專利名稱：用于黑素瘤的多抗原載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療癌癥的多抗原載體。尤其是，本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防黑素瘤的多抗原載體。
背景技術(shù)：
在幾種技術(shù)如高密度微陣列、SEREX、免疫組織化學(xué)(IHC)、RT-PCR、原位雜交(ISH)和激光捕獲顯微鏡檢查(laser capturemicroscopy)(Rosenberg，Immunity，1999；Sgroi et al，1999，Schenaet al，1995，Offringa et al，2000)的幫助下，由于基于原發(fā)腫瘤和正常細(xì)胞的表達(dá)譜鑒定分子的巨大進(jìn)步，最近幾年含腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的癌癥疫苗的發(fā)展已有巨大增加。TAAs是由腫瘤細(xì)胞表達(dá)或過表達(dá)的抗原并且對(duì)一種或幾種腫瘤可以是特異性的，例如CEA抗原在結(jié)腸直腸、乳房和肺癌中表達(dá)。Sgroi et al(1999)采用激光捕獲顯微解剖和cDNA微陣列的聯(lián)合使用鑒定了在侵犯性和轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中差異表達(dá)的幾個(gè)基因。幾種遞送系統(tǒng)，象DNA或病毒可以用于抗人癌癥的治療性接種(Bonnet et al，2000)并且可以引發(fā)免疫反應(yīng)以及切斷針對(duì)TAAs的免疫耐受性。通過插入編碼T細(xì)胞共刺激分子如B7.1或細(xì)胞因子例如IFN-γ、IL2或GM-CSF等的轉(zhuǎn)基因，腫瘤細(xì)胞可以變得具有更高的免疫原性。TAA和細(xì)胞因子或共刺激分子的共表達(dá)可以開發(fā)有效的治療疫苗(Hodge et al，95，Bronte et al，1995，Chamberlain etal，1996)。
本領(lǐng)域需要對(duì)刺激免疫反應(yīng)以預(yù)防或治療癌癥有用的試劑和方法。本發(fā)明提供了克服別人試圖治療癌癥中所遭遇的許多困難的這種試劑和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于給患者施用以預(yù)防和/或治療癌癥的多抗原載體。尤其是，多抗原載體編碼一個(gè)或多個(gè)腫瘤抗原(“TA”)。多抗原載體還可以編碼免疫刺激物，如共刺激分子和/或與佐劑一起給予。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.質(zhì)粒pALVAC.Tricom(#33)和pT1132的圖。
圖2.質(zhì)粒pALVAC.Tricom(#33)的DNA序列。
圖3.質(zhì)粒pT1132的DNA序列。
圖4.質(zhì)粒pT3217的圖。
圖5.質(zhì)粒pT3217的DNA序列。
圖6.示例的NY-ESO-1、TRP-2、gp100、gp100M、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、B7.1、LFA-3和ICAM-1蛋白的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了對(duì)治療和/或預(yù)防癌癥有用的試劑和方法。本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)引入作為參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗一個(gè)或多個(gè)腫瘤抗原(“TA”)的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)或增強(qiáng)，以預(yù)防和/或治療癌癥。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)TAs可以被組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，給予編碼腫瘤抗原的核酸載體或例如肽或多肽形式的腫瘤抗原本身后，TA在宿主細(xì)胞中的表達(dá)引起免疫反應(yīng)。
在此使用的“抗原”是在已經(jīng)給予抗原的宿主中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的分子(如多肽)或其一部分。免疫反應(yīng)可以包括與抗原的至少一個(gè)表位結(jié)合的抗體的產(chǎn)生和/或針對(duì)表達(dá)該抗原的表位的細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。該反應(yīng)可以是目前免疫反應(yīng)的增強(qiáng)，通過例如引起抗體產(chǎn)生增加、與抗原親和力增加的抗體的產(chǎn)生增加或細(xì)胞免疫反應(yīng)增加(即免疫活性T細(xì)胞數(shù)量或活性增加)。產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原可以被認(rèn)為是具有免疫原性的或免疫原。在描述本發(fā)明時(shí)，TA可以被稱為“免疫原性靶”。本發(fā)明提供了在宿主中表達(dá)一個(gè)或多個(gè)免疫原性靶的表達(dá)載體。
術(shù)語TA包括腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)和腫瘤特異性抗原(TSAs)，其中癌細(xì)胞是抗原的來源。TAA是在腫瘤細(xì)胞表面上以高于正常細(xì)胞上觀察到的量表達(dá)的抗原或在胎兒發(fā)育過程中在正常細(xì)胞上表達(dá)的抗原。TSA是對(duì)腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的和在正常細(xì)胞上不表達(dá)的抗原。TA進(jìn)一步包括TAAs或TSAs、其抗原性片段和保持它們的抗原性的修飾形式。
依照TAs的表達(dá)模式、功能或遺傳來源，它們典型地被分為五類睪丸癌(CT)抗原(即MAGE、NY-ESO-1)；黑素細(xì)胞分化抗原(即MelanA/MART-1、酪氨酸酶、gp100)；突變抗原(即MUM-1、p53、CDK-4)；過表達(dá)“自身”抗原(即HER-2/neu、p53)；和病毒抗原(即HPV、EBV)。為實(shí)施本發(fā)明的目的，合適的TA是誘導(dǎo)或增強(qiáng)已經(jīng)給予TA的宿主中的抗腫瘤免疫反應(yīng)的任何TA。合適的TAs包括例如各種gp100(Coxet al.，Science，264716-719(1994)；美國(guó)專利6,500,919 B1和WO01/30847，第162位殘基是Val，也稱為“gp100M”；美國(guó)專利6,537,560B1，第162位殘基是Phe)、MART-1/Melan A(Kawakami etal.，J.Exp.Med.，180347-352(1994)；美國(guó)專利5,874,560)、gp75(TRP-1)(Wang et al.，J.Exp.Med.，1861131-1140(1996))、TRP-2(Wang et al.1996 J.Exp.Med.1842207；美國(guó)專利5,831,016和6,083,783)、酪氨酸酶(Wolfel et al.，Eur.J Immunol.，24759-764(1994)；WO 200175117；WO 200175016；WO 200175007)、NY-ESO-1(WO 98/14464；WO 99/18206；GenBank登錄號(hào)P78358；美國(guó)專利5,804,381)、黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom et al.，J.Immunol.，1301467-1472(1983))、MAGE家族抗原(即MAGE-1、2、3、4、6、12、51；Van der Bruggen et al.，Science，2541643-1647(1991)；美國(guó)專利6,235,525；CN 1319611)、BAGE家族抗原(Boel et al.，Immunity，2167-175(1995))、GAGE家族抗原(即GAGE-1，2；Van den Eynde etal.，J.Exp.Med.，182689-698(1995)；美國(guó)專利6,013,765)、RAGE家族抗原(即RAGE-1；Gaugler et at.，Immunogenetics，44323-330(1996)；美國(guó)專利5,939,526)、N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶-V(Guilloux etat.，J.Exp.Med.，1831173-1183(1996))、p15(Robbins et al.，J.Immunol.1545944-5950(1995))、β-連環(huán)蛋白(Robbins et al.，J.Exp.Med.，1831185-1192(1996))、MUM-1(Coulie et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980(1995))、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-4(CDK4)(Wolfel et al.，Science，2691281-1284(1995))、p21-ras(Fossum et at.，Int.J.Cancer，5640-45(1994))、BCR-abl(Bocchia et al.，Blood，852680-2684(1995))、p53(Theobald et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9211993-11997(1995))、p185 HER2/neu(erb-B1；Fisk et al.，J.Exp.Med.，1812109-2117(1995))、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)(Harris et al.，Breast Cancer Res.Treat，291-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong et al.，J Natl.Cancer Inst.，85982-990(1995)美國(guó)專利5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710和EP 784483)；癌相關(guān)突變粘蛋白(即MUC-1基因產(chǎn)物；Jerome et al.，J.Immunol.，1511654-1662(1993))；EBV的EBNA基因產(chǎn)物(即EBNA-1；Rickinson et al.，Cancer Surveys，1353-80(1992))；人乳頭瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing et al.，J.Immunol.1545934-5943(1995))；前列腺特異性抗原(PSA；Xue et al.，The Prostate，3073-78(1997))；前列腺特異性膜抗原(PSMA；israeli etal.，Cancer Res.，541807-1811(1994))；獨(dú)特型表位或抗原，例如免疫球蛋白獨(dú)特型或T細(xì)胞受體獨(dú)特型(Chen et al.，J.Immunol.，1534775-4787(1994))；KSA(美國(guó)專利5,348,887)、驅(qū)動(dòng)蛋白2(Dietz，et al.Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7275(3)731-8)、HIP-55、TGFβ-1抗調(diào)亡因子(Toomey，et al.Br J Biomed Sci 2001；58(3)177-83)、腫瘤蛋白D52(Bryne J.A.et al.，Genomics，35523-532(1996))、HIFT、NY-BR-1(WO 01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87、NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic andBioinformatic Approaches to the Identification of Human TumorAntigens，in Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，NewYork，NY)，包括“野生型”(即由基因組正常編碼的、天然存在的)、其修飾和突變形式，以及其它片段和衍生物。任何這些TAs可以單獨(dú)使用或在共免疫方案中一個(gè)與另一個(gè)聯(lián)合使用。
優(yōu)選的TAs對(duì)誘導(dǎo)抗黑素瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)有用。術(shù)語“黑素瘤”包括但不限于例如黑素瘤、轉(zhuǎn)移性黑素瘤、由黑素細(xì)胞或黑素細(xì)胞相關(guān)痣細(xì)胞衍生的黑素瘤、黑素癌、黑素上皮瘤、黑素肉瘤、原位黑素瘤、淺表蔓延性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、惡性小痣黑素瘤、肢端小痣黑素瘤、侵犯性黑素瘤和家族非典型痣和黑素瘤(FAM-M)綜合癥。通常，黑素瘤由例如染色體畸形、退形性生長(zhǎng)和發(fā)育紊亂、促有絲分裂劑、紫外線輻射(UV)、病毒感染、基因的不適當(dāng)組織表達(dá)、基因表達(dá)改變或致癌物質(zhì)引起。
在某些情況下，用TA和其它抗原如血管生成相關(guān)抗原(“AA”)共免疫患者可能有益。AA是與涉及在血管誘導(dǎo)和/或再發(fā)育中的細(xì)胞相關(guān)的免疫原性分子(即肽、多肽)。例如，AA可以在內(nèi)皮細(xì)胞(“EC”)上表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞是血管的主要結(jié)構(gòu)成分。在癌癥的情況下，優(yōu)選在提供腫瘤的血管內(nèi)或附近找到AA。優(yōu)選患者的抗AA免疫產(chǎn)生抗AA免疫反應(yīng)，借此預(yù)防和/或抑制腫瘤附近或內(nèi)部發(fā)生的血管生成過程。示例的AAs包括例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(即VEGF；Bernardini，et al.J.Urol.，2001，166(4)1275-9；Starnes，et al.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.；2001，122(3)518-23；Dias，et al.Blood，2002，992179-2184)、VEGF受體(即VEGF-R、flk-1/KDR；Starnes，et al.J.Thorac.Cardiovasc.Surg，2001，122(3)518-23)、EPH受體(即EPHA2；Gerety，et al.1999，Cell，4403-414)、表皮生長(zhǎng)因子受體(即EGFR；Ciardeillo，et al.Clin.Cancer Res.，2001，7(10)2958-70)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(即bFGF；Davidson，et al.Clin.Exp.Metastasis2000，18(6)501-7；Poon，et al.Am J.Surg.，2001，182(3)298-304)、血小板衍生細(xì)胞生長(zhǎng)因子{即PDGF-B)、血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF；Hong，et al.J.Mol.Med.，2001，8(2)141-8)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(即，TGF-α；Hong，et al.J.Mol.Med.，2001，8(2)141-8)、endoglin(Balza，et al.Int.J.Cancer，2001，94579-585)、Id蛋白(Benezra，R.Trends Cardiovasc.Med.，2001，11(6)237-41)、蛋白酶如uPA、uPAR和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9；Djonov，et al.J.Pathol.，2001，195(2)147-55)、一氧化氮合酶(Am.J.Ophthalmol.，2001，132(4)551-6)、氨肽酶(Rouslhati，E.NatureCancer，284-90，2002)、血小板反應(yīng)蛋白(即TSP-1、TSP-2；Alvarez，et al.Gynecol.Oncol.，2001，82(2)273-8；Seki，et al.Int.J.Oncol.，2001，19(2)305-10)、k-ras(Zhang，et al.Cancer Res.，2001，61(16)6050-4)、Wnt(Zhang，et al.Cancer Res.，2001，61(16)6050-4)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs；Drug Resist.Updat.2000，3(2)83-88)、微管(Timar，et al.2001.Path.Oncol.Res.，7(2)85-94)、熱休克蛋白(即HSP90(Timar，上述))、肝素結(jié)合因子(即肝素酶；Gohji，et al.Int.J.Cancer，2001，95(5)295-301)、合酶(即ATP合酶、thymidilate合酶)、膠原受體、整聯(lián)蛋白(即αvβ3、αvβ5、α1β1、α2β1、α5β1)、表面蛋白聚糖NG2、AAC2-1或AAC2-2等，其中包括“野生型”(即由基因組正常編碼的、天然存在的)，其修飾、突變形式，以及其它片段和衍生物。在實(shí)施本發(fā)明中，這些靶中的任何一種可能都合適，單獨(dú)或彼此聯(lián)合或與其它試劑聯(lián)合。
核酸分子可以包含編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原性靶的核苷酸序列或其片段或衍生物，或由它們組成，如ATCC保藏物中DNA插入物中含有的序列。術(shù)語“核酸序列”或“核酸分子”是指DNA或RNA序列。該術(shù)語包括由DNA和RNA的任何已知堿基類似物形成的分子，例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮雜環(huán)丙烯基-胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異-戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤等。
分離的核酸分子是(1)當(dāng)總核酸分離自來源細(xì)胞時(shí)，與至少大約50％的自然情況下與其一起找到的蛋白、脂類、碳水化合物或其它物質(zhì)相分離的核酸分子；(2)不與自然情況下該核酸分子所連接的多核苷酸的全部或部分連接的核酸分子；(3)與自然情況下不與之連接的多核苷酸可操作連接的核酸分子；(4)自然情況下不作為更大的多核苷酸序列的一部分存在的核酸分子。優(yōu)選，本發(fā)明的分離的核酸分子基本上不含任何其它污染核酸分子或在其自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的將干擾所述核酸分子在多肽制備中的用途或它的治療、診斷、預(yù)防或研究用途的其它污染物。在此使用的術(shù)語“天然存在的(naturally occuring)”或“天然的(native)”或“天然發(fā)現(xiàn)的”，當(dāng)與生物材料如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等相關(guān)使用時(shí)，是指自然情況下發(fā)現(xiàn)的和未被人們操作的物質(zhì)。類似地，在此使用的“非天然存在的”或“非天然的”是指不是自然情況下發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)或已被人們進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或合成的物質(zhì)。
兩個(gè)或更多核酸或氨基酸序列的同一性(identity)通過比較序列來確定。如本領(lǐng)域已知，“同一性”是通過組成該分子的單位(即核苷酸或氨基酸殘基)之間的配對(duì)確定的核酸或氨基酸序列之間序列相關(guān)的程度。同一性測(cè)定兩個(gè)或更多序列的較小序列之間相同配對(duì)的百分比，其中缺口比對(duì)(如果有的話)是通過特定數(shù)學(xué)模式或計(jì)算機(jī)程序(即算法)得到的。核酸序列之間的同一性還可以通過核酸序列彼此雜交的能力來確定。在限定雜交方法中，術(shù)語“高度嚴(yán)格條件”和“中等嚴(yán)格條件”是指允許序列互補(bǔ)的核酸鏈雜交，并排除顯著錯(cuò)配核酸的雜交的條件。對(duì)于雜交和洗滌的“高度嚴(yán)格條件”的實(shí)例是在65-68℃，0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉或在42℃，0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉和50％甲酰胺。(參見例如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)；Anderson et al.，Nucleic AcidHybridisationA Practical Approach Ch.4(IRL Press Limited))。術(shù)語“中等嚴(yán)格條件”是指能夠形成比在“高度嚴(yán)格條件”下可能發(fā)生的堿基對(duì)錯(cuò)配程度更大的DNA雙螺旋的條件。示例的中等嚴(yán)格條件是在50-65℃，0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉或在37-50℃，0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉和20％甲酰胺。舉例來說，在50℃，0.015M鈉離子中的中等嚴(yán)格條件將允許大約21％的錯(cuò)配。雜交過程中，為了降低非特異性和/或背景雜交的目的，雜交和洗滌緩沖液中可以包括其它試劑。實(shí)例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％焦磷酸鈉、0.1％十二烷基硫酸鈉、NaDodSO4、(SDS)、ficoll、Denhardt′s溶液、超聲處理的鮭精DNA(或另一非互補(bǔ)的DNA)和葡聚糖硫酸酯，盡管還可以使用其它合適的試劑。這些添加劑的濃度和類型可以改變，而基本上不影響雜交條件的嚴(yán)格性。雜交實(shí)驗(yàn)通常在pH6.8-7.4進(jìn)行；然而，在典型的離子強(qiáng)度條件下，雜交速度幾乎與pH無關(guān)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，載體用于將編碼免疫原性靶的核酸序列轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。載體是用于將核酸序列轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的任何分子。在某些情況下，利用表達(dá)載體。表達(dá)載體是適于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并且含有指導(dǎo)和/或控制所轉(zhuǎn)移核酸序列的表達(dá)的核酸序列的核酸分子。表達(dá)包括但不限于多種過程，如轉(zhuǎn)錄、翻譯，和剪接，如果存在內(nèi)含子的話。表達(dá)載體典型地包含與編碼多肽的異源核酸序列可操作連接的一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼序列。側(cè)翼序列可以是例如同源的(即來自與宿主細(xì)胞相同的物種和/或菌株)、異源的(即來自宿主細(xì)胞物種或菌株之外的物種)、雜種的(即來自一個(gè)以上來源的側(cè)翼序列的組合)，或合成的。
優(yōu)選側(cè)翼序列能夠?qū)崿F(xiàn)(effect)編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯并且與編碼序列可操作連接。在此使用的術(shù)語可操作連接是指多核苷酸元件以功能性關(guān)系的連接。例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作連接，如果它影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄的話。然而，側(cè)翼序列無須必然鄰近編碼序列，只要它正確發(fā)揮功能即可。因此，例如，插入的不被翻譯但被轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間，啟動(dòng)子序列仍然可以被認(rèn)為與編碼序列可操作連接。類似地，增強(qiáng)子序列可以位于編碼序列上游或下游并且影響該序列的轉(zhuǎn)錄。
在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選側(cè)翼序列是驅(qū)動(dòng)靶細(xì)胞中高水平基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以包含例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、阻遏物元件(repressor element)或其組合。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以是組成型的、組織特異性的、細(xì)胞類型特異性的(即與另一種組織或細(xì)胞類型相比，該區(qū)域驅(qū)動(dòng)在一種組織或細(xì)胞類型中的更高水平轉(zhuǎn)錄)或可調(diào)節(jié)的(即對(duì)與化合物如四環(huán)素的相互作用有反應(yīng)性)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的來源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物或任何植物，條件是該側(cè)翼序列通過引起細(xì)胞內(nèi)核酸轉(zhuǎn)錄而在細(xì)胞中行使功能。在實(shí)施本發(fā)明中可以利用各式各樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。
合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)包括CMV啟動(dòng)子(即CMV立早(immediateearly)啟動(dòng)子)；來自真核基因(即雌激素誘導(dǎo)型雞卵清蛋白基因、干擾素基因、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因和胸苷激酶基因)的啟動(dòng)子；和主要早期和晚期腺病毒基因啟動(dòng)子；SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290304-10)；魯斯氏肉瘤病毒(RSV)的3’長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)中含有的啟動(dòng)子(Yamamoto，et al.，1980，Cell 22787-97)；單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動(dòng)子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781444-45)；金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)；原核表達(dá)載體如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc.Acad.Sci.U.S.A.753727-31)；或tac啟動(dòng)子(DeBoer et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。組織和/或細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括例如在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶1基因控制區(qū)(Swift et al.，1984，Cell 38639-46；Omitz et al.，1986，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；在胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，Nature 315115-22)；在淋巴樣細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-58；Adameset al.，1985，Nature 318533-38；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睪丸、乳腺、淋巴樣和肥大細(xì)胞中的小鼠乳房瘤病毒控制區(qū)(Leder et al.，1986，Cell 45485-95)；肝臟中的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-76)；肝臟中的α-feto-protein基因控制區(qū)(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer et al.，1987，Science 23553-58)；肝臟中的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-71)；髓樣細(xì)胞中的β-珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram et al.，1985，Nature 315338-40；Kollias et al.，1986，Cell 4689-94)；腦中少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead et al.，1987，Cell 48703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)(Sani，1985，Nature 314283-86)；下丘腦中的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(Mason et al.，1986，Science 2341372-78)，和黑素瘤細(xì)胞中的酪氨酸酶啟動(dòng)子(Hart，I.Semin Oncol 1996 Feb；23(1)154-8；Siders，et al.Cancer Gene Ther 1998 Sep-Oct；5(5)281-91)等。還可以使用在某些化合物或條件例如光、熱、輻射、四環(huán)素或熱休克蛋白存在下活化的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(參見例如WO00/10612)。其它合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。
如上所述，增強(qiáng)子也可以是合適的側(cè)翼序列。增強(qiáng)子是作用于啟動(dòng)子以增加轉(zhuǎn)錄的DNA的順式作用元件，通常長(zhǎng)度大約10-300bp。增強(qiáng)子典型地是方向和位置不依賴性的，已經(jīng)在受控編碼序列的5′和3′都鑒定出了增強(qiáng)子。已知可從哺乳動(dòng)物基因獲得的幾個(gè)增強(qiáng)子序列(即珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-feto蛋白和胰島素)。類似地，SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多形瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子對(duì)真核生物啟動(dòng)子序列有用。雖然增強(qiáng)子可以在核酸編碼序列的5′或3′的位置剪接入載體，但是典型地它位于啟動(dòng)子的5′的位點(diǎn)。其它合適的增強(qiáng)子是本領(lǐng)域已知的，并且將適用于本發(fā)明。
當(dāng)制備本發(fā)明的試劑時(shí)，細(xì)胞可能需要被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)染是指細(xì)胞對(duì)外來或外源性DNA的攝取，當(dāng)外源性DNA已經(jīng)被導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)染。很多轉(zhuǎn)染技術(shù)為本領(lǐng)域熟知(即Graham etal.，1973，Virology 52456；Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratoty Manual.(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)；Daviset al.，Basic Methods in Molecular Biology，(Elsevier，19S6)；和Chuet al.，1981，Gene 13197)。這種技術(shù)可用于將一個(gè)或多個(gè)外源性DNA部分導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。
在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選細(xì)胞的轉(zhuǎn)染引起那些細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。當(dāng)細(xì)胞的特征有改變時(shí)，細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，當(dāng)它已被修飾含有新核酸時(shí)，細(xì)胞正在被轉(zhuǎn)化(being transformed)。轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染的核酸可以通過物理整合入細(xì)胞的染色體而與細(xì)胞的核酸重組，可以作為游離型元件短暫維持而不被復(fù)制，或可以作為質(zhì)粒獨(dú)立復(fù)制。當(dāng)核酸隨細(xì)胞的分裂而復(fù)制時(shí)，細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的表達(dá)載體還提供免疫原性靶的片段的表達(dá)。片段可以包括在氨基末端(有或沒有前導(dǎo)序列)和/或羧基末端截?cái)嗟男蛄?。片段也可以包括變異體(即等位的、剪接)、直向同源物、同源物和與親本序列相比具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加或置換或內(nèi)部缺失的其它變異體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，截短和/或缺失包含大約1-5個(gè)氨基酸、5-10個(gè)氨基酸、10-20個(gè)氨基酸、20-30個(gè)氨基酸、30-40個(gè)氨基酸、40-50個(gè)氨基酸或更多。這種多肽片段可以任選包含氨基末端甲硫氨酸殘基。應(yīng)理解這種片段可以用于例如產(chǎn)生針對(duì)免疫原性靶的抗體或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
變異體是與主題序列相比具有一個(gè)或多個(gè)序列置換、缺失和/或添加的序列。變異體可以是天然存在的或人工構(gòu)建的。可以從相應(yīng)的核酸分子制備這種變異體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，變異體具有1至3，或1至5，或1至10，或1至15，1至20，或1至25，1至30，或1至40，或1至50，或50個(gè)以上氨基酸置換、插入、添加和/或缺失。
等位變異體是占據(jù)生物或生物種群染色體上給定基因座的序列的幾個(gè)可能天然存在的替換形式之一。剪接變異體是從由初級(jí)轉(zhuǎn)錄物剪接產(chǎn)生的幾個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄物之一產(chǎn)生的多肽。直向同源物是來自另一個(gè)物種的類似核酸序列或多肽序列。例如，小鼠和人的免疫原性靶可以彼此被認(rèn)為是直向同源物。序列衍生物是由親本序列獲得的具有置換、添加、缺失或化學(xué)修飾變異的那些序列。變異體也可以包括融合蛋白，它是指一個(gè)或多個(gè)第一序列(如肽)在至少一個(gè)其它序列(如異源肽)的氨基或羧基末端的融合。
“相似性”是與同一性相關(guān)的概念，除了相似性是指相關(guān)性的測(cè)量，包括相同的配對(duì)和保守置換的配對(duì)。如果兩個(gè)多肽序列具有例如10/20相同的氨基酸，并且其余的全部是非保守置換，那么同一性和相似性百分比將都是50％。如果在相同實(shí)例中，還有五個(gè)位置上有保守置換，那么同一性百分比仍然是50％，但是相似性百分比將是75％(15/20)。因此，在有保守置換的情況下，兩個(gè)多肽之間的相似性百分比將比那兩個(gè)多肽之間的同一性百分比高。
置換可以是保守的或非保守的或其任何組合。多肽序列的保守氨基酸修飾(和編碼核苷酸的相應(yīng)修飾)可以產(chǎn)生具有類似于親本多肽的功能和化學(xué)特征的多肽。例如，“保守氨基酸置換”可以包括用非天然殘基置換天然氨基酸殘基，以致對(duì)那個(gè)位置的氨基酸殘基的大小、極性、電荷、疏水性或親水性有很少或沒有影響，尤其是不引起免疫原性降低。表I示出了合適的保守氨基酸置換。
表I
本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用熟知技術(shù)確定免疫原性靶的合適變異體。為了鑒定該分子的可以改變而不破壞生物活性(即MHC結(jié)合、免疫原性)的合適區(qū)域，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以靶向那些被認(rèn)為對(duì)那種活性不重要的區(qū)域。例如，當(dāng)已知來自相同物種或來自其它物種的具有類似活性免疫原性靶時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將多肽的氨基酸序列與這種類似多肽進(jìn)行比較。通過進(jìn)行這種分析，人們可以鑒定保守的分子的殘基和部分。應(yīng)理解該分子的相對(duì)于這種類似免疫原性靶不保守的區(qū)域的改變將更小可能地不利地影響多肽的生物活性和/或結(jié)構(gòu)。類似地，結(jié)合MHC所需的殘基是已知的，并可以被修飾以提高結(jié)合。然而，在多數(shù)情況下，引起與MHC結(jié)合降低的修飾將不適當(dāng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將知曉，甚至在相對(duì)保守的區(qū)域，人們也可以用化學(xué)上類似的氨基酸置換天然存在的殘基，同時(shí)保持活性。因此，甚至對(duì)于生物活性或?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)重要的區(qū)域也可以經(jīng)受保守氨基酸置換，而不破壞免疫原性靶的生物活性或不會(huì)不利地影響免疫原性靶的結(jié)構(gòu)。
其它優(yōu)選多肽變異體包括糖基化變異體，其中糖基化部位的數(shù)量和/或類型與主題氨基酸序列相比已經(jīng)被改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽變異體包含比主題氨基酸序列更多或更少數(shù)量的N聯(lián)糖基化部位。N聯(lián)糖基化部位(N-linked glycosylation site)的特點(diǎn)在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸殘基。產(chǎn)生這個(gè)序列的氨基酸殘基置換提供了添加N聯(lián)糖鏈的潛在新部位?；蛘撸@個(gè)序列的置換將除去存在的N聯(lián)糖鏈。也提供了N聯(lián)糖鏈的重排，其中一個(gè)或多個(gè)N聯(lián)糖基化部位(典型地是天然存在的部位)被消除和產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)新的N聯(lián)部位。為影響多肽的O聯(lián)糖基化，人們將修飾絲氨酸和/或蘇氨酸殘基。
另外的優(yōu)選變異體包括半胱氨酸變異體，其中與主題(subject)氨基酸序列組相比，一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被刪除或被另一個(gè)氨基酸置換(如絲氨酸)。當(dāng)肽或多肽必須再折疊為生物學(xué)有活性的構(gòu)象時(shí)，如不溶包涵體分離后，半胱氨酸變異體有用。半胱氨酸變異體通常具有比天然蛋白更少的半胱氨酸殘基，典型地具有偶數(shù)以使不成對(duì)半胱氨酸引起的相互作用減至最小。
在其它實(shí)施方案中，肽或多肽可以與有助于多肽純化的一個(gè)或多個(gè)融合片段連接?？梢栽谥黝}多肽變異體的氨基末端或羧基末端進(jìn)行融合。可以沒有接頭或銜接分子直接融合或可以通過接頭或銜接分子融合。接頭或銜接分子可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，典型地大約20個(gè)至大約50個(gè)氨基酸殘基。接頭或銜接分子也可以設(shè)計(jì)有DNA限制性核酸內(nèi)切酶或蛋白酶的切割位點(diǎn)以允許融合部分的分離。應(yīng)理解融合多肽一旦被構(gòu)建，就可以根據(jù)在此描述的方法來衍生化。合適的融合片段包括金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如聚組氨酸片段)、免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即A蛋白、G蛋白、T細(xì)胞、B細(xì)胞、Fc受體或補(bǔ)體蛋白質(zhì)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和/或“tag”結(jié)構(gòu)域(即α-半乳糖苷酶的至少一部分、鏈球菌標(biāo)記肽(a strep tagpeptide)、T7標(biāo)記肽、FLAG肽或使用結(jié)合該結(jié)構(gòu)域的化合物如單克隆抗體可以純化的其它結(jié)構(gòu)域)等。這個(gè)標(biāo)記(tag)典型地與肽或多肽融合，并且表達(dá)后可以用作從宿主細(xì)胞親和純化感興趣多肽序列的工具。親和純化法可以通過例如使用抗標(biāo)記抗體作為親和基質(zhì)的柱層析完成。任選，隨后用各種方法如使用某些肽酶進(jìn)行切割，從純化的感興趣多肽序列中除掉該標(biāo)記。如下所述，例如也可以在TA和共刺激成分如趨化因子CXC10(IP-10)、CCL7(MCP-3)或CCL5(RANTES)之間進(jìn)行融合。
融合基序(motif)可以增強(qiáng)免疫原性靶到MHC加工隔室如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸。被稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)胞吞序列的這些序列包括來源于HIVtat(參見Kim et al.1997 J.Immunol.1591666)、Drosophilaantennapedia(參見Schutze-Redelmeier et al.1996 J.Immunol.157650)或人1期(period-1)蛋白(hPER1；尤其是SRRHHCRSKAKRSRHH)的序列。
此外，多肽或其變異體可以與同源肽或多肽融合形成同源二聚體或與異源肽或多肽融合形成異源二聚體。異源肽和多肽包括但不限于允許檢測(cè)和/或分離融合多肽的表位；跨膜受體蛋白或其部分如胞外結(jié)構(gòu)域或跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；與跨膜受體蛋白結(jié)合的配體或其部分；具有催化活性的酶或其部分；促進(jìn)寡聚化的多肽或肽如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域；增加穩(wěn)定性的多肽或肽如免疫球蛋白恒定區(qū)；具有不同于該肽或多肽的治療活性的肽或多肽；和/或其變異體。
在某些實(shí)施方案中，在本發(fā)明組合物中，編碼免疫原性靶的核酸序列與一個(gè)或多個(gè)共刺激成分組合可能有益，如細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞因子或趨化因子。共刺激成分可以例如作為多肽或作為編碼該多肽的核酸包括在組合物中。合適的共刺激分子包括例如結(jié)合CD28家族成員(即CD28，ICOS；Hutloff，et al.Nature 1999，397263-265；Peach，et al.J Exp Med 1994，1802049-2058)的多肽，如CD28結(jié)合多肽B7.1(CD80；Schwarz，1992；Chen et al，1992；Ellis，et al.J.Immunol.，156(8)2700-9)、B7.2(CD86；Ellis，et al.J.Immunol.，156(8)2700-9)和其突變體/變異體(WO 00/66162)；結(jié)合整聯(lián)蛋白家族成員的多肽(即LFA-1(CD 11a/CD18)；Sedwick，et al.J Immunol 1999，1621367-1375；Wulfing，et al.Science 1998，2822266-2269；Lub，et al.Immunol Today 1995，16479-483)，包括ICAM家族成員(即ICAM-1、-2或-3)；結(jié)合CD2家族成員的多肽(即CD2，信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子(CDw150或″SLAM″；Aversa，et al.J Immunol 1997，1584036-4044))如CD58(LFA-3；CD2配體；Davis，et al.ImmunolToday 1996，17177-187)或SLAM配體(Sayos，et al.Nature 1998，395462-469)；結(jié)合熱穩(wěn)定抗原的多肽(HSA or CD24；Zhou，et al.Eur J Immunol 1997，272524-2528)；結(jié)合TNF受體(TNFR)家族成員的多肽(即4-1BB(CD137；Vinay，et al.Semin Immunol 1998，10481-489)、OX40(CD134；Weinberg，et al.Semin Immunol 1998，10471-480；Higgins，et al.J Immunol 1999，162486-493)，和CD27(Lens，et al.Semin Immunol 1998，10491-499))如4-1BBL(4-1BB配體；Vinay，et al.Semin Immunol 1998，10481-48；DeBenedette，et al.J Immunol 1997，158551-559)、TNFR相關(guān)因子-1(TRAF-1；4-1BB配體；Saoulli，et al.J Exp Med 1998，1871849-1862，Arch，et al.Mol Cell Biol 1998，18558-565)、TRAF-2(4-1BB和OX40配體；Saoulli，et al.J Exp Med 1998，1871849-1862；Oshima，et al.Int Immunol 1998，10517-526，Kawamata，et al.J BiolChem 1998，2735808-5814)、TRAF-3(4-1BB和OX40配體；Arch，et al.Mol Cell Biol 1998，18558-565；Jang，et al.Biochem BiophysRes Commun 1998，242613-620；Kawamata S，et al.J Biol Chem1998，2735808-5814)、OX40L(OX40配體；Gramaglia，et al.JImmunol 1998，1616510-6517)、TRAF-5(OX40配體；Arch，et al.Mol CellBiol 1998，18558-565；Kawamata，et al.J Biol Chem 1998，2735808-5814)和CD70(CD27配體；Couderc，et al.Cancer GeneTher.，5(3)163-75)。CD 154(CD40配體或″CD40L″；Gurunathan，et al.J.Immunol.，1998，1614563-4571；Sine，et al.Hum.Gene Ther.，2001，121091-1102)可能也合適。
一種或多種細(xì)胞因子也可能是合適的共刺激成分或“佐劑”，作為本發(fā)明組合物內(nèi)含有的多肽或由含有的核酸編碼(Parmiani，et al.Immunol Lett 2000 Sep 15；74(1)41-4；Berzofsky，et al.NatureImmunol.1209-219)。合適的細(xì)胞因子包括例如白介素-2(IL-2)(Rosenberg，et al.Nature Med.4321-327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(綜述，Pardoll，1992；Harries，et al.J.Gene Med.2000 Jul-Aug；2(4)243-9；Rao，et al.J.Immunol.1563357-3365(1996))、IL-15(Xin，et al.Vaccine，17858-866，1999)、IL-16(Cruikshank，et al.J.Leuk Biol.67(6)757-66，2000)、IL-18(J.Cancer Res Clin.Oncol.2001.127(12)718-726)、GM-CSF(CSF(Disis，et al.Blood，88202-210(1996))、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或干擾素如IFN-α或IFN-γ。其它細(xì)胞因子也可能適于實(shí)施本發(fā)明，如本領(lǐng)域已知。
也可以使用趨化因子，以多肽或核酸形式。已經(jīng)表明與腫瘤自身抗原融合的包含CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白誘導(dǎo)抗腫瘤免疫(Biragyn，et al.Nature Biotech.1999，17253-258)。趨化因子CCL3(MIP-1α)和CCL5(RANTES)(Boyer，et al.Vaccine，1999，17.(Supp.2)S53-S64)在實(shí)施本發(fā)明中可能也有用。其它合適的趨化因子是本領(lǐng)域已知的。
本領(lǐng)域也已知抑制性或負(fù)性調(diào)節(jié)免疫機(jī)制可以被阻斷，引起增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。例如，已經(jīng)表明用抗CTLA-4(Shrikant，et al.Immunity，1996，14145-155；Sutmuller，et al.J.Exp.Med.，2001，194823-832)、抗CD25(Sutmuller，上述)、抗CD4(Matsui，et al.J.Immunol.，1999，163184-193.)、融合蛋白IL13Ra2-Fc(Terabe，et al.NatureImmunol.，2000，1515-520)及其組合(即抗CTLA-4和抗CD25，Sutmuller，上述)治療上調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)并將適于實(shí)施本發(fā)明。尤其是這種治療也可以與本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)免疫原性靶聯(lián)合。
這些組分中的任何一種可以單獨(dú)或與其它試劑聯(lián)合使用。例如，已經(jīng)表明CD80、ICAM-1和LFA-3(“TRICOM”)的組合可以增強(qiáng)抗癌免疫反應(yīng)(Hodge，et al.Cancer Res.595800-5807(1999)。其它有效組合包括例如IL-12+GM-CSF(Ahlers，et al.J.Immunol.，1583947-3958(1997)；Iwasaki，et al.J.Immunol.1584591-4601(1997))、IL-12+GM-CSF+TNF-α(Ahlers，et al.Int.Immunol.13897-908(2001))、CD80+IL-12(Fruend，et al.Int.J.Cancer，85508-517(2000)；Rao，et al.上述)和CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasaki，上述)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉實(shí)施本發(fā)明有用的另外的組合。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉可以用來調(diào)節(jié)這種機(jī)制的另外的試劑或方法。在實(shí)施本發(fā)明中可以使用這些試劑和方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試劑和方法。
也可以使用提高基于核酸的免疫的效率的另外策略，包括例如使用自我復(fù)制病毒復(fù)制子(Caley，et al.1999.Vaccine，173124-2135；Dubensky，et al.2000.Mol.Med.6723-732；Leitner，et al.2000.Cancer Res.6051-55)、密碼子優(yōu)化(Liu，et al.2000.Mol.Ther.，1497-500；Dubensky，上述；Huang，et al.2001.J.Virol.754947-4951)、體內(nèi)電穿孔(Widera，et al.2000.J.Immunol.1644635-3640)、CpG刺激基序的摻入(Gurunathan，et al.Ann.Rev.Immunol.，2000，18927-974；Leitner，上述；Cho，et al.J.Immunol.168(10)4907-13)、靶向內(nèi)吞或泛素加工途徑的序列(Thomson，et al.1998.J.Virol.722246-2252；Velders，et al.2001.J.Immunol.1665366-5373)、Marek病病毒1型VP22序列(J.Virol.76(6)2676-82，2002)、激發(fā)-加強(qiáng)方案(prime-boost regimens)(Gurunathan，上述；Sullivan，et al.2000.Nature，408605-609；Hanke，et al. 1998.Vaccine，16439-445；Amara，et al.2001.Science，29269-74)和使用粘膜遞送載體如沙門氏菌(Darji，et al.1997.Cell，91765-775；Woo，et al.2001.Vaccine，192945-2954)。其它方法是本領(lǐng)域已知的，其中一些描述如下。
在使用免疫原性靶治療和/或預(yù)防癌癥中也可以利用化療劑、射線、抗血管生成化合物或其它試劑(Sebti，et al.Oncogene 2000 Dec27；19(56)6566-73)。例如，在治療轉(zhuǎn)移性黑素瘤中，合適的化療方案可以包括BELD(博萊霉素，長(zhǎng)春地辛，羅氮芥，和deacarbazine；Young，et al.1985.Cancer，551879-81)、BOLD(博萊霉素、長(zhǎng)春新堿、環(huán)己亞硝脲、氮烯唑胺；Seigler，et al.1980.Cancer，462346-8)、DD(氮烯唑胺、放線菌素；Hochster，et al.Cancer TreatmentReports，6939-42)或POC(普魯芐肼、長(zhǎng)春新堿、環(huán)己亞硝脲；Carmo-Pereira，et al.1984.Cancer Treatment Reports，681211-4)等。也可以使用其它合適的化療方案。
許多抗血管生成試劑是本領(lǐng)域已知的并且將適于與免疫原性靶疫苗和/或化療方案共同施用(參見例如Timar，et al.2001.PathologyOncol.Res.，7(2)85-94)。這種試劑包括例如生理試劑如生長(zhǎng)因子(即ANG-2，NK1，2，4(HGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因于β(TGF-β))、細(xì)胞因子(即干擾素如IFN-α、-β、-γ、血小板因子4(PF-4)、PR-39)、蛋白酶(即切割的AT-III、膠原XVIII片段(Endostatin)、HmwKallikrein-d5纖溶酶片段(Angiostatin)、凝血酶原-Fl-2、TSP-1)、蛋白酶抑制劑(即金屬蛋白酶的組織抑制劑如TIMP-1、-2或-3；maspin；纖溶酶原激活物抑制劑如PAI-1；色素上皮衍生因子(PEDF))，Tumstatin(通過ILEX，Inc.可獲得)、抗體產(chǎn)物(即膠原結(jié)合抗體HUIV26、HUI77、XL313；抗VEGF；抗整聯(lián)蛋白(即Vitaxin，(Lxsys)))和糖苷酶(即肝素酶-I、-III)。已知或被認(rèn)為具有抗血管生成潛力的“化學(xué)試劑”或修飾的生理試劑，包括例如長(zhǎng)春堿、紫杉酚、酮康唑、薩力多胺、dolestatin、combrestatin A、雷帕霉素(Guba，et al.2002，Nature Med.，8128-135)、CEP-7055(可從Cephalon，Inc.獲得)、黃酮乙酸、Bay 12-9566(Bayer Corp.)、AG3340(Agouron，Inc.)、CGS 27023A(Novartis)、tetracylcine衍生物(即COL-3(Collagenix，Inc.))、Neovastat(Aeterna)、BMS-275291(Bristol-Myers Squibb)、低劑量5-FU、低劑量氨甲喋呤(MTX)、irsofladine、radicicol、cyclosporine、卡托普利、塞來昔布、D45152硫酸化多糖、陽離子蛋白(魚精蛋白)、陽離子肽VEGF、蘇拉明(polysulphonated napthyl urea)、干擾VEGF功能或產(chǎn)量的化合物(即SU5416 或 SU6668(Sugen)、PTK787/ZK22584(Novartis))、遠(yuǎn)霉素A、Angiozyme(核酶)、isoflavinoids、星形孢菌素衍生物、染料木素、EMD121974(Merck KcgaA)、tyrphostins、isoquinolones、視黃酸、carboxyamidotriazole、TNP-470、善得定、2-甲氧基雌二醇、aminosterols (即squalamine)、谷胱甘肽類似物(即N-乙酰-L-半胱氨酸)、combretastatin A-4(Oxigene)、Eph受體阻滯劑(Nature，414933-938，2001)、Rh-Angiostatin、Rh-Endostatin(WO 01/93897)、環(huán)狀RGD肽、accutin-disintegrin、苯并二氮雜、人源化抗avb3 Ab、Rh-PAI-2、氨氯吡脒、p-amidobenzamidine、抗uPA ab、抗uPAR Ab、L-phanylalanin-N-methylamides(即Batimistat，Marimastat)、AG3340和米諾環(huán)素。許多其它合適的試劑是本領(lǐng)域已知的，并將足以實(shí)踐本發(fā)明。
本發(fā)明也可以與治療癌癥的“非傳統(tǒng)”方法聯(lián)合使用。例如，最近已證明給予某些厭氧菌可以有助于減緩腫瘤生長(zhǎng)。在一項(xiàng)研究中，諾氏梭菌(Clostridium novyi)被修飾除去噬菌體游離基因(episome)上攜帶的毒素基因并被給予具有結(jié)腸直腸腫瘤的小鼠(Dang，et al.P.N.A.S.USA，98(26)15155-15160，2001)。與化療聯(lián)合，表明該治療在動(dòng)物中引起腫瘤壞死。本申請(qǐng)中描述的試劑和方法可以與這種治療方法聯(lián)合。
編碼免疫原性靶的核酸可以通過幾種可利用技術(shù)中的任何一種給予患者。已經(jīng)成功用于將核酸引入宿主的各種病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒等。本領(lǐng)域理解在本領(lǐng)域中許多這種病毒載體可以利用。本發(fā)明的載體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛可利用的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)構(gòu)建。在普通分子生物學(xué)參考文獻(xiàn)中可以找到這種技術(shù)，如Molecular CloningA LaboratoryManual(Sambrook，et al.，1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)、Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，Vol.185，edited by D.Goeddel，1991.Academic Press，San Diego，CA)和PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis，et al.1990.Academic Press，San Diego，CA)。
優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒(lentivirus)衍生物以及鼠和鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體實(shí)例包括例如Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和魯斯氏肉瘤病毒(RSV)。很多逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以合并(incorporate)多個(gè)外源核酸序列。由于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是有缺陷的，因此為了產(chǎn)生傳染性載體顆粒，它們需要輔助。這種輔助可以通過例如編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因的輔助細(xì)胞系來提供。合適的輔助細(xì)胞系包括Ψ2、PA317 和 PA12等。然后使用這種細(xì)胞系產(chǎn)生的載體病毒粒子可以用來感染組織細(xì)胞系，如NIH3T3細(xì)胞以產(chǎn)生大量嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過傳統(tǒng)方法(即注射)或通過接近靶細(xì)胞群的“生產(chǎn)細(xì)胞系”的植入給予(Culver，K.，et al.，1994，Hum.Gene Ther.，5(3)343-79；Culver，K.，et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，59685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1)39-69)。生產(chǎn)細(xì)胞系(producer cell line)被改造以產(chǎn)生病毒載體和在靶細(xì)胞附近釋放病毒顆粒。一部分釋放的病毒顆粒接觸靶細(xì)胞并感染那些細(xì)胞，由此將本發(fā)明的核酸遞送至靶細(xì)胞。靶細(xì)胞感染后，發(fā)生載體核酸的表達(dá)。
已證明腺病毒載體對(duì)于將基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞(Rosenfeld，M.，etal.，1991，Science，252(5004)431-4；Crystal，R.，etal.，1994，Nat.Genet.，8(1)42-51)、真核基因表達(dá)的研究(Levrero，M.，et al.，1991，Gene，101(2)195-202)、疫苗開發(fā)(Graham，F(xiàn).and Prevec，L.，1992，Biotechnology，20363-90)和動(dòng)物模型中(Stratford-Perricaudet，L.，et al.，1992，Bone Marrow Transplant.，9(Suppl.1)151-2；Rich，D.，et al.，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)461-76)特別有用。將重組Ad給予體內(nèi)不同組織的實(shí)驗(yàn)途徑包括氣管內(nèi)滴注(Rosenfeld，M.，et al.，1992，Cell，68(1)143-55)、肌內(nèi)注射(Quantin，B.，et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)2581-4)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz，J.，and Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)2812-6)和趨實(shí)體接種(stereotactic inoculation)至腦(LeGal La Salle，G.，et al.，1993，Science，259(5097)988-90)等。
腺病毒相關(guān)病毒(AAV)顯示出高水平傳染性、廣泛的宿主范圍和整合入宿主細(xì)胞基因組的特異性(Hermonat，P.，et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)6466-70)。和單純皰疹病毒1型(HSV-1)是又一個(gè)吸引人的載體系統(tǒng)，尤其是由于其親神經(jīng)性能而用于神經(jīng)系統(tǒng)(Geller，A.，et al.，1991，Trends Neurosci.，14(10)428-32；Glorioso，et al.，1995，Mol. Biotechnol.，4(1)87-99；Glorioso，et al.，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49675-710)。
痘病毒是另一種有用的表達(dá)載體(Smith，et al.1983，Gene，25(1)21-8；Moss，et al，1992，Biotechnology，20345-62；Moss，et al，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，15825-38；Moss，et al.1991.Science，2521662-1667)。證明有用的痘病毒包括牛痘、NYVAC、禽痘(avipox)、鳥痘(fowlpox)、金絲雀痘(canarypox)、ALVAC和ALVAC(2)等。
NYVAC(vP866)源自于牛痘病毒的哥本哈根疫苗株，通過刪除基因組的編碼已知或潛在的毒力因子的六個(gè)非必需區(qū)(參見例如美國(guó)專利5,364,773和5,494,807)。缺失基因座也被改造為插入外源基因的接受基因座。缺失區(qū)域是胸苷激酶基因(TK；J2R)；出血區(qū)(u；B13R+B14R)；A型包涵體區(qū)(ATI；A26L)；血細(xì)胞凝集素基因(HA；A56R)；宿主范圍基因區(qū)(C7L-K1L)和大亞基、核糖核苷酸還原酶(I4L)。NYVAC是遺傳改造的牛痘病毒株，是通過特異性缺失編碼與毒性和宿主范圍相關(guān)的基因產(chǎn)物的十八個(gè)開放閱讀框產(chǎn)生的。已經(jīng)證明NYVAC可用于表達(dá)TAs(參見例如美國(guó)專利6,265,189)。NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB也按照布達(dá)佩斯條約的條件保藏在ATCC，保藏號(hào)分別為VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。
基于ALVAC的重組病毒(即ALVAC-1和ALVAC-2)也適合用于實(shí)施本發(fā)明(參見例如美國(guó)專利5,756,103)。ALVAC(2)與ALVAC(l)相同，除了ALVAC(2)基因組包含牛痘啟動(dòng)子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美國(guó)專利6,130,066；Beattie et al.，1995a，1995b，1991；Chang et al.，1992；Davies et al.，1993)。已經(jīng)證明ALVAC(1)和ALVAC(2)都可用于表達(dá)外源DNA序列，如TAs(Tartaglia et al.，1993a，b；美國(guó)專利5,833,975)。ALVAC按照布達(dá)佩斯條約的條件保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，美國(guó)，ATCC保藏號(hào)VR-2547。
另一種有用的痘病毒載體是TROVAC。TROVAC是指減毒的鳥痘，是來源于被許可對(duì)1日齡小雞接種的鳥痘病毒的FP-1疫苗株的噬菌斑克隆分離物。TROVAC同樣按照布達(dá)佩斯條約的條件保藏在ATCC，保藏號(hào)2553。
“非病毒”質(zhì)粒載體可能也適于實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選的質(zhì)粒載體與細(xì)菌、昆蟲和/或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞相容。這種載體包括例如PCR-II、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(BlueBacII，Invitrogen)、pDSR-α(PCT
發(fā)明者N·伯林斯泰因, J·塔塔格利亞, M·帕林頓, D·帕尼卡利, L·格里茨 申請(qǐng)人:圣諾菲·帕斯圖爾有限公司, 特里昂生物學(xué)公司