專利名稱：用于增加來(lái)自海洋微生物的生物質(zhì)和/或生物質(zhì)成分的產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在好氣條件(aerobic conditions)下培養(yǎng)海洋微生物的方法，其中在20-100小時(shí)中使用連續(xù)發(fā)酵過(guò)程生產(chǎn)100-300g/l的細(xì)胞干物質(zhì)CDM。
背景技術(shù)：
在通過(guò)微生物的批量、補(bǔ)料分批或連續(xù)培養(yǎng)的生物質(zhì)或構(gòu)成生物質(zhì)有效(significant)部分的成分的工業(yè)生產(chǎn)中，希望獲得最高可能的生物質(zhì)生產(chǎn)率。進(jìn)一步地，構(gòu)成基本上連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)是較少的人力需要以及較少的用于工藝控制的潛在需要。連續(xù)發(fā)酵過(guò)程依賴于足夠穩(wěn)定的使用菌株，并且如果這種菌株是可利用的，論及可獲得包括產(chǎn)品濃度和產(chǎn)品可回收性的整個(gè)培養(yǎng)肉湯(broth)的特點(diǎn)，使用連續(xù)發(fā)酵過(guò)程可能提供容許較高均勻度的制造過(guò)程。
US 5,244,921描述了用于從例如Nitzschia alba的硅藻以商業(yè)上可行的產(chǎn)率生產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)的方法，其在60小時(shí)中的產(chǎn)率少于70gCDM/l。
US 5,711,983涉及用于從包括隱甲藻(Crypthecodinium sp)的海洋甲藻類(lèi)(dinoflagellates)以商業(yè)上可行的產(chǎn)率生產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)的方法。報(bào)到產(chǎn)率的范圍是在75小時(shí)中為23gCDM/l和在160小時(shí)中為33gCDM/l。
EP 0823475 A1涉及從Schizochytrium屬SR21生產(chǎn)DHA和DPA。報(bào)到所得到的產(chǎn)率是在150小時(shí)中最多為60gCDM/l。
US 5,518,918涉及包括選自Thraustochytrium和Schizochytrium的微生物的微生物系統(tǒng)生物質(zhì)。獲得的CDM少于8g/l。
WO 01/04338涉及培養(yǎng)微生物寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)用于合成多聚不飽和脂肪酸的方法。獲得的產(chǎn)率在140小時(shí)中少于46gCDM/l。
US 6,582,941涉及Schizochytrium菌株。獲得的產(chǎn)率在120h中少于60gCDM/l。
WO 01/54510涉及以補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)的真核微生物，以及特別是Thraustochytriads目(order)的微海藻，并且強(qiáng)調(diào)將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為2個(gè)階段的重要性一個(gè)用于起始的生物質(zhì)積累，以及一個(gè)階段容許在特定的營(yíng)養(yǎng)限制和低氧壓力的條件下發(fā)生多烯脂肪酸的累積。獲得包含至少20％w/w脂類(lèi)的大于100g/l的細(xì)胞干物質(zhì)，同時(shí)DHA的生產(chǎn)率(ω-3 C226，二十二碳六烯酸)可高于補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程的0.3g/l/h。然而，可能由于涉及發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜特性，在進(jìn)行的31個(gè)相同的發(fā)酵批量?jī)?nèi)顯示DHA-生產(chǎn)率以～2的系數(shù)變化(參見(jiàn)實(shí)施例4)。WO 01/54510也顯示當(dāng)利用連續(xù)發(fā)酵過(guò)程時(shí)可獲得達(dá)到20g/l細(xì)胞干物質(zhì)的產(chǎn)率(參見(jiàn)實(shí)施例9)。
因此仍然需要用于簡(jiǎn)化培養(yǎng)含油的、生產(chǎn)多烯酸的微藻同時(shí)保持高多烯酸生產(chǎn)率的發(fā)酵過(guò)程的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物，產(chǎn)生極高生物質(zhì)生產(chǎn)率的改進(jìn)方法，其中可從連續(xù)操作的發(fā)酵罐(fermentor)收獲100-300g/l產(chǎn)率的細(xì)胞干物質(zhì)，其中培養(yǎng)肉湯的滯留期(residence time)在20-100小時(shí)范圍之內(nèi)，同時(shí)保持約0.5g脂類(lèi)/g生物質(zhì)干物質(zhì)的脂類(lèi)含量和至少0.2gDHA/l/h的多烯酸生產(chǎn)率。
考慮到現(xiàn)有技術(shù)，最令人驚奇的是，可獲得這種高多烯酸生產(chǎn)率而不用使細(xì)胞生長(zhǎng)和多烯酸生產(chǎn)分開(kāi)。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在好氣條件下以Yg/l的細(xì)胞干物質(zhì)CDM，于發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是從100-300g/l的范圍，包括在包含以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h)克逐步加入碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物，其中h是從1.1-3.0的范圍，并且滯留期為20-150h，特別是20-100h的滯留期。
規(guī)定h的范圍，可理解給出的碳源的數(shù)量不含任何締合水(associatedwater)。在下列章節(jié)中，可理解給出的氮源的量是氮的量。
發(fā)明詳述眾所周知微生物為了生長(zhǎng)需要碳源。同樣培養(yǎng)基中碳源的濃度對(duì)于細(xì)胞干物質(zhì)的最后產(chǎn)率也很重要。
令人驚訝地我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加喂飼至連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)基中碳源的濃度，有可能獲得100-300g/l級(jí)別的表示為細(xì)胞干物質(zhì)CDM的產(chǎn)率(Y)，當(dāng)在限制碳源或氮源用于生物質(zhì)形成同時(shí)保持高脂類(lèi)和高多烯酸生產(chǎn)率的培養(yǎng)基中培養(yǎng)海洋微生物時(shí)，在少于100h中產(chǎn)生所述量的生物質(zhì)。
應(yīng)以每升培養(yǎng)肉湯Y×h克的量加入碳源，其中h是從1.1至3.0的范圍，優(yōu)選從1.1-2.5的范圍，更優(yōu)選從1.2-2.0的范圍。
應(yīng)產(chǎn)生有效量的例如酪蛋白氨基酸和/或(NH4)2SO3形式的氮，其為碳源量的0.002至0.2倍(Y×h×f)，優(yōu)選為碳源量的0.004至0.1倍，更優(yōu)選為碳源量的0.01至0.04倍。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及在好氣條件下連續(xù)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物的方法，其中可在已知點(diǎn)在20-100小時(shí)內(nèi)從發(fā)酵罐收獲Yg/l的細(xì)胞干物質(zhì)，其中Y包括在100-300g/l的范圍內(nèi)，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的海洋微生物，該培養(yǎng)基包括i)以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h)克連續(xù)加入的碳源，其中h包括在1.1-3.0的范圍內(nèi)；以及ii)以Y×h×f的量連續(xù)加入的氮源，其中f包括在0.002至0.2的范圍內(nèi)。
也需要通過(guò)將這些成分加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)向微生物提供為生物質(zhì)形成所需要的附加成分，例如鹽、礦物質(zhì)和維生素。所加入成分的量應(yīng)為當(dāng)進(jìn)一步加入這些成分時(shí)將對(duì)獲得的生物質(zhì)濃度不具有顯著的影響。
培養(yǎng)方法的設(shè)計(jì)可應(yīng)用許多不同的培養(yǎng)方法設(shè)計(jì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，該培養(yǎng)方法是包括3個(gè)培養(yǎng)步驟的連續(xù)發(fā)酵過(guò)程a)起始的批量生產(chǎn)，然后是b)補(bǔ)料分批生產(chǎn)，然后是c)連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程，其中以恒定的給料量連續(xù)加入培養(yǎng)基，并且其中連續(xù)除去培養(yǎng)肉湯以使得保持總的肉湯重量，因此我們也要求保護(hù)一種在好氣條件下以Yg/l的細(xì)胞干物質(zhì)CDM，于發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是從100-300g/l的范圍，包括在包含以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h)克逐步加入碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物，其中h是從1.1-3.0的范圍，并且滯留期為20-100h，其中連續(xù)發(fā)酵過(guò)程包括3個(gè)培養(yǎng)步驟a)起始的批量生產(chǎn)，然后是b)補(bǔ)料分批(fed batch)生產(chǎn)，然后是c)連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程。
階段a)和b)主要用作一個(gè)目的，即容許生物質(zhì)濃度的水平達(dá)到＞當(dāng)在階段c)中獲得恒定狀態(tài)時(shí)達(dá)到的生物質(zhì)濃度的＞50％，這容許在接近于階段c)中最終獲得的穩(wěn)態(tài)生物質(zhì)濃度的濃度開(kāi)始從階段c)收獲生物質(zhì)。
用于起始的批量階段以及用于補(bǔ)料分批階段的培養(yǎng)基組合物應(yīng)反映這個(gè)目的。
應(yīng)在階段a)的培養(yǎng)基中的碳源耗盡前發(fā)生階段a)至階段b)的轉(zhuǎn)換。
階段b)至階段c)的轉(zhuǎn)換應(yīng)發(fā)生在i)適于達(dá)到上述階段a)和b)的共同(collective)目的的時(shí)間，和ii)依賴于階段b)中使用的飼養(yǎng)培養(yǎng)基中碳和氮源濃度，以及階段a)的批量培養(yǎng)基中碳和氮源濃度的時(shí)間。
應(yīng)理解當(dāng)進(jìn)入恒定狀態(tài)時(shí)，連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程的特性構(gòu)成關(guān)于獲得的生物質(zhì)生產(chǎn)率的全過(guò)程的性狀和所使用的培養(yǎng)基的技術(shù)規(guī)格。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯然連續(xù)發(fā)酵過(guò)程通常使用恒定的培養(yǎng)肉湯滯留期。然而，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也已知變化滯留期可提高連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的總性能并且這種變化在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，因此我們要求保護(hù)下列兩種方法根據(jù)本發(fā)明的方法，其中連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)肉湯的滯留期保持恒定并且是在20-100h的范圍內(nèi)；以及根據(jù)本發(fā)明的方法，其中連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)肉湯的滯留期在20-100h范圍內(nèi)變化。
氮的量也可變化并且應(yīng)相應(yīng)于碳源的量，以使得有機(jī)和無(wú)機(jī)氮的總濃度，Nkonc是Y×h×f。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)海洋微生物時(shí)，有可能獲得可從發(fā)酵罐收獲的CDM形式的生物質(zhì)生產(chǎn)率，其范圍為每升培養(yǎng)基每小時(shí)0.67至15g的細(xì)胞干物質(zhì)，同時(shí)保持脂類(lèi)含量為約0.5g/g生物資源干物質(zhì)，以及同時(shí)保持至少0.20gDHA/l/h的高多烯酸生產(chǎn)率，優(yōu)選至少0.25gDHA/l/h，更優(yōu)選至少0.30gDHA/l/h，最優(yōu)選至少0.35gDHA/l/h。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法可生產(chǎn)濃度為0.20-0.40gDHA/l/h的多烯酸，優(yōu)選濃度為0.25-0.4gDHA/l/h，更優(yōu)選濃度為0.30-0.40gDHA/l/h，最優(yōu)選濃度為0.35-0.40gDHA/l/h。
在一個(gè)實(shí)施方案中在10％以上飽和度的溶解氧水平進(jìn)行本發(fā)明所述的發(fā)酵。然而，根據(jù)WO 01/54510，更低水平進(jìn)行發(fā)酵可能進(jìn)一步增強(qiáng)多烯脂肪酸形成中的生產(chǎn)率。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，當(dāng)發(fā)酵控制的一個(gè)目的是保持溶解氧水平在較低水平時(shí)，使用連續(xù)發(fā)酵過(guò)程相對(duì)于飼養(yǎng)分批發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)是明顯的，因?yàn)樵谶B續(xù)生產(chǎn)過(guò)程中可僅僅通過(guò)調(diào)節(jié)通氣(aeration)和固定水平的振蕩速率獲得這種控制，而在補(bǔ)料分批生產(chǎn)中這種控制必須依賴于發(fā)酵過(guò)程中自始至終進(jìn)行溶解氧的精密測(cè)量。進(jìn)一步地，這種溶解氧的精密測(cè)量可能遭到失敗。
因此，我們也要求保護(hù)一種在好氣條件下以Yg/l的細(xì)胞干物質(zhì)CDM，于發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是從100-300g/l的范圍，包括在包含以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h)克逐步加入碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物，其中h是從1.1-3.0的范圍，并且滯留期為20-100h，其中連續(xù)發(fā)酵過(guò)程包括3個(gè)培養(yǎng)步驟a)起始的批量生產(chǎn)，然后是b)補(bǔ)料分批生產(chǎn)，然后是c)連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程，并且其中保持步驟c)中溶解氧壓力的水平低于10％的飽和度，優(yōu)選低于5％的飽和度，更優(yōu)選低于1％的飽和度。
在一個(gè)實(shí)施方案中在20至35℃范圍的培養(yǎng)溫度，特別為25至30℃的范圍下進(jìn)行本發(fā)明所述的發(fā)酵。
培養(yǎng)基中的pH應(yīng)包括在3.0至9.0的范圍內(nèi)，特別為在5.0至7.5的范圍中。
營(yíng)養(yǎng)缺陷型的海洋微生物本發(fā)明所述的優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的海洋微生物是藻類(lèi)，特別是微藻或藻樣微生物，優(yōu)選Stramenopiles類(lèi)，更優(yōu)選Hamatores sp、Proteromonads sp、Opalines sp.、Developayella sp、Diplophrys sp、Labrinthulids sp、Thraustochytrids sp、Biosecids sp、卵菌(Oomycetes sp)、Hypochytridiomycetessp、Commation sp、Reticulosphaera sp、Pelagomonas sp、Pelagococcus sp、Ollicola sp、Aureococcus sp、Parmales sp、Diatoms sp、Xanthophytes sp、Phaeophytes sp(褐藻)、Eustigmatophytes sp、Raphidophytes sp、Synurids sp、Axodines sp、Chrysomeridales sp、Sarcinochrysidales sp、Hydrurales sp、Hibberdiales sp、或Chromulinales sp的成員。
本發(fā)明所述的特別優(yōu)選的海洋微生物是Thraustochytrids sp，特別是Schizochytrium sp或Thraustochytrium sp。最優(yōu)選的是Schizochytrium sp，特別是S.limacinum sp，優(yōu)選菌株SR21(FERM BP-5034)。
脂類(lèi)含量本發(fā)明的方法可用來(lái)生產(chǎn)多種脂類(lèi)化合物，特別是不飽和的脂類(lèi)，優(yōu)選多不飽和的脂類(lèi)(即，含有至少2個(gè)不飽和碳-碳鍵，例如雙鍵的脂類(lèi))，以及更優(yōu)選高度不飽和的脂類(lèi)(即，含有4個(gè)以上不飽和碳碳鍵的脂類(lèi))，例如ω-3和/或ω-6多聚不飽和脂肪酸，包括二十二碳六烯酸(即，DHA)；和其他天然存在的不飽和、多不飽和和高度不飽和的化合物。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)″脂類(lèi)″包括磷脂；游離脂肪酸；脂肪酸的酯類(lèi)；三甘油酯；甾醇和固醇酯；類(lèi)胡蘿卜素；葉黃素(例如，氧化類(lèi)胡蘿卜素)；碳?xì)浠衔铮划愇於╊?lèi)衍生的化合物和其他本領(lǐng)域已知的脂類(lèi)。特別地本發(fā)明的方法在生產(chǎn)多烯酸中很有用。
由本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的細(xì)胞干物質(zhì)中的脂類(lèi)含量是可通過(guò)氯仿∶甲醇混合物提取的成分，并且構(gòu)成所生產(chǎn)生物質(zhì)的至少40％，優(yōu)選所生產(chǎn)生物質(zhì)的至少45％，更優(yōu)選所生產(chǎn)生物質(zhì)的50％，甚至優(yōu)選所生產(chǎn)生物質(zhì)的至少55％。在一個(gè)實(shí)施方案中氯仿∶甲醇比率是2∶1(v/v)，優(yōu)選在一個(gè)實(shí)施方案中氯仿∶甲醇比率是2∶1(v/v)，0.1％丁基羥基甲苯。
某些海洋微生物，類(lèi)似的例如，Thraustochytrids sp.，生產(chǎn)合乎需要的長(zhǎng)鏈多聚不飽和脂肪酸(LC PUFA)，如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。
同樣富集LC PUFA′s的人類(lèi)飲食的臨床效果已經(jīng)得到廣泛地證明。特別感興趣的LC PUFA′s是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。然而，關(guān)于成年人飲食中EPA∶DHA的最佳比率還沒(méi)有達(dá)到一致，并且進(jìn)一步地，Thraustochytrids sp.生產(chǎn)生物質(zhì)、脂類(lèi)和LC PUFA′s的高效能力不必與一個(gè)菌株中產(chǎn)生EPA∶DHA最佳比率的能力相結(jié)合。
因此，改進(jìn)Thraustochytrids種屬的生物質(zhì)、脂類(lèi)和LC PUFA生產(chǎn)率和/或與本發(fā)明的應(yīng)用相結(jié)合而產(chǎn)生的EPA∶DHA比率的特性方面可能是極為有益的。
實(shí)施例實(shí)施例1Schizochytrium limacinum，SR21(FERM BP-5034)的深低溫保藏將來(lái)源于″國(guó)立生命科學(xué)和人類(lèi)技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)技術(shù)辦事處，日本″(″National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Japan″)，在瓊脂上培養(yǎng)保藏的培養(yǎng)物通過(guò)使瓊脂上的細(xì)胞懸浮在″1/2TM″中(如下所述)來(lái)轉(zhuǎn)入搖瓶。使搖瓶(具有100ml培養(yǎng)基″OMEPRK_A″(如下所述)+10ml懸浮細(xì)胞的500ml錐形瓶)于28℃和150rpm，在Unitron，Infors AG恒溫控制的旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)25h。向搖瓶加入25ml加熱消毒的甘油。在室溫下培養(yǎng)40min后取1ml等分轉(zhuǎn)入低溫試管。
通過(guò)在flamingo-box(20×20cm w/4cm flamingo壁、蓋和底)中孵育低溫試管，使低溫試管(40pc.)在-20℃緩慢冷凍24h，然后將低溫試管(cryotube)轉(zhuǎn)移至-80℃冷凍。
在-80℃保存低溫試管備用。
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基″OmePRK_A″Tropic Marin(Article 10135) 16.7gKH2PO4 5g酪蛋白氨基酸，無(wú)維生素 3g″MikroPM″(如下所述)20ml″VitapM″(如下所述) 20ml-全部混合。
用NaOH/HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。
用自來(lái)水調(diào)節(jié)體積至900ml。
在121℃加熱殺菌20min。
最后加入100ml，其含33gGlucose·1H2O，其已在0.25微米濾器中無(wú)菌過(guò)濾。
將100ml無(wú)菌轉(zhuǎn)入空的、加熱消毒的500ml錐形搖瓶。
″1/2TM″Tropic Marin 16.7g/l溶解于自來(lái)水中。
在121℃加熱殺菌20min。
″MikroPM″MnSO4·1H2O 0.98gFeSO4·7H2O 3.93gCuSO4·5H2O 0.39gZnCl2 0.39g檸檬酸 19.6g-全部混合，用去離子化的水調(diào)節(jié)體積至1.01。
″VitapM″硫胺素-二氯化物 2.28g核黃素 0.19g煙酸 1.53g鈣D-泛酸(Panthothenat) 1.9g吡哆醛HCl0.38gD-生物素 0.075g葉酸 0.19g-全部混合，用去離子化的水調(diào)節(jié)體積至1.01。
實(shí)施例2Schizochytrium limacinum菌株SR21的生長(zhǎng)將在室溫下融解的來(lái)自1個(gè)低溫試管的細(xì)胞轉(zhuǎn)入包含在40ml的圓柱形玻璃杯中的10ml″OmePRK_A″培養(yǎng)基中，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，并且在28℃和150RPM培養(yǎng)24h(Unitron，Enfors AG)。
將如此產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯轉(zhuǎn)入包含在500ml錐形搖瓶中的100ml″OmePRK_A″培養(yǎng)基中，在28℃和150RPM無(wú)菌培養(yǎng)24h(Unitron，Enfors AG)。
將如此產(chǎn)生的90ml培養(yǎng)肉湯用于接種發(fā)酵罐。
實(shí)施例3在30-35h的肉湯滯留期連續(xù)培養(yǎng)SR21菌株使用21的Porton型玻璃/不銹鋼發(fā)酵罐。
容許菌株在1.01培養(yǎng)基″OME8″上生長(zhǎng)20h，其中保持-通過(guò)加入NaOH/H3PO4控制pH在6.0-7.0的范圍中-溫度在28℃-以300rpm線性增加到400rpm振蕩-以1.0l/min通氣(aeration)-溶解氧壓力在飽和度的10％以上在20.1h用培養(yǎng)基″OME8a″(如下所述)以0.057g/min引發(fā)培養(yǎng)物的補(bǔ)料分批喂養(yǎng)。保持給料速度直到100h。
從20至80h，使振蕩從400rpm線性增加至500rpm；其它的工藝參數(shù)維持先前的設(shè)定值。
在100h，通過(guò)改變飼養(yǎng)培養(yǎng)基為″OME17b″(如下所述)，增加給料速度至0.5g/min以及保持總的培養(yǎng)肉湯重量為1000g執(zhí)行連續(xù)培養(yǎng)模式，其中容許通過(guò)泵送從發(fā)酵罐移出培養(yǎng)肉湯。
進(jìn)一步地，在100h使振蕩速率增加至800rpm。通過(guò)人工加入葡萄核油控制泡沫。
根據(jù)OD測(cè)量值(650nm，1cm比色杯，測(cè)量前在去離子化的水中400倍稀釋肉湯)以及從培養(yǎng)物的呼吸能力(通過(guò)來(lái)自Innovo Air Tech.Instruments的1313發(fā)酵監(jiān)測(cè)器測(cè)量廢氣中的％O2)判斷，在～160h獲得穩(wěn)定狀態(tài)。
在190h，取出50ml樣品，在Heraus Labofuge Ae中500rpm室溫離心10min；用～35ml″1/2TM″輕輕洗滌如此產(chǎn)生的沉淀顆粒，重復(fù)離心，在-80℃冷凍如此產(chǎn)生的沉淀顆粒，然后在來(lái)自Heto Lab Equipment的HetosiccCD52-1冰凍干燥器上冷凍干燥。
因此確定104.1g/l的懸浮固體物質(zhì)干重濃度。
因?yàn)樗械呐囵B(yǎng)基由可溶成分唯一組成，把這個(gè)數(shù)字作為細(xì)胞干重濃度。
利用來(lái)自ACCU-CHEK的″Keto-diabur-test 5000″條結(jié)合適當(dāng)稀釋的樣品確定，從25h開(kāi)始?xì)堄嗥咸烟菨舛仁牵迹?g/l。
在本實(shí)施例中Y＝104.1g/l，h＝1.24，以及f＝0.021。
″OME8″Tropic Marin 16.7gKH2PO4 5g
酪蛋白氨基酸，無(wú)維生素 3g(NH4)2SO4 0.5g″MikroPM″20g″VitaPM″ 20g-全部混合，用NaOH/H3PO4調(diào)節(jié)pH至6.5，并且將體積調(diào)節(jié)至700ml。
在121℃與包含在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基一起加熱殺菌這種培養(yǎng)基40分鐘。加熱殺菌并冷卻至40℃以下后，將自來(lái)水中的33g葡萄糖·1H2Ow/在121℃單獨(dú)加熱殺菌40分鐘前，調(diào)節(jié)體積至300ml加入發(fā)酵罐/培養(yǎng)基如此產(chǎn)生″OME8″，準(zhǔn)備pH-在發(fā)酵罐中調(diào)節(jié)至6.5然后接種。自始至終使用自來(lái)水。
″OME8a″所有的成分表示為g/l。
在用NaOH/H3PO4調(diào)節(jié)pH至5.0后，所有的成分-除了葡萄糖外-以最終培養(yǎng)基體積的40％v/v于121℃一起加熱消毒40分鐘。
以最終培養(yǎng)基體積的60％v/v單獨(dú)加熱消毒葡萄糖，然后在冷卻到40℃以下后加入另一個(gè)成分。
自始至終使用自來(lái)水。
Tropic Marin 16.7g/lKH2PO4 5g/l″MikroPM″20g/l″VitaPM″ 20g/l酪蛋白氨基酸，無(wú)維生素 45g/l(NH4)2SO4 7.5g/l葡萄糖·1H2O 495g/l″OME17b″所有成分表示為g/l。
在用NaOH/H3PO4調(diào)節(jié)pH至5.0后，所有成分-除了葡萄糖外-以最終培養(yǎng)基體積的40％v/v在121℃一起加熱消毒40min。
以最終培養(yǎng)基體積的60％v/v單獨(dú)加熱消毒葡萄糖，然后在冷卻到至40℃以下后加入另一個(gè)成分。
自始至終使用自來(lái)水。
Tropic Marin 16.7g/lKH2PO45g/l″MikroPM″ 20g/l″VitaPM″ 20g/l酪蛋白氨基酸，無(wú)維生素 12.94g/l(NH4)2SO42.15g/l葡萄糖·1H2O142.3g/l實(shí)施例4在60-70h的肉湯滯留期連續(xù)培養(yǎng)SR21菌株如實(shí)施例3中所描述的用下列改良法進(jìn)行這種培養(yǎng)當(dāng)在100h執(zhí)行連續(xù)培養(yǎng)模式時(shí)，設(shè)置供液速率為0.25g/min。
進(jìn)一步地，在190h將飼養(yǎng)培養(yǎng)基從″OME17b″改變?yōu)椤錙ME17c″(如下所述)。
在285h、350h、450h和500h，如實(shí)施例3所描述的測(cè)定細(xì)胞干重濃度分別為188.6；152.54；189.07和182.75g/l。振蕩和通氣率從最初的在100h 800rpm和11/min減小到在～400h，550rpm和0.75l/min。
如實(shí)施例3中所描述的測(cè)定-從25h開(kāi)始?xì)堄嗥咸烟鞘牵迹?g/l。
″OME17c所有的成分表示為g/l。
在用NaOH/H3PO4調(diào)節(jié)pH至5.0后，所有的成分-除了葡萄糖外-以最終培養(yǎng)基體積的40％v/v于121℃一起加熱消毒40分鐘。
以最終培養(yǎng)基體積的60％v/v單獨(dú)加熱消毒葡萄糖，然后在冷卻到至40℃以下后加入另一個(gè)成分。
自始至終使用自來(lái)水。
Tropic Marin16.7g/lKH2PO410g/l″MikroPM″ 40g/l″VitaPM″ 40g/l酪蛋白氨基酸，無(wú)維生素 25.88g/l(NH4)2SO44.3g/l葡萄糖·1H2O 284.6g/l從上可知在285h，Y＝189g/l；h＝1.37以及f＝0.021；
在350h，Y＝153g/l；h＝1.70以及f＝0.021；在450h，Y＝189g/l；h＝1.37以及f＝0.021，在500h，Y＝183g/l；h＝1.42以及f＝0.021。
應(yīng)當(dāng)注意細(xì)胞生產(chǎn)率內(nèi)的變化令人驚訝地是很小的(當(dāng)h恒定時(shí)，如在285h和450h的結(jié)果所分別說(shuō)明的，Y也幾乎是恒定的)。
實(shí)施例5來(lái)自高細(xì)胞密度連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞干物質(zhì)中的脂類(lèi)含量。
將從通過(guò)冷凍干燥洗滌過(guò)的50ml肉湯樣品所收獲的物質(zhì)重懸浮在～40ml″1/2TM″中。從重懸浮液用氯仿∶甲醇(2∶1v/v，0.1％w/v丁基羥基甲苯(BHT))提取脂類(lèi)，并且在蒸發(fā)所有的氯仿∶甲醇后測(cè)定提取的脂類(lèi)的量。將如此回收的脂類(lèi)儲(chǔ)存在-80℃，然后在40℃經(jīng)受甲基化并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的HPLC方法分析DHA。
因此通過(guò)這些方法可確定細(xì)胞干物質(zhì)中的脂類(lèi)含量和多烯酸生產(chǎn)率。
在實(shí)施例3描述的發(fā)酵中(滯留期～30-35h)，在190h細(xì)胞干物質(zhì)中脂類(lèi)含量測(cè)定為(＞＝)47.5％w/w。
在實(shí)施例4描述的發(fā)酵中(滯留期～60-70h)，在350h(在減小振蕩/通氣前)細(xì)胞干物質(zhì)中脂類(lèi)含量測(cè)定為(＞＝)60.1％w/w，并且多烯酸含量為21(總脂肪酸的％DHA)。
在實(shí)施例4描述的發(fā)酵中(滯留期～60-70h)，在450h(在減小振蕩/曝氣后)細(xì)胞干物質(zhì)中脂類(lèi)含量測(cè)定為(＞＝)56.4％w/w，并且多烯酸含量為23(總脂肪酸的％DHA)。
在實(shí)施例4描述的發(fā)酵中(滯留期～60-70h)，在500h細(xì)胞干物質(zhì)中脂類(lèi)含量測(cè)定為(＞＝)48.2％w/w，并且多烯酸含量為25(總脂肪酸的％DHA)。
在實(shí)施例4描述的發(fā)酵中(滯留期～60-70h)，在350h、450h和500h，多烯酸生產(chǎn)率分別是0.30、0.38和0.34gDHA/l/h。
應(yīng)當(dāng)注意DHA的生產(chǎn)率內(nèi)的變化令人驚訝地是很小的。
總之實(shí)施例4顯示有可能利用本發(fā)明的方法在60-70的滯留期產(chǎn)生高細(xì)胞濃度和高DHA濃度。
權(quán)利要求
1.一種在好氣條件下以Yg/l的細(xì)胞干物質(zhì)CDM，于發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物的方法，其中Y是從100-300g/l的范圍，包括在包含以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h)克逐步加入的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物，其中h是從1.1-3.0的范圍，并且滯留期為20-100h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基包括以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h×f)克逐步加入的氮源，其中f是從0.002至0.2的范圍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該培養(yǎng)基包括為生物質(zhì)形成所需要的、以不限制獲得的生物質(zhì)濃度的數(shù)量逐步加入的鹽、礦物質(zhì)和任選維生素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中h是從1.1-2.5的范圍，特別是從1.2-2.0的范圍。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任何的方法，其中f是從0.004至0.1的范圍，特別是從0.01至0.04的范圍。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中營(yíng)養(yǎng)缺陷型的海洋微生物是藻類(lèi)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中營(yíng)養(yǎng)缺陷型的海洋微生物是Thraustochytrids sp。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中Thraustochytrids sp.選自Schizochytrium或Thraustochytrium。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中培養(yǎng)溫度是從20-35℃。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中培養(yǎng)基的pH是在3.0-9.0的范圍。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中所產(chǎn)生的生物質(zhì)的至少40％由可通過(guò)氯仿∶甲醇混合物萃取的成分組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中氯仿和甲醇以2∶1(v/v)的比率混合。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中獲得至少0.2g DHA/l/h的多烯酸生產(chǎn)率。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)肉湯的滯留期保持恒定并且是在20-100h的范圍內(nèi)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何的方法，其中連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)肉湯的滯留期是在20-100h的范圍內(nèi)變化的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中連續(xù)培養(yǎng)包括下列3個(gè)培養(yǎng)步驟a)起始的批量生產(chǎn)過(guò)程，然后是b)補(bǔ)料分批生產(chǎn)過(guò)程，然后是c)連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中從步驟c)開(kāi)始溶解氧的水平保持在10％的飽和度以下。
全文摘要
本發(fā)明提供在好氣條件下以Yg/l的細(xì)胞干物質(zhì)CDM，于發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物的優(yōu)化方法，其中Y是從100－300g/l的范圍，包括在包含以每升培養(yǎng)肉湯適量(Y×h)克逐步加入的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型海洋微生物，其中h是1.1－3.0的范圍，并且滯留期為20－100h。該方法保持高產(chǎn)量的細(xì)胞脂類(lèi)，特別是多烯酸。
文檔編號(hào)C12P7/64GK1845986SQ200480025011
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月1日
發(fā)明者莫根斯·沃姆佩爾曼 申請(qǐng)人:諾維信公司