專利名稱：用于檢測(cè)靶物質(zhì)的橋接元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文件一般地屬于傳感器設(shè)備，更具體地屬于但并不限于靶物質(zhì)的檢測(cè)和分析。
背景技術(shù)：
以前用于檢測(cè)分析物比如生物因子、病原體、細(xì)菌、病毒、真菌、分子和毒素的方法，都相當(dāng)麻煩、耗時(shí)，還要求顯著的專業(yè)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)操作。例如，一種技術(shù)方法通常要求樣品在皮氏培養(yǎng)皿中持續(xù)培養(yǎng)幾天。另一種技術(shù)涉及選擇已染色抗體用于識(shí)別特定病原細(xì)菌存在的的用途。
此外，有些系統(tǒng)要求靶生物分子經(jīng)過(guò)擴(kuò)增過(guò)程，這很容易出錯(cuò)并要求高水平的技術(shù)能力。而且，擴(kuò)增有時(shí)并不能確定靶生物因子的濃度，也不適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。
有些系統(tǒng)不能檢測(cè)生物因子的天然或者工程化變化，已知它們會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性錯(cuò)誤，而且對(duì)測(cè)試條件也很敏感。有些用于檢測(cè)生物分子(比如DNA序列或者蛋白質(zhì))的設(shè)備需要大量靶分子的有效作用，因此，必須擴(kuò)增靶分子，并在有些情況下靶分子被標(biāo)記，這阻止模板分子的進(jìn)一步利用。


在附圖中，所示附圖不必按比例畫出，所有這幾個(gè)視圖中相似數(shù)字表示基本類似的組件；具有不同字母后綴的相似數(shù)字表示基本相似元件的不同情況。以實(shí)例的方式而非限制性方式，附圖一般性舉例說(shuō)明本文件中討論的各種實(shí)施方案。
圖1表示檢測(cè)靶分子方法的流程圖。
圖2表示懸臂檢測(cè)器。
圖3表示懸臂結(jié)構(gòu)的一部分。
圖4表示位移隨時(shí)間變化的函數(shù)圖。
圖5A和5B表示懸臂檢測(cè)器系統(tǒng)的示意圖。
圖6表示電流隨電壓變化的函數(shù)圖。
圖7A和7B表示測(cè)量的參數(shù)隨時(shí)間變化的函數(shù)圖。
圖8表示諧振中的偏移。
圖9表示準(zhǔn)備模板分子方法的流程圖。
圖10和11表示檢測(cè)靶分子方法的流程圖。
圖12表示系統(tǒng)中懸臂陣列的示意圖。
圖13表示便攜檢測(cè)器的實(shí)例。
詳細(xì)說(shuō)明下面的詳細(xì)說(shuō)明包括參考結(jié)合附圖的內(nèi)容，附圖部分構(gòu)成詳細(xì)說(shuō)明的一部分。附圖以舉例說(shuō)明的方式表示可實(shí)施發(fā)明的具體實(shí)施方案。通過(guò)對(duì)這些典型實(shí)施方案(本文中也稱為實(shí)施例)足夠詳細(xì)的說(shuō)明，可使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。實(shí)施方案之間可以相互結(jié)合，也可以利用其他的實(shí)施方案，或者可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)、邏輯和與電有關(guān)的變化而不超出本發(fā)明的范圍。因此，下面的詳細(xì)說(shuō)明并不對(duì)本發(fā)明起限制作用，本發(fā)明的范圍由附屬權(quán)利要求及其等價(jià)物來(lái)確定。
象通常專利文件中一樣，本文件中術(shù)語(yǔ)“一”包括一個(gè)或者多于一個(gè)。本申請(qǐng)文件中，術(shù)語(yǔ)“或者”表示非唯一的，除非有其他明確說(shuō)明。此外，本文件參考的所有出版物、專利和專利文件，在此都合并作為一個(gè)整體全部引用，就像單獨(dú)參考引用一樣。如果出現(xiàn)本文件和那些合并引用文件不一致的地方，合并引用文件中的用法應(yīng)考慮是對(duì)本文件的補(bǔ)充說(shuō)明；對(duì)于不能協(xié)調(diào)一致的內(nèi)容，以本文件中用法為準(zhǔn)。
附圖是申請(qǐng)文件的一部分，以舉例說(shuō)明的方式、而非限制性方式表示可實(shí)施本發(fā)明主題的具體實(shí)施方案。對(duì)示例性的實(shí)施方案進(jìn)行足夠詳細(xì)說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)嵤┕_(kāi)的內(nèi)容。也可以利用其他實(shí)施例并從中衍生，使得可以做出結(jié)構(gòu)和邏輯方面的替代和變化而不偏離本公開(kāi)的范圍。因此所述詳細(xì)說(shuō)明不具有限制意義，各種實(shí)施方案的范圍僅受所附權(quán)利要求、以及全部范圍的由這些權(quán)利要求享有權(quán)利的等價(jià)物的限制。
此處涉及的本發(fā)明主題的實(shí)施方案在本文中可以全部或者單獨(dú)地用術(shù)語(yǔ)“發(fā)明”來(lái)表示，這僅僅是為了方便，如果實(shí)際上超過(guò)一種被公開(kāi)，這并不意味著將本申請(qǐng)的范圍限于任意單一發(fā)明或發(fā)明構(gòu)思。因此，盡管具體實(shí)施方案已經(jīng)在此處用于舉例說(shuō)明并被描述，應(yīng)該理解任何能夠達(dá)到相同目的的方案都可替代所列出的具體實(shí)施方案。本文件意思覆蓋各種實(shí)施方案的任意和所有改變、變化或組合。
通過(guò)上述說(shuō)明，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，上述實(shí)施方案和其他沒(méi)有具體說(shuō)明的實(shí)施方案的組合將是顯而易見(jiàn)的。
概述分子受周圍環(huán)境變化的影響。比如，單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)會(huì)對(duì)引入它的互補(bǔ)ssDNA產(chǎn)生反應(yīng)；一條DNA鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交導(dǎo)致總長(zhǎng)度的減小，以及DNA導(dǎo)電特性的變化。這些變化與兩條DNA鏈之間的匹配忠實(shí)度成正比，即使單個(gè)核苷酸的錯(cuò)配都有可檢測(cè)的效應(yīng)。對(duì)這些變化的分析使鑒定各種病原體成為可能并允許區(qū)分特定株系。
在一個(gè)實(shí)施例中，用微機(jī)電(MEMS)結(jié)構(gòu)測(cè)量與雜交相關(guān)的分子變化。例如，MEMS芯片中的移動(dòng)元件由選擇的單鏈DNA片段橋接。根據(jù)該元件偏移的測(cè)量和由雜交引起的電導(dǎo)率的測(cè)量來(lái)檢測(cè)和鑒定互補(bǔ)片段。在一個(gè)實(shí)施例中，信號(hào)處理用于解釋檢測(cè)和鑒定時(shí)的雜交事件。長(zhǎng)度和電導(dǎo)率變化與DNA鏈同源性之間的相關(guān)性用于區(qū)分已知和變體病原體以及區(qū)分良性和毒性株。
此外，雜交后施加的電壓導(dǎo)致病原體DNA鏈或者靶分子從模板分子上釋放。釋放靶分子的電流也可以提供鑒定靶分子的信息。另外，通過(guò)釋放靶分子，傳感器可為另外的檢測(cè)事件作準(zhǔn)備。而且，在檢測(cè)事件之前，通過(guò)給模板分子施加低水平電流來(lái)測(cè)試傳感器的完整性。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA橋接的MEMS傳感器陣列允許同時(shí)多路檢測(cè)很多病毒或者細(xì)菌病原體，或者使之能夠測(cè)量單種病原體的濃度。
此外，模板分子諧振的變化被用于鑒定與模板分子結(jié)合的樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，懸臂的可移動(dòng)端通過(guò)模板分子和一個(gè)結(jié)構(gòu)橋接，懸臂系統(tǒng)(和模板分子橋)的諧振頻率將隨樣品和模板分子的雜交而變化?？筛鶕?jù)振幅或者頻率偏移的幅度和方向來(lái)確定同源性程度。
方法實(shí)例圖1表示用于檢測(cè)和鑒定靶物質(zhì)的示例性方法100。在一個(gè)實(shí)施例中，靶物質(zhì)包含單鏈DNA片段。
此處所用的靶分子和模板分子是新創(chuàng)的術(shù)語(yǔ)，所述分子以它們結(jié)合在一起的方式而相互關(guān)聯(lián)。因此，特定的傳感器利用第一種ssDNA鏈作為模板分子而第二種ssDNA鏈?zhǔn)前蟹肿?，另外一個(gè)傳感器則可利用第一種ssDNA鏈作為靶分子而第二種ssDNA鏈作為模板分子。
也包括其它的結(jié)合伴侶組合。例如，模板分子或者靶分子可以包含核酸分子(比如寡核苷酸，包括ss-DNA或者稱為ss-RNA的RNA)、蛋白質(zhì)和碳水化合物。包含單鏈DNA的模板分子可與互補(bǔ)DNA鏈雜交，形成雙鏈DNA(ds-DNA)。另外，包含蛋白質(zhì)的模板分子可與靶分子結(jié)合，所述靶分子也包含蛋白質(zhì)(通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)識(shí)別)、核酸(通過(guò)蛋白質(zhì)-核酸識(shí)別)或者碳水化合物(通過(guò)蛋白質(zhì)-碳水化合物識(shí)別)。另外，包含核酸的模板分子可與靶分子結(jié)合，所述靶分子包含使用DNA的核酸(通過(guò)核酸-核酸識(shí)別)或者碳水化合物(通過(guò)核酸-碳水化合物識(shí)別)。而且，包含碳水化合物的模板分子可與包含碳水化合物的靶分子結(jié)合(通過(guò)糖類-糖類識(shí)別)。通常，模板分子-靶分子間的組合可描述為象鎖和鑰匙的關(guān)系，允許某些分子僅與其他分子結(jié)合。
在105，收集待分析的樣品。潛在包含靶分子的樣品可以是氣態(tài)、液態(tài)或者固態(tài)。在110，準(zhǔn)備樣品用于分析，在一個(gè)實(shí)施例中，包括樣品的過(guò)濾。在115，樣品遞送給傳感器進(jìn)行分析。在一個(gè)實(shí)施例中，樣品遞送包括使用微流泵、閥、通道、儲(chǔ)器或者其他構(gòu)造發(fā)送樣品。在120，樣品被導(dǎo)入一個(gè)或者多個(gè)傳感器進(jìn)行可能的檢測(cè)和鑒定。在各種實(shí)施例中，檢測(cè)和鑒定包括監(jiān)測(cè)長(zhǎng)度或者位置的變化、力的變化、電導(dǎo)率或者電阻率的變化，確定將樣品從模板分子解離的信號(hào)水平和確定諧振偏移。在125，處理收集的數(shù)據(jù)來(lái)檢測(cè)和鑒定樣品。在各種實(shí)施例中，數(shù)據(jù)處理包括將輸出信號(hào)與存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，其中存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)包括靶分子與模板分子相關(guān)性的查表。
也包括其他方法。比如，可以在將傳感器暴露于樣品之前通過(guò)監(jiān)測(cè)各種參數(shù)進(jìn)行傳感器完整性檢測(cè)。
懸臂傳感器實(shí)例圖2是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的傳感器200。襯底215提供一個(gè)結(jié)構(gòu)或者參考平臺(tái)，懸臂構(gòu)造于其上?；?10附著在懸臂205A的一端，并將懸臂205A抬升到襯底215之上。在一個(gè)實(shí)施例中，懸臂205A的尺寸大約是200μm長(zhǎng)、20μm寬和1μm厚。模板分子220的一部分附著在懸臂205A的自由端。
該附圖表示，模板分子220作為線性元件，其中一端與懸臂205A的自由端結(jié)合，另一端與襯底215的一部分結(jié)合。懸臂205A和襯底215之間的空間通過(guò)模板分子220橋接。
如圖所示，模板分子220是在沒(méi)有互補(bǔ)結(jié)合伴侶結(jié)合的狀態(tài)下，懸臂205A是在松弛或者無(wú)負(fù)載的狀態(tài)下，懸臂205A還可位于圖中虛線所示處。比如，圖中所示的懸臂205B是當(dāng)結(jié)合伴侶與模板220結(jié)合時(shí)的狀態(tài)。懸臂205B產(chǎn)生懸臂205A所示位置下距離D1的一段位移，模板分子220與低親和性的結(jié)合伴侶結(jié)合。所示的懸臂205C是當(dāng)不同的結(jié)合伴侶與模板220結(jié)合時(shí)的狀態(tài)，懸臂205C產(chǎn)生懸臂205A所示位置下距離D2的一段位移。懸臂205C表示模板分子220與比懸臂205B表示的結(jié)合伴侶具有更強(qiáng)親和性的結(jié)合伴侶結(jié)合時(shí)的狀態(tài)。
在光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)懸臂205A的位移。如圖所示，光源230將光束250投射到懸臂205A的表面并被反射，如光線245A所示，并被光學(xué)傳感器235的池240A檢測(cè)。懸臂205B反射光，如光線245B所示，該光線被池240B檢測(cè)；懸臂205C反射光，如光線245C所示，該光線被池240C檢測(cè)。圖示的傳感器235有三個(gè)池，但是也包括更多或更少的池。在一個(gè)實(shí)施例中，光源230包括激光或者其他準(zhǔn)直光源。
也包括檢測(cè)懸臂205A的位移和諧振的其它手段。在一個(gè)實(shí)施例中，壓電元件提供作為懸臂205A偏移函數(shù)的電信號(hào)。該壓電元件包括與懸臂205A、基座210或者其他結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合或集成一體的壓電材料。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)量電容來(lái)確定位移或者諧振。例如，懸臂結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電層作為電容極板，懸臂導(dǎo)電層和另一個(gè)導(dǎo)體之間的電容隨導(dǎo)體間的距離變化。因此，對(duì)電容的測(cè)量可以提供位移和諧振數(shù)據(jù)。在各種實(shí)施例中，懸臂的導(dǎo)電層與懸臂的其他導(dǎo)電層是電隔離的。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)磁場(chǎng)或者電場(chǎng)來(lái)確定懸臂結(jié)構(gòu)的位移或者諧振。磁體和導(dǎo)體間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)提供用于確定位移或者諧振的信號(hào)。此外，附著于懸臂的應(yīng)變儀提供位移和諧振信息。
懸臂結(jié)構(gòu)實(shí)例圖3表示利用定向模板電路(Directed Template CircuitryDiTC)構(gòu)造制造的傳感器結(jié)構(gòu)的實(shí)例。定向模板電路利用微機(jī)電系統(tǒng)、自組裝單層(SAM)和DNA雜交。利用光刻技術(shù)，各種材料包括金屬如銀(Ag)、鉻(Cr)、金(Au)和碳的薄膜都以微米級(jí)大小制成圖樣。自組裝單層允許將模板分子選擇性固定在MEMS表面。此外，蛋白質(zhì)和其他生物分子可以用SAM固定在諸如金的表面上。而且，可利用電流測(cè)量方法和電極上SAM來(lái)檢測(cè)靶分析物。
在定向模板電路的一個(gè)實(shí)施例中，SAM技術(shù)用于將單層蛋白質(zhì)鏈親和素施加在鉻上的金層上?；诮鸨砻嫔系鞍踪|(zhì)和生物素disulde單層之間的結(jié)合，將鏈親和素固定在金電極表面上。
然后同樣基于生物素的化學(xué)被用于專門設(shè)計(jì)和合成的約20-100個(gè)堿基寡核苷酸引物之間的結(jié)合，該引物用以與單鏈DNA模板橋雜交，如圖8所示。該定向模板電路引物指導(dǎo)ssDNA模板橋即左手引物的定向和定位。
在一個(gè)實(shí)施例中，利用寡核苷酸引物以一定的方式結(jié)合單鏈DNA(ssDNA)模板，其結(jié)合方式使得其橋接電子MEMS基的電路。與來(lái)源于待鑒定微生物的靶分子的雜交導(dǎo)致懸臂梁間距離的減小。
利用定向模板電路制造MEMS微芯片裝置簡(jiǎn)單地需要凝膠光聚合技術(shù)來(lái)產(chǎn)生由疏水玻璃表面隔離開(kāi)的聚丙烯酰胺凝膠墊微基質(zhì)(micromatrices)。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA寡核苷酸施加到凝膠墊上并利用熒光顯微鏡和核酸外切酶消化來(lái)測(cè)試是否正確定位和定向。
可用其他方法來(lái)將模板分子附著在接觸點(diǎn)上，其附著方式使得模板分子適于檢測(cè)和識(shí)別靶分子。例如，也包括利用金-鏈親和素和硫基/生物素建立的結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施例中，該引物被設(shè)計(jì)和合成以雜交包含單鏈DNA分子的模板分子。而且引物的排列和定向使得模板分子將具有期望的定向和位置。更具體而言，引物確保模板分子的選定部分(位于或者朝向第一端)與懸臂的一個(gè)表面結(jié)合，并且確保模板分子的選定部分(位于或者朝向第二端)和懸臂的另外一個(gè)表面結(jié)合。在各種實(shí)施例中，模板分子的末端與懸臂結(jié)構(gòu)的特定部分配合(單向匹配)或者不配合(雙向匹配)。
性能-位移在一個(gè)實(shí)施例中，DNA鏈的強(qiáng)度和長(zhǎng)度取決于堿基組成、序列和環(huán)境。當(dāng)單鏈DNA與其互補(bǔ)鏈相互作用時(shí)發(fā)生可測(cè)量的生物物理學(xué)現(xiàn)象。具體地，與其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)DNA長(zhǎng)度平均自由減少大約為40％。DNA核苷序列及組成可與結(jié)構(gòu)和其他生物物理參數(shù)建立相關(guān)性。
圖4表示力幅度和懸臂205A表面位移之間關(guān)系。對(duì)于一個(gè)特定的懸臂來(lái)說(shuō)，測(cè)量性能可用于鑒定互補(bǔ)結(jié)合伴侶。如果懸臂暴露于不是完全互補(bǔ)的樣品分子，那么結(jié)果將會(huì)不同。
圖4圖解表示生物分子強(qiáng)度的一個(gè)實(shí)例。對(duì)于提供的數(shù)據(jù)，分子被束縛在懸臂尖端和襯底之間。通過(guò)向模板ssDNA的末端添加官能團(tuán)從而將一端附著在懸臂上并且另一端附著在襯底上來(lái)實(shí)現(xiàn)這種束縛。組合實(shí)例包括金-硫醇結(jié)合和生物素-鏈親和素結(jié)合。
圖中顯示確定分子抗張強(qiáng)度的數(shù)據(jù)分析。在一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)造傳感器結(jié)構(gòu)使得模板分子處于輕微張力，但是也包括中性或接近零的張力。模板分子處于這種方式下，導(dǎo)入結(jié)合伴侶。對(duì)于ssDNA模板分子來(lái)說(shuō)，合適的結(jié)合伴侶是互補(bǔ)ssDNA鏈。模板分子與靶分子的隨后結(jié)合(或雜交)提供了物理參數(shù)或者特性的可測(cè)量變化。懸臂可檢測(cè)(和測(cè)量)由于雜交引起的位移和分子長(zhǎng)度的變化。
圖中顯示懸臂位移與模板ssDNA和靶ssDNA的雜交相關(guān)。參照附注，將模板ssDNA暴露于遺傳匹配(或互補(bǔ))的靶ssDNA后，懸臂大約有10.2nm的變形。用超過(guò)100種不同生物分子對(duì)這種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了重復(fù)。
如圖所示，標(biāo)準(zhǔn)靶表示與模板分子(鏈)有100％同源性的互補(bǔ)ssDNA鏈。所示的其他靶是來(lái)自100％同源性互補(bǔ)ssDNA鏈的2％、19％和38％的變體。此處用的術(shù)語(yǔ)“變體”表示相對(duì)于100％同源性互補(bǔ)ssDNA鏈包含隨機(jī)堿基對(duì)替換的靶ssDNA。圖中的等級(jí)表示利用本發(fā)明的系統(tǒng)也可檢測(cè)和鑒定變體ssDNA分子。
雙懸臂檢測(cè)器實(shí)例圖5A和5B是基于懸臂的傳感器500的示意圖。圖5A表示模板分子545橋接、或連接雙懸臂505A自由端。懸臂505A通過(guò)導(dǎo)體550和位于懸臂505A固定端的連接板535與傳感器電路530電連接。連接板535結(jié)合到位于層515和層520之上的層510上。在一個(gè)實(shí)施例中，層510、515和520分別由Si3N4、Si、Si3N4組成，并分別為約50nm、150nm和250nm厚。懸臂505A懸在形成于層515中的樣品通道540之上。在一個(gè)實(shí)施例中，懸臂505A由厚度分別為約40nm和5nm的層555(金)和層560(鉻)形成。
圖5A中，懸臂505A通過(guò)模板分子ssDNA545在很小或者沒(méi)有張力的情況下橋接。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)器電路530提供電流以檢測(cè)電導(dǎo)率水平。我們知道電導(dǎo)率是電阻的倒數(shù)并且在一個(gè)實(shí)施例中測(cè)定電阻。在一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)定阻抗值。在圖5B中，橋565表示由模板分子(ssDNA)和靶分子(ssDNA)組合形成的雜交dsDNA。如圖5B所示，懸臂505A收斂偏移，檢測(cè)器電路530生成電導(dǎo)率的測(cè)量值，并在dsDNA鏈雜交時(shí)，反映電導(dǎo)率測(cè)量值的增加。
在多種實(shí)例中，檢測(cè)器電路530中有測(cè)試電路和復(fù)位電路，測(cè)試電路設(shè)置成向模板分子545提供電流，以確立模板分子和懸臂梁之間的正確附著。例如，如果傳感器和模板分子正確設(shè)置，電流源、傳感器和電阻的串聯(lián)組合將指示預(yù)期電流。與預(yù)期電流水平的偏差可能表示模板分子或者傳感器沒(méi)有為樣品測(cè)試正確配置。
檢測(cè)器電路的復(fù)位電路包括驅(qū)動(dòng)電路，所述驅(qū)動(dòng)電路用于將靶分子從模板分子解離，從而為另一次檢測(cè)和鑒定事件作準(zhǔn)備。在一個(gè)實(shí)施例中，這需要向模板分子提供斜線電壓并監(jiān)控峰值電流。在一個(gè)實(shí)施例中，這需要向模板分子提供斜線電流并監(jiān)測(cè)峰值電壓。該峰值電壓或電流將與模板分子和靶分子的變性或解離事件同時(shí)發(fā)生。
圖6表示誘導(dǎo)束縛DNA與互補(bǔ)鏈變性所需電流的實(shí)例。復(fù)位電路、或提供變性電流的其它手段可將互補(bǔ)鏈從傳感器位置移除，從而為新的感測(cè)事件作準(zhǔn)備。在一個(gè)實(shí)施例中，置于流動(dòng)流中的傳感器可用于連續(xù)的和單獨(dú)的感測(cè)事件，從而允許對(duì)該傳感器的連續(xù)操作。
如圖所示，縱坐標(biāo)表示變性電流，橫坐標(biāo)表示所加電壓，如圖所示，電流強(qiáng)度的差異提供區(qū)分互補(bǔ)模板分子和變化的手段。
應(yīng)該注意的是，無(wú)論變化發(fā)生在遺傳序列的一個(gè)區(qū)域還是沿靶序列散布在多個(gè)不同位置，促使變性所需的電流量和模板與靶ssDNA鏈間的錯(cuò)配程度之間是高度成比例的。
圖7A和7B表示人工操作步驟，增加電壓以促使變性，隨后將電壓降低至感測(cè)水平，以允許另一次雜交發(fā)生。如圖7A所示，記錄了多個(gè)感測(cè)事件，與那些感測(cè)事件相應(yīng)的復(fù)位信號(hào)如圖7B所示。變性電流提供復(fù)位傳感器的手段，在ssDNA期間以及雜交(dsDNA)狀態(tài)之后，變性電流都顯示是一致的。
如圖所示，開(kāi)始數(shù)據(jù)采集大約15秒后引入互補(bǔ)鏈，隨后立即是感測(cè)事件。幾秒鐘后，人工將電壓增加到約4伏，導(dǎo)致雙鏈DNA變性。人工將電壓降至3伏，系統(tǒng)由此復(fù)位從而為另一次感測(cè)事件作準(zhǔn)備。
諧振實(shí)例圖8包括圖解數(shù)據(jù)800，該數(shù)據(jù)800表示如何能夠使用諧振來(lái)利用橋接模板分子鑒定和檢測(cè)靶分子。
如圖所示，橫坐標(biāo)表示頻率，縱坐標(biāo)表示振幅。懸臂結(jié)構(gòu)或者其他懸結(jié)構(gòu)被激勵(lì)信號(hào)驅(qū)動(dòng)而振蕩。在各種實(shí)施例中，該激勵(lì)信號(hào)由位于可移動(dòng)結(jié)構(gòu)附近的磁性、壓電或者聲學(xué)元件提供。如圖所示，曲線805表示一個(gè)實(shí)例，其中模板分子以初始頻率F2和初始振幅A2諧振。模板分子暴露于靶分子后，該結(jié)構(gòu)以頻率F1和振幅A1諧振。頻率差ΔF和振幅差ΔA表示同源性程度，從而允許檢測(cè)和鑒定靶分子。例如，認(rèn)為靶分子與模板分子匹配率越高所表現(xiàn)的振幅和/或頻率變化越大。
圖中示出振幅和頻率的下降。然而，在其它實(shí)例中，振幅和頻率之一或者二者都可能表現(xiàn)為增加或者下降。
在一個(gè)實(shí)施例中，MEMS裝置移動(dòng)部件的諧振允許檢測(cè)和鑒定。在一個(gè)實(shí)施例中，懸臂的一端包括磁性物質(zhì)，并且通過(guò)位于懸臂下面的線圈的交變電流引起懸臂以交變電流的頻率振動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇懸臂的尺寸和交變電流來(lái)使輸出最大。例如，如果交變電流接近懸臂的固有頻率，這個(gè)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的反應(yīng)將最大。當(dāng)有ssDNA或者其他模板分子被束縛在懸臂一端和基座之間時(shí)，結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的剛度會(huì)變化。振蕩系統(tǒng)的振幅位移和/或振蕩頻率將不同于具有自由懸臂端的系統(tǒng)。當(dāng)引入靶分子(比如分析物或者與模板ssDNA互補(bǔ)的ssDNA)時(shí)，振蕩系統(tǒng)的振幅位移和頻率將變化。由于dsDNA鏈的剛度比兩個(gè)獨(dú)立的ssDNA的剛度之和大，變化的量與模板分子和靶分子間的同源性程度成比例。因此，除了檢測(cè)分析物的存在外，當(dāng)和互補(bǔ)配對(duì)比較時(shí)，振幅和頻率的變化可用于測(cè)量ssDNA分子的同源性程度。
準(zhǔn)備實(shí)例圖9表示根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的方法900的流程圖。如圖所示，在905將懸臂構(gòu)造于基座上。也包括懸臂以外的結(jié)構(gòu)，例如，包括具有一個(gè)支持點(diǎn)和自由端的圓形或者螺旋狀結(jié)構(gòu)。此外，也可以是盤狀或者矩形結(jié)構(gòu)，具有可移動(dòng)中心區(qū)域和以鼓膜方式附著于基座結(jié)構(gòu)的周邊。在一個(gè)實(shí)施例中，利用半導(dǎo)體制造技術(shù)在基座上形成懸臂。
在910，向懸臂和向基座結(jié)構(gòu)或襯底施加結(jié)合物或者引物(primer)。選擇引物確保模板分子以正確的對(duì)準(zhǔn)和定向固定。在各種實(shí)施例中，引物包括金和鏈親和素。
在915，模板分子橋接在襯底和懸臂之間。
在一個(gè)實(shí)施例中，由制備特定用途的傳感器的制造商來(lái)實(shí)施方法900。
檢測(cè)和鑒定實(shí)例圖10和11分別表示測(cè)試方法1000和測(cè)試方法1100。如圖所示的方法以及其他方法可通過(guò)和傳感器偶聯(lián)的計(jì)算機(jī)或者其他控制電路實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法通過(guò)人工控制傳感器來(lái)完成。
圖10中，在1005進(jìn)行樣品準(zhǔn)備。在各種實(shí)施例中，樣品準(zhǔn)備需要過(guò)濾、純化、擴(kuò)增和其他程序以準(zhǔn)備樣品進(jìn)行分析。
在1010，分析模板分子以建立一個(gè)或者多個(gè)參數(shù)作為基線。在一個(gè)實(shí)施例中，這需要通過(guò)驗(yàn)證通過(guò)模板分子的電流水平來(lái)校驗(yàn)?zāi)０宸肿诱_對(duì)準(zhǔn)和定位。此外，測(cè)量單獨(dú)的模板分子電導(dǎo)率或者電阻率、諧振振幅和頻率。在一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)量模板分子的物理位置。
在1015，樣品暴露于模板。在一個(gè)實(shí)施例中，這需要將樣品(其中可能包括靶分子)注入測(cè)試儀器的通道或者儲(chǔ)器中。通道或者儲(chǔ)器與模板分子連通。
在1020，分析模板分子以生成對(duì)應(yīng)于暴露模板分子的物理參數(shù)。在各種實(shí)施例中，暴露參數(shù)包括測(cè)量位置變化或位移、測(cè)量對(duì)準(zhǔn)程度變化、測(cè)量電導(dǎo)率或電阻率的變化、測(cè)量變性電流和測(cè)量諧振的變化。也可測(cè)量其他的物理參數(shù)，包括基于模板與靶分子結(jié)合的顏色或者光學(xué)性質(zhì)的參數(shù)。
在1025，出現(xiàn)詢問(wèn)以確定是否發(fā)現(xiàn)傳感器暴露于靶分子后基線和參數(shù)之間的差別。如果發(fā)現(xiàn)物理參數(shù)的變化或差別，則繼續(xù)執(zhí)行1030，鑒定樣品。差別的存在指示模板分子的檢測(cè)。
如本文中其他地方說(shuō)明，同源性程度指示模板分子和靶分子間的匹配程度。也包括其他結(jié)合對(duì)，并且與完全匹配的接近程度可以與物理參數(shù)的差別建立關(guān)聯(lián)。
在一個(gè)實(shí)施例中，與本主題的處理器偶聯(lián)的存儲(chǔ)器包括查表形式的存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。存儲(chǔ)數(shù)據(jù)提供了物理參數(shù)的差別和變化與同源性程度之間的關(guān)聯(lián)性。
如果1025的詢問(wèn)得到否定結(jié)果，則繼續(xù)執(zhí)行1035，產(chǎn)生輸出信號(hào)。在各種實(shí)施方案中，該輸出信號(hào)包括所述差別和變化的量度、同源性程度或者靶分子鑒定。
在1040，模板分子被清除出剩余的靶分子或者樣品物質(zhì)，或復(fù)位，這是通過(guò)向模板分子施加電激勵(lì)并誘導(dǎo)變性或者解離。
在一個(gè)實(shí)施例中，1040之后，方法返回1005以檢測(cè)和鑒定另外的樣品。
圖11表示包括串行測(cè)試樣品的方法1100。容易理解，也可以用其他測(cè)試順序以及并行測(cè)試。例如，諧振頻率變化、諧振振幅和電導(dǎo)的測(cè)試可以同時(shí)進(jìn)行。在方法1100中，初始狀態(tài)或者基線在1105建立。
在1110，確定由于模板分子與靶分子的雜交引起的傳感器位移。在1115，確定諧振偏移。該偏移可以對(duì)應(yīng)諧振頻率或者諧振振幅的變化。在1120，確定模板分子與靶分子的電導(dǎo)率。在1125，通過(guò)監(jiān)測(cè)峰值信號(hào)確定解離電流或者熱水平。
圖12表示在具有公共基座1210的襯底1205上制造的懸臂傳感器陣列。其中有些懸臂被標(biāo)記為1240A、1240B、1240C和1240D，懸臂的一端與基座1210相連并且通過(guò)模板分子分別被束縛到襯底1205表面上的接觸點(diǎn)1245A、1245B、1245C和1245D。在一個(gè)實(shí)施例中，模板分子都是同樣的組分，并為測(cè)試提供一個(gè)冗余水平。在一個(gè)實(shí)施例中，至少兩種模板分子是不同的，并被定制為檢測(cè)和鑒定不同的靶分子。
利用多路復(fù)用器1220通過(guò)導(dǎo)電體1235A和1235B將每個(gè)懸臂比如1240A與控制器1215偶聯(lián)?？刂破?215選擇性地施加測(cè)試電流、電壓、驅(qū)動(dòng)信號(hào)或者其他信號(hào)，以使每個(gè)懸臂檢測(cè)和鑒定靶分子?？刂破?215的電源1225提供恒定或者斜變的激勵(lì)電壓或者電流。在一個(gè)實(shí)施例中，電源1225提供變性電流或者電壓。在一個(gè)實(shí)施例中，電源1225為每個(gè)懸臂提供驅(qū)動(dòng)信號(hào)以激勵(lì)諧振。
接口1230與控制器1215偶聯(lián)，并提供數(shù)據(jù)輸入和數(shù)據(jù)輸出。在各種實(shí)施例中，接口1230包括顯示器、觸摸屏、鍵盤、小鍵盤、鼠標(biāo)或者其他指針控制，音頻轉(zhuǎn)換器、存儲(chǔ)設(shè)備、打印機(jī)、網(wǎng)絡(luò)連接(例如，廣域網(wǎng)如因特網(wǎng)，或者局域網(wǎng)如內(nèi)聯(lián)網(wǎng))、電連接器或者無(wú)線收發(fā)機(jī)。
圖13是根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的便攜設(shè)備1300實(shí)例。如圖所示，顯示器1305提供視頻提示和對(duì)應(yīng)于靶分子分析及設(shè)備狀況的數(shù)據(jù)。用戶易接近的控制裝置和數(shù)據(jù)輸入點(diǎn)包括電源鍵1310、試劑切口1315、樣品輸入1320和控制裝置1325。也可以包括其他控制裝置和輸入設(shè)備。在一個(gè)實(shí)施例中，設(shè)備1300上的可滲透表面允許用戶利用注射器或者其他注射設(shè)備遞送樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，1300表面的端口包括接收樣品的儲(chǔ)器。
圖示的設(shè)備1300是便攜的、用電池工作的設(shè)備，但是，也可以包括其他實(shí)施方案，例如包括具有接收樣品和提供輸出能力的桌面裝置。
實(shí)施例除了長(zhǎng)度或者力的可測(cè)量變化外，DNA結(jié)構(gòu)傳遞電流的能力與含量、序列、長(zhǎng)度和橋接電路化學(xué)環(huán)境有關(guān)。在一個(gè)實(shí)施例中，電導(dǎo)率與鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶水平有關(guān)。
在一個(gè)實(shí)施例中，121個(gè)堿基對(duì)(bp)的桿菌(Bacillus)基因組DNA序列分離自基因組、質(zhì)粒和λ病毒DNA。利用關(guān)于DNA特性(長(zhǎng)度、序列組成)和分析條件(氧化還原、pH、鹽、變性劑和雜交促進(jìn)劑控制)和從桿菌分離的其他DNA(單鏈和雙鏈)、分子和遺傳變體以及E.coli DNA的大量變量，數(shù)據(jù)顯示了一致的結(jié)果。
通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶消化從桿菌基因組DNA分離研究片段并連接到pUC13質(zhì)粒克隆載體，用該載體轉(zhuǎn)化入作為親代菌株的大腸桿菌宿主。沿著質(zhì)粒插入片段的長(zhǎng)度創(chuàng)建隨機(jī)遺傳點(diǎn)突變文庫(kù)，并對(duì)含有與親代相比變化2％、19％和35％的插入片段的分離物進(jìn)行測(cè)序并用于進(jìn)一步分析。從宿主質(zhì)粒切出親代和變體插入物并用硫醇和生物素基團(tuán)化學(xué)修飾5’和3’端。利用親和色譜(基于生物素修飾)分離單鏈DNA，并附著在包被鏈親和素和金的導(dǎo)電原子力顯微鏡(AFM)尖端與工作臺(tái)之間，AFM尖端最初是不偏斜的。在一個(gè)實(shí)施例中，由于單鏈DNA和其互補(bǔ)鏈雜交，它的有效長(zhǎng)度減小40％。
在將DNA互補(bǔ)鏈(在雜交溶液中)或者遺傳變體引入到束縛DNA模板的幾秒鐘內(nèi)，即可觀察到AFM尖端的位移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一致的尖端位移(＜0.5％COV)是模板與互補(bǔ)鏈錯(cuò)配程度的函數(shù)?？梢哉J(rèn)為，堿基對(duì)錯(cuò)配對(duì)整體螺旋結(jié)構(gòu)的形成沒(méi)有貢獻(xiàn)，因此減小了分子長(zhǎng)度的減少。
利用AFM導(dǎo)電尖端來(lái)確定電導(dǎo)率。相同的121bp片段束縛在AFM尖端和工作臺(tái)之間，并引入DNA互補(bǔ)鏈。作為固定電壓下的時(shí)間函數(shù)測(cè)量電流(納安)。
在引入互補(bǔ)DNA之前，施加電壓導(dǎo)致流過(guò)束縛ssDNA的穩(wěn)定或者基線電流(約0.3nA)。用DNA核酸酶處理束縛ssDNA導(dǎo)致?lián)p失該基線電流，熱處理的核酸酶不導(dǎo)致電流損失。
由于如果ssDNA保持束縛于MEMS移動(dòng)元件則電流將流動(dòng)，所以通過(guò)傳感器的可測(cè)量電流提供傳感器功能驗(yàn)證(傳感器自檢)。束縛ssDNA和它的互補(bǔ)鏈之間雜交后，如圖所示出現(xiàn)電流增加。此外，圖中示出測(cè)量電流和鏈間匹配程度之間的關(guān)系。雜交后，只要電壓施加在傳感器位置上，電流即維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。
雜交后，增加施加電壓，電流將相應(yīng)增加到峰值。對(duì)這種特定的121bp片段來(lái)說(shuō)，束縛ssDNA和互補(bǔ)鏈變性發(fā)生在約4.1伏電勢(shì)。與變性相關(guān)的電流量隨束縛ssDNA和互補(bǔ)鏈之間的匹配程度變化。與電流下降同時(shí)發(fā)生，AFM尖端返回未偏轉(zhuǎn)位置?？梢哉J(rèn)為，較高水平的電流向雜交鏈提供充分的能量，使得它們能不再保持雜交，盡管其他機(jī)理或者因素也可解釋這種現(xiàn)象。變體中存在的堿基對(duì)錯(cuò)配表現(xiàn)為在鏈上引入隔離位置，由此成比例地降低導(dǎo)電性。
在一個(gè)實(shí)施例中，選擇用于橋接電路或者懸臂結(jié)構(gòu)的模板分子比如特定DNA影響DNA特異性、長(zhǎng)度、序列、組成和電導(dǎo)率。在一個(gè)實(shí)施例中，從病原體的多個(gè)遺傳區(qū)域選擇用于束縛的ssDNA可增強(qiáng)檢測(cè)和鑒定的特異性。在一個(gè)實(shí)施例中，較長(zhǎng)的DNA片段提供增強(qiáng)的特異性(對(duì)特定生物因子靶獨(dú)特的DNA序列)。在一個(gè)實(shí)施例中，較短的DNA片段允許選擇高鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的區(qū)域。GC總體組成和序列提供腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的隔離特性。DNA中高AT含量導(dǎo)致非柔性，以及依賴于富含AT區(qū)域的相對(duì)定位而造成整體分子彎曲(即處于含螺旋旋轉(zhuǎn)的狀態(tài))。在各種實(shí)施方案中，選擇的DNA片段具有超過(guò)40％的GC，或者超過(guò)60％的GC。DNA片段長(zhǎng)度因此小于500個(gè)堿基對(duì)(bp)，或者小于150-200個(gè)堿基對(duì)(bp)。利用商業(yè)和公開(kāi)軟件比如PubMed BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)確定DNA的GC組成、序列和特異性?？色@得其他軟件用于建立一級(jí)分子參數(shù)與高級(jí)特性(即柔性、曲率)之間的關(guān)聯(lián)性。在一個(gè)實(shí)施例中，利用軟件算法來(lái)選擇模板分子。
其他實(shí)施例在一個(gè)實(shí)施例中，傳感器包括包括懸臂的懸部件。模板分子附著在接觸點(diǎn)上，至少一個(gè)接觸點(diǎn)位于懸部件上。在各種實(shí)施例中，懸臂是彎曲、圓形或者網(wǎng)狀。在一個(gè)實(shí)施例中，懸部件是能繞軸轉(zhuǎn)動(dòng)的旋轉(zhuǎn)部件。作為旋轉(zhuǎn)部件，當(dāng)模板分子和靶分子結(jié)合時(shí)，接觸點(diǎn)沿著弧線移動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)部件的一端旋轉(zhuǎn)，同時(shí)另一端靜止，或者朝相反的方向旋轉(zhuǎn)或在較小范圍旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)部件兩個(gè)端點(diǎn)間的相位差提供用于區(qū)分靶分子的差別信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施例中，模板分子具有超過(guò)一個(gè)對(duì)靶分子特異的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，靶分子有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)對(duì)不同靶分子具有特異性。在一個(gè)實(shí)施例中，靶分子有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)對(duì)單個(gè)靶分子具有特異性。
在一個(gè)實(shí)施例中，傳感器上提供多個(gè)接觸點(diǎn)，模板分子與多個(gè)接觸點(diǎn)中的兩個(gè)或者多個(gè)結(jié)合。例如，雙末端的模板分子可以和具有兩個(gè)、三個(gè)或者更多個(gè)接觸點(diǎn)的傳感器結(jié)合。作為另一個(gè)實(shí)施例，有三個(gè)末端的模板分子可以和具有兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或者更多個(gè)接觸點(diǎn)的傳感器結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)生的輸出信號(hào)是物理參數(shù)測(cè)量變化的函數(shù)。物理參數(shù)包括結(jié)構(gòu)以及電參數(shù)。結(jié)構(gòu)參數(shù)的實(shí)例包括位置變化比如物理位移、諧振頻率、諧振振幅、接觸點(diǎn)和參考點(diǎn)的物理對(duì)準(zhǔn)程度或定向、施加在軸上的力、生成的熱和包括顏色在內(nèi)的光學(xué)變化。也包括其他物理參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)生的輸出信號(hào)是電參數(shù)測(cè)量值變化的函數(shù)。電參數(shù)的實(shí)例包括阻抗、電導(dǎo)率、電阻率、電感、電容。此外，在輸入信號(hào)存在下電參數(shù)也可描述為輸出信號(hào)。比如，在模板分子上傳導(dǎo)的電流的變化可導(dǎo)致電壓的變化。此外，施加在模板分子上的電壓可導(dǎo)致電流的變化。也可施加其他驅(qū)動(dòng)信號(hào)，測(cè)量的響應(yīng)可用于產(chǎn)生輸出信號(hào)。也包括其他電參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施例中，物理參數(shù)包括電導(dǎo)率的測(cè)量。電導(dǎo)率是對(duì)電子在物質(zhì)中流動(dòng)的度量。電導(dǎo)率是電阻率或者電阻的倒數(shù)，在一個(gè)實(shí)施例中，監(jiān)測(cè)的物理參數(shù)包括電阻。
在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)由寡核苷酸引物結(jié)合的ssDNA模板分子橋接基于電子MEMS的電路。與靶分子(比如DNA)雜交源自待鑒定的微生物，并引起懸臂元件間距離的縮小。
在各種實(shí)施例中，比較器或者惠斯通電橋用于檢測(cè)、鑒定和比較電壓水平、電流水平、電導(dǎo)率或者其他參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)加熱模板和靶分子使模板分子變性。加熱水平通過(guò)測(cè)量電流、電壓或者功率來(lái)定量。在一個(gè)實(shí)施例中，加熱水平差異與靶分子身份相關(guān)。
在一個(gè)實(shí)施例中，單個(gè)傳感器位點(diǎn)包括微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)芯片上與移動(dòng)元件橋接的束縛、單鏈DNA(ssDNA)。在一個(gè)實(shí)施例中，幾百幾千個(gè)這樣的位點(diǎn)分布在單個(gè)芯片上。選擇束縛ssDNA與從感興趣生物因子提取的互補(bǔ)鏈雜交，產(chǎn)生的雜交改變束縛分子的物理長(zhǎng)度，還改變束縛分子的電導(dǎo)率。這些變化在MEMS系統(tǒng)中以高信噪比被測(cè)量。變化的程度與束縛和生物因子DNA鏈之間的匹配程度有關(guān)。因此，可以測(cè)量生物因子的變化程度(特異性)。在檢測(cè)、鑒定和區(qū)分被確認(rèn)后，增加通過(guò)分子中電流將生物因子DNA鏈排出束縛鏈，由此復(fù)位傳感器用于隨后的測(cè)試事件。由于束縛ssDNA(沒(méi)有其互補(bǔ)鏈)能傳導(dǎo)可測(cè)量的電流，因此通過(guò)自檢來(lái)驗(yàn)證傳感器的可用性。
物理參數(shù)的變化與模板分子和靶分子(或者DNA鏈)間的匹配忠實(shí)度成比例。單個(gè)核苷酸錯(cuò)配產(chǎn)生可測(cè)量的變化，由此能夠鑒定多種病原體并區(qū)分特定菌株間的細(xì)微變化。
在一個(gè)實(shí)施例中，模板分子包括ssDNA。在一個(gè)實(shí)施例中，炭疽桿菌的特定DNA區(qū)域被擴(kuò)增并功能化。傳感器可通過(guò)來(lái)自任何生物因子(細(xì)菌、病毒或者真菌)的DNA橋接。
在一個(gè)實(shí)施例中，選擇炭疽桿菌(Bacillus anthracis(Ames))的4個(gè)150-200堿基對(duì)(bp)片段用作DNA橋接模板。在一個(gè)實(shí)施例中，為了測(cè)試系統(tǒng)區(qū)分菌株的能力，設(shè)計(jì)模板中一種的替代序列。通過(guò)隨機(jī)核苷酸替換產(chǎn)生與親代差異2％、10％和20％的變體。模板分子的選擇基于計(jì)算特異性、電導(dǎo)率參數(shù)和柔性。從16S rRNA指紋和毒力基因中選擇物種和菌株特異性片段。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)商業(yè)DNA合成設(shè)備合成4種選擇的150-200bp模板和變體。所述150-200bp DNA模板和變體合成為～50bp ssDNA片段。用雜交和連接步驟產(chǎn)生全長(zhǎng)150-200bp的模板。模板被連接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)?？寺≥d體中并在準(zhǔn)備大規(guī)模質(zhì)粒生產(chǎn)中生成DNA橋接模板文庫(kù)。任選地，通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶消化切出150-200bp候選模板或從炭疽桿菌(Ames)DNA中PCR擴(kuò)增并亞克隆。
在一個(gè)實(shí)施例中，DNA橋接模板經(jīng)由生物素-鏈親和素和硫醇-金鍵合共價(jià)地附著在AFM和MEMS表面。攜帶模板的質(zhì)粒被限制性核酸內(nèi)切酶切割并用商品試劑盒進(jìn)行5’-/3’-生物素/硫醇末端標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，用生物素和硫醇標(biāo)記的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增模板。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)商業(yè)轉(zhuǎn)包的DNA測(cè)序服務(wù)來(lái)驗(yàn)證DNA模板和變體的序列完整性。每個(gè)分子的特異性通過(guò)對(duì)炭疽桿菌菌株(即Ames、Sterne、A2012、1055、Vollum、Kruger)和炭疽模擬物(simulant)(即B.globigii、B.cereus、B.subtilis、B.thuringiensis)的基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)Southern篩選來(lái)驗(yàn)證，這些菌株從American TypeCulture Collection購(gòu)得或通過(guò)材料轉(zhuǎn)讓協(xié)議或其它合作者獲得。
在一個(gè)實(shí)施例中，原子力顯微鏡(AFM)用于測(cè)量炭疽桿菌和變體ssDNA片段的特定物理性質(zhì)(即位移和電導(dǎo)率)。AFM尖端和工作臺(tái)包被金和鏈親和素，硫醇/生物素末端標(biāo)記的DNA橋接模板附著到上面。在與互補(bǔ)鏈和變體ssDNA分子雜交之前、之中和之后測(cè)量AFM尖端的位移和材料電特性，并作為MEMS設(shè)備設(shè)計(jì)的輸入。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇用于控制雜交(pH緩沖劑、鹽)、變性、水解和核苷酸氧化的試劑。
在一個(gè)實(shí)施例中，MEMS制造技術(shù)用于構(gòu)建傳感器芯片。在一個(gè)實(shí)施例中，制造需要將材料薄膜沉積在襯底上、用光刻方法將帶有圖案的掩模敷在材料上以及利用所產(chǎn)生的顯影掩模選擇性蝕刻膜。利用基于化學(xué)反應(yīng)的方法(化學(xué)氣相沉積、外延生長(zhǎng)、電沉積或加熱氧化)或者基于物理反應(yīng)的方法(蒸發(fā)、濺射或鑄造)來(lái)實(shí)現(xiàn)將材料沉積在襯底(硅晶片)上。通過(guò)蝕刻技術(shù)來(lái)完成材料的去除。因此，使用施加帶有圖案的光刻掩模，適當(dāng)使用施加絕緣和導(dǎo)電材料層來(lái)構(gòu)建設(shè)備的電路。制造設(shè)備將芯片集成到封裝中，在一個(gè)實(shí)施例中，所述封裝包括芯片的陶瓷或者塑料外殼，所述芯片包括連接到印刷電路板(PCB)上的引腳接口。
在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)制造MEMS芯片時(shí)，DNA橋接模板被產(chǎn)生并檢驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，MEMS移動(dòng)單元(懸臂端)包括硫醇/金和生物素/鏈親和素的共價(jià)鍵。單個(gè)分子的附著通過(guò)靜電吸引來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，該設(shè)備在移動(dòng)MEMS單元間隙施加5伏電壓，其中期望束縛ssDNA與10MΩ的電阻串聯(lián)。ssDNA分子被吸引到形成的電場(chǎng)中。當(dāng)足夠接近時(shí)，在襯底基座上形成生物素-鏈親和素鍵，并且金-硫醇鍵在懸臂自由端形成。當(dāng)一個(gè)分子以這種方式附著時(shí)，間隙電壓將由于電路中串聯(lián)電阻而減小。因此，單個(gè)ssDNA分子附著在每個(gè)位點(diǎn)上。其余不橋接MEMS電路的過(guò)量DNA由DNA核酸外切酶消化去除。該電路保存在DNA穩(wěn)定緩沖液(即300mMNaCl，10mM檸檬酸鈉和5mM EDTA)中。
在一個(gè)實(shí)施例中，利用集成電路放大器來(lái)測(cè)量納安培級(jí)電流。利用多路復(fù)用集成電路(IC)放大器和其他電子器件及處理方法來(lái)顯示感測(cè)事件的結(jié)果。從MEMS芯片提取的模擬信號(hào)被放大并轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施例中，印刷電路板包括用于附著MEMS芯片和IC芯片的安排。該電路板還包括專門的主處理芯片，用于執(zhí)行計(jì)算和控制PCB板上的電操作。該P(yáng)CB板包括用于顯示和電池以及菜單鈕的電接口。在一個(gè)實(shí)施例中，由主處理器執(zhí)行的程序利用來(lái)自IC的數(shù)字信號(hào)提供顯示。用戶接口包括顯示和設(shè)置參數(shù)的控制，所述參數(shù)確定顯示特性、檢測(cè)閾值、電池水平、開(kāi)/關(guān)和病原體分子清除控制。
在一個(gè)實(shí)施例中，塑料外殼包含印刷電路板(和附著的生物和IC芯片)、樣品流路、LCD顯示和控制鈕。在一個(gè)實(shí)施例中，外殼內(nèi)壁包含突出部和溝槽，用于容納電子元件和防止殼內(nèi)的偏移。在一個(gè)實(shí)施例中，外殼包括一個(gè)或多個(gè)用于引導(dǎo)和清除試劑和樣品的流路。
在一個(gè)實(shí)施例中，利用AFM技術(shù)，通過(guò)傳感器位點(diǎn)的電流大于0.2nA。在一個(gè)實(shí)施例中，集成電路提供模擬信號(hào)放大＞10mV峰峰值。
在一個(gè)實(shí)施例中，配置傳感器用于檢測(cè)和鑒定制備的炭疽桿菌菌株和炭疽模擬物(simulant)(即B.globigii，B.cereus，B.subtilis，B.thuringiensis)的基因組DNA、化學(xué)和/或機(jī)械(超聲)破碎滅活的前述炭疽菌株和模擬物的全細(xì)胞和孢子、普通污染物和干擾物如郵寄灰塵、土壤成分、其他化學(xué)混合物和微生物混合體(mixedconsortia)存在下的DNA和全細(xì)胞/孢子。
在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)包括信號(hào)放大、處理和顯示部分，足以檢測(cè)和鑒定靶分子。在一個(gè)實(shí)施例中，電子控制包括開(kāi)/關(guān)、模式、顯示控制、電池壽命、自檢和復(fù)位功能。在一個(gè)實(shí)施例中，該系統(tǒng)包括一個(gè)或者多個(gè)流路，用于向傳感器表面?zhèn)魉椭苽浜玫臉悠罚鰝鞲衅髋渲贸设b定破碎溶液中的單個(gè)預(yù)先確定的病原體、模擬物或DNA靶變體。
在一個(gè)實(shí)施例中，利用表面擦拭或者批空氣收集器在系統(tǒng)外收集樣品。
本系統(tǒng)包括用于確定包含生物或化學(xué)分析物的靶物質(zhì)的存在、身份或數(shù)量的方法和裝置。在一個(gè)實(shí)施例中，包括生物-電子懸臂的至少一個(gè)可偏移臂的電子線路經(jīng)表面處理以輔助結(jié)合到模板聚合物分子上，對(duì)環(huán)境變化如存在與待檢測(cè)靶物質(zhì)結(jié)合的靶分子作出應(yīng)答時(shí)，所述模板聚合物分子經(jīng)歷物理參數(shù)的可測(cè)量變化。例如，模板分子在物理結(jié)構(gòu)或者尺寸上的變化被轉(zhuǎn)變?yōu)閼冶哿旱钠?。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)單鏈DNA橋接模板與其互補(bǔ)鏈的雜交來(lái)檢測(cè)通過(guò)模板分子的電特性的變化。測(cè)量這種物理性質(zhì)或者參數(shù)方面的變化以提供與感興趣的物質(zhì)存在和身份相關(guān)的信息。在一個(gè)實(shí)施例中，提供多個(gè)由相似模板分子橋接的這種電路，并可獲得與靶物質(zhì)濃度或量相關(guān)的信息。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供具有定制用于生物因子檢測(cè)設(shè)備中的幾何結(jié)構(gòu)的微電路，用于檢測(cè)靶和相關(guān)生物因子或物質(zhì)的存在。
用于本文的靶分子可以是任意分子，只要該分子能結(jié)合生物因子或生物因子的成分，或可以對(duì)生物因子或生物因子成分的存在或結(jié)合作出反應(yīng)。因此，模板分子可包含天然存在或合成的生物分子，該生物分子將、或能夠、選擇性應(yīng)答、或結(jié)合到、與待檢測(cè)靶物質(zhì)結(jié)合的靶分子。在一個(gè)實(shí)施例中，靶分子包括抗體、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、糖蛋白或聚合物。在一個(gè)實(shí)施例中，選用于檢測(cè)特定靶分子(或者靶分子的種或?qū)?存在的特定模板分子這樣選擇，使得模板分子僅與正確的靶分子或者相關(guān)的靶分子作出反應(yīng)或結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，差異電流或者物理位移源于模板和靶之間的生物分子-生物分子識(shí)別。因此，模板分子和靶分子間的關(guān)系可以是核酸(包括核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)和衍生分子)互補(bǔ)鏈的關(guān)系。模板分子和靶分子間關(guān)系的另外實(shí)例包括核酸-核酸識(shí)別、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)識(shí)別、蛋白質(zhì)-核酸識(shí)別、蛋白質(zhì)-碳水化合物識(shí)別、核酸-碳水化合物識(shí)別和碳水化合物-碳水化合物識(shí)別。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供含有所述電路的生物檢測(cè)設(shè)備，所述電路包括跨越兩個(gè)表面之間間隙的模板分子。在一個(gè)實(shí)施例中，這兩個(gè)表面相互之間可相對(duì)移動(dòng)。當(dāng)模板分子暴露于靶分子或與靶分子結(jié)合時(shí)，該模板分子發(fā)生尺寸上的變化，改變兩個(gè)表面之間的距離。因此，當(dāng)檢測(cè)到兩個(gè)表面之間距離的變化時(shí)，依據(jù)本發(fā)明該實(shí)施方案的生物檢測(cè)設(shè)備能夠發(fā)出靶或者相關(guān)生物因子或物質(zhì)存在的信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施例中，表面間距離變化的量是暴露于模板分子或與模板分子結(jié)合的分子的指標(biāo)。比如，與模板分子準(zhǔn)確匹配的靶分子(即“正確靶分子”)可導(dǎo)致連接兩個(gè)表面的模板分子的點(diǎn)間距離的縮短，這個(gè)縮短的量比當(dāng)模板分子與相關(guān)分子而不是與其準(zhǔn)確匹配的分子結(jié)合時(shí)發(fā)生的縮短量大。因此，通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)表面間距離的變化量，可獲得與模板分子結(jié)合的分子的身份相關(guān)的信息。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供含有能夠測(cè)量跨模板分子電導(dǎo)率的電路的生物檢測(cè)設(shè)備。具體地，模板分子與第一和第二電極相互連接，由此模板分子跨越兩個(gè)電極間的間隙。當(dāng)模板分子與靶分子結(jié)合時(shí)，電極間的電導(dǎo)率發(fā)生改變。因此，通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)電極間電導(dǎo)率的變化，可檢測(cè)到靶分子或者相關(guān)分子的存在。此外，電極間電導(dǎo)率的變化量是與模板分子結(jié)合的分子的指標(biāo)。例如，與模板分子與相關(guān)的而不是完全等同于正確靶分子的靶分子產(chǎn)生的電導(dǎo)率變化相比，正確的靶分子會(huì)導(dǎo)致電極間觀察到的導(dǎo)電率的更大變化。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供一種可再利用的、無(wú)需替換部件的檢測(cè)裝置。具體地，通過(guò)加熱模板分子，靶或者相關(guān)分子能夠從模板分子解離。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)向模板分子(和結(jié)合分子)通電流來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)模板分子的加熱。此外，將靶分子與模板分子解離的過(guò)程可用于獲得與靶分子身份相關(guān)的信息。具體地，施加于模板分子(和靶分子)的電流可穩(wěn)定增加或逐步增加，直到觀察到電導(dǎo)率的突然變化，這指示靶分子已經(jīng)與模板分子解離。因?yàn)榻怆x靶分子所需的電流和因此產(chǎn)生的熱與靶分子和模板分子的匹配緊密程度相關(guān)，所以解離靶分子所需電流的量指示結(jié)合分子和靶分子間匹配的緊密程度。例如，正確靶分子需要更多能量以將其與模板分子解離，而將模板分子和與所述靶分子不同的分子解離就不需要那么多的能量。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供包含組合多種檢測(cè)機(jī)理或技術(shù)的電路的生物因子檢測(cè)設(shè)備。例如，通過(guò)檢測(cè)模板分子經(jīng)歷的尺寸變化、通過(guò)檢測(cè)通過(guò)模板分子的電導(dǎo)率的變化、或者通過(guò)確定將靶分子與模板分子解離需要的電流量，檢測(cè)設(shè)備可確定靶生物因子的存在。此外，利用這些機(jī)理或技術(shù)可提供鑒定靶分子的信息。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供一種通過(guò)檢測(cè)與模板分子相關(guān)的物理尺寸的變化來(lái)檢測(cè)靶物質(zhì)或者分析物的方法。根據(jù)這種方法，當(dāng)和靶分子結(jié)合時(shí)發(fā)生物理尺寸變化的模板分子可暴露于懷疑的生物因子或者靶物質(zhì)(即懷疑包含靶分子的物質(zhì))。待檢生物因子可來(lái)源于氣態(tài)、液態(tài)或者固態(tài)介質(zhì)。如果正確靶分子或者相關(guān)分子與模板分子結(jié)合，可檢測(cè)到模板分子所產(chǎn)生的尺寸變化，并報(bào)告這種變化。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，該方法包括測(cè)量模板分子物理尺寸變化的量。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供一種通過(guò)感測(cè)在分析物存在下與模板分子相關(guān)的電導(dǎo)率變化來(lái)檢測(cè)靶物質(zhì)的方法。能夠選擇性與正確靶分子或者相關(guān)靶分子結(jié)合的模板分子暴露于生物因子。根據(jù)該方法，監(jiān)測(cè)通過(guò)模板分子的電導(dǎo)率。當(dāng)變得與靶分子結(jié)合時(shí)，檢測(cè)通過(guò)模板分子的電導(dǎo)率的變化結(jié)果，并報(bào)告該結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)量電導(dǎo)率的變化。
在一個(gè)實(shí)施例中，提供一種通過(guò)確定將靶分子與模板分子解離需要的能量來(lái)檢測(cè)待檢生物因子存在的方法。電流通過(guò)模板分子-靶分子對(duì)。此外，可以增加電流強(qiáng)度，直到觀察到通過(guò)模板分子的電導(dǎo)率突然變化，這指示靶分子已經(jīng)與模板分子解離。而且，靶分子與模板分子解離的電流用于表征或者鑒定與模板分子結(jié)合的靶分子。
本系統(tǒng)涉及檢測(cè)和鑒定生物分析物。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)感測(cè)模板生物分子的變化來(lái)檢測(cè)靶分子。模板生物分子的變化可包括模板分子物理尺寸的變化、觀察到的通過(guò)模板分子的電導(dǎo)率的變化、和/或?qū)蟹肿优c模板分子解離所需的能量?？蓽y(cè)量物理尺寸的變化幅度、電導(dǎo)率的變化或者將靶分子與模板分子解離所需的能量，以確定靶分子與模板分子間的同源性程度。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)方法和裝置，用于多次讀取而無(wú)需替換部件。
在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)包括生物組分或者生物組分的代表物的模板分子將電路橋接。在一個(gè)實(shí)施例中，該電路包括通過(guò)核酸分子如DNA分子或者物理和化學(xué)表現(xiàn)為單鏈DNA分子的分子來(lái)橋接的基于MEMS的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)橋接DNA分子與其互補(bǔ)物雜交或者接近互補(bǔ)的DNA鏈雜交時(shí)，該MEMS電路感測(cè)并響應(yīng)橋接DNA分子的運(yùn)動(dòng)和電導(dǎo)率。
下面描述生物-電子線路的生物組分的選擇和設(shè)計(jì)。
當(dāng)用于本文中時(shí)，生物檢測(cè)和鑒定設(shè)備的特異性是指系統(tǒng)特異性和精確性鑒定靶生物因子的具體屬、種和菌株的能力。在基于DNA的生物檢測(cè)器/鑒定器的情況下，術(shù)語(yǔ)特異性有時(shí)指系統(tǒng)的DNA組分與從生物因子分離的DNA特異性互補(bǔ)和雜交的能力。為了增強(qiáng)檢測(cè)和鑒定特異性，在此，選擇多個(gè)(在一個(gè)實(shí)施例中超過(guò)3個(gè))生物因子DNA片段。所述DNA片段選擇基于橋接MEMS電路的分子的計(jì)算長(zhǎng)度、特異性、電導(dǎo)率參數(shù)和柔性。越長(zhǎng)的DNA片段趨于保持越大的特異性(對(duì)特定生物因子靶獨(dú)特的DNA序列)，而較短的DNA片段允許選擇高鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的區(qū)域。GC整體組成和序列與腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的絕緣特性相關(guān)。另外，根據(jù)富含AT區(qū)域(即處于螺旋旋轉(zhuǎn)狀態(tài))的相對(duì)位置，DNA中的高AT含量導(dǎo)致非柔性和整體分子彎曲。因此，選擇的DNA片段可含有多于40％的GC，或者多于60％的GC。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA片段的長(zhǎng)度小于500個(gè)堿基對(duì)(bp)，或者小于150-200個(gè)堿基對(duì)(bp)。通過(guò)多種私人、商業(yè)和可公開(kāi)獲取的軟件比如PubMedBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)來(lái)測(cè)定DNA的GC組成、序列、柔性、曲率和特異性。在一個(gè)實(shí)施例中，4個(gè)DNA模板片段與炭疽桿菌(Ames)是100％同源性的，與其他的桿菌屬菌種和菌株表現(xiàn)出較小同源性。菌種和菌株特異性片段從16S rRNA指紋和毒力基因中選擇。在這個(gè)實(shí)施例中，桿菌屬以外的微生物低于準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定的閾值。在一個(gè)實(shí)施例中，基質(zhì)包括具有與其他生物因子特異性的DNA組分的DNA橋接MEMS，在一個(gè)實(shí)施例中，能夠同時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)這些因子的存在。
下面描述生物-電子線路的生物組分的制造。
在一個(gè)實(shí)施例中，為了附著于MEMS電路，選擇、生成、大量生產(chǎn)和化學(xué)修飾靶生物因子的特異性DNA區(qū)域。此外，為了測(cè)試建議電路的區(qū)分能力，也生成并生產(chǎn)DNA區(qū)域的變體。在一個(gè)實(shí)施例中，變體是與選定DNA模板在核苷酸組成和序列方面有2％-30％差異的DNA分子。在一個(gè)實(shí)施例中，4個(gè)選擇的150-200bp片段或者被合成、PCR擴(kuò)增，或者從實(shí)際的靶生物因子中亞克隆。高忠實(shí)度DNA合成通常限制于～50bp ssDNA片段，為了產(chǎn)生期望的全長(zhǎng)150-200bp DNA模板，需要雜交和連接步驟。如果5’-和3’-～50bp合成片段用附著配體特異性標(biāo)記，則完成的DNA模板隨后直接附著在MEMS引線表面上。作為替代方案，完成的150-200bp模板被連接到質(zhì)?？寺≥d體中并且制備DNA橋接模板文庫(kù)，用于準(zhǔn)備大量生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，選用于橋接MEMS電路引線的選定DNA區(qū)域可以經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化切出或者從目標(biāo)生物因子中PCR擴(kuò)增和亞克隆。
下面描述生物組分完整性的驗(yàn)證。
在一個(gè)實(shí)施例中，驗(yàn)證DNA電路橋接模板和變體的序列完整性。序列完整性是指與期望序列比較的實(shí)際核苷酸序列。DNA測(cè)序方法將揭露將要被標(biāo)記和附著在MEMS引線表面的分子的正確核苷酸序列。本主題對(duì)單堿基對(duì)錯(cuò)配敏感，因此，應(yīng)該解釋任何序列變化。
下面描述生物組分的生化和物理性質(zhì)的測(cè)試和分析。
在一個(gè)實(shí)施例中，選擇、大量制造特定ssDNA分子，并用于橋接MEMS電路移動(dòng)元件。特定ssDNA分子的選擇基于多種生物物理性質(zhì)，如長(zhǎng)度、核苷酸組成和序列、柔性和機(jī)械運(yùn)動(dòng)、和電導(dǎo)率參數(shù)。計(jì)算的運(yùn)動(dòng)和電導(dǎo)率參數(shù)由能夠測(cè)量ssDNA橋接模板和變體ssDNA片段特定物理性質(zhì)(即由尖端位移和電導(dǎo)率測(cè)定的分子運(yùn)動(dòng))的原子力顯微鏡(AFM)來(lái)驗(yàn)證。根據(jù)公開(kāi)方法包被金和鏈親和素的AFM尖端和工作臺(tái)由硫醇/生物素末端標(biāo)記的DNA橋接模板來(lái)橋接。作為MEMS設(shè)備設(shè)計(jì)的輸入，在和互補(bǔ)鏈或者變體ssDNA分子雜交之前、之中和之后測(cè)量AFM尖端位移和物質(zhì)電特性。
對(duì)于特定ssDNA橋接模板可以考慮操作、化學(xué)和溫度環(huán)境。例如，用于控制用戶定義操作環(huán)境、操作溫度和DNA特異性雜交(pH緩沖劑、鹽)、變性、水解和核苷酸氧化的影響的試劑會(huì)有作用。在一個(gè)實(shí)施例中，操作試劑包括a.鹽、pH值、溫度b.水解控制通過(guò)水環(huán)境的電導(dǎo)率可以誘導(dǎo)可能對(duì)通過(guò)介質(zhì)的電導(dǎo)率產(chǎn)生影響的水解，通過(guò)添加合適的試劑控制這種影響。
c.氧化控制通過(guò)DNA的電導(dǎo)率可以引起氧化性破壞，尤其是對(duì)鳥(niǎo)嘌呤殘基。通過(guò)添加抗氧化劑(即抗壞血酸、檸檬酸)來(lái)控制這種氧化性破壞。
d.DNA熱穩(wěn)定因子(即0.5-3摩爾的甜菜堿(N，N，N，-三甲基甘氨酸；(Rees等人，Biochem.，(1993)32137-144)。
e.變性試劑(即2-4摩爾乙酸四乙基酯、尿素、離液鹽(即三氯乙酸鹽、高氯酸鹽、硫氰酸鹽和氟乙酸鹽)，或者甘油、甲酰胺、甲醛和二甲亞砜(DMSO)。
f.雜交促進(jìn)劑，通過(guò)分子排斥現(xiàn)象增強(qiáng)DNA對(duì)DNA的雜交；促進(jìn)劑實(shí)例包括醋酸鹽與醇、某些胺(精胺、亞精胺、多賴氨酸)、0.1-0.5摩爾去污劑(十二烷基三甲銨溴化物和十六烷基三甲銨溴化物)和特定的小蛋白質(zhì)如單鏈結(jié)合蛋白。
下面描述DNA特異性的驗(yàn)證。
在一個(gè)實(shí)施例中，驗(yàn)證DNA電路橋接模板和變體的序列特異性。用軟件分析選擇的DNA片段可證明所述片段對(duì)靶生物因子的一個(gè)菌株的一個(gè)區(qū)域的特異性，這可以通過(guò)生物因子特異性篩選來(lái)確認(rèn)。這些方法的一個(gè)實(shí)例包括Southern篩選，其中生物因子靶基因組(和任何其他待檢的相關(guān)種)的各種限制性消化片段被電泳分離并轉(zhuǎn)移到固相基質(zhì)(即尼龍或硝化纖維素)上。然后固定的基因組DNA片段可以與標(biāo)記(即熒光或放射性)的DNA橋接模板DNA一起孵育。在合適條件下(即溫度、pH值和鹽濃度)模板DNA將與單個(gè)片段(假設(shè)基因組DNA限制性消化物不切割片段)雜交。DNA模板與基因組DNA在多個(gè)位點(diǎn)雜交可能需要改變生物檢測(cè)設(shè)備的條件或者選擇新模板DNA。
下面描述DNA橋接模板末端標(biāo)記。
在一個(gè)實(shí)施例中，合成、PCR擴(kuò)增或者克隆的DNA片段(選擇用于橋接MEMS電路引線)通過(guò)DNA附著有機(jī)或無(wú)機(jī)表面的各種方法中任意方法附著在MEMS表面。在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)DNA橋接模板末端和MEMS引線表面的獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)交聯(lián)時(shí)，實(shí)現(xiàn)方向特異性固定。商品化學(xué)結(jié)構(gòu)特異性交聯(lián)劑通常基于親核取代化學(xué)。這種化學(xué)通常涉及通過(guò)攻擊親核試劑直接替換離去基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施例中，MEMS電路引線包括分別包被金和鏈親和素的引線。在一個(gè)實(shí)施方案中，ssDNA橋接模板經(jīng)由生物素-鏈親和素和硫醇-金結(jié)合共價(jià)地附著在AFM和MEMS表面上。用商品試劑盒或用標(biāo)記或功能化DNA的5’和3’末端的任意其他手段對(duì)DNA片段進(jìn)行5’/3’生物素/硫醇末端標(biāo)記。附著化學(xué)可包括但并不限于氨基(如N-羥基-琥珀酰亞胺酯)、聚乙二醇、碳二亞胺、硫醇基團(tuán)(如馬來(lái)酰亞胺或者α-鹵代乙?；?、有機(jī)-硅烷基團(tuán)、或生物素-鏈親和素。在一個(gè)實(shí)施例中，DNA片段用5’和3’生物素或者鏈親和素修飾的核苷酸合成，或者用生物素/鏈親和素標(biāo)記的引物從基因組或質(zhì)粒攜帶的DNA靶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
下面描述制造MEMS的實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施例中，微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)指利用在百萬(wàn)分之一米(微米)尺寸上構(gòu)造的小移動(dòng)結(jié)構(gòu)的技術(shù)。這些結(jié)構(gòu)利用多種工具和方法來(lái)制造，它們與集成電路(IC)制造的工具和方法類似。在一個(gè)實(shí)施例中，MEMS設(shè)備包括機(jī)械元件和電元件的組合，當(dāng)制造時(shí)，這些元件都放置在引腳封裝中，該封裝允許通過(guò)印刷電路板(PCB)上的插口來(lái)連接。
下面描述MEMS的層結(jié)構(gòu)。
通常，MEMS設(shè)備的制造涉及將薄膜材料沉積在襯底上、利用光刻法將具有圖案的掩膜覆蓋在材料上、和利用所產(chǎn)生的顯影掩膜選擇性蝕刻膜。利用基于化學(xué)反應(yīng)的方法(化學(xué)氣相沉積、外延生長(zhǎng)、電沉積或加熱氧化)或者基于物理反應(yīng)的方法(蒸發(fā)、濺射或鑄造)實(shí)現(xiàn)將材料沉積在襯底(通常是硅晶片)上。每種方法的速度、精度和處理成本不一樣；涂覆材料可以是幾納米至約100微米。涂覆圖案涉及將感光材料置于表面上，將成圖的掩膜定位在表面上(通常在表面和掩膜上對(duì)準(zhǔn)標(biāo)記的幫助下進(jìn)行)，以及將感光材料通過(guò)掩膜曝光。根據(jù)所用方法，可以去除曝光或未曝光的材料，在襯底物質(zhì)上留下圖案。其他程序包括準(zhǔn)備表面、顯影感光薄膜和清潔所得物。
MEMS元件制造可利用微制造技術(shù)來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施例中，使用半導(dǎo)體制造工藝，比如在玻璃、石英或者硅襯底上光學(xué)蝕刻、等離子體蝕刻或者濕化學(xué)蝕刻，將蝕刻技術(shù)應(yīng)用于制造中。
材料的去除典型地通過(guò)濕蝕刻來(lái)完成，其中當(dāng)浸入化學(xué)溶液中時(shí)材料被溶解；或者通過(guò)干蝕刻來(lái)完成，其中通過(guò)與基于物理反應(yīng)沉積基本相反的方法去除材料。當(dāng)用各種方法沉積時(shí)，方法的速度、精度和成本都有變化。在一個(gè)實(shí)施例中，以50比1的側(cè)壁深寬比來(lái)實(shí)施在襯底上蝕刻“深”口。
MEMS設(shè)備可制造成具有一個(gè)或者多個(gè)移動(dòng)元件，通過(guò)這些元件與ssDNA模板分子附著。能夠構(gòu)造移動(dòng)單元比如懸臂梁，使得梁和位于梁自由端下的襯底包含至少一個(gè)導(dǎo)電層。這樣，利用成圖光刻掩膜，可以用適當(dāng)涂覆絕緣和導(dǎo)電材料層來(lái)構(gòu)造設(shè)備的電路。在一個(gè)實(shí)施例中，幾何結(jié)構(gòu)允許樣品從一個(gè)DNA橋接MEMS流向下一個(gè)，并如此循環(huán)以提高接觸的概率和節(jié)約試劑。一個(gè)實(shí)施方案包括在支持物上構(gòu)造的電子電路，所述支持物由諸如玻璃、石英、硅和多種聚合物襯底如塑料的材料組成，但并不限于這些材料。
在一個(gè)實(shí)施例中，在襯底上提供多種絕緣層。在一個(gè)實(shí)施例中，用于支持和響應(yīng)所述分子特性(即電導(dǎo)率和運(yùn)動(dòng))的固體材料被用于構(gòu)造該設(shè)備。雖然本公開(kāi)文本中的附圖可描述該電路的平面定位，但其他實(shí)施方案包括其他定向(即垂直方向等)。
一個(gè)實(shí)施例包括覆蓋通道和儲(chǔ)器的附加平面元件，以包圍和密封從而形成管道。在某些帶電或親水襯底存在下，通過(guò)粘合劑、熱連接或者自然粘合連接這種附加平面。
在一個(gè)實(shí)施例中，樣品收集和準(zhǔn)備在設(shè)備外完成。用拭子或墊子收集表面上的樣品，或者利用抽吸通過(guò)過(guò)濾器、液體阱或者色譜樹(shù)脂在空氣中或者液體中收集樣品。通過(guò)加入試劑以破壞生物試因子、釋放靶分子并制備用于經(jīng)設(shè)備感測(cè)的那些分子，從而準(zhǔn)備那些樣品。然后利用注射器、移液器、滴眼器或者其他類似手動(dòng)或者自動(dòng)手段，將準(zhǔn)備好的樣品通過(guò)流通道、儲(chǔ)器或?qū)Ч芤朐O(shè)備。
一個(gè)實(shí)施例包括通過(guò)板上風(fēng)扇抽吸系統(tǒng)的自動(dòng)化操作由設(shè)備自己獲取和準(zhǔn)備空氣樣品。一個(gè)實(shí)施例包括自動(dòng)收集和準(zhǔn)備液體樣品進(jìn)入設(shè)備。樣品破壞可由機(jī)械手段如超聲技術(shù)來(lái)提供。
在一個(gè)實(shí)施例中，樣品通過(guò)與設(shè)備一體的流路傳輸?shù)缴镄酒谋砻?。該設(shè)備包括試劑儲(chǔ)器，用于樣品準(zhǔn)備以及系統(tǒng)沖洗、設(shè)備校準(zhǔn)和廢棄物收集。在一個(gè)實(shí)施例中，該設(shè)備包括將物質(zhì)泵送到儲(chǔ)器中或從儲(chǔ)器中泵出的手段。在一個(gè)實(shí)施例中，如果沒(méi)有陽(yáng)性感測(cè)事件發(fā)生并且反應(yīng)物保持合適純度，設(shè)備循環(huán)使用通過(guò)該系統(tǒng)的試劑。
在一個(gè)實(shí)施例中，在引線上形成寡核苷酸序列層，以協(xié)助DNA橋接模板定位和定向。通常，寡核苷酸指導(dǎo)的經(jīng)電路DNA雜交被用于單鏈DNA(ssDNA)橋接模板的定向和定位。在一個(gè)實(shí)施例中，ssDNA橋接模板經(jīng)由包括硫醇或者生物素結(jié)合的任意附著方法與MEMS引線結(jié)合。
多個(gè)DNA橋接MEMS電路可以矩陣或陣列幾何結(jié)構(gòu)定位于單個(gè)芯片上，以便能夠從相同樣品中同時(shí)檢測(cè)和鑒定多種病原體。在一個(gè)實(shí)施例中，矩陣包括相同DNA橋接MEMS的多個(gè)重復(fù)，使得可以作為單位體積樣品中“激勵(lì)”電路數(shù)量的函數(shù)來(lái)測(cè)量靶DNA分子濃度。
下面描述MEMS移動(dòng)元件的生物橋接。
包含移動(dòng)元件和電路的物理MEMS設(shè)備制造以后，感興趣的單個(gè)ssDNA分子(模板分子)連接到設(shè)備中。在一個(gè)具有懸臂梁的實(shí)施例中，ssDNA連接于懸臂自由端和懸臂下的襯底基座間。在一個(gè)實(shí)施例中，準(zhǔn)備表面以使模板ssDNA的功能化末端連接于表面。ssDNA一端用硫醇基團(tuán)功能化(對(duì)金表面具有高親和力)、另一端用生物素功能化(對(duì)包被鏈親和素的表面具有高親和力)。這樣，如果金用于懸臂底部表面的導(dǎo)體上，ssDNA硫醇功能化的一端將與之連接。位于懸臂自由端下的襯底金表面也被暴露。在引入待結(jié)合的ssDNA模板之前，將生物素靜電沉積在襯底的金表面。鏈親和素被引入晶片上，它與襯底上的生物素化表面結(jié)合。因此，MEMS設(shè)備的表面準(zhǔn)備好結(jié)合ssDNA模板。
下面描述橋接分子模板的靜電捕獲，在一個(gè)實(shí)施例中，包括將單個(gè)ssDNA分子連接于懸臂自由端和其下的制備的襯底基座的間隙之間。在一個(gè)實(shí)施例中，電壓被施加于間隙，其中與大電阻串聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，ssDNA分子被所產(chǎn)生的電場(chǎng)吸引。當(dāng)足夠接近時(shí)，在襯底基座上形成生物素-鏈親和素的結(jié)合，以及在懸臂自由端形成金-硫醇結(jié)合。一旦有一個(gè)分子以這種方式附著，由于電路中串聯(lián)電阻而使間隙電壓大大降低。因此，每個(gè)位點(diǎn)僅連接一個(gè)ssDNA分子。場(chǎng)輔助吸引ssDNA到MEMS引線臂-設(shè)備有助于單分子連接。靜電捕獲單個(gè)導(dǎo)電納米顆粒在納米電極之間(Electrostatic trapping of single conducting nanoparticles between nanoelectrodes.)。Appl.Phys.Lett.71(9)。
下面描述過(guò)量模板分子的去除。
某些情況下，即使只有一條鏈跨間隙連接，可以有多個(gè)ssDNA與或者金或者生物素化表面連接。這些“游離”物具有不期望的結(jié)合靶病原體ssDNA序列的能力。在一個(gè)實(shí)施例中，利用核酸外切酶處理設(shè)備，以去除所有沒(méi)有在兩端都連接的ssDNA，從而消除與非傳感器位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合事件的可能。
在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)包括另外的移動(dòng)元件，該元件橋接合成或生物分子，作為參考或基線對(duì)照用于消除機(jī)械、電或化學(xué)背景影響(如溫度、壓力、運(yùn)動(dòng)、雜散電壓、感應(yīng)電場(chǎng)、和/或樣品化學(xué)污染物)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述設(shè)備包括位于一個(gè)MEMS芯片上的數(shù)千個(gè)傳感器和參考位點(diǎn)。這些傳感器位點(diǎn)可以都包括檢測(cè)單個(gè)生物因子存在的生物元件，或者可以包括多種生物元件，以能夠在單個(gè)生物芯片上同時(shí)檢測(cè)多種生物因子。
下面描述將MEMS電路集成到信號(hào)放大、處理和顯示系統(tǒng)。測(cè)量納安培級(jí)的電流需要集成電路放大器。在一個(gè)實(shí)施例中，多路復(fù)用和集成電路(IC)放大器和其它電子組件和處理用于顯示感測(cè)事件的結(jié)果。集成電路用于放大來(lái)自MEMS芯片的模擬信號(hào)，并將它們轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施例中，IC制造將IC進(jìn)行封裝，以允許將IC的引腳連接到印刷電路板(PCB)上。除了提供MEMS和IC芯片的連接外，PCB包括主處理器，執(zhí)行計(jì)算和控制PCB上的電操作。PCB包括顯示和電池的電接口，以及菜單鈕的輸入/輸出。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)處理器進(jìn)行編程，以利用來(lái)自IC的數(shù)字信號(hào)輸出進(jìn)行顯示。用戶接口包括顯示的直接控制以及參數(shù)設(shè)置的控制，以確定顯示的特性、檢測(cè)閾值、電池水平，開(kāi)/關(guān)和生物因子分子清除的控制。在一個(gè)實(shí)施例中，PCB、顯示器、用戶接口、電池和輸入/輸出都集成在塑料或者金屬外殼內(nèi)。
下面描述示例性系統(tǒng)的測(cè)試和分析。其中一個(gè)實(shí)施例需要樣品收集、處理和向電子線路傳送。
a.樣品收集氣體、液體或者固體樣品的收集方法基于靶分子源和儀器的工作環(huán)境。例如，合適大小、質(zhì)量或者電荷的粒子可以通過(guò)過(guò)濾和/或質(zhì)譜方法分離并收集。過(guò)濾器捕獲的化學(xué)或者生物因子能夠被樣品準(zhǔn)備試劑洗脫并傳遞給儀器。在一個(gè)實(shí)施例中，采用儀器抽吸技術(shù)吸引或者迫使氣態(tài)樣品通過(guò)樣品準(zhǔn)備試劑并隨后傳遞給檢測(cè)芯片。
b.樣品準(zhǔn)備在一個(gè)實(shí)施例中，氣體、液體或者固體樣品在檢測(cè)設(shè)備外部準(zhǔn)備，或者利用自動(dòng)樣品準(zhǔn)備技術(shù)在內(nèi)部準(zhǔn)備。樣品準(zhǔn)備的具體步驟和試劑依賴于待檢測(cè)和鑒定的靶分子和來(lái)源?；瘜W(xué)、熱、和/或機(jī)械手段用于破裂生物細(xì)胞內(nèi)容物和釋放靶分子。相似手段被用于準(zhǔn)備先前準(zhǔn)備的有機(jī)或者無(wú)機(jī)來(lái)源的靶分子。通常，破壞生物細(xì)胞需要溶解脂質(zhì)膜的去污劑、酶促消化與細(xì)胞膜或靶分子結(jié)合的蛋白質(zhì)、和修飾或者其它準(zhǔn)備靶分子用于檢測(cè)和鑒定的各種變性劑。機(jī)械手段包括單獨(dú)或破碎珠存在下的超聲或攪拌。在一個(gè)實(shí)施例中，基于大小、親水性、電荷或者配體親和，用過(guò)濾或者色譜方法純化靶分子。在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)抵抗與靶來(lái)源結(jié)合的成分和其它環(huán)境污染物(即鹽、灰塵、溶劑或特別加入抑制正確檢測(cè)或鑒定的試劑)。在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)對(duì)與樣品結(jié)合的痕量靶分子敏感。在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)檢測(cè)和鑒定在DNA源(即微生物、動(dòng)物細(xì)胞、病毒)中發(fā)現(xiàn)、DNA源表面、或與DNA源結(jié)合的特定DNA片段。在一個(gè)實(shí)施例中，雙鏈DNA被片段化并變性。
c.向微芯片傳遞樣品。
d.發(fā)生檢測(cè)、鑒定和區(qū)分。
e.在設(shè)備上顯示結(jié)果。
本系統(tǒng)的應(yīng)用實(shí)例包括實(shí)時(shí)檢測(cè)、鑒定、區(qū)分和濃度測(cè)量來(lái)自源(包括但不限于在土壤、水或空氣中發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物、細(xì)菌、病毒、真菌、植物和古菌)的成分。成分實(shí)例包括但不限于與人類、植物或者動(dòng)物病原體相關(guān)的有機(jī)物(即由核酸、氨基酸或者碳水化合物等組成)或者無(wú)機(jī)物(即金屬、無(wú)機(jī)磷酸鹽等)、涉及食品安全的成分和源，涉及醫(yī)學(xué)疾病的成分和源、與疾病易感性相關(guān)的遺傳序列、植物和動(dòng)物疾病出現(xiàn)癥狀之前的診斷、列出的成分或源的實(shí)驗(yàn)室診斷工具、監(jiān)測(cè)特定RNA的基因表達(dá)和通過(guò)多態(tài)性ID鑒定特定動(dòng)物或人的實(shí)驗(yàn)室工具。
除了DNA-DNA間的相互作用，還包括其它替代方案，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)1)朊病毒蛋白質(zhì)和其他朊病毒的相互作用。牛海綿樣腦病(BSE，也稱作瘋牛病)，是牛的一種神經(jīng)退行性疾病，攝取受感染的肉制品導(dǎo)致人類克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)(CJD和vCJD)。已經(jīng)在動(dòng)物中鑒定出BSE的變型，所有變型都被歸類為傳染性海綿樣腦病(TSE)。牛BSE或者人類CJD是稱為朊病毒的神經(jīng)蛋白質(zhì)從正常形狀變形為錯(cuò)折疊的有傳染性的形狀時(shí)所產(chǎn)生的結(jié)果。這種錯(cuò)折疊傳染性的朊病毒然后誘導(dǎo)其他朊病毒蛋白質(zhì)也錯(cuò)折疊。本系統(tǒng)能夠檢測(cè)正常朊病毒以及傳染性形式的物理構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施例中，正常的朊病毒蛋白質(zhì)經(jīng)由表面暴露的半胱氨酸或組氨酸連接于包被金、鎳或鉑的MEMS表面。
2)抗體-抗原相互作用。在一個(gè)實(shí)施例中，MEMS電路的移動(dòng)元件與天然產(chǎn)生的或者合成的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)代表物(representation)橋接，所述抗體對(duì)來(lái)自特定生物或無(wú)機(jī)因子的抗原是特異性的。在一個(gè)實(shí)施例中，代表抗原結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸分子經(jīng)由上述與朊病毒類似的化學(xué)反應(yīng)附著在移動(dòng)MEMS表面上。生物因子抗原與橋接的抗原結(jié)合位點(diǎn)的相互作用誘導(dǎo)橋接元件的結(jié)構(gòu)變化，由此產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)。
蛋白質(zhì)-碳水化合物(糖蛋白的形成)1)細(xì)胞外糖表位和受體蛋白間的相互作用能夠被檢測(cè)和分析。這種生物過(guò)程的實(shí)例包括病毒和細(xì)菌傳染。一個(gè)實(shí)例模型是帶有甘露糖的刀豆(Canavalia ensiformis)蛋白質(zhì)伴刀豆球蛋白A(con A)(Acta Crystallogr.，Sect.D 50pp.847(1994))。一個(gè)實(shí)例包括經(jīng)由組氨酸或半胱氨酸殘基橋接MEMS電路的移動(dòng)單元和Con A。含葡萄糖的樣品結(jié)合并改變ConA蛋白質(zhì)的尺寸構(gòu)造，從而產(chǎn)生系統(tǒng)信號(hào)。包括這種電路的本系統(tǒng)在糖尿病控制中能夠檢測(cè)葡萄糖殘余物的存在和濃度。
2)糖脂類globotriaosyl神經(jīng)酰胺，在腎細(xì)胞表面表達(dá)，通過(guò)蛋白質(zhì)的五聚體“B”結(jié)合亞基之間的結(jié)合相互作用而作為志賀樣毒素(SLT1)的受體起作用，這種毒素是兩組分細(xì)菌毒素的成員。
碳水化合物-碳水化合物細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和細(xì)胞粘附力有時(shí)與碳水化合物與其他碳水化合物或糖蛋白間的相互作用有關(guān)(J Cell Biol.2004 May 24；165(4)529-37.2004 May 17)。糖鞘脂(GSL)的共相互作用似乎在小鼠黑素瘤細(xì)胞粘附方面起關(guān)鍵作用。一個(gè)實(shí)例系統(tǒng)包括為監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞生長(zhǎng)而創(chuàng)建具有GSL結(jié)合位點(diǎn)的糖蛋白結(jié)構(gòu)。
在一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)和生物檢測(cè)/鑒定系統(tǒng)需要樣品收集、樣品處理和傳送、樣品分析技術(shù)、和信號(hào)處理和輸出。
DNA鏈的強(qiáng)度和長(zhǎng)度取決于堿基組成、序列和環(huán)境。平均而言，dsDNA的直徑為20埃()，鄰近核苷酸間的距離為3.4或者整個(gè)一圈螺旋約為34。dsDNA螺旋表現(xiàn)出兩個(gè)溝小溝(～12埃)和大溝(～22埃)。而ssDNA中相鄰核苷酸的距離約為5.84埃。
分子收縮第一個(gè)物理現(xiàn)象與雙鏈DNA(dsDNA)所采用的螺旋形狀有關(guān)。單鏈DNA(ssDNA)通常是線狀物理結(jié)構(gòu)，每個(gè)核苷酸堿基的長(zhǎng)度約為5.84埃。(組成DNA鏈的單個(gè)構(gòu)造模塊(堿基)是鳥(niǎo)嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C))。一條DNA鏈與其互補(bǔ)鏈的匹配和結(jié)合(此過(guò)程稱為雜交)產(chǎn)生螺旋狀dsDNA結(jié)構(gòu)，其中核苷酸堿基間距離減小為3.4埃。因此，盡管ssDNA的50個(gè)堿基約為292埃，但相同數(shù)量的dsDNA核苷酸只有175埃(17.5nm)，或者DNA長(zhǎng)度期望平均減小約40％(由堿基組成、序列和環(huán)境決定)。這種長(zhǎng)度的減小是一種穩(wěn)定和物理可測(cè)量的事件。
此外，分子長(zhǎng)度總體變化的量還和第一(模板)ssDNA與第二(互補(bǔ)或靶)附著鏈間的匹配程度相關(guān)。在適當(dāng)條件下，不完全匹配的DNA鏈也可雜交。然而，對(duì)長(zhǎng)度縮短具有相應(yīng)更小的影響。因此，如果測(cè)量長(zhǎng)度變化，并且由于完全匹配引起的最大長(zhǎng)度變化是已知的，那么可以確定靶ssDNA和引入的ssDNA之間遺傳序列的變異程度。要求正確匹配的環(huán)境條件包括低鹽條件和高溫(20C A&T，40C G&C)條件。相反地，通過(guò)提高鹽條件和降低溫度可導(dǎo)致不完全匹配的DNA鏈(或者遺傳變體)間的雜交。
一個(gè)ssDNA分子與另一個(gè)的相互作用以及引發(fā)的物理構(gòu)象變化對(duì)本發(fā)明的功能至關(guān)重要。鏈-鏈間和亞基連接鍵合的總體強(qiáng)度是個(gè)體單元間吸引力組合的結(jié)果。這些吸引力包括氫鍵、堿基堆積作用、和促使堿基進(jìn)入內(nèi)部和磷酸基處于外部的疏水作用。認(rèn)識(shí)到結(jié)合能的確切測(cè)量值與相鄰核苷酸和環(huán)境條件(pH值、溫度、離子強(qiáng)度等)有關(guān)也是重要的。氫鍵增加4-7千卡/摩爾，堿基堆積增加3.8-14.6千卡/摩爾，磷酸二酯鍵的共價(jià)鍵能量(80-100千卡/摩爾)(referecences)。實(shí)驗(yàn)和理論研究證實(shí)，平均堿基組成和序列dsDNA的抗張強(qiáng)度約為5×10-12牛頓(kg/s2)(referecences)。這個(gè)力與單個(gè)細(xì)菌的重量大體一致；不過(guò)，前面提到的技術(shù)足夠精密，能夠精確施加這種力。
電導(dǎo)率與兩個(gè)匹配ssDNA再結(jié)合相關(guān)的第二個(gè)生理學(xué)現(xiàn)象是，雜交后ssDNA電導(dǎo)率顯著增加。大量研究工作已經(jīng)證實(shí)ssDNA能夠傳導(dǎo)電流。ssDNA的電導(dǎo)率高度依賴于遺傳序列的組成，鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶(G和C)趨于作為導(dǎo)體，而腺嘌呤和胸腺嘧啶(A和T)更趨于作為絕緣體(referecences)。
對(duì)于適當(dāng)富含G-C的序列，雜交后電導(dǎo)率的增加能達(dá)到ssDNA的100X倍。對(duì)于允許這種顯著增加的機(jī)理在文獻(xiàn)中仍存在爭(zhēng)議，可能是通過(guò)堿基區(qū)的電子隧道效應(yīng)或是電子在糖磷酸骨架中的跳躍；無(wú)論機(jī)理如何，這種增加是可測(cè)量的并且良好地在任何信噪比問(wèn)題之上。
隨著分子長(zhǎng)度的變化，電導(dǎo)率的增加與靶ssDNA和潛在匹配ssDNA間的匹配程度成正比。ssDNA分子間錯(cuò)配程度越大，雜交后電導(dǎo)率的增加越小。
電壓誘導(dǎo)的變性第三個(gè)生理學(xué)現(xiàn)象與dsDNA分離為兩個(gè)互補(bǔ)ssDNA相關(guān)。Southern雜交是一種經(jīng)很好驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室方法，用于控制DNA分子的雜交和變性(referecences)。通過(guò)控制環(huán)境變量如鹽度和溫度，可以促使DNA分子的雜交或者變性。還可使足夠的電流通過(guò)dsDNA來(lái)實(shí)現(xiàn)變性。此外，雖然最終機(jī)理沒(méi)被完全理解，但是已經(jīng)反復(fù)觀察到該現(xiàn)象(referecences)。
隨著分子長(zhǎng)度和電導(dǎo)率的變化，促使dsDNA變性為兩個(gè)組分ssDNA所需的電流與組分ssDNA鏈間的匹配程度成正比。匹配程度越高，導(dǎo)致變性需要的電流越大。
DNA模板生產(chǎn)枯草桿菌基因組DNA制備枯草芽孢桿菌(Ehrenberg)Cohn株168，(AmericanType Culture Collection(ATCC)#27370)，培養(yǎng)在100ml無(wú)菌ATCC培養(yǎng)基#265中，每升該培養(yǎng)基由12.5g心臟浸出肉湯(BD#238400)、5.4g營(yíng)養(yǎng)肉湯(BD#234000)和2.5g酵母提取物(BD#212730)組成。培養(yǎng)基在30℃、140rpm振蕩下生長(zhǎng)15小時(shí)。根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)(Marmur，J.1961.A procedure for the isolation ofdeoxyribonucleic acid from microorganisms.J.Mol.Biol.3208-218)，從培養(yǎng)基中分離基因組DNA。簡(jiǎn)單地說(shuō)，100ml桿菌培養(yǎng)基在4000xg下離心10分鐘。沉淀重懸于9.5mlTE(10mM Tris(三羥基-氨基甲烷EM#9210)、1mM EDTA(乙二胺四乙酸EM#4010))、0.5ml 10％SDS(十二烷基硫酸鈉EM#DX2490-2)和50微升20mg/ml蛋白酶K(EM#24568-3)中并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，加入1.8ml 5M NaCl(氯化鈉VWR#6430-1)，完全混合溶液，然后加入1.5ml CTAB/NaCl溶液(0.7M NaCl中的10％CTAB(十六烷基三甲基銨溴化物VWR 80501-950)，并在65℃下保溫20分鐘。用等體積氯仿(EM#CX1054-6)/異戊醇(Calbiochem#80055-544)萃取溶液，并在22℃ 6000xg下離心10分鐘。水相用酚(EM #PX0511-1)/氯仿/異戊醇萃取并在22℃以6000xg離心10分鐘。水相中的DNA通過(guò)加入0.6體積的異丙醇(VWR3424-7)而沉淀并在4℃ 6000xg下離心10分鐘。沉淀物用70％(v/v)乙醇洗滌，然后重懸于4ml TE中。用分光光度計(jì)在260nm吸光度處測(cè)定濃度，并調(diào)至100μg/ml。每4ml DNA中加入200μl溴乙錠(EM#4310)和4.3g CsCl(氯化銫EM#3030)。溶液在15℃300,000xg下離心4小時(shí)。基因組DNA帶通過(guò)UV光觀察，并用注射器針頭取出。用CsCl飽和的異丙醇萃取溴乙錠，在4℃下2升TE中透析過(guò)夜去除CsCl。用0.6體積的異丙醇沉淀DNA，并在-70℃下保存。
枯草桿菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增由根據(jù)上述公開(kāi)方法(H.-J.Bach，1，D.Errampalli，K.T.，Leung，H.，Lee，A，.Hartmann，J.，T.Trevors，and J.C.Munch.1999.Specific Detection of the Gene for the Extracellular Neutral Protease of Bacillus cereus byPCR and Blot Hybridization.Applied and Environmental Microbiology，p.3226-3228，Vol.65，No.7)制備的基因組DNA來(lái)PCR擴(kuò)增枯草桿菌的16S rRNA基因。DNA擴(kuò)增由GeneAmp PCR系統(tǒng)9600(Perkin-Elmer，Norwalk，Conn.)來(lái)進(jìn)行。包含50ng模板枯草桿菌基因組DNA的50μl樣品、25pmol每種引物(正向5’-gggtttgatcctggctcag-3’；反向5’-acggttaccttgttacgactt-3’)、0.2mM脫氧核苷三磷酸(Boehringer，Mannheim，Germany)、2單位Taq/AmpliTaqDNA聚合酶(Promega)、5μl 10×反應(yīng)緩沖液(EM)和3mM MgCl2(EM)。PCR程序如下94℃持續(xù)5分鐘和80℃持續(xù)4分鐘的熱啟動(dòng)循環(huán)；94℃持續(xù)2分鐘、64℃持續(xù)1分鐘和72℃持續(xù)2分鐘的一個(gè)循環(huán)；94℃持續(xù)30秒、64℃持續(xù)30秒和72℃持續(xù)45秒的30個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用TAE緩沖液中(40mM Tris-乙酸鹽〔pH 7.6〕，1mM Na2EDTA)的0.8％瓊脂糖(Promega LMP#2831)凝膠電泳分離。切出約1500bp的PCR產(chǎn)物，并利用AgarACE(Promega)消化方法從瓊脂糖中提取PCR產(chǎn)物。(注上面提到的引物已由Dr.Albert專門設(shè)計(jì)，作為從多種細(xì)菌中PCR擴(kuò)增16S rRNA核苷酸序列的工具)。
枯草桿菌16S rRNA的克隆根據(jù)制造商推薦的方法，在上述步驟中產(chǎn)生的16SrRNA PCR產(chǎn)物被連接至質(zhì)?？寺≥d體pGem-T Easy(Promega)上。簡(jiǎn)單地說(shuō)，75ngPCR產(chǎn)物加入5μl 2×快速連接緩沖液(Promega)、1μl(50ng)載體DNA和1μl(3Weiss單位)T4DNA連接酶中。反應(yīng)液在22℃保溫1小時(shí)。根據(jù)下述方法，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞(Promega)中將2μl冰冷連接反應(yīng)體系小心加入無(wú)菌1.5ml試管中的50μl冰冷感受態(tài)細(xì)胞中。管子在冰上保溫20分鐘，然后在42℃保持50秒，再轉(zhuǎn)到冰上保持2分鐘。加入22℃950μl無(wú)菌SOC培養(yǎng)基，管子在37℃下150rpm振蕩1.5小時(shí)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪在LB/氨芐青霉素/IPTG/X-Gal培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)20小時(shí)。利用下面的質(zhì)粒小量制備方法隨后篩選白色菌落以獲得插入片段。
質(zhì)粒小量制備方法利用Blin & Doly在Nucleic Acids Research 71513-1523(1979)技術(shù)的改進(jìn)方法從JM109 E.coli宿主中快速純化含枯草桿菌16S rRNA核苷酸序列插入片段的質(zhì)粒。用無(wú)菌移液器吸頭將代表候選插入片段/載體轉(zhuǎn)化克隆的20個(gè)白色菌落分別挑入無(wú)菌帶蓋試管中的2ml LB/氨芐青霉素肉湯中，并在37℃下200rpm振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。將培養(yǎng)物分別加入無(wú)菌1.5ml微離心管，并在4℃下以4000xg離心5分鐘。沉淀重懸于180μl溶液I和20μl 5mg/ml溶菌酶中，并在22℃保溫5分鐘。加入400μl溶液II，顛倒5次，并將溶液冰浴保溫5分鐘。加入300μl冰冷溶液III，旋轉(zhuǎn)振蕩試管內(nèi)容物，并在冰上保溫10分鐘。樣品在22℃10,000xg下離心2分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的無(wú)菌1.5ml微離心管中，該管含有500μl(0.6體積)的異丙醇以沉淀DNA。旋轉(zhuǎn)振蕩樣品，并在22℃下以10,000xg離心5分鐘，沉淀重懸于200μl TE中。
篩選含16S rRDA基因插入片段的轉(zhuǎn)化體根據(jù)制造商指導(dǎo)，5μl質(zhì)粒制備物用NotI(Promega)限制性消化，并用1％瓊脂糖電泳分離質(zhì)粒和切出的插入片段，從而鑒定含期望pGem-B.subtils rRNA質(zhì)粒構(gòu)造物的菌落分離物。由電泳分析鑒定為含有合適質(zhì)粒構(gòu)造物的候選克隆在500ml LB/氨芐青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，等分保存在-70℃下的70％甘油中，并進(jìn)行大量質(zhì)粒制備以建立培養(yǎng)物和DNA的保存物。
用于生成相同121bp橋接模板的替代方案下面提供兩種用于產(chǎn)生相同121bp核苷酸序列的替代方案。
1)由枯草桿菌DNA亞克隆。通常，微生物DNA的克隆片段能夠從個(gè)人或者商業(yè)渠道獲取。含有包括期望121bp片段的枯草桿菌DNA大插入片段的質(zhì)粒可以用限制酶AatII和SphI消化。消化將釋放一個(gè)171bp片段，能被克隆入任意合適的克隆載體如pGem-T(Promega)的Aat II/Sph I位點(diǎn)。根據(jù)上述PCR方法，期望的121bp片段能夠從質(zhì)粒中亞克隆。
2)合成期望橋接模板。期望寡核苷酸橋接模板可通過(guò)任何商業(yè)系統(tǒng)如ABI 392DNA合成儀來(lái)合成?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)的氨基磷酸酯(phosphoramidite)化學(xué)在5’末端產(chǎn)生二甲氧三苯甲基保護(hù)基團(tuán)。所述分子由C18反相HPLC(25mM NH4OAc，pH 7，5-25％CH3CN 30分鐘)純化，隨后在80％乙酸溶液中去保護(hù)15分鐘。去保護(hù)后，用反相HPLC(25mM NH4OAc，pH 7，2-20％CH3CN，30分鐘)在相同C18柱上將寡核苷酸二次純化。合成的DNA量通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜法用下面的單鏈DNA的消光系數(shù)來(lái)確定(260nm，M-1cm-1)腺嘌呤(A)＝15,000；鳥(niǎo)嘌呤(G)＝12,300；胞嘧啶(C)＝7400；胸腺嘧啶(T)＝6700。由于超過(guò)70-90個(gè)堿基時(shí)大部分合成方法喪失忠實(shí)度，此處討論的121bp橋接模板將合成為至少兩個(gè)片段。特別地，如研究計(jì)劃的步驟1所示，四個(gè)約60堿基的單鏈核苷酸將被合成，并且以合適的方式互相雜交和連接。然后將產(chǎn)物連接入克隆載體。
利用PCR擴(kuò)增制備121bp電路橋接模板從pGem-B.subtilis rRNA質(zhì)粒構(gòu)造物中PCR擴(kuò)增枯草桿菌16S rRNA基因的121bp片段。含50ng Sal I消化的模板質(zhì)粒DNA的50μl樣品、25pmol每種引物(正向5’-CGAGCGGCCGCCTGGGCTACACACGTGC-3’；反向5’-CGACCGCGGCCAGCTTCACGCAGTCG-3’)、0.2mM脫氧核苷三磷酸(Boehringer，Mannheim，Germany)、2單位Taq/AmpliTaqDNA聚合酶(Promega)、5μl 10×反應(yīng)緩沖液(EM)和3mM MgCl2(EM)。PCR程序如下94℃持續(xù)5分鐘和80℃持續(xù)4分鐘的熱啟動(dòng)循環(huán)；94℃持續(xù)2分鐘、64℃持續(xù)1分鐘和72℃持續(xù)2分鐘的一個(gè)循環(huán)；94℃持續(xù)30秒、64℃持續(xù)30秒和72℃持續(xù)45秒的30個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用TAE緩沖液中(40mM Tris-乙酸鹽〔pH 7.6〕，1mM Na2EDTA)的1.5％瓊脂糖(Promega LMP#2831)凝膠電泳分離。切出約121bp的PCR產(chǎn)物，并利用AgarACE(Promega)消化方法從瓊脂糖中提取PCR產(chǎn)物。純化的產(chǎn)物連接至pGem載體的Not I/Sac II位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化入JM109，并利用上述方法制備含121bp插入片段的質(zhì)粒。
驗(yàn)證DNA橋接模板的特異性利用上述方法克隆的121bp枯草桿菌片段經(jīng)商業(yè)轉(zhuǎn)包合同DNA測(cè)序服務(wù)來(lái)驗(yàn)證序列完整性。經(jīng)確定121bp插入核苷酸序列是5’-ctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatCccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctgg-3’，并且與16S rRNA枯草桿菌亞種枯草菌株168(Entrez PubMed accession#NC000964)完全匹配。
通過(guò)對(duì)從American Type Culture Collection購(gòu)買的枯草桿菌和其他桿菌種(即B.globigii，B.cereus，B.subtilis，B.thuringiensis)的基因組DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Southern篩選來(lái)驗(yàn)證121bp插入片段的特異性。Southern雜交篩選涉及以下操作。如上述制備的桿菌種基因組DNA用不消化121bp插入片段的限制酶Hind III、EcoR I和Pst I限制性消化。消化產(chǎn)生的片段在TAE中0.8％瓊脂糖分離，并用溴乙錠染色。在透射儀上，凝膠用260nm UV處理5分鐘，隨后浸泡在0.2M HCl中7分鐘。然后凝膠在堿液(1.5MNaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分鐘，隨后用中和液(5M Tris-HCl，3M NaCl，pH7.4)處理90分鐘。見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)Southern參數(shù)(Southern，E.M.(1975)Dection of specific sequencesamong DNA fragments separated by gel electrophoresis.J.Mol.Biol.98，503-517)中。簡(jiǎn)要地，處理的凝膠夾在吸水Whatman 3MM濾紙和結(jié)合DNA的硝化纖維素(SS)之間，使得20×SSPE(3M NaCl，0.2M NaH2PO4，20mM EDTA，pH 7.0)經(jīng)毛細(xì)作用通過(guò)濾紙、并通過(guò)凝膠，同時(shí)將凝膠DNA轉(zhuǎn)移至結(jié)合膜。在室溫條件下，基因組DNA被允許轉(zhuǎn)移16個(gè)小時(shí)。取出膜，并在5×SSPE中浸泡30分鐘，在80℃真空箱中烤幾小時(shí)，直至濾膜干燥。然后探測(cè)膜上的片段，所述片段將與根據(jù)制造商指導(dǎo)AlkPhos-DIRECT(Pharmacia)標(biāo)記的上述121bp克隆模板片段雜交。探測(cè)膜顯色清楚表明，探針對(duì)枯草桿菌是特異性的并且僅對(duì)枯草桿菌基因組內(nèi)的單個(gè)位點(diǎn)是特異性的。
制備點(diǎn)突變變體用公開(kāi)方法(Molecular BiologyCurrent Innovations and FutureTrends.Eds.A.M.Griffin and H.G.Griffin.ISBN 1-898486-01-8.1995 Horizon ScientificPress，PO Box 1，Wymondham，Norfolk，U.K.)制備121bp核苷酸序列的遺傳變體。具體地，向PCR混合物中加入0.5pmol pGem-B.subtilis質(zhì)粒模板DNA，在25μl 1×突變緩沖液(20mM Tris HCl，pH 7.5；8mM MgCl2；40ug/ml BSA)中所述PCR混合物含有T7和SP6引物(Promega)各20pmol、250uM每種dNTP、2.5U Taq DNA聚合酶、2.5U Taq Extender(Stratagene)。PCR循環(huán)參數(shù)是1個(gè)循環(huán)的94℃保持4分鐘、50℃保持2分鐘和72℃保持2分鐘；隨后進(jìn)行5-10個(gè)循環(huán)的94℃保持1分鐘、54℃保持2分鐘和72℃保持1分鐘。用DpnI(10U)和Pfu DNA聚合酶(2.5U)處理親代模板DNA和摻入線性致突變引物的新合成DNA。這導(dǎo)致體內(nèi)甲基化的親代模板和雜合DNA的DpnI消化。Pfu DNA聚合酶除去線性PCR產(chǎn)物上Taq DNA聚合酶延伸的堿基。反應(yīng)體系在37℃下保溫30分鐘，然后轉(zhuǎn)至72℃下再保溫30分鐘。加入含0.5mM ATP的115ul致突變緩沖液并將溶液混合。將4單位T4DNA連接酶加入到新微離心管中的10ul這種溶液中，并在37℃下保溫90分鐘。用上述方法將該溶液轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109E.coli，并鋪板于LB/氨芐青霉素上在37℃下保溫16小時(shí)。制備來(lái)自單個(gè)分離物的質(zhì)粒DNA并如上述測(cè)定其核苷酸序列。保留證明2％、19％和35％堿基突變的分離物以備進(jìn)一步研究。
末端標(biāo)記121bp模板DNA橋接模板將經(jīng)由生物素-鏈親和素和硫醇-金結(jié)合共價(jià)連接到AFM和MEMS表面。用Not I和Sac II限制性消化含121bp 16S rRNA枯草桿菌片段的質(zhì)粒以釋放插入片段，如上述該插入片段在TAE緩沖液中用0.8％LMP瓊脂糖凝膠純化。用商品末端標(biāo)記試劑盒(Pierce#89818)并根據(jù)公開(kāi)方法(B.A.Connoly and P.Rider，Nucleic Acids Res.13，4485(1985).和A.Kumar，S.Dvani，H.Dawar，G.P.Talwar，ibid.19，4561(1991))將分子的5’-末端和3’-末端分別用硫醇和生物素化學(xué)標(biāo)記。
測(cè)量DNA物理特性原子力顯微鏡(AFM)典型地用于評(píng)估分子水平的表面狀況。AFM系統(tǒng)包括具有突出尖端的懸臂梁，所述尖端垂直于臂長(zhǎng)軸。降低臂直到尖端接觸表面，然后沿表面拖動(dòng)尖端以測(cè)量表面尺寸的變化。測(cè)量懸臂尖端的移動(dòng)；對(duì)樣品表面充分重復(fù)這個(gè)過(guò)程以表征表面狀況。最常見(jiàn)的，利用反射激光方法來(lái)測(cè)量尖端偏移。
在這個(gè)操作中，為了測(cè)量斷裂沿單鏈或雙鏈DNA分子軸的鍵所需的力，用AFM測(cè)量由于結(jié)合DNA分子的運(yùn)動(dòng)引起的AFM尖端位移。
實(shí)驗(yàn)測(cè)量施加到連接AFM尖端和工作臺(tái)的分子上的力的阻力松散連接于尖端和工作臺(tái)間的分子開(kāi)始以標(biāo)準(zhǔn)AFM方式被壓縮直至記錄到正力。當(dāng)尖端隨后從表面抬升時(shí)，分子變得繃緊從而產(chǎn)生負(fù)力，記錄結(jié)果直到尖端和工作臺(tái)之間的距離超出最大分子長(zhǎng)度，在該點(diǎn)上分子斷裂。
原子力顯微鏡(AFM)用于精確測(cè)量枯草桿菌121bp插入片段和變體DNA片段的特定物理特性(即位移和電導(dǎo)率)。根據(jù)預(yù)定化學(xué)反應(yīng)和方法來(lái)操作AFM。根據(jù)公開(kāi)方法在AFM尖端和工作臺(tái)包被金和鏈親和素，并連接用上述方法制備的硫醇/生物素末端標(biāo)記的DNA橋接模板(RM Zimmermann and EC Cox.1994.DNA stretchingon functionalized gold surface.Nucleic Acids Research，Vol 22，Issue 3492-497)。在連接之前，用0.04M DTT、pH 8.0的0.17M磷酸鹽緩沖溶液過(guò)夜去保護(hù)末端標(biāo)記的DNA硫醇基團(tuán)。在10mM HEPES、pH 6.6的5mM EDTA緩沖液中連接之前，用乙酸乙酯反復(fù)萃取除去過(guò)量DTT。在室溫下，將用金處理過(guò)的AFM尖端浸泡在DNA溶液中2小時(shí)，然后在氮?dú)饬髦懈稍?。結(jié)合DNA的AFM尖端裝在AFM上，反應(yīng)室里充滿SPE(0.1M磷酸鈉，pH 6.6，1mM EDTA，和1M氯化鈉)，以便形成生物素-鏈親和素共價(jià)鍵。
在與互補(bǔ)鏈和變體ssDNA分子雜交之前、之中和之后測(cè)量AFM尖端位移和材料電特性。檢查控制雜交(pH緩沖液、鹽)、變性、水解和核苷酸氧化的試劑。
關(guān)于尖端從固定狀態(tài)的位移的試驗(yàn)在與其互補(bǔ)聯(lián)雜交后，單鏈?zhǔn)`DNA的長(zhǎng)度減小。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，束縛ssDNA長(zhǎng)度的減小導(dǎo)致可測(cè)量的AFM尖端向工作臺(tái)方向的位移。
結(jié)果此處描述的該項(xiàng)工作實(shí)際上包括對(duì)長(zhǎng)度在83bp至2854bp間的大約80種分子進(jìn)行的分子和AFM研究。DNA源自質(zhì)粒載體、λ病毒、E.coli基因組和B.subtilis基因組DNA。雖然對(duì)上述的121bp片段上進(jìn)行了最集中的研究，但是，所有分子的結(jié)果都是相似的。初始研究是根據(jù)前述方法測(cè)量?jī)啥硕寂cAFM尖端和工作臺(tái)結(jié)合的121bp單鏈片段長(zhǎng)度的減小。在吸移4-5μl稀釋(每μl 1-2個(gè)分子)單鏈121bp片段或包含該121bp插入片段的變性質(zhì)粒的數(shù)秒內(nèi)觀察到AFM尖端位移。圖4表示121bp片段長(zhǎng)度如何縮短約10nm。
DNA鏈的準(zhǔn)確長(zhǎng)度取決于堿基組成、序列和環(huán)境。平均起來(lái)，dsDNA的直徑是20埃()，兩個(gè)相鄰核苷酸間的距離是3.4或者一個(gè)完整螺旋的長(zhǎng)度大約是34。dsDNA螺旋表現(xiàn)出兩個(gè)溝；小溝(～12)和大溝(～22)。而ssDNA中相鄰核苷酸間的距離大約是5.84埃。因此，盡管ssDNA的121個(gè)堿基大約為701埃，但相同數(shù)量的dsDNA核苷酸約為411埃，或者DNA長(zhǎng)度預(yù)期平均減小約40％。因此，如果允許連接于AFM的121bp鏈自由扭曲，尖端將被移動(dòng)29nm。
分別引入核苷酸序列與親本具有2％、19％和35％不同的DNA分子(變體)顯示出可測(cè)量的尖端位移差異。如果這些研究中AFM尖端位移是由于雙鏈DNA螺旋形成的長(zhǎng)度小于單鏈DNA的長(zhǎng)度，那么接下來(lái)可知，由越少互補(bǔ)的鏈組成的雜合分子表現(xiàn)出越小的尖端位移。
圖4表示在約15秒鐘之前的時(shí)間，如文中所述的連接AFM尖端和工作臺(tái)并保持輕微張力的121bp DNA橋接模板。當(dāng)引入模板的互補(bǔ)DNA鏈時(shí)，保持在約71nm穩(wěn)定狀態(tài)位置的尖端移動(dòng)大約10nm。分別引入與親本具有2％、19％和35％差異的分子導(dǎo)致可測(cè)量的尖端位移差異。圖中的線表示每個(gè)經(jīng)5次測(cè)量的小于0.3％的偏差。
包被金的AFM懸臂表面允許電流傳導(dǎo)通過(guò)所研究分子。通過(guò)向懸臂和工作臺(tái)間施加電壓，測(cè)量到通過(guò)橋接的121bp ssDNA模板的對(duì)應(yīng)電流。如果施加大約1伏的電壓，那么測(cè)量出的通過(guò)ssDNA模板的電流大約為0.3nA。當(dāng)引入完全匹配的靶ssDNA時(shí)，相同電壓下測(cè)量的電流將增至2.1nA。
這些結(jié)果證實(shí)這種行為與前面討論的ssDNA/dsDNA電導(dǎo)率有關(guān)。DNA分子的電導(dǎo)率還被證實(shí)依賴于DNA分子的組成和序列。具體地，腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)核苷酸起絕緣體的作用，而鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷酸是較好的導(dǎo)體。
當(dāng)引入工程化變體的靶ssDNA鏈時(shí)出現(xiàn)類似的結(jié)果，所述變體具有已知的與模板不同的變異程度。引入變形研究中用的相同變體靶ssDNA分子，從而測(cè)量電導(dǎo)率反應(yīng)。值得注意的是，雜交時(shí)分子電導(dǎo)率的增加與模板和靶ssDNA鏈間錯(cuò)配程度之間的高度比例關(guān)系，這提供前述特異性現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。不論變異出現(xiàn)在遺傳序列的一個(gè)區(qū)域還是分布在沿靶序列的多個(gè)不同位置，結(jié)果都是一致的。
當(dāng)測(cè)量通過(guò)dsNDA傳導(dǎo)電流的量時(shí)，人工增加AFM懸臂和襯底間施加的電壓，從而導(dǎo)致通過(guò)dsDNA的電導(dǎo)率增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖在圖6中表示。在變性點(diǎn)處，傳導(dǎo)電流下降到ssDNA相關(guān)的水平。
如圖6所示，促使變性所需的電流量和模板與靶ssDNA鏈的錯(cuò)配程度之間高度成比例。當(dāng)與現(xiàn)有研究比較時(shí)，不論變異出現(xiàn)在遺傳序列的一個(gè)區(qū)域還是分布在沿靶序列的多個(gè)不同位置，結(jié)果都是一致的。
另一個(gè)AFM操作實(shí)驗(yàn)涉及增大電壓以促使變性，然后減小電壓回到感測(cè)水平允許發(fā)生另一次雜交。從圖7可以看出，AFM成功地執(zhí)行了多次感測(cè)事件，并已驗(yàn)證，通過(guò)增加電流作為復(fù)位生物傳感器的手段，電流感測(cè)雜交/強(qiáng)迫變性的用途。圖7中要注意的是，ssDNA期間和雜交(dsDNA)之后，在多次感測(cè)事件之間測(cè)量電流的一致性。圖7的實(shí)驗(yàn)描述了4次分立的感測(cè)事件，實(shí)際上通過(guò)數(shù)百次感測(cè)事件進(jìn)行了大量試驗(yàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的信號(hào)減弱，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感測(cè)前后測(cè)量電流的明顯變化。
AFM允許研究和驗(yàn)證前述的現(xiàn)象。感測(cè)事件涉及專用生物檢測(cè)設(shè)備的選定屬性。例如，利用與設(shè)備制造相同的方法和技術(shù)來(lái)構(gòu)造AFM懸臂尖端，涉及AFM的傳感器設(shè)備利用一個(gè)ssDNA作為探測(cè)位點(diǎn)。
合成121bp DNA橋接模板的研究計(jì)劃步驟1合成帶連接頭(小寫)的分子片段(A+，A-，B+和B-)(A+)＝5′-CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCC(B+)＝5′-CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGgcatg(A-)＝3′-tgcaGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGCTTTGGCGCT(B-)＝3′-CCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTTGAGCTGACGCACTTCGACC步驟2分子片段的雜交(A+到A-，B+到B-)(A+/A-)-加熱到95攝氏度，緩慢冷卻到室溫CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACGCGAGGTTAAGCCAATCCtgcaGACCCGATGTGTGCACGATGTTACCTGTCTTGTTTCCCGTCGCTTTGGCGCT(B+/B-)-加熱到95攝氏度，緩慢冷卻到室溫
CACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGgcatgCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAAGAGTCAAGCCTAGCGTCAGACGTTGAGCTGACGCACTTCGACC步驟3連接片段A+/A-到B+/B-(A+/A-)-室溫下，在1×連接緩沖液中加入T4DNA連接酶CTGGGCTACA----ACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTT---GTGAAGCTGGgcatgtgcaGACCCGATGT----TGGCGCTCCAATTCGGTTAGGGTGTTTAGACAA---CACTTCGACC產(chǎn)生的121bp分子然后可以連接到pGem-T的Aat II/Sph I克隆位點(diǎn)中。溶液溶液I50mM葡萄糖(0.9％w/v)；25mM Tris pH8，10mM EDTA pH 7.5溶液II0.2N NaOH，1％SDS溶液III2.7M醋酸鉀，用冰醋酸調(diào)節(jié)至pH 4.8SOC培養(yǎng)基＝(每100ml2g Bacto-胰蛋白胨(BD)，0.5g酵母提取物(BD)，1ml 1M NaCl，0.25ml 1M KCl，1ml 2M Mg+2儲(chǔ)備液，1ml 2M葡萄糖)Mg+2儲(chǔ)備液＝1M MgCl2，1M MgSO4LB/氨芐青霉素/IPTG/X-Gal平板＝每升加入15g瓊脂(BD)，10g Bacto-胰蛋白胨(BD)、5g酵母提取物(BD)和5gNaCl；用NaOH調(diào)pH值，高壓滅菌，冷卻至50℃；每ml加入100微克氨芐青霉素，0.5mM IPTG和80μg/ml X-Gal。每85mm平板中倒入30-35ml培養(yǎng)基，使瓊脂在22℃硬化，在4℃保存。
縮寫ml毫升，μl微升，g克，mg毫克，ng納克，M摩爾/升(mol/l)，mM毫摩爾/升，(BD＝Becton，Dickinson and Company，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)(EM＝EMD Chemical Inc.，Gibbstown，NJ)(VWR＝VWR International，West Chester，PA)(Calbiochem/Novabiochem Corp，San Diego，CA)(Promega＝Promega Corporation Madison，WI)(Pierce＝Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)
所有化學(xué)和生物檢測(cè)/鑒定系統(tǒng)都必須包括(A)樣品收集、(B)樣品處理和傳遞、(C)樣品分析技術(shù)、和(D)信號(hào)處理和輸出(圖1)。在一個(gè)實(shí)施例中，微芯片、或者一系列微芯片是由數(shù)千個(gè)對(duì)DNA敏感的稱作微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)的懸臂以一定方式排列組成，允許檢測(cè)、鑒定多種病原體和確定其濃度流量(多路復(fù)用)。
微芯片上每個(gè)孔可包含一個(gè)或者數(shù)百個(gè)基于懸臂的電路，每個(gè)電路由某種形式的優(yōu)選由生物分子橋接的移動(dòng)單元組成，使得當(dāng)該分子與其他分子相互作用時(shí)，相關(guān)的運(yùn)動(dòng)促使懸臂發(fā)生移動(dòng)?？梢杂卸喾N幾何結(jié)構(gòu)，比如象AFM圖所描述的懸在臺(tái)面之上的單懸臂，單個(gè)旋轉(zhuǎn)盤或者其他形狀，或者如圖10所述的相互相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩個(gè)懸臂梁。能夠構(gòu)造這些橋接懸臂的矩陣或者這些懸臂的孔，使得在一個(gè)軸上冗余的相同電路上，根據(jù)對(duì)生物因子響應(yīng)的電路的數(shù)量來(lái)測(cè)量單個(gè)生物因子的濃度。這些懸臂或者這些懸臂孔的每行可以專門用于不同的生物因子。每個(gè)芯片還將包括顯著量的參考懸臂，以對(duì)化學(xué)、機(jī)械或者其他環(huán)境“噪聲”的背景水平做出反應(yīng)。生物檢測(cè)/鑒定設(shè)備可包括專用于生物因子特定陣列的芯片。例如，一個(gè)設(shè)備可含有具有由分子橋接的懸臂的芯片，所述分子只對(duì)與國(guó)家安全相關(guān)的因子做出反應(yīng)。其他的設(shè)備可以包含只對(duì)食品安全、或者對(duì)醫(yī)療或農(nóng)業(yè)重要的因子做出反應(yīng)的橋接懸臂。
當(dāng)生物分子對(duì)其所在環(huán)境中的變化產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)，移動(dòng)單元會(huì)偏移，隨后測(cè)量這種偏移。測(cè)量MEMS設(shè)備內(nèi)的移動(dòng)已有很好記錄。一種測(cè)量變形的方法是在可變形元件表面上反射激光束。當(dāng)分子反應(yīng)時(shí)，元件移動(dòng)，激光束隨后偏移到不同的接收器位置。反射光束的變化通過(guò)不同的接收器位置來(lái)測(cè)量，并且與分子表現(xiàn)出的物理反應(yīng)的量相關(guān)。
本發(fā)明對(duì)位移的靈敏度約為10埃，對(duì)力的靈敏度約為5皮牛頓，但預(yù)期隨著設(shè)備體積的縮小可改進(jìn)靈敏性。報(bào)道的最小晶體管-探針的尺寸為3×2μm×140nm。Stanford’s Thomas Kenny報(bào)道了原子力顯微鏡中的精細(xì)懸臂用于測(cè)量阿托牛頓(attonewton)(10-18牛頓)水平的力。
還存在測(cè)量移動(dòng)MEMS元件變形的幾種替代方法。一種方法是，在變形元件自身上有壓電材料層。另一種方法涉及在移動(dòng)MEMS元件末端添加一定量的磁性物質(zhì)，在移動(dòng)元件由于生物元件的反應(yīng)而移動(dòng)時(shí)，測(cè)量磁場(chǎng)變化。而另一種方法涉及當(dāng)由于生物元件而發(fā)生移動(dòng)時(shí)，測(cè)量由生物元件橋接的間隙之間電容的變化。
MEMS設(shè)備的移動(dòng)單元還包含包括模板分子的電路。由此，可以向移動(dòng)單元施加電壓，產(chǎn)生的電流通過(guò)ssDNA。雜交后通過(guò)電路的電導(dǎo)率將增加，通過(guò)感測(cè)電流增加、放大該信號(hào)并將結(jié)果轉(zhuǎn)換為數(shù)字輸出以備處理，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)量。
在正常操作中，當(dāng)傳感器位點(diǎn)處于其準(zhǔn)備狀態(tài)(檢測(cè)事件還沒(méi)有發(fā)生)時(shí)，跨移動(dòng)單元的電壓將被設(shè)在“感測(cè)”水平。這個(gè)水平足夠高，允許產(chǎn)生可測(cè)量的電流，但接近變性極限相比太低。這個(gè)電流似乎還具有將靶ssDNA拉向感測(cè)位點(diǎn)的附加好處，最有可能是通過(guò)電泳。
使電流通過(guò)ssDNA還具有其他好處。由于ssDNA自己能夠傳遞較小量的電流(在雜交之前)，設(shè)備具有固有的自檢能力。如果ssDNA模板被破壞、斷裂或者與移動(dòng)MEMS元件變得松弛，則電路不再完整。因此，能夠驗(yàn)證每個(gè)傳感器位點(diǎn)處于感測(cè)事件準(zhǔn)備狀態(tài)的能力。如果發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)不能操作，在將來(lái)計(jì)算病原體存在和濃度計(jì)算中，可以將來(lái)自那個(gè)位點(diǎn)的信號(hào)從軟件中去除。
具有由模板ssDNA完成的電路還將使得能夠測(cè)量前述的第三現(xiàn)象利用電流進(jìn)行變性。施加的電壓可以增加到產(chǎn)生足以使dsDNA變性的電流的水平。這提供傳感器自我復(fù)位的能力，從而在感測(cè)事件發(fā)生后，可以排除與設(shè)備的模板部分連接的病原體。被排除的ssDNA靶在流經(jīng)傳感器的物質(zhì)中被沖掉，降低電壓回到感測(cè)水平，然后傳感器位點(diǎn)為另一次感測(cè)事件做好準(zhǔn)備。
這些元件的尺寸非常小，使得成千個(gè)傳感器位點(diǎn)能夠位于硬幣大小的MEMS芯片上。因此，多種毒力基因區(qū)能夠被包括在特定病原體的給定芯片上，此外，多種病原體也可以被包括在給定的芯片上。
在多個(gè)實(shí)施例中，本主題的傳感器與檢測(cè)器偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)器包括電路，稱作檢測(cè)器電路。在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)器利用非電學(xué)手段來(lái)區(qū)分物理位移或者諧振狀況。當(dāng)缺少調(diào)節(jié)器時(shí)，術(shù)語(yǔ)檢測(cè)器包括電學(xué)和非電學(xué)檢測(cè)器。
應(yīng)該理解，上面的描述旨在舉例說(shuō)明，而不是限制性的。比如，上述實(shí)施方案、或其方面可以相互組合使用。在查閱以上說(shuō)明時(shí)，很多其他實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)參考附屬權(quán)利要求來(lái)確定，還包括授權(quán)權(quán)利要求的全范圍的等價(jià)物。在附屬權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“包括”和“其中”是通俗英語(yǔ)的用法，其分別與術(shù)語(yǔ)“包含”和“在其中”的意思一致。此外，在以下權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“包括”和“包含”是開(kāi)放式的，也就是說(shuō)，除了在權(quán)利要求中這種術(shù)語(yǔ)之后列舉的以外，還包括其他元素的系統(tǒng)、設(shè)備、物品或方法都落在所述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。而且，在以下權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”和“第三”等僅用作標(biāo)記，而沒(méi)有對(duì)其對(duì)象有任何數(shù)字要求的含義。
權(quán)利要求
1.一種裝置，包含連接在至少兩個(gè)接觸點(diǎn)之間的模板分子，該至少兩個(gè)接觸點(diǎn)包括位于第一表面的第一接觸點(diǎn)和位于第二表面的第二接觸點(diǎn)，其中第一表面獨(dú)立于第二表面，而且其中模板分子包括靶分子的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；和與第一接觸點(diǎn)偶聯(lián)的檢測(cè)器，所述第一接觸點(diǎn)具有第一物理參數(shù)，檢測(cè)器配置為產(chǎn)生基于第一物理參數(shù)變化的輸出信號(hào)，其中第一物理參數(shù)的變化與靶分子和模板分子間的結(jié)合對(duì)應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子是核酸。
3.權(quán)利要求2的裝置，其中模板分子是ssDNA或者ssRNA。
4.權(quán)利要求2的裝置，其中靶分子是含有和模板分子序列充分互補(bǔ)的序列的核酸，以使靶分子能和所述模板分子雜交。
5.權(quán)利要求2的裝置，其中模板分子是核酸，該核酸在其3’-末端與第一接觸點(diǎn)和在其5’-末端與第二接觸點(diǎn)結(jié)合。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子包含多肽。
7.權(quán)利要求6的裝置，其中多肽在其羧基端與第一接觸點(diǎn)結(jié)合，并在其氨基端與第二接觸點(diǎn)結(jié)合。
8.權(quán)利要求6的裝置，其中多肽包含靶分子結(jié)合區(qū)，其中該靶分子是抗體。
9.權(quán)利要求6的裝置，其中多肽包含源自結(jié)合靶分子的抗體的結(jié)合位點(diǎn)，該靶分子包含所述抗體的抗原性位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求6的裝置，其中多肽包含靶分子的受體位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求10的裝置，其中靶分子是包含受體位點(diǎn)的多肽的拮抗劑或者激動(dòng)劑。
12.權(quán)利要求1的裝置，其中靶分子是多肽，該多肽包含模板分子至少一部分的受體位點(diǎn)。
13.權(quán)利要求1的裝置，其中靶分子是或者包含金屬離子。
14.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子是多糖。
15.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子是核酸序列的合成類似物。
16.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子是多肽的合成類似物。
17.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子是多糖的合成類似物。
18.權(quán)利要求1的裝置，其中第一物理參數(shù)包括以下至少一個(gè)第一接觸點(diǎn)相對(duì)于參考點(diǎn)的諧振頻率；第一接觸點(diǎn)相對(duì)于參考點(diǎn)的諧振振幅；第一接觸點(diǎn)和參考點(diǎn)之間的距離；和第一接觸點(diǎn)和參考點(diǎn)間的對(duì)準(zhǔn)程度。
19.權(quán)利要求18的裝置，其中參考點(diǎn)包括第二接觸點(diǎn)。
20.權(quán)利要求1的裝置，其中第一表面包括懸結(jié)構(gòu)，并且輸出信號(hào)是該懸結(jié)構(gòu)位移的函數(shù)。
21.權(quán)利要求19的裝置，其中所述懸結(jié)構(gòu)包括懸臂。
22.權(quán)利要求1的裝置，其中第一表面包括壓電元件，并且輸出信號(hào)是施加在該壓電元件上的力的函數(shù)。
23.權(quán)利要求1的裝置，其中第一表面包括可移動(dòng)表面。
24.權(quán)利要求1的裝置，其中檢測(cè)器包括光學(xué)傳感器、磁場(chǎng)傳感器、電場(chǎng)傳感器、電容傳感器、電阻傳感器和張力傳感器中的至少一種。
25.權(quán)利要求1的裝置，其中檢測(cè)器包括比較器和橋接電路中的至少一種。
26.權(quán)利要求1的裝置，其中檢測(cè)器包括與第一表面連通的諧振驅(qū)動(dòng)器。
27.權(quán)利要求1的裝置，其中第一接觸點(diǎn)具有第二物理參數(shù)，并且其中檢測(cè)器配置成產(chǎn)生基于第二物理參數(shù)變化的輸出信號(hào)，其中第二物理參數(shù)的變化與靶分子和模板分子的結(jié)合相對(duì)應(yīng)。
28.權(quán)利要求1的裝置，其中檢測(cè)器與第二接觸點(diǎn)偶聯(lián)，并且其中具有第一物理參數(shù)的第一接觸點(diǎn)包括第一接觸點(diǎn)和具有第一電參數(shù)的第二接觸點(diǎn)。
29.權(quán)利要求28的裝置，其中檢測(cè)器包括與第一接觸點(diǎn)和第二接觸點(diǎn)偶聯(lián)的電壓源，并且其中第一電參數(shù)包括電流的測(cè)量值。
30.權(quán)利要求29的裝置，其中電壓源配置成能夠提供遞增電壓。
31.權(quán)利要求28的裝置，其中檢測(cè)器包括與第一接觸點(diǎn)和第二接觸點(diǎn)偶聯(lián)的電流源，并且其中第一電參數(shù)包括電壓的測(cè)量值。
32.權(quán)利要求31的裝置，其中電流源配置成能夠提供遞增電流。
33.權(quán)利要求28的裝置，其中檢測(cè)器包括配置成傳遞電信號(hào)的驅(qū)動(dòng)電路，并且其中第一物理參數(shù)的變化與靶分子和模板分子的解離相對(duì)應(yīng)。
34.權(quán)利要求1的裝置，其中第一表面和第二表面中至少一個(gè)包括玻璃、石英、硅和聚合物中的至少一種。
35.權(quán)利要求1的裝置，其中模板分子包括硫醇、金、生物素和鏈親和素中的至少一種。
36.一種方法，包括將靶分子暴露于模板分子，該模板分子連接在至少兩個(gè)接觸點(diǎn)之間，該至少兩個(gè)接觸點(diǎn)包括位于第一表面的第一接觸點(diǎn)和位于第二表面的第二接觸點(diǎn)，其中模板分子包括靶分子的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；和產(chǎn)生作為第一物理參數(shù)變化的函數(shù)的輸出信號(hào)，該變化利用第一接觸點(diǎn)相對(duì)于參考點(diǎn)來(lái)測(cè)量，其中第一物理參數(shù)的變化與靶分子和模板分子的結(jié)合相對(duì)應(yīng)。
37.權(quán)利要求36的方法，還包括監(jiān)測(cè)第一接觸點(diǎn)相對(duì)于參考點(diǎn)的諧振頻率；監(jiān)測(cè)第一接觸點(diǎn)相對(duì)于參考點(diǎn)的諧振振幅；監(jiān)測(cè)第一接觸點(diǎn)和參考點(diǎn)之間的距離；和監(jiān)測(cè)第一接觸點(diǎn)和參考點(diǎn)之間的對(duì)準(zhǔn)程度。
38.權(quán)利要求37的方法，其中參考點(diǎn)包括第二接觸點(diǎn)。
39.權(quán)利要求36的方法，還包括驅(qū)動(dòng)第一表面共振。
40.權(quán)利要求36的方法，還包括在暴露之前利用模板分子傳導(dǎo)電流。
41.權(quán)利要求36的方法，還包括，利用模板分子傳導(dǎo)遞增的電流；監(jiān)測(cè)對(duì)應(yīng)于靶分子和模板分子解離的電壓峰值；和產(chǎn)生作為電壓峰值處電流函數(shù)的輸出。
42.權(quán)利要求36的方法，還包括，向模板分子施加遞增電壓；監(jiān)測(cè)對(duì)應(yīng)于靶分子和模板分子解離的電流峰值；和產(chǎn)生作為電流峰值處電壓函數(shù)的輸出。
43.權(quán)利要求36的方法，還包括向模板分子施加電信號(hào)以解離靶分子。
44.一個(gè)系統(tǒng)，包含用于接受樣品的靶分子入口；具有和靶分子入口連通的模板分子的傳感器，所述模板分子位于第一表面的第一點(diǎn)和第二表面的第二點(diǎn)之間，所述第一表面獨(dú)立于所述第二表面，并且其中模板分子具有靶分子特異性的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；檢測(cè)器，所述檢測(cè)器與所述第一點(diǎn)偶聯(lián)并配置成產(chǎn)生基于第一點(diǎn)測(cè)量參數(shù)變化的輸出信號(hào)，所述輸出信號(hào)與模板分子和靶分子間的結(jié)合對(duì)應(yīng)；和提供基于輸出信號(hào)的結(jié)果的輸出電路。
45.權(quán)利要求44的系統(tǒng)，還包括多個(gè)傳感器，每個(gè)傳感器通過(guò)多路復(fù)用器和檢測(cè)器偶聯(lián)。
46.權(quán)利要求44的系統(tǒng)，其中處理器與檢測(cè)器偶聯(lián)并可訪問(wèn)存儲(chǔ)器，其中存儲(chǔ)器數(shù)據(jù)存儲(chǔ)，用于基于測(cè)量參數(shù)的變化而鑒定靶分子。
47.權(quán)利要求44的系統(tǒng)，其中輸出電路包括接口、顯示器和無(wú)線收發(fā)機(jī)中的至少一個(gè)。
48.權(quán)利要求44的系統(tǒng)，還包括和模板分子偶聯(lián)的測(cè)試電路，用于確定模板分子的電導(dǎo)率。
49.權(quán)利要求44的系統(tǒng)，還包括和模板分子偶聯(lián)的復(fù)位電路，用于解離靶分子和模板分子。
50.權(quán)利要求44的系統(tǒng)，還包括外殼，用于放置靶分子入口、傳感器、檢測(cè)器和輸出電路中的至少一個(gè)。
全文摘要
通過(guò)監(jiān)測(cè)模板分子的變化來(lái)檢測(cè)由于模板分子和靶分子間結(jié)合引起的物理變化。變化實(shí)例包括模板分子的物理尺寸或者剛度方面的變化、模板分子電導(dǎo)率的變化以及解離靶分子和模板分子所需能量的變化。變化幅度表示靶分子的特定身份。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1846130SQ200480025562
公開(kāi)日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月6日
發(fā)明者弗雷德·G·阿伯特, 布拉德·W·賴特 申請(qǐng)人:布里杰技術(shù)有限公司