。表達(dá)載體可以包含多個(gè)“控制序列”，其指的是在特定的宿主細(xì)胞中可操作的連接編碼序列轉(zhuǎn)錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除了管理轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列之外，載體和表達(dá)載體可以包含行使其它功能的核酸序列并在下文中描述。
在特定實(shí)施方案中，質(zhì)粒載體被設(shè)計(jì)用于克隆和基因傳遞。一般地，包含取自能與宿主細(xì)胞相容物種中的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體被用于與這些宿主結(jié)合。載體通常攜帶了一個(gè)復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。在一個(gè)非限制性的例子中，E.Coli經(jīng)常采用pBR322的衍生物轉(zhuǎn)化，其為源自E.coli物種的質(zhì)粒。pBR322含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因并且因而提供了識(shí)別轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)易方法。pBR質(zhì)粒，或其他微生物質(zhì)?；蚴删w必須還要包含，或被修飾以包含，例如，能被微生物有機(jī)體利用以表達(dá)其自身蛋白的啟動(dòng)子。
此外，包含能與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體可被用作轉(zhuǎn)化載體與這些宿主結(jié)合。例如，噬菌體λGEMTM-11可用于制造重組噬菌體載體，其能被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如，E.coli LE392。
細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如，包含表達(dá)載體的E.coli，生長(zhǎng)在任何合適的培養(yǎng)基，例如，LB。在特定載體中的重組蛋白的表達(dá)可以通過(guò)使宿主細(xì)胞與特定啟動(dòng)子特異的試劑相接觸，例如通過(guò)轉(zhuǎn)換到培養(yǎng)基中添加IPTG或通過(guò)在更高溫度中間斷而被誘導(dǎo)，這是本領(lǐng)域人員可以理解的。在培養(yǎng)菌株更長(zhǎng)一段時(shí)間后，一般為2至24小時(shí)，通過(guò)離心收集細(xì)胞并清洗以去除殘余的培養(yǎng)基。
表達(dá)系統(tǒng)的其他例子包括STRATAGENE的COMPLETECONTROLTM可誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其包含合成蛻皮激素-可誘導(dǎo)的受體，或者它的pET表達(dá)系統(tǒng)，E.coli表達(dá)系統(tǒng)。另一種可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)的例子是來(lái)自INVITROGENO，其攜帶T-REXTM(四環(huán)素調(diào)節(jié)的表達(dá))系統(tǒng)，采用全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。INVROGEN還提供酵母表達(dá)系統(tǒng)名稱(chēng)為Pichia methanolica表達(dá)系統(tǒng)，其被設(shè)計(jì)成在嗜甲醇酵母Pichia methanolica中高表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何表達(dá)載體，例如表達(dá)構(gòu)建子，以生產(chǎn)核酸序列或其同源的多肽，蛋白，或肽。
調(diào)節(jié)信號(hào) 構(gòu)建子可以包含附加的5′和/或3′元件，例如啟動(dòng)子，poly A序列等等。元件可以源自宿主細(xì)胞，即與宿主同源，或者它們可以源自不同的來(lái)源即異源的。
″啟動(dòng)子″是一段核酸序列的控制序列，其控制轉(zhuǎn)錄起始和速度。它可包含調(diào)節(jié)蛋白的分子可以結(jié)合的遺傳元件，例如RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄因子，以起始核酸序列的特異轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)“可操作地位于”，“可操作地連接”，“控制下”和“轉(zhuǎn)錄控制下”意味著啟動(dòng)子相對(duì)于核酸序列是處于正確的功能位置和/或方向，從而控制該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。
啟動(dòng)子一般包含位于RNA合成起始位點(diǎn)的序列。這種情況的最佳例子是TATA盒，但是在某些缺乏TATA盒的啟動(dòng)子中，例如，哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和SV40后期基因的啟動(dòng)子，覆蓋起始位點(diǎn)分離元件，以幫助固定起始位置。附加的啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。典型地，這些元件位于起始位點(diǎn)上游的30-110堿基區(qū)域，雖然許多啟動(dòng)子已被顯示包含位于起始位點(diǎn)下游的功能元件。為了攜帶在啟動(dòng)子“控制下”的編碼序列，將轉(zhuǎn)錄閱讀框架的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5‘端定位于所選擇啟動(dòng)子的“下游”(即3’端)?！吧嫌巍眴?dòng)子刺激DNA的轉(zhuǎn)錄和所編碼RNA的表達(dá)。
啟動(dòng)子元件之間的間隔通常是可變的，因此當(dāng)元件被顛倒或彼此移動(dòng)時(shí)啟動(dòng)子的功能被保持。在tk啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件之間的間隔在活性開(kāi)始下降之前可以提高到50堿基。取決于啟動(dòng)子，表現(xiàn)出單個(gè)元件能夠協(xié)同或單獨(dú)激活轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以或不可以與“增強(qiáng)子”結(jié)合，增強(qiáng)子指的是涉及核酸序列轉(zhuǎn)錄活性的順式作用調(diào)節(jié)序列。
一個(gè)啟動(dòng)子可以是一個(gè)天然與核酸分子結(jié)合的，也可以是通過(guò)分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列。這樣的一個(gè)啟動(dòng)子可以被稱(chēng)為“內(nèi)源”的。相似地，一個(gè)增強(qiáng)子可以是一個(gè)天然與核酸分子結(jié)合的，位于該序列的上游或下游?？商鎿Q地，通過(guò)將編碼核酸片段定位在重組或異源啟動(dòng)子的控制之下可獲得一定的優(yōu)勢(shì)，其指的啟動(dòng)子是指在其正常的天然環(huán)境中沒(méi)有與核酸結(jié)合。重組或異源的增強(qiáng)子也指的是正常的在其天然環(huán)境中沒(méi)有與核酸結(jié)合的增強(qiáng)子。這樣的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可以包括其它基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以及從其他病毒，原核或真核細(xì)胞分離的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，和非“天然產(chǎn)生的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即包含不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和/或改變表達(dá)的突變的不同元件。例如，最常用于重組DNA構(gòu)建子中的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)。除了產(chǎn)生合成的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子核酸序列之外，序列可以采用重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生，包括PCRTM，結(jié)合這里公開(kāi)的組合物(參見(jiàn)U.S.專(zhuān)利Nos.4,683,202和5,928,906，在此引入作為參考)。而且，設(shè)計(jì)成在非核細(xì)胞器官例如線粒體，葉綠體，及其類(lèi)似物中直接轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)序列的控制序列也可以被采用。
天然地，采用一個(gè)能在選擇用于表達(dá)的細(xì)胞器官，細(xì)胞類(lèi)型，組織，器官，或有機(jī)體中有效直接表達(dá)DNA片段的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子將是重要的。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般都知道采用啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，和重組細(xì)胞類(lèi)型用于蛋白表達(dá)，(參見(jiàn)，例如Sambrook，等，1989，在此引入作為參考)。所采用的啟動(dòng)子可以是組成性的，組織特異的，可誘導(dǎo)的，和/或在適宜條件下能夠高表達(dá)被導(dǎo)入的DNA片段，這樣在重組蛋白和/或肽的大規(guī)模生產(chǎn)中有優(yōu)勢(shì)。啟動(dòng)子可以是異源的或內(nèi)源的。
此外，任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(根據(jù)，例如，真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)基礎(chǔ)庫(kù)EPDB，www.epd.isb-sib.ch/)也可用于操縱表達(dá)。利用T3，T7或SP6細(xì)胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是另一種可行的實(shí)施方案。如果提供了合適的細(xì)菌聚合酶，真核細(xì)胞可以支持從特定細(xì)菌啟動(dòng)子所進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，作為釋放復(fù)合物的一部分或作為附加的遺傳表達(dá)構(gòu)建子。
對(duì)于編碼序列有效地翻譯也可以要求一個(gè)特異的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG啟動(dòng)密碼子或鄰近序列。包括外源翻譯控制信號(hào)ATG啟動(dòng)密碼子，可能需要被提供。本領(lǐng)域的人員將很容易確定這一點(diǎn)并提供必需的信號(hào)。公知的是啟動(dòng)密碼子必須“在框架內(nèi)”處于預(yù)定的編碼序列的框架中以確保整個(gè)插入子的翻譯。外源翻譯控制信號(hào)和啟動(dòng)密碼子既可以是天然的也可以是合成的。表達(dá)的效率可以通過(guò)包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件而被增強(qiáng)。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，內(nèi)源核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件被用于產(chǎn)生多基因或多順?lè)醋拥男畔?。IRES元件能夠繞過(guò)5′甲基化帽子依賴(lài)翻譯的核糖體掃描模型并在內(nèi)部位點(diǎn)開(kāi)始翻譯(Pelletier和Sonenberg，Nature，334320-325(1988))。來(lái)自細(xì)小核糖核酸病毒家族的兩個(gè)成員的IRES元件(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒)已經(jīng)被公開(kāi)(上述的Pelletier和Sonenberg)，以及來(lái)自哺乳動(dòng)物信息的IRES(Macejak和Sarnow，Nature，35390-94(1991))1991)。IRES元件可以被連接至異源的開(kāi)放閱讀框架。多個(gè)開(kāi)放閱讀框架可以被一起轉(zhuǎn)錄，每個(gè)由一個(gè)IRES分離開(kāi)，產(chǎn)生多順?lè)醋有畔ⅰＭㄟ^(guò)IRES元件的特性，每個(gè)開(kāi)放閱讀框架能靠近核糖體以便有效翻譯。采用單個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄單個(gè)信息就可以有效表達(dá)多個(gè)基因(參見(jiàn)U.S.專(zhuān)利Nos.5,925,565和5,935,819，每個(gè)在此引入作為參考)。
其它載體序列元件 載體可以包括多個(gè)克隆位點(diǎn)(MCS)，其為包含多個(gè)限制性酶位點(diǎn)的核酸區(qū)，其任何一個(gè)能被用于與標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)結(jié)合以消化載體(參見(jiàn)，例如，Carbonelli，等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，172(1)75-82(1999)，Levenson，等，Hum.Gene Ther.9(8)1233-1236(1998)，以及Cocea，Biotechniques，23(5)814-816(1997))，在此引入作為參考)“限制性酶消化”指的是用一種僅僅作用于核酸分子中特異位置的酶來(lái)催化核酸分子的剪切。許多這樣的限制性酶可以從商品中獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解這樣酶的利用。通常，一個(gè)載體采用限制性酶在MCS內(nèi)剪切從而線性化或片斷化以使外源序列被連接到載體。″連接″指的是在兩個(gè)可以是或不是連續(xù)的核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。涉及限制性酶和連接反應(yīng)的技術(shù)對(duì)于重組領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。
大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的真核RNA分子要進(jìn)行RNA剪接以從原始轉(zhuǎn)錄本中去除內(nèi)含子。含有基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點(diǎn)以確保用于蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的正確過(guò)程(參見(jiàn)，例如，Chandler等，1997，在此引入作為參考)。
本發(fā)明的載體或構(gòu)建子一般包含至少一個(gè)終止信號(hào)。一個(gè)″終止信號(hào)″或″終止子″包含參與通過(guò)RNA聚合酶的RNA轉(zhuǎn)錄本特異終止的DNA序列。這樣，在特定實(shí)施方案中設(shè)計(jì)了結(jié)束RNA轉(zhuǎn)錄本生產(chǎn)的終止信號(hào)。在體內(nèi)一個(gè)終止子可能是必需的以達(dá)到理想的信號(hào)水平。
在真核系統(tǒng)中，終止子區(qū)域還可以包含允許新轉(zhuǎn)錄本位點(diǎn)特異剪切的特異DNA序列以便于暴露聚腺苷酸化位點(diǎn)。其指示一個(gè)特異的內(nèi)源聚合酶一段大約200腺苷殘基(polyA)的序列加至轉(zhuǎn)錄本的3′端。采用這種聚A尾巴修飾的RNA分子更加穩(wěn)定并且被更有效地翻譯。因此，在涉及真核的其他實(shí)施方案中，優(yōu)選的是終止子包含一個(gè)用于RNA剪切的信號(hào)，更優(yōu)選的是終止子信號(hào)提高了聚腺苷酸化的信息。終止子和/或聚腺苷酸化位點(diǎn)元件可服務(wù)于增強(qiáng)信息水平并使從閱讀框通讀而進(jìn)入其它序列最小化。
設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的終止子包括任何這里描述的或本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)錄本的終止子，包括但不限于，例如，基因的終止序列，例如牛生長(zhǎng)激素終止子，病毒終止序列，例如SV40終止子。在特定實(shí)施方案中，終止信號(hào)可以是可轉(zhuǎn)錄的或可翻譯序列的缺失，例如一個(gè)由于基因截?cái)鄬?dǎo)致的不可轉(zhuǎn)錄或不可翻譯的序列。
在表達(dá)中，特別是真核表達(dá)，其典型地包括一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)以有效促進(jìn)轉(zhuǎn)錄本的正確聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信號(hào)的特性不被認(rèn)為是本發(fā)明成功操作的關(guān)鍵并可使用任何這樣的序列。優(yōu)選的實(shí)施方案包括SV40聚腺苷酸化信號(hào)或牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)，兩者都是方便的，容易得到的，并且已知在各種目標(biāo)細(xì)胞中都具有良好功能。聚腺苷酸化可以提高轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性或促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸。
為了在宿主細(xì)胞中增殖載體，可包括一個(gè)或更多復(fù)制位點(diǎn)(經(jīng)常被稱(chēng)為″ori″)，其為復(fù)制被起始的特異核苷酸序列?？商娲?，如果宿主細(xì)胞是酵母可采用一個(gè)自主復(fù)制序列(ARS)。
轉(zhuǎn)化方法 用于本發(fā)明的合適的核酸遞送方法被認(rèn)為包括事實(shí)上任何這里所描述的或本領(lǐng)域公知的可將核酸分子(例如DNA)導(dǎo)入細(xì)胞中的方法。這樣的方法包括，但不限于，直接分送DNA例如通過(guò)來(lái)自體內(nèi)(ex vivo)的轉(zhuǎn)染(Wilson等，Science，2441344-1346(1989)，(Nabel等，Science，2441342-1344(1989)，并通過(guò)注射(U.S.專(zhuān)利Nos.5,994,624，5,981,274，5,945,100，5,780,448，5,736,524，5,702,932，5,656,610，5,589,466和5,580,859每個(gè)都在此引入作為參考)，包括微注射(Harlan和Weintraub，J.Cell Biol.，101(3)1094-1099(1985)；U.S.專(zhuān)利No.5,789,215，在此引入作為參考)；通過(guò)電穿孔(U.S.專(zhuān)利No.5,384,253，在此引入作為參考；Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6716-718(1986)；Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，817161-7165(1984)；通過(guò)磷酸鈣沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52456-467(1973)；Chen和Okayama，Mol.CellBiol.，7(8)2745-2752(1987)；Rippe等，Mol.CellBiol.，10689-695(1990)；通過(guò)采用DEAE-葡聚糖隨后采用聚乙二醇(Gopal，Mol.Cell Biol.，51188-190(1985)；通過(guò)直接聲波裝載(Fechheimer，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(17)8463-8467(1987)；通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Nicolau和Sene，Biochem.&Biophys.Acta.，721185-190(1982)；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352(1979)；Nicolau，等，Meth.Enzym.，149157-176(1987)；Wong，等，基因，10879-894(1980)；Kaneda等，Science，243375-378(1989)；Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364(1991)和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432(1987)；Wu和Wu，1988)；通過(guò)PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh，等，Plant Mol.Biol.，21(3)415-428(1987)；U.S.專(zhuān)利Nos.4,684,611和4,952,500，在此引入作為參考)；通過(guò)干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199(2)169-177(1985)，以及任何這樣方法的結(jié)合。
II.檢測(cè)系統(tǒng)的組成 對(duì)于這里所描述的方法，作為本發(fā)明特征的產(chǎn)品具有優(yōu)選的實(shí)施方案。例如，在“三部分構(gòu)建子”中，即包含編碼檢測(cè)蛋白，剪切位點(diǎn)，和活化劑蛋白的序列，檢測(cè)蛋白優(yōu)選膜結(jié)合蛋白，例如跨膜受體，例如，GPCR家族的成員。這些序列可以被修飾以便它們編碼的蛋白的C末端具有與第二蛋白更好和更強(qiáng)的相互作用。修飾可以包括，例如，用編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2PLI，CCR4，CXCR2/IL-8，CCR4，或GRPR的C末端編碼區(qū)域置換例如GPCR檢測(cè)蛋白編碼序列的C-末端，，所有這些如前定義。
激活報(bào)道基因的蛋白可以是在核內(nèi)作用的蛋白，就像轉(zhuǎn)錄因子(例如tTA，GAL4等)，或者它可以是產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的分子，導(dǎo)致通過(guò)另蛋白的細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)。本領(lǐng)域人員很熟悉這樣的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
第二構(gòu)建子，如上所述，包括編碼與第一蛋白相互作用的蛋白的區(qū)域，導(dǎo)致一些可檢測(cè)的現(xiàn)象。該蛋白可以是活化劑，抑制劑或，更多，通常地，第一蛋白的“調(diào)節(jié)劑”。抑制蛋白家族成員是優(yōu)選的，特別是在第一蛋白是GPCR時(shí)，但是也可以采用其他蛋白編碼序列，特別是在第一蛋白不是GPCR時(shí)。這些兩部分構(gòu)建子的第二部分編碼蛋白酶，或蛋白酶的片段，其用于從由第一構(gòu)建子編碼的融合蛋白中去除活化分子。
然而，這些優(yōu)選的實(shí)施方案如隨后要討論的補(bǔ)充實(shí)施方案一樣并不是限制本發(fā)明。
宿主細(xì)胞 這里所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可以相互變化使用。所有這些術(shù)語(yǔ)也包括它們的后代，任何以及所有隨后的傳代。要理解的是后代可能因?yàn)橛?jì)劃或偶然的突變而不相同。宿主細(xì)胞一般已經(jīng)被工程化以表達(dá)可篩選的或可選擇的標(biāo)記，其被隨著第一檢測(cè)蛋白，作為融合蛋白一部分的轉(zhuǎn)錄因子激活。
在表達(dá)異源的核酸序列的內(nèi)容中，″宿主細(xì)胞″指的是能夠復(fù)制載體和/或表達(dá)由載體所編碼的異源基因的原核或真核細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞用核酸分子″轉(zhuǎn)染″或″轉(zhuǎn)化″時(shí)，它們被稱(chēng)為″重組″細(xì)胞或宿主細(xì)胞，例如，一種被外源核酸序列，例如載體所引入的細(xì)胞。因此，重組細(xì)胞是可以與不包含被引入重組核酸的天然發(fā)生細(xì)胞相區(qū)別的。
大量的細(xì)胞系和培養(yǎng)物可被用作宿主細(xì)胞，作為它們可以從American Type Culture Collection(ATCC)中獲得，其為獲得活培養(yǎng)物和遺傳材料的機(jī)構(gòu)(www.atcc.org)。本領(lǐng)域人員可以根據(jù)載體的主鏈和預(yù)期的結(jié)果來(lái)確定合適的宿主。例如質(zhì)?；蛘沉?，可以被引入原核宿主細(xì)胞用于復(fù)制許多載體?？傻玫接糜谳d體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型包括但不限于，細(xì)菌，例如E.coli(例如，E.coli菌株RR1，E.coli LE392，E.coli B，E.coli X 1776(ATCC No.31537)以及E.coliW3110(F-，lambda-，prototrophic，ATCC No.273325)，DH5α，JM109，和KC8，桿菌例如枯草芽孢桿菌；以及其它腸桿菌例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌，粘質(zhì)沙雷菌(Serratia rnarcescens)，各種假單胞桿菌屬種類(lèi)，以及各種商業(yè)可獲得的細(xì)菌宿主例如SURECompetent細(xì)胞和SOLOPACKTMGold細(xì)胞(STRATAGENELa Jolla)。在特定實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞例如E.coli LE392被特別設(shè)計(jì)作為噬菌體病毒的宿主細(xì)胞。
用于復(fù)制和/或表達(dá)載體的真核宿主細(xì)胞的例子包括，但不限于，HeLa，NIH3T3，Jurkat，293，COS，CHO，Saos，和PC12。來(lái)自各種細(xì)胞類(lèi)型和有機(jī)體的宿主細(xì)胞是可獲得的并且對(duì)本領(lǐng)域人員是已知的。相似的，病毒載體可被用于與真核或原核宿主細(xì)胞相結(jié)合，尤其是能夠用于載體的復(fù)制或表達(dá)的細(xì)胞。
檢測(cè)蛋白 本發(fā)明考慮任何兩種相互作用是已知的或猜測(cè)的蛋白。蛋白將作為融合蛋白存在，第一檢測(cè)蛋白融合到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，而第二檢測(cè)蛋白融合到識(shí)別位于第一檢測(cè)蛋白的剪切位點(diǎn)的蛋白酶上，該位點(diǎn)的剪切導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子釋放。對(duì)于檢測(cè)蛋白/融合子的唯一要求是(a)第一檢測(cè)蛋白在剪切前不能定位于核，并且(b)在與第二檢測(cè)蛋白融合以及第一檢測(cè)蛋白與第二檢測(cè)蛋白結(jié)合之后該蛋白酶都要維持活性。
對(duì)應(yīng)于第一構(gòu)建子，第一檢測(cè)蛋白可以是，例如，天然膜結(jié)合蛋白，或者是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)被工程化后成為膜結(jié)合的。第一檢測(cè)蛋白可以是，例如，跨膜受體，例如任何的GPCRs，或感興趣的任何跨膜受體，包括，但不限于，酪氨酸激酶受體，絲氨酸蘇氨酸激酶受體，細(xì)胞因子受體等等。而且，公知的是蛋白片段，將以與第一檢測(cè)蛋白全長(zhǎng)同樣的方式起作用，第一檢測(cè)蛋白這樣的活性片段通過(guò)這里定義的蛋白來(lái)囊括。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然的是，本發(fā)明可以用于檢測(cè)任何蛋白的相互作用，并且不限于檢測(cè)膜結(jié)合受體，比如GPCRs。例如，其它種類(lèi)跨膜受體的活性，包括但不限于受體酪氨酸激酶(RTKs)，例如IGF11R，例如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，ErbB2/HER2/Neu或相關(guān)RTKs；絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta(TGFβ)，活化素，或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)受體；細(xì)胞因子受體，例如干擾素家族受體，白細(xì)胞介素、促紅細(xì)胞生成素、G-CSF、GM-CSF、腫瘤壞死因子(TNF)和瘦素leptin受體；以及其它受體，其不一定必須是膜結(jié)合的，例如雌激素受體1(ESR1)，和雌激素受體2(ESR2)。在每種情況中，該方法涉及用調(diào)控包含感興趣的受體的嵌合蛋白表達(dá)的經(jīng)修飾了的受體構(gòu)建子轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該構(gòu)建子添加了蛋白酶剪切位點(diǎn)以及編碼轉(zhuǎn)錄因子的核酸分子。調(diào)控由感興趣的蛋白融合至識(shí)別和裂解上面所述位點(diǎn)的蛋白酶組成的嵌合蛋白的表達(dá)的第二構(gòu)建子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，。在RTKs的情況下，例如EGFR，這種相互作用的蛋白可以由班漢蛋白或其片段的SH2組成(Src同源結(jié)構(gòu)域2)，例如磷脂酶C(PLC)或包含轉(zhuǎn)化蛋白1(SHC1)的Src同源結(jié)構(gòu)域2。在絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的情況下，例如TGFβ，活化素，BMP受體，這種相互作用蛋白可以是Smad蛋白或其片段。在細(xì)胞因子受體的情況下，例如干擾素-α/β或干擾素-γgamma受體，這種相互作用蛋白可以是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子(STAT)蛋白，例如，但不限于，Statl，Stat2；Janus激酶(JAK)蛋白Jak1，Jak2或Tykk2或其片段。在每種情況中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞包含一個(gè)被融合至受體的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)的報(bào)道基因。然后，檢測(cè)通過(guò)用檢測(cè)化合物處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞一定的時(shí)間并且在檢測(cè)時(shí)期結(jié)束時(shí)檢測(cè)報(bào)道基因的活性而得以進(jìn)行。如果檢測(cè)化合物激活感興趣的受體，感興趣的受體和相互作用蛋白之間的相互作用被刺激，導(dǎo)致蛋白酶位點(diǎn)的剪切和融合的轉(zhuǎn)錄因子的釋放，其作為報(bào)道基因活性的提高轉(zhuǎn)而可得到檢測(cè)。
其它可能的蛋白對(duì)包括抗體-配體，酶-底物二聚蛋白，信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成員，以及本領(lǐng)域公知的其他蛋白對(duì)。
報(bào)道基因 激活報(bào)道基因的蛋白可以是對(duì)基因具有影響的任何蛋白，其表達(dá)或缺乏會(huì)導(dǎo)致可檢測(cè)的信號(hào)。典型的蛋白報(bào)道基因包括酶，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，β-葡糖醛酸酶(GUS)或β-半乳糖苷酶。也考慮熒光素和化學(xué)發(fā)光蛋白例如綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白，藍(lán)綠色熒光蛋白，熒光素酶，β內(nèi)酰胺酶，以及堿性磷酸酶。
轉(zhuǎn)錄因子和阻抑蛋白 根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)錄因子被用于激活在工程化宿主細(xì)胞中的報(bào)道基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子典型的根據(jù)它們的DNA結(jié)合區(qū)域來(lái)分類(lèi)，一般為(a)鋅指，(b)螺旋-拐彎-螺旋，(c)亮氨酸拉鏈，(d)螺旋-圈-螺旋，或(e)高度可變基團(tuán)。轉(zhuǎn)錄因子的活化結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄裝置的元件(RNA聚合酶)以及其它調(diào)節(jié)蛋白相互作用，因此影響DNA結(jié)合的效率。
Rel/核因子κB(NF-κB)和激活因子-1(AP-1)是最常被研究的轉(zhuǎn)錄因子家族。它們被鑒定為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的成員，會(huì)導(dǎo)致病理結(jié)果，例如炎癥和腫瘤發(fā)生。其它轉(zhuǎn)錄因子家族包括熱休克/E2F家族，POU家族和ATF家族。具體的轉(zhuǎn)錄因子，例如tTA和GAL4，被考慮用在本發(fā)明中。
雖然轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)可以利用的分子，檢測(cè)也可以被修飾以接受采用轉(zhuǎn)錄抑制分子，其中可檢測(cè)信號(hào)是信號(hào)發(fā)生器的下調(diào)節(jié)，或甚至是細(xì)胞死亡。
蛋白酶和剪切位點(diǎn) 蛋白酶是特征為在特定位點(diǎn)剪切其他蛋白的酶。Ser/Thr蛋白酶家族，在絲氨酸和蘇氨酸殘基剪切。其它蛋白酶包括半胱氨酸或巰基蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金屬蛋白酶，氨基肽酶，雙&三肽酶，羧基肽酶，以及肽基肽酶。這些物質(zhì)的選擇留給本領(lǐng)域技術(shù)人員并且特定的需要并不局限于在這里描述的這些分子。公知的是酶具有催化區(qū)域并且這些可以被用來(lái)替代全長(zhǎng)的蛋白酶。這些也包括在本發(fā)明中。一個(gè)具體實(shí)施方案是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶，或其活性片段。也可以采用其他用于蛋白酶的特異剪切位點(diǎn)，這對(duì)于本領(lǐng)域人員是顯而易見(jiàn)的。
檢測(cè)蛋白的修飾 在此檢測(cè)中，第一檢測(cè)蛋白可以被修飾以增強(qiáng)與相互作用蛋白的結(jié)合。例如，已知的是特定的GPCRs在配體的刺激下能更穩(wěn)定或更具親和性地結(jié)合抑制蛋白并且這種增強(qiáng)的相互作用被獨(dú)立的介導(dǎo)，例如，C-末端的絲氨酸和蘇氨酸殘基簇(Oakley等，J.Biol.Chem.，27432248-32257，1999和Oakley，等，J.Biol.Chem.，27619452-19460，2001)。采用這作為例子，清楚的是受體編碼序列本身可以被修飾，以便提高膜結(jié)合蛋白的親和性，例如受體與其結(jié)合的蛋白。這樣修飾的例子是對(duì)膜結(jié)合蛋白C-末端區(qū)域的修飾，例如，受體，例如如上所描述的那些，其包括用相應(yīng)的與結(jié)合蛋白具有更高親和性但是不影響受體功能的另一種受體的區(qū)域替換其一部分。在前的例子16和20，顯示了本發(fā)明這種特征的實(shí)施方案。
此外，第二檢測(cè)蛋白可以被修飾以增強(qiáng)其與第一檢測(cè)蛋白的相互作用。例如，檢測(cè)可以摻入點(diǎn)突變的、截?cái)嗟幕蚱渌凅w的第二檢測(cè)蛋白，例如，已知的與激活劑-偶聯(lián)的GPCRs結(jié)合更穩(wěn)定的或在磷酸化非依賴(lài)方式中的抑制蛋白(Kovoor，等，J.Biol.Chem.，2746831-6834，1999)。
III.檢測(cè)方式 如上所述，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中提供了一個(gè)直接的方法去檢測(cè)當(dāng)表達(dá)在一個(gè)相同的細(xì)胞中時(shí)兩種蛋白的相互作用。一個(gè)第一構(gòu)建子，如上所述，包含編碼第一蛋白的序列，其連接至一個(gè)編碼用于蛋白酶或蛋白酶片段的剪切位點(diǎn)的序列，該序列本身連接在編碼報(bào)道基因激活子的序列。采用″連接著″指的是所描述的序列被融合以產(chǎn)生單一的，完整的開(kāi)放閱讀框架，其可以被翻譯成包含所有元件的單一多肽的序列。這些可以是，但不必須是，被可以編碼或不編碼附加蛋白或肽的附加核苷酸序列分離開(kāi)。插入重組細(xì)胞中的第二構(gòu)建子也在上文中被描述了，即它既包含編碼第二蛋白的序列也包含編碼蛋白酶或蛋白酶片段的序列?？偠灾?，這些元件在與能夠影響所尋找的目標(biāo)蛋白相互作用的待選試劑結(jié)合時(shí)構(gòu)成了基本的檢測(cè)方式。
然而，本發(fā)明也用于檢測(cè)多于膜結(jié)合蛋白，例如受體，同時(shí)采用不同的報(bào)道基因，每被一個(gè)蛋白激活，例如這里所描述的蛋白種類(lèi)。例如，這可以通過(guò)采用不同的受體構(gòu)建子和不同的報(bào)道基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合而實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)將不同的轉(zhuǎn)錄因子融合至每個(gè)檢測(cè)受體，并且采用檢測(cè)化合物檢測(cè)每個(gè)報(bào)道基因的活性。例如，它可以是確定是否感興趣的分子激活第一受體并還可以確定作為與第二受體相互作用的結(jié)果的副效應(yīng)是否是預(yù)期的。在這樣的情況中，例如，采用編碼第一受體和第一報(bào)道子的第一細(xì)胞系，例如lacZ，以及編碼第二受體和第二報(bào)道子的第二細(xì)胞系，例如GFP。這樣系統(tǒng)的優(yōu)選實(shí)施方案見(jiàn)于實(shí)施例17和18。人們可以混合這兩種細(xì)胞系，加入感興趣的化合物，并尋找對(duì)一個(gè)具有正效應(yīng)而對(duì)另一個(gè)沒(méi)有效應(yīng)的物質(zhì)。
要知道的是本發(fā)明既涉及檢查的是相互作用檢測(cè)蛋白的單一對(duì)的方法，但是更為優(yōu)選的是，其也可以指的是這里的采用“多個(gè)”檢測(cè)的方法。這樣的檢測(cè)可以各種方法進(jìn)行，但是在所有的情況下，多于一對(duì)的檢測(cè)蛋白被同時(shí)檢測(cè)。這可以被實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)提供多于一個(gè)細(xì)胞樣本，每種都已經(jīng)被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，以檢測(cè)每種的蛋白相互作用對(duì)。不同的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以在一個(gè)容器中結(jié)合并被同時(shí)檢測(cè)，或者將每種不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)化置于不同的孔中，然后檢測(cè)。
這里所描述的用于多個(gè)檢測(cè)的細(xì)胞可以是，但不必須是相同的。類(lèi)似地，在每種樣本中所采用的報(bào)道子系統(tǒng)可以是，但不必須是相同的。在樣本或多個(gè)樣本被置入容器中后，例如微量檢測(cè)板的孔中，抗(against)容器中所產(chǎn)生的多個(gè)蛋白相互作用一種或多種化合物可以被篩選。
構(gòu)建子所表達(dá)的融合蛋白也是本發(fā)明的一個(gè)特征。對(duì)于本領(lǐng)域人員來(lái)說(shuō)本發(fā)明的其它特征很清楚包括，能鑒別融合蛋白以及用于確定蛋白存在的檢測(cè)基礎(chǔ)上的各種蛋白的抗體，以及雜交檢測(cè)，例如基于PCR(確定基因的表達(dá))的檢測(cè)。
III.試劑盒
這里所描述的任何組合物都將包含在試劑盒中。這樣，試劑盒將包含處于合適包裝方式的本發(fā)明的載體或細(xì)胞，以及根據(jù)本發(fā)明所采用的任何附加試劑。
試劑盒可以包含合適的整數(shù)倍的本發(fā)明的組合物。試劑盒的成分可以為液體的或凍干的形式包裝起來(lái)。試劑盒的包裝中一般包括至少一個(gè)玻璃瓶，試管，培養(yǎng)瓶，瓶子，注射器或其他容器方式，在其中可放置成分，并且優(yōu)選地，合適的整數(shù)倍。在試劑盒中有多于一種成分時(shí)，試劑盒也一般會(huì)包含第二，第三或其他附加容器，使得附加成分可以單獨(dú)放置。然而，各種成分的結(jié)合物可以放置在一個(gè)瓶子中。本發(fā)明的試劑盒還典型的包含用于容納試劑容器的裝置，以便用于商品銷(xiāo)售。這樣的容器可以包括注射或吹模塑料容器以便放置預(yù)定的瓶子。
當(dāng)試劑盒的成分是以一種和/或更多液體溶液提供時(shí)，液體溶液是一種水溶液，特別優(yōu)選無(wú)菌水溶液。然而，試劑盒的成分可以以干的粉末提供。當(dāng)試劑和/或成分以干的粉末提供時(shí)，粉末可以通過(guò)合適的溶劑而重構(gòu)成。預(yù)想的是溶劑可以以另一種包裝方式提供。
IV.實(shí)施例
描述本發(fā)明的特異實(shí)施方案將見(jiàn)于以下實(shí)施例中，但本發(fā)明不限于此。
實(shí)施例1
一個(gè)融合構(gòu)建子采用編碼人β2腎上腺素受體的DNA而產(chǎn)生，編碼人β2腎上腺素受體的DNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)在這里及以后被稱(chēng)為″ADRB2″。它的核苷酸序列可以在GenBank中找到，其登記號(hào)為NM_000024(SEQ ID NO1)。四環(huán)素控制的反式激活蛋白(transactivator)tTA，由Gossen等公開(kāi)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，875547-5551(1992)，引入作為參考及使用。一個(gè)編碼煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶識(shí)別和剪切位點(diǎn)的序列(由Parks等公開(kāi)，Anal.Biochem.，216413-417(1994)，引入作為參考)，被插入在融合編碼基因中的這些序列之間。CMV啟動(dòng)子區(qū)域被置于ADRB2編碼區(qū)域的上游，而一個(gè)polyA序列被置于tTA區(qū)域的下游。
融合構(gòu)建子通過(guò)缺乏內(nèi)源BamHI和BglII限制位點(diǎn)的ADRB2的第一產(chǎn)生形式而被制備。而且，內(nèi)部終止密碼子被唯一的BamHI位點(diǎn)替換。
采用重疊PCR做到這一點(diǎn)。詳細(xì)來(lái)說(shuō)，編碼區(qū)域的5′部分采用如下序列擴(kuò)增gattgaagatctgccttcttgctggc(SEQ ID NO2)，以及gcagaacttggaagacctgc ggagtcc(SEQ ID NO3)，而編碼區(qū)域的3′部分采用如下序列擴(kuò)增ggactccgca ggtcttccaa gttctgc(SEQID NO4)，以及ttcggatcct agcagtgagt catttgt(SEQ ID NO5)。
PCR也可以用于修飾tTA的編碼區(qū)域以便內(nèi)源開(kāi)始密碼子被置換為T(mén)EV NIa-Pro剪切位點(diǎn)。該剪切位點(diǎn)，由七個(gè)氨基酸序列ENLYFQS(SEQ ID NO6)限定，是由Parks等教導(dǎo)的，Anal.Biochem.，216413-417(1994)，引入作為參考。第七個(gè)氨基酸已知是作為PI′位置，并且將它與其它氨基酸已知減小TEV NIa-Pro剪切效率的。見(jiàn)于Kapust等，Biochem.Biophys.Res.Commun..294949-955(2002)。
產(chǎn)生了第七氨基酸變成Tyr和Leu的變體。這些導(dǎo)致與天然的高效率位點(diǎn)相比，中等的和低效率的剪切位點(diǎn)。
在兩個(gè)步驟中將編碼天然高效率位點(diǎn)的DNA序列加入tTA編碼區(qū)域。簡(jiǎn)言之，通過(guò)以下序列進(jìn)行PCR而使BamHI和XbaI限制位點(diǎn)被加入到tTA編碼區(qū)域5′端而Xhol限制位點(diǎn)被加入到tTA區(qū)域3′端，ccggatcctc tagattagat aaaagtaaag tg(SEQ ID NO7)，以及gactcgagct agcagtatcctcgcgccccc taccc(SEQ ID NO8)，通過(guò)將具有如下序列g(shù)agaacctgt acttccag(SEQ ID NO9)的寡核苷酸連接在5′端，而在BamHI和XbaI位點(diǎn)之間加入TEV NIa-Pro剪切位點(diǎn)。
進(jìn)行修飾以編碼中等的和低效率剪切位點(diǎn)的DNA序列的PCR采用如下序列g(shù)gatccgaga acctgtacttccagtacaga tta(SEQ ID NO10)，以及ctcgagagatcctcgcgccc cctacccacc(SEQ ID NO11)，而用于ENLYFQY(SEQID NO12)，以及
ggatccgagaacctgtactt ccagctaaga tta(SEQ ID NO13)，以及ctcgagagatcctcgcgccc cctacccacc(SEQ ID NO11)而用于ENLYFQL(SEQ ID NO14)。
這些PCR步驟還包括將一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)引入編碼每個(gè)剪切位點(diǎn)的序列中5′端，以及一個(gè)XhoI限制位點(diǎn)至tTA終止密碼子的3′端。
這樣修飾的ADRB2編碼區(qū)域采用在編碼區(qū)域中的核苷酸位置260使用PstI以及BamHI消化。這個(gè)3′片段與具有TEV NIa-Pro剪切位點(diǎn)修飾的tTA的三個(gè)變體連接，其已被BamHI和Xhol消化，并且最終復(fù)合物被克隆進(jìn)BlueScriptII，其已被PstI和Xhol消化。
再次通過(guò)PCR將NotI限制位點(diǎn)引至ADRB2編碼區(qū)域的開(kāi)始密碼子中的5′端，其采用gcggccgcca ccatgaacggtaccgaaggc cca(SEQ ID NO15)，以及ctggtgggtggcccggtacc a(SEQ ID NO16)。
通過(guò)NotI和PstI消化分離修飾的ADRB2編碼區(qū)域5′片段并且連接至在之前已經(jīng)被消化的ADRB2-TEV-NIa-Pro-剪切位點(diǎn)tTA融合蛋白的3′片段的每個(gè)構(gòu)建子之中，以產(chǎn)生三個(gè)編碼融合蛋白的全長(zhǎng)構(gòu)建子。
每個(gè)被NotI和XhoI消化的構(gòu)建子，隨后被插入到用NotI和Xhol消化的商業(yè)可得的表達(dá)載體pcDNA 3中。
實(shí)施例2
第二構(gòu)建子也可以被制造，通過(guò)將這里及以后被稱(chēng)為″β抑制蛋白2或ARRB2″(GenBank，NM_004313)(SEQ ID NO17)的編碼序列，被連接至TEV蛋白中的TEV NIa蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域(即成熟NIa蛋白酶的氨基酸189-424，殘基2040-2279)。為了做到這一點(diǎn)，編碼ARRB2的DNA序列被修飾，以便在其5′端加入一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)。而且，該序列被修飾以一個(gè)BamHI位點(diǎn)替換內(nèi)源終止密碼子。寡核苷酸caggatcctctggaatgggggagaaacccg ggacc(SEQ ID NO18)，以及ggatccgcagagttgatcat catagtcgtc(SEQID NO19)被采用。PCR結(jié)果的產(chǎn)品被克隆進(jìn)商業(yè)可得的載體pGEM-T EASY(Promega)。pGEM-TEASY載體的多克隆位點(diǎn)包括一個(gè)在ARRB2開(kāi)始密碼子5′的EcoRI位點(diǎn)。
TEV NIa-Pro編碼區(qū)域隨后被修飾以用BglII位點(diǎn)替換內(nèi)源開(kāi)始密碼子，并且在3′端插入編碼流行性感冒血凝素(hemagluttinin)表位YPYDVPDYA(SEQ ID NO20)的序列，根據(jù)Kolodziej等，Meth.Enzvmol.，194508-519(1991)，之后為一個(gè)終止密碼子和NotI限制位點(diǎn)。這通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)，采用agatctagct tgtttaaggg accacgtg(SEQ ID NO21)，以及gcggccgctc aagcgtaatc tggaacatca tatgggtacg agtacaccaattcattcatg ag(SEQID NO22). 結(jié)果，修飾了的ARRB2編碼區(qū)域被EcoRI和BamHI消化，而修飾了的TEV編碼區(qū)域被BglII和NotI剪切。兩個(gè)片段被連接至商業(yè)可得的采用EcoRI和NotI消化的pcDNA3表達(dá)載體。
實(shí)施例3
將編碼ADRB2-TEV-NIa-Pro剪切位點(diǎn)-tTA和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞，并且進(jìn)入為HEK-293T衍生物的″克隆41″，其具有穩(wěn)定整合的在tTA依賴(lài)的啟動(dòng)子控制之下的β-半乳糖苷酶基因。大約5×104細(xì)胞被放置在24孔板的每個(gè)孔中，用帶有10％胎牛血清的，2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，100μg/ml G4I8，和5μg/ml purimycin的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第二天細(xì)胞達(dá)到50％融合度，然后采用0.4μg質(zhì)粒DNA，和2μl Fμgene(一種合適的包含脂質(zhì)體和其他材料轉(zhuǎn)染試劑)轉(zhuǎn)染?；旌衔镌?00μl DMEM培養(yǎng)基中混合，并且在加入細(xì)胞之前在室溫下孵育15分鐘。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在通過(guò)加入已知的受體拮抗劑進(jìn)行檢測(cè)之前孵育8-20小時(shí)，然后在藥物加入后孵育16-24小時(shí)。
實(shí)施例4
細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性水平首先通過(guò)用產(chǎn)色的底物染色細(xì)胞而檢測(cè)，即“X-gal”，由MacGregor等，Somat.Cell Mol.Genet.，13253-265(1987)教導(dǎo)，引入作為參考。培養(yǎng)后，細(xì)胞采用帶有鈣和鎂的D-PBS清洗兩次，在4％多聚甲醛中固定5分鐘，隨后再用D-PBS(含鈣和鎂)清洗兩次，每次10分鐘。固定了的細(xì)胞用含有鈣和鎂、5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，2mM MgCl2，由儲(chǔ)存在二甲基甲酰胺中的4％X-Gal中1∶40稀釋而制備的0.1％X-Gal的D-PBS孵育。
室溫下反應(yīng)在黑暗中被孵育3-4小時(shí)至過(guò)夜。去除底物溶液，采用mowiol封固介質(zhì)(mounting medium)(10％mowiol，0.1％1.4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷，24％甘油)將細(xì)胞封固在玻璃蓋玻片下。
結(jié)果顯示無(wú)論是單獨(dú)采用ADRB2-TEV-NIa-Pro剪切位點(diǎn)-tTA質(zhì)粒還是ARRB2-TEV-NIa蛋白酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都不表達(dá)β-半乳糖苷酶。采用兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小部分細(xì)胞則表達(dá)β-半乳糖苷酶，可能是由于未刺激的ADRB2和ARRB2之間存在基底水平的相互作用。在采用10uM異丙基腎上腺素，或10uM腎上腺素(這兩者均為ADRB2激活劑)處理細(xì)胞后，大約3-5倍更多的細(xì)胞表達(dá)報(bào)道基因。
當(dāng)細(xì)胞采用ADRB2拮抗劑阿普洛爾(alprenolol)(10uM)預(yù)處理5分鐘時(shí)，激活劑所引起的細(xì)胞中β-半乳糖苷酶表達(dá)的提高被阻斷，而單獨(dú)采用阿普洛爾處理不會(huì)引起明顯的效果。
這些結(jié)果使人們可以將激活劑結(jié)合與GPCR刺激報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄活性相聯(lián)系。
實(shí)施例5
為了更加精確的定量報(bào)道基因在細(xì)胞中的活性水平和使檢測(cè)信號(hào)對(duì)背景最大化而進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)。這通過(guò)采用商業(yè)可得的針對(duì)β-半乳糖苷酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)進(jìn)行報(bào)道基因誘導(dǎo)水平的檢測(cè)而實(shí)現(xiàn)?？寺?1細(xì)胞用前述的包含高，中或低效應(yīng)的剪切位點(diǎn)的ADRB2-tTA融合構(gòu)建子以及ARRB2-TEV-NIa蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之后20小時(shí)采用或不采用1uM異丙基腎上腺素處理細(xì)胞，并且在藥物加入后的24小時(shí)后進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基，將50μl裂解緩沖液(100mM磷酸鉀，pH7.8，0.2％TritonX-100)加入到每孔中。通過(guò)在室溫下輕微攪拌5分鐘而裂解細(xì)胞。收集裂解物并且通過(guò)商業(yè)可得的產(chǎn)品進(jìn)行分析。
在所有情況下，采用激活劑處理會(huì)提高β-半乳糖苷酶活性水平。然而，在帶有低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的未處理的細(xì)胞中報(bào)道基因活性的背景水平相對(duì)于中間和高的效應(yīng)位點(diǎn)來(lái)說(shuō)是最低的。而且，激活劑處理后，帶有低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的細(xì)胞中報(bào)道基因的活性為4.8倍而相比于含有中等效應(yīng)剪切位點(diǎn)的2.8倍的活性和含有高效應(yīng)剪切位點(diǎn)的細(xì)胞的1.2倍的活性。這樣，通過(guò)采用低效應(yīng)蛋白酶剪切位點(diǎn)就獲得了最高的信噪比。
實(shí)施例6
這些試驗(yàn)被設(shè)計(jì)以確定。激活劑刺激引起的報(bào)道基因表達(dá)的提高是依賴(lài)于被激活劑結(jié)合和激活的受體。
為了做到這一點(diǎn)，采用前述方式產(chǎn)生了ADRB2-tTA融合構(gòu)建子的變體，其中不包括每個(gè)中在位置113從D到S的單個(gè)氨基酸變化的突變，其導(dǎo)致對(duì)激活劑異丙基腎上腺素親和性的大量降低，參見(jiàn)Strader等，J.Biol.Chem.，2665-8(1991)。形成了帶有不同剪切位點(diǎn)的三種受體-tTA融合構(gòu)建子突變體。
在采用包含前述的D113S點(diǎn)突變的ADRB2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的克隆41細(xì)胞中檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的水平?；钚詸z測(cè)如前述進(jìn)行。結(jié)果顯示激活劑異丙基腎上腺素不刺激報(bào)道基因在表達(dá)突變的ADRB2-tTA融合構(gòu)建子的細(xì)胞中的表達(dá)。
實(shí)施例7
這些試驗(yàn)被設(shè)計(jì)以檢查是否激活劑刺激的報(bào)道基因表達(dá)的提高是依賴(lài)于TEV NIa-Pro與ARRB2的融合。
為了做到這一點(diǎn)，檢測(cè)在采用帶有低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的ADRB2-tTA融合構(gòu)建子和前述的ARRB2TEV-NIa蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒，或者和一個(gè)融合至磷脂酶C的SH2結(jié)構(gòu)域的TEV-NIa蛋白酶對(duì)照共轉(zhuǎn)染的克隆41細(xì)胞中檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性水平。活性檢測(cè)如前述進(jìn)行。結(jié)果表明激活劑刺激報(bào)道基因表達(dá)的提高僅僅在TEV蛋白酶被融合至ARRB2上被檢測(cè)到而在融合至不相關(guān)的多肽時(shí)不能檢測(cè)到。
實(shí)施例8
這些試驗(yàn)被設(shè)計(jì)以確定是否基因表達(dá)是由目標(biāo)受體的激活劑選擇性誘導(dǎo)的，或者其能被其他分子刺激。
ATP是G蛋白偶聯(lián)受體P2Y1和P2Y2的激活劑，其被HEK-293T細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)。
采用前述的帶有低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的ADRB2-tTA融合構(gòu)建子和抑制蛋白TEV-NIa蛋白酶融合共轉(zhuǎn)染的，并用異丙基腎上腺素、ATP或未處理的克隆41細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。檢測(cè)如前述進(jìn)行。
結(jié)果顯示報(bào)道基因活性的誘導(dǎo)是目標(biāo)受體激活所特異的。另一種GPCR通路的刺激是不相關(guān)的。
實(shí)施例9
采用前述的帶有低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的ADRB2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2TEV-NIa蛋白酶融合共轉(zhuǎn)染的克隆41細(xì)胞進(jìn)行一系列試驗(yàn)，其采用數(shù)量變化的腎上腺受體激活劑之一的異丙基腎上腺素和腎上腺素處理。檢測(cè)如前所述進(jìn)行。圖2a中所代表的結(jié)果顯示報(bào)道基因表達(dá)對(duì)這兩種配體刺激的劑量應(yīng)答曲線。每個(gè)點(diǎn)代表從三個(gè)試驗(yàn)中獲得的平均值。
一系列的試驗(yàn)如前述進(jìn)行，在其中共轉(zhuǎn)染的克隆41細(xì)胞采用各種濃度的腎上腺素受體拮抗劑阿普洛爾預(yù)處理15分鐘，然后用1uM腎上腺素處理。在圖2b中顯示的結(jié)果說(shuō)明這種拮抗劑的劑量抑制曲線。
實(shí)施例10
制造類(lèi)似的系列構(gòu)建子以建立對(duì)于偶聯(lián)的G蛋白的精氨酸血管加壓素受體2(AVPR2)檢測(cè)。AVPR2編碼區(qū)域(Genbank登記號(hào)NM_000054)(SEQ ID NO23)被修飾為在5’端放置EcoRI位點(diǎn)并且用BamHI位點(diǎn)替換終止密碼子，采用如下引物進(jìn)行PCRgaattcatgc tcatggcgtc caccac(SEQ ID NO24)以及ggatcccgat gaagtgtcct tggccag(SEQ ID NO25)。
修飾的AVPR2編碼區(qū)域被連接至前述的已經(jīng)被EcoRI和BamHI剪切的三種ADRB2-tTA構(gòu)建子。這用AVPR2的編碼序列替換了ADRB2的整個(gè)編碼序列。
克隆41細(xì)胞被前述的包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的AVPR2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合蛋白共轉(zhuǎn)染，并且采用各種濃度(1pM到2uM)的[Arg8]血管加壓素(AVPR2激活劑)進(jìn)行檢測(cè)。在圖3中代表的數(shù)據(jù)顯示對(duì)這種激活劑的劑量應(yīng)答曲線，采用3.3nM的EC50，與以前公開(kāi)的數(shù)據(jù)一致(Oakley，R.等，Assay and DrμgDevelopment Technologies，121-30，(2002))。最大應(yīng)答結(jié)果是誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)大約是背景水平的40倍。
實(shí)施例11
一系列相似的構(gòu)建子被制造以建立G蛋白偶聯(lián)的血清素受體1a(HTR1A)的檢測(cè)。HTR1A編碼區(qū)域(Genbank登記號(hào)NM_000524)(SEQ ID NO26)被修飾為在5’端放置一個(gè)EcoRI位點(diǎn)而用一個(gè)BamHI位點(diǎn)替換終止密碼子，采用如下引物進(jìn)行PCRgaattcatggatgtgctcagccctgg(SEQ ID NO27)，以及ggatccctgg cggcagaact tacac(SEQ ID NO28). 修飾的HTR1A編碼區(qū)被連接至前述的已被EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-tTA構(gòu)建子。這采用HTR1A的編碼序列替換了整個(gè)AVPR2編碼序列。最終構(gòu)建子在這里即以后被稱(chēng)為“HTR1A-tTA”。
克隆41細(xì)胞被前述的包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的HTR1A-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并采用10μM 8-氫氧基-DPAT HBr(OH-DPAT)，HTR1A激活劑，以及10uM血清素，HTR1A天然激活劑進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)如前述進(jìn)行。對(duì)OH-DPAT最大應(yīng)答結(jié)果是誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)大約是背景水平的6.3倍，而血清素最大應(yīng)答結(jié)果是誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)大約是背景水平的4.6倍。
實(shí)施例12
相似的構(gòu)建子被制造以建立G蛋白偶聯(lián)的m2毒蕈堿性乙酰膽堿受體(CHRM2)的檢測(cè)。CHRM2編碼區(qū)域(Genbank登記號(hào)NM_000739)(SEQ ID NO29)被修飾為在5’端放置一個(gè)EcoRI位點(diǎn)并且采用一個(gè)BglII位點(diǎn)替換終止密碼子，采用如下引物進(jìn)行PCRgaattcatga ataactcaac aaactcc(SEQ ID NO30)以及agatctccttgtagcgccta tgttc(SEQ ID NO31)。
修飾的CHRM2編碼區(qū)域被連接至前述AVPR2-tTA構(gòu)建子，其已被EcoRI和BamHI剪切。這用CHRM2的編碼序列替換了整個(gè)AVPR2編碼序列。
克隆41細(xì)胞被前述的包含高效應(yīng)剪切位點(diǎn)的CHRM2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，其中ARRB2-蛋白酶融合構(gòu)建子在單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，并采用10uM氨甲?；憠ACl(卡巴膽堿carbochol)，CHRM2激活劑，如前述進(jìn)行檢測(cè)?？ò湍憠A最大應(yīng)答結(jié)果是誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)大約是背景水平的7.2倍。
實(shí)施例13
構(gòu)建子也可被制造以建立G蛋白偶聯(lián)趨化因子(C-C模序)受體5(CCR5)的檢測(cè)。CCR5編碼區(qū)域(Genbank登記號(hào)NM_000579)(SEQID NO32)被修飾以在5’端放置一個(gè)Not I位點(diǎn)并采用一個(gè)BamHI位點(diǎn)替換終止密碼子，采用如下引物進(jìn)行PCRgcggccgcat ggattatcaa gtgtcaagtc c(SEQ ID NO33)以及ggatccctggcggcagaact tacac(SEQ ID NO34)。
CCR5編碼區(qū)域也被修飾以在5’端放置一個(gè)BsaI位點(diǎn)，其在被剪切時(shí)，留下與EcoRI剪切DNA相容的核苷酸突出端，采用如下引物ggtctccaattcatggatta tcaagtgtca agt(SEQ ID NO35)，以及gacgacagcc aggtacctat c(SEQ ID NO36)。
第一修飾的編碼區(qū)域被ClaI和BamHI剪切而第二被Bsal和Clal剪切。這兩個(gè)片段被連接至前述AVPR2-tTA構(gòu)建子，其已被EcoRI和BamHI剪切。這用CCR5的編碼序列替換了整個(gè)AVPR2編碼序列。
含有低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的CCR5-tTA融合構(gòu)建子被轉(zhuǎn)染至″克隆34″細(xì)胞，其為前述HEK細(xì)胞系″克隆41″的衍生物，但是其包含一個(gè)在CMV啟動(dòng)子控制之下的穩(wěn)定整合了的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合基因。采用1μg/ml“調(diào)節(jié)正常T-細(xì)胞表達(dá)和分泌活性”(RANTES)的已知CCR5激活劑進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)RANTES的最大應(yīng)答如前述檢測(cè)的結(jié)果為誘導(dǎo)大約40倍于背景的報(bào)道基因的表達(dá)。
實(shí)施例14
其次，一系列構(gòu)建子被制造以建立G蛋白偶聯(lián)的多巴胺2受體(DRD2)的檢測(cè)。DRD2編碼區(qū)域(Genbank登記號(hào)NM_000795)(SEQ ID NO37)被修飾以在5’端放置一個(gè)EcoRI位點(diǎn)并且用一個(gè)BglII位點(diǎn)替換整個(gè)終止密碼子，采用如下引物進(jìn)行PCRgaattcatgg atccactgaa tctgtcc(SEQ ID NO38)，以及agatctgcag tggaggatct tcagg(SEQ ID NO39). 修飾的DRD2編碼區(qū)域被連接至前述用EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-tTA構(gòu)建子。這用DRD2的編碼序列替換了整個(gè)AVPR2編碼序列。
克隆41細(xì)胞被前述的包含中等效應(yīng)剪切位點(diǎn)的DRD2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且采用10uM多巴胺HCl(多巴胺)，一種DRD2激活劑進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在前述的檢測(cè)中被檢測(cè)。對(duì)多巴胺的最大應(yīng)答為誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)是背景的2.7倍。
實(shí)施例15
這些試驗(yàn)被設(shè)計(jì)來(lái)證明采用結(jié)合激活劑-偶聯(lián)的GPCRs的抑制蛋白變體的增強(qiáng)作用更穩(wěn)定。首先，構(gòu)建TEV NIa蛋白酶至(β-抑制蛋白-1(ARRB1)的融合構(gòu)建子。ARRB1的編碼區(qū)域(Genbank登記號(hào)NM_004041)(SEQ ID NO40)被修飾以在5’端放置一個(gè)Asp718位點(diǎn)并用一個(gè)BamHI位點(diǎn)替換終止密碼子，采用如下引物進(jìn)行PCRggtaccatgg gcgacaaagggacgcgagtg(SEQ ID NO41)，以及ggatcctctg ttgttgagctgtggagagcc tgtaccatcc tcctcttc(SEQ ID NO42)。
結(jié)果，修飾的ARRB1編碼區(qū)域被Asp718和EcoRI以及EcoRI和BamHI剪切，而前述的修飾的TEV NIa-Pro編碼區(qū)域被BglII和NotI剪切。所有這三個(gè)片段被連接至商業(yè)可得的pcDNA3表達(dá)載體，其已經(jīng)被Asp718和NotI消化。
克隆41細(xì)胞被包含中等效應(yīng)剪切位點(diǎn)的DRD2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB1-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且檢測(cè)采用如前述的10μM多巴胺HCI(多巴胺)，一種D2受體的激活劑進(jìn)行。對(duì)多巴胺的最大應(yīng)答為誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)是背景的2.1倍。
在氨基酸382后截?cái)郃RRB1已被報(bào)道會(huì)導(dǎo)致不依賴(lài)GRK-介導(dǎo)的磷酸化對(duì)激活劑結(jié)合的GPCRs親和性增加，(Kovoor A.等，J.Biol.Chem.，274(11)6831-6834(1999))。為了在目前的檢測(cè)中使用這樣的“組成性活性的”抑制蛋白，β-抑制蛋白-1的編碼區(qū)域被修飾以在5’端放置一個(gè)Asp718位點(diǎn)并在氨基酸382之后放置一個(gè)BamHI位點(diǎn)，采用如下序列以及前述的SEQID NO41進(jìn)行PCRggatccattt gtgtcaagtt ctatgag(SEQ ID NO43)。
結(jié)果產(chǎn)生比全長(zhǎng)的編碼區(qū)域短36個(gè)氨基酸的ARRb1編碼區(qū)域于。稱(chēng)為″ARRB1(Δ383)″的獲得的修飾的ARRB1編碼區(qū)域采用Asp718和EcoRI以及采用EcoRI和BamHI剪切，而前述的修飾的TEV NIa-Pro編碼區(qū)域采用BglII和Notl剪切。所有這三種片段被連接至商業(yè)可得的采用Asp718和NotI消化pcDNA3表達(dá)載體。
克隆41細(xì)胞被包含中等效應(yīng)剪切位點(diǎn)的DRD2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB1(Δ383)-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且采用10μM多巴胺HCl(多巴胺)，一種前述的DRD2受體激活劑進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)多巴胺的最大應(yīng)答是誘導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)是背景的8.3倍。。
為了檢查ARRB2編碼區(qū)域類(lèi)似的截?cái)?，ARRB2的編碼區(qū)域被修飾以在5’端放置一個(gè)Asp718位點(diǎn)并且用一個(gè)BamHI位點(diǎn)替換3’端的81核苷酸，采用如下引物進(jìn)行PCRggtaccatgggggagaaacc cgggacc(SEQ ID NO44)，以及ggatcctgtg gcatagttgg tatc(SEQID NO45)。
結(jié)果產(chǎn)生短于全長(zhǎng)的編碼區(qū)域27個(gè)氨基酸的ARRB2編碼區(qū)。最終修飾的ARRB2編碼區(qū)域采用Asp718和BamHI剪切，而前述修飾的TEV NIa-Pro編碼區(qū)域采用BglII和Notl剪切。這兩種片段被連接至商業(yè)可得的采用Asp718和NotI消化pcDNA3表達(dá)載體，。
克隆41細(xì)胞被包含中等效應(yīng)剪切位點(diǎn)的DRD2-tTA融合構(gòu)建子和ARRB2(Δ383)-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且采用10μM多巴胺HCl(多巴胺)，如前述的一種DRD2受體拮抗劑進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)多巴胺的最大應(yīng)答是誘導(dǎo)的報(bào)道基因?yàn)楸尘暗?.1倍。
這些結(jié)果如圖4所代表，證明DRD2多巴胺受體檢測(cè)顯示采用抑制蛋白變體ARRB1(Δ383)獲得最高信噪比。
實(shí)施例16
進(jìn)行一系列的試驗(yàn)已證明采用被設(shè)計(jì)成提高蛋白相互作用的受體修飾增強(qiáng)了檢測(cè)。在這個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)受體的C-末端區(qū)域被用來(lái)自AVPR2的相應(yīng)尾巴區(qū)域替換，其為一種已知的具有高親和性結(jié)合抑制蛋白的物質(zhì)。在這些實(shí)施例中，在第七跨膜螺旋末端保存的NPXXY模序之后15-18個(gè)氨基酸融合連接，其典型的相對(duì)應(yīng)于緊挨著受體C末端的公認(rèn)的棕櫚酰化位點(diǎn)之后。
首先，PCR被用來(lái)生產(chǎn)一個(gè)編碼AVPR2C-末端29個(gè)氨基酸DNA片段，之后為低效應(yīng)TEV剪切位點(diǎn)和tTA轉(zhuǎn)錄因子。該片段還被設(shè)計(jì)成前兩個(gè)氨基酸(Ala，A和Arg，R)被BssHII限制位點(diǎn)GCGCGC編碼。這通過(guò)擴(kuò)增具用前述低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的AVPR2-tTA構(gòu)建子而實(shí)現(xiàn)，引物如下tgtgcgcgcg gacgcacccc acccagcctg ggt(SEQ ID NO46)，以及ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc(SEQ ID NO11). 其次，DRD2的編碼區(qū)域被修飾以在5’端放置一個(gè)EcoRI位點(diǎn)并將一個(gè)BssHII位點(diǎn)插入到編碼區(qū)域中的最后氨基酸之后(Cys-443)。這采用如下引物進(jìn)行PCRgaattcatgg atccactgaatctgtcc(SEQ ID NO47)，以及tgtgcgcgcg cagtggagga tcttcaggaa ggc(SEQ ID NO48)。
獲得的修飾的D2編碼區(qū)域采用EcoRI和BssHII剪切并且獲得的AVPR2C-末端低效應(yīng)剪切位點(diǎn)-tTA片段采用BssHII和BamHI剪切。這兩個(gè)片段被連接至前述的用EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-低效應(yīng)剪切位點(diǎn)-tTA構(gòu)建子。
克隆41細(xì)胞被包含低效應(yīng)TEV剪切位點(diǎn)的DRD2-AVPR2尾巴-tTA融合構(gòu)建子和前述的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且采用如前述的10μM多巴胺HCl(多巴胺)，一種DRD2受體激活劑，進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)多巴胺的最大應(yīng)答是誘導(dǎo)的報(bào)道基因?yàn)楸尘暗?0倍。
制造了一種構(gòu)建子，其中通過(guò)在5’端插入一個(gè)Asp718位點(diǎn)和在Cys-341之后放置一個(gè)BssHII位點(diǎn)而修飾ADRB2受體。通過(guò)如下引物進(jìn)行PCRgcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca(SEQ ID NO49)，以及tgtgcgcgcgcacagaagct cctggaaggc(SEQ ID NO50)。
修飾的ADRB2受體編碼區(qū)域采用EcoRI和BssHII剪切而AVPR2C-末端尾巴低效應(yīng)剪切位點(diǎn)-tTA片段采用BssHII和BamHI剪切。這兩個(gè)片段被連接至前述的采用EcoRI和BamHI剪切的AVPR2-低效應(yīng)剪切位點(diǎn)-tTA構(gòu)建子，。獲得構(gòu)建子是″ADRB2-AVPR2尾巴-tTA.″(也參見(jiàn)出版的上述專(zhuān)利U.S.2002/0106379，特別是SEQ IDNO3)
克隆41細(xì)胞被包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的DRB2-AVPR2尾巴-tTA融合構(gòu)建子和前述的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且采用如前述的10μM異丙腎上腺素，一種ADRB2受體激活劑進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)異丙腎上腺素的最大應(yīng)答是誘導(dǎo)的報(bào)道基因?yàn)楸尘暗?0倍。
制造了一種構(gòu)建子，其中通過(guò)在Cys-345之后放置一個(gè)BssHII位點(diǎn)而修飾卡巴阿片樣物質(zhì)受體(OPRK；Genbank登記號(hào)NM_000912)(SEQID NO51)編碼區(qū)域。通過(guò)如下引物進(jìn)行PCRggtctacttg atgaattcct ggcc(SEQ ID NO52)，以及gcgcgcacag aagtcccgga aacaccg(SEQ ID NO53)
修飾的OPRK受體編碼區(qū)域采用EcoRI和BssHII剪切而AVPR2C-末端尾巴低效應(yīng)剪切位點(diǎn)-tTA片段采用BssHII和Xhol剪切。這兩個(gè)片段被連接至包含克隆進(jìn)入在Asp718(5′)和XhoI(3′)的pcDNA3.1+的修飾的OPRK受體序列的質(zhì)粒中，其被EcoRI和Xhol剪切。
克隆41細(xì)胞被包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的OPRK-AVPR2尾-tTA融合構(gòu)建子和前述的ARRB2-TEV-NIa蛋白酶融合構(gòu)建子共轉(zhuǎn)染，并且采用10μMU-69593，一種OPRK受體激活劑進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)U-69593的最大應(yīng)答是誘導(dǎo)的報(bào)道基因?yàn)楸尘暗?2倍。
實(shí)施例17
該試驗(yàn)被設(shè)計(jì)已證明利用該檢測(cè)方法采用一種多重方式同時(shí)檢測(cè)兩種待測(cè)受體的活性。
克隆41細(xì)胞和″克隆1H10″細(xì)胞，其為包含受tTA依賴(lài)的啟動(dòng)子控制的熒光素酶基因穩(wěn)定整合的HEK-293T細(xì)胞系，每個(gè)被置于24孔培養(yǎng)盤(pán)中并且分別用前述嵌合的ADRB2-AVPR2尾-tTA或DRD2-AVPR2尾-tTA融合構(gòu)建子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。采用每孔100μμl培養(yǎng)基，0.4μg DNA和2μl Fμgene試劑實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。孵育24小時(shí)之后，表達(dá)ADRB2-AVPR2尾-tTA的克隆41細(xì)胞和表達(dá)DRD2-AVPR2尾-tTA的克隆H10細(xì)胞被胰酶消化，等量混合，重置于96孔板的12孔中。三個(gè)孔不加藥進(jìn)行孵育或立刻用1μM異丙基腎上腺素，1μM多巴胺，或1μM兩者的混合物處理。在配體加入之后的24小時(shí)對(duì)細(xì)胞報(bào)道基因的活性檢測(cè)。培養(yǎng)基被廢棄，細(xì)胞在40μμl裂解緩沖液中[100mM磷酸鉀，pH 7.8，0.2％Triton X-100]中裂解而細(xì)胞裂解物采用商業(yè)可獲得的發(fā)光檢測(cè)試劑檢測(cè)β-半乳糖苷酶和熒光素酶活性。
圖5A和5B代表了結(jié)果。用異丙基腎上腺素處理的結(jié)果是β-半乳糖苷酶報(bào)道基因活性大約誘導(dǎo)了7倍，而熒光素酶活性維持不變。用多巴胺處理的結(jié)果是熒光素酶活性大約誘導(dǎo)了3.5倍，而β-半乳糖苷酶活性維持不變。用異丙基腎上腺素和多巴胺同時(shí)處理的結(jié)果是分別誘導(dǎo)了7倍的β半乳糖苷酶和3倍的熒光素酶活性。
實(shí)施例18
這個(gè)試驗(yàn)被設(shè)計(jì)證明采用一個(gè)多重方式利用該檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)兩種待測(cè)受體。
″克隆34.9″細(xì)胞，其為克隆41細(xì)胞的衍生物并且包含一個(gè)穩(wěn)定整合的ARRB2-TEV NIa蛋白酶融合蛋白基因，采用前述的嵌合的OPRK-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合構(gòu)建子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。平行地，″克隆HTL 5B8.1″細(xì)胞，其為包含在tTA依賴(lài)的啟動(dòng)子控制下的熒光素酶基因穩(wěn)定整合子的HEK-293T細(xì)胞系，采用前述的ADRB-AVPR2尾-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合構(gòu)建子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在每種情況下，5×105細(xì)胞被置入6孔盤(pán)的每個(gè)孔中，并且在添加有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μg/ml G418和3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞用100μl的DMEM，0.5μg的OPRK-AVPR2尾-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA DNA和2.5μlFμgene(″克隆34.9細(xì)胞″)或100μμl的DMEM，0.5μμlg的ADRB2-AVPR2尾-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTADNA，0.5μgμl的ARRB2-TEV NIa蛋白酶DNA和5μlFμgene(″克隆HTL5B8.1細(xì)胞″)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞被培養(yǎng)24小時(shí)，然后用胰酶消化，等量混合并重置于96孔板中。在采用10μM U-69593，10μM異丙基腎上腺素或10μM這兩者的混合物處理之前細(xì)胞孵育24小時(shí)。每種試驗(yàn)條件檢測(cè)16個(gè)孔。24小時(shí)之后，細(xì)胞被裂解并且采用前述的方法檢測(cè)β-半乳糖苷酶和熒光素酶報(bào)道基因活性。結(jié)果見(jiàn)于圖6。采用U-69593處理結(jié)果誘導(dǎo)了大約15倍的β-半乳糖苷酶報(bào)道基因活性，而熒光素酶活性維持不變。采用異丙基腎上腺素處理結(jié)果誘導(dǎo)了145倍的熒光素酶活性，而β-半乳糖苷酶活性維持不變。采用U-69593和異丙基腎上腺素結(jié)果分別誘導(dǎo)了9倍的β-半乳糖苷酶和136倍的熒光素酶活性。
實(shí)施例19
實(shí)施該試驗(yàn)以證明在本發(fā)明的檢測(cè)中不同轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的使用。
制造一種融合構(gòu)建子，包含編碼AVPR2的DNA，融合進(jìn)入編碼包括前述的TEV Nla-Pro低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的氨基酸連接子GSENLYFQLR(SEQ ID NO54)的DNA序列的框架中，融合進(jìn)入編碼酵母GAL4蛋白(GenBank登記號(hào)P04386)(SEQ ID NO55)氨基酸2-147的DNA序列中，其后為一個(gè)連接子，即序列PELGSASAELTMVF (SEQ ID NO56)，其后為鼠核因子卡巴-B鏈p65蛋白(GenBank登記號(hào)A37932)(SEQ ID NO57)的氨基酸368-549。CMV啟動(dòng)子被放置于AVPR2編碼區(qū)域的上游而一個(gè)polyA序列被放置于GAL4-NFkB區(qū)域的下游。這種構(gòu)建子是重新設(shè)計(jì)的AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GAL4。
HμL 5C1.1是HEK-293T細(xì)胞的一種衍生物，其包含在一個(gè)商業(yè)可得的pFR-LUC的GAL4上游激活序列(UAS)控制之下穩(wěn)定整合的熒光素酶報(bào)道基因。
這個(gè)AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GAL4質(zhì)粒和前述的β-抑制蛋白2-TEV Nla蛋白酶共轉(zhuǎn)染入HμL 5C1.1細(xì)胞。大約2.5×104細(xì)胞被放置在96孔板的每孔中，在10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μμg/ml G418以及3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至50％融合度融合度并且采用10μμl每孔的包含85μμl 的DMEM，0.1μμg的AVPR2-TEV-Nia-Pro剪切(Leu)-GAL4DNA，0.1μμg的ARRB2-TEVNla蛋白酶DNA，以及1μμl的Fμgene的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這些物質(zhì)在加入細(xì)胞之前在室溫孵育15分鐘。在采用10μM血管加壓素處理之前培養(yǎng)細(xì)胞大約16小時(shí)。6小時(shí)之后，裂解細(xì)胞并且如前述進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。在這些條件下，血管加壓素處理導(dǎo)致報(bào)道基因活性提高180倍。
實(shí)施例20
進(jìn)行這一系列的試驗(yàn)以證明采用進(jìn)一步的受體修飾可增強(qiáng)檢測(cè)，該受體修飾被設(shè)計(jì)成提高與相互作用蛋白的親和性。在這個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)受體的C末端尾巴區(qū)域采用如下受體相應(yīng)的尾巴區(qū)域替換apelin J受體-AGTRL1(登記號(hào)NM_005161)(SEQ ID NO58)，胃泌激素釋放肽受體-GRPR(登記號(hào)NM_005314)(SEQ ID NO59)，蛋白酶活化受體2-F2RL1(登記號(hào)NM_005242)(SEQ ID NO60)，CCR4(登記號(hào)NM 005508)(SEQ ID NO61)，趨化因子(C-X-C模序)受體4-CXCR4(登記號(hào)NM 003467)(SEQ ID NO62)，以及白細(xì)胞介素8受體，β-CXCR2/IL8b(登記號(hào)NM_001557)(SEQ ID NO63)。
用第一PCR產(chǎn)生編碼上述受體C-末端尾巴的DNA片段。這些片段是這樣設(shè)計(jì)的，即前兩個(gè)氨基酸(Ala，A和Arg，R)通過(guò)BssHII限制位點(diǎn)編碼。
AGTRL1C-末端片段采用如下引物擴(kuò)增tgtgcgcgcggccagagcag gtgcgca(SEQID NO64)，以及gaggatccgt caaccacaagggtctc(SEQ ID NO65)。
GRPR C-末端片段采用如下引物擴(kuò)增tgtgcgcgcg gcctgatcatccggtct(SEQ ID NO66)，以及gaggatccgacataccgctc gtgaca(SEQ ID NO67)。
F2RL1C-末端片段采用如下引物擴(kuò)增tgtgcgcgcagtgtccgcactgtaaagc(SEQ ID NO68)以及gaggatccataggaggtcttaacagt(SEQ ID NO69). CCR4C-末端片段采用如下引物擴(kuò)增tgtgcgcgcggcctttttgtgctctgc(SEQIN N70)，以及gaggatccca gagcatcatg aagatc(SEQ ID NO71)。
CXCR2/IL8b C-末端片段采用如下引物擴(kuò)增tgtgcgcgcggcttgatcagcaagggac(SEQ ID NO72)，以及gaggatccga gagtagtgga agtgtg(SEQ ID NO73)。
CXCR4C-末端片段采用如下引物擴(kuò)增tgtgcgcgcgggtccagcct caagatc(SEQ ID NO74)，以及gaggatccgc tggagtgaaaacttga(SEQ ID NO75)。
獲得的編碼這些受體C-末端修飾的DNA片段采用BssHII和BamHI剪切并且片段被連接至OPRK受體編碼區(qū)域框架，在前述的OPRK-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA表達(dá)構(gòu)建子中替換AVPR2-C-末端片段。
前述的HTL 5B8.1細(xì)胞采用上面修飾的每個(gè)OPRK編碼區(qū)域-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA構(gòu)建子和前述的β-抑制蛋白2-TEVNIa蛋白酶融合構(gòu)建子進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。放置每孔大約2.5×104細(xì)胞在96孔板中，用10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μg/ml G418，和3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至50％融合度融合度并且采用每孔10μl的如下混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染85μl的DMEM，0.25μμg的AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GAL4DNA，0.25μμg的ARRB2-TEV NIa蛋白酶DNA，以及2.5μμl的Fμgene(一種合適的包含脂質(zhì)體和其他材料的轉(zhuǎn)染試劑)，在加入細(xì)胞之前在室溫下孵育15分鐘。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在用10μM U-69593處理前孵育大約16小時(shí)。6小時(shí)之后，裂解細(xì)胞并如前述檢測(cè)熒光素酶活性。在這些條件下，采用U-69593處理，結(jié)果導(dǎo)致對(duì)于每種修飾的OPRK受體下述的報(bào)道基因活性的提高OPRK-AGTRLI C-末端尾巴-30倍；OPRK-GRPRC-末端尾巴-312倍；OPRK-F2RL1 C-末端尾巴-69.5倍；OPRK-CCR4C-末端尾巴-3.5倍；OPRK-CXCR4C-末端尾巴-9.3倍；OPAK-IL8b C-末端尾巴-113倍。
實(shí)施例21
這個(gè)實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)以生產(chǎn)前述的穩(wěn)定表達(dá)ARRB2-TEVNIa蛋白酶融合蛋白的細(xì)胞系。
制造了一種在EFlα啟動(dòng)子控制之下表達(dá)ARRB2-TEVNIa蛋白酶融合蛋白并且還在胸腺嘧啶核苷激酶(TK)啟動(dòng)子控制之下表達(dá)潮霉素抗性基因的質(zhì)粒。
該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染進(jìn)HTL 5B8.1，并且通過(guò)在100μμg/ml潮霉素存在下進(jìn)行培養(yǎng)而選擇出質(zhì)粒穩(wěn)定整合在基因組的克隆。抗性克隆被分離的和擴(kuò)展并且通過(guò)前述的ADRB2-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而進(jìn)行篩選。采用這一程序進(jìn)行選擇的三個(gè)細(xì)胞系，分別稱(chēng)為″HTLA 4C2.10″，″HTLA 2C11.6″和″HTLA 5D4″。大約每孔2.5×104細(xì)胞被植入到96孔板上，在帶有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μμg/ml G418，3μμg/ml嘌呤霉素，和100μg/ml潮霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至50％融合度融合度并且被每孔10μl的如下混合物轉(zhuǎn)染85μμl的DMEM，0.25μμg的ADRB2-AVPR2-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-GALADNA和0.5μμl的Fμgene，其在加入細(xì)胞之前在室溫孵育15分鐘。在用10μM異丙基腎上腺素處理之前培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞大約16小時(shí)。6小時(shí)之后，細(xì)胞被裂解并如前述檢測(cè)熒光素酶活性。在這些條件下，用異丙基腎上腺素處理導(dǎo)致這三個(gè)細(xì)胞系中分別有如下報(bào)道基因活性的提高112-倍(″HTLA 4C2.10″)，56-倍(″HTLA 2C11.6″)和180-倍(″HTLA 5D4″)。
實(shí)施例22
該實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)以生產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)前述的ARRB2-TEV NIa蛋白酶和ADRB2-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合蛋白的細(xì)胞系。
包含潮霉素抗性基因的ARRB2-TEV NIa蛋白酶質(zhì)粒與前述的ADRB2-AVPR2尾巴-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA融合蛋白質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染進(jìn)HTL 5B8.1細(xì)胞并且通過(guò)在100μμg/ml潮霉素的存在下培養(yǎng)而選擇包含質(zhì)粒穩(wěn)定整合到基因組的克隆。抗性克隆被分離并擴(kuò)展，并通過(guò)采用10μM異丙基腎上腺素處理而被篩選并檢測(cè)如前述誘導(dǎo)的報(bào)道基因活性。采用該程序選擇的三個(gè)細(xì)胞系被稱(chēng)為″HTLAR1E4″，″HTLAR lC10″和″HTLAR 2G2″。用異丙基腎上腺素處理6小時(shí)結(jié)果導(dǎo)致分別在三種細(xì)胞系中如下報(bào)道基因活性的提高208-倍(″HTLAR 1E4″)，197-倍(″HTLAR lC10″)和390-倍(″HTLAR 2G2″)。
實(shí)施例23
該實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)以證明利用該檢測(cè)方法檢測(cè)受體酪氨酸激酶表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的活性。
制造第一融合構(gòu)建子，包含編碼人EGFR的DNA，其可以在GenBank登記號(hào)NM 005228(SEQ ID NO76)中找到，融合進(jìn)入編碼前述四環(huán)素控制的反式激活蛋白(transactivator)tTA的氨基酸3-335的DNA序列的框架中。插入在這些序列之間的是一個(gè)編碼包括前述TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的氨基酸序列GGSGSENLYFQL(SEQID NO77)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子被放置在表皮生長(zhǎng)因子受體編碼區(qū)域的上游，而polyA序列被放置在tTA區(qū)域的下游。這一構(gòu)建子被稱(chēng)為EGFR-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA。
制造第二融合構(gòu)建子，其包含編碼兩個(gè)人磷脂酶CGamma 1相應(yīng)于氨基酸538-759(基因Bank登記號(hào)NP_002651.2)(SEQ ID NO78)的SH2結(jié)構(gòu)域的DNA，其被融合進(jìn)入一個(gè)編碼前述成熟TEV NIa蛋白酶對(duì)應(yīng)于氨基酸2040-2279(基因Bank登記號(hào)AAA47910)(SEQ ID NO79)的催化結(jié)構(gòu)域的DNA序列的框架中。在這些序列之間插入的一個(gè)編碼氨基酸NSSGGNSGS(SEQ ID NO80)的連接子DNA序列。CMV啟動(dòng)子被放置在PLC-Gamma SH2結(jié)構(gòu)域編碼序列的上游并且polyA序列被放置在TEV NIa蛋白酶序列的下游。這個(gè)構(gòu)建子被稱(chēng)為PL CGammal-TEV。
EGFR-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA和PLC Gammal-TEV融合構(gòu)建子被轉(zhuǎn)染進(jìn)入前述克隆HTL5B8.1細(xì)胞。大約2.5×104細(xì)胞被放置于96孔板的每孔中，在帶有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μg/ml G418，和3μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至50％融合度融合度并采用每孔15μl如下混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染100μμl的DMEM，0.4μμg的pcDNA3DNA(″攜帶子″載體DNA)，0.04μμg的EGFR-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA DNA，0.04μμg的PLC Gammal-TEV DNA，以及2μμlFμgene(一種合適的包含脂質(zhì)體和其他材料的轉(zhuǎn)染試劑)，在加入細(xì)胞之前在室溫下孵育15分鐘。在采用特異的受體激活劑和抑制劑處理之前轉(zhuǎn)染細(xì)胞被培養(yǎng)大約16小時(shí)。6小時(shí)之后，裂解細(xì)胞并如前述方法檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖7。
加入2.5ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子(對(duì)應(yīng)于該配體的EC80)結(jié)果導(dǎo)致熒光素酶報(bào)道基因活性增加12.3倍，而加入100ng/ml人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Alpha結(jié)果導(dǎo)致增加18.3倍。在加入人表皮生長(zhǎng)因子之前采用酪氨酸激酶抑制子(70μM AG-494；0.3μM AG-1478；2mMRG-130022)預(yù)處理阻斷了報(bào)道基因活性的誘導(dǎo)。
實(shí)施例24
該實(shí)驗(yàn)被發(fā)計(jì)以證明采用該檢測(cè)方法檢測(cè)人I型干擾素受體的活性。
制造一種融合構(gòu)建子，其包含編碼人干擾素受體I(IFNAR1)(557氨基酸)的NA，可以在Genbank登記號(hào)NM_000629(SEQ ID NO81)中找到，被融合進(jìn)入編碼前述四環(huán)素控制的反式激活蛋白tTA的氨基酸3-335的DNA序列框架中。在這些序列之間插入的是一個(gè)編碼包括前述TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)的低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQ ID NO82)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子被放置于人干擾素受體I(IFNAR1)編碼區(qū)域的上游，而一個(gè)poly A序列被放置于tTA區(qū)域的下游。這個(gè)構(gòu)建子被稱(chēng)為IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA。
制造一個(gè)第二融合構(gòu)建子，采用編碼人干擾素受體2的DNA，即剪接變體2(IFNAR2.2)(515個(gè)氨基酸)，其可以在Genbank登記號(hào)L41942(SEQ ID NO83)中找到，被融合進(jìn)入一個(gè)編碼前述對(duì)應(yīng)于氨基酸2040-2279(GenBank登記號(hào)AAA47910)(SEQ ID NO84)的TEV NIa蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域的DNA序列的框架中。在這些序列之間插入的是一個(gè)編碼氨基酸序列RS(Arg-Ser)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子區(qū)域被放置于人干擾素受體2(IFNAR2.2)編碼區(qū)域的上游，而一個(gè)poly A序列被放置于TEV區(qū)域的下游。該構(gòu)建子被稱(chēng)為IFNAR2.2-TEV。
構(gòu)建了Genbank登記號(hào)為NM_007315(SEQ ID NO85)的人信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)的基因和人轉(zhuǎn)錄本2(STAT2)信號(hào)轉(zhuǎn)換和活化子見(jiàn)于Genbank登記號(hào)為NM_005419(SEQID NO86)的人信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子2(STAT2)的基因的表達(dá)構(gòu)建子，其表達(dá)受CMV啟動(dòng)子區(qū)域控制。這些構(gòu)建子分別被稱(chēng)為CMV-STAT1和CMV-STAT2。
IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA和IFNAR2.2-TEV融合構(gòu)建子與CMV-STAT1和CMV-STAT2一起被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入前述HTL5B8.1細(xì)胞。大約2.5×104細(xì)胞被種植在96孔板的每孔中并在帶有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，100μμg/mlG418，和5μμg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。孵育24小時(shí)之后，細(xì)胞采用每種15ng的IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA，IFNAR2.2-TEV，CMV-STAT1和CMV-STAT2DNA，或者采用60ng對(duì)照pcDNA質(zhì)粒，與0.3μl Fμgene每孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在采用5000U/ml人干擾素α或5000U/ml人干擾素β處理之前孵育8-20小時(shí)。在加入干擾素時(shí)，吸出培養(yǎng)基并采用帶有2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，3μμg/ml嘌呤霉素和500μμg/ml的G418的293SFM II培養(yǎng)基替換。在進(jìn)行前述的熒光素酶報(bào)道基因活性檢測(cè)之前干擾素-處理的細(xì)胞被培養(yǎng)18-20小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)圖8。采用5000U/ml IFNα處理結(jié)果導(dǎo)致報(bào)道基因活性提高15倍，而采用5000U/ml IFNβ處理導(dǎo)致10倍的提高。用干擾素處理采用對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染的HTL5B8.1細(xì)胞對(duì)報(bào)道基因活性沒(méi)有影響。圖9顯示在采用前述的IFNAR1(ENLYFQ(L)-tTa，IFNAR2.2-TEV，STAT1和STAT2表達(dá)構(gòu)建子轉(zhuǎn)染的HTL5B8.1細(xì)胞中對(duì)于IFNa所產(chǎn)生的劑量應(yīng)答曲線。
實(shí)施例25
該實(shí)驗(yàn)證明該檢測(cè)方法采用不同的轉(zhuǎn)錄因子和不同的細(xì)胞系檢測(cè)人I型干擾素受體的活性。
制造融合構(gòu)建子，采用編碼人干擾素受體I(IFNAR1)的DNA，融合進(jìn)入一個(gè)編碼前述GAL4-NF-KB融合子的DNA序列。在這些序列之間插入的是一個(gè)編碼包括前述的TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)的低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQID NO87)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子被放置在人干擾素受體I(IFNAR1)編碼區(qū)域的上游，而一個(gè)poly A序列被放置在GAL4-NE-κB區(qū)域的下游。該構(gòu)建子被稱(chēng)為IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-GAL4-NF-κB。
CHO-K1細(xì)胞隨后被采用如下5種質(zhì)粒的混合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染IFNAR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-GAL4-NF-κB，IFNAR2.2-TEV，CMV-STAT1，CMV-STAT2和GAL4依賴(lài)的啟動(dòng)子控制下的熒光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒pFR-Luc。在轉(zhuǎn)染前大約每孔1.0×104細(xì)胞被種植在96孔板中，采用帶有如下成分的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素。細(xì)胞在第二天被轉(zhuǎn)染，采用10ng報(bào)道基因質(zhì)粒(pFR-Luc)，加上20ng前述的每種表達(dá)構(gòu)建子，或者采用10ng報(bào)道基因質(zhì)粒加上80ng對(duì)照pcDNA3質(zhì)粒，以及每孔0.3μl Fμgene。在采用5000U/ml人干擾素-α處理之前培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞8-20小時(shí)。在加入干擾素之前，吸出培養(yǎng)基，用帶有2mM L-谷氨酰胺，100units/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基替換。干擾素α處理的細(xì)胞在進(jìn)行前述的熒光素酶報(bào)道基因活性檢測(cè)之前培養(yǎng)6小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)圖10。采用報(bào)道基因，IFNAR和STAT構(gòu)建子CHO-K1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)IFN α處理結(jié)果導(dǎo)致報(bào)道基因活性提高3倍，而采用報(bào)道基因和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)干擾素處理對(duì)報(bào)道基因活性沒(méi)有影響。
實(shí)施例26
設(shè)計(jì)本系列的試驗(yàn)以證明采用設(shè)計(jì)好的提高檢測(cè)受體與相互作用蛋白之間親和性的修飾增強(qiáng)檢測(cè)。在這些例子中，在檢測(cè)受體和GRPR(Genbank登記號(hào)NM 005314)(SEQ ID NO59)C-末端尾巴區(qū)域之間的融合連接在第七跨膜螺旋末端保存的NPXXY模序之后形成17-23個(gè)氨基酸。
首先，PCR被用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)編碼在假定的棕櫚酰化位點(diǎn)之后的從GRPR開(kāi)始2個(gè)氨基酸的C-末端42氨基酸的DNA片段(自此以后被稱(chēng)為GRPR 42aa)。該片段被設(shè)計(jì)魏C-末端尾巴的第一氨基酸之前為由XbaI限制位點(diǎn)TCTAGA所編碼的兩個(gè)氨基酸(Ser，S andArg，R)，而終止密碼子被由BamHI限制位點(diǎn)GGATCC所編碼的兩個(gè)氨基酸(Gly，G and Ser，S)替換。這通過(guò)擴(kuò)增包含GRPR編碼區(qū)域的質(zhì)粒而完成，采用的引物是tctagaggcctgatcatccggtctcac(SEQ ID NO88)，以及gaggatccgacataccgctcgtgaca(SEQ ID NO67)
接下來(lái)OPRK(Genbank登記號(hào)NM_000912)(SEQ IDNO51)的編碼區(qū)域被修飾以在Pro-347之后插入Xbal位點(diǎn)。采用如下引物進(jìn)行PCRggtctacttgatgaattcctggcc(SEQ ID NO52)，以及tctagatggaaaacagaagtcccggaaac(SEQ ID NO89)
此外，ADRA1A(Genbank登記號(hào)Nom_000680)(SEQIDNO90)的編碼區(qū)域被修飾以在Lys-349之后插入Xbal位點(diǎn)。采用如下引物進(jìn)行PCRctcggatatctaaacagctgcatcaa(SEQ ID NO91)，以及tctagactttctgcagagacactggattc(SEQ ID NO92) 此外，DRD2(Genbank登記號(hào)NM_000795)(SEQ IDNO37)的編碼區(qū)域被修飾以在Cys-343之后插入兩個(gè)氨基酸(Leu和Arg)以及XbaI位點(diǎn)。這采用如下引物進(jìn)行PCRgaattcatggatccactgaatctgtcc(SEQ ID NO38)，以及tctagatcgaaggcagtggaggatcttcagg(SEQ ID NO93)
修飾的OPRK受體編碼區(qū)域采用EcoRI和XbaI剪切而GRPR 42aa C-末端尾巴片段采用XbaI和BamHI剪切。兩個(gè)片段被連接至包含具有前述的AVPR2C-末端尾巴-低效應(yīng)剪切位點(diǎn)-tTA的OPRK受體的質(zhì)粒中，其采用EcoRI和BamHI消化。
修飾的ADRA1A受體編碼區(qū)域采用EcoRV和Xbal剪切而包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的OPRK-GRPR 42aa尾-tTA融合構(gòu)建子采用XbaI和XhoI剪切。兩個(gè)片段被連接至包含ADRA1A受體的質(zhì)粒中，其被EcoRV和XhoI消化。
修飾的DRD2受體編碼區(qū)域采用EcoRI和Xbal剪切而包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的OPRK-GRPR 42aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子采用XbaI和Xhol剪切。兩個(gè)片段被連接至pcDNA6質(zhì)粒，其被EcoRI和XhoI消化。
如前述的HTLA 2C11.6細(xì)胞，被包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的OPRK-GRPR 42aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子轉(zhuǎn)染并且檢測(cè)采用10μMU-69593，一種OPRK激活劑而進(jìn)行。對(duì)U-69593的最大應(yīng)答為報(bào)道基因活性提高大約200倍。
HTLA 2C11.6細(xì)胞采用包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的ADRA1A-GRPR 42aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子轉(zhuǎn)染并且檢測(cè)采用10μM腎上腺素，一種ADRAIA激活劑而進(jìn)行。對(duì)腎上腺素最大應(yīng)答為報(bào)道基因活性提高大約14倍。
HTLA 2C11.6細(xì)胞采用包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的DRD2-GRPR 42aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子轉(zhuǎn)染并且檢測(cè)采用10μM多巴胺，一種DRD2激活劑而進(jìn)行。對(duì)多巴胺最大應(yīng)答為報(bào)道基因活性提高大約30倍。
實(shí)施例27 本系列的試驗(yàn)本設(shè)計(jì)以證明采用設(shè)計(jì)好的提高檢測(cè)受體與相互作用蛋白之間親和性的修飾的不同檢測(cè)受體進(jìn)一步增強(qiáng)檢測(cè)。在這些實(shí)施例中，檢測(cè)受體的C-末端區(qū)域被GRPR內(nèi)源的C-末端尾巴結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片斷替換。
首先，PCR被用于生產(chǎn)一個(gè)編碼截?cái)嗟腉RPR尾巴的DNA片段，特別是編碼從Gly-343至Asn-365的23氨基酸的序列。片段被設(shè)計(jì)為C-末端尾巴的第一氨基酸之前為由XbaI限制位點(diǎn)TCTAGA所編碼的兩個(gè)氨基酸(Ser，S和Arg，R)，而Ser-366被由BamHI限制位點(diǎn)GGATCC所編碼的兩個(gè)氨基酸(Gly，G和Ser，S)替換。這通過(guò)擴(kuò)增一個(gè)包含GRPR編碼區(qū)域的質(zhì)粒而完成，所用引物如下tctagaggcctgatcatccggtctcac(SEQ ID NO94)以及cggatccgttggtactcttgagg(SEQID NO95)。
接下來(lái)，截?cái)嗟腉RPR片段(自此以后被稱(chēng)為GRPR23aa尾巴)采用Xbal和BamHI剪切并插入到包含這里所述的低效應(yīng)檢測(cè)位點(diǎn)的OPRK-GRPR 42aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子中，其采用Xbal和BamHI消化。
同樣地，GRPR 23aa尾巴片段采用Xbal和BamHI消化并且被插入到這里所述的包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的ARRA1A-GRPR42aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子中，其采用Xbal和BamHI消化。
HTLA 2C11.6細(xì)胞采用包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的OPRK-GRPR 23aa尾巴-tTA融合構(gòu)建子轉(zhuǎn)染并且檢測(cè)采用10μMU-69593，一種OPRK激活劑而進(jìn)行。對(duì)U-69593的最大應(yīng)答為報(bào)道基因表達(dá)比背景提高了大約115倍。
HTLA 2C11.6細(xì)胞采用包含低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的ADRA1A-GRPR 23aa尾-tTA融合構(gòu)建子轉(zhuǎn)染并且檢測(cè)采用10μM腎上腺素，一種ADRA1A激活劑而進(jìn)行。對(duì)腎上腺素的最大應(yīng)答為報(bào)道基因的表達(dá)比背景提高了大約102倍。
實(shí)施例28
該實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)以證明利用該檢測(cè)方法能檢測(cè)受體酪氨酸激酶胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)的活性，特別是通過(guò)監(jiān)控配體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白SHCI(包含Src同源2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化蛋白1)的募集而檢測(cè)。
制造第一融合構(gòu)建子被，包含編碼人IGF-1R的DNA，其可在GenBank登記號(hào)NM_000875(SEQ ID NO96)下找到，其被融合進(jìn)入一個(gè)編碼前述的四環(huán)素控制的反式激活蛋白tTA的氨基酸3-335的DNA序列中。在這些序列中插入的是一個(gè)編碼包括前述的TEVNIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQID NO82)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子被放置在IGF1R編碼區(qū)域的上游，并且polyA序列被放置在tTA區(qū)域的下游。該構(gòu)建子被稱(chēng)為IGF1R-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA。
制造第二融合構(gòu)建子，包含編碼人SHC1，對(duì)應(yīng)于氨基酸1-238(基因Bank登記號(hào)BC014158)(SEQ ID NO97)的PTB區(qū)域的DNA被融合進(jìn)入一個(gè)編碼前述的成熟TEV NIa蛋白酶，對(duì)應(yīng)于氨基酸2040-2279(基因Bank登記號(hào)AAA47910)(SEQ ID NO79)的催化結(jié)構(gòu)域的DNA序列中。在這些序列中插入的是一個(gè)連接子DNA序列，其編碼氨基酸NSGS(SEQ ID NO98)。CMV啟動(dòng)子被放置在SHC1PTB結(jié)構(gòu)域編碼序列的上游而一個(gè)polyA序列被放置在TEV NIa蛋白酶序列的下游。該構(gòu)建子被稱(chēng)為SHC1-TEV。
IGF1R-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA和SHC1-TEV融合構(gòu)建子被轉(zhuǎn)染進(jìn)入前述的克隆HTL5B8.1細(xì)胞中。大約2.5×104細(xì)胞放置于96孔板的每孔中，采用帶有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，500μμg/ml G418，和3μg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。第二天細(xì)胞生長(zhǎng)至50％融合度融合度并且采用每孔15μl如下混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染100μμgl DMEM，0.2μμg IGF1R-TEV-NIa-Pro剪切(Leu)-tTA DNA，0.2μμg SHC1-TEV DNA，以及2μμl Fμgene(一種合適的包含脂質(zhì)體和其他材料的轉(zhuǎn)染試劑)，在加入細(xì)胞之前在室溫下孵育15分鐘。在采用特異受體激活劑處理之前，轉(zhuǎn)染細(xì)胞被培養(yǎng)大約16小時(shí)。24小時(shí)之后，裂解細(xì)胞并如前述檢測(cè)熒光素酶活性。
加入1μM人胰島素樣生長(zhǎng)因子1導(dǎo)致熒光素酶報(bào)道基因活性提高90倍。
實(shí)施例29
該試驗(yàn)本設(shè)計(jì)以證明采用該檢測(cè)方法能檢測(cè)不是正常膜結(jié)合蛋白的兩種檢測(cè)蛋白之間的相互作用。在這個(gè)實(shí)施例中，該檢測(cè)方法被用來(lái)檢測(cè)配體誘導(dǎo)的核類(lèi)固醇激素受體，ESR1(雌激素受體1或ERα)和ESR2(雌激素受體2或ERβ)二聚化。在這個(gè)實(shí)施例中，ESR1被融合至轉(zhuǎn)錄因子tTA，其中TEV NIa-Pro蛋白酶剪切位點(diǎn)在ESRI和tTA序列之間插入。該ESRI-tTA通過(guò)融合細(xì)胞內(nèi)跨膜蛋白CD8的C末端而系在膜上。CD8基本功能為一個(gè)插入支架，而使ESR1連系在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)。這樣融合的轉(zhuǎn)錄因子不能進(jìn)入核直到與ESR2和蛋白酶相互作用。可采用任何跨膜蛋白。這種CD8-ESR1-TEV NIa Pro剪切-tTA融合蛋白與一個(gè)包含ESR2和TEV NIa-Pro蛋白酶的第二融合蛋白一起在包含一個(gè)tTA依賴(lài)的報(bào)道基因的細(xì)胞系中表達(dá)。雌激素誘導(dǎo)的ESR1和ESR2二聚化因而觸發(fā)了tTA轉(zhuǎn)錄因子從膜結(jié)合的融合蛋白中釋放，其可以通過(guò)隨后誘導(dǎo)的報(bào)道基因活性而得以檢測(cè)。
制造融合構(gòu)建子，其包含編碼人CD8基因(235氨基酸)的DNA序列，其可在Genbank登記號(hào)NM_001768(SEQ ID NO99)下發(fā)現(xiàn)，被融合進(jìn)入編碼人ESR1(596氨基酸s)的DNA序列中，其可在Genbank登記號(hào)NM_000125(SEQ ID NO100)下發(fā)現(xiàn)。在這些序列中插入的是一個(gè)編碼氨基酸序列GRA(Gly-Arg-Ala)的DNA序列。最終構(gòu)建子隨后被融合至編碼前述的四環(huán)素控制的反式激活蛋白tTA的氨基酸3-335的DNA編碼序列框中。在這些序列中插入的是一個(gè)編碼包含前述的TEV NIa-Pro，ENLYFQL(SEQ ID NO14)的低效應(yīng)剪切位點(diǎn)的氨基酸序列GSENLYFQL(SEQID NO82)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子被放置在人CD8編碼區(qū)域的上游，而poly A序列被放置在tTA區(qū)域的下游。該構(gòu)建子被稱(chēng)為CD8-ESR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA。
制造第二融合構(gòu)建子，采用編碼人雌激素受體β(ESR2)(530個(gè)氨基酸)的DNA，其可在Genbank登記號(hào)NM_001437(SEQIDNO101)下被找到，其被融合進(jìn)入一個(gè)編碼前述的TEV NIa蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，對(duì)應(yīng)于氨基酸2040-2279(GenBank登記號(hào)AAA47910)(SEQ ID NO84)的DNA序列中。在這些序列中插入的是一個(gè)編碼氨基酸序列RS(Arg-Ser)的DNA序列。CMV啟動(dòng)子區(qū)域被放置在人雌激素受體β(ESR2)編碼區(qū)域的上游，而poly A序列被放置在TEV區(qū)域的下游。該構(gòu)建子被稱(chēng)為ESR2-TEV。
CD8-ESR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA和ESR2-TEV融合構(gòu)建子，與pCDNA3一起被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入前述的HTL5B8.1細(xì)胞中。大約2.0×104細(xì)胞被種植在96孔板的每孔中并且在帶有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100units/ml青霉素，100μμg/ml G418和5μμg/ml嘌呤霉素的不含酚的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在孵育24小時(shí)后，細(xì)胞每孔采用5ng的ESR1-TEV-NIa-Pro剪切(L)-tTA，15ngESR2-TEV和40ng pCDNA3以及0.3μμl Fμgene的混合物一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6小時(shí)之后，細(xì)胞用PBS清洗并在采用50nM 17-β雌二醇處理之前用100μμl不含酚和血清的DMEM中孵育24小時(shí)。配體處理的細(xì)胞在如前述檢測(cè)熒光素酶報(bào)道基因活性之前再培養(yǎng)18-20小時(shí)。用50nM 17-β雌二醇處理使得報(bào)道基因活性增加16倍。
本發(fā)明的其它特征對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的并且不需要在此再介紹。
序列表<110>K·J·李R·阿謝爾W·斯特拉波斯G·巴爾內(nèi)亞<120>檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的方法<130>SENTI203.3PCT<140>PCT/US2004/021887<141>2004-07-09<150>60/566,113<151>2004-04-27<150>60/511,918<151>2003-10-15<150>60/485,968<151>2003-07-09<160>101<210>1<211>2015<212>DNA<213>人<400>1actgcgaagc ggcttcttca gagcacgggc tggaactggc aggcaccgcg agcccctagc 60acccgacaag ctgagtgtgc aggacgagtc cccaccacac ccacaccaca gccgctgaat 120gaggcttcca ggcgtccgct cgcggcccgc agagccccgc cgtgggtccg cccgctgagg 180cgcccccagc cagtgcgctt acctgccaga ctgcgcgcca tggggcaacc cgggaacggc 240agcgccttct tgctggcacc caatagaagc catgcgccgg accacgacgt cacgcagcaa 300agggacgagg tgtgggtggt gggcatgggc atcgtcatgt ctctcatcgt cctggccatc 360gtgtttggca atgtgctggt catcacagcc attgccaagt tcgagcgtct gcagacggtc 420accaactact tcatcacttc actggcctgt gctgatctgg tcatgggcct ggcagtggtg 480ccctttgggg ccgcccatat tcttatgaaa atgtggactt ttggcaactt ctggtgcgag 540ttttggactt ccattgatgt gctgtgcgtc acggccagca ttgagaccct gtgcgtgatc 600gcagtggatc gctactttgc cattacttca cctttcaagt accagagcct gctgaccaag 660aataaggccc gggtgatcat tctgatggtg tggattgtgt caggccttac ctccttcttg 720cccattcaga tgcactggta ccgggccacc caccaggaag ccatcaactg ctatgccaat 780gagacctgct gtgacttctt cacgaaccaa gcctatgcca ttgcctcttc catcgtgtcc 840ttctacgttc ccctggtgat catggtcttc gtctactcca gggtctttca ggaggccaaa 900aggcagctcc agaagattga caaatctgag ggccgcttcc atgtccagaa ccttagccag 960gtggagcagg atgggcggac ggggcatgga ctccgcagat cttccaagtt ctgcttgaag 1020gagcacaaag ccctcaagac gttaggcatc atcatgggca ctttcaccct ctgctggctg 1080cccttcttca tcgttaacat tgtgcatgtg atccaggata acctcatccg taaggaagtt 1140tacatcctcc taaattggat aggctatgtc aattctggtt tcaatcccct tatctactgc 1200cggagcccag atttcaggat tgccttccag gagcttctgt gcctgcgcag gtcttctttg 1260aaggcctatg ggaatggcta ctccagcaac ggcaacacag gggagcagag tggatatcac 1320gtggaacagg agaaagaaaa taaactgctg tgtgaagacc tcccaggcac ggaagacttt 1380gtgggccatc aaggtactgt gcctagcgat aacattgatt cacaagggag gaattgtagt 1440acaaatgact cactgctgta aagcagtttt tctactttta aagacccccc cccccccaac 1500agaacactaa acagactatt taacttgagg gtaataaact tagaataaaa ttgtaaaaat 1560tgtatagaga tatgcagaag gaagggcatc cttctgcctt ttttattttt ttaagctgta 1620
aaaagagaga aaacttattt gagtgattat ttgttatttg tacagttcag ttcctctttg 1680catggaattt gtaagtttat gtctaaagag ctttagtcct agaggacctg agtctgctat 1740attttcatga cttttccatg tatctacctc actattcaag tattaggggt aatatattgc 1800tgctggtaat ttgtatctga aggagatttt ccttcctaca cccttggact tgaggatttt 1860gagtatctcg gacctttcag ctgtgaacat ggactcttcc cccactcctc ttatttgctc 1920acacggggta ttttaggcag ggatttgagg agcagcttca gttgttttcc cgagcaaagg 1980tctaaagttt acagtaaata aaatgtttga ccatg 2015<210>2<211>26<212>DNA<213>人<400>2gattgaagat ctgccttctt gctggc 26<210>3<211>27<212>DNA<213>人<400>3gcagaacttg gaagacctgc ggagtcc 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人<400>4ggactccgca ggtcttccaa gttctgc 27<210>5<211>27<212>DNA<213>人<400>5ttcggatcct agcagtgagt catttgt 27<210>6<211>7<212>PRT<213>人<400>6Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser5<210>7<211>32<212>DNA<213>人<400>7ccggatcctc tagattagat aaaagtaaag tg32
<210>8<211>35<212>DNA<213>人<400>8gactcgagct agcagtatcc tcgcgccccc taccc 35<210>9<211>18<212>DNA<213>人<400>9gagaacctgt acttccag18<210>10<211>33<212>DNA<213>人<400>10ggatccgaga acctgtactt ccagtacaga tta 33<210>11<211>30<212>DNA<213>人<400>11ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc 30<210>12<211>7<212>PRT<213>人<400>12Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Tyr5<210>13<211>33<212>DNA<213>人<400>13ggatccgaga acctgtactt ccagctaaga tta 33<210>14<211>7<212>PRT<213>人<400>14
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Leu5<210>15<211>33<212>DNA<213>人<400>15gcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca 33<210>16<211>21<212>DNA<213>人<400>16ctggtgggtg gcccggtacc a21<210>17<211>1936<212>DNA<213>人<400>17ccccgcgtgt ctgctaggag agggcgggca gcgccgcggc gcgcgcgatc cggctgacgc 60atctggcccc ggttccccaa gaccagagcg gggccgggag ggagggggaa gaggcgagag 120cgcggagggc gcgcgtgcgc attggcgcgg ggaggagcag ggatcttggc agcgggcgag 180gaggctgcga gcgagccgcg aaccgagcgg gcggcgggcg cgcgcaccat gggggagaaa 240cccgggacca gggtcttcaa gaagtcgagc cctaactgca agctcaccgt gtacttgggc 300aagcgggact tcgtagatca cctggacaaa gtggaccctg tagatggcgt ggtgcttgtg 360gaccctgact acctgaagga ccgcaaagtg tttgtgaccc tcacctgcgc cttccgctat 420ggccgtgaag acctggatgt gctgggcttg tccttccgca aagacctgtt catcgccacc 480taccaggcct tccccccggt gcccaaccca ccccggcccc ccacccgcct gcaggaccgg 540ctgctgagga agctgggcca gcatgcccac cccttcttct tcaccatacc ccagaatctt 600ccatgctccg tcacactgca gccaggccca gaggatacag gaaaggcctg cggcgtagac 660tttgagattc gagccttctg tgctaaatca ctagaagaga aaagccacaa aaggaactct 720gtgcggctgg tgatccgaaa ggtgcagttc gccccggaga aacccggccc ccagccttca 780gccgaaacca cacgccactt cctcatgtct gaccggtccc tgcacctcga ggcttccctg 840gacaaggagc tgtactacca tggggagccc ctcaatgtaa atgtccacgt caccaacaac 900tccaccaaga ccgtcaagaa gatcaaagtc tctgtgagac agtacgccga catctgcctc 960ttcagcaccg cccagtacaa gtgtcctgtg gctcaactcg aacaagatga ccaggtatct 1020cccagctcca cattctgtaa ggtgtacacc ataaccccac tgctcagcga caaccgggag 1080aagcggggtc tcgccctgga tgggaaactc aagcacgagg acaccaacct ggcttccagc 1140accatcgtga aggagggtgc caacaaggag gtgctgggaa tcctggtgtc ctacagggtc 1200aaggtgaagc tggtggtgtc tcgaggcggg gatgtctctg tggagctgcc ttttgttctt 1260atgcacccca agccccacga ccacatcccc ctccccagac cccagtcagc cgctccggag 1320acagatgtcc ctgtggacac caacctcatt gaatttgata ccaactatgc cacagatgat 1380gacattgtgt ttgaggactt tgcccggctt cggctgaagg ggatgaagga tgacgactat 1440gatgatcaac tctgctagga agcggggtgg gaagaaggga ggggatgggg ttgggagagg 1500tgagggcagg attaagatcc ccactgtcaa tgggggattg tcccagcccc tcttcccttc 1560ccctcacctg gaagcttctt caaccaatcc cttcacactc tctcccccat ccccccaaga 1620tacacactgg accctctctt gctgaatgtg ggcattaatt ttttgactgc agctctgctt 1680ctccagcccc gccgtgggtg gcaagctgtg ttcataccta aattttctgg aaggggacag 1740tgaaaagagg agtgacagga gggaaagggg gagacaaaac tcctactctc aacctcacac 1800caacacctcc cattatcact ctctctgccc ccattccttc aagaggagac cctttgggga 1860
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1.一種用于確定是否一種檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)感興趣的特異蛋白/蛋白相互作用的方法，其包含使所述化合物與采用如下物質(zhì)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接觸(a)包括下述物質(zhì)的核酸分子(i)編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶或蛋白酶片段識(shí)別的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)包括下述物質(zhì)的核酸分子(i)編碼在要檢測(cè)的所述檢測(cè)化合物存在下與所述第一檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，并確定所述報(bào)道基因的活性從而確定是否所述化合物調(diào)節(jié)所述蛋白/蛋白相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一檢測(cè)蛋白是膜結(jié)合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述膜結(jié)合蛋白是跨膜受體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述跨膜受體是GPCR。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中激活所述報(bào)道基因的所述蛋白是轉(zhuǎn)錄因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是tTA或GAL4。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第二蛋白是抑制性蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白，并且所述第一蛋白是跨膜受體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述報(bào)道基因是外源基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述外源基因編碼β-半乳糖苷酶或熒光素酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列被修飾以提高與所述第二檢測(cè)蛋白的相互作用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述修飾包含采用編碼相比于原始序列與所述第二檢測(cè)蛋白具有更高親和性的氨基酸序列的核苷酸序列替換所述第一檢測(cè)蛋白C-末端區(qū)域的全部或部分核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述C-末端區(qū)域的核苷酸序列被編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2PL1，CXCR2/IL-8B，CCR4或GRPR的C-末端區(qū)域的全部或部分的核苷酸序列所替換。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包含使多于一種化合物與多個(gè)細(xì)胞樣本接觸，所述樣本中的每個(gè)與一個(gè)或更多所述化合物接觸，其中所述細(xì)胞樣本中的每個(gè)采用(a)和(b)進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，并且在所述多個(gè)所述樣本中確定報(bào)道基因的活性，從而確定是否任何所述化合物調(diào)節(jié)所述特異蛋白/蛋白相互作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述膜結(jié)合蛋白是β2-腎上腺素受體(ADRB2)，精氨酸血管加壓素受體2(AVPR2)，血清素受體1a(HTR1A)，m2毒蕈堿性乙酰膽堿受體(CHRM2)，趨化因子(C-C模序)受體5(CCR5)，多巴胺D2受體(DRD2)，卡巴阿片樣物質(zhì)受體(OPRK)或ADRA1A。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，包含使所述樣本的每個(gè)與一種化合物接觸，其中的每種與其他不相同。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，包含使所述樣本的每個(gè)與所述化合物的混合物接觸。
20.一種用于確定是否一種檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)感興趣的多個(gè)蛋白的一個(gè)或多個(gè)的相互作用的方法，包含使所述檢測(cè)化合物與多個(gè)細(xì)胞樣本接觸，每種細(xì)胞樣本已經(jīng)被如下物質(zhì)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化(a)第一核酸分子，包含(i)編碼第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶識(shí)別剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，(b)第二核酸分子，包含(i)編碼在要檢測(cè)的感興趣的所述檢測(cè)化合物存在下與所述第一檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼對(duì)所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶核苷酸序列，其中在所述多個(gè)樣本的每個(gè)中，所述第一檢測(cè)蛋白不同于其他的第一檢測(cè)蛋白，并且在一個(gè)或多個(gè)所述多個(gè)樣本中確定所述報(bào)道基因的活性從而確定感興趣的一個(gè)或多個(gè)蛋白相互作用的調(diào)節(jié)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第二檢測(cè)蛋白在每個(gè)樣本中是不同的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第二檢測(cè)蛋白在每個(gè)樣本中是相同的。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所有的所述樣本放置于一個(gè)普通容器中，每個(gè)樣本包含一個(gè)不同的第一和第二檢測(cè)蛋白對(duì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中每個(gè)樣本在不同的容器中進(jìn)行檢測(cè)。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在給定樣本中的報(bào)道基因不同于其他樣本中的報(bào)道基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物的混合物包含生物學(xué)樣本。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述生物學(xué)樣本為腦脊液，尿液，血液，血清，膿液，腹水，滑液，組織提取物或分泌物。
28.采用如下物質(zhì)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞(a)核酸分子，包含(i)編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶或蛋白酶片段識(shí)別的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，和(b)核酸分子，包含(i)編碼在要檢測(cè)的所述檢測(cè)化合物存在下與所述第一檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼對(duì)于所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述核酸分子中的一個(gè)或兩個(gè)被穩(wěn)定整合到所述細(xì)胞的基因組中。
30.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞被所述報(bào)道基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。
31.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述第一檢測(cè)蛋白是膜結(jié)合蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求31中的重組細(xì)胞，其中所述膜結(jié)合蛋白是跨膜受體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32中的重組細(xì)胞，其中所述跨膜受體是GPCR。
34.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述激活所述報(bào)道基因的蛋白是轉(zhuǎn)錄因子。
36.根據(jù)權(quán)利要求31中的重組細(xì)胞，其中所述膜結(jié)合蛋白是ADBR2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2或OPRK。
37.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是tTA或GAL4。
38.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述第二蛋白是抑制性蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求38中的重組細(xì)胞，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白，并且所述第一蛋白是跨膜受體。
40.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
42.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中所述報(bào)道基因是外源基因。
43.根據(jù)權(quán)利要求42中的重組細(xì)胞，其中所述外源基因編碼β-半乳糖苷酶或熒光素酶.
44.根據(jù)權(quán)利要求28中的重組細(xì)胞，其中編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列被修飾以提高與所述第二檢測(cè)蛋白的相互作用。
45.根據(jù)權(quán)利要求44中的重組細(xì)胞，其中所述修飾包含采用一種編碼相比于原始序列與所述第二檢測(cè)蛋白具有更高親和性的氨基酸序列的核苷酸序列替換所述第一檢測(cè)蛋白C-末端區(qū)域的全部或部分核苷酸序列。
46.根據(jù)權(quán)利要求44中的重組細(xì)胞，其中所述C-末端區(qū)域的核苷酸序列被編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2PL1，CXCR2/IL-8B或CCR4的C-末端區(qū)域的核苷酸序列所替換。
47.一種分離的核酸分子，其包含，從5′至3′順序，(i)編碼檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶或蛋白酶片段識(shí)別的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的分離的核酸分子，其中所述檢測(cè)蛋白是膜結(jié)合蛋白。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的分離的核酸分子，其中所述膜結(jié)合蛋白是跨膜受體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的分離的核酸分子，其中所述跨膜受體是GPCR。
51.根據(jù)權(quán)利要求47的分離的核酸分子，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。
52.根據(jù)權(quán)利要求47的分離的核酸分子，其中所述激活所述報(bào)道基因的蛋白是轉(zhuǎn)錄因子。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的分離的核酸分子，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是tTA或GAL4。
54.根據(jù)權(quán)利要求48的分離的核酸分子，其中所述膜結(jié)合蛋白是ADBR2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2或OPRK。
55.包含權(quán)利要求47的分離的核酸分子的表達(dá)載體，可操作的連接到啟動(dòng)子。
56.一種分離的核酸分子，其包含(i)編碼在要檢測(cè)的檢測(cè)化合物存在下與另一種檢測(cè)蛋白相互作用的檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼對(duì)所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的分離的核酸分子，其中所述檢測(cè)蛋白是抑制性蛋白。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的分離的核酸分子，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白.
59.包含權(quán)利要求56的分離的核酸分子的表達(dá)載體，可操作的連接到啟動(dòng)子。
60.由權(quán)利要求47的分離的核酸分子的表達(dá)所產(chǎn)生的融合蛋白。
61.由權(quán)利要求56的分離的核酸分子的表達(dá)所產(chǎn)生的融合蛋白。
62.一種用于確定是否檢測(cè)化合物調(diào)節(jié)感興趣的特異蛋白/蛋白相互作用的檢測(cè)試劑盒，包括每種獨(dú)立的部分(a)核酸分子，其包含(i)編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼蛋白酶或蛋白酶片段識(shí)別的剪切位點(diǎn)的核苷酸序列，(iii)編碼在所述細(xì)胞中激活報(bào)道基因的蛋白的核苷酸序列，(b)核酸分子，其包含(i)編碼在要檢測(cè)的檢測(cè)化合物存在下與所述第一檢測(cè)蛋白相互作用的第二檢測(cè)蛋白的核苷酸序列，(ii)編碼對(duì)所述剪切位點(diǎn)特異的蛋白酶或蛋白酶片段的核苷酸序列，(c)分別獨(dú)立容納每種(a)和(b)的包裝方式。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的檢測(cè)試劑盒，其中所述第一檢測(cè)蛋白是膜結(jié)合蛋白。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的檢測(cè)試劑盒，其中所述膜結(jié)合蛋白是跨膜受體。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的檢測(cè)試劑盒，其中所述跨膜受體是GPCR。
66.根據(jù)權(quán)利要求62的檢測(cè)試劑盒，其中所述蛋白酶或蛋白酶片段是煙草蝕紋病毒核內(nèi)包涵體A蛋白酶。
67.根據(jù)權(quán)利要求62的檢測(cè)試劑盒，其中所述激活所述報(bào)道基因的蛋白是轉(zhuǎn)錄因子。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的檢測(cè)試劑盒，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是tTA或GAL4。
69.根據(jù)權(quán)利要求62的檢測(cè)試劑盒，其中所述第二蛋白是抑制性蛋白。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的檢測(cè)試劑盒，其中所述抑制性蛋白是抑制蛋白，并且所述第一蛋白是跨膜受體。
71.根據(jù)權(quán)利要求61的檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一步包含編碼報(bào)道基因的分離的核酸分子的獨(dú)立部分。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的檢測(cè)試劑盒，其中所述報(bào)道基因編碼β-半乳糖苷酶或熒光素酶.
73.根據(jù)權(quán)利要求62的檢測(cè)試劑盒，其中編碼所述第一檢測(cè)蛋白的核苷酸序列被修飾以提高與所述第二檢測(cè)蛋白的相互作用。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的檢測(cè)試劑盒，其中所述修飾包含采用編碼相比于原始序列與所述第二檢測(cè)蛋白具有更高親和性的氨基酸序列的核苷酸序列替換所述第一檢測(cè)蛋白C-末端區(qū)域的全部或部分核苷酸序列。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的檢測(cè)試劑盒，其中所述C-末端區(qū)域的核苷酸序列被編碼AVPR2，AGTRLI，GRPR，F(xiàn)2PL1，CXCR2/IL-8B或CCR4的C-末端區(qū)域的全部或部分的核苷酸序列所替換。
76.根據(jù)權(quán)利要求63的檢測(cè)試劑盒，其中所述膜結(jié)合蛋白是ADRB2，AVPR2，HTR1A，CHRM2，CCR5，DRD2或OPRK。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于確定是否一種檢測(cè)化合物或化合物的混合物調(diào)節(jié)感興趣的兩種蛋白的之間相互作用的檢測(cè)方法。確定過(guò)程可以通過(guò)利用兩種重組分子，一個(gè)包含第一蛋白和用于蛋白水解分子的剪切位點(diǎn)，以及基因的激活劑。第二重組分子包括第二蛋白和蛋白水解分子。如果檢測(cè)化合物結(jié)合至第一檢測(cè)蛋白，啟動(dòng)反應(yīng)而由此激活劑被剪切，并且激活報(bào)道基因。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1894581SQ200480024864
公開(kāi)日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月9日
發(fā)明者K·J·李, R·阿謝爾, W·斯特拉波斯, G·巴爾內(nèi)亞 申請(qǐng)人:森蒂金生物科學(xué)公司, 紐約市哥倫比亞大學(xué)托管會(huì)