專利名稱：具有人類主要組織相容性復(fù)合物(mhc)表型的轉(zhuǎn)基因小鼠、其實(shí)驗(yàn)性使用及用途的制作方法
相關(guān)申請相互參考本申請基于2003年7月30日遞交的美國臨時申請60/490,945(代理人案卷號03495.6093)并要求其優(yōu)先權(quán)，在此通過引用將該申請的全部內(nèi)容并入本申請。
背景技術(shù)：
目前人們正在研制許多用于人類癌癥免疫療法及用于治療傳染性疾病(如瘧疾、艾滋病、丙肝病毒以及嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS))的疫苗。考慮到新興病原體可能出現(xiàn)的迅速程度，對可用于快速、可靠地評估疫苗策略和不同抗原表位的保護(hù)能力的動物模型進(jìn)行改進(jìn)非常重要。而且，體內(nèi)研究已經(jīng)被要求用于評估不易或無法通過體外試驗(yàn)進(jìn)行評價或測量的疫苗行為的重要變量，如疫苗免疫原性、疫苗組成、給藥途徑、組織分布以及其中初級和次級淋巴器官的參與。由于其簡單性和靈活性，至少在初期疫苗研制中，小動物(如小鼠)是一種很具吸引力的對麻煩并且昂貴的模型系統(tǒng)(如非人類靈長類動物)的替代物。
在數(shù)例疫苗(這些疫苗已在野生動物研究中證明具有保護(hù)作用)的臨床試驗(yàn)中觀察到的中度有效性(McMichael，A.J.& Hanke，T.Nat Med9，874-880(2003))，也許可以部分通過由于動物MHC和人類HLA的最佳抗原表位不同而造成的人類和動物MHC對免疫應(yīng)答結(jié)果的不同影響進(jìn)行解釋(Rotzschke，O.et al.Nature 348，252-254(1990))。因此，除開一些缺陷，具有人類HLA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠比野生小鼠更適于作為一種測試候選疫苗、評估疫苗可能誘導(dǎo)自身免疫性疾病的潛在風(fēng)險，以及設(shè)計更好的基于人類限制性元件的治療方案的臨床前模型。
細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)在消除傳染性疾病和某些癌癥方面具有很關(guān)鍵的作用(P.Aichele，H.Hengartner，R.M.Zinkernagel and M.Schulz，J Exp Med 171(1990)，p.1815；L.BenMohamed，H.Gras-Masse，A.Tartar，P.Daubersies，K Brahimi，M.Bossus，A.Thomas and P.Druhile，Eur J Immunol27(1997)，p.1242；D.J.Diamond，J.York，J.Sun，C.L.Wright and S.J.Forman，Blood 90(1997)，p.1751)。重組蛋白疫苗不能可靠地誘導(dǎo)CTL應(yīng)答(Habeshaw JA，Dalgleish AG，Bountiff L，Newell AL，Wilks，D，WalkerLC，Manca F.1990 Nov；11(11)418-25；Miller SB，Tse H，Rosenspire AJ，King SR.Virology.1992 Dec；191(2)973-7)。在一些重要疾病的治療中，其它一些含有減毒病原體的免疫疫苗的在人體內(nèi)的使用由于安全方面的顧慮而受到阻礙。在過去幾年中，基于抗原表位的方法已被提出作為一種研制新的預(yù)防和免疫治療疫苗的可能性策略(Melief CJ，Offringa R，Toes RE，Kast WM.Curr Opin Immunol.1996 Oct，8(5)651-7；Chesnut RW，Design testing of peptide based cytotoxic T-cell mediated imrnunotherapeuticto treat infiction disease，cancer，in Ppowell，MF，Newman，MJ(eds.)VaccineDesignThe Subunit，Adjuvant Approach，Plenum Press，New-York1995，847)。這種方法具有一些優(yōu)點(diǎn)，如可選擇自然處理的抗原表位，使得免疫系統(tǒng)關(guān)注于病原體的高度保守和免疫顯性表位(R.G.van der Most，A.Sette，C.Oseroff，J.Alexander，K.Murali-Krishna，L.L.Lau，S，Southwood，J.Sidney，R.W.Chesnut，M.Matioubian and R.Ahmed，Jimmune)157(1996)，p.5543)以及誘導(dǎo)多表位應(yīng)答以阻止如在HIV、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染中觀察到的突變逃逸。它還可以在需要TH1應(yīng)答時，除去可能優(yōu)先引起TH2應(yīng)答的抑制性T細(xì)胞決定簇，相反亦然(Pfeiffer C，Murray J，Madri J，Bottomly K.Immunol Rev.1991 Oct；12365-84；P Chaturvedi，Q Yu，S Southwood，A Sette，and B Singh IntImmunol 19968745-755)。最后，它還提供了除去抗原中的可能誘導(dǎo)不良自身免疫性疾病的自身免疫T細(xì)胞決定簇的可能。使用CTL抗原表位肽以獲得保護(hù)性抗病毒或抗腫瘤免疫已在一些實(shí)驗(yàn)性模型中得到實(shí)現(xiàn)(D.J.Diamond，J.York，J.Sun，C.L.Wright and S.J.Forman，Blood 90 1997，p.1751；J.E.J.Blaney，E.Nobusawa，M.A.Brehm，R.H.Bonneau，L.M.Mylin，T.M.Fu，Y.Kawaoka and S.S.Tevethia，J Virol 72(1998)，p.9567)。
基于人類淋巴細(xì)胞應(yīng)用的CTL抗原表位定義可能會由于導(dǎo)致不完全結(jié)果的環(huán)境和遺傳異質(zhì)性以及分離CTL克隆的技術(shù)困難而形成誤導(dǎo)。目前所述的HLA I類或II類轉(zhuǎn)基因小鼠已被證明是一種能夠克服這些缺陷的很有價值的工具，這些帶有新CTL和T輔助細(xì)胞表位的動物模型(HillAV.Annu Rev Immunol.1998；16593-617；Carmon L，EI-Shami KM，Paz A.，Pascolo S，Tzehoval E，Tirosb B，Koren R，F(xiàn)eldman M，F(xiàn)ridkin M，LemonnierFA，Eisenbach L.Int J Cancer，2000 Feb 1；85(3)391-7)。這些小鼠還被用于證明i)肽HLA親和力與免疫原性間的良好關(guān)聯(lián)(Lustgarten J，Theobald M，Labadie C，LaFace D，Peterson P，Disis ML，Cheaver MA，Sherman LA.Hum Immunol.1997 Feb；52(2)109-18；Bakker AB，van derBurg SH，Huijbens RJ，DRijfhout JW，Melief CJ，Adema GJ，F(xiàn)igdor CG.Int JCancer.1997 Jan 27；70(3)302-9)，ii)鼠類和人類CTL系統(tǒng)在抗原處理(產(chǎn)生相同抗原表位)水平方面的顯著重疊，以及，iii)比較針對HLA轉(zhuǎn)基因小鼠和人類中的CTL組成的大多數(shù)抗原的免疫動員(Wentworth，P.A.，A.Vifiello，J.Sidney，E.Keogh，P，W.Chesnut，H.Grey，A.Sette.1996.Eur.J.Immunol.2697；Alexander，J.，C.Oserof，J.Sidney，P.Wentworth，E.Keogh，G.Hermanson，F(xiàn).V.Chisari R.T，Kubo，H.M，Grey，A，Sette，1997.J.Immunol.1594753)。
迄今為止，已研制出合成肽基CTL抗原表位疫苗，用于多種人類疾病的免疫治療。但是，在數(shù)例臨床試驗(yàn)中僅觀察到了中度的療效(21)。這可能部分是因?yàn)檫@些疫苗不能引起足夠強(qiáng)的CTL應(yīng)答。實(shí)際上，近期的報告提示需要CD4+T輔助細(xì)胞，以獲得最大的CTL應(yīng)答(A.J.Zajac，K.Murali-Krishna，J.N.Blattman and R.Ahmed，Curr Opin Immunol 10(1998)，p.444；Firat H，Garcia-Pons F，Tourdot S，Pascolo S，Scardino A，Garcia Z，Michel ML，Jack RW，Jung O，Kosmatopoulos K，Mateo L，SuhrbierA，Lemonnier FA，Langlade-Demoyen PEur J Irmnunol 29，3112，1999)。
CTL是針對病毒感染的保護(hù)性免疫的關(guān)鍵因素，但體內(nèi)激活CTL的條件還沒有被完全認(rèn)識?，F(xiàn)在，Th細(xì)胞通常是利用合成肽激活CTL的基礎(chǔ)的觀點(diǎn)已經(jīng)得到接受。對于合成CTL抗原表位肽，一些研究指出T輔助淋巴細(xì)胞刺激是引起最大的CTL應(yīng)答所必需的(C.Fayolle，E.Deriaudand C.Leclerc，J Immunol 147(1991)，p，4069；C.Widmann，P.Romero，J.L.Maryanski，G.Corradin and D.Valmori，J Immunol Meth 155(1992)，p.95；M.Shirai，C.D.Pendkton，J.Ahlers，T.Takeshita，M.Newman and J.A.Berzofsky，J Immunol 152(1994)，p.549；J.P.Sauet，H.Gras-Masse，J.G.Guillet and E.Gomard，Int Immunol 8(1996).p.457)。一些該類研究表明激活CD8+細(xì)胞需要CD4+T輔助細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞間同時發(fā)生的相互作用依靠同樣的抗原呈遞細(xì)胞呈遞它們的同源表位(Ridge JP，Di Rosa F，Matzinger P.Nature.1998 Jun 4；393(6684)474-8)。激活CTL所需的這三種細(xì)胞相互作用的關(guān)聯(lián)性在病毒抗原表位和動物模型的研究中得到了確認(rèn)，因?yàn)轶w內(nèi)當(dāng)CTL和Th抗原表位完全連接，而非僅僅以相互分開的混合物存在時，CTL的誘導(dǎo)最為有效(Shirai M，Pendleton CD，Ahlers J，Takeshita T，Newman M，Berzohky JA.J Immunol.1994 Jan 15；152(2)549-56；Oseroff C，Sette A，Wentworth P，Celis E，Maewal A，Dahlberg C，F(xiàn)ikes J，Kubo RT，Chesnut RW，Grey BX Alexander J.Vaccine.1998 May；16(8)823-33)。CTL和Th抗原肽有效誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的能力已在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?C.Fayolle，E.Deriaud and C.Leclerc，J Immunol 147(1991)，p，4069；C.Widmann，P.Romero，J.L.Maryanski，G.Corradin and D.Valmori，JImmunol Meth 155(1992)，p.95)和人身上得到證明。而且，有效的Th應(yīng)答不僅在最大化地引起CTL應(yīng)答中，而且在維持CTL記憶方面都起著重要的作用(E.A.Walter，P.D.Greenberg，M.J.Gilbert，R.J.Finch，K-S.Watanabe，E.D.Tbomas and S.R.Riddell，N Engt J Med 333(1995)，p.1038；Riddell SR，Greenberg PD，In Thomas ED，Blume KG，F(xiàn)orman SJ(eds)Hematopoietic Cell Transplantation，2nd edn.Malden，MABlackwellScienceInc.，1999)。最后，早已有文獻(xiàn)表明CD4+T“輔助”細(xì)胞對協(xié)調(diào)針對外源性抗原的分子和體液免疫應(yīng)答很關(guān)鍵。
最近，一種同時表達(dá)有HLA-A*0201 I類和HLA-DR1 II類分子的轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型被建立起來(BenMohamed L，Krishnan R，Longmate J，Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum，Immunol.2000 Aug；61(8)764-79)。該作者報道說HLA-A*0201和HLA-DR1轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)均有效，MHCI類和II類分子都被用作限制性元件，HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物增強(qiáng)了HLA-A*0201限制性的抗原特異性CTL應(yīng)答(BenMohamed L，Krishnan R，Longmate J，Auge C，Low L，Primus J，Diamond DJ，Hum，Immunol.2000 Aug；61(8)764-79)。
值得注意的是這些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠表達(dá)了自身的MHCH-2 I類和II類分子。因?yàn)榫哂袃?nèi)源性小鼠MHC I類基因表達(dá)的HLA I類轉(zhuǎn)基因小鼠優(yōu)先并通常專門會引起H-2限制性CTL應(yīng)答(C Barra，HGoumier，Z Garcia，PN Marche，E Jouvin-Marche，P Briand，P Fillip，andFALemonnier J Immunol 1993 1503681-3689；Epstein H，Hardy F.，May JS，Johnson MH，Holmes N.Eur J Immunol.1989 Sep；19(9)1575-83；Le AX；EJ Bernhard，MJHolterman，S Strub，PParham，E Lacy，and VH Engelhard JImmunol 1989 14213 66-1371；Vitiello A，Marchesini D，F(xiàn)urze J，ShermanLA，Chesnut RW.，J Exp Med.1991 Apr 1；173(4)100715)，而具有內(nèi)源性小鼠MCH II類基因表達(dá)的HLA II類轉(zhuǎn)基因小鼠不能誘導(dǎo)可靠的HLA II類限制性抗原特異性應(yīng)答(Nishimura Y，Iwanaga T，Inamitsu T，Yanagawa Y，Yasunami M，Kimura A，Hirokawa K，Sasazuki T.，J Immunol 1990Jut 1；145(1)353-60)，這些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠對評估對抗原的人類特異性應(yīng)答的作用有限。
然而，在HLA I類轉(zhuǎn)基因而H-2 I類基因敲除小鼠，或HLA II類轉(zhuǎn)基因而H-2II類基因敲除小鼠中，只出現(xiàn)了HLA限制性CTL免疫應(yīng)答(Pascolo S，Bervas N，UreJM，Smith AG，Lemonnier FA，Perarnau，B.，J ExpMed.1997 Jun 16；185(12).2043-51；Madsen L，Labrecque N，Engberg J，Dierich A，Svejgaard A，Benoist C，Mathis D，F(xiàn)uggerL.，Proc Natl AcadSciUSA-1999 Aug 31；96(18)10338-43)。事實(shí)上，與仍具內(nèi)源性鼠H-2 I類分子的HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠相比，HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因而H-2類基因敲除(KO)小鼠表現(xiàn)出了達(dá)到增強(qiáng)HLA-A2.1限制性應(yīng)答的能力。(Pascolo，S.etal.J Exp Med 185，2043-2051(1997)；Ureta-Vidal，A.，F(xiàn)irat，H.，Perarnau，B.& Lemonnier，F(xiàn).A.J Immunol 163，2555-2560(1999)；Firat，H.etal.，IntImmunol 14，925-934(2002)；Rohrlich，P.S.etal.，Int Immunol 15，765-772(2003))。根據(jù)小鼠是否缺乏H-2II類分子，本發(fā)明人對HLA-DR1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了類似的觀察(A.Pajot，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。另外，在缺乏鼠MHC分子競爭的情況下，HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因而H-2類/-KO小鼠或HLA-DR1轉(zhuǎn)基因而H-2I類/-KO小鼠只發(fā)生了HLA限制性免疫應(yīng)答(Pascolo，S.et al.J Exp Med185，2043-2051(1997))(A.Pajot，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，促進(jìn)了對HLA限制性CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的監(jiān)控。但是，針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答通常需要T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的協(xié)調(diào)合作，因而不能在單獨(dú)的HLA類或HLA II類轉(zhuǎn)基因小鼠身上進(jìn)行研究，因?yàn)椴豢赡茉谕恢恍∈笊砩贤瑫r進(jìn)行HLAI類和II類人類免疫應(yīng)答的評估。
相應(yīng)地，還需要有一種方便的動物模型系統(tǒng)用來對包含人類CTL抗原表位的候選人體疫苗的免疫原性進(jìn)行測試，而且，在一些情況下，還需要高效CD4+Th(輔助T淋巴細(xì)胞)抗原表位來支持抗病毒和抗腫瘤CD8+T細(xì)胞活性(A.J.Zajac，K.Murali-Krishna，J.N.Blattman and R.Ahmed，Curr Opin Immunol 10(1998)，p.444；Firat H，Garcia-Pons F，Tourdot S，Pascolo S，Scardino A，Garcia Z，Michel ML，Jack RW，Jung O，Kosmatopoulos K，Mateo L，Suhrbier A，Lemonnier FA，Langlade-DernoyenP，Eur J Irmnunol 29，3112，1999)。另外，還需要有一種能允許同時對CTL應(yīng)答、TH應(yīng)答(尤其是TH1或TH2應(yīng)答)和體液應(yīng)答之間的相互協(xié)調(diào)進(jìn)行評估的系統(tǒng)。
發(fā)明概述本發(fā)明人已通過提供缺乏H-2I類和II類分子，而具有HLA-A2.1和HLA-DR1分子的轉(zhuǎn)基因小鼠，滿足并超過了這種需要。具體地說，本發(fā)明提供了小鼠，其包含(1)突變的H-2I類和II類分子；和(2)表達(dá)HLAI類轉(zhuǎn)基因分子，或表達(dá)HLA II類轉(zhuǎn)基因分子，或同時表達(dá)HLA I類轉(zhuǎn)基因分子和HLA II類轉(zhuǎn)基因分子。這些小鼠為構(gòu)建對于人類具有最大體內(nèi)免疫原性的疫苗的研制和優(yōu)化提供了一種有用的模型。具體地說，這種小鼠使得在一種動物身上對免疫適應(yīng)性應(yīng)答的三大因素(抗體、輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞)的整體分析成為可能，也使得對疫苗針對抗原攻擊的保護(hù)作用的評估成為可能。
本發(fā)明中的小鼠缺乏H-2I類和II類分子，具有HLA I類轉(zhuǎn)基因分子和HLAII類轉(zhuǎn)基因分子表達(dá)，代表了一種完全人化的，可用于同時檢測抗原特異性抗體、抗原特異性HLA-DR1限制性T細(xì)胞應(yīng)答和抗原特異性HLA-A2限制性T細(xì)胞應(yīng)答的試驗(yàn)小鼠。這些小鼠將有助于研究CTL應(yīng)答、TH應(yīng)答(尤其是TH1或TH2應(yīng)答)，以及，任選地，體液應(yīng)答之間的相互協(xié)調(diào)是如何進(jìn)行的。這些小鼠代表了一種基礎(chǔ)和應(yīng)用疫苗學(xué)研究的最佳工具。
本發(fā)明的第一種實(shí)施方式提供了一種包含斷裂的(disrupted)H2I類基因、斷裂的H2II類基因和功能性I類或II類轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
本發(fā)明的第二種實(shí)施方式提供了一種包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。
在一些實(shí)施方式中，HLAI類轉(zhuǎn)基因是HLA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLAII類轉(zhuǎn)基因是HLA-DR1轉(zhuǎn)基因。在另一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式中還提供了缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個實(shí)施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。在一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種可同時確定候選抗原或抗原組中存在一種或多種抗原表位的方法，其中所述一種或多種抗原表位可引起特異性體液應(yīng)答、TH HLA-DR1限制性應(yīng)答和/或CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答。該方法包括將候選抗原或抗原組施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中；測定小鼠體內(nèi)對抗原的特異性體液應(yīng)答；測定小鼠體內(nèi)對抗原的TH HLA-DR1限制性應(yīng)答；并測定小鼠體內(nèi)對抗原的CTRLHLA-A2限制性應(yīng)答。如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的特異性體液反應(yīng)，說明抗原內(nèi)存在引起體液應(yīng)答的抗原表位。如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的TH HLA-DR1限制性應(yīng)答，說明抗原中存在引起TH HLA-DR1限制性應(yīng)答的抗原表位。如小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答，說明抗原中存在引起CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。
在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)方法包括對小鼠體內(nèi)的對抗原的Th1-特異性應(yīng)答和Th2-特異性應(yīng)答進(jìn)行測定。在這種情況下，如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的Th1-特異性應(yīng)答，說明存在引起小鼠體內(nèi)對抗原的Th1-特異性應(yīng)答的抗原表位，而在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的Th2-特異性應(yīng)答，說明存在引起小鼠體內(nèi)對抗原的Th2-特異性反應(yīng)的抗原表位。
本發(fā)明還提供一種確定在候選抗原或抗原組中存在HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的方法，該方法包括將候選抗原或抗原組施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠；并測定小鼠體內(nèi)對抗原的TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答。如在小鼠體內(nèi)觀察到針對抗原TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答，說明抗原中存在引起TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。
另外，本發(fā)明提供了一種包含通過以上段落中的方法確定出的HLADR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的分離的抗原。在一些實(shí)施方式中，該分離的抗原還包括引起體液應(yīng)答的抗原表位和/或引起CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。在一些實(shí)施方式中，包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含多肽。在另一些實(shí)施方式中，包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些實(shí)施方式中，包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含DNA、RNA，或DNA和RNA。
另外，本發(fā)明提供了一種確定候選抗原或抗原組中是否存在HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的方法，該方法包括將候選抗原或抗原組施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的小鼠中；并測定小鼠體內(nèi)對該抗原或抗原組的HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如在小鼠體內(nèi)觀察到針對該抗原或抗原組的HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，說明抗原或抗原組中存在引起HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的抗原表位。
本發(fā)明提供了一種包含通過以上段落中方法確定的HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的分離的抗原。在一些實(shí)施方式中，抗原還包含引起體液應(yīng)答的抗原表位和/或引起TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。在一些實(shí)施方式中，包含HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的抗原包含多肽。在一些實(shí)施方式中，包含HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些實(shí)施方式中，包含HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的抗原包含DNA、RNA、或DNA和RNA。
該發(fā)明還提供了一種比較由兩種或兩種以上的疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的方法。這種方法包括將第一種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由該疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；將第二種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由第二種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，測量小鼠體內(nèi)由該種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；通過比較每種疫苗所引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，確定各種疫苗引起T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的能力。在一些實(shí)施方式中，T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DR1限制性應(yīng)答。
另外，本發(fā)明提供了一種比較由兩種或兩種以上疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括將第一種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由第一種疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將第二種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由第二種疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由該種疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；通過比較各種疫苗所引起的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答確定各種疫苗引起細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力。在一些實(shí)施方式中，T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。
另外，本發(fā)明提供了一種可同時比較由兩種或兩種以上疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括將第一種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由第一種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將第二種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測量小鼠體內(nèi)由第二種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，測量小鼠體內(nèi)由該種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；通過比較每種疫苗所引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答確定各種候選疫苗引起T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力。在一些實(shí)施方式中，T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DR1限制性應(yīng)答，而T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了一種可同時確定在施用一種抗原或包含一種或多種抗原的疫苗后，小鼠體內(nèi)的體液應(yīng)答、T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括將抗原或包含一種或多種抗原的疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，測定小鼠體內(nèi)對該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應(yīng)答，測定小鼠體內(nèi)對該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，測定小鼠體內(nèi)對該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為TH HLA-DR1限制性應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答。
基于預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明還提供了一種優(yōu)化兩種或兩種以上用于人類的候選疫苗組合的方法。該方法包括同時確定小鼠在施用兩種或兩種以上候選疫苗組合后的體液應(yīng)答、T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。通過向包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中施用抗原或包含一種或多種抗原的疫苗，測定小鼠體內(nèi)對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應(yīng)答，測定小鼠體內(nèi)對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，測定小鼠體內(nèi)對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，并按照預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)測定結(jié)果選擇最優(yōu)疫苗。在一些實(shí)施方式中，兩種或兩種以上候選疫苗的不同之處僅在于疫苗中的抗原與佐劑的比例不同。在一些實(shí)施方式中，兩種或兩種以上候選疫苗的不同之處僅在于疫苗中佐劑的類型不同。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定疫苗在施用于人體后是否存在引起自身免疫疾病風(fēng)險的方法。該方法包括將疫苗施用于包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測定小鼠體內(nèi)的自身免疫應(yīng)答。如觀察到小鼠體內(nèi)出現(xiàn)自身免疫應(yīng)答，表明疫苗在施用于人體后存在引起自身免疫疾病的風(fēng)險。
本發(fā)明還提供了一種包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因和功能性HLAI類或II類轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。
另外，本發(fā)明提供了一種包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，HLAI類轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLAII類轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-DR1轉(zhuǎn)基因。在另一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
另外，本發(fā)明提供了一種缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。在另一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。


本發(fā)明將結(jié)合以下圖示進(jìn)行更詳細(xì)的描述圖1所示為轉(zhuǎn)基因分子在細(xì)胞表面表達(dá)的流式細(xì)胞檢測分析。(a)取自HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2II類-KO(DR1+CII-，左側(cè))、HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO(A2+DR1+CI-CII-，中)和HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因H-2I類/-KO(A2+CI-，右側(cè))小鼠的脾細(xì)胞，使用FITC-標(biāo)記W6/32(抗-HLA-ABC，橫坐標(biāo))或生物素化的28-8-6S(抗-H-2Kb/Db，縱坐標(biāo))m.Ab染色，后者以PE-標(biāo)記抗-小鼠lg G顯色。(b)從同種小鼠身上取得的B220+脾B淋巴細(xì)胞，使用FITC-標(biāo)記L243(抗-HLA-DR1，上)和PE-標(biāo)記AF6-120.1(抗H-2IAβb，下)m.Ab染色。
圖2顯示了具有指定基因型的小鼠體內(nèi)CD8+和CD4+脾T細(xì)胞數(shù)量和BV片段的用途(基于免疫掃描分析)。(a)取自HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2II類-KO(DR1+CII-，左側(cè))、HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO(A2+DR1+CI-CII-，中)和HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因H-2類/-KO(A2+CI-，右側(cè))小鼠的脾細(xì)胞，使用PE-標(biāo)記CT-CD4(抗-小鼠CD4，縱坐標(biāo))和FITC-標(biāo)記53-6.7(抗-小鼠CD8，橫坐標(biāo))m.Ab染色。數(shù)字與CD4+(左上部分)或CD8+(右下部分)T細(xì)胞在總的脾細(xì)胞中的百分比相對應(yīng)。(b和c)用于BV片段家族(1-20)的提純脾CD8+(b)和CD4+(c)T細(xì)胞進(jìn)行免疫掃描TR-PCR分析，采用正向BV家族(1-20)特異的和反向BC引物。有效重排的BV片段家族的典型圖像包括一系列相差3個核苷酸的帶高斯分布的波峰。該圖示說明了使用具有HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO代表性小鼠的結(jié)果。
圖3所示為HBs-特異性抗體、細(xì)胞溶解及增殖應(yīng)答。對HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類/II類-KO小鼠進(jìn)行HBs Ag-編碼質(zhì)體-DNA肌肉注射免疫，并對進(jìn)行和未進(jìn)行免疫的小鼠分別進(jìn)行測驗(yàn)。(a)體液(上)，細(xì)胞溶解(中)和增殖(下)應(yīng)答及對典型性HBsAg-DNA-免疫小鼠的特異性對照組。對含有中小HBV包膜蛋白的HBsAg分子及preS2109-134肽進(jìn)行的抗體(lgG)滴度在ELISA分析中得到確定。使用相關(guān)(HBsAg348-357，HLA-A2.1-限制性◆)或?qū)φ?HBsAg371-378，H-2Kb-限制性Δ；和MAGE-3271-279，HLA-A2.1-限制性□))肽脈沖的RMAS-HHD靶細(xì)胞對不同效應(yīng)器與靶器官(E/T)比率下的細(xì)胞溶解活動進(jìn)行評估。使用相關(guān)(HBsAg180-195，HLA-DR1-限制性)或?qū)φ?HBsAg126-138，H-2 1Ab-限制性和HIV 1 Gag263-278，HLA-DR1-限制性)肽對增殖應(yīng)答進(jìn)行測定。(b)將6只(1-6)HBsAg-DNA-免疫小鼠進(jìn)行的抗體(IgG，上)、細(xì)胞溶解(中)和增殖(下)應(yīng)答與6只初次接受試驗(yàn)的小鼠的平均應(yīng)答(0)比較進(jìn)行了類似評估。在以HBsAg348-357，免疫顯性(填充條帶)或HBsAg335-343，亞顯性(subdominant)(灰色條帶)肽脈沖的RMAS-HHD靶細(xì)胞上檢測到E/T比率為30/1的細(xì)胞溶解活性。
圖4顯示了保護(hù)分析的結(jié)果。使用編碼HBsAg的質(zhì)粒DNA對HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類/II類-KO小鼠進(jìn)行(對照組不進(jìn)行)兩次免疫。最后一次免疫完成15天后，使用表達(dá)HBsAg或HBx蛋白的107PFU的rVV對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。4天后，對這些小鼠分別進(jìn)行卵巢內(nèi)病毒滴度測試。給出了rVV-HBsAg(I，n＝10)攻擊的HBsAg-DNA-免疫小鼠，rVV-HBsAg(N，n＝6)攻擊的初次試驗(yàn)的小鼠、rVV-HBx(Ix，n＝6)攻擊的HbsAg-免疫小鼠和rVV-HBx(Nx，n＝6)攻擊的初次試驗(yàn)小鼠的結(jié)果(rVV PFU/卵巢，以log 10表示)。
圖5顯示了pcmv S2/S免疫后的HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠的AC抗-pre S2應(yīng)答。
圖6顯示了pcmv S2-S免疫后的HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠對HLA-A2限制性抗原表位的T CD4增殖應(yīng)答。
圖7顯示了pcmvS2/S免疫后的HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠對HLA-A2限制性HBS(348-357)抗原表位的CD8T細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答。
序列SEQ ID NO1包含以下部分核苷酸1-1205包含HLA-A2啟動子；核苷酸1206-1265HLA-A2引導(dǎo)序列；核苷酸1266-1565為人β2微球蛋白cDNA；核苷酸1566-1610(Gly4Ser)3接頭；核苷酸2441-4547，為含有HLA-A2外顯子2和部分內(nèi)含子3的節(jié)段；核苷酸2441-4547，為含有部分內(nèi)含子3、外顯子4-8和部分H2Db基因3′非編碼區(qū)域的節(jié)段。
SEQ ID NO2是DRA*0101基因的核苷酸序列。核苷酸1-15279是定位于HLA-DR alpha基因5’的啟動子，核苷酸15280-15425是外顯子1，核苷酸15344-15346是ATG起始密碼字，核苷酸17838-18083是外顯子2，核苷酸18575-18866是外顯子3，核苷酸19146-19311是外顯子4，核苷酸20008-20340是外顯子5。
SEQ ID NO3是DRB1*010101基因的核苷酸序列。核苷酸7391-7552是外顯子1，核苷酸7453-7455是ATG起始密碼子，核苷酸15809-16079是外顯子2，核苷酸19536-19817是外顯子3，核苷酸20515-20624是外顯子4，核苷酸21097-21121是外顯子5，核苷酸21750-22085是外顯子6。
發(fā)明詳述除非特別說明，本發(fā)明的實(shí)踐將采取細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中進(jìn)行了詳細(xì)的解釋。例如Molecular Cloning ALaboratory Manual，2nd Ed.，ed.By Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis(ColdSpring Harbor Laboratory Press1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translaion(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods InENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)andVol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；HandbookOf Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
本發(fā)明提供了包含(1)突變型H-2I類和II類分子和(2)表達(dá)HLAI類轉(zhuǎn)基因分子、或HLAII類轉(zhuǎn)基因分子、或HLA I類轉(zhuǎn)基因分子和HLAII類轉(zhuǎn)基因分子的小鼠。本發(fā)明中的缺乏H-2I類和II類分子，并具有HLAI類和II類轉(zhuǎn)基因分子表達(dá)的小鼠代表了一種完全人化的實(shí)驗(yàn)性小鼠，可用于同時檢測是否存在抗原-特異性抗體、抗原-特異性HLA-DRI限制性T細(xì)胞應(yīng)答及抗原-特異性HLA-A2限制性T細(xì)胞應(yīng)答。這些小鼠有助于研究CTL應(yīng)答、TH應(yīng)答(尤其是TH1或TH2應(yīng)答)和，任選地，體液應(yīng)答之間的相互協(xié)調(diào)是如何進(jìn)行的。這些小鼠為基礎(chǔ)以及應(yīng)用疫苗學(xué)研究提供了最佳工具。
本發(fā)明提供了一種包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因和功能性HLA I類或II類轉(zhuǎn)基因的小鼠。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因、功能性HLA I類轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類轉(zhuǎn)基因。這種小鼠可以說是一種完全人化的試驗(yàn)小鼠，因?yàn)樗杀挥糜谕瑫r檢測抗原-特異性抗體，抗原-特異性HLA-DRI限制性T細(xì)胞應(yīng)答和抗原-特異性HLA-A2限制性T細(xì)胞應(yīng)答是否存在。
部分如此處提供的實(shí)施例所示，并且每個專業(yè)人士通常都能從本發(fā)明中清楚看到的是HLA-A2.1-/HLA-DRI-轉(zhuǎn)基因H2-I/II類-KO小鼠具有通過DNA免疫產(chǎn)生HBsAg-特異性抗體、CD4+輔助細(xì)胞和CD8+溶細(xì)胞T細(xì)胞應(yīng)答的能力。這些在每個單獨(dú)受試小鼠身上觀察到的應(yīng)答指向的是和人類應(yīng)答一樣的免疫顯性表位，并且表現(xiàn)為免疫動物對HBsAg重組體疫苗病毒的特異性保護(hù)。
T輔助細(xì)胞對于抗體應(yīng)答的完全成熟(Katz，D.H.& Benacerraf，B.，Adv Immunol 15，1-94(1972))，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)激發(fā)的針對很多表位的應(yīng)答(von Boehmer，H.& Haas，W.，J Exp Med 150，1134-1142(1979)；Keene，J.A.& Forman，J.，J ExpMed 155，768-782(1982))，以及CTL長期維護(hù)都很至關(guān)重要(Matloubian，M.，Concepcion，R.J.& Ahmed，R.，JVirol 68，8056-8063(1994))。兩種抗體(Lefrancois，L.，JVirol 51，208-214(1984))以及CTL(Zinkernagel，R.M.& Welsh，R.M.，J Immunol 117，1495-1502(1976))都是抵抗病毒感染的保護(hù)性免疫的關(guān)鍵成分。實(shí)際中，有效的HBsAg-特異性抗體和CTL應(yīng)答在HLA-A2.1/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因、H-2I類/II類-KO小鼠身上觀察到，而并沒有在HLA-A2.1-單轉(zhuǎn)基因H-2I/II＝KO小鼠身上觀察到。因此，HBsAg-特異CD4+T輔助細(xì)胞對于產(chǎn)生有效的HBsAg-特異性CTL和抗體應(yīng)答很重要。這些結(jié)果與在HBsAg-免疫小鼠(Milich，D.R.，Semin LiverDis 11，93-112(1991))及HBsAg-接種的人上(Celis，E.，Kung，P.C.& Chang，T.W.，J Immunol 132，1511-1516(1984))進(jìn)行的研究相符，提示抗-HBs抗體應(yīng)答的產(chǎn)生取決于CD4+T細(xì)胞。
表達(dá)HLA-A2.1I類和HLA-DR1II類分子的轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)產(chǎn)生(BenMohamed，L.et al.Hum Immunol 61，764-779(2000))。作者提出HLA-A2.1和HLA-DR1分子都是體內(nèi)功能性限制性元件，HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物能增強(qiáng)HLA-A2.1限制性抗原-特異性CTL應(yīng)答。但是，發(fā)生在小鼠上的這些免疫應(yīng)答，其于人類的關(guān)聯(lián)性被以下事實(shí)削弱了這些小鼠仍然表達(dá)出它們自身的H-2I類和II類分子，通常這些被優(yōu)先并常常是專門作為對抗原的限制性元件使用(Ureta-Vidal，A.，F(xiàn)irat，H.，Peramau，B.& Lemonnier，F(xiàn).A.，J Immunol 163，2555-2560(1999)；Rohrlich，P.S.etal.，Int Immunol 15，765-772(2003))(A.Pajot，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。此處描述的發(fā)明通過提供HLA-A2.1/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類/II類-KO小鼠克服了該限制。
在一些實(shí)施方式中，HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類/II類-KO小鼠在β2m-KO背景下表達(dá)HLA-A2.1單鏈，其中的人類β2m通過肽鍵與HLA-A2.1重鏈通過共價鍵相連。H-2IAβb基因失活，使得它們還缺乏在細(xì)胞表面?zhèn)鹘y(tǒng)表達(dá)的H-2IA和IEII類分子，因?yàn)樵贖-2b單倍體中H-2IEa是假基因。此處提供的結(jié)果說明這種小鼠不具有H-2I類和II類分子的細(xì)胞表面表達(dá)。但是，在一例報告中指出，自由I類重鏈，尤其是H-2Db，可能存在于β2m-KO小鼠細(xì)胞表面，并可能引起同種異體反應(yīng)性應(yīng)答。即便如此，由于這種小鼠缺乏多肽，它們不會干擾抗原-特異性免疫應(yīng)答(Bix，M.& Raulet，D.，J Exp Med 176，829-834(1992))。這一點(diǎn)在Allen et al的報告中得到了支持(Allen，H.，F(xiàn)raser，J.，F(xiàn)lyer，D.，Calvin，S.& Flavell，R.，ProcNatl Acad Sci U S A 83，7447-7451(1986))，該報告確認(rèn)即使細(xì)胞內(nèi)不呈現(xiàn)β2m表達(dá)，細(xì)胞表面也存在H-2Db表達(dá)，但這種Db抗原不會被Db-異種特異性或Db-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識別。另外，Db抗原不能被大多數(shù)天然Db的單克隆抗體識別。
盡管如此，在HLA-DRα單轉(zhuǎn)基因小鼠中，非傳統(tǒng)HLA-DRα/H-2IEβb雜交復(fù)合體可某種程度地在細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，至少在缺乏HLA-DRβ鏈時(Lawrance，S.K.etal.，Cell 58，583-594(1989))。除開這些發(fā)現(xiàn)，即使使用會同這些雜交分子發(fā)生反應(yīng)的mAb(17-3-3S)，采用血清學(xué)的方法也未在HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠的細(xì)胞表面測出這些非傳統(tǒng)分子(Ozato，K.，Mayer，N.& Sachs，D.H.，J Immunol 124，533-540(1980))(圖1a和數(shù)據(jù)未被顯示)。另外，對這些小鼠的HBsAg-特異性和HIV 1-Gag-特異性T細(xì)胞應(yīng)答的研究結(jié)果均表明HLA-A2.1和HLA-DR1分子作為限制性元件的專門用途。這說明非傳統(tǒng)HLA-DRα/H-2IEβb雜交分子不如傳統(tǒng)HLA-DRα/HLA-DRβ分子穩(wěn)定，而且它們可能只存在于缺少HLA-DRβ鏈的情況中。采用整個(H-2IAβb、IAαb、IEβb)H-2II類基因區(qū)域以及H-2 Db基因被刪除的小鼠菌株進(jìn)行分析，以完全排除此可能性。對取自第一種動物的脾細(xì)胞的初步分析顯示出與在HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2II類-KO(Iαβbo)小鼠身上所觀察到的類似的CD4+T細(xì)胞池再生，提示這些小鼠的HLA-DR1-限制性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答與HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠的等同。
與親代HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-KO小鼠相比，HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因，H-2I類-/II類-KO小鼠的外周CD8+T淋巴細(xì)胞從數(shù)量和質(zhì)量上都與完全多樣化類似，至少在T細(xì)胞受體(TCR)BV基因片段的利用方面。與野生動物相比，部分恢復(fù)，尤其是CD8+T細(xì)胞池的部分恢復(fù)，一直是對具有嵌合(原小鼠的α3結(jié)構(gòu)域)HLA-A2.1分子表達(dá)的單HLA-轉(zhuǎn)基因小鼠的一個觀察對象。不管α3結(jié)構(gòu)域的置換，小鼠的CD8與HLA-A2.2分子之間也具有次最優(yōu)的相互作用，因?yàn)镃o-晶體分析表明人類CD8也與HLA-A2.1重鏈α2結(jié)構(gòu)域相互接觸(Gao，G.F.etal.，Nature 387，630-634(1997))。次最優(yōu)的協(xié)同作用還可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，許多分子(TAP，tapasine，ERp 57)參與MHC I類分子的生物合成。但是，在這個階段，文獻(xiàn)唯一報道的這些小鼠和人類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子的功能性差異(即人類的有效轉(zhuǎn)運(yùn)，而不是羧基末端帶有正電荷的小鼠細(xì)胞溶質(zhì)肽TAP)(Momburg，F(xiàn).，Neefjes，J.J.& Hammerling，G.J.，CurrOpin Immunol 6，32-37(1994))與通過疏水的C-末端結(jié)合肽的HLA-A2.1分子無關(guān)，既然這些肽被小鼠和人類TAP有效地轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)目在單HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因，H-2類/-KO小鼠和HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠中較低，然而它們在抗HBsAg方面起著有效的作用，并且，重要的是，后一種小鼠可產(chǎn)生與人類類似的抗體、輔助細(xì)胞和細(xì)胞溶解等淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
妨礙基于T抗原表位的針對T淋巴細(xì)胞的疫苗設(shè)計的困難之一是HLA I類/II類分子多態(tài)性。HLA-A2.1和HLA-DR1分子在人類個體中具有顯著比例的表達(dá)(HLA-A2.130-50％，HLA-DR16-18％)。盡管已知HLAI類分子超家族中功能簇是基于呈遞的肽34組的顯著重復(fù)，但對由各種HLAI類同型或等位變體引起的應(yīng)答的個體分析中，確定其最佳抗原表型仍然是迫切期望的。這對于設(shè)計新的監(jiān)控免疫應(yīng)答的試劑，例如四聚體(HLA-I類或HLA-II類)尤其重要。由于同樣的原因，獲取具有HLA-A2.1和其它HLAII類分子共同表達(dá)的小鼠菌株很有幫助，即使肽與HLAII類分子的連接比與I類分子的連接限制少?；诖颂幍慕Y(jié)論，更多的HLAI類/II類轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠可被設(shè)計作為這些以及其它目的。
盡管HLA-轉(zhuǎn)基因H-2-KO小鼠使得進(jìn)行可很好的可移置于人的抗原肽的免疫原性的詳細(xì)分析和優(yōu)化成為可能(Rohrlich，P.S.et al.，IntImmunol 15，765-772(2003)；Loirat，D.，Lemonnier，F(xiàn).A.& Michel，M.L.，JImmunol 165，4748-4755(2000)；Scardino，A.etal.，Eur J Immunol 31，3261-3270(2001))，但這對于疫苗佐劑組成的研究的作用并不明顯。這可能是由于兩種物種之間在抗原激發(fā)的反應(yīng)早期多種啟動的效應(yīng)器的不同引起的。將來，不斷增加對先天免疫方面的基礎(chǔ)知識的認(rèn)識，可能有助于更加完善小鼠免疫系統(tǒng)的人類化。
總之，本發(fā)明描述了一種優(yōu)化的、人類化轉(zhuǎn)基因小鼠模型，小鼠中的H-2I類(小鼠β2m)和II類(H-2IAβb)基因被刪除并被相應(yīng)的人類基因HHD(HLA-A*0201)，HLA-DRA*0101和HLA-DRB1*0101替代。HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠的細(xì)胞免疫完全由人類HLA分子所限制，完全不具備鼠MHC分子所限制的免疫應(yīng)答。缺少鼠類MHC和人類(轉(zhuǎn)基因)HLA免疫應(yīng)答之間的競爭使得可以用這種小鼠來確定人類疫苗的表位，人類疫苗需要HLA-限制性CD4+T輔助細(xì)胞和HLA-限制性CD8+T溶細(xì)胞性細(xì)胞之間的合作。
“HLA”是人類MHC復(fù)合物，而“H-2”是小鼠MHC復(fù)合物。人類復(fù)合物包括三種I類α-鏈基因，HLA-A、HLA-B和HLA-C，和三對MHCII類α-和β鏈基因HLA-DR、-DP和-DQ。在許多單倍體中，HLA-DR簇包含一種額外的β鏈基因，其產(chǎn)物可與DRα鏈配對，因此這三組基因可生成四種MHCII類分子。在小鼠中，這三種I類α-鏈基因?yàn)镠-2-L、H-2-D和H-2-K。小鼠MHCII類基因?yàn)镠-2-A和H-2-E。
已知，作為多態(tài)性HLA抗原和不同HLA等位基因的結(jié)果，不同個體的HLA基因之間存在遺傳差異。相應(yīng)地，本發(fā)明所述的實(shí)施方式中的多態(tài)性HLA抗原或HLA等位基因可能會從一種換為另一種。HLA多態(tài)現(xiàn)象和等位基因的例子可在以下地方找到例如http//www.anthonynolan.org.uk/HIG/data.Html、http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla、Genetic diversity of HLAFunctional andMedical Implication，Dominique Charon(Ed.)，EDK Medical and ScientificInternational Publisher，and The HLA FactsBook，Steven G.E.Marsh，PeterParham and Linda Barber，AP Academic Press，2000。
“斷裂的(disrupted)”基因是一種通過同源重組或其它已知方法進(jìn)行突變的基因。斷裂的基因可能是基因的下效等位基因或基因的無效等位基因。專業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)將要使用的等位基因的類型，并根據(jù)任何特定的環(huán)境進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中，優(yōu)選的是無效等位基因。
“同源重組”是一種通用的對預(yù)先選中的、需要的細(xì)胞基因序列進(jìn)行靶向突變，以得到轉(zhuǎn)基因動物的方法(Mansour，S.L.et al.，Nature 336348-352(1988)；Capecchi，M.R.，Trends Genet.570-76(1989)；Capecchi，M.R.，Science 2441288-1292(1989)；Capecchi，M.R.etal.，InCurrentCommunications in Molecular Biology，Capecchi，M.R.(ed.)，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，pp.45-52；Frohman，M.A.etal.，Cell56145-147(1989))。
現(xiàn)在，想要改變小鼠的任何基因都是可行的(Capecchi，M.R.，TrendsGenet.570-76(1989)；Frohman，M.A.etal.，Cell 56145-147(1989))。基因打靶涉及到標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)的使用，以將所需的突變引入到選中的基因座中的克隆DNA序列。隨后，這種突變再通過同源重組傳入多能胚胎源性干細(xì)胞(ES)的基因組中。改變后的干細(xì)胞通過顯微注射進(jìn)入小鼠胚泡中并成為發(fā)育中的小鼠胚胎的一部分，最終形成嵌合體動物。在有的情況下，該嵌合體動物的生殖譜系細(xì)胞將從遺傳改變的ES細(xì)胞分化而來，于是突變的基因型可以通過生育來進(jìn)行傳遞。
基因打靶已被用于培育將nptII基因嵌入β2-微球蛋白基因座的嵌合體和轉(zhuǎn)基因小鼠(Koller，B.H.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)868932-8935(1989)；Zijistra，M.et al.，Nature 342435-438(1989)；Zijfstra，M.et al.，Nature 344742-746(1989)；DeChiaba etal.，Nature 34578-80(1990))。類似的試驗(yàn)可用于培育包含被嵌入nptII基因破壞的ac-abl基因的嵌合體和轉(zhuǎn)基因動物(Schwartzberg，P.L.etal.，Science 246799-803(1989))。這種技術(shù)被用于培育en-2基因被嵌入的nptII基因打斷的嵌合體Robertson，Ed.)，IRL Press，Oxford，1987)來實(shí)現(xiàn)，該參考和方法均在此引用作為參考。這種克隆繁殖的目的是為了獲得能夠高效分化形成動物的ES細(xì)胞。同源選擇的ES細(xì)胞形成轉(zhuǎn)基因動物的效率是CCE祖細(xì)胞株的約10倍。對于本發(fā)明中重組方法的目的，克隆選擇不具有優(yōu)勢。
從胚胎中克隆獲得的ES細(xì)胞株的一個例子是ES細(xì)胞株，AB1(hprt+)或AB2.1(hprt-)。ES細(xì)胞最好是在基質(zhì)細(xì)胞(如STO細(xì)胞(尤其是SNC4STO細(xì)胞)和/或原代胚胎成纖維細(xì)胞)上進(jìn)行培育。如E.J.Robertson所描述的那樣(InTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach，(E.J.Robertson，Ed.，IRL Press，Oxford，1987，pp 71-112)，在此引用作為參考。嵌合小鼠的培育和分析方法在Bradley，A的文獻(xiàn)中進(jìn)行了介紹(InTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，(E.J.Robertson，Ed.)，IRL Press，Oxford，1987，pp 113-151)，在此引用作為參考。基質(zhì)(和/或成纖維)細(xì)胞的作用是消滅異常ES細(xì)胞的克隆性生長。最好是在存在白細(xì)胞抑制因子(″lif″)的環(huán)境中培育細(xì)胞(Gough，N.M.etal.，Reprod.Fertil.Dev.1281-288(1989)；Yamamori，Y.et al.，Science 2461412-1416(1989)，在此引用作為參考)。既然基因編碼lif已被克隆(Gough，N.M.et al.，Reprod.Fertig.Dev.1281-288(1989))，特別建議根據(jù)已知的方法，用這種基因來轉(zhuǎn)化基質(zhì)細(xì)胞，然后在轉(zhuǎn)化后的可分泌lif入培養(yǎng)基的基質(zhì)細(xì)胞上培育ES細(xì)胞。
本處使用的“轉(zhuǎn)基因”指的是部分或完全異源的核酸序列，即，與它所引入的轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞完全異質(zhì)，或與被引入的轉(zhuǎn)基因動物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，但將被或已被嵌入動物基因組以改變被嵌入細(xì)胞的基因組的核酸序列(如被嵌入與自然基因不同的部位或其嵌入造成基因缺失)。轉(zhuǎn)基因可以通過操作與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和任何其它能最小鼠(Joyner，A.L.etal.，Nature 338153-155(1989))。
采用“基因打靶”方法，必須對興趣基因預(yù)先進(jìn)行克隆，并確定內(nèi)含子及外顯子邊界。這種方法的結(jié)果是將標(biāo)志基因(如nptII基因)嵌入感興趣的特定基因的轉(zhuǎn)譯區(qū)。這樣，使用基因打靶方法就造成了對感興趣的基因的破壞。
使用基因打靶來改變細(xì)胞的基因顯著地引起了該基因序列結(jié)構(gòu)的變化?；虼虬械男ЧQ于一系列的可變因素，并且根據(jù)結(jié)構(gòu)不同而不同。
本發(fā)明中的嵌合體或轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞通過向細(xì)胞(可能是前體多能細(xì)胞，如ES細(xì)胞，或者同等細(xì)胞)中引入一種或多種DNA分子制備的(Robertson，E.J.，InCurrent Communications in Molecular Biology，Capecchi，M.R.(ed.)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，pp.39-44)?！扒绑w”只是表明多能細(xì)胞是所需要的(轉(zhuǎn)染的)多能細(xì)胞的前體，是按照本發(fā)明的指導(dǎo)來培育的。多能(前體或轉(zhuǎn)換后的)細(xì)胞可以按照已知的方法(Evans，M.J.etal.，Nature 292154-156(1981))在體內(nèi)進(jìn)行培育以形成嵌合體或轉(zhuǎn)基因動物。
任何ES細(xì)胞都可以按照本發(fā)明的指導(dǎo)使用。但是，優(yōu)先選擇ES細(xì)胞的原代分離株。這種初期分離細(xì)胞可直接從胚胎中獲得，如CCE細(xì)胞株(Robertson，E.J.，InCurrent Communications in Molecular Biology，Capecchi，M.R.(ed.)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，pp.39-44)，或從CCE細(xì)胞株中的ES細(xì)胞克隆分離株中得來(Schwartzberg，P.A.etal.，Science 246799-803(1989)，將該文通過引用并入本文)。這種克隆分離株可根據(jù)E.J.Robertson的方法(InTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，(E.J.佳表達(dá)所選核酸而所需的核酸(如內(nèi)含子)相連。本發(fā)明的示范轉(zhuǎn)基因編碼含有H-2多肽。其它示范轉(zhuǎn)基因被用于通過與HLA基因的基因組序列同源重組來破壞一種或多種HLA基因。
“功能性轉(zhuǎn)基因”是產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄物，這種轉(zhuǎn)錄物又能在包含轉(zhuǎn)基因的小鼠的至少一個細(xì)胞中生成適當(dāng)處理的蛋白質(zhì)的基因。專業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)到各種已知轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后處理的序列提供了很多指導(dǎo)宿主小鼠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的選擇。在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中，在H-2基因調(diào)節(jié)元件控制下進(jìn)行HLA轉(zhuǎn)基因表達(dá)可被優(yōu)先考慮。
在一些實(shí)施方式中，HLAI類轉(zhuǎn)基因是HLA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLAII類轉(zhuǎn)基因是HLA-DR1轉(zhuǎn)基因。HLA-A2轉(zhuǎn)基因的一個例子是一種包含序列表中提供的HLA-A2序列的基因。HLA-DR1轉(zhuǎn)基因的一個例子是一種包含序列表中提供的HLA-DR1序列的基因。
在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一些實(shí)施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。在其它實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
本發(fā)明還提供了分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在有的情況中的細(xì)胞包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2II類基因和功能性HLAI或II類轉(zhuǎn)基因。在另一些情況中，細(xì)胞包含斷裂的H2I類基因，斷裂的H2II類基因、功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因。HLAI類轉(zhuǎn)基因可以是HLA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLAII類轉(zhuǎn)基因可以是HLA-DR1轉(zhuǎn)基因。在一些情況中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。這種分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞包含HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。HLA-A2轉(zhuǎn)基因可包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因可包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
本發(fā)明中的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞可具有本發(fā)明中的任何小鼠的基因型。但是，本發(fā)明中的分離的小鼠細(xì)胞的基因型和本發(fā)明中小鼠的基因型不需要完全重疊。
本發(fā)明中的分離的小鼠細(xì)胞可以從小鼠或小鼠胚胎中獲得。在一個實(shí)施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有與將要獲取的細(xì)胞一樣的基因型。在另一個實(shí)施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有與將要獲得的細(xì)胞不同的基因型。當(dāng)細(xì)胞從小鼠或小鼠胚胎中獲得后，細(xì)胞的基因可以通過如同源重組的方法破壞。另外，功能性轉(zhuǎn)基因可通過，如轉(zhuǎn)染的方法被引入細(xì)胞的基因組中。專業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)任何已知的適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎杀挥糜谛薷募?xì)胞的基因組，并由此獲得具有理想基因型的分離的小鼠細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。在其它實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
T細(xì)胞在獲得性免疫的很多方面都具有重要的作用，實(shí)現(xiàn)了多種調(diào)節(jié)和防御功能。當(dāng)有的T細(xì)胞遇到感染或癌性細(xì)胞，它們會將其視為外來物并發(fā)揮殺手細(xì)胞的作用，作為細(xì)胞性免疫應(yīng)答的一部分，殺死宿主本身的細(xì)胞。其它T細(xì)胞，如T輔助細(xì)胞，將通過刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或者抑制體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答的某些方面，而對外來抗原作出應(yīng)答。
T輔助細(xì)胞(Th)通過產(chǎn)生細(xì)胞因子協(xié)調(diào)多數(shù)免疫應(yīng)答。盡管通?？筛鶕?jù)攜帶CD4細(xì)胞表面標(biāo)記物識別，這些細(xì)胞根據(jù)它們生成的細(xì)胞因子和它們對于免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞的影響，從功能上被分為Th1或Th2亞群。
Th1細(xì)胞通過被稱為T細(xì)胞抗原受體的識別系統(tǒng)檢測入侵的病原體或癌性宿主細(xì)胞。被稱為細(xì)胞免疫的Th1-相關(guān)免疫過程通常涉及非-B細(xì)胞的激活作用，并常常以生成IFN-γ作為特征。但是，盡管Th1系統(tǒng)基本上獨(dú)立于體液性抗體的生成，Th1細(xì)胞因子確實(shí)促進(jìn)了向lgG2a同種型的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換。
檢測到外來抗原后，大多數(shù)成熟的Th1細(xì)胞將指導(dǎo)釋放出IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF、高水平的TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。這些細(xì)胞因子將促進(jìn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和普通細(xì)胞介導(dǎo)免疫。例如IL-2是一種細(xì)胞生長因子，它可促進(jìn)對初期檢測出來的特定的抗原敏感的T細(xì)胞克隆的生成。致敏T細(xì)胞附在細(xì)胞上并攻擊帶有這種抗原的細(xì)胞或病菌。
相反，成熟的Th2細(xì)胞可促進(jìn)IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平TNF-α的分泌。另外，Th2應(yīng)答通過激活B細(xì)胞、刺激抗體的生成和分泌、以及引導(dǎo)向IgA、lgG1和IgE同種型的類型轉(zhuǎn)換來促進(jìn)體液免疫。
此處使用的“抗原”包含1)至少一種HTL抗原表位、或2)至少一種CTL抗原表位、或3)至少一種B細(xì)胞抗原表位、或4)至少一種HTL抗原表位和至少一種CTL抗原表位、或5)至少一種HTL抗原表位和至少一種B細(xì)胞抗原表位、或6)至少一種CTL抗原表位和至少一種B細(xì)胞抗原表位、或7)至少一種HTL抗原表位和至少一種CTL抗原表位和至少一種B細(xì)胞抗原表位?！昂蜻x抗原”是一種處于調(diào)查階段，確定其是否能作為抗原的分子。
“體液免疫應(yīng)答”是一種抗體-介導(dǎo)的特異性免疫。
“抗原表位”是被免疫系統(tǒng)識別出來的抗原上的一個位點(diǎn)。抗體抗原表位是被抗體識別出來的抗原上的一個位點(diǎn)。T-細(xì)胞抗原表位是抗原上與MHC分子相連的一個位點(diǎn)。TH抗原表位是與MHCII類分子相連的位點(diǎn)。CTL抗原表位是與MHCI類分子相連的位點(diǎn)。
抗原可以包含多肽序列或多核苷酸序列(可含有RNA、DNA、或RNA和DNA)。在一個實(shí)施方式中，抗原至少包含一種編碼包含一種或多種抗原多肽的多核苷酸序列。在本文中，“包含”指的是宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和/翻譯工具通過與編碼至少一種抗原多肽的外源多核苷酸提供了至少一種抗原多肽。如以下專利中所描述U.S.專利No.6,194,389 and 6,214,808。
本發(fā)明中的抗原可以是任何抗原分子?？乖肿影ǖ鞍踪|(zhì)、脂蛋白、糖蛋白(包括病毒的、細(xì)菌的、寄生的、動物)和真菌蛋白(如白蛋白、破傷風(fēng)毒素、破傷風(fēng)毒素、百日咳菌、細(xì)菌外膜蛋白(包括腦膜炎球菌外膜蛋白)、RSV-F蛋白、瘧疾衍生肽、B-乳球蛋白B、抑酞酶、卵白蛋白、溶菌酶和腫瘤相關(guān)抗原(如癌胚抗原(CEA)、CA 15-3、CA125、CA19-9、前列腺特異性抗原(PSA)和TAA復(fù)合物(U.S.專利No.5,478,556，在此全文引用作為參考)；碳水化合物(包括天然的和合成多糖以及其它聚合物，如聚蔗糖、葡聚糖、羧甲基纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺和其它丙烯酸樹脂、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙烯醇、局部水解聚醋酸乙烯酯、polyvinyl pryrolidine、B類葡萄球菌和肺炎球菌莢膜多糖(包括III型)、銅綠假單胞菌胞外粘液多糖和莢膜多糖(包括fisher type I)和流感(嗜血)桿菌多糖(包括PRP)；半抗原和其它包含低分子重量分子，如TNP、糖、低聚糖、多糖、肽、毒素、藥物、化學(xué)藥品和變應(yīng)原；以及從細(xì)菌、立克次(氏)體、真菌、病毒、寄生蟲中衍生出來的半抗原和抗原，包括白喉、百日咳、破傷風(fēng)、乙型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、克雷白(氏)桿菌屬、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、脊髓灰質(zhì)炎、腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、呼吸道合胞病毒、狂犬病、伊波拉出血癥、炭疽、李斯特菌屬、甲/乙/丙型肝炎、I類/II類人免疫缺陷癥病毒、1/2型單純性皰疹、巨細(xì)胞病毒、EB病毒(非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒)、水痘帶狀皰疹、瘧疾、結(jié)核、白色念珠菌和其它念珠菌屬、卡氏肺孢子蟲，支原菌、A/B流行感冒病毒，腺病毒、A組鏈球菌屬、B組鏈球菌屬、假單胞菌aeryinosa、鼻病毒屬、利什曼原蟲屬、1/2/3型副流感、冠形病毒、門(氏)菌、志賀(氏)桿菌、輪狀病毒、弓形體屬、腸道病毒，和沙眼衣原體和肺炎衣原體。
此處的藥物合劑或疫苗包含至少一種免疫組分，這種組分能溶解、懸浮或與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合。任何藥學(xué)上可采用的載體都能被用于給藥。合適的藥物載體在下文中進(jìn)行了描述Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition(A.Gennaro，ed.，1990)Mack Pub.，Easton，Pa.，在此將其全文通過引用并入本文。載體可以是無菌液體，如水、聚乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)、油(包括石油、動物油、植物油、花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。載體可以以霧狀、噴霧劑、粉狀、蠟狀、膏狀、栓劑、埋植劑、對氧水楊酸鈉、軟膏、片狀、敷劑、膜狀或化妝品制劑的形態(tài)存在。
藥物合劑或疫苗的適當(dāng)組成取決于所選擇的給藥途徑。例如當(dāng)通過單次快速靜脈注射或連續(xù)輸注進(jìn)行靜脈給藥時，藥物最好是水溶性的，并且最好選擇鹽水作為載體。對于經(jīng)皮、鼻內(nèi)、口腔、胃、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或其它通過粘膜給藥，可選擇適當(dāng)?shù)哪芡高^屏障的滲透劑作為藥物成分。對于口服給藥，活性成分可與適于加入片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、混懸液的載體結(jié)合使用。時間敏感的給藥系統(tǒng)也可用于本發(fā)明的合劑給藥。代表系統(tǒng)包括聚合物基材系統(tǒng)，如聚(丙交酯糖苷)、copolyoxalates、聚己酸內(nèi)酯、聚酯酰胺、多正酯類、聚-3-羥基丁酸和聚酐。這些及類似聚合物可根據(jù)已知的方法(如U.S.專利No.5,075,109中的方法，在此全文引用作為參考)制成微包囊。適于本發(fā)明中的免疫刺激復(fù)合物的多選擇給藥系統(tǒng)包括在以下專利中提到的方法U.S.專利No.6,194,389，6,024,983 5,817,637，6,228,621，5,804,212，5,709,879，5,703,055，5,643,605，5,643,574，5,580,563，5,239,660，5,204,253，4,748,043，4,667,014，4,452,775，3,854,480，和3,832,252(在此均全文應(yīng)用作為參考)。
葡萄糖水溶液和甘油溶液也可被作為液體載體使用，尤其是用于注射液和氣溶膠溶液。對于通過氣溶膠(使用自動噴霧罐或噴霧器)給藥，專業(yè)人員可酌情加入適當(dāng)?shù)膰娚鋭Ｃ庖邚?fù)合物中還可以加入增溶劑、乳化劑、穩(wěn)定劑；分散劑、調(diào)味劑；佐劑；載體；局麻劑(如賽魯卡因、利多卡因等)；抗生素或其它已知或可疑的抗病毒、抗真菌、抗寄生物或抗腫瘤復(fù)合物進(jìn)行配置。
“佐劑”是一種可促進(jìn)或增強(qiáng)對目標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答的復(fù)合物。專業(yè)人員能選擇適當(dāng)?shù)淖魟┻M(jìn)行本發(fā)明中的實(shí)踐。
本發(fā)明包括通過施用本發(fā)明中的一種或多種抗原，對需要免疫刺激的病人進(jìn)行治療的方法。本處的治療包括與任何疾病、狀況、異?；虬Y狀相關(guān)的矯正、滋補(bǔ)、改善和預(yù)防方法。治療還進(jìn)一步包括在試驗(yàn)動物或體外引起或抑制免疫應(yīng)答。
因此，治療包括通過任何普通專業(yè)人員所熟知的方法(通常包括口服或鼻內(nèi)途徑、以及靜脈、肌肉和皮下注射，但也包括腹膜內(nèi)、體內(nèi)、關(guān)節(jié)問、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、表面、扁桃體、粘膜、經(jīng)皮、陰道內(nèi)及管飼法途徑)給予免疫刺激量的本發(fā)明中的任何免疫刺激復(fù)合物。
熟練的專業(yè)人員都知道，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法對治療的效果有幫助，對一些應(yīng)用應(yīng)優(yōu)先選擇局部給藥?？刹捎玫木植拷o藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、玻璃體內(nèi)、吸入或灌洗、口服、鼻內(nèi)給藥以及向預(yù)先確定的組織、器官、關(guān)節(jié)、腫塊或細(xì)胞群的定向注射。例如，粘膜應(yīng)用或向粘膜淋巴節(jié)或派伊爾(氏)淋巴集結(jié)中注射可以促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，引起實(shí)質(zhì)性的lgA類轉(zhuǎn)換?；蛘?，向傷口、病灶或身體感染部位進(jìn)行靶注射可以用于治療實(shí)體瘤、局限性感染或其它需要免疫刺激的部位。
或者，免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞)可以從宿主中取出，并在體外進(jìn)行處理。處理過的細(xì)胞可進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)或重新輸入病人體內(nèi)(或輸入異源宿主中)以提供對病人或宿主的免疫刺激。例如，骨髓細(xì)胞可以被從病人身上抽出，并使用HDR進(jìn)行處理以刺激全身或特異性免疫。高劑量輻射或類似處理可被用于毀壞病人體內(nèi)剩余的免疫細(xì)胞。在重新植入后，自體刺激細(xì)胞在病人體內(nèi)將恢復(fù)正常的免疫功能?；蛘?，從癌癥病人體內(nèi)分離NK和/或T細(xì)胞可在體外暴露于一種或多種病人癌癥的特異性抗原中。在被重新植入病人體內(nèi)后，抗原刺激細(xì)胞將對癌癥細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的分子免疫應(yīng)答。
免疫刺激(有效)量指的是能在病人體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，足以阻止、改善或治療致病攻擊、過敏癥、或免疫異常的疫苗的量。免疫刺激量指的是，與將抗原施用于未預(yù)先使用疫苗治療病人所獲得的應(yīng)答相比，能提供可測定的對抗原的至少一種抗原表位的體液或分子免疫應(yīng)答提高的量。因此，舉例來說，免疫刺激量指的是能促進(jìn)針對感興趣的抗原表位的抗體的生成，或能激發(fā)可測定的對致病或致敏刺激的保護(hù)作用，或能促進(jìn)針對感興趣的抗原表位的CTL應(yīng)答的含抗原藥物的量。
使用本發(fā)明中的免疫刺激量的含抗原藥物進(jìn)行治療包括引起宿主(尤其是包含至少一種免疫系統(tǒng)細(xì)胞或細(xì)胞株衍生物的體外組織培養(yǎng)宿主細(xì)胞)內(nèi)免疫應(yīng)答的任何直接、間接或統(tǒng)計學(xué)上可見或可測量的增長或其它想要的變化。宿主細(xì)胞可以從人類或動物外周血、淋巴結(jié)或類似物中衍生出來。優(yōu)先選擇的組織培養(yǎng)宿主細(xì)胞包括新提取的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞。每種都可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離或提純出來?？梢姷幕蚩蓽y的應(yīng)答包括B或T細(xì)胞增殖或激活；抗體分泌增加；同型體轉(zhuǎn)換；細(xì)胞因子釋放增多，尤其是一種或多種IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，GM-CSF，IFN-γ，TNF-α，TNF-β，GM-CSF，MIP-1α，MIP-1β，或RANTES釋放增多；對特異性抗原的抗體滴度或親和力增加；與致病感染相關(guān)的發(fā)病或死亡率降低；促進(jìn)、引起、維持或延長病毒潛伏期；抑制或改善惡性和良性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移或作用；以及提供對疾病或疾病效應(yīng)的預(yù)防性保護(hù)。
當(dāng)需要抑制免疫應(yīng)答時，如，在自身免疫性疾病或過敏癥的治療中，有效劑量還包括足以引起可測量或可觀察的與待治療的病況或病理有關(guān)的應(yīng)答降低。
含抗原藥物的劑量及給藥頻率可以按經(jīng)驗(yàn)來確定，并考慮到所治療病人的年齡和身材，以及病情或所治療的疾病。適當(dāng)?shù)膭┝吭?.01微克至100微克/次接種范圍內(nèi)，但也可略高于或低于這個量。第二次加強(qiáng)免疫可在間隔一周至數(shù)月后進(jìn)行。
以下實(shí)施例對本發(fā)明中的某些實(shí)施方式進(jìn)行了說明。普通的專業(yè)人員將識別出在不改變本發(fā)明本質(zhì)和范圍的前提下進(jìn)行的各種修改和變動。這些修改和變動被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍以內(nèi)。這些實(shí)施例不對本發(fā)明造成限制。
實(shí)施例以下實(shí)驗(yàn)技術(shù)和試劑被用于說明本發(fā)明中的某些非限制性實(shí)施方式。
轉(zhuǎn)基因小鼠HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2II類-KO(IAβb°)小鼠由HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因小鼠(Altmann，D.M.et al.，J Exp Med 181，867-875(1995))和H-2II類-KO(IAβb°)小鼠(Rohrlich，P.S.etal.，Int Immunol 15，765-772(2003))在Institute Pasteur of Lille雜交得來。培育表達(dá)嵌合體單鏈(HHD分子HLA-A2.1的α1-α2結(jié)構(gòu)域、H-2Db的胞漿區(qū)的α3，依靠15個氨基酸的肽接頭以其N末端與人β2m C末端相連)的HLA-A21-轉(zhuǎn)基因小鼠。將HLA-A2.1(HHD)-轉(zhuǎn)基因H-2I類-KO和HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H2II類-KO(IAβb°)小鼠進(jìn)行雜交篩選直到得到HLA-A2.1+/-/HLA-DR1+/-雙轉(zhuǎn)基因H-2-I類(β2m0)-/II類(IAβ0)-KO小鼠，用于此處所述的試驗(yàn)。使用HLA-A2.1+/-單轉(zhuǎn)基因H-2-I(β2m0)-/II(IAβ0)-KO小鼠作為保護(hù)性測定中的對照組。在Institut Pasteur巴黎的動物實(shí)驗(yàn)室中培育小鼠；所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計經(jīng)過Institut Pasteur權(quán)威機(jī)構(gòu)評估，符合法國和歐洲關(guān)于動物福利的法規(guī)和公共衛(wèi)生服務(wù)建議。
基因分型使用PCR檢測HLA-DRB1*0101、HLA-DRA*0101和HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因。在56℃，100mMNaCl、50mM Tris-HCI pH7.2，100mM EDTA，1％SDS和0.5mg/ml蛋白酶K孵育過夜，再加入250微升飽和NaCl溶液和異丙醇沉淀提取尾DNA。將樣品在70％的酒精中洗三次，并在150微升10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8中重懸起來。PCR條件為1.5mMMgCl2、1.25U的Taq聚合酶、生產(chǎn)商(InVitrogen，Carisbad，CA)提供的緩沖液、1個循環(huán)(7min，94℃)，40個循環(huán)(30sec，94℃；30sec，60℃；1min，72℃)，1個循環(huán)(4min，72℃)，使用正向引物和反向引物，對HHD5’CATTGA GAC AGA GCG GTT GGC CAC GAA GCA G 3’和5’GGA TGACGT GAG TAA ACC TGA ATC TTT GGA GTA CGC 3’和對HLA-DRB1*01015’TTC TTC AAC GGG ACG GAG CGG GTG 3’和5’CTG CAC TGT GAA GCT ACC AAC 3’，和對HLA-DRA*01015’CTCCAA GCC CTC TCC CAG AG 3’和5’ATG TGC CTT ACA GAG GCC CC3’。
FACS分析使用FITC-結(jié)合W6/32(anti-HLA-ABC，Sigma，St Louis，MO)和生物素化抗-28-8-6S(anti-H-2 Kb/Db，BD Biosciences，San Diego，CA)m.Ab在去除了紅細(xì)胞的、淋巴細(xì)胞M-提純(Tebu-bio，Le Perray en Yvelines，F(xiàn)rance)的脾細(xì)胞上進(jìn)行流式細(xì)胞分析研究。使用PE-標(biāo)記的CT-CD4抗-小鼠CD4(CALTAG，South San Francisco，CA)和FITC-標(biāo)記的53-6.7抗-小鼠CD8m.Ab(BD Biosciences)對CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色。MHCII類分子表達(dá)的分析通過質(zhì)譜柱陽性選擇B220+B淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)(Miltenyl Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)。用2.4G2m.Ab與Fc受體飽和結(jié)合，HLA-DR1和H-2IAb的表達(dá)可以用FITC標(biāo)記的L243(抗HLA-DR)和PE標(biāo)記的AF6-120.1(抗H-IAβb)(BD Bioscciences)進(jìn)行分析。使用FACS Calibur(Becton Dickinson，Bedford，MA)對多聚甲醛固定細(xì)胞進(jìn)行分析。
免疫掃描分析在自動-Macs(Miltenyi Biotec)上陽性選擇來自未經(jīng)免疫處理的小鼠的CD4+和CD8+T細(xì)胞，使用RNA簡易工具包(Qiagen，Hilden，Germany)處理RNA，并用于cDNA合成。使用BV片段家族特異性正向引物和兩個BC片段共享的反向引物對cDNA進(jìn)行PCR-擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物為從屬于內(nèi)在的BC FAM-標(biāo)記引物的延續(xù)產(chǎn)物。延續(xù)產(chǎn)物加入6％丙烯酰胺/8M尿素凝膠中電泳(7h，35w)分離，使用373A DNA測序儀(PerkinElmer Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，CA)檢測。使用免疫掃描軟件(Pannetier，C.etal.，ProcNatlAcad Sci U S A 90，4319-4323(1993))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
肽HLA-A2結(jié)合肽HBsAg348-357GLSPTVWLSV和HBsAg335-343WLSLLVPFV，H-2Kb結(jié)合肽HBsAg371-378ILSPFLPL，HLA-DR1結(jié)合肽HBsAg180-195QAGFFLLTRILTIPQS，H-21Ab結(jié)合肽HBsAg126-138REGLYFPAGGSSSG以及preS2肽HBsAg109-134MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG是通過Neo系統(tǒng)(Strasbourg，F(xiàn)rance)合成的，并溶解于濃度為1mg/ml的PBS-10％DMSO中。肽的氨基酸序列編號從HBV ayw亞型preS1域的第一個甲硫氨酸開始。
使用編碼HBV的S2-S蛋白的DNA進(jìn)行免疫在人類CMV早期快反應(yīng)基因控制下表達(dá)preS2和S HBV表面抗原的pCMV-S2.S質(zhì)粒載體(Michel，M.L.etal.，ProcNatlAcad Sci U S A 92，5307-5311(1995))編碼通過質(zhì)粒Giga Kit柱在沒有內(nèi)毒素的條件下提純。如前所述，對小鼠的再生脛骨前肌進(jìn)行注射普魯卡因麻醉(50微克每側(cè))(Davis，H.L.，Michel，M.L.& Whalen，R.G.，Hum Mol Genet 2，1847-1851(1993))。
T細(xì)胞增殖測定最后免疫的12天后，在加入10％FCS、10mM HEPES，1mM丙酮酸鈉、5×10-5M 2-巰基乙醇、100I.U/ml青霉素和100微克鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中同時培養(yǎng)去除了紅血細(xì)胞的、聚蔗糖提純脾細(xì)胞(5.106細(xì)胞/25cm2培養(yǎng)瓶(Techno Plastic Products(TPP)，Trasadingen，Switzerland))和肽-脈沖(20，微克/ml)、γ-輻射(180Gy)LPS-胚細(xì)胞(5.106細(xì)胞/培養(yǎng)瓶)。第七天，用于增殖分析細(xì)胞分于平底96孔板中，每孔5×105細(xì)胞，含3％FCS不完全RPMI培養(yǎng)基中肽沖擊、放射線照射并用內(nèi)毒素(每孔2×105細(xì)胞)處理細(xì)胞72小時。每孔細(xì)胞用1Ci 3H標(biāo)記的胸腺嘧啶處理16小時，然后用帶濾膜的TOMTEC收集器(Perkin Elmer Applied Biosystem)收集細(xì)胞，用micro-β計數(shù)器(Perkin Elmer Applied Biosystem)檢測參入的放射性。結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)形式給出，SI＝特異性肽的cpm/不相關(guān)肽的cpm。
CTL活動測量對進(jìn)行增殖測定的同一免疫脾細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞毒性測定。使用與增殖測定相同的補(bǔ)充RPMI培養(yǎng)基同時培養(yǎng)應(yīng)答細(xì)胞(5.106細(xì)胞/25cm2培養(yǎng)瓶，TPP)和刺激性肽-脈沖(20，微克/ml)γ-輻射(180Gy)LPS-胚細(xì)胞(5.106細(xì)胞/培養(yǎng)瓶)7天。在針對10微克/ml試驗(yàn)或?qū)φ针拿}沖的RMA-S HHD靶細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)4h51Cr測定中檢測溶細(xì)胞活動。特異性溶解，以％為單位，被重復(fù)計算，依據(jù)[試驗(yàn)性-自發(fā)釋放]/[最高自發(fā)性釋放]×100，減去使用對照肽觀察到的非特異性溶解。
體內(nèi)抗體產(chǎn)生測量在DNA注射前后的不同時間，使用加肝素的玻璃吸管對小數(shù)進(jìn)行眼球后穿刺，采集血樣，并通過特異性ELISA對離心法恢復(fù)的血清進(jìn)行抗HBs和抗-preS2測定。使用帶HBV小S蛋白(1微克/ml)或preS2(120-145)合成肽(1微克/ml)的提純重組體顆粒作為固相。在使用追加了10％FCS的PBST(含有0.1％Tween 20的PBS)進(jìn)行阻斷后，加入系列稀釋劑。在廣泛沖洗后，使用辣根過氧化物酶(Amersham，LittleChalfont，UK)標(biāo)記的抗小鼠lg(總lgG)對聯(lián)結(jié)抗體進(jìn)行檢測。使用系列終點(diǎn)稀釋法確定抗體滴度。單獨(dú)檢測小鼠血清，滴度是進(jìn)行至少三次測定的平均值。血清稀釋在1/100以下被視為陰性。
抗體滴度使用ELISA(Michel，M.L.etal).，Proc Natl Acad Sci U S A92，5307-5311(1995))在提純的HBV中、小蛋白或preS2合成HBs109-134肽上對免疫小鼠血清分別進(jìn)行了測定。在使用含有0.1％Tween 20，10％FCS的PBS進(jìn)行封閉并沖洗三次后，使用辣根過氧化物酶-標(biāo)記的抗-小鼠IgG(Amersham，Little Chalfont，UK)對連接抗體進(jìn)行檢測?？贵w滴度(至少三次測定的平均值)由系列終點(diǎn)稀釋法確定。滴度在1/100以下被視為陰性。
痘苗攻擊及噬菌斑測定在最后一次注射12天后，以107PFU表達(dá)HBsAg(Smith，G.L.，Mackett，M.& Moss，B.，Nature 302，490-495(1983))或HBx蛋白(Schek，N.，Bartenschlager，R.，Kuhn，C.& Schaller，H.，Oncogene 6，1735-1744.(1991))(分別由Dr B.Moss和Dr H.Schaller提供)的重組體痘苗病毒(Western Reserve strain)對DNA-注射小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。四天后，采用BHK 21細(xì)胞的噬菌斑測定分析卵巢的rVV滴度(Buller，R.M.& Wallace，G.D.，Lab Anim Sci 35，473-476(1985)。
實(shí)施例1細(xì)胞表面MHC分子表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)評估在脾細(xì)胞表面的HLA-A2.1、H-2Kb/Db、HLA-DR1和H-2IAb分子的表達(dá)。如圖1a所示，在HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因，H-2I類/II類-KO小鼠和HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因，H-2I類-KO小鼠身上觀察到相近水平的HLA-A2.1表達(dá)，但未觀察到HLA-A2.1b表達(dá)，而且只在HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2II類-KO小鼠身上觀察到了H-2Kb/Db表達(dá)。在B220+-濃縮B細(xì)胞上對細(xì)胞表面的HLA-DR1和H-2IAb表達(dá)進(jìn)行測量。如圖1b所示，在HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠和HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2II類-KO小鼠身上觀察到相近水平的HLA-DR1表達(dá)，但在HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-KO類小鼠身上未觀察到該表達(dá)。但是，細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)基因分子(尤其是HLA-DR1)表達(dá)低于內(nèi)源性H-2I類和II類分子表達(dá)。
實(shí)施例2CD4+和CD8外周淋巴細(xì)胞如圖2a所示，通過免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)分析對CD4+和CD8+外周脾淋巴細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行確定。
HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠和HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2II類-KO小鼠身上的CD4+T淋巴細(xì)胞占了脾細(xì)胞總數(shù)的13-14％。相反，H-2II類-KO小鼠身上的CD4+細(xì)胞只占脾細(xì)胞總數(shù)的2-3％(數(shù)據(jù)未顯示)，符合關(guān)于缺乏MHCII類分子小鼠的初期報告(Cosgrove，D.etal.，Cell 66，1051-1066(1991))。與預(yù)想的一樣，轉(zhuǎn)基因HLA-A2.1分子表達(dá)導(dǎo)致了CD8+外周淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加，在HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠和HLA-A2.1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-KO類小鼠中均達(dá)到了脾細(xì)胞總數(shù)的2-3％，而在β2微球蛋白(β2m)-KO MHCI類-缺失的小鼠身上只占了0.6-1％(Pascolo，S.etal.，J ExpMed 185，2043-2051(1997))。
實(shí)施例1和2中的結(jié)果表明(1)HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°小鼠的HLA-A2分子表達(dá)、H2-Kb分子缺失、CD8+外周淋巴細(xì)胞數(shù)量以及CD8+T組成成分的多樣性，通常與HLA-A2+β2m°小鼠相當(dāng)；(2)在HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°小鼠中，HLA-DR1分子表達(dá)、H2-IAb缺失、CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量以及CD4+組成成分的多樣性，通常與HLA-DR1+IAβ°小鼠相當(dāng)；(3)HLA-A2+HLA-DR 1+β2m°IAβ°小鼠具有HLA-A2+β2m°小鼠和HLA-DR1+IAβ°小鼠身上的所有優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例3T淋巴細(xì)胞受體(TCR)BV片段使用由于單MHC I類分子和單MHC II類分子的存在會減少TCR組成成分的數(shù)量和多樣性，按先前所述(Cochet，M.et al.，EurJ Immunol 22，2639-2647(1992))，通過RT-PCR免疫掃描技術(shù)在提純CD4+或CD8+脾淋巴細(xì)胞上對各BV家族和CDR3長度多樣性的表達(dá)進(jìn)行研究。在CD8+(圖2b)和CD4+(圖2c)淋巴細(xì)胞中，大多數(shù)BV家族(15/20)都表現(xiàn)出了高斯分布的顯著強(qiáng)度高峰。在外周T淋巴細(xì)胞觀察到的這種分布圖形，每一個波峰都是BV片段與3個核苷酸長度變化的CDR3亞區(qū)的功能性重排的典型表現(xiàn)(Cochet，M.etal.，Eur J Immunol 22，2639-2647(1992))。
觀察到缺乏BV 5.3和17分布(或者說其完全改變的分布趨勢)是意料中的，因?yàn)檫@兩個BV片段在C57BL/6小鼠中是假基因(Wade，T.，Bill，J.，Marrack，P.C.，Palmer，E.& Kappler，J.W.，J Immunol 141，2165-2167(1988))；Chou，H.S.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 84，1992-1996(1987)。而BV 5.1、5.2和11片段的改變的圖形是由于對應(yīng)的BV-表達(dá)T淋巴細(xì)胞亞群小而引起的(它們在C57BL/6小鼠中小于5％，在HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2II類-KO小鼠中占約2％)(數(shù)據(jù)未顯示)。除了這些情況，HLA-A2.1/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因，H-2I類/II類-KO小鼠的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞均分別顯示出TCRBV鏈?zhǔn)褂煤虲DR3多樣性，這與非-轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠的情況類似。
實(shí)施例4功能表征對Ag HBs(乙肝病毒包膜蛋白)免疫的HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°小鼠進(jìn)行分析。圖5顯示了特異性體液應(yīng)答，即如HBs S2抗體的生成所示。圖6顯示了HBS348-357的特異性DR1-限制性CD4+T增殖應(yīng)答。圖7顯示了HBS348-357或HBS335-343的特異性HLA-A2-限制性CD8+細(xì)胞溶解T細(xì)胞應(yīng)答。
這些結(jié)果表明HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°小鼠可用于對免疫個體中的特異性體液應(yīng)答、CD4+T輔助細(xì)胞的Ag-特異性HLA-DR1-限制性應(yīng)答以及Ag-特異性HLA-A2-限制性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解應(yīng)答進(jìn)行同時分析。
表1-3中提供了從小鼠身上獲得的其它信息。
表1.注射了pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2CI-CII-轉(zhuǎn)基因小鼠中的對HBV病毒包膜HLA-DR1抗原表位

表2.注射了pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2CI-CII-轉(zhuǎn)基因小鼠中的細(xì)胞溶解應(yīng)答

表3.注射pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2CI-CII轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗-PreS2抗體應(yīng)答

實(shí)施例5對HBsAg-DNA-疫苗的免疫應(yīng)答為評估HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類/II類-KO小鼠的免疫能力，以及為將它們的體液、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答與人類的這些應(yīng)答相比較，使用HBsAg-DNA質(zhì)體對小鼠進(jìn)行免疫。這些質(zhì)粒編碼兩種乙肝病毒包膜蛋白(preS2/S中蛋白和S/小蛋白)，所述蛋白在帶有乙肝病毒表面抗原的顆粒內(nèi)自組裝。目前使用的乙肝病毒疫苗包含這兩種蛋白。
如圖3a中的代表性小鼠所示，HBsAg-特異性抗體在注射HBsAg-DNA-疫苗(圖3a，上)后第12天被首次測出，而這些抗體的滴度一直增加到第24天(第二次DNA免疫后的12天后，數(shù)據(jù)未顯示)。這種早期的抗體應(yīng)答對中HBV包膜蛋白所攜帶的preS2-B細(xì)胞抗原表位(HBs109 134)和HBsAg顆粒具有特異性，與HBsAg-DNA-免疫小鼠(Michel，M.L.etal.，ProcNatl Acad Sci U S A 92，5307-5311(1995))和HBsAg免疫人類的類似應(yīng)答(Moulia-Pelat，J.P.etal.，Vaccine 12，499-502(1994))相符。
檢查對HBsAg的CD8+CTL應(yīng)答，確定HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO類小鼠的CD8+外周淋巴細(xì)胞是否從功能上受到了轉(zhuǎn)基因人類I類分子的限制。在HBV-感染HLA-A2.1+人群中，免疫顯性HLA-A2.1-限制性HBsAg-特異性CTL應(yīng)答指向HBsAg348-357(Maini，M.K.etal.，Gastroenterology 117，1386-1396(1999))和HBsAg335-343(Nayersina，R.etal.，J Immunol 150，4659-4671(1993))肽(即，觀察到了多抗原表位應(yīng)答)。在C57BL/6小鼠中，H-2Kb-限制性HBsAg-特異性CTL應(yīng)答指向HBsAg371-378肽(Schirmbeck，R.，Wild，J.& Reimann，J.，Eur J Immunol 28，4149-4161(1998))。為評估人化小鼠是否可作出與人一樣的應(yīng)答，按照此處所描述的那樣，使用相關(guān)的(HBsAg348-357，HLA-A2.1-限制性)、或?qū)φ盏?HBsAg371-378，H-2Kb-限制性；MAGE-3271-279，HLA-A2.1-限制性)肽對脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行7天的再刺激。圖3a(中)表明HBsAg-DNA-免疫引起了強(qiáng)HBsAg348-357-特異CTL應(yīng)答，但未引起對HBsAg371-378或MAGE-3271-279肽的應(yīng)答。
為確定HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠中的外周CD4+T淋巴細(xì)胞是否會從功能上受到轉(zhuǎn)基因人類II分子的限制，對針對HBsAg蛋白的CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行檢查。在HBs Ag-接種或HBV-感染HLA-DR1+人群中，免疫顯性HLA-DR1-限制性HBsAg-特異性CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答指向HBsAg180-195肽(Mm，W.P.etal.，HumImmunol 46，93-99(1996))。在C57BL/6小鼠中，H-2IAb-限制性HBsAg-特異性CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答指向HBsAg126-138肽(Milich，D.R.，Semin LiverDis 11，93-112(1991))。為將人化小鼠和人以及野生小鼠進(jìn)行比較，使用相關(guān)(HBsAg180-195，HLA-DR1-限制性)或?qū)φ?HBsAg126-138，H-21Ab-限制性；HIV 1Gag263-278，HLA-DR1-限制性)肽對脾T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外再激活。圖3a(下)顯示了針對HLA-DR1-限制性HBsAg180-195肽的強(qiáng)增殖應(yīng)答，而如預(yù)期那樣，H-2IAβ-限制性肽未能有效的激發(fā)應(yīng)答。同樣，HIV I Gag263-278肽未能激發(fā)應(yīng)答。另外，體外使用HBsAg180-195多肽增加一次免疫復(fù)活可使特異性增殖指數(shù)增加數(shù)倍(數(shù)據(jù)未顯示)。
在第一種HBsAg-DNA-免疫HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠中已記錄到HBsAg-特異性抗體、增殖應(yīng)答及細(xì)胞溶解T細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)展和特異性，6只額外的HBsAg-DNA-免疫和6只未免疫對照組HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠也被分別作了針對以上三種應(yīng)答的檢測。如圖3b所示，這三種應(yīng)答同時出現(xiàn)在6只受試免疫動物身上，但未出現(xiàn)在對照組未免疫小鼠中。有趣的是，2只免疫小鼠能引起針對HBsAg348-357和HBsAg335-343HLA-A2.1限制性肽的CTL應(yīng)答(圖3b，中)。
實(shí)施例6保護(hù)測定以上實(shí)施例記錄了在HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2I類/II類-KO小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的HBsAg-特異性體液、CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并表明它們是指向與自然感染或HBsAg-接種的人體的相同的免疫顯性表位。本實(shí)施例測試了這些免疫應(yīng)答能否給接種動物帶來保護(hù)。因?yàn)樾∈蟛⒉桓腥綡BV，這些試驗(yàn)采用了HBsAg-重組體痘苗病毒(rVV-HBsAg)。兩次通過肌肉注射100微克HBsAgDNA對小鼠進(jìn)行免疫。免疫12天后，使用107PFU的rVV-HBsAg對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。四天后，根據(jù)公布的方法確定病毒滴度并記錄為“rVV PFU/卵巢”的形式(Buller，R.M. &Wallace，G.D.，Lab AnimSci 35，473-476(1985))。
圖4顯示了試驗(yàn)結(jié)果。未經(jīng)過HBsAg-DNA免疫的動物在攻擊后顯示出了rVV-HBsAg復(fù)制。相反，HBsAg-DNA免疫小鼠的病毒滴度則要低超過4個數(shù)量級。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明使用HBsAg-DNA進(jìn)行免疫誘導(dǎo)了控制rVV-HBsAg感染的保護(hù)性HBsAg-特異性免疫應(yīng)答。
HBsAg-DNA免疫小鼠接受另一種HBx-重組痘苗病毒(rVV，編碼乙型肝炎病毒x蛋白)的攻擊的研究證實(shí)了HBsAg-DNA免疫引起的特異性保護(hù)。與未免疫的對照組相比，HBsAg-DNA-免疫小鼠中未觀察到rVV-HBx復(fù)制減少。
實(shí)施例7HLA-DR1-限制性CD4+T淋巴細(xì)胞對于抗體和CTL應(yīng)答以及抵抗病毒感染的保護(hù)很關(guān)鍵為評估HLA-DR1-限制性T輔助淋巴細(xì)胞是否有助于人化小鼠中的抗體和CTL應(yīng)答，對單(HLA-A2.1)和雙(HLA-A2.1/HLA-DR1)轉(zhuǎn)基因H-2I類/II類-KO小鼠中的免疫應(yīng)答和病毒感染的效力進(jìn)行比較。如表4所示，在HLA-A2.1-/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因、H-2I類-/II類-KO小鼠中觀察到了有<p>

上述MM1_replace.RES消息中的Request Status及相應(yīng)的建議文本如下

如果在上述實(shí)施例中采用新的消息或在原有消息上進(jìn)行擴(kuò)展，通過發(fā)送擴(kuò)展替換請求消息的方案，也能夠?qū)崿F(xiàn)在終端替換已經(jīng)發(fā)送的多媒體消息。下面對擴(kuò)展替換請求的方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例二如圖3所示，當(dāng)用戶發(fā)送MM1_submit.REQ多媒體消息到MMSC之后，MMSC向手機(jī)終端返回MM1_submit.RES應(yīng)答消息。這時，如果需要替換已發(fā)送出去的消息(例如，發(fā)現(xiàn)原來的消息內(nèi)容有誤)，可執(zhí)行終端擴(kuò)展替換多媒體消息的操作。
本實(shí)施例是在MM1接口上新增兩條消息MM1_extended_replace.REQ/RES來實(shí)現(xiàn)終端擴(kuò)展替換多媒體消息功能。手機(jī)終端將擴(kuò)展替換多媒體消息的請求通過消息MM1_extended_replace.REQ發(fā)送給MMSC，該擴(kuò)展替換請求消息包含待替換的原消息標(biāo)識MessageID及新消息相關(guān)字段內(nèi)容；MMSC在接收到<p>使用107PFU的rVV-HBsAg對未免疫的HLA-A2.1-/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠(A1-6)、HBsAg-DNA-免疫的IHLA-A2.1-/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠(B1-10)和HBsAg-DNA-免疫的HLA-A2.1-單轉(zhuǎn)基因H-2I類-/II類-KO小鼠(C1-6)進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。四天后，使用HBsAg348-357(免疫顯性表位)或HBsAg335-343(亞顯性表位)對每個卵巢的噬菌斑形成單位數(shù)(PFU/卵巢)、細(xì)胞溶解、增殖脾T細(xì)胞應(yīng)答和血清抗體滴度分別進(jìn)行評估，加載了HLA-A2.1-限制性肽的RMAS-HHD靶細(xì)胞(E/T比為30/1)用于細(xì)胞溶解測定，HBsAg179-194HLA-DR1-限制性肽用于增殖測定，preS2109-134肽用于確定抗體(IgG)滴度。
本申請中所引用的參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容、專利和公布的專利申請在此全文引用作為參考。
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&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(1266)..(1565)&lt;223&gt;human Beta2 microglobulin cDNA&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(1566)..(1610)&lt;223&gt;GlySer linker&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(1611)..(2440)&lt;223&gt;exon 2 and partial intron 3 from HLA-A2 gene&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(2441)..(4547)&lt;223&gt;intron 3 partial-exon 4-exon 8-3′non codant gene&lt;400&gt;1gaattcttag gtttaaatac attgttttat ggattttaat acatccatct acagagccta 60gcagggtgtc cttggcagtt gtcttttaat acctcatgtg ggtctgccta aaaactaatt 120ttttatgtta atcaggttta aaaaatacta agtgttccta taaaatatac acaacactta 180gaagtggata cttcctaaaa acaggcagtg catgagcact agtgaggggc attgtgagtg 240cattgaacag ttgcaacttt gaggtgaata aagcctgtaa tcgcttctgg ttgcaacata 300taggaacaca gtcgctactt tgtattgagg agatgtcctg gactcacaca gaaactcaga 360
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&lt;221&gt;promoter&lt;222&gt;(1)..(15279)&lt;223&gt;promoter 5′from HLA-DR alpha gene(HLA-DRA gene)&lt;220&gt;
&lt;221&gt;gene&lt;222&gt;(1)..(29133)&lt;223&gt;HLA-DR alpha gene(HLA-DRA gene)&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(15280)..(15425)&lt;223&gt;exon 1&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(15344)..(15346)&lt;223&gt;ATG start&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(17838)..(18083)&lt;223&gt;exon 2&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(18575)..(18866)&lt;223&gt;exon 3&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(19146)..(19311)&lt;223&gt;exon 4&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(20008)..(20340)&lt;223&gt;exon 5&lt;400&gt;2aaaaaattaa gtatataaag tttaaaaagt tagagtaagc taaggttaat tattgtagaa 60aaacattttt cataaattta atgttgtctt agttacagta tttataaagt ctacagtaat 120gtatagtaat gccttaggcc ctcgcattca ctcaccactc actcactgac tcatcagggc 180aacttccagt cctgcaagct ccattcatgg taagtgtcct agaaagatct accatttaaa 240
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ccagagccta ggtttacaga gaagcagaca aaaagctaaa caaggagact tactctgtct 19500gcatgactta ttccctctac cttgttttct cctagtctat cctgaggtga ctgtgtatcc 19560tgcaaagacc cagcccctgc agcaccacaa cctcctggtc tgctctgtga atggtttcta 19620tccaggcagc attgaagtca ggtggttccg gaacggccag gaagagaaga ctggggtggt 19680gtccacaggc ctgatccaga atggagactg gaccttccag accctggtga tgctggaaac 19740agttcctcgg agtggagagg tttacacctg ccaagtggag cacccaagcc tgacgagccc 19800tctcacagtg gaatggagtg agcagctttc tgacttcata aatttctcac ccaccaagac 19860gcgaacttta ctaatccctg agtatcaggc ttctcctatc ccacatccta ttttcatttg 19920ctccacgttc tcatctccat cagcacaggt cactgggggg tagccctgta atactttcta 19980gaaacacctg taccccctgg ggaagcagtc atgcctgcca ggcaggagag gctgtccctc 20040ttttgaacct ccccatgatg tcacaagtcg gggtcacctg ctgtctgtgg gctccaggcc 20100ctgcctctgg gtctgagact gagtttctgg tactgttgct ctgagtcgtt tgttgtaatc 20160tgagaagagg agaagtatag ggaccttcct gacatgaggg gagtccaatc tcagctccgc 20220cttttattag atctgtcact ctaggcaact acttaacctc attgggtctc aggctttctg 20280ttcatcagat gttgaagtcc tgtcttacat caaggctgta atatttgaat gagtttgatg 20340actgaacctt gtaactgttc agtgtgattt gaaaaccttt ctcaagaaat ggtcagttat 20400tttagttctt gcagagcagc cttctttctc attttcaaag ctctgaatct caaggtgtca 20460attaaagagg ttccatttgg gataaaaatc actaaacctg gcttcctctc tcaggagcac 20520ggtctgaatc tgcacagagc aagatgctga gtggagtcgg gggcttcgtg ctgggcctgc 20580tcttccttgg ggccgggctg ttcatctact tcaggaatca gaaaggtgag gagcctttgg 20640tagctggctg tctccatacg cttttctgga ggaggaacta tggctttgct gaagttggtt 20700ctcagcatat gaatggccct ggataaagcc tctctactcc caaatgacct ccaatgttct 20760gcaaatccag aaatcatcag tgcatggttg ctatgtcaaa gcataatagc ttgtggccta 20820cagagataac agaaagatta acaggtatag gtgctttggt tgagatcgtg gagcaaatta 20880aggaagagca actaaagcta atacaattac actggatcct gtgacagaca cttcacactt 20940catgggtcac atggtctgtt tctgctcctc tctgccctgg ctggtgtggg ttgtggtgtc 21000agagaactct caggtgggag atctggagct gggacattgt gttggaggac agatttgctt 21060ccatatcctt taagtgtata tcttctcttt ttcctaggac actctggact tcagccaaca 21120ggtaatacct tttcatcctc tttaagaaac agatttggag gccaggcgca gtggctcacg 21180cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag gcgggcgaat catgaggtca ggagttcgag 21240accagcctga ccaacgtggt gaaaccccgt ctctactaaa aatacaaaaa aaaatcagtc 21300gggcgtggtg gtgtgcgcct gtaatcccag ctactcagga ggccaaggca ggagaatcgc 21360tggaacccag gaggcagagg ttgcagtgag ccgagattgg gccactgcac tccagcctag 21420gtgacagagt gagaccccat ctcaaaaaaa caaaaaaaag aaagaaagaa acagatttcc 21480tttccctaga atgatggtag aggtaataag gcatgagaca gaagtaatag caaagacatt 21540ggatccaaat ttctgatcag gcaatttaca ccagaactcc tcctctccac ttagaaaagg 21600cctgtgctct gcaggagtat tgactcatgg agacttcaga acttgttttt cttcttcctg 21660cagtgctctc atctgagtcc ttgaaagagg gcaaaataaa ctgttagtag agccaggtct 21720gaaaacaaca ctttcttgcg tctctgcagg attcctgagc tgaagtgaag atgaccacat 21780tcaaggaaga accttctgcc ccagctttgc aggatgaaac acttccccgc ttggctctca 21840ttcttccaca agagagacct ttctccggac ctggttgcta ctggttcagc agctctgcag 21900aaaatgtcct cccttgtggc tgcctcagct cgtacctttg gcctgaagtc ccagcattaa 21960tggcagcccc tcatcttcca agttttgtgc tcccctttac ctaatgcttc ctgcctccca 22020tgcatctgta ctcctgctgt gccacaaaca cattacatta ttaaatgttt ctcaaacatg 22080gagttaaaaa tcgtctggtc atttggcccc aaggacaaaa aataaaaaga aaagaaaaag 22140tgaagattat ttcccgatag aataatggtt ttcatggata tgtcataagt atgtgagata 22200gtgcatatgt taaataggtt gatttagaca ttttacacta caggcatata tcaaaacttc 22260atgctgtatg acataaatgc acaattttta cttgtcaatt taaaaagtaa acctaacgtt 22320taaaaaggtg atgcataaaa actgagaaca gactataaga actgaaacaa acttggcaaa 22380catgagatga taaaccagct agcaagtcaa tcagaactct ttctcaaccc cgtctacaat 22440attgtgtgtc tataactgta aattagtata tagtttttca ttcca 22485&lt;210&gt;4&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticGlv-Ser Linker
&lt;400&gt;4Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15&lt;210&gt;5&lt;211&gt;31&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPrimer&lt;400&gt;5cattgagaca gagcgcctgg cacagaagca g 31&lt;210&gt;6&lt;211&gt;36&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPrimer&lt;400&gt;6ggatgacgtg agtaaacctg aatctttgga gtacgc 36&lt;210&gt;7&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPrimer&lt;400&gt;7ttcttcaacg ggacggagcg ggtg 24&lt;210&gt;8&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPrimer&lt;400&gt;8ctgcactgtg aagctctcac caac 24&lt;210&gt;9&lt;211&gt;20
&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPrimer&lt;400&gt;9ctccaagccc tctcccagag20&lt;210&gt;10&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPrimer&lt;400&gt;10atgtgcctta cagaggcccc20&lt;210&gt;11&lt;211&gt;10&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;11Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val1 5 10&lt;210&gt;12&lt;211&gt;9&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;12Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val1 5&lt;210&gt;13&lt;211&gt;8&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide
&lt;400&gt;13Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu1 5&lt;210&gt;14&lt;211&gt;16&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;14Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser1 5 10 15&lt;210&gt;15&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;15Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly1 5 10&lt;210&gt;16&lt;211&gt;26&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;16Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly20 25&lt;210&gt;17&lt;211&gt;15&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;17Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln
1 5 10 15&lt;210&gt;18&lt;211&gt;21&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;Artificial Sequence&lt;220&gt;
&lt;223&gt;Description of Artificial SequenceSyntheticPeptide&lt;400&gt;18Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr1 5 10 15Val Trp Leu Ser Val20
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其包含a)斷裂的H2I類基因；b)斷裂的H2II類基因；和c)功能性HLAI類或II類轉(zhuǎn)基因。
2.一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其包含a)斷裂的H2I類基因；b)斷裂的H2II類基因；c)功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因；和d)功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因。
3.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中HLAI類轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-A2轉(zhuǎn)基因而HLAII類轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-DR1轉(zhuǎn)基因。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
5.缺乏H2I類和II類分子的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因小鼠，其具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
8.一種同時確定候選抗原或抗原組中是否存在一種或多種抗原表位的方法，其中所述抗原表位可引起特異性體液應(yīng)答、TH HLA-DR1限制性應(yīng)答和/或CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用候選抗原或抗原組；b)測定小鼠體內(nèi)對該抗原的特異性體液應(yīng)答；c)測定小鼠體內(nèi)對該抗原的TH HLA-DR1限制性應(yīng)答；并d)測定小鼠體內(nèi)對該抗原的CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答；其中，如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的特異性體液應(yīng)答，可確定抗原中存在引起體液應(yīng)答的抗原表位；如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的TH HLA-DR1限制性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起TH HLA-DR1限制性應(yīng)答的抗原表位；而如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。
9.權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括測定小鼠體內(nèi)對抗原的Th1-特異性應(yīng)答和測定小鼠體內(nèi)對抗原的Th2-特異性應(yīng)答；其中，如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的Th1-特異性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起小鼠體內(nèi)Th1-特異性應(yīng)答的抗原表位；如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的Th2-特異性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起小鼠體內(nèi)Th2-特異性應(yīng)答的抗原表位。
10.一種確定候選抗原或抗原組中是否存在HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的方法，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用候選抗原或抗原組；并b)測定小鼠體內(nèi)對抗原的TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答；其中，如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原的TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答，可確定抗原中存在引起TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。
11.通過權(quán)利要求10的方法確定的、包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的分離的抗原。
12.權(quán)利要求11的分離的抗原，其中抗原還包含引起體液應(yīng)答的抗原表位和/或引起CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。
13.權(quán)利要求11的分離的抗原，其中包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含多肽。
14.權(quán)利要求11的分離的抗原，其中包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含多核苷酸。
15.權(quán)利要求14的分離的抗原，其中包含HLA DR1-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含DNA、RNA、或DNA和RNA。
16.一種確定候選抗原或候選抗原組中是否存在HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)抗原表位的方法，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠中施用候選抗原或候選抗原組；并b)測定小鼠體內(nèi)對抗原或抗原組的HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)應(yīng)答；其中，如在小鼠體內(nèi)觀察到對抗原或抗原組的HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)應(yīng)答，可確定在抗原或抗原組中存在引起HLA-A2限制性T細(xì)胞毒性(CTL)應(yīng)答的抗原表位。
17.通過權(quán)利要求16的方法確定的、包含HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)抗原表位的分離的抗原。
18.權(quán)利要求17的分離的抗原，其中抗原還包含引起體液應(yīng)答的抗原表位和/或引起TH HLA-DR1限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。
19.權(quán)利要求17的分離的抗原，其中包含HLA-A2限制性T細(xì)胞毒性(CTL)抗原表位的抗原包含多肽。
20.權(quán)利要求17的分離的抗原，其中包含HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)抗原表位的抗原包含多核苷酸。
21.權(quán)利要求20的分離的抗原，其中包含HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)抗原表位的抗原包含DNA、RNA或DNA和RNA。
22.一種比較由兩種或兩種以上疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的效力的方法，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用第一種候選疫苗，并測量小鼠體內(nèi)由第一種候選疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；b)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用第二種候選疫苗，并測量小鼠體內(nèi)由第二種候選疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用于權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠，并測量小鼠體內(nèi)由各種待比較的其他候選疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；和d)通過比較針對各種待比較的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答來確定各種候選疫苗誘導(dǎo)T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的效力。
23.權(quán)利要求22的方法，其中T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DR1限制性應(yīng)答。
24.一種比較由兩種或兩種以上疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效力的方法，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用第一種候選疫苗，并測量小鼠體內(nèi)由第一種疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；b)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用第二種候選疫苗，并測量小鼠體內(nèi)由第二種候選疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用于權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠，并測量小鼠體內(nèi)由每種待比較的其他候選疫苗所誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；和d)通過比較針對各種待比較的疫苗的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答來確定各種候選疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效力。
25.權(quán)利要求24的方法，其中T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。
26.一種同時比較由兩種或兩種以上疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效力的方法，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用第一種候選疫苗，并測量小鼠體內(nèi)由第一種候選疫苗所誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；b)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用第二種候選疫苗，并測量小鼠體內(nèi)由第二種候選疫苗所誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用于權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠，并測量小鼠體內(nèi)由各種待比較的候選疫苗所誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；并d)通過比較針對各種待比較的疫苗的T-細(xì)胞輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答，確定各種候選疫苗誘導(dǎo)T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效力。
27.權(quán)利要求26的方法，其中T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DR1限制性應(yīng)答，且其中T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。
28.一種同時確定在以抗原或以包含一種或多種抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，小鼠體內(nèi)的體液應(yīng)答、T輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括a)將抗原或包含一種或多種抗原的疫苗施用于權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠；b)測定小鼠體內(nèi)對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應(yīng)答；c)測定小鼠體內(nèi)對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；并d)測定小鼠體內(nèi)對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答。
29.權(quán)利要求28的方法，其中T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為TH HLA-DR1限制性應(yīng)答。
30.權(quán)利要求28的方法，其中T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為CTRL HLA-A1限制性應(yīng)答。
31.一種基于預(yù)先選定的標(biāo)準(zhǔn)對施用于人體的兩種或兩種以上候選疫苗組合物進(jìn)行優(yōu)化的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求28，同時確定小鼠在使用兩種或兩種以上候選疫苗組合物進(jìn)行免疫后的體液應(yīng)答、T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性應(yīng)答；并通過將預(yù)先選定的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于測定結(jié)果，選擇最優(yōu)的疫苗。
32.權(quán)利要求31的方法，其中兩種或兩種以上候選疫苗的區(qū)別僅在于疫苗中的抗原與佐劑的比例不同。
33.權(quán)利要求31的方法，其中兩種或兩種以上候選疫苗的區(qū)別僅在于疫苗中的佐劑類型不同。
34.一種確定疫苗在施用于人體后是否存在引起自身免疫性疾病的風(fēng)險的方法，該方法包括a)給權(quán)利要求3或權(quán)利要求6的小鼠施用疫苗；并b)測定小鼠體內(nèi)的自身免疫應(yīng)答；其中，如觀察到小鼠體內(nèi)出現(xiàn)自身免疫應(yīng)答，表明疫苗在施用于人體后存在引起自身免疫性疾病的風(fēng)險。
35.一種分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其包含a)斷裂的H2I類基因；b)斷裂的H2II類基因；和c)功能性HLAI類或II類轉(zhuǎn)基因。
36.一種分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其包含a)斷裂的H2I類基因；b)斷裂的H2II類基因；c)功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因；和c)功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因。
37.權(quán)利要求36的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其中HLAI類轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLAII類轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-DR1轉(zhuǎn)基因。
38.權(quán)利要求37的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其中HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
39.一種分離的缺乏H2I類和II類分子的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞包含功能性HLAI類轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類轉(zhuǎn)基因。
40.權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其具有HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。
41.權(quán)利要求40的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，其中HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DR1轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DR1序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因小鼠和分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，小鼠和小鼠細(xì)胞包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA I類轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類轉(zhuǎn)基因。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠或小鼠細(xì)胞缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類轉(zhuǎn)基因。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠或小鼠細(xì)胞包含HLA－A文檔編號C12N5/10GK1859843SQ200480028550
公開日2006年11月8日 申請日期2004年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者克洛德·奧里歐, 韋羅尼克·潘克里, 龍玉春, 安東尼·帕諾, 弗朗索瓦·萊蒙尼爾 申請人:巴斯德研究院