專利名稱：：免疫毒素的表達(dá)和純化方法本申請(qǐng)要求2003年8月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/491,923的權(quán)益。美國(guó)政府對(duì)該申請(qǐng)擁有一定權(quán)利。發(fā)明
背景技術(shù)：
：領(lǐng)域本發(fā)明一般而言涉及蛋白表達(dá)和純化方法，更具體地說(shuō)，涉及免疫毒素的表達(dá)和純化方法。
背景技術(shù)：
：美國(guó)每年進(jìn)行的器官移植手術(shù)約有24,000例，主要包括腎臟移植(14,000例)、肝臟移植(5,000例)、心臟移植(2,200例)，以及少量的胰、肺、心-肺和腸移植(2002年OPTN/SRTR年度報(bào)告)。移植耐受仍然是患者和醫(yī)生難以企及的目標(biāo)，他們期望成功地實(shí)現(xiàn)異源器官移植而無(wú)需堅(jiān)持使用無(wú)限期的、非特異性的免疫抑制劑，并免除其帶來(lái)的副作用。許多此類患者使用環(huán)孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)和潑尼松(prednisone)，以及多種其他免疫抑制劑治療，以誘導(dǎo)或維持免疫抑制。在美國(guó)，維持免疫抑制療法的年均花費(fèi)約$11,000(ImmunosuppressiveDrugsCoverageAct，NationalKidneyFoundation，參見(jiàn)http//www.kidney.org/general/pubpol/immufact.cfm)。雖然這些藥物可有效防止排斥反應(yīng)，但免疫抑制療法的副作用是相當(dāng)大的。免疫抑制療法誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的非特異性無(wú)應(yīng)答。移植接受者易于感染，并有患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，如以移植后淋巴增生性障礙的形式。移植免疫生物學(xué)的主要目標(biāo)是開(kāi)發(fā)對(duì)器官移植的特異性免疫耐受，而使患者從持續(xù)藥理免疫抑制的副作用及其帶來(lái)的并發(fā)癥和費(fèi)用中解脫出來(lái)。開(kāi)發(fā)了二價(jià)抗T細(xì)胞免疫毒素，A-dmDT390-bisFv(G4S)，用于對(duì)移植、T細(xì)胞白血病和自體免疫疾病進(jìn)行耐受誘導(dǎo)。該免疫毒素由白喉毒素的前390個(gè)氨基酸殘基(DT390)和來(lái)自抗CD3抗體UCHT1的兩個(gè)成串的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sFv)構(gòu)成，后者負(fù)責(zé)將該免疫毒素結(jié)合至T細(xì)胞受體復(fù)合物的CD3εγ亞基。抗CD3ε抗體部分使得該免疫毒素能夠靶向特定細(xì)胞，而白喉毒素部分可殺死靶細(xì)胞。該免疫毒素可用于使至少部分T細(xì)胞耗盡，以治療或防止T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病或病癥。施用抗T細(xì)胞免疫毒素提供了一種實(shí)現(xiàn)特異性免疫耐受的方法。它可應(yīng)用于接受者體內(nèi)具有穩(wěn)定移植物功能的新器官移植物，也可用于已經(jīng)存在的移植物。該免疫毒素可提供高度特異性免疫抑制，在靈長(zhǎng)類中實(shí)現(xiàn)移植耐受，而沒(méi)有非特異性免疫抑制藥物、抗淋巴細(xì)胞血清或放射的副作用。將排斥應(yīng)答抑制到不會(huì)減短移植接受者平均壽命的程度，是本領(lǐng)域的一個(gè)目標(biāo)。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母——巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)已成功用于表達(dá)不同來(lái)源的異源蛋白(Gellissen2000)。作為真核生物，巴斯德畢赤酵母能夠進(jìn)行多種翻譯后蛋白修飾，如蛋白酶解加工、折疊、二硫鍵形成和糖基化作用。像其他酵母一樣，巴斯德畢赤酵母具有勝過(guò)高等真核細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)或桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)。它易于操控，生長(zhǎng)速度快，所需培養(yǎng)基價(jià)格低廉。這大大減少了生產(chǎn)時(shí)間和費(fèi)用，特別在商業(yè)規(guī)模上更是如此。與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不同，巴斯德畢赤酵母并非強(qiáng)發(fā)酵酵母，可很容易地培養(yǎng)至＞100g干細(xì)胞/升的極高細(xì)胞密度(Siegeletal.，1989)。再加上采用強(qiáng)AOX1啟動(dòng)子驅(qū)使外源基因轉(zhuǎn)錄，使得巴斯德畢赤酵母成為高水平異源基因表達(dá)的優(yōu)選系統(tǒng)。AOX1啟動(dòng)子在表達(dá)對(duì)表達(dá)宿主有害的外源蛋白時(shí)也具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵搯?dòng)子在非甲醇生長(zhǎng)條件下受到嚴(yán)格調(diào)控和高度抑制?？烧T導(dǎo)的和嚴(yán)格調(diào)控的AOX1啟動(dòng)子使得巴斯德畢赤酵母菌株(沒(méi)有任何導(dǎo)致對(duì)DT有抗性的突變)可成功地以分泌形式表達(dá)基于DT的免疫毒素(Wooetal.，2002)。然而，如果白喉毒素(DT)的催化區(qū)能夠進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，它對(duì)所有的真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)都是很強(qiáng)的毒素。巴斯德畢赤酵母對(duì)這些毒素本性上是敏感的。現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母的方法。例如，巴斯德畢赤酵母可在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。一種巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵方法包括使用甘油作為最初的碳源，隨后進(jìn)行短暫的碳饑餓，再使用甲醇作為碳源(PichiapastorisFermentationUsingaBioFlo110BenchtopFermentor，NewBrunswickScientific)。Woo等記載，當(dāng)在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)二價(jià)抗人抗T細(xì)胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)時(shí)，含1％酪蛋白氨基酸的pH7.0的緩沖復(fù)合物培養(yǎng)基可提供搖瓶培養(yǎng)的最高表達(dá)，加入1至3mM范圍的PMSF可提高表達(dá)水平。(25ProteinExpressionandPurification270-82(2002))。Sreekrishna記載，以搖瓶培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母，當(dāng)細(xì)胞通入大量空氣并在補(bǔ)充有酵母提取物和胨的pH6.0的緩沖培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，可使分泌水平提高(Chapter16，IndustrialMicroorganismsBasicandAppliedMolecularGenetics(1993))。含酵母氮堿基以及硫酸銨、生物素和甘油的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，使用磷酸鉀以及酵母提取物和胨調(diào)節(jié)pH至6.0。誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有甲醇代替甘油。與之相比，本發(fā)明提供了一種使用巴斯德畢赤酵母制備免疫毒素的改進(jìn)的方法。本發(fā)明所表達(dá)和純化的免疫毒素可用于誘導(dǎo)免疫耐受的方法中。很有必要提供一種提高免疫毒素產(chǎn)量的表達(dá)和純化方法。本發(fā)明在下文中闡述了此問(wèn)題以及其他一些問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明一方面涉及一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；b)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培養(yǎng)基)的限量甲醇，且甲醇誘導(dǎo)的溫度在約17.5℃以下。本發(fā)明另一方面涉及一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；b)使用含甲醇和甘油的添加物對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride)和氨基酸源相接觸，且甲醇誘導(dǎo)的溫度在約17.5℃以下。本發(fā)明再一方面涉及一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液裝入疏水作用柱(hydrophobicinteractioncolumn)中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素裝入陰離子交換柱中；d)通過(guò)使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達(dá)到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。應(yīng)該理解，上文的一般性敘述和下文的詳細(xì)敘述均只起示例和解釋作用，并不限制由權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明范圍。附圖顯示一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案，并與文字?jǐn)⑹鲆黄鸾忉尡景l(fā)明的原理。圖1(a)真核EF-2中白喉酰胺結(jié)構(gòu)域的保守性以及DT抗性突變。(b)巴斯德畢赤酵母EF-2中可導(dǎo)致Arg替換Gly701的核苷酸序列突變。帶有下劃線的序列為由核苷酸突變導(dǎo)致的限制酶SacII位點(diǎn)。見(jiàn)SEQIDNO1-10。圖2巴斯德畢赤酵母EF-2的5′端序列，顯示短內(nèi)含子(SEQIDNO11；mRNA)和(SEQIDNO12；gDNA)。5′剪接位點(diǎn)、分支位點(diǎn)以及3′剪接位點(diǎn)使用下劃線標(biāo)出。EF-2編碼序列使用粗體標(biāo)出。圖3(A)(B)(C)(D)巴斯德畢赤酵母EF-2(SEQIDNO13)的核苷酸序列和推得的氨基酸序列。核苷酸序列從起始密碼子的開(kāi)端處開(kāi)始編號(hào)。蛋白序列中共有的GTP結(jié)合基序?yàn)锳HVDHGKST(SEQIDNO14)，據(jù)推測(cè)在體內(nèi)被EF-2激酶磷酸化的蘇氨酸殘基用圓圈標(biāo)出，在所有的延長(zhǎng)因子中均保守的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域?yàn)镈EQERGITIKSTA(SEQIDNO15)。白喉酰胺結(jié)構(gòu)域中22個(gè)高度保守的殘基使用方框標(biāo)出。圖4使用已經(jīng)體外突變的EF-2的3′序列進(jìn)行定向突變。突變質(zhì)粒pBLURA-Δ5’mutEF-2包括四個(gè)重要元件β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)、尿嘧啶選擇標(biāo)記(URA3)、3′AOX1轉(zhuǎn)錄終止序列(TT)和體外突變的FF-23′序列Δ5’mutEF-2。圖5對(duì)來(lái)自巴斯德畢赤酵母JC308菌株的所選Ura+克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。(a)使用引物1和M的PCR產(chǎn)物；(b)使用引物2和w的PCR產(chǎn)物；(c)ScaII消化的使用引物2和3的PCR產(chǎn)物。圖6在突變型和野生型巴斯德畢赤酵母菌株中胞質(zhì)溶膠表達(dá)的DT-A鏈的蛋白質(zhì)印跡分析。(a)泳道1～6為使用pPIC3-DtA轉(zhuǎn)化的6個(gè)獨(dú)立mutEF2JC307-8克隆的細(xì)胞提取物，+C純化的A-dmDT390-bisFv。MSeeBlueplus2蛋白標(biāo)記(Invitrogen)。(b)在兩個(gè)獨(dú)立菌落mut-3和mut-5(分別為mutEF2JC307-8(3)和(5))，C3和C4培養(yǎng)物中，胞質(zhì)溶膠表達(dá)的DT-A鏈。蛋白樣本加于4～12％NuPAGE凝膠(Invitrogen)上。圖7細(xì)胞內(nèi)表達(dá)DT-A對(duì)帶有突變型或野生型EF-2的巴斯德畢赤酵母菌株的存活的影響。Mut-3和Mut5分別為EF-2突變體mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)，Mut-3在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)DTA鏈，而mut-5并非如此。C3和C4是野生型EF-2菌株，在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)(C4)或不表達(dá)DTA鏈。每一類的第一個(gè)柱表示甲醇誘導(dǎo)前的菌落形成單位。每一類的第二個(gè)柱代表甲醇誘導(dǎo)后的菌落形成單位。圖8質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。(a)pBLARG-A-dmDT390-bisFv；(b)pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv；(c)pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv。圖9A-dmDT390-bisFv表達(dá)情況的蛋白質(zhì)印跡分析。培養(yǎng)基(a)和細(xì)胞提取物(b)樣本加于4～12％NuPAGE凝膠(Invitrogen)上。+c泳道為純化的A-dmDT390-bisFv。泳道1～9是使用2拷貝A-dmDT390-bisFv基因轉(zhuǎn)化的mutEF2JC303中，所選的9個(gè)克隆樣本。泳道10、11和12是單拷貝克隆樣本泳道12為非突變型EF-2克隆JHW#2，泳道10和11是兩個(gè)選出的mutEF2JC307-8(1)和mutEF2JC307-8(2)克隆，后者也稱為YYL#8-2。圖10比較不同巴斯德畢赤酵母菌株的甲醇消耗速率。所有這些菌株均為Mut+(甲醇利用增加)，除了pJHW#3為MutS(甲醇利用緩慢)。pJHW#2到5和EF-2突變體YYL#8-2均表達(dá)二價(jià)免疫毒素A-dmDT390-bisFv。X-33為不表達(dá)A-dmDT390-bisFv的野生型菌株，但使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。圖11X-33和JW102之間，以及在指定溫度下對(duì)JW102添加不同營(yíng)養(yǎng)物之間的甲醇消耗速率曲線的比較。YE和casa分別代表添加酵母提取物和酪蛋白氨基酸。圖12降低發(fā)酵中的攪拌速度減少免疫毒素聚集體。在高攪拌速度下進(jìn)行發(fā)酵導(dǎo)致50％以上的分泌免疫毒素在上清液中以無(wú)活性的聚集體形式存在。另外，聚集體在誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)累積。然而，將攪拌速度從800rpm降低到400rpm減少了免疫毒素聚集體。免疫毒素聚集體在誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)水平保持不變。圖13在30℃、250rpm下，經(jīng)20小時(shí)誘導(dǎo)之后，TWEEN20對(duì)純化免疫毒素聚集的影響。使用純化免疫毒素，通過(guò)攪拌，TWEEN20可防止聚集體的形成。通過(guò)在30℃、250rpm下誘導(dǎo)20小時(shí)，大約50％的純化免疫毒素聚集。然而，通過(guò)攪拌，0.01％～0.04％的TWEEN20可顯著減少純化免疫毒素的聚集。圖14甲醇誘導(dǎo)的前44小時(shí)內(nèi)濕細(xì)胞密度收獲量的變化。MeOH，只有甲醇并加入酪蛋白氨基酸；M∶G＝4∶1，補(bǔ)充甲醇/甘油混合物并補(bǔ)充酪蛋白氨基酸；YE+MeOH，補(bǔ)充酵母提取物以及只有甲醇；YE+4∶1，補(bǔ)充酵母提取物并補(bǔ)充甲醇/甘油混合物。圖15根據(jù)誘導(dǎo)溫度不同，二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平及其最終純化產(chǎn)率。A誘導(dǎo)溫度不同表達(dá)水平的變化。B從甲醇誘導(dǎo)22、44和67小時(shí)時(shí)所取的1升上清液中所獲最終純化產(chǎn)率的變化。22小時(shí)、44小時(shí)和67小時(shí)代表甲醇誘導(dǎo)時(shí)間。C誘導(dǎo)溫度不同甲醇消耗量的變化。圖16優(yōu)化的發(fā)酵批次的代表。在所示時(shí)間點(diǎn)取的樣本在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級(jí)，并且該凝膠使用考馬斯藍(lán)染色。箭頭表示二價(jià)免疫毒素的位置。使用Mark12標(biāo)記(Invitrogen)。圖17通過(guò)butyl650M捕捉步驟獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳分析。泳道1～4，樣本流過(guò)組分#1～#4；泳道5，匯集的樣本流過(guò)組分；泳道6～8，洗滌組分#1～#3；泳道9，匯集的洗滌組分；泳道10、11、17，上清液；泳道12，Mark12蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣本(Invitrogen)；泳道13～15，洗脫組分#1～#3；泳道16，匯集的洗脫組分。IT，免疫毒素。圖18通過(guò)Poros50HQ硼酸鹽陰離子交換步驟獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳分析。泳道1，Mark12蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣本(Invitrogen)；泳道2，從Butyl650MHIC步驟獲得的樣本；泳道3～7，樣本流過(guò)組分#1～#5；泳道8，使用25mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#1；泳道9，使用50mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#2；泳道10，使用75mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#3；泳道11，使用100mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#4；泳道12，使用1M溶于緩沖液B的NaCl洗脫的組分#5；IT，免疫毒素。圖19純化免疫毒素的分析凝膠過(guò)濾和SDS-PAGE電泳分析。ASuperdex20010/300GL凝膠過(guò)濾色譜圖。B考馬斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠圖譜。圖20(a)(b)(c)Ala-dmDT390-bisFv(UCHT1)的氨基酸序列(SEQIDNO16)。圖21甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)、甲醇消耗和免疫毒素分泌曲線比較。組AX-33菌株和產(chǎn)生免疫毒素的毒素抗性EF-2突變體mutEF2JC307-8(2)。這兩個(gè)菌株在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中具有相似的甲醇消耗速率和濕細(xì)胞密度增長(zhǎng)曲線。組A中所示數(shù)據(jù)來(lái)自X-33。對(duì)于毒素抗性突變體，在甲醇誘導(dǎo)44h時(shí)，最大甲醇消耗速率和濕細(xì)胞密度增長(zhǎng)分別為2.2ml/min和9.17％。組B-F菌株JW102。在所有組A-F中的恒定條件是在誘導(dǎo)之前的甘油分批階段，并繼之以甘油補(bǔ)料分批階段。對(duì)于誘導(dǎo)，僅使用純甲醇(MeOH)或者使用4∶1甲醇∶甘油(M/G)混合補(bǔ)料。誘導(dǎo)過(guò)程中持續(xù)注入溶于甲醇的10mM的PMSF。當(dāng)不添加酵母提取物(YE)時(shí)則添加酪蛋白氨基酸。誘導(dǎo)條件組A，添加M/G，不添加YE；組B，添加甲醇，不添加YE；組C，添加甲醇，添加YE；組D，添加M/G，添加YE；組E，添加M/G，不添加YE；組F，添加M/G，添加YE。誘導(dǎo)溫度，A-E為23～25℃，F(xiàn)為15℃(注意組F的右側(cè)軸與其他組相比壓縮2倍)。甲醇消耗速率(ml/min)，虛線；濕細(xì)胞密度(％，w/v)，實(shí)線；分泌免疫毒素水平(mg/L)，短劃線。因?yàn)樵?0L生物反應(yīng)器發(fā)酵中有大量的工作，所以重復(fù)組A-E的結(jié)果是不切實(shí)際的。優(yōu)化方法組F進(jìn)行了3次，點(diǎn)為平均值，當(dāng)均值的標(biāo)準(zhǔn)差超過(guò)10％時(shí)在圖中表示出來(lái)。濕細(xì)胞密度和分泌免疫毒素水平的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示為方塊和圓圈。因?yàn)槊糠昼姕y(cè)量一次甲醇消耗速率，所以省略了甲醇消耗速率的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖22蛋白降解和免疫毒素生產(chǎn)。A在補(bǔ)充甲醇和酵母提取物的培養(yǎng)物(圖21C)中，甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中免疫毒素水平的時(shí)程。免疫毒素條帶使用IT和箭頭標(biāo)出。B對(duì)等體積的純化免疫毒素(250μg/ml)與等體積的在甲醇誘導(dǎo)后所示時(shí)間收集的上清液，在培育(28℃，20h，250rpm搖動(dòng))后通過(guò)SDS-PAGE對(duì)殘留免疫毒素進(jìn)行分析。等體積純化免疫毒素和PBS緩沖液的混合物，或者來(lái)自0h的上清液用作對(duì)照(CON)。10μl制備的樣本加于SDS-PAGE，并在非還原條件下在4～20％SDS-tri-甘氨酸凝膠上分級(jí)。凝膠使用考馬斯藍(lán)染料染色。使用Mark12標(biāo)記(Invitrogen)作為蛋白標(biāo)記。圖23溫度對(duì)生產(chǎn)免疫毒素的影響。在所示誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)(44，50，67h)從不同誘導(dǎo)溫度(15～23℃)批次中取得的樣本，在非還原條件下在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級(jí)。對(duì)于所有批次，持續(xù)添加酵母提取物和甲醇-甘油補(bǔ)料。凝膠使用考馬斯藍(lán)染料染色。IT-dp表示二價(jià)免疫毒素的降解產(chǎn)物。這些降解產(chǎn)物通過(guò)蛋白質(zhì)印跡使用抗DT抗體和抗(G4S)3接頭抗體識(shí)別。抗(G4S)3接頭抗體可檢測(cè)二價(jià)免疫毒素和降解產(chǎn)物，因?yàn)槊庖叨舅匕齻€(gè)(G4S)3接頭。箭頭指向與二價(jià)免疫毒素?zé)o關(guān)的條帶。IT表示免疫毒素。使用Mark12標(biāo)記(Invitrogen)作為蛋白標(biāo)記。圖24在15℃下的甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，對(duì)于存在和不存在PMSF的上清液中的蛋白酶活性進(jìn)行分析。上清液是在甲醇誘導(dǎo)0、22、44和67h時(shí)，從持續(xù)添加酵母提取物和甲醇-甘油補(bǔ)料處理的發(fā)酵批次中取得的。上清液與作為底物的無(wú)切口的CRM9一起培育。培育后，10μl樣本在還原條件下在4～20％SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級(jí)。染色和干燥后，通過(guò)使用NIH成像軟件將凝膠數(shù)字化并分析無(wú)切口CRM9的條帶密度。在甲醇誘導(dǎo)中補(bǔ)充PMSF，實(shí)線；無(wú)PMSF，虛線。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為3個(gè)發(fā)酵批次的平均值，并帶有均值的標(biāo)準(zhǔn)差。具體實(shí)施例方式在公開(kāi)和描述本發(fā)明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法之前，應(yīng)該理解，除非另有說(shuō)明，并不限于特定的合成方法或特定的重組生物技術(shù)方法，除非另有說(shuō)明，并不限于特定試劑，因其毫無(wú)疑問(wèn)地可有多種變化形式。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定實(shí)施方案的目的，而非意在限制。如在說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的，單數(shù)形式的“一”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象，除非上下文中另外明確指出。因此，例如，提及“一種藥物載體”包括兩種或更多種這類載體的混合物等等。本文中范圍可以表示為從“大約”一個(gè)具體的數(shù)值，和/或至“大約”另一個(gè)具體的數(shù)值。當(dāng)表示為這種范圍時(shí)，另一個(gè)實(shí)施方案包括從前述的一個(gè)具體的數(shù)值和/或至前述的另一個(gè)具體的數(shù)值。類似地，當(dāng)通過(guò)在前面使用“大約”將數(shù)值表示為近似值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，該具體的數(shù)值構(gòu)成另一個(gè)實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)相關(guān)和獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。還應(yīng)當(dāng)理解的是此處公開(kāi)了許多數(shù)值，且除了數(shù)值本身外每一個(gè)數(shù)值在此還以“大約”該具體數(shù)值公開(kāi)。例如，如果公開(kāi)了數(shù)值“10”，那么也公開(kāi)了“大約10”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開(kāi)了一個(gè)數(shù)值時(shí)，也公開(kāi)了“小于或等于該數(shù)值”，“大于或等于該數(shù)值”以及數(shù)值間可能的范圍，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所恰當(dāng)理解的。例如，如果公開(kāi)了數(shù)值“10”，也公開(kāi)了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應(yīng)理解，在整個(gè)本申請(qǐng)中，以多種不同格式提供數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)代表了端點(diǎn)和起點(diǎn)，以及這些數(shù)據(jù)點(diǎn)任何組合的范圍。例如，如果公開(kāi)了特定數(shù)據(jù)點(diǎn)“10”和特定數(shù)據(jù)點(diǎn)15，應(yīng)該理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之間的數(shù)值也認(rèn)為已經(jīng)公開(kāi)。在本說(shuō)明書(shū)及其后的權(quán)利要求書(shū)中，將會(huì)提及許多被界定為具有如下含義的術(shù)語(yǔ)“可選的”或“可選地”意即隨后所描述的事件或情況可以發(fā)生或不發(fā)生，以及該描述包括其中所述事件或情況發(fā)生的例子及其不發(fā)生的例子?！敖佑|”是指將一種物質(zhì)置于可與另一種物質(zhì)發(fā)生物理關(guān)聯(lián)的條件下?！胺翘腔笔侵笡](méi)有糖基化作用，或者使用本領(lǐng)域常規(guī)的測(cè)定糖基化的方法，檢測(cè)不到糖基化作用。因此，非糖基化包括已使糖基化位點(diǎn)發(fā)生突變使得糖基化作用不發(fā)生，在不發(fā)生糖基化作用的系統(tǒng)中表達(dá)，或者在野生狀態(tài)下不具有糖基化作用位點(diǎn)?！把b入”柱中是指將樣本放在某位置，以使至少一部分樣本最終進(jìn)入柱中由樹(shù)脂占據(jù)的位置。“酶消化”是指使用一種或多種不同的酶將蛋白或肽在肽鍵處水解。此類酶包括但不限于胰島素、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或羧肽酶A?！敖湍柑崛∥铩笔侵竿ㄟ^(guò)對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行蛋白酶解而獲得的肽和氨基酸的制備物?！罢T導(dǎo)”是指為給定的啟動(dòng)子提供信號(hào)，促使給定基因的表達(dá)。“添加”是指以一定速率提供新鮮培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物，以至少部分取代被消耗掉的培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物?！安糠帧笔侵缚煞譃槎鄠€(gè)部分的分子或化合物的一個(gè)部分。在本發(fā)明中，部分可以指免疫毒素的毒素部分或抗體部分。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“二價(jià)”是指單個(gè)組合物能夠與兩個(gè)配體相結(jié)合。例如，A-dmDT390-bisFv(G4S)免疫毒素可結(jié)合兩個(gè)CD3分子。還應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)“兩價(jià)”在本領(lǐng)域中具有相似的含義。在此，術(shù)語(yǔ)“二價(jià)”和“兩價(jià)”指相同的性質(zhì)，可互換使用。本發(fā)明提供了一種在巴斯德畢赤酵母變體中表達(dá)和純化變體ADP核糖基化毒素和毒素融合蛋白的系統(tǒng)。本發(fā)明方法具有遵循優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GoodManufacturingPractices)的優(yōu)點(diǎn)。正如廣泛使用的情況一樣，免疫毒素可選為融合蛋白。免疫毒素可包括白喉毒素部分。應(yīng)該理解且涵蓋于本文之中的是，本方法可使用其他ADP核糖基化免疫毒素。例如，特別考慮的是免疫毒素包含綠膿桿菌外毒素A(PsuedomonasexotoxinA)部分的融合蛋白。毒素部分可為截短型(truncated)部分和/或可包含相對(duì)于野生型毒素的變異。免疫毒素可進(jìn)一步包括CD3抗體部分或其他抗體部分。還應(yīng)理解，免疫毒素可包括除CD3抗體以外的靶向抗體部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)靶細(xì)胞，知道在免疫毒素中使用何種部分。例如，CD22抗體可用于將免疫毒素融合蛋白引導(dǎo)至B細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達(dá)免疫毒素的方法，包括在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；在低于約17.5℃的溫度下進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。本發(fā)明一方面提供了一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達(dá)免疫毒素的方法，包括在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培養(yǎng)基)的限量甲醇，且甲醇誘導(dǎo)的溫度在約17.5℃以下。本發(fā)明另一方面提供了一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括在包含蛋白(如大豆蛋白)的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；使用含甲醇和甘油的添加物(如甲醇和甘油的比例為約4∶1)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源(如酵母提取物)相接觸，且甲醇誘導(dǎo)的溫度在約17.5℃以下。在該表達(dá)方法中，將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接觸的操作包括，將這些細(xì)胞與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接觸至少2小時(shí)，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的小時(shí)數(shù)，或者介于其中的任何量。優(yōu)選地，苯甲烷磺酰氟溶于4∶1的甲醇甘油誘導(dǎo)添加物中，濃度不超過(guò)10mM。甲醇誘導(dǎo)溫度優(yōu)選低于約17.5℃，更優(yōu)選約15℃。本方法實(shí)踐中適于發(fā)生甲醇誘導(dǎo)的其他溫度包括17.0、16.5、16.0、15.5、14.5、14.0、13.5、13、12.5、12℃或者介于其中的任何量。生長(zhǎng)培養(yǎng)基是指所選有機(jī)體生長(zhǎng)所需的任何物質(zhì)。生長(zhǎng)所需的物質(zhì)包括但不限于碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鈉、鐵、微量元素和有機(jī)生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可包括多種原料以提供所需物質(zhì)。這些物質(zhì)包括但不限于單糖，提取物如胨、大豆胨(soytone)、胰胨(tryptone)、酵母提取物，二氧化碳，維生素，氨基酸，嘌呤和嘧啶。本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)例利用了DIFCO公司生產(chǎn)的大豆的酶消化產(chǎn)物的存在。本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)例利用了DIFCO公司生產(chǎn)的酵母提取物的存在。應(yīng)該理解，可使用生產(chǎn)此類產(chǎn)品的任何廠商(如NewEnglandBiosciences)生產(chǎn)的酵母提取物和酶消化產(chǎn)物。在本方法的一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可選進(jìn)一步包括消泡劑。更具體地，消泡劑的濃度為約0.01％或更高。例如，消泡劑濃度可為0.07％，或者約0.01％至約0.07％之間的任何量。消泡劑的最佳水平可選擇為使液體-空氣界面之上的泡沫層減少至1/2英寸或更薄所需的最小量。因此，生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成可為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，約0.43％PTM1溶液，以及約0.02％消泡劑。應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以改變生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成以利于最佳生長(zhǎng)。特別考慮的變化是高于或低于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中組分百分比最多20％。因此本文公開(kāi)了一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中該生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為約3.2-4.8％甘油，約1.6-2.4％酵母提取物，約1.6-2.4％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.07-1.61％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約.34-.52％PTM1溶液。例如，特別公開(kāi)了一種培養(yǎng)基，其中該生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為約3.6％甘油，約2.4％酵母提取物，約1.9％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.43％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液。在本發(fā)明的表達(dá)方法中，可選地，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溶解氧濃度保持在40％或更高(如45％、50％、55％、60％或65％)的數(shù)值。例如，在本發(fā)明中，甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始之前采用添加甘油批料階段(glycerol-fedbatchphase)以獲得高細(xì)胞密度。當(dāng)溶解氧濃度上升到40％以上時(shí)開(kāi)始添加甘油批料階段。每當(dāng)溶解氧上升至40％以上時(shí)即添加甘油，直至該水平降至40％以下。停止添加甘油后溶解氧再次升高時(shí)，添加物換為甲醇。溶解氧(DO)水平升高或達(dá)到尖峰說(shuō)明已耗盡碳源。通常DO尖峰用于顯示生長(zhǎng)所用的甘油已耗盡，說(shuō)明應(yīng)該轉(zhuǎn)為甲醇誘導(dǎo)階段。另外，生長(zhǎng)階段可選pH值為約3.0-4.0，甲醇誘導(dǎo)階段pH值為約6.7-7.4。例如，生長(zhǎng)階段pH值為3.5，甲醇誘導(dǎo)階段pH值為7.0?？稍黾蛹状颊T導(dǎo)時(shí)間以提高產(chǎn)量。通常的誘導(dǎo)時(shí)間包括22h、44h、67h和163h。誘導(dǎo)可長(zhǎng)達(dá)12天(288h)。因此，特別考慮的甲醇誘導(dǎo)持續(xù)約22h至約12天(288h)。例如，應(yīng)該理解，甲醇誘導(dǎo)可持續(xù)163h。因而本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；b)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中所述甲醇誘導(dǎo)包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導(dǎo)進(jìn)行的溫度低于17.5℃，補(bǔ)充消泡劑至0.07％，攪拌減慢至400RPM，且其中誘導(dǎo)步驟進(jìn)行約22至288h之間。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)可表達(dá)免疫毒素的巴斯德畢赤酵母，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液，其中生長(zhǎng)期間pH值約為3.5，且生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溶解氧濃度保持在40％或更高的數(shù)值；b)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中所述甲醇誘導(dǎo)包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導(dǎo)進(jìn)行的溫度為15℃，pH值約7.0，補(bǔ)充消泡劑0.02％，攪拌減慢至400RPM，且誘導(dǎo)階段約163h。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可選擇性殺傷人T細(xì)胞的二價(jià)抗T細(xì)胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)，用以治療T細(xì)胞白血病、自體免疫病和移植耐受誘導(dǎo)(美國(guó)專利申請(qǐng)09/573,797，通過(guò)引用納入本文)。二價(jià)抗T細(xì)胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)，由白喉毒素(DT)的前390個(gè)氨基酸殘基(DT390)和來(lái)自抗CD3抗體UCHT1的兩個(gè)成串的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sFv)構(gòu)成。通過(guò)引入兩個(gè)突變已將DT390免疫毒素中的兩個(gè)N糖基化位點(diǎn)除去(Liuetal.，2000)，導(dǎo)致生成分子量96.5kDa的非糖蛋白。免疫毒素還可包括接頭分子，用以連接抗體部分與毒素部分。接頭(L)可為Gly-Ser接頭。Gly-Ser接頭可以是但不限于(Gly4Ser)n或(Gly3Ser)n。更具體地說(shuō)，接頭可為(Gly4Ser)3接頭(GGGGSGGGGSGGGGS)(SEQIDNO17)，本文也稱為(G4S)，或者(Gly3Ser)4接頭(GGGSGGGSGGGSGGGS)(SEQIDNO18)，本文也稱為(G3S)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。免疫毒素對(duì)6.0以下的pH水平敏感，這與低pH可誘導(dǎo)DT390部分的易位結(jié)構(gòu)域(translocationdomain)的不可逆構(gòu)象改變相一致。易位結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)DT390的A鏈以質(zhì)子依賴方式從內(nèi)體或質(zhì)膜到胞質(zhì)溶膠的易位。催化型A鏈在胞質(zhì)溶膠中通過(guò)延長(zhǎng)因子2(EF-2)的ADP核糖基化負(fù)責(zé)蛋白合成抑制。這種蛋白合成抑制作用對(duì)許多真核細(xì)胞具有毒性。由于陽(yáng)離子交換色譜法和親和色譜法需用低pH緩沖液洗脫，所以免疫毒素的pH敏感性限制了這兩種技術(shù)的使用。使用毒素抗性真核細(xì)胞可克服免疫毒素的毒性問(wèn)題。然而，篩選和鑒定毒素抗性真核細(xì)胞是一項(xiàng)煩瑣、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)的工作。而且，在EF-2突變體CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)二價(jià)免疫毒素被限制在5mg/L，無(wú)法通過(guò)選擇多基因插入提高其產(chǎn)量。由于這種限制，除三個(gè)例外(12，20，25)，所有治療用途的重組免疫毒素的生產(chǎn)均限于使用大腸桿菌(E.coli)制備，迫使包含體(6)變性再重新折疊。然而，來(lái)自大腸桿菌的二價(jià)免疫毒素的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的重新折疊不能有效完成，無(wú)法恢復(fù)其全部生物活性(25)。還有，二價(jià)免疫毒素的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)妨礙大腸桿菌的高效生產(chǎn)。因此，現(xiàn)有生產(chǎn)系統(tǒng)的缺點(diǎn)驅(qū)使我們?cè)噲D開(kāi)發(fā)有效的二價(jià)免疫毒素的巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)系統(tǒng)。對(duì)于二價(jià)抗T細(xì)胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv來(lái)說(shuō)，巴斯德畢赤酵母是良好的表達(dá)系統(tǒng)，這是因?yàn)?，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，它可提供最佳的蛋白折疊，而與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)相比(CHO細(xì)胞)，它可提供更高的產(chǎn)量。抗體融合蛋白需要正確的二硫鍵，酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供了與真核的抗體制造細(xì)胞相似的氧化環(huán)境。二價(jià)免疫毒素的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)需要真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)正確地折疊這種復(fù)雜的蛋白。而免疫毒素一旦表達(dá)，多數(shù)真核生物對(duì)其蛋白合成抑制作用敏感。然而，一種芽殖酵母——巴斯德畢赤酵母對(duì)DT具有一定程度的耐受性(Nevilleetal.，1992；Wooetal.，2002)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)中免疫毒素的產(chǎn)量可達(dá)40mg/L。通過(guò)遺傳工程改造的巴斯德畢赤酵母(JW102，從pJHW#2重新命名(Wooetal.，2002))的發(fā)酵，由分泌途徑制備免疫毒素。如實(shí)施例41所示，本方法在163h的誘導(dǎo)階段之后可提供120mg/l的產(chǎn)量，純化后的產(chǎn)量為90.8mg/L(見(jiàn)表6)。在經(jīng)過(guò)基因優(yōu)化，減少DNA序列中的AT含量之后，在生物反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)過(guò)24-44小時(shí)的誘導(dǎo)，受AOX1啟動(dòng)子控制的分泌表達(dá)水平可達(dá)25-30mg/L。巴斯德畢赤酵母對(duì)在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)的白喉毒素A鏈的毒性作用敏感，該鏈?zhǔn)寡娱L(zhǎng)因子2(EF-2)ADP核糖基化導(dǎo)致蛋白合成停止。通過(guò)分泌途徑表達(dá)的A-dmDT390-bisFv的毒性可通過(guò)誘導(dǎo)后甲醇消耗水平的不斷降低來(lái)說(shuō)明。給細(xì)胞提供甘油和甲醇的混合添加物。在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)DT的催化結(jié)構(gòu)域(A鏈)對(duì)巴斯德畢赤酵母來(lái)說(shuō)是致命的。當(dāng)使用甲醇誘導(dǎo)帶有構(gòu)建體A-dmDT390-bisFv(UCHT1)的細(xì)胞以表達(dá)免疫毒素時(shí)，24小時(shí)后近50％被殺死(Wooetal.，2002)。與之相比，當(dāng)在具有DT抗性突變的CHO細(xì)胞中表達(dá)相同的免疫毒素時(shí)，沒(méi)有觀察到毒性作用(Liu，etal.，2000；Thompson，etal.，2001)。在真核細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中，DT的催化結(jié)構(gòu)域催化延長(zhǎng)因子2(EF-2)的ADP核糖基化，導(dǎo)致蛋白合成抑制和細(xì)胞死亡(byproteinstarvationandorapoptosis，VanNessetal.，1980；Houchins，2000)。真核EF-2對(duì)這些毒素所致的ADP核糖基化的敏感性在于該蛋白的結(jié)構(gòu)。EF-2是約850個(gè)氨基酸的單條多肽鏈，由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。N末端G結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合和水解可促進(jìn)翻譯的GTP，C末端R(或白喉酰胺)結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為與核糖體相互作用(Kohnoetal.，1986；Perentesisetal.，1992)。白喉酰胺結(jié)構(gòu)域(圖1a)在22殘基的區(qū)域中包括一個(gè)在所有真核生物EF-2中高度保守的組氨酸殘基。該保守性組氨酸經(jīng)過(guò)特別的翻譯后修飾變?yōu)檠苌锇缀眭０?，白喉酰胺為DT所致ADP核糖基化時(shí)的獨(dú)特靶標(biāo)(VanNessetal.，1880)。在釀酒酵母中，可使該保守性組氨酸發(fā)生突變并使用某些其他2個(gè)氨基酸替換，可產(chǎn)生對(duì)ADP核糖基化具有抗性的功能性EF-2(Phanetal.，1993；KimataandKohno1994)。然而，其EF-2在白喉酰胺位置發(fā)生突變的細(xì)胞比表達(dá)野生型EF-2的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。在CHO細(xì)胞中，位于白喉酰胺C末端一側(cè)第3位置的另一個(gè)高度保守的甘氨酸若被精氨酸單一替換，也可阻止白喉酰胺的形成(Kohno&amp;Uchida，1987；Foleyetal.，1992)，生成不可ADP核糖基化的EF-2。該突變對(duì)釀酒酵母EF-2具有相同的效果(Kimataetal.，1993)。與白喉酰胺的突變相比，EF-2中Gly到Arg的突變不會(huì)影響CHO和釀酒酵母的細(xì)胞生長(zhǎng)(Foleyetal.，1992；KimataandKohno1994；Kimataetal.，1993)。為了確定可否通過(guò)使巴斯德畢赤酵母對(duì)毒素不敏感來(lái)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步提高A-dmDT390-bisFv的表達(dá)水平，使巴斯德畢赤酵母的EF-2基因產(chǎn)生突變，701位的Gly變?yōu)锳rg，該突變?cè)谄渌矬w內(nèi)已經(jīng)顯示可阻止EF-2的ADP核糖基化。EF-2誘變需要克隆該基因，將帶有選擇標(biāo)記URA3的體外突變序列引入基因組中，以及對(duì)突變的克隆進(jìn)行PCR鑒定。巴斯德畢赤酵母的整個(gè)EF-2基因已被克隆和測(cè)序。巴斯德畢赤酵母EF-2的編碼序列為2526個(gè)核苷酸，編碼842個(gè)氨基酸。巴斯德畢赤酵母EF-2與釀酒酵母和裂變酵母(S.pombe)的EF-2長(zhǎng)度相同，并分別與兩者在氨基酸序列上具有88％和78％的相同性(identity)。與這兩種酵母相比，巴斯德畢赤酵母只有一個(gè)含較短內(nèi)含子的EF-2基因拷貝。在弄清EF-2的完整序列之前，曾使用各種方法使巴斯德畢赤酵母發(fā)生突變，以獲得DT抗性株。由于缺少有效的篩選方法，所有這些努力都以失敗而告終。基于獲得的EF-2序列，構(gòu)建了靶向巴斯德畢赤酵母EF-2基因的pBLURA-Δ5’mutEF-2，通過(guò)同源重組在該基因中引入Gly701到Arg的突變。該構(gòu)建體包括EF-2的3’端1028個(gè)核苷酸和營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記URA3，其中EF-2已經(jīng)體外誘變含有上述的氨基酸替換。還開(kāi)發(fā)了PCR檢測(cè)方法，以便在尿嘧啶篩選之后快速準(zhǔn)確地分辨突變克隆。使用構(gòu)建體pBLURA-Δ5’mutEF-2進(jìn)行的定向克隆手段使得在巴斯德畢赤酵母EF-2基因的突變體中，約40％的尿嘧啶陽(yáng)性克隆被發(fā)現(xiàn)含有引入的突變。使用不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記培育EF-2突變體，(特別是mutEF2JC308(adelarg4his4)，mutEF2JC303(arg4his4)和mutEF2JC307(his4))，證實(shí)了EF-2中Gly701至Arg的突變使之對(duì)胞質(zhì)溶膠中表達(dá)的DTA鏈產(chǎn)生抗性。當(dāng)EF-2突變體在AOX1啟動(dòng)子的調(diào)控之下用于表達(dá)A-dmDT390-bisFv時(shí)，與未突變的表達(dá)株JW102相比，在搖瓶中制備該蛋白時(shí)并未顯示出優(yōu)勢(shì)。然而，若在JW102的最適條件下進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，突變株YYL#8-2[MUT2JC307-8(2)]的產(chǎn)量在96小時(shí)內(nèi)持續(xù)提高，達(dá)到高于未突變JW102株1.46倍的水平。至于細(xì)胞生長(zhǎng)和甲醇消耗速度，表達(dá)A-dmDT390-bisFv的突變株和不表達(dá)的野生株是相等的。因此，似乎表達(dá)A-dmDT390-bisFv對(duì)突變株沒(méi)有毒性。EF-2突變體允許在組成型GAP啟動(dòng)子(PGAP)的調(diào)控下表達(dá)A-dmDT390-bisFv。在搖瓶培養(yǎng)中，由PGAP調(diào)控表達(dá)A-dmDT390-bisFv的產(chǎn)量比由PAOX1調(diào)控表達(dá)要高出約30％。若采用發(fā)酵培養(yǎng)，由PGAP調(diào)控表達(dá)的產(chǎn)量可更為顯著地提高，這是由于發(fā)酵可使細(xì)胞生長(zhǎng)至極高的密度。在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，使用簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基(definedmedium)已成功表達(dá)和/或分泌了多種異源蛋白，如疫苗用肉毒菌神經(jīng)毒素片段(Potteretal.，2000)、乙型肝炎病毒表面抗原(Hardyetal.，2000)、明膠(Wertenetal.，1999)、膠原(Nokelainenetal.，2001)和胰島素(Wangetal.，2001)。胞質(zhì)溶膠中表達(dá)DT的催化結(jié)構(gòu)域?qū)е碌鞍缀铣梢种疲购铣膳囵B(yǎng)基中所有細(xì)胞死亡，但在天然培養(yǎng)基中不會(huì)如此(Liuetal.，2003)。該發(fā)現(xiàn)表明，天然培養(yǎng)基在減弱由EF-2的ADP核糖基化導(dǎo)致的蛋白合成抑制方面起著重要作用。使用搖瓶培養(yǎng)時(shí)，在合成培養(yǎng)基中觀察到極少量二價(jià)免疫毒素生成，但在天然培養(yǎng)基中沒(méi)有。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于合成培養(yǎng)基的巴斯德畢赤酵母發(fā)酵方法，用以表達(dá)異源蛋白，但使用天然培養(yǎng)基以分泌形式表達(dá)二價(jià)免疫毒素會(huì)提高產(chǎn)量。在當(dāng)前利用巴斯德畢赤酵母大規(guī)模制備二價(jià)免疫毒素過(guò)程中，將誘導(dǎo)溫度降至15℃會(huì)顯著提高生物活性免疫毒素的分泌量，因而可補(bǔ)償巴斯德畢赤酵母分泌能力的限制。另外，使用含酵母提取物的天然培養(yǎng)基明顯減弱了免疫毒素對(duì)巴斯德畢赤酵母宿主的毒性作用，進(jìn)一步提高了免疫毒素的分泌量。通過(guò)按如下方式優(yōu)化巴斯德畢赤酵母的發(fā)酵條件，生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)的二價(jià)免疫毒素表達(dá)水平可比搖瓶培養(yǎng)提高4倍(1)使用基于大豆蛋白胨(SoytonePeptone)和酵母提取物的天然培養(yǎng)基，(2)甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，使用甲醇/甘油混合添加物(4∶1)補(bǔ)充能源，(3)誘導(dǎo)過(guò)程中繼續(xù)添加PMSF和酵母提取物，(4)甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中將溫度降至15℃。甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中降低溫度可導(dǎo)致分泌量相比23℃時(shí)提高2倍。如上所述，生產(chǎn)二價(jià)免疫毒素的主要問(wèn)題是在甲醇誘導(dǎo)階段甲醇利用量減少。甲醇利用量減少是由限速酶醇氧化酶(AOX1)的活性降低所致。這相對(duì)于從分泌區(qū)泄漏或者從輕度酸性分泌區(qū)通過(guò)質(zhì)子依賴的易位，而到達(dá)胞質(zhì)溶膠區(qū)的二價(jià)免疫毒素所導(dǎo)致的蛋白合成抑制來(lái)說(shuō)，還是次要的(Arataetal.，2002)。在EF-2基因中具有毒素抗性突變的巴斯德畢赤酵母菌株中，甲醇利用量不受產(chǎn)生免疫毒素的影響(Liuetal.，2003)，這一事實(shí)說(shuō)明在菌株JW102中，毒素誘導(dǎo)的ADP核糖基化是AOX1活性降低的原因。然而，AOX1水平是由合成和降解兩方面的平衡來(lái)控制的，降解機(jī)制可因毒素介導(dǎo)的ADP核糖基化而加強(qiáng)。出于未知原因，酵母提取物可提高甲醇利用量，但對(duì)野生型水平不起作用。另外，低甲醇利用量會(huì)負(fù)面影響巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。這在本方法中，通過(guò)在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中加入另一種碳源——甘油，以及持續(xù)添加酵母提取物來(lái)解決。這兩項(xiàng)措施將甲醇利用量提高到非表達(dá)菌株的80％。為了進(jìn)一步補(bǔ)償由表達(dá)的免疫毒素所致的巴斯德畢赤酵母蛋白合成抑制，采用使甲醇代謝限速酶——醇氧化酶I(AOX1)具有最大活性的發(fā)酵條件(Veenhuisetal.，1983)。既然免疫毒素基因和AOX1基因處于同一強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，免疫毒素應(yīng)該被高水平表達(dá)。然而，先前曾觀察到，在異源蛋白的分泌中，各種蛋白似乎分別具有最佳分泌水平。在哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)和酵母細(xì)胞中，分泌型異源蛋白的超過(guò)最佳水平的表達(dá)(過(guò)表達(dá))可導(dǎo)致分泌型蛋白產(chǎn)量減少(BannisterandWittrup，2000；Liebmanetal.，1999；Liuetal.，2003；Pendseetal.，1992)。為了確定二價(jià)免疫毒素在巴斯德畢赤酵母中是否過(guò)表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中降低誘導(dǎo)溫度。由于在低溫下包括蛋白合成在內(nèi)的大部分細(xì)胞活性均降低，所以降低誘導(dǎo)溫度應(yīng)該降低二價(jià)免疫毒素的合成速率。對(duì)所導(dǎo)致的任何分泌變化均作出判斷。在較低的誘導(dǎo)溫度下，二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平提高，在17.5℃時(shí)達(dá)到最大值，生物活性的免疫毒素的分泌在15℃時(shí)達(dá)到最大值，盡管存在甲醇消耗率在15℃時(shí)下降至23℃時(shí)的75％這一事實(shí)。因?yàn)樵谡T導(dǎo)過(guò)程中持續(xù)添加PMSF和酵母提取物可有效抑制上清液中的蛋白酶活性，所以似乎不能用較低誘導(dǎo)溫度下蛋白酶活性降低來(lái)解釋15℃下二價(jià)免疫毒素的分泌水平增加了近2倍。前述的巴斯德畢赤酵母分泌二價(jià)免疫毒素的限制可能實(shí)際上反映了在23℃時(shí)過(guò)表達(dá)，在15℃時(shí)表達(dá)減少，從而實(shí)現(xiàn)分泌區(qū)內(nèi)輸入和輸出的較好平衡。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用巴斯德畢赤酵母(JW102)，在發(fā)酵罐中以甲醇作為碳源，在AOX1啟動(dòng)子的調(diào)控下以分泌途徑制備免疫毒素。高效制備免疫毒素主要有兩大障礙，免疫毒素對(duì)巴斯德畢赤酵母的毒性和巴斯德畢赤酵母分泌免疫毒素的能力限制。對(duì)巴斯德畢赤酵母的毒性導(dǎo)致在合成培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)的過(guò)程中，出現(xiàn)甲醇消耗代謝率下降、細(xì)胞生長(zhǎng)速率減緩以及產(chǎn)量極低等。這些問(wèn)題通過(guò)以下手段克服(1)使用基于大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物(如大豆蛋白胨)和酵母提取物的天然培養(yǎng)基，(2)在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中使用甲醇/甘油混合添加物(4∶1)補(bǔ)充能源，(3)甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中持續(xù)添加PMSF和酵母提取物。將誘導(dǎo)溫度降至15℃，與誘導(dǎo)溫度23℃時(shí)的分泌相比，分泌的免疫毒素產(chǎn)量提高幾乎2倍，達(dá)40mg/L(誘導(dǎo)67小時(shí))，盡管此時(shí)甲醇消耗量下降。另外，使用本方法，以無(wú)生物活性的寡聚體形式存在的免疫毒素部分減少。本發(fā)明還提供了一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液裝入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素裝入陰離子交換柱中；d)通過(guò)使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達(dá)到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。可選地，本方法進(jìn)一步包括在使用硼酸鈉溶液洗脫之前，先使用約25mM硼酸鈉溶液洗滌陰離子交換柱。被純化的非糖基化免疫毒素優(yōu)選通過(guò)本文教導(dǎo)的方法表達(dá)。純化方法的步驟(d)中，硼酸鈉溶液濃度在約25mM至約200mM之間，優(yōu)選在約75mM至約100mM之間。例如，步驟(e)中硼酸鈉濃度為約20mM。從巴斯德畢赤酵母上清液中大規(guī)模純化二價(jià)抗T細(xì)胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv(G4S)時(shí)所遇到的主要問(wèn)題，是存在具有相似電荷、大小和疏水特性的宿主糖蛋白。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)采用硼酸鹽陰離子色譜來(lái)解決。硼酸鹽陰離子對(duì)碳水化合物具有親和性，可使這些結(jié)構(gòu)帶有負(fù)電荷。硼酸鈉濃度在50至100mM之間時(shí)，非糖基化免疫毒素不與Poros50HQ陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，但是糖蛋白，包括與免疫毒素相關(guān)的聚集體卻可以結(jié)合。通過(guò)利用硼酸鈉存在時(shí)的免疫毒素的這種特性，開(kāi)發(fā)了3步純化過(guò)程(1)Butyl650M疏水作用色譜，(2)硼酸鹽存在下的Poros50HQ陰離子交換色譜，(3)Q陰離子交換色譜。該方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)(1)相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)滲析或滲濾步驟；(2)重復(fù)性好；(3)最終產(chǎn)率超過(guò)50％；(4)最終純度超過(guò)98％。以前，硼酸樹(shù)脂一直用于從蛋白質(zhì)中分離糖蛋白。然而，將硼酸鹽陰離子與常規(guī)陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合可實(shí)現(xiàn)從糖蛋白中分離免疫毒素，沒(méi)有必要根據(jù)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范準(zhǔn)則評(píng)估非標(biāo)準(zhǔn)樹(shù)脂。因此，將硼酸鹽陰離子交換色譜用于從巴斯德畢赤酵母糖蛋白中分離免疫毒素。免疫毒素只有單體形式具有功能活性。然而，從發(fā)酵過(guò)程中收獲的上清液包含免疫毒素的單體、二聚體和更高的寡聚體形式，以及巴斯德畢赤酵母蛋白。在這些巴斯德畢赤酵母蛋白之中，一種約45kDa的糖蛋白以二聚體形式(～90kDa)存在。二聚體和更高的寡聚體形式的免疫毒素可相對(duì)容易地使用常規(guī)疏水作用色譜和陰離子交換色譜分離。然而，分離純單體免疫毒素非常困難，因?yàn)?5kDa的糖蛋白與單體免疫毒素的大小、疏水性和等電點(diǎn)非常相似。以前，一直使用固定的苯硼酸樹(shù)脂從蛋白質(zhì)中分離糖蛋白(Myohanenetal.，1981；Bouritisetal.，1981；Williamsetal.，1981；Zanetteetal.，2003)。根據(jù)pH值、糖的存在與否、糖的類型、糖的濃度和緩沖液類型，這些固定樹(shù)脂可結(jié)合并選擇性阻礙糖蛋白。將免疫毒素與45kDa的糖蛋白分離時(shí)使用硼酸鹽陰離子交換色譜，而不使用固定苯硼酸親和色譜，因?yàn)楸脚鹚針?shù)脂的分離能力太差。硼酸鹽與具有鄰近順式羥基的糖殘基形成復(fù)合物(Boeseken，1949)，并且這些復(fù)合物可逆(Weigel，1963)。硼酸鹽與糖蛋白上的碳水化合物形成可逆復(fù)合物，導(dǎo)致糖蛋白的負(fù)電荷增加。該性質(zhì)使得非糖蛋白和糖蛋白的分離可以在陰離子交換色譜上進(jìn)行(Nomotoetal.，1982；NomotoandInoue，1983)。在分離免疫毒素與糖蛋白的過(guò)程中，硼酸鹽陰離子交換色譜和苯硼酸親和色譜具有不同的結(jié)合特性。在苯硼酸親和色譜中，糖蛋白以及免疫毒素在低離子強(qiáng)度條件下結(jié)合，它們可使用0-100mM硼酸鈉梯度或0-50mM山梨糖醇梯度共洗脫，說(shuō)明免疫毒素通過(guò)另一種機(jī)制與至少一種結(jié)合的糖蛋白發(fā)生物理相互作用，或者與苯硼酸柱發(fā)生相互作用。純化的二價(jià)免疫毒素也可與苯硼酸柱結(jié)合，這一事實(shí)說(shuō)明結(jié)合通過(guò)另一種機(jī)制進(jìn)行。在以前的使用搖瓶培養(yǎng)的純化方法中，采用包括DEAE陰離子交換色譜和蛋白L親和色譜的2步操作過(guò)程來(lái)純化免疫毒素(Wooetal.，2002)。然而，在巴斯德畢赤酵母的高密度發(fā)酵罐培養(yǎng)上清液中，含有嚴(yán)重影響陰離子交換樹(shù)脂能力的物質(zhì)。另外，蛋白L親和步驟需要超大型柱，費(fèi)用較高，且沒(méi)有優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)認(rèn)證。因而，需要開(kāi)發(fā)其他方法。利用Butyl650M的疏水作用色譜可順利進(jìn)行捕捉步驟，但同樣，濃縮的巴斯德畢赤酵母糖蛋白與免疫毒素具有相似的電荷、大小和疏水性。刀豆素A(concanavalinA)親和樹(shù)脂有望可除去糖蛋白，但具有潛在毒性的刀豆素A從樹(shù)脂上流下，造成對(duì)最終產(chǎn)品的不可接受的污染。陰離子交換柱可以是但不限于陰離子丙烯酸、陰離子瓊脂糖、陰離子纖維素、陰離子葡聚糖或陰離子聚苯乙烯。陰離子交換柱優(yōu)選PorosHQ50和Q陰離子交換柱。在本發(fā)明中，通過(guò)使用Poros50HQ硼酸鹽交換色譜，可實(shí)現(xiàn)免疫毒素單體形式的基本純化，盡管洗脫部分的免疫毒素被稀釋。因此，隨后通過(guò)Q陰離子交換色譜進(jìn)行濃縮步驟。疏水作用柱可以是但不限于Phenyl-SEPHAROSECL-4B，OctylAgarose，Phenyl-Sepharose6FastFlow，Phenyl-Agarose，Phenyl-Sepharose6FastFlow，Octyl-Sepharose4FastFlow，ButylSepharoseTM4FastFlow，OctylAgarose，Phenyl-Agarose，Hydrophobicchromatographymedia-monoaminoMAA-8，Hexyl-Agarose，Dodecyl-Agarose，Hexyl-Agarose，4-Phenylbutylamine-Agarose，Ethyl-Agarose，Matrix，Butyl-Agarose，PropylAgarose，AffinitychromatographymediaAAF-8，OctylAgarose，Butyl-Agarose，Decyl-Agarose，Phenyl-Agarose，MethylMatrixCeramicHyperDFHydrogelComposite，OctylAgarose，Trityl-Agarose，QSepharose，Ether650，Phenyl650，Butyl650或Hexyl650。疏水作用柱優(yōu)選Butyl650M疏水作用柱。這里的硼酸鹽陰離子交換色譜可用于純化巴斯德畢赤酵母表達(dá)的其他蛋白。巴斯德畢赤酵母正越來(lái)越多地用作治療用重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)(Cereghinoetal.，2002)。由于巴斯德畢赤酵母和人類的糖基化作用模式具有顯著差異，許多這些重組蛋白已經(jīng)去掉了其糖基化作用位點(diǎn)。然后這些重組蛋白可使用硼酸鹽陰離子交換色譜來(lái)純化?？煽紤]使用任何緩沖液、流速和柱大小，只要與裝在柱上的免疫毒素相比，其可以成功影響免疫毒素的洗脫，使之處于更加純凈的狀態(tài)。本發(fā)明中使用的免疫毒素包括與抗體部分(靶向部分)相連的突變型毒素部分(如DT毒素)?？墒褂玫亩舅匕ǖ幌抻诎缀矶舅?、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素。抗體部分優(yōu)選單鏈(sc)可變區(qū)。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施時(shí)將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、蛋白質(zhì)化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在參考文獻(xiàn)中給出詳細(xì)解釋，包括Sambrook，etal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)；DNACLONING，第I和II卷，D.NGlover編著(IRLPress，1985)；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS，M.J.Gait編著(IRLPress，1984)；NUCLEICACIDHYBRIDIZATION，B.D.Hames和S.J.Higgins編著(IRLPress，1984)；TRANSCRIPTIONANDTRANSLATION，B.D.Hames和S.J.Higgins編著，(IRLPress，1984)；ANIMALCELLCULTURE，R.I.Freshney編著(IRLPress，1986)；IMMOBILIZEDCELLSANDENZYMES，K.Mosbach(IRLPress，1986)；B.Perbal，APRACTICALGUIDETOMOLECULARCLONING，Wiley(1984)；系列METHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，Inc.；GENETRANSFERVECTORSFORMAMMALIANCELLS，J.H.Miller和M.P.Calos編著(ColdSpringHarborLaboratory，1987)；METHODSINENZYMOLOGY，第154和155卷，分別由Wu和Grossman編著，以及Wu編著，(AcademicPress，1987)，IMMUNOCHEMICALMETHODSINCELLANDMOLECULARBIOLOGY，R.J.Mayer和J.H.Walker編著(AcademicPressLondon，HarcourtBraceU.S.，1987)，PROTEINPURIFICATIONPRINCIPLESANDPRACTICE，第2版(Springer-Verlag，N.Y.(1987)，和HANDBOOKOFEXPERIMENTALIMMUNOLOGY，第I-IV卷，D.M.Weiretal.，(BlackwellScientificPublications，1986)；Kittsetal.，Biotechniques14810-817(1993)；Munemitsuetal.，Mol.andCell.Biol.105977-5982(1990)。本發(fā)明利用了編碼含白喉毒素的融合蛋白的核酸，其中該核酸可由酵母細(xì)胞表達(dá)?？捎山湍副磉_(dá)的核酸包括修飾的天然白喉編碼序列。為了促進(jìn)本發(fā)明的核酸由酵母細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)富含A和T核苷酸的核酸區(qū)進(jìn)行修飾，以使其編碼的免疫毒素融合蛋白可由酵母表達(dá)。例如，這種修飾使之可由巴斯德畢赤酵母表達(dá)。這種修飾設(shè)計(jì)為可抑制聚腺苷酸化信號(hào)和/或減少RNA轉(zhuǎn)錄的提前終止。更具體地說(shuō)，對(duì)天然白喉編碼序列的一個(gè)或多個(gè)富含AT區(qū)進(jìn)行修飾，減少AT含量。富含AT區(qū)包括AT含量至少60％的至少150個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域，或者AT含量至少65％的至少90個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域，富含AT區(qū)的AT含量?jī)?yōu)選降至55％或更低。富含AT區(qū)還包括AT含量至少63％的至少150個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域，或者AT含量至少68％的至少90個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域，富含AT區(qū)的AT含量降至55％或更低。優(yōu)選將天然白喉編碼序列進(jìn)一步修飾以編碼C末端截短的白喉毒素。而且，優(yōu)選將天然白喉編碼序列進(jìn)一步修飾，以在天然白喉毒素氨基末端甘氨酸殘基之前編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸。而且，優(yōu)選將天然白喉編碼序列進(jìn)一步修飾，以編碼α-交配因子信號(hào)肽或其一部分。本發(fā)明的免疫毒素可在多種生物體內(nèi)表達(dá)和純化。這些生物體包括酵母如巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母，細(xì)菌如大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞。使用酵母表達(dá)系統(tǒng)(包括，例如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母)有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，有證據(jù)表明，由酵母分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白顯示正確的二硫配對(duì)(disulfidepairing)。其次，使用酵母表達(dá)系統(tǒng)，可進(jìn)行高效的大規(guī)模生產(chǎn)。釀酒酵母前-原-α交配因子前導(dǎo)區(qū)可用于指導(dǎo)酵母的蛋白分泌(Brake，etal.(82))。前-原-α交配因子的前導(dǎo)區(qū)包括信號(hào)肽和原-片段，其中原-片段又包括由KEX2基因編碼的酵母蛋白酶的識(shí)別序列該酶在Lys-Arg二肽切割信號(hào)序列的羧基一側(cè)將前體蛋白切除。核酸編碼序列與前-原-α交配因子前導(dǎo)區(qū)發(fā)生框內(nèi)(in-frame)融合。該構(gòu)建體可放置于強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的調(diào)控之下，如醇脫氫酶I啟動(dòng)子、醇氧化酶I啟動(dòng)子、糖分解啟動(dòng)子(glycolyticpromoter)或者半乳糖利用途徑啟動(dòng)子。核酸編碼序列隨后是翻譯終止密碼子，再后是轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)?；蛘?，核酸編碼序列可與另一條蛋白編碼序列(如Sj26或β-半乳糖苷酶)融合，以有利于融合蛋白通過(guò)親和色譜法純化?？稍谟糜诮湍副磉_(dá)的構(gòu)建體內(nèi)插入蛋白酶切割位點(diǎn)，以便將該融合蛋白的各部分分開(kāi)。當(dāng)白喉毒素A鏈在胞質(zhì)溶膠區(qū)合成而沒(méi)有分泌信號(hào)時(shí)，該毒素對(duì)酵母是有毒性的(Parentesisetal.，1988)。該毒素催化活性對(duì)EF-2具有特異性，發(fā)生于第699位的獨(dú)特的翻譯后組氨酸殘基，該殘基在所有真核生物EF-2的保守性氨基酸序列中均有發(fā)現(xiàn)。酵母EF-2中的第701位甘氨酸變?yōu)榫彼釟埢?，可?dǎo)致對(duì)DT產(chǎn)生抗性。在另一個(gè)純化方法中，(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)在畢赤酵母(Pichia)培養(yǎng)基中生產(chǎn)，產(chǎn)量在5mg/ml水平，不論是否存在突變型EF-2基因。在以下兩方面之間存在極緊耦合一方面是α-交配因子信號(hào)序列的存在，另一方面是(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)區(qū)室化，進(jìn)入分泌途徑而遠(yuǎn)離胞質(zhì)溶膠區(qū)中的EF-2毒素底物，因?yàn)榘|(zhì)溶膠中的一個(gè)毒素分子在24小時(shí)內(nèi)就可以使99％的EF-2失活。利用α-交配因子信號(hào)序列在畢赤酵母中生產(chǎn)(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1)，而非使畢赤酵母產(chǎn)生毒素抗性的突變，已經(jīng)提供了成功的結(jié)果。另外，酵母產(chǎn)生的毒素(蓖麻毒素A鏈)和信號(hào)序列Kar2的結(jié)合可導(dǎo)致生產(chǎn)細(xì)胞的死亡(Simpsonetal.，1999(80))。在畢赤酵母中的免疫毒素融合蛋白的基因劑量較高的情況下，mEF-2有可能對(duì)生產(chǎn)具有益處。對(duì)生產(chǎn)免疫毒素融合蛋白來(lái)說(shuō)，酵母相對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)為，未經(jīng)任何處理的酵母即對(duì)存在于外部培養(yǎng)基中的水平高達(dá)3.3×10-6M的白喉毒素具有極高的抗性。顯然，酵母莢膜阻止了毒素被逆行運(yùn)輸回胞質(zhì)溶膠區(qū)，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母原生質(zhì)球中會(huì)發(fā)生此類現(xiàn)象(Chenetal.，1985)。本發(fā)明可利用包含編碼免疫毒素融合蛋白的核酸的細(xì)胞。該細(xì)胞可為原核細(xì)胞，包括，例如細(xì)菌細(xì)胞。更具體地說(shuō)，細(xì)菌細(xì)胞可為大腸桿菌細(xì)胞?；蛘?，該細(xì)胞可為真核細(xì)胞，包括，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括，例如，如Moehring和Moehring所選擇的DT抗性CHO-K1RE1.22c細(xì)胞系)、骨髓瘤細(xì)胞、畢赤酵母細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞。可將免疫毒素融合蛋白編碼序列引入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，例如通過(guò)氨甲喋呤抗性編碼載體，或者使用適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記引入其他細(xì)胞系。可通過(guò)DNA印跡分析來(lái)確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞中是否存在載體DNA?？赏ㄟ^(guò)RNA印跡分析來(lái)確定是否有相應(yīng)于插入編碼序列的RNA產(chǎn)生。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多其他適合的宿主細(xì)胞系，包括骨髓瘤細(xì)胞系、成纖維細(xì)胞系，以及多種腫瘤細(xì)胞系如黑色素瘤細(xì)胞系。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，以及必需的信息處理位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。表達(dá)控制序列優(yōu)選來(lái)自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動(dòng)子。含有所研究的核酸片段的載體可通過(guò)公知的方法轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，且這些方法可根據(jù)細(xì)胞宿主類型而變化。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化通常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣、DEAE葡聚糖或脂質(zhì)體(lipofectin)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或者電穿孔可用于其他細(xì)胞宿主。用于本發(fā)明的核酸可與一個(gè)或多個(gè)可指導(dǎo)和調(diào)控插入核酸的轉(zhuǎn)錄的功能元件有效連接，并且該核酸可被表達(dá)。例如，核酸可與細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子有效連接，用于指導(dǎo)核酸的體外轉(zhuǎn)錄。提供了巴斯德畢赤酵母的突變株。該突變株包括在至少一個(gè)編碼延長(zhǎng)因子2(EF2)的基因中發(fā)生突變。該突變包括在修飾的組氨酸殘基白喉酰胺的羧基一側(cè)的兩個(gè)殘基位置發(fā)生Gly到Arg的替換。籍此，可使該突變株產(chǎn)生對(duì)于白喉毒素ADP核糖基化毒性作用的抗性。提供了一種表達(dá)白喉毒素蛋白部分的方法。本發(fā)明的此方法包括，在可使細(xì)胞中蛋白編碼核酸表達(dá)的條件下，使用包括毒素蛋白編碼核酸的載體轉(zhuǎn)染本發(fā)明的突變巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。所述條件為用于巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的條件，且可根據(jù)該特定系統(tǒng)優(yōu)化?？贵w部分優(yōu)選經(jīng)由抗CD3途徑或其他T細(xì)胞表位途徑。免疫毒素可為單價(jià)，但目前來(lái)講優(yōu)選二價(jià)抗體部分，因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)二價(jià)抗體可增強(qiáng)細(xì)胞殺傷能力約15倍。可考慮將任何數(shù)量的化學(xué)耦合或重組DNA方法用于生成本發(fā)明的免疫毒素。因此，提到融合毒素或耦合毒素，未必是限制性的。免疫毒素可為重組法制備的融合蛋白?？稍谥亟M產(chǎn)生的二價(jià)抗體(靶向部分)和重組產(chǎn)生的突變型毒素部分的特殊位點(diǎn)，通過(guò)化學(xué)硫醚鍵連接制備免疫毒素。免疫毒素的靶向部分可包括人μCH2、μCH3和μCH4區(qū)，以及來(lái)自鼠Ig抗體的VL和VH區(qū)。這些區(qū)可來(lái)自抗體UCHT1，以使該抗體部分為scUCHT1，它是具有人μCH2、μCH3和μCH4區(qū)和如圖所示的小鼠可變區(qū)的單鏈CD3抗體。可考慮多種DT突變型毒素部分，包括例如DT390和DT389，帶有多個(gè)突變或者以野生型毒素部分的形式。毒素部分保留其毒性功能，以及全部膜易位至胞質(zhì)溶膠的功能。位于該蛋白的受體結(jié)合區(qū)域的結(jié)合功能的喪失，可通過(guò)減少與非靶細(xì)胞的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)減小全身毒性。因此，該免疫毒素可安全施用。通常由毒素結(jié)合功能提供的尋路(routing)功能由靶向抗體抗CD3來(lái)提供。重要的尋路途徑有(1)定位于有被小窩進(jìn)行胞吞作用，(2)從溶酶體尋路中逃逸，(3)返回質(zhì)膜。任何以此方式尋路的抗體均可與毒素部分一起發(fā)揮作用，而不論該抗體所針對(duì)的表位，只要毒素沿該途徑可實(shí)現(xiàn)足夠的蛋白酶解加工。足夠的加工可通過(guò)細(xì)胞殺傷水平來(lái)確定。作為核內(nèi)體酸化的結(jié)果，受體構(gòu)型受特定受體的誘導(dǎo)而變化，可導(dǎo)致抗體與其受體的脫離，這時(shí)抗體進(jìn)入溶酶體途徑。這可以通過(guò)以下方式避免或控制在最小水平將抗體導(dǎo)向質(zhì)膜附近的相同受體上的外功能區(qū)表位(Ruud，etal.(1989)Scand.J.Immunol.29299；Herzetal.(1990)J.Biol.Chem.26521355)。突變型DT毒素部分可為具有和沒(méi)有點(diǎn)突變或置換的截短型突變體，如DT390、DT389或DT383，或其他的截短型突變體，以及具有點(diǎn)突變的全長(zhǎng)毒素，如DTM1或CRM9(在潰瘍棒狀桿菌(C.ulcerans)中克隆)，與DTM1和DT483的scUCHT1融合蛋白，DT390和DT389，并且已經(jīng)在大腸桿菌中克隆和表達(dá)?？贵w部分可為具有本文所詳細(xì)敘述的尋路和其他特性的scUCHT1或其他抗CD3或抗T細(xì)胞抗體。因此，用于本發(fā)明方法的免疫毒素的一個(gè)實(shí)例包括融合蛋白免疫毒素UCHT1(或其片段)-DT390。有一條糖基化作用的共有序列(NXS/T(SEQIDNO19))，可將其去除或插入以控制糖基化作用。糖基化作用存在于所有真核生物中，如巴斯德畢赤酵母。有多種免疫毒素的變體。蛋白變體和衍生物為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，可包括氨基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾通常可歸入三類中的一類或多類置換、插入或缺失變體。插入包括氨基和/或羧基末端融合，以及在序列內(nèi)部插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入通常為比氨基或羧基末端融合小的插入，例如大約一至四個(gè)殘基。具免疫原性的融合蛋白衍生物，例如實(shí)施例中所述的，是通過(guò)體外交聯(lián)或者使用編碼該融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞培養(yǎng)，以使足夠大的可產(chǎn)生免疫原性的多肽與靶序列融合來(lái)制備。缺失的特征是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基從蛋白序列中去除。通常在蛋白分子內(nèi)的任何位點(diǎn)，不超過(guò)大約從2至6個(gè)殘基缺失。這些變體一般通過(guò)將編碼該蛋白的DNA中的核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變制備，由此產(chǎn)生編碼該變體的DNA，然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)。在具有已知序列的DNA中的預(yù)定點(diǎn)造成置換突變的技術(shù)已為公知，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換通常為單個(gè)殘基，但可以同時(shí)在多個(gè)不同位置發(fā)生；插入通常為大約1至10個(gè)氨基酸殘基；缺失的范圍為大約1至30個(gè)殘基。缺失或插入優(yōu)選在相鄰的一對(duì)中發(fā)生，即2殘基缺失或2殘基插入。置換、缺失、插入或其任意形式的結(jié)合可一起實(shí)現(xiàn)最終的構(gòu)建體。突變不可將序列置于讀框之外，優(yōu)選不產(chǎn)生可導(dǎo)致二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。置換變體是去掉至少一個(gè)殘基并在該位置插入另一個(gè)殘基形成的變體。該置換一般按照下表進(jìn)行，被稱為保守性置換。氨基酸縮寫(xiě)氨基酸置換初始?xì)埢纠员Ｊ匦灾脫Q，其他為本領(lǐng)域所公知?？赏ㄟ^(guò)下列方法使功能或免疫同一性發(fā)生較大變化選擇與氨基酸置換表中的置換相比，保守性較低的置換，即選擇對(duì)維持以下方面的效果有顯著差異的殘基(a)置換區(qū)的多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)的分子電荷或疏水性，或者(c)側(cè)鏈大小。通常會(huì)使蛋白性質(zhì)發(fā)生最大變化的置換是(a)親水性殘基(如絲氨?；蛱K氨酰基)置換疏水性殘基(如亮氨?；惲涟滨；⒈奖滨；?、纈氨?；虮滨；?(或者前者被后者置換)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置換任何其他殘基(或者被任何其他殘基置換)；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基(如賴氨?；?、精氨?；蚪M氨?；?置換負(fù)電殘基(如谷氨?；蛱於滨；?(或者前者被后者置換)；或者(d)具有較大側(cè)鏈的殘基(如苯丙氨酸)置換沒(méi)有側(cè)鏈的殘基(如甘氨酸)(或者前者被后者置換)，在這種情況下，(e)增加硫酸化和/或糖基化位點(diǎn)的數(shù)目。例如，一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)生物或者化學(xué)上相似的氨基酸殘基替換，這作為保守性置換已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，保守性置換可使用一個(gè)疏水性殘基置換另一個(gè)疏水性殘基，或者使用一個(gè)極性殘基置換另一個(gè)極性殘基。這種置換所包括的組合例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr。各條明確公開(kāi)的序列的此類保守性置換變異形式均包含于本發(fā)明提供的嵌合體多肽之中。置換或缺失誘變可用于插入N糖基化作用位點(diǎn)(Asn-X-Thr/Ser)或O糖基化作用位點(diǎn)(Ser或Thr)。可能還需要使半胱氨酸或其他不穩(wěn)定殘基發(fā)生缺失。潛在的蛋白酶解位點(diǎn)(如Arg)的缺失和置換，可通過(guò)例如使一個(gè)堿性殘基缺失或者使一個(gè)殘基被谷氨酰胺?；蚪M氨?；鶜埢脫Q來(lái)實(shí)現(xiàn)。一定的翻譯后衍生作用是重組宿主細(xì)胞對(duì)所表達(dá)的多肽作用的結(jié)果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺?；鶜埢Ｔ诜g后脫去酰胺，變成相應(yīng)的谷氨?；吞於滨；鶜埢??；蛘?，這些殘基在溫和的酸性條件下脫去酰胺。其他的翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰基或蘇氨?；鶜埢牧u基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的o-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&amp;Co.，SanFranciscopp79-86)，N末端胺的乙?；?，以及在某些情況下，C末端羧基的酰胺化。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還可包括可影響mRNA表達(dá)的、轉(zhuǎn)錄終止必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中，轉(zhuǎn)錄為聚腺苷酸片段。3′非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄單位優(yōu)選還包括聚腺苷酸區(qū)。該區(qū)的一個(gè)作用是增加了轉(zhuǎn)錄單位像mRNA一樣被處理和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。表達(dá)構(gòu)建體中聚腺苷酸信號(hào)的識(shí)別和利用方法已經(jīng)較好地建立起來(lái)。優(yōu)選將同源聚腺苷酸信號(hào)用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。在某些轉(zhuǎn)錄單位中，聚腺苷酸區(qū)來(lái)自SV40早期聚腺苷酸信號(hào)，并且包括大約400個(gè)堿基。轉(zhuǎn)錄單位還優(yōu)選包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列，單獨(dú)或與以上序列相結(jié)合，以提高構(gòu)建體的表達(dá)水平或穩(wěn)定性。實(shí)施例提出以下實(shí)施例，以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供本發(fā)明所要求保護(hù)的化合物、組合物、產(chǎn)品、裝置和/或方法的制備和評(píng)估手段的完全公開(kāi)和描述，僅僅出于示例性目的，并非意在限制本公開(kāi)的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，份數(shù)為重量份數(shù)，溫度以℃為單位或者為環(huán)境溫度，壓力等于或接近大氣壓。實(shí)施例1使用經(jīng)誘變處理的寡核苷酸轉(zhuǎn)化56個(gè)核苷酸的寡聚體(見(jiàn)引物列表)包含兩點(diǎn)突變，將氨基酸701從甘氨酸換為精氨酸。經(jīng)誘變處理的寡聚體(56聚體，100μg)與ARG4DNA片段共轉(zhuǎn)化進(jìn)入GS200(Mut+，His-，Arg-)菌株。帶有啟動(dòng)子的ARG4基因通過(guò)SphI和EcoRV取自質(zhì)粒PMY30(由Prof.JimCregg，KeckGraduateInstituteofAppliedLifiSciences，Claremont，CA91711提供)。共獲得大約1000個(gè)轉(zhuǎn)化體。為了篩選具有正確突變的突變型克隆，采用使用引物mdb1EF-2和2253EF-2C的診斷PCR。突變檢測(cè)引物(mdb1EF-2)可以區(qū)分正常基因和氨基酸701突變的基因的DNA序列。對(duì)于正常基因來(lái)說(shuō)，得不到PCR產(chǎn)物，因?yàn)?′端的2個(gè)核苷酸與正?；虻腄NA序列不匹配，Taq聚合酶阻止了其延伸。對(duì)于突變基因，引物可完美退火，所以Taq聚合酶可產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。用這種PCR方法篩選了1000多個(gè)菌落，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變型菌落。(在以上的PCR檢測(cè)中，來(lái)自釀酒酵母的氨基酸701突變的EF-2用作陽(yáng)性對(duì)照。該突變基因已經(jīng)事先制備出來(lái)，意在將其引入巴斯德畢赤酵母中。然而，以此轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母生長(zhǎng)速率極低，產(chǎn)生所需蛋白的水平也很低。)使用包含EF-2基因保守區(qū)和氨基酸701突變的部分DNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化。巴斯德畢赤酵母EF-2的部分序列(位置1717至2289，圖3(a)(b)(c)(d))在體外發(fā)生突變，將氨基酸701從甘氨酸變?yōu)榫彼?圖1b)，然后與ARG4基因片段共轉(zhuǎn)化進(jìn)入GS200菌株。共獲得2000多個(gè)Arg4陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體，再通過(guò)診斷PCR使用引物mdb2EF-2和2253EF-2C從中篩選EF-2突變。未觀察到突變。引物列表來(lái)自釀酒酵母EF-2的引物5′引物TTGGTTATTGACCAAACTAAGGCTGTCCAA(SEQIDNO20)3′引物ACCTCTCTTCTTGTTTAAGACGGAGTAGAT(SEQIDNO21)在巴斯德畢赤酵母EF-2的克隆和突變中使用的引物dT22-Not5’-CTTGCTTTTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQIDNO22)EF-2C25’-GATAAGAATGCGGCCGCCATTTCTTGGTCTTTGGGTTGAAG(SEQIDNO23)EF-2C15’-GATAAGAATGCGGCCGCCAACTTAGTTGTTGACCAGTCTAAG(SEQIDNO24)5’EF-25’-ATAGCTAGCACTTTGAAGTTCTTAATTTTGTTCCTC(SEQIDNO25)3’EF-2C5’-ATAAGAATGCGGCCGCAAGTTAATGAAACATTAAGCTTACAAC(SEQIDNO26)wEF-25’-GAATGACTTGTCCTCCACC(SEQIDNO27)mEF-25’-GAATGACTTGTCCTCCGCGG(SEQIDNO28)EF-14265’-CAACTAGCTAGCGCTCACAACATGAAGGTCATGAAATTC(SEQIDNO29)EF-13185’-AGAACCGTCGAGCCTATTGACGAT(SEQIDNO30)經(jīng)誘變處理的寡核苷酸5’-CCCTGCACGCCGATGCTATCCACAGAAGAGGAGGACAAGTCATTCCAACCATGAAG(SEQIDNO31)mdb1EF-25’-GCCGATGCTATCCACAGAAGA(SEQIDNO32)mbb2EF-2GCCGATGCTATCCACCGCCGC(SEQIDNO33)2253EF-2CTCTCTTCTTGTTCAAAACAGAGTAGATACC(SEQIDNO34)實(shí)施例2使用突變型EF-2部分片段和ARG4片段進(jìn)行原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化。在實(shí)施例1的方法中，沒(méi)有針對(duì)野生型DT的篩選步驟。因而采用雙轉(zhuǎn)化。首先，突變型EF-2片段通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化進(jìn)入GS200菌株。然后，將電穿孔細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)突變型EF-2。培養(yǎng)的細(xì)胞用于制備原生質(zhì)球。生成的原生質(zhì)球使用野生型DT(200μg/ml)和ARG4片段(10μg)處理1小時(shí)，并且通過(guò)CaCl2和PEG轉(zhuǎn)化。只獲得少量正常菌落大小的轉(zhuǎn)化體，沒(méi)有突變菌株。另外，還獲得100個(gè)或更多的微小菌落。對(duì)這其中100個(gè)進(jìn)行篩選，沒(méi)有檢測(cè)到突變菌株。實(shí)施例3巴斯德畢赤酵母EF-2基因的克隆和測(cè)序在克隆巴斯德畢赤酵母EF-2基因的全序列之前，已經(jīng)獲得其部分序列。最開(kāi)始，從基因組DNA中擴(kuò)增巴斯德畢赤酵母EF-2的保守性R結(jié)構(gòu)域，該過(guò)程使用來(lái)自釀酒酵母EF-2的相同結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)引物(Perentesisetal.，1992)。5′引物包括釀酒酵母EF-2中從位置1933至1962的序列，而3′引物與2227至2256區(qū)域互補(bǔ)。然后在巴斯德畢赤酵母EF-2基因的編碼區(qū)內(nèi)，這條324個(gè)核苷酸的序列在5′端延伸至位置284，在3′端延伸至位置2289。后來(lái)發(fā)現(xiàn)這條延伸的序列包含幾處錯(cuò)誤。為了克隆整個(gè)巴斯德畢赤酵母EF-2基因，首先使用兩條不同的引物從EF-2mRNA分別合成了兩種cDNA。引物dT22-Not包括與mRNA的3′polyA尾巴互補(bǔ)的一串22個(gè)T殘基，以及限制酶Not1的識(shí)別序列。引物EF-2C2有25個(gè)核苷酸，它與巴斯德畢赤酵母EF-2編碼序列的位置747至771的核苷酸(圖3(a)(b)(c)(d))互補(bǔ)。cDNA合成后，一串同聚物A殘基通過(guò)同聚物加尾反應(yīng)加至由引物C2延伸的cDNA的3′端(Sambrooketal.，1989)。EF-2的5′端序列通過(guò)PCR從經(jīng)過(guò)修飾的、使用EF-2C2和dT22-Not引物合成的cDNA擴(kuò)增，而3′端序列從使用引物dT22-Not和EF-2C1合成的cDNA擴(kuò)增，后者包括對(duì)應(yīng)于位置1927至1953的27個(gè)核苷酸。然后將代表巴斯德畢赤酵母EF-2的5′端和3′端序列的PCR產(chǎn)物分別克隆進(jìn)入pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)。選出5個(gè)包含巴斯德畢赤酵母EF-2的5′序列的獨(dú)立的克隆用來(lái)測(cè)序。它們首先使用位于載體內(nèi)分別靠近插入物上游和下游的M13反向引物和M13正向引物來(lái)測(cè)序，然后使用與EF-2編碼序列的位置349至384互補(bǔ)的內(nèi)引物(internalprime)來(lái)測(cè)序。在5個(gè)克隆中，三個(gè)具有相同的序列，一個(gè)在兩個(gè)不同的內(nèi)部位置具有兩個(gè)不同的核苷酸，另一個(gè)在一個(gè)不同的位置具有另一個(gè)不同的內(nèi)核苷酸(internalmucleotide)。這些不同的核苷酸有可能是在克隆過(guò)程中產(chǎn)生的，因?yàn)檫@些不同的核苷酸在來(lái)自基因組DNA的克隆中均沒(méi)有出現(xiàn)。在5′端，所有五個(gè)克隆在第一個(gè)ATG密碼子之前都還有57到69個(gè)相同序列的核苷酸。5′端序列的最大的開(kāi)放讀碼框(ORF)開(kāi)始于第一個(gè)AUG，有747個(gè)核苷酸，其推得的氨基酸序列(249個(gè)氨基酸)與釀酒酵母EF-2的N末端的前249個(gè)氨基酸具有90％的相同性。所有包括EF-2序列的3′端序列的四個(gè)克隆都具有相同的675個(gè)核苷酸的序列，隨后是同聚物A串(homopolymericAtrack)。最大的ORF有603個(gè)核苷酸，結(jié)束于終止密碼子TAA，該密碼子位于poly-A串的上游72個(gè)核苷酸處。推得的氨基酸序列(201個(gè)氨基酸)與釀酒酵母EF-2的C末端的后201個(gè)氨基酸具有85％的相同性。已經(jīng)獲得巴斯德畢赤酵母EF-2的5′和3′端序列之后，設(shè)計(jì)兩個(gè)引物用來(lái)從巴斯德畢赤酵母基因組DNA中擴(kuò)增整個(gè)EF-2基因。引物5′EF-2來(lái)自5′非編碼區(qū)，包括相對(duì)于ATG起始密碼子的位置28至54的序列。引物3′EF-2C包括與3′端的位置2523至2549互補(bǔ)的27個(gè)核苷酸。使用Pfu聚合酶(Stratagene)進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，EF-2基因的PCR產(chǎn)物使用Taq聚合酶處理，以使其加上3′A突出端(overhanging)(InstructionmanualfororiginalTAcloningkit，Invitogen)，然后將其插入TA克隆載體pCR2.1-TOPO。選出十個(gè)克隆，從這些克隆分離質(zhì)粒DNA，對(duì)其進(jìn)行限制酶分析表明它們均具有相同的插入物。首先使用M13反向引物和M13正向引物進(jìn)行DNA測(cè)序，然后使用來(lái)自前一步所獲序列的引物，一步步地朝相對(duì)一端進(jìn)行測(cè)序。八個(gè)克隆被完全測(cè)序，結(jié)果序列相同。從基因組DNA獲得的3′端序列與來(lái)自mRNA的序列相同。然而，與mRNA的5′序列相比，來(lái)自基因組DNA的序列在緊接EF-2ORF起始位點(diǎn)的密碼子中具有77個(gè)核苷酸的插入物(圖2)。該插入物具有序列GTATGT...CACTAAC...TAG(SEQIDNO35)，即釀酒酵母的短內(nèi)含子的保守模式(Davisetal.，200；Rymond&amp;Rosbash，1992)。盡管內(nèi)含子在釀酒酵母中很常見(jiàn)，但在巴斯德畢赤酵母中卻極少出現(xiàn)(Gregg，personalcommunication)。巴斯德畢赤酵母EF-2的編碼序列顯示于圖3(a)(b)(c)(d)。它包括2526個(gè)核苷酸，編碼842個(gè)氨基酸。巴斯德畢赤酵母EF-2與釀酒酵母和裂變酵母EF-2的長(zhǎng)度相同，并且其氨基酸序列與釀酒酵母有88％的相同性(Perentesisetal.，1992)，與裂變酵母有78％的相同性(Mitaetal.，1997)。釀酒酵母和裂變酵母在每一單倍體基因組中均有兩個(gè)功能性EF-2基因(EFT1和EFT2)。這兩個(gè)EF-2基因拷貝編碼相同的氨基酸序列，但在編碼區(qū)中有少數(shù)核苷酸不同(釀酒酵母有4個(gè)，裂變酵母有13個(gè))，側(cè)翼序列也不同。然而，來(lái)自mRNA和基因組DNA的獨(dú)立克隆的測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，所有不同的克隆均具有相同的5′和3′端側(cè)翼序列以及相同的編碼序列。這再加上限制酶消化的基因組DNA的DNA印跡證據(jù)，說(shuō)明巴斯德畢赤酵母只有一個(gè)EF-2基因拷貝。實(shí)施例4構(gòu)建突變質(zhì)粒pBLURA-Δ5’mutEF-2。為了制備DT抗性的巴斯德畢赤酵母菌株，使EF-2基因發(fā)生突變，將711位的Gly變?yōu)锳rg。將突變引入基因組中所采用的手段是根據(jù)Shortleetal.(1984)的敘述，并顯示于圖4中。在該方法中，使用靶基因的截短型(只在一端)，通過(guò)同源重組將突變引入基因組中的基因中。整合帶有突變的截短型基因片段將導(dǎo)致下述情形基因組包括一個(gè)帶有突變的該基因的完整拷貝，以及一個(gè)截短型拷貝。因?yàn)榘形稽c(diǎn)位于3′端附近，所以使用5′截短型EF-2(Δ5’EF-2)作為突變序列。Δ5’EF-2包括來(lái)自EF-2的3′端的1127個(gè)核苷酸，從位置1432至2549(圖3)，通過(guò)PCR使用Pfu聚合酶產(chǎn)生。在克隆進(jìn)入pCR2.1-TOPO載體之后，通過(guò)寡核苷酸指導(dǎo)的誘變，使Δ5’EF-2在體外發(fā)生突變。然后通過(guò)使用限制酶Nhe1和Not1分別切5′和3′端，使突變的Δ5’EF-2(Δ5’mutEF-2)從pCR2.1-TOPO上釋放，然后克隆進(jìn)入已經(jīng)被Nhe1和Not1消化的載體pBLURA-SX(由Cregg教授提供，記載于Geoffreyetal.(2001))中。該載體包括營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記URA3。從細(xì)菌中純化的質(zhì)粒DNApBLURA-Δ5’mutEF-2被線性化，再由電穿孔轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母菌株中。該質(zhì)粒DNA包括一個(gè)獨(dú)特的AatII位點(diǎn)，位于EF-2序列中突變位點(diǎn)之前大約220個(gè)核苷酸處。在該位點(diǎn)切割可使質(zhì)粒整合靶向于EF-2基因座，并且有利于使突變的序列轉(zhuǎn)移至EF-2的完整拷貝中。使用該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化三個(gè)巴斯德畢赤酵母尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株。它們是JC308(ade1arg4his4ura3)、JC303(arg4his4ura3)和JC307(his4ura3)，全部由Cregg教授提供并記載于Geoffreyetal.(2001)。先轉(zhuǎn)化JC308，然后轉(zhuǎn)化JO303和JC307。實(shí)施例5識(shí)別含突變型EF-2的克隆。在使用線性化的pBLURA-Δ5’mutEF-2DNA電穿孔之后，將細(xì)胞涂布在含有缺少尿嘧啶的合成完全酵母培養(yǎng)基的平板上(K.DMedical，Maryland)。然后通過(guò)“菌落PCR”分析Ura+克隆，以確定在完整的EF-2拷貝中是否含有正確的突變。在該方法中，使用牙簽從菌落中選取酵母細(xì)胞，重新懸浮于20μl的PCR混合液(PCRmix)中。在第一個(gè)PCR步驟(94℃，5分鐘)中將細(xì)胞裂解，從中釋放的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。在PCR檢測(cè)程序中使用五個(gè)引物引物5′EF-2和3′EF-2C在前面的第4部分中已經(jīng)敘述；EF-2(1318)具有從位置1318至1341的EF-2序列；引物wEF-2與位置2100至2119互補(bǔ)，而引物mEF-2具有相同位置的互補(bǔ)序列，但對(duì)該突變有特異性。如圖1b所示設(shè)計(jì)的核苷酸突變可產(chǎn)生新的SacII限制酶位點(diǎn)，可用于確定基因組中含有正確的突變。首先使用引物5′EF-2和mEF-2檢測(cè)Ura+轉(zhuǎn)化體中的突變。圖6a顯示，所選的12個(gè)JC308Ura+克隆之中，有9個(gè)(克隆1、2、3、12、13、14、33、40和41)為mEF-2引物陽(yáng)性，它們具有預(yù)期大小(大約2.2kbp)的PCR產(chǎn)物，而克隆25、38和47為陰性。如圖6b所示，當(dāng)使用引物EF-2(1318)和wEF-2分析相同的克隆以確定是否存在野生型序列時(shí)，所有三個(gè)mEF-2-克隆均為wEF-2引物陽(yáng)性。產(chǎn)生了0.8kbp的PCR片段。所有的mEF-2+克隆，除克隆33和41也為wEF-2+外，其余均為wEF-2-。最后當(dāng)使用引物EF-2(1318)和3′EF-2C時(shí)，選擇的所有克隆均產(chǎn)生如預(yù)期的約1.2kbp大小的PCR產(chǎn)物(圖6c)。來(lái)自mEF-2+且wEF-2-克隆的PCR產(chǎn)物被SacII完全消化，而來(lái)自mEF-2.但wEF-2+的克隆25、38和47的PCR產(chǎn)物不能被該酶切割。同時(shí)為mEF-2+且wEF-2+的情況下，克隆33和41既生成可被SacII切割(clearable)的PCR產(chǎn)物，也生成不能被其切割的產(chǎn)物。為了研究為何克隆33和41既有突變型也有野生型EF-2，將這些克隆劃線接種于新的選擇板，使這些細(xì)胞生長(zhǎng)形成菌落。從每個(gè)克隆中選取十個(gè)完全分離的菌落，使用引物EF-2(1318)加引物3′EF-2C進(jìn)行PCR，并進(jìn)行SacII消化步驟。所有克隆均未得到與原來(lái)相同的混合PCR產(chǎn)物。來(lái)自克隆33的4個(gè)菌落、來(lái)自克隆41的7個(gè)菌落的PCR產(chǎn)物可被SacII完全消化，而來(lái)自克隆33和41的其他菌落完全不能被切割。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，克隆33和44最初每一個(gè)都是由兩個(gè)不同的細(xì)胞形成的，一個(gè)具有帶突變的完整EF-2，另一個(gè)具有完整野生型EF-2。然后重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)一些具有只能被SacII裂解的EF-2的克隆(克隆1、2、3、12、13、14和40)，證明它們只含有突變型完整EF-2。成功獲得JC308的EF-2突變體克隆之后，使用相同的選擇步驟識(shí)別JC303和JC307的EF-2突變體克隆。在選出來(lái)要進(jìn)行分析的Ura+陽(yáng)性克隆中，35％只包含突變型完整EF-2。如此高的完全突變頻率的原因可能是巴斯德畢赤酵母的每個(gè)單倍體基因組只有一個(gè)EF-2拷貝。如CHO細(xì)胞和釀酒酵母所表現(xiàn)的一樣，巴斯德畢赤酵母中Arg置換EF-2的Gly711在正常條件下不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)施例6在EF-2突變體中表達(dá)DTA鏈。為了驗(yàn)證所獲得的EF-2突變體是否對(duì)DT表達(dá)具有抗性，使用質(zhì)粒DNApPIC3-DtA轉(zhuǎn)化mutEF2JC307-8，即JC307的一個(gè)EF-2突變體克隆(克隆8)。構(gòu)建pPIC3-DtA的方法已有記載(Wooetal.，2002)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在5′端使用BamHI，在3′端使用NotI，通過(guò)PCR擴(kuò)增DTA鏈基因，將其插入巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3(Invitrogen)中，并使用這兩種酶消化。整合pPIC3-DtA能夠使其一經(jīng)甲醇誘導(dǎo)即可在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)DT。該質(zhì)粒DNA先前已經(jīng)用于轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS200菌株(Invitrogen)，所得的兩個(gè)克隆(C3和C4)已用于研究巴斯德畢赤酵母對(duì)DT的耐受性(Wooatal.，2002)。C3已被鑒定為不表達(dá)DTA的克隆，而C4為表達(dá)DTA的克隆。在使用pPIC3-DtA轉(zhuǎn)化之后，隨機(jī)挑選六種mutEF2JC307-8克隆，即mutEF2JC307-8-DtA(1)至(6)，用于分析其在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)DTA鏈的情況，以及甲醇誘導(dǎo)后的存活能力。來(lái)自單一菌落mutEF2JC307-8-DtA(1)至(6)、C3和C4的細(xì)胞，在2mlYPD(酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖)培養(yǎng)基中30℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后離心沉淀。來(lái)自各培養(yǎng)物的細(xì)胞重新懸浮于YP培養(yǎng)基，使密度達(dá)到OD600nm±0.5。通過(guò)加入甲醇至1％來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞懸液(2ml)，并在劇烈搖動(dòng)中30℃下培養(yǎng)。甲醇誘導(dǎo)24小時(shí)后，各培養(yǎng)物均取100μl，使其細(xì)胞沉淀，并用PBS緩沖液沖洗。然后，細(xì)胞重新懸浮于PBS中，并混以蛋白樣本緩沖液。最后，樣本經(jīng)過(guò)兩個(gè)煮沸和干冰冷卻循環(huán)，使用DT特異性抗體通過(guò)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析。mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)、C3和C4的培養(yǎng)物也用于生存力測(cè)試。這通過(guò)下述步驟進(jìn)行使用PBS緩沖液將各培養(yǎng)物稀釋104至107倍，將100μl的等分鋪于YPD板上，30℃下培育3天，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)于板上的菌落數(shù)。SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，除了mutEF2JC307-8-DtA(5)，所有的mutEF2JC307-8-DtA克隆均表達(dá)DTA鏈(圖7a)。mutEF2JC307-8-DtA(3)的表達(dá)水平粗略估計(jì)為20μg/ml細(xì)胞培養(yǎng)物。跟預(yù)期一樣，C3不表達(dá)DTA。盡管C4不表達(dá)DTA，蛋白質(zhì)譜帶卻隱約可見(jiàn)(圖7b)。甲醇誘導(dǎo)前，mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)、C3和C4每毫升細(xì)胞的菌落形成單位(CFU)數(shù)量幾乎相同。甲醇誘導(dǎo)24小時(shí)后，mutEF2JC307-8-DtA(3)和(5)以及C3的CFU數(shù)量都增長(zhǎng)了大約103倍，而C4的CFU數(shù)量下降了大約102(圖8)。該結(jié)果說(shuō)明，帶有突變型EF-2的細(xì)胞在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)DTA鏈不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害。實(shí)施例7搖瓶培養(yǎng)小規(guī)模表達(dá)首先使用mutEF2JC307-8表達(dá)二價(jià)免疫毒素。由于該EF-2突變體為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，使用含有二價(jià)免疫毒素——Wooetal.(2002)中記載的A-dmDT390-bisFv的修飾基因最終版本的質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化。二價(jià)指兩個(gè)重復(fù)的sFv抗體片段。用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體選擇以及蛋白表達(dá)和分析的方法均已有記載(Wooetal.，2002，其中教導(dǎo)的方法通過(guò)引用全部納入本說(shuō)明書(shū))。轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)選取12個(gè)菌落分析其蛋白表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析顯示，所選克隆全部表達(dá)二價(jià)免疫毒素，但是有些克隆，如克隆編號(hào)2[mutEF2JC307-8(2)]，其表達(dá)水平比其他略高。當(dāng)它們?cè)谙嗤瑮l件下培養(yǎng)和表達(dá)相同時(shí)間時(shí)，mutEF2JC307-8(2)表達(dá)二價(jià)免疫毒素的水平與pJHW#2相同，后者為已使用pPIC9K-A-dmDT390-bisFv轉(zhuǎn)化的GS115克隆(帶有野生型EF-2)。在搖瓶培養(yǎng)中，mutEF2JC307-8(2)和pJHW#2的表達(dá)水平約為5至10μg/ml培養(yǎng)上清液。mutEF2JC307-8(2)的表達(dá)水平并非相對(duì)較高的事實(shí)說(shuō)明，除了EF-2ADP核糖基化，還有其他因素限制二價(jià)免疫毒素的產(chǎn)生。再次嘗試在突變型巴斯德畢赤酵母中表達(dá)二價(jià)免疫毒素，將A-dmDT390-bisFv基因的兩個(gè)拷貝引入mutEF2JC303-5，即JC303的EF-2突變克隆(克隆5)，其為組氨酸和精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。為了構(gòu)建帶有ARG4選擇標(biāo)記的表達(dá)載體，將A-dmDT390-bisFv基因(見(jiàn)圖20)克隆進(jìn)入表達(dá)載體pBLARG-SX3中，該表達(dá)載體由Cregg教授提供，并記載于Geoffreyetal.(2001)。這通過(guò)以下步驟完成將A-dmDT390-bisFv基因最終版，加上經(jīng)由HindIII和NotI消化從pPICZα(Wooetal.，2002)釋放的α-因子信號(hào)序列，插入已經(jīng)使用這兩種限制酶切割的pBLARG-SX3中。產(chǎn)生的構(gòu)建體pBLARG-A-dmDT390-bisFv(圖9a)，與pPIC9K-A-dmDT390-bisFv一起經(jīng)電穿孔同時(shí)引入mutEF2JC303(5)中。在含有缺少精氨酸和組氨酸的合成完全培養(yǎng)基的平板上(K.DMedical，Maryland)，篩選表達(dá)這兩種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化體。從篩選板上挑選18個(gè)菌落，分析其免疫毒素蛋白的表達(dá)情況。SDS-PAGE電泳顯示，它們分泌進(jìn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的完整免疫毒素蛋白的量大致相等。這個(gè)量與單一拷貝克隆mutEF2JC307-8(2)和pJHW#2分泌的量接近。如圖10a所示，所選的三個(gè)克隆(克隆3、6、8)還表達(dá)一種更小的、但量非常多的可與抗DT抗體反應(yīng)的蛋白，它與單價(jià)免疫毒素的大小相同(Liuetal.，2000)。較小的蛋白比完整蛋白更加穩(wěn)定，而不管該蛋白是由A-dmDT390-bisFv基因的截短型拷貝產(chǎn)生，還是完整蛋白的蛋白酶解切割產(chǎn)物。該圖還顯示在培養(yǎng)上清液中有許多其他更小的蛋白可與抗DT抗體反應(yīng)。它們最有可能是完整蛋白的蛋白酶解切割產(chǎn)物。最小且量最多的一種被鑒定為DT的A鏈，它非常穩(wěn)定(Collier1975)，可看作完整蛋白的蛋白酶解降解的最終產(chǎn)物。該降解也發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)部(圖10b)。因?yàn)锳鏈只有完整蛋白的約1/4大小，蛋白質(zhì)印跡顯示的A鏈數(shù)量表明，其實(shí)際表達(dá)水平可能要高出存在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的完整蛋白水平的數(shù)倍。合成的多數(shù)蛋白可能在分泌進(jìn)入培養(yǎng)基之前或之后降解。盡管雙拷貝克隆與單拷貝克隆在培養(yǎng)基中積累等量的完整蛋白，但雙拷貝克隆產(chǎn)生更多的降解產(chǎn)物，說(shuō)明已經(jīng)合成更多的基因產(chǎn)物。已經(jīng)采用多種措施控制蛋白降解，但完整蛋白的產(chǎn)量并沒(méi)有提高。因此，細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的蛋白降解是提高二價(jià)免疫毒素產(chǎn)量的限制因素。實(shí)施例8使用PMSF發(fā)酵培養(yǎng)的另一種大規(guī)模表達(dá)方法為了進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，使用BioFlo4500發(fā)酵罐(NewBrunswickScientificCompany)，它安裝有甲醇傳感器(RavenBiotechnologyCompany)，以便精確控制培養(yǎng)物中的甲醇濃度。起始發(fā)酵培養(yǎng)基(10L)包含1％酵母提取物，2％蛋白胨或2％大豆胨，4％甘油，1％酪蛋白氨基酸，1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，0.43％PTM1鹽溶液，以及0.01％消泡劑289(SigmaCo.)或消泡劑204的混合物，0.01％以及Stuktol0.01％。根據(jù)培養(yǎng)條件，甲醇誘導(dǎo)前使用含1.8％PTM1鹽溶液的75％(v/v)甘油溶液以獲得所需細(xì)胞密度，和/或補(bǔ)充另外的碳源或能源以利于甲醇誘導(dǎo)。誘導(dǎo)采用含20mMPMSF和/或1.2％PTM1鹽溶液的100％甲醇溶液。或者，誘導(dǎo)通過(guò)持續(xù)添加含73mMPMSF的4∶1的甲醇/甘油進(jìn)行，并且誘導(dǎo)前加入PMSF至終濃度為1mM。為了制備發(fā)酵罐所用的種子培養(yǎng)物(seedculture)，使用1mlYYL#8-2的冷凍原液接種50mlYPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)，然后在劇烈搖動(dòng)中30℃下培養(yǎng)2天。50ml培養(yǎng)物中的30ml用作第一種子培養(yǎng)物，用以接種大約600ml第二種子培養(yǎng)物。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐中的DO水平維持在25％以上。發(fā)酵罐中的pH值在生長(zhǎng)階段控制在3.5，甲醇誘導(dǎo)階段控制在7.0。溫度在生長(zhǎng)階段設(shè)置為28℃，在甲醇誘導(dǎo)階段設(shè)置為15～25℃。在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，酪蛋白氨基酸溶液(20％)以20ml/h的流速持續(xù)添加，或者在甲醇誘導(dǎo)的前2個(gè)小時(shí)內(nèi)，以泵的最大流速添加。在甲醇誘導(dǎo)溫度為23℃時(shí)，二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平高于其他4批發(fā)酵。然而，其表達(dá)水平與當(dāng)前表達(dá)菌株pJHW#2相近。表1總結(jié)了5批發(fā)酵的結(jié)果。表1各批發(fā)酵結(jié)果1甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)，根據(jù)培養(yǎng)物中的甲醇濃度，添加50mlPMSF溶液(每50ml甲醇3.484g)。添加PMSF溶液結(jié)束后，每1升甲醇含12mlPTM1鹽溶液的甲醇溶液被替換。2甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)，注入15mlPMSF溶液(每15ml甲醇1.742g)。根據(jù)甲醇濃度添加甲醇溶液(20mMPMSF和12mlPTM1鹽溶液/升甲醇)。3甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)，以泵的最大流速添加10％酪蛋白氨基酸溶液。4以20ml/小時(shí)的泵流速持續(xù)添加20％酪蛋白氨基酸溶液。5以20ml/小時(shí)的泵流速持續(xù)添加15％酪蛋白氨基酸溶液。6未測(cè)量在這些條件下，在42小時(shí)的甲醇誘導(dǎo)中，二價(jià)免疫毒素的野生型表達(dá)菌株pJHW#2的最大產(chǎn)量為27.5mg/L，總產(chǎn)量為286.0mg。誘導(dǎo)時(shí)間在42小時(shí)以上，該水平也不會(huì)隨之提高。然而，在pJHW#2所采用的條件下，甲醇誘導(dǎo)后EF-2突變菌株YYL8-2的產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)達(dá)94小時(shí)，盡管最初的10L培養(yǎng)基被甲醇和10％酪蛋白氨基酸溶液逐漸稀釋成13.4L(見(jiàn)第5批)。第5批二價(jià)免疫毒素總量為435.5mg(32mg/L)。這要高出pJHW#2的最大產(chǎn)量的1.46倍。這兩個(gè)菌株二價(jià)免疫毒素產(chǎn)量的差異反映在如圖11所示的甲醇消耗率上。實(shí)施例9現(xiàn)有的二價(jià)免疫毒素的純化方法。巴斯德畢赤酵母上清液中含有與A-dmDT390-bisFv競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合陰離子交換樹(shù)脂的物質(zhì)。另外，若將毒素部分暴露于6.5以下的pH值環(huán)境，疏水殘基一定會(huì)展開(kāi)。因而采用使用Butyl-650M(TosoHaas)的疏水作用色譜步驟。該樹(shù)脂優(yōu)先結(jié)合單聚體A-dmDT390-bisFv而非二聚體形式，后者的生物活性大大降低。該捕捉步驟同時(shí)濃縮了巴斯德畢赤酵母糖蛋白，這些糖蛋白在SDS凝膠上顯示為～40kD的擴(kuò)散帶，但在分子排阻色譜條件下與A-dmDT390-bisFv具有相同的流動(dòng)性。該物質(zhì)可通過(guò)優(yōu)先結(jié)合ConA瓊脂糖(Pharmacia)而除去。Superdex(Pharmacia)分子排阻步驟可除去前面捕捉步驟中未濾掉的任何A-dmDT390-bisFv二聚體。當(dāng)發(fā)酵條件使得A-dmDT390-bisFv單體含量為85％時(shí)，總產(chǎn)率為45％。純化A-dmDT390-bisFv的過(guò)程如下所述1.Butyl-650M疏水作用色譜●柱床體積600ml(柱直徑10cm)●流速50～70cm/小時(shí)●樣本制備加入固體硫酸鈉和1M的Tris緩沖液(pH8.0)，至終濃度分別為0.5M和20mM?！駱颖倔w積通常10L●結(jié)合緩沖液500mMNa2SO4，1mMEDTA，20mMTris緩沖液(pH8.0)●洗脫緩沖液5％甘油，1mMEDTA，20mMTris緩沖液(pH8.0)●過(guò)程○使用結(jié)合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上○使用5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗滌○使用6倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫○根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使柱再生●洗脫組分體積3600ml2.滲濾●膜超過(guò)濾螺旋纏繞(Amiconspiral-wound)膜(30Kd)型號(hào)(model)S3Y30(0.23m2)●樣本從捕捉步驟中洗脫的組分●滲濾緩沖液5％甘油，1mMEDTA，20mMTris緩沖液(pH8.0)●用于滲濾的緩沖液體積6倍樣本體積●壓力7psi●終體積大約2L3.Poros50HQ離子交換色譜●柱床體積40ml(柱直徑2.6cm)●流速1ml/min●樣本經(jīng)滲濾的樣本(通常為2L)●結(jié)合緩沖液5％甘油，20mMTris緩沖液(pH8.0)●洗脫結(jié)合緩沖液中的0～500mMNaCl梯度(10倍的柱床體積)●過(guò)程○使用結(jié)合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上○使用3倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗滌，并開(kāi)始收集每個(gè)組分20ml○使用10倍柱床體積的0～500mMNaCl梯度洗脫○根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使柱再生●組分大小20ml4.ConA親和色譜●樣本來(lái)自PorosIEX的、含有A-dmDT390-bisFv的洗脫組分90～120ml●柱床體積裝于2.5cm×20cm柱中的60ml樹(shù)脂●結(jié)合緩沖液5％甘油，20mMTris緩沖液(pH8.0)●流速重力作用下●過(guò)程○使用結(jié)合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上，并開(kāi)始收集每個(gè)組分10ml○每個(gè)組分中加0.5MEDTA至終濃度為1mM○使用5倍柱床體積結(jié)合緩沖液洗柱○根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使柱再生5.Superdex200prep分級(jí)凝膠過(guò)濾●樣本來(lái)自ConA親和步驟的、含A-dmDT390-bisFv的50ml匯集的組分●樣本制備加入5MNaCl至終濃度為200mM●柱床體積970mlSuperdex200樹(shù)脂，裝于5cm×60cm柱中●緩沖液200mMNaCl，1mMEDTA，20mMTris-Cl(pH8.0)以及5％甘油●流速1ml/min●過(guò)程○使用結(jié)合緩沖液平衡柱○將樣本加于柱上，并開(kāi)始收集每個(gè)組分20ml○使用1倍柱床體積的緩沖液洗脫柱○根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使柱再生該方法從調(diào)節(jié)觀點(diǎn)來(lái)看很困難，因?yàn)镃onA有毒，可從柱基質(zhì)中浸出。與之相比，本發(fā)明方法(見(jiàn)實(shí)施例16和實(shí)施例38〔Gibson重新編號(hào)？〕)使用硼酸鹽除去糖蛋白。硼酸鹽與糖蛋白的vicyl羥基結(jié)合，使之帶有負(fù)電荷，因而使糖蛋白與陰離子交換柱緊密結(jié)合。然而，由于rIT沒(méi)有糖類基團(tuán)，可被硼酸鹽洗脫。實(shí)施例10構(gòu)建表達(dá)載體pPGAP-Arg和pPGAP-His。已經(jīng)鑒別出巴斯德畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子(PGAP)，并用于在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行異源蛋白的表達(dá)(Waterhametal.，1997)。PGAP是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。據(jù)報(bào)道，葡萄糖培養(yǎng)的巴斯德畢赤酵母在PGAP調(diào)控下的蛋白表達(dá)水平比通常的甲醇培養(yǎng)的細(xì)胞利用PAOX1調(diào)控下的要高(Waterhametal.，1997；Dringetal.，1998)。在異源蛋白表達(dá)中使用組成型啟動(dòng)子的缺點(diǎn)是它們不適于對(duì)表達(dá)宿主有毒的蛋白。既然巴斯德畢赤酵母EF-2突變體具有胞質(zhì)溶膠表達(dá)DTA的抗性，這些突變體應(yīng)該可以在其細(xì)胞中組成型表達(dá)基于DT或PE的免疫毒素。因而，使用PGAP在巴斯德畢赤酵母中驅(qū)動(dòng)A-dmDT390-bisFv的表達(dá)，以期PGAP可提高蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)使用PGAP替換pBLARG-A-dmDT390-bisFv中的AOX1啟動(dòng)子來(lái)制備pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv構(gòu)建體(圖9b)。首先，使用含PGAP5′和3′端序列的引物，通過(guò)PCR從表達(dá)載體pGAPZA(Invitrogen)中擴(kuò)增PGAP。5′和3′端引物分別加上NheI和HindIII。使用NheI和HindIII消化后，將PGAP的PCR產(chǎn)物插入pBLARG-A-dmDT390-bisFv中，該載體已經(jīng)使用這兩種限制酶切割除去了AOX1啟動(dòng)子。通過(guò)將來(lái)自質(zhì)粒pPIC9K(Invitrogen)和pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv的DNA片段連接，制備出構(gòu)建體pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv(圖9c)。質(zhì)粒pPIC9K通過(guò)NotI使用Klenow片段填充后，首先使用SfuI切割，然后使用瓊脂糖凝膠電泳分離這些DNA片段。分離出含卡那霉素抗性基因、HIS4基因和3′AOX1轉(zhuǎn)錄終止(TT)的5.1kbp的片段，并將其與質(zhì)粒DNApPGAPArg-A-dmDT390-bisFv連接，后者已經(jīng)使用Not1和ScaI消化除去了3′AOX1TT和ARG4基因。實(shí)施例11在PGAP的調(diào)控下表達(dá)二價(jià)免疫毒素。如同在AOX1啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)進(jìn)行的操作一樣，通過(guò)使用構(gòu)建體pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv轉(zhuǎn)化mutEF2JC307-8來(lái)獲得單拷貝克?。煌ㄟ^(guò)使用pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv和pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv轉(zhuǎn)化mutEF2JC303-5來(lái)獲得雙拷貝克隆。這次雙拷貝克隆通過(guò)兩步構(gòu)建。首先，在篩選和蛋白表達(dá)分析之后，使用pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv轉(zhuǎn)化mutEF2JC303-5。然后使用pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv轉(zhuǎn)化表達(dá)完整免疫毒素水平最高的克隆。小規(guī)模蛋白表達(dá)通過(guò)以下步驟進(jìn)行將單一菌落接種至2mlYPD，過(guò)夜生長(zhǎng)后，細(xì)胞接種于2ml表達(dá)培養(yǎng)基，并使其OD600nm＝0.5，然后在28℃下培育24小時(shí)，取培養(yǎng)上清液分析表達(dá)免疫毒素的情況。該表達(dá)培養(yǎng)基與在PAOX1調(diào)控下表達(dá)免疫毒素所用的BMMYC相似，只是它不含0.5％甲醇，而是含有2％葡萄糖。SDS-PAGE電泳分析表明，在2拷貝克隆培養(yǎng)上清液中，所積累的完整蛋白略高于1拷貝克隆。2拷貝克隆之一(Pgap2-9)始終可產(chǎn)生每ml培養(yǎng)基10至15μg的完整蛋白。對(duì)培養(yǎng)上清液和提取細(xì)胞沉淀(extractcellpellet)的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，與PAOX1調(diào)控下的表達(dá)一致。在搖瓶培養(yǎng)中，PGAP調(diào)控下的二價(jià)免疫毒素的產(chǎn)量略高于PAOX1調(diào)控下的產(chǎn)量。由于發(fā)酵可使細(xì)胞生長(zhǎng)至極高密度，所以當(dāng)使用發(fā)酵罐生產(chǎn)時(shí)，PGAP調(diào)控下的產(chǎn)量提高可能會(huì)更加顯著。PGAP調(diào)控表達(dá)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)化，時(shí)間縮短。它無(wú)需在表達(dá)培養(yǎng)基中添加和保持一定水平的甲醇。整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程大約40小時(shí)，而PAOX1調(diào)控下的表達(dá)需要72小時(shí)以上。實(shí)施例12酵母菌株和菌株保持為了優(yōu)化發(fā)酵條件，使用基因工程改造的巴斯德畢赤酵母菌株JW102(原名為pJHW#2)，它是為了生產(chǎn)二價(jià)免疫毒素而產(chǎn)生于宿主菌株GS115(Invitrogen，Carlsbad，CA)(Wooetal.，2002)。AOX1(醇氧化酶1)啟動(dòng)子在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中調(diào)控免疫毒素的表達(dá)。該基因產(chǎn)物由α-前原前導(dǎo)序列分泌。為了比較發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵參數(shù)，使用X-33和JW103(MutS)或mutEF2JC307-8(2)，以及其他地方。表2本研究中所用巴斯德畢赤酵母菌株*JW102和JW103分別重命名自pJHW#2和pJHW#3(Wooetal.，2002)可表達(dá)二價(jià)免疫毒素的菌株JW102遺傳上非常穩(wěn)定。在YPD板(1％酵母提取物，2％細(xì)菌用蛋白胨，2％葡萄糖和2％瓊脂)上傳代培養(yǎng)該菌株60代以上，該菌株仍然可以表達(dá)二價(jià)免疫毒素。將極早期分離的菌落分散于YPD液體培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％細(xì)菌用蛋白胨，2％葡萄糖)中，然后在-80℃下保存為冷凍原液。冷凍原液通過(guò)將培育2天的培養(yǎng)物與等體積的25％(v/v)甘油混合來(lái)制備，并將1ml這種混合物裝入2ml的冷凍瓶(Cryovial)中。實(shí)施例13發(fā)酵。使用帶有甲醇傳感器和控制器(RavenBiotechnologyCompany，Canada)的BioFlo4500發(fā)酵罐(NewBrunswickScientificCompany，Esison，NJ)，其中傳感器和控制器可在誘導(dǎo)過(guò)程中維持甲醇含量在0.15％(v/v)。該發(fā)酵罐連接有運(yùn)行基于AFS-BioCommandWindows的軟件(NewBrunswickScientificCompany)的計(jì)算機(jī)，它可使所有參數(shù)均由程序化過(guò)程控制?；A(chǔ)起始發(fā)酵培養(yǎng)基(10升)包括2％(20g/L)酵母提取物，2％(20g/L)大豆蛋白胨(Difco)，4％(40g/L)甘油，1.34％(13.4g/L)含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，0.43％(4.3ml/L)PTM1鹽溶液以及0.02％(v/v)消泡劑289(SigmaCo.)。PTM1鹽溶液(Invitrogen)包括24.0mM(6g/L)藍(lán)礬(CuSO4·5H2O)、0.534mM(80mg/L)碘化鈉(NaI)、17.8mM(338.6mg/L)硫酸錳(MnSO4·5H2O)、0.827mM(200mg/L)鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)、0.323mM(20mg/L)硼酸(H3BO3)、2.1mM(500mg/L)氯化鈷(CoCl2·6H2O)、過(guò)過(guò)濾器循環(huán)約10分鐘之后顯現(xiàn)為透明的，將樣品取出和檢查肥皂(參見(jiàn)表11)。將濾液收集入5-加侖容器并貯存用于進(jìn)一步的分析。表11用MAGNESOLR60處理大豆生物柴油黃油脂甲酯為確定適當(dāng)?shù)奶幚硭?，在?shí)驗(yàn)室采用2wt％(4g)MAGNESOLR60在160下處理200g生物柴油樣品。在處理之前和之后測(cè)試肥皂和閃點(diǎn)(參見(jiàn)下表12)。表12初始黃油脂生物柴油實(shí)驗(yàn)室測(cè)試將15加侖從黃油脂原料制備的甲酯(未水洗滌的)泵送入混合罐以由MAGNESOLR60處理。收集一加侖樣品。將剩余14加侖采用MAGNESOL在170下處理10分鐘并隨后開(kāi)始過(guò)濾和再循環(huán)約20分鐘(表13)。將生物柴油收集入5-加侖容器用于進(jìn)一步的分析。表13用MAGNESOLR60處理黃油脂生物柴油IV生物柴油樣品的分析測(cè)試將收集的生物柴油樣品標(biāo)記如下S1＝未洗滌、未處理的大豆生物柴油S2＝洗滌和干燥的大豆生物柴油S3＝1％MAGNESOLR60處理的大豆生物柴油Y1＝未洗滌、未處理的黃油脂生物柴油Y2＝洗滌和干燥的黃油脂生物柴油Y3＝2％MAGNESOLR60處理的黃油脂生物柴油實(shí)施例14測(cè)定濕細(xì)胞密度(％，w/v)以監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。將1ml培養(yǎng)物樣本放入配衡的(tared)1.5毫升微量離心管中，在20,800×g、25℃下離心30分鐘。使用吸量管除去上清液，使用濾紙吸干管內(nèi)殘留液體。稱量含細(xì)胞沉淀物的管，計(jì)算濕細(xì)胞密度(％，w/v)。實(shí)施例15純化。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可調(diào)整規(guī)模的3步純化二價(jià)免疫毒素的方法，該方法利用硼酸鹽陰離子交換色譜除去宿主糖蛋白雜質(zhì)。純化過(guò)程使用1L離心上清液進(jìn)行。無(wú)需采用滲析或滲濾步驟。簡(jiǎn)單地說(shuō)，1L上清液與28.4g固體Na2SO4混合，加于100mlbutyl-650M的柱床上，在使用200mlNa2SO4洗滌之后，使用5％甘油、20mMtris和1mMEDTA，pH8.0洗脫。600ml洗脫劑使用4.2LTE緩沖液(20mMtris，1mMEDTA，pH8.0)稀釋，并加于40mlPoros50HQ的柱床上。二價(jià)免疫毒素在25～100mM的硼酸鈉緩沖液步驟中洗脫，然后糖蛋白和一些高度聚集的免疫毒素使用1MNaCl洗脫。1.2L硼酸鹽洗脫劑使用3.6LTE緩沖液稀釋，并加于5ml預(yù)先裝好的Hi-trapQ柱床上。洗滌后，二價(jià)免疫毒素使用0～400mMNaCl梯度洗脫。Butyl-650M疏水作用色譜(HIC)將大約100mlButyl-650M樹(shù)脂(TosohBiosepLLC)裝于5cm×20cm的XK柱(AmershamPharmaciaBiotech)中，該柱使用含200mMNa2SO4、1mMEDTA、20mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)的緩沖液A平衡。將固體硫酸鈉和1MTris-Cl緩沖液(pH8.0)加入1升上清液中，至終濃度分別為200mM和20mM。在裝載樣本前，將樣本使用802槽狀濾紙(＞15um粒子駐留WhatmanInc.；Clifton，NJ，USA)過(guò)濾。流速為44cm/小時(shí)(14.4ml/min)。平衡柱之后，將1L制備的樣本加于柱上，然后使用6倍柱體積的結(jié)合緩沖液A洗滌。與Butyl-650M樹(shù)脂相結(jié)合的蛋白使用6倍柱體積的含5％甘油、1mMEDTA、20mMTris-Cl緩沖液(pH8.0)的緩沖液B洗脫。將洗脫的含有免疫毒素的組分匯集以備下一步使用(體積～600ml)。每輪操作之后，根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使柱再生。除了第一步在室溫下進(jìn)行外，所有步驟均在冷室中進(jìn)行。Poros50HQ陰離子交換色譜(AEX)，使用硼酸鈉緩沖液逐步洗脫大約40mlPoros50HQ樹(shù)脂(PerSeptiveBiosystems)裝于2.6cm×20cm的XK柱(AmershamPharmaciaBiotech)中，然后將柱使用緩沖液B平衡。前面步驟中匯集的樣本使用4.2LTE緩沖液(20mMtris-Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗脫。洗脫的樣本以80.2cm/小時(shí)(7.08ml/min)的流速加于柱上，該柱然后使用6倍柱體積的緩沖液B洗滌。結(jié)合的蛋白使用溶于緩沖液B中的硼酸鈉25mM、50mM、75mM和100mM幾步洗脫(每步中使用10倍柱體積)。將這些洗脫的組分匯集以備下一步使用。與樹(shù)脂相結(jié)合的殘余蛋白使用6倍柱體積的溶于緩沖液B中的1MNaCl溶液除去。每輪操作之后，柱使用0.5MNaOH溶液洗滌，然后使用不含5％甘油的緩沖液B重新平衡以備下次使用。Hi-trapQ陰離子交換色譜從AmershamPharmaciaBiotech購(gòu)得預(yù)先填充的Hi-trapQ陰離子交換柱(5ml)。上一步中匯集的樣本使用3.6LTE緩沖液稀釋。樣本以221.5cm/小時(shí)(7.08ml/min)的流速加于用緩沖液B平衡過(guò)的柱上。該柱使用5倍柱體積的緩沖液B洗滌。結(jié)合的免疫毒素使用溶于緩沖液B的0～400mMNaCl線性梯度洗脫(20倍柱體積)。洗滌和洗脫步驟中的流速為2ml/min，組分大小為5ml。實(shí)施例16測(cè)定上清液中的蛋白酶活性。將無(wú)切口的(unnicked)CRM9(白喉毒素(7)的識(shí)別結(jié)構(gòu)域中有單點(diǎn)突變)用作測(cè)量絲氨酸蛋白酶活性的底物，其在上清液中的終濃度為225μg/ml。上清液在28℃、250rpm(軌道直徑1.9cm)的搖動(dòng)下培育20h，然后在還原劑(100mM二硫蘇糖醇)的存在下加于4-20％tris-甘氨酸預(yù)制的SDS-PAGE凝膠中。CRM9包含完全暴露的furin/Kex-2切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于由二硫鍵連接的A片段(22kDa)和B片段(40kDa)之間。培養(yǎng)基中的蛋白酶活性通過(guò)在還原條件下無(wú)切口的CRM9的減少來(lái)測(cè)定，無(wú)切口的CRM9的譜帶強(qiáng)度通過(guò)在考馬斯染色的凝膠上進(jìn)行密度測(cè)定(densitometry)來(lái)定量測(cè)定。實(shí)施例17SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析。培養(yǎng)上清液中的蛋白在非還原性和/或還原性條件下，使用tris-甘氨酸4～20％預(yù)制凝膠(Invitrogen)進(jìn)行SDS-PAGE電泳。為進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，將分離的蛋白通過(guò)電印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。使用溶于TBST緩沖液(50mMTris-HCl、pH7.5、150mMNaCl和0.1％TWEEN20)的5％脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合。針對(duì)白喉毒素的羊多克隆抗體(Thompsonetal.，1995)以1∶2000稀釋后用作一次抗體，堿性磷酸酶綴合的兔抗羊IgG(RocheMolecularBiochemicals)以1∶5000稀釋后用作二次抗體。使用一步NBT/BCIP底物(PierceChemicalCompany)使免疫毒素完全可見(jiàn)?；蛘撸捎诙r(jià)免疫毒素包含三個(gè)(G4S)3接頭，將針對(duì)(G4S)3接頭的兔多克隆抗體用作一次抗體，檢測(cè)完整免疫毒素及降解產(chǎn)物。該抗體針對(duì)氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO17)的合成肽制備。實(shí)施例18細(xì)胞毒性測(cè)試。按所述方法(Nevilleetal.，1992)對(duì)巴斯德畢赤酵母表達(dá)的抗人抗CD3免疫毒素進(jìn)行特異性細(xì)胞毒性測(cè)量實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將免疫毒素加于位于96孔板上不含亮氨酸的RPMI1640培養(yǎng)基中的Jurkat細(xì)胞中，即人CD3∈+T細(xì)胞白血病株(5×104細(xì)胞/孔)。20小時(shí)后，供給1小時(shí)脈沖(pulse)[3H]亮氨酸。然后使用細(xì)胞采集器將細(xì)胞收集到過(guò)濾器上。加入閃爍體后，在Beckman閃爍計(jì)數(shù)器中使用標(biāo)準(zhǔn)的液體閃爍計(jì)數(shù)技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)施例19測(cè)定細(xì)胞存活力。為了測(cè)定采自發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)物的細(xì)胞存活力，對(duì)Ormerod的方法進(jìn)行修改(Ormerod，2000)。使用醋酸熒光素(FDA)和碘化丙啶(PI)作為細(xì)胞存活力的活體染料。巴斯德畢赤酵母吸收的FDA被細(xì)胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化成熒光素。如果細(xì)胞具有完整的質(zhì)膜，就會(huì)保留熒光素而將PI排斥在外。簡(jiǎn)單地說(shuō)，溶于PBS緩沖液的106細(xì)胞/ml的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞懸液500μl，與50μlFDA溶液(10μg/ml)和50μlPI溶液(100μg/ml)混合。室溫下培育10分鐘，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析樣本的存活力。活細(xì)胞的門(mén)電極(gate)包括綠色熒光而沒(méi)有紅色熒光。實(shí)施例20二價(jià)免疫毒素濃度的定量測(cè)定。從AmershamPharmaciaBiotech購(gòu)得Superdex20010/300GL預(yù)填充柱(尺寸1.0cm×30cm)。將該柱連接HPLC系統(tǒng)(GBCScientificEquipement；ArlingtonHeights，IL，USA)。凝膠過(guò)濾緩沖液由90mM硫酸鈉(Na2SO4)、10mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)和1mMEDTA(pH8.0)組成。流速為0.5ml/min，注入體積為500μl。已知濃度的純化免疫毒素基于UV吸光度(25)用作標(biāo)準(zhǔn)樣本。對(duì)上清液或液體樣本中的二價(jià)免疫毒素的定量測(cè)定，通過(guò)將考馬斯染色的4-20％預(yù)制SDS凝膠的強(qiáng)度與已知濃度的免疫毒素標(biāo)準(zhǔn)樣本的強(qiáng)度比較而確定。實(shí)施例21通過(guò)AOX1活性降低來(lái)證實(shí)巴斯德畢赤酵母表達(dá)過(guò)程中的免疫毒素毒性。二價(jià)免疫毒素在巴斯德畢赤酵母中通過(guò)分泌途徑表達(dá)。巴斯德畢赤酵母中這種分泌二價(jià)免疫毒素可顯著減弱免疫毒素的毒性(Wooetal.，2002)，但是在發(fā)酵培養(yǎng)的甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，二價(jià)免疫毒素的表達(dá)降低了甲醇利用的代謝能力，并導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩。在巴斯德畢赤酵母的甲醇代謝中，醇氧化酶(AOX1)催化的甲醇氧化是限速反應(yīng)步驟(Veenhuisetal.，1983)，AOX1基因產(chǎn)物的量決定了甲醇代謝的速率。AOX1可占到利用甲醇的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中蛋白總量的30％。因而，甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇消耗速率的量值反映出AOX1水平，并可顯示出二價(jià)免疫毒素的表達(dá)如何影響巴斯德畢赤酵母中AOX1的蛋白合成和降解。為此，比較野生型宿主菌株X-33和JW102菌株在發(fā)酵罐培養(yǎng)中的甲醇消耗速率曲線，其中JW102菌株通過(guò)分泌途徑表達(dá)二價(jià)免疫毒素。在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中使用酪蛋白氨基酸添加物的發(fā)酵條件下，X-33在25℃下甲醇消耗的最大值為1.95ml/min，并在整個(gè)甲醇誘導(dǎo)階段，消耗速率一直保持在最大速率的70％以上(圖11)。對(duì)于免疫毒素表達(dá)菌株JW102(Mut+)，在23℃時(shí)的甲醇最大消耗速率大約為1.10ml/min。甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始后7～8小時(shí)達(dá)到峰值，隨后消耗速率逐漸降到最大速率的20％。甲醇誘導(dǎo)的前18小時(shí)內(nèi)，甲醇消耗速率降至甲醇最大消耗速率的50％以下(圖11)。這種低水平的甲醇消耗是與低水平的濕細(xì)胞密度增長(zhǎng)(44小時(shí)時(shí)，JW102為2％，X-33為10.5％)相關(guān)聯(lián)的(圖14)。實(shí)施例22在甲醇誘導(dǎo)階段使用PMSF和酪蛋白氨基酸或酵母提取物發(fā)酵優(yōu)化的第一步中，在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中補(bǔ)充PMSF和酪蛋白氨基酸對(duì)于提高發(fā)酵罐中的表達(dá)水平極為重要。甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中如果缺少這兩種組分，二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平在甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始后7小時(shí)達(dá)到最大值，然后開(kāi)始下降。然而，如果在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中補(bǔ)充這兩種組分，可將最佳誘導(dǎo)時(shí)間從甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始后的7～8小時(shí)延長(zhǎng)至24～48小時(shí)。另外，表達(dá)水平提高至2倍。為了避免使用動(dòng)物來(lái)源的材料，使用酵母提取物代替酪蛋白氨基酸。這種替換導(dǎo)致表達(dá)水平和濕細(xì)胞密度分別有30％和45％的較大增長(zhǎng)。在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，通過(guò)持續(xù)添加酵母提取物，所得JW102的濕細(xì)胞密度與X-33接近(圖14)。這些提高是由于甲醇消耗速率穩(wěn)定保持在最大速率的80％以上(圖11)。本文所公開(kāi)的最終表達(dá)方法的一個(gè)實(shí)例(見(jiàn)實(shí)施例41)，使用毒素抗性EF-2突變體，誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇添加量限制為0.5至0.75ml/min(每10L初始培養(yǎng)基)而不另加碳源，誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至163h，溫度15℃，持續(xù)注入酵母提取物，攪拌速度限制為400RPM，添加消泡劑至0.07％，以及DO水平降至40％以下時(shí)補(bǔ)充氧氣。在此條件下無(wú)需PMSF和酪蛋白氨基酸。酪蛋白氨基酸為動(dòng)物產(chǎn)物，會(huì)影響FDA的效果。PMSF是有助于防止產(chǎn)物降解的蛋白酶抑制劑，它有毒，需要提供另外的證明文件以證明它不存在于最終產(chǎn)品中，因而這些變換有助于獲得管理部門(mén)的批準(zhǔn)。使用該方法的產(chǎn)量是120mg/L(見(jiàn)實(shí)施例41)。實(shí)施例23在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中使用甲醇/甘油混合添加物。二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平與甲醇誘導(dǎo)前44小時(shí)內(nèi)獲得的濕細(xì)胞密度呈正相關(guān)。在低產(chǎn)量培養(yǎng)物中，所獲得的濕細(xì)胞密度小于6.0％。然而，在二價(jià)免疫毒素的產(chǎn)量高于25mg/L的發(fā)酵批次中，在甲醇誘導(dǎo)前44小時(shí)內(nèi)所獲得的濕細(xì)胞密度(％)平均為9.26％(圖14)。如果不持續(xù)添加甘油作為另外的碳源，則在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中很難獲得較高的濕細(xì)胞密度。因而在甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，使用甲醇/甘油(4∶1)混合添加物支持細(xì)胞生長(zhǎng)。野生型菌株X-33不產(chǎn)生免疫毒素(圖21A)，用作監(jiān)控甲醇消耗和細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)照。該菌株在25℃時(shí)具有1.95ml/min的最大甲醇消耗量。在整個(gè)甲醇誘導(dǎo)階段，消耗速率保持在最大速率的＞70％(圖21A)。在44h的甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，濕細(xì)胞密度持續(xù)增長(zhǎng)。DT抗性、產(chǎn)生免疫毒素的EF-2突變型菌株mutEF2JC307-8(2)用作另一個(gè)對(duì)照，以比較分泌免疫毒素時(shí)的甲醇消耗和細(xì)胞生長(zhǎng)。在誘導(dǎo)過(guò)程中，該EF-2突變型菌株具有與野生型菌株X-33相似的甲醇消耗和濕細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖21A)。在44h的甲醇誘導(dǎo)過(guò)程中，甲醇最大消耗速率和濕細(xì)胞收獲物分別為2.2ml/min和9.17％。然而，在JW102菌株可產(chǎn)生免疫毒素的發(fā)酵條件下，使用EF-2突變體不會(huì)提高免疫毒素的分泌量。對(duì)于菌株JW102來(lái)說(shuō)，25℃時(shí)的甲醇最大消耗速率為1.30ml/min。甲醇誘導(dǎo)開(kāi)始后7～8小時(shí)達(dá)到高峰，此后在甲醇誘導(dǎo)44h時(shí)消耗速率降到最大速率的15％。在甲醇誘導(dǎo)的前22h內(nèi)，甲醇消耗速率降至甲醇最大消耗速率的＜50％(圖21B)。這種低水平的甲醇消耗量導(dǎo)致JW012的濕細(xì)胞密度(2.0％)比X-33(10.5％)增長(zhǎng)緩慢(圖21A和21B)。在甲醇誘導(dǎo)的前22h后濕細(xì)胞密度增長(zhǎng)很少或沒(méi)有增長(zhǎng)，免疫毒素的分泌水平從15mg/L降至10mg/L。免疫毒素分解產(chǎn)物在用于監(jiān)測(cè)產(chǎn)物穩(wěn)定性的SDS凝膠上檢測(cè)不到。實(shí)施例24添加酵母提取物，甲醇消耗和免疫毒素生產(chǎn)。與免疫毒素的產(chǎn)生相關(guān)的甲醇消耗量減少和細(xì)胞生長(zhǎng)速率變慢，可能是由于免疫毒素對(duì)巴斯德畢赤酵母的毒性作用。如果持續(xù)添加酵母提取物至生物反應(yīng)器中，并且使用甲醇作為唯一碳源(圖21C)，則甲醇消耗峰值低于野生型菌株和EF-2突變型菌株(圖21A)，但在10h后停止下降，細(xì)胞生長(zhǎng)在整個(gè)誘導(dǎo)階段保持增長(zhǎng)。這種增長(zhǎng)反應(yīng)與8h后培養(yǎng)基中缺少免疫毒素相耦合，顯示了蛋白酶活性。誘導(dǎo)后4h即存在免疫毒素片段，一直到誘導(dǎo)后19h均檢測(cè)不到完整免疫毒素(圖22A)。如果從不同時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)基，并與純化的免疫毒素一起培育，那么形成的免疫毒素片段的量要取決于培養(yǎng)基的時(shí)間長(zhǎng)短(圖22B)。例如，在誘導(dǎo)后49h，與較早時(shí)間點(diǎn)的樣本相比，完整免疫毒素譜帶大大減小，代表降解片段的36.5kDa的譜帶顯著增加。通過(guò)添加酵母提取物所改善的甲醇利用量的減少(圖21C)，其效果顯然次于隨著EF-2的ADP核糖基化由免疫毒素導(dǎo)致的蛋白合成抑制。這可由以下事實(shí)說(shuō)明可產(chǎn)生免疫毒素且其EF-2基因(13)被改造成毒素抗性的巴斯德畢赤酵母菌株，與野生型菌株消耗甲醇的速率相等(圖21和圖21圖例)。在毒素敏感型菌株中，如果免疫毒素能夠進(jìn)入EF-2所在的胞質(zhì)溶膠區(qū)室，就會(huì)發(fā)生蛋白合成抑制。兩種不同的機(jī)制可產(chǎn)生這種效果。一種機(jī)制是翻譯后易位，這種情況下，整個(gè)免疫毒素在翻譯后進(jìn)入Sec61易位子(16)。這將為EF-2的ADP核糖基化提供短暫的時(shí)機(jī)。當(dāng)信號(hào)肽為α-交配因子時(shí)，通常會(huì)發(fā)生翻譯后易位，這里正是這種情況(24)。另一機(jī)制為資料較多的質(zhì)子介導(dǎo)的催化結(jié)構(gòu)域跨內(nèi)膜區(qū)室(2)易位。這在輕度酸性的高爾基區(qū)室或較強(qiáng)酸性的液泡中均可發(fā)生。無(wú)論哪種免疫毒素易位機(jī)制占主導(dǎo)，酵母提取物添加物要么干擾此步驟，要么干擾隨后的EF-2ADP核糖基化，后者直接進(jìn)行或者通過(guò)減弱易位的毒素A鏈的催化活性進(jìn)行。實(shí)施例25向帶有酵母提取物添加物的甲醇添加物中加入甘油。當(dāng)甲醇為唯一碳源時(shí)所觀察到的蛋白酶活性可能是從死亡或受傷細(xì)胞中泄漏所致。當(dāng)使用4∶1甲醇∶甘油添加物(圖21D)代替純甲醇(圖21C)時(shí)，培養(yǎng)基中的免疫毒素水平在44h時(shí)上升至20mg/L。此時(shí)在SDS凝膠中只檢測(cè)到微量的培養(yǎng)基中的蛋白的降解產(chǎn)物(圖23，最右側(cè)一組)。沒(méi)有酵母提取物的甲醇-甘油混合添加物不能維持甲醇消耗或細(xì)胞質(zhì)量的持續(xù)增長(zhǎng)，最終免疫毒素產(chǎn)量達(dá)15mg/L(圖21E)。盡管持續(xù)添加酵母提取物可較好地改善甲醇代謝降低的情況，但免疫毒素產(chǎn)量較低，出現(xiàn)較多的蛋白酶解(圖21C和22)。這種較多的蛋白酶解可通過(guò)補(bǔ)充4∶1甲醇∶甘油混合添加物形式的碳來(lái)逆轉(zhuǎn)(圖21D和圖23，23℃組)，這樣可提高免疫毒素產(chǎn)量至20mg/L。據(jù)報(bào)道，在巴斯德畢赤酵母甲醇投料培養(yǎng)過(guò)程中，有最理想的最大特定生長(zhǎng)速率，當(dāng)超過(guò)此速率時(shí)反而會(huì)抑制異源蛋白的產(chǎn)生(27)。以最適速率添加甲醇，并且以最大甘油生長(zhǎng)速率的20％的速率添加甘油，可使異源蛋白的產(chǎn)量提高50％(27)。這種增長(zhǎng)可能由甲醛和H2O2的代謝增加，以及過(guò)氧化氫酶和AOX的活性提高所致。在分泌型蛋白的情況下，這些代謝變化還可減少分泌的蛋白酶的量，以及減少泄漏蛋白酶解酶的死亡或受傷細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)施例26低溫與二價(jià)免疫毒素的分泌。通過(guò)增強(qiáng)在ER中的蛋白折疊和/或通過(guò)減弱培養(yǎng)基蛋白酶活性，低溫可提高巴斯德畢赤酵母中異源蛋白表達(dá)的產(chǎn)量(9)。在15℃下44h時(shí)，甲醛消耗減少25％，然而細(xì)胞生長(zhǎng)保持不變(圖15C)。免疫毒素產(chǎn)量在44h時(shí)提高50％(30±0mg/L，n＝3)在67h時(shí)提高幾乎100％(37±2.9mg/L，n＝3)。免疫毒素分泌量提高多數(shù)發(fā)生于20～15℃之間。在17.5℃觀察到最高表達(dá)水平(圖15A)，但經(jīng)過(guò)免疫毒素的3步純化步驟所獲得的最終產(chǎn)量在15℃時(shí)最高(圖15B)，在44和67h時(shí)分別為平均13.8±1mg/L(n＝3)和16.0±1mg/L(n＝3)。在15℃時(shí)產(chǎn)生的純化免疫毒素具有完全功能，這通過(guò)在蛋白合成分析中測(cè)定特異性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性來(lái)確定，該實(shí)驗(yàn)中三個(gè)單獨(dú)的生產(chǎn)批次的IC50值為1.2(±0.1)×10-13M，與之相比，搖瓶培養(yǎng)的三個(gè)批次平均為2×10-13M。從生物反應(yīng)器上清液(全部持續(xù)加入10mMPMSF添加物)中在SDS凝膠上觀察到的降解的免疫毒素譜帶的量，從23℃時(shí)的中等水平減少到15℃時(shí)的不可檢測(cè)水平(圖23)。采用突變型白喉毒素(CRM9)底物對(duì)絲氨酸Kex-2樣蛋白酶進(jìn)行敏感性測(cè)試，蛋白酶活性在15℃下67h時(shí)不可檢測(cè)，但是當(dāng)不加入PMSF時(shí)在67h時(shí)可檢測(cè)到活性(圖24)。在15℃下不論是否加入PMSF，凝膠譜帶和免疫毒素產(chǎn)量均相同。來(lái)自甲醇-甘油混合添加物加上酵母提取物培養(yǎng)基的15℃生物反應(yīng)器樣本使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞存活力，具有低水平的死亡細(xì)胞甘油投料階段0.7±0.22％(置信限99％)；甘油-甲醇混合添加物，在22h時(shí)為1.2±0.58％(置信限99％)，在44h時(shí)為1.7±0.61％(置信限99％)，在67h時(shí)為1.1±0.51％(置信限99％)(死亡細(xì)胞比例從一個(gè)發(fā)酵批次中測(cè)定)。在甲醇誘導(dǎo)的所有時(shí)間點(diǎn)，顯示細(xì)胞內(nèi)酯酶活性的活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的96％以上。使誘導(dǎo)溫度從23～25℃降低到15℃，可將免疫毒素水平進(jìn)一步提高到44h時(shí)的30mg/L和67h時(shí)的37mg/L(圖21F)。低誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)過(guò)程中低且恒定的死亡細(xì)胞水平(＜2.0％)相聯(lián)系，并且減弱了蛋白酶對(duì)生物反應(yīng)器內(nèi)免疫毒素的活性，盡管通過(guò)靈敏的實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到少量蛋白酶活性(圖23和24)。這些結(jié)果與利用限制溫度(12℃)投料技術(shù)的研究相一致(9)。在限制溫度投料技術(shù)中，與30℃下限制甲醇投料工藝相比，44h時(shí)死亡細(xì)胞從9％減少到＜1％。死亡細(xì)胞的減少與降解產(chǎn)物(脂肪酶)的顯著減少和最后時(shí)間點(diǎn)完整產(chǎn)物的2倍增加相聯(lián)系。這些變化有助于避免在高細(xì)胞密度下缺乏氧氣。在限制溫度投料技術(shù)中，在67h時(shí)AOX活性提高2倍以上。低誘導(dǎo)溫度下，通過(guò)減慢總蛋白合成速率，平衡通過(guò)分泌途徑的免疫毒素輸入和輸出，還可導(dǎo)致免疫毒素分泌增加。在異源蛋白的表達(dá)和分泌中，每種蛋白似乎都有最佳分泌水平。超過(guò)最佳水平的表達(dá)(過(guò)表達(dá))可減少分泌蛋白的產(chǎn)量(1，11，13，15)。二價(jià)免疫毒素因?yàn)槠涠嘟Y(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，還需要更長(zhǎng)的正確折疊處理時(shí)間，它在大腸桿菌中表達(dá)后經(jīng)過(guò)體外重新折疊具有低活性(25)。在從23℃變?yōu)?5℃時(shí)，甲醇消耗速率只減少了25％，在44h時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速率保持不變。實(shí)施例27巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)二價(jià)免疫毒素的天然培養(yǎng)基。為了在發(fā)酵罐中獲得合理范圍的二價(jià)免疫毒素表達(dá)水平，需要在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中使用天然培養(yǎng)基。在初始發(fā)酵批次中，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)合成培養(yǎng)基時(shí)，觀察到發(fā)酵罐中二價(jià)免疫毒素的產(chǎn)量極低。因此開(kāi)發(fā)了基于大豆蛋白胨和酵母提取物的培養(yǎng)基，包括4％甘油，2％酵母提取物，2％大豆蛋白胨，1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，0.43％PTM1溶液，以及0.01％消泡劑289。實(shí)施例28Mut+與MutS表型測(cè)試來(lái)自于巴斯德畢赤酵母GS115(Mut+)和KM71(MutS)的不同Mut(甲醇利用)表型菌株，比較它們?cè)诎l(fā)酵罐中的二價(jià)免疫毒素表達(dá)水平。在發(fā)酵罐中，MutS表型菌株具有優(yōu)勢(shì)，如易于控制誘導(dǎo)溫度，無(wú)需供給純氧，以及對(duì)高濃度甲醇的抗性。盡管這兩種不同表型菌株在試管培養(yǎng)時(shí)表達(dá)水平?jīng)]有差異，但在發(fā)酵罐中Mut+菌株的表達(dá)水平要高出MutS菌株的5～7倍。實(shí)施例29pH變換工藝減少了上清液中的污染蛋白。搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)在表達(dá)二價(jià)免疫毒素方面有較大差別。在搖瓶培養(yǎng)中，可使用新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，可除去在生長(zhǎng)階段細(xì)胞裂解產(chǎn)生的細(xì)胞膜片段、DNA和蛋白酶，以及巴斯德畢赤酵母分泌的蛋白。然而，這些分子在發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中不斷積累，在純化步驟中常會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。為了在發(fā)酵罐中減少此類問(wèn)題，采用pH變換工藝。巴斯德畢赤酵母可在pH3～7的范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)。在甘油分批階段和甘油補(bǔ)料分批階段，巴斯德畢赤酵母在低pH值(如pH3.5)下培養(yǎng)，并且在pH7.0下誘導(dǎo)以產(chǎn)生二價(jià)免疫毒素。pH變換工藝使上清液中充滿大量二價(jià)免疫毒素，因?yàn)樵诘蚿H值下巴斯德畢赤酵母分泌蛋白的量顯著減少，而二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平卻不受影響。實(shí)施例30使用葡萄糖嚴(yán)格控制AOX1啟動(dòng)子。一般來(lái)說(shuō)，為了在宿主細(xì)胞中獲得毒素蛋白，需要嚴(yán)格的基因控制。表達(dá)二價(jià)免疫毒素對(duì)巴斯德畢赤酵母產(chǎn)生毒害。由于在使用甘油作為碳源的情況下AOX1啟動(dòng)子不能嚴(yán)格控制基因表達(dá)，所以在甲醇誘導(dǎo)之前即可在考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠上觀察到二價(jià)免疫毒素。為進(jìn)行嚴(yán)格的基因控制，將甘油補(bǔ)料分批階段替換為葡萄糖補(bǔ)料分批階段，因?yàn)槠咸烟且种艫OX1驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)(Tschoppetal.，1987)。然而，在補(bǔ)料分批階段中使用葡萄糖替換甘油不會(huì)改變二價(jià)免疫毒素的最終表達(dá)水平。在補(bǔ)料分批階段使用甘油是因?yàn)槠咸烟窃诟邼舛认氯芙庖ㄙM(fèi)一定時(shí)間。當(dāng)與甘油補(bǔ)料分批階段結(jié)合時(shí)，pH變換工藝可阻止在甘油補(bǔ)料分批過(guò)程中在考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠上出現(xiàn)二價(jià)免疫毒素。實(shí)施例31表達(dá)二價(jià)免疫毒素的最適pH值為了測(cè)定表達(dá)二價(jià)免疫毒素的最適pH值，試管培養(yǎng)的表達(dá)菌株JW102在pH3.5到8.0的范圍內(nèi)誘導(dǎo)24小時(shí)，使用考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析比較上清液中的二價(jià)免疫毒素。使用檸檬酸鈉緩沖液(pH3.5～5.5)、bis-tris緩沖液(pH6.0～7.0)和tris緩沖液(pH7.5～8.0)維持培養(yǎng)物在設(shè)定pH值。同時(shí)，在甲醇誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)用前述方法(Wooetal.，2002)測(cè)定菌落形成單位。pH6.0以下時(shí)，使用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)不到二價(jià)免疫毒素。盡管在pH6到8范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)印跡顯示它們的表達(dá)水平相近，但使用考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠表明pH7.0是表達(dá)二價(jià)免疫毒素的最適pH水平。在pH3.5至7.0范圍內(nèi)，巴斯德畢赤酵母具有相似的菌落形成單位，但在pH7.4以上時(shí)菌落形成單位急劇下降。既然pH7.4是最適pH值范圍的上限，于是又在發(fā)酵罐中測(cè)定了pH6.7時(shí)的表達(dá)水平。然而，pH6.7和7.4時(shí)的表達(dá)水平?jīng)]有差異。實(shí)施例32最適發(fā)酵批次的再現(xiàn)性和細(xì)胞存活力。在最適發(fā)酵條件下，二價(jià)免疫毒素的表達(dá)水平在甲醇誘導(dǎo)67小時(shí)時(shí)增加到40mg/L(圖16)。甲醇誘導(dǎo)44小時(shí)和67小時(shí)時(shí)上清液中的二價(jià)免疫毒素表達(dá)水平，以及經(jīng)3步純化步驟獲得的最終產(chǎn)量均可再現(xiàn)。如表4所示，在最適條件下的3個(gè)獨(dú)立的發(fā)酵批次中，所獲二價(jià)免疫毒素水平極為相似。更重要的是，它們之間純化二價(jià)免疫毒素的最終產(chǎn)量極為接近，說(shuō)明產(chǎn)生的上清液中二價(jià)免疫毒素的品質(zhì)相似。在最適發(fā)酵條件下，在甲醇誘導(dǎo)階段的細(xì)胞存活力經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定保持在95％以上。表4最適發(fā)酵條件1和純化2的再現(xiàn)性<p>隨機(jī)挑出4個(gè)新的超級(jí)MAR并分析AT和TA二核苷酸含量，并且與前面已知的雞lysMAR進(jìn)行比較，考慮100個(gè)堿基對(duì)的窗口(表6)。令人驚奇的是，申請(qǐng)人已經(jīng)表明在100個(gè)DNA堿基對(duì)的窗口中所有的超級(jí)MAR都具有占分析的總二核苷酸超過(guò)12％的AT二核苷酸頻率和超過(guò)10％的TA二核苷酸。最有效的MAR顯示了數(shù)值約為34％的二核苷酸對(duì)。表6實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的MAR的％AT和TA二核苷酸頻率的匯總6.4人類和小鼠基因組直向同源(orthologous)基因間區(qū)域的分析為了得到對(duì)于S/MAR進(jìn)化的知識(shí)，已經(jīng)用SMARScan分析了人和小鼠基因組的直向同源基因間區(qū)域。所使用的數(shù)據(jù)組由87對(duì)來(lái)自人與小鼠基因組的全部直向同源基因間區(qū)域構(gòu)成(ShabalinaSA，OgurtsovAY，KondrashovVA，KondrashovAS，Selectiveconstraintinintergenicregionsofhumanandmousegenomes，TrendsGenet，17(7)3736，2001)(平均長(zhǎng)度為～12000bp)，其位于12個(gè)人染色體和12個(gè)小鼠染色體上，這些序列的同線性用配對(duì)的序列比對(duì)得到確認(rèn)，并且考慮到側(cè)翼基因(實(shí)驗(yàn)測(cè)試或預(yù)測(cè)的)的情況。按所述方法(Nevilleetal.，1992)進(jìn)行純化的抗人抗CD3免疫毒素的特異性細(xì)胞毒性測(cè)試。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將免疫毒素加于位于96孔板上不含亮氨酸的PRMI1640培養(yǎng)基中的Jurkat細(xì)胞中，即人CD3∈+T細(xì)胞白血病株(5×104細(xì)胞/孔)。20小時(shí)后，供給1小時(shí)脈沖[3H]亮氨酸。然后使用Skatron采集器將細(xì)胞收集到過(guò)濾器上。加入閃爍體后，在Beckman閃爍計(jì)數(shù)器中使用標(biāo)準(zhǔn)的LSC技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)施例35Butyl650M疏水作用色譜(Butyl650MHIC)。如圖17所示，對(duì)上清液中的免疫毒素來(lái)說(shuō)，Butyl650MHIC是有效的捕捉步驟。然而，在此步驟中糖蛋白與免疫毒素一起被純化。在這些糖蛋白之中，通過(guò)過(guò)碘酸-希夫氏(periodicacidSchiff)染色，大約45kDa的糖蛋白種類(圖17箭頭所示)影響了純免疫毒素的分離。通過(guò)諸如凝膠過(guò)濾和陰離子交換色譜等常規(guī)色譜法，這些糖蛋白無(wú)法與免疫毒素分離，說(shuō)明這些45kDa的糖蛋白種類以二聚體形式存在，并且具有相似的等電點(diǎn)。因此，這些45kDa的糖蛋白與免疫毒素在大小和等電點(diǎn)，以及疏水性方面非常相似。評(píng)估了各種遵循GMP(優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范)的疏水性樹(shù)脂。在這些樹(shù)脂之中，Butyl650M顯示出具有最好的免疫毒素結(jié)合和洗脫曲線。本發(fā)明中可使用其他疏水性樹(shù)脂。還發(fā)現(xiàn)200mM的硫酸鈉是將免疫毒素結(jié)合到butyl650M樹(shù)脂的適當(dāng)濃度。在發(fā)酵批次結(jié)束時(shí)，發(fā)酵罐培養(yǎng)物通常具有約30％的濕細(xì)胞密度。在大規(guī)模生產(chǎn)中，上清液通過(guò)需要對(duì)高細(xì)胞密度培養(yǎng)物進(jìn)行3倍稀釋的持續(xù)離心獲得。稀釋的樣本中的免疫毒素的處理過(guò)程與200mM硫酸鈉下有效結(jié)合至Butyl650M樹(shù)脂的上清液中的免疫毒素相同。實(shí)施例36使用硼酸鈉緩沖液分步洗脫的Poros50HQ陰離子交換色譜。通過(guò)采用硼酸鹽陰離子交換色譜，可成功地將免疫毒素與巴斯德畢赤酵母糖蛋白分離(圖18)。通過(guò)洗脫來(lái)自前一步驟中的樣本，可使免疫毒素結(jié)合至陰離子樹(shù)脂上，簡(jiǎn)化了純化過(guò)程。在使用50mM、75mM和100mM溶于緩沖液B的硼酸鈉洗脫的組分中(圖18中泳道9、10、11)，多數(shù)免疫毒素以單體形式存在。匯集這3個(gè)組分以備下一步使用。為了除去來(lái)自上一步的樣本中的糖蛋白種類，采用硼酸鈉陰離子交換色譜，這是因?yàn)榕鹚徕c通過(guò)結(jié)合至糖蛋白的糖殘基上而使糖蛋白的負(fù)電荷增加。免疫毒素在pH8.0下結(jié)合至陰離子交換樹(shù)脂上(Wooetal.，2002)。設(shè)計(jì)預(yù)備實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化硼酸鈉存在下的免疫毒素結(jié)合條件。使用緩沖液B進(jìn)行滲析的樣本等分與不同體積的200mM溶于緩沖液B的硼酸鈉混合，以獲得預(yù)定的硼酸鈉濃度。然后將制備的樣本加于Poros50HQ陰離子柱(40ml)上，該柱使用含有相應(yīng)濃度硼酸鈉的緩沖液B平衡。在100mM硼酸鈉濃度下，免疫毒素不與Poros50HQ陰離子樹(shù)脂結(jié)合，但是多數(shù)糖蛋白仍然結(jié)合。在50mM以下的硼酸鈉濃度下，免疫毒素與Poros50HQ陰離子樹(shù)脂結(jié)合。在將免疫毒素結(jié)合至陰離子交換柱之后，進(jìn)一步使用硼酸鈉分析分步洗脫條件。首先，將使用緩沖液B滲析的樣本結(jié)合至陰離子柱，然后在濃度逐漸增加的硼酸鈉(100、120、140、200mM)和1MNaCl的步驟中洗脫。結(jié)合的免疫毒素主要在100mM硼酸鈉下洗脫，但是這些洗脫的組分還包括很多在下一步中無(wú)法分離的45kDa糖蛋白。多數(shù)糖蛋白在1MNaCl下洗脫。如第一次實(shí)驗(yàn)所述裝入相同的樣本之后，結(jié)合的免疫毒素在50、75和100mM硼酸鈉和1MNaCl步驟中洗脫。多數(shù)結(jié)合的免疫毒素在75mM硼酸鈉下洗脫。然而，對(duì)應(yīng)于21kDa的蛋白條帶包含于使用50mM硼酸鈉洗脫的組分之中。結(jié)合于柱上之后，結(jié)合的免疫毒素在溶于緩沖液B的25、50、75和100mM硼酸鈉和1MNaCl步驟中洗脫(圖18)。通過(guò)使用25mM硼酸鈉緩沖液洗滌，減少了對(duì)應(yīng)于21kDa的蛋白條帶的量。實(shí)施例37與苯硼酸親和色譜對(duì)比。為了比較分離曲線，采用苯硼酸親和色譜法。來(lái)自butyl650MHIC捕捉步驟的洗脫劑使用低離子強(qiáng)度緩沖液(10mMHEPES，0.25mMEDTA和20mMMgCl2，pH8.2)滲析以備苯硼酸親和色譜使用。滲析的樣本加于5ml柱床體積的苯硼酸瓊脂糖柱(SigmaCo.)上，使用同一緩沖液洗滌，然后使用溶于相同緩沖液的0～100mM硼酸鈉梯度或0～50mM山梨糖醇梯度(20倍柱床體積)洗脫結(jié)合的蛋白。在低離子強(qiáng)度的結(jié)合條件下，糖蛋白和免疫毒素均可結(jié)合。糖蛋白和免疫毒素不能通過(guò)苯硼酸親和色譜分離。糖蛋白和免疫毒素被0～100mM硼酸鈉梯度或0～50mM山梨糖醇梯度共洗脫。實(shí)施例38Q陰離子交換色譜。使用Q陰離子交換色譜來(lái)濃縮從50HQ陰離子交換色譜獲得的洗脫樣本。在低于50mM的硼酸鈉濃度下，免疫毒素結(jié)合至陰離子交換樹(shù)脂上。因此，從前一步中匯集的樣本使用3倍樣本體積的TE緩沖液(20mMTris-Cl和1mMEDTA，pH8.0)稀釋，以使稀釋的樣本中的硼酸鈉在20mM以下。如預(yù)期效果一樣，免疫毒素有效結(jié)合至Q陰離子交換柱上。結(jié)合的免疫毒素使用0～400mMNaCl梯度(20倍柱體積)洗脫。匯集免疫毒素組分，然后通過(guò)SDS-PAGE電泳和蛋白合成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)最終制備物的產(chǎn)量、純度和毒性。實(shí)施例39純化過(guò)程的蛋白產(chǎn)量、重復(fù)性，純化免疫毒素的純度和功能。表4總結(jié)了從3批3步純化批次中獲得的免疫毒素產(chǎn)率，方法是從在較為相似的發(fā)酵條件下進(jìn)行的、具有相似免疫毒素表達(dá)水平的3個(gè)發(fā)酵批次中，在甲醇誘導(dǎo)44小時(shí)時(shí)取上清液。這批純化的平均產(chǎn)率為52.8％。通過(guò)使用3步純化步驟，從1升上清液中獲得大約16mg純化的物質(zhì)。根據(jù)發(fā)酵批次過(guò)程中誘導(dǎo)時(shí)間的不同，起始上清液中含有不同水平的免疫毒素聚集體和單體免疫毒素。在這些免疫毒素聚集體之中，有一部分在Butyl650MHIC步驟中逆轉(zhuǎn)化為單體形式的免疫毒素。通過(guò)凝膠過(guò)濾和隨后的SDS-PAGE電泳分析對(duì)上清液進(jìn)行分級(jí)表明，上清液中含有超過(guò)50％的免疫毒素聚集體。然而，經(jīng)3步純化步驟，免疫毒素的終產(chǎn)率為52.8％，表明在純化過(guò)程中一部分聚集體離解為單體免疫毒素。將純化過(guò)程應(yīng)用于上清液免疫毒素含量相近的3個(gè)獨(dú)立的發(fā)酵批次中，對(duì)其進(jìn)行比較后證實(shí)該過(guò)程的產(chǎn)率有很好的重復(fù)性(表5)。純化免疫毒素的純度通過(guò)分析凝膠過(guò)濾來(lái)評(píng)估。最終制備物中的<p>表1(單位百分?jǐn)?shù))在表1中可以看出，在吸附了PEI800的表面上檢測(cè)到了N，在吸附了DNA的表面上檢測(cè)到了P。此外，在ITO中含有的In和Sn的原子組成隨著循環(huán)數(shù)的增加而降低。這些結(jié)果表明PEI800和DNA存在于ITO電極的表面上，被吸附的層的厚度隨著循環(huán)數(shù)而增加。圖13顯示了對(duì)其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO電極的表面所記錄的ATR-IR光譜。1065和1230cm-1處的兩個(gè)吸收帶被確定為DNA骨架中的磷酸基團(tuán)。從圖13中可以看出，當(dāng)吸附循環(huán)數(shù)增加時(shí)，這些吸收增加。在圖14中，使用這兩個(gè)吸收帶的峰面積對(duì)吸附循環(huán)數(shù)進(jìn)行了作圖。峰面積隨著循環(huán)數(shù)的增加而線性增加。結(jié)果表明裝載于ITO表面上的DNA的量隨著吸附循環(huán)數(shù)的增加而增加。然后，測(cè)量了其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO表面的水接觸角度，以研究表面的潤(rùn)濕性的變化。結(jié)果顯示在圖15中。當(dāng)PEI800出現(xiàn)在最外表面時(shí)，水接觸角度大約為45度，而在最外層是DNA的情況下，水接觸角度大約是32度。從圖15中可以看出，接觸角度根據(jù)最外表面的類型而交替改變。這個(gè)結(jié)果表明由PEI800和DNA制成的交替吸附層在ITO電極的表面上形成。其上吸附了一層PEI800的表<p>本研究證實(shí)在使用甘油補(bǔ)充碳源和持續(xù)補(bǔ)充酵母提取物之間存在協(xié)同作用，該協(xié)同作用減弱了免疫毒素的毒性效果，提高了產(chǎn)量，特別是在15℃時(shí)。該項(xiàng)可靠的工藝具有37mg/L的產(chǎn)量，比先前報(bào)導(dǎo)的毒素抗性CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)高出7倍(25)。實(shí)施例41最終方法使用毒素抗性EF-2突變體，誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇添加量限制為0.5至0.75ml/min(每10L初始培養(yǎng)基)而不另加碳源，誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至163h，溫度15℃，持續(xù)注入酵母提取物，攪拌速度限制為400RPM，添加消泡劑至0.07％，以及DO水平降至40％以下時(shí)補(bǔ)充氧氣。在此條件下無(wú)需PMSF和酪蛋白氨基酸。另外，通過(guò)降低攪拌速度減小剪切力，以及添加消泡劑可顯著減少免疫毒素聚集體。結(jié)果，純化產(chǎn)率從64％提高至76％。通過(guò)該優(yōu)化的方法，在甲醇誘導(dǎo)163小時(shí)時(shí)的免疫毒素分泌水平為120mg/L。表6總結(jié)了通過(guò)解決這些主要問(wèn)題，提高了多少免疫毒素分泌和純化產(chǎn)量?；騼?yōu)化使IT分泌從不可檢測(cè)水平提高到10mg/L。通過(guò)使用DT抗性菌株和采用低溫，我們將免疫毒素分泌量提高到35mg/L。而且，采用甲醇限量添加提高了免疫毒素分泌量以及純化產(chǎn)率。最后，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間以及添加消泡劑顯著提高了免疫毒素分泌量和純化產(chǎn)率。消泡劑是購(gòu)自KaboChemical公司(Cheyennne，WY82007，USA)的KFOTM673。該方法可用于在毒素敏感的巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)其他重組免疫毒素和其他有毒蛋白。表6通過(guò)解決主要問(wèn)題，免疫毒素分泌量和純化產(chǎn)率的提高在本申請(qǐng)中，引用了多種出版物。這些出版物按如下方式全文引用。所提及的出版物通過(guò)引用的方式全文納入本說(shuō)明書(shū)中，以更加詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的狀況。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，只要不背離本發(fā)明的范圍和精神，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。通過(guò)考慮本發(fā)明所公開(kāi)的說(shuō)明書(shū)和實(shí)施情況，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例應(yīng)僅看作示例性用途，本發(fā)明真正的范圍和精神在所附的權(quán)利要求書(shū)中說(shuō)明。參考文獻(xiàn)Arata，Y.，T.Nishi，S.Kawasaki-Nishi，E.Shao，S.Wilkens，andM.Forgac.2002.Structure，subunitfunctionandregulationofthecoatedvesicleandyeastvacuolar(H(+))-ATPases.Biochim.Biophys.Acta155571-4.Bannister，S.J.，andK.D.Wittrup.2000.GlutathioneexcretioninresponsetoheterologousproteinsecretioninSaccharomycescerevisiae.Biotechnol.Bioeng.68389-95.Bennett，M.J.，andD.Eisenberg.1994.Refinedstructureofmonomericdiphtheriatoxinat2.3Aresolution.ProteinSeience31464-1475.Boeseken，J.1949.Theuseofboricacidforthedeterminationoftheconfigurationofcarbohydrates.Adv.Carbohydr.Chem.4189-210.Bouriotis，V.，Scott，J.，Galloway，A.，Bellingham，A.J.，andDean，P.D.1981.Measurementofglycosylatedhaemoglobinsusingaffinitychromatography.Diabetologia21579-580.Cereghino，G.P.，Cereghino，J.L.，Ilgen，C.andCregg，J.M..2002.ProductionofrecombinantproteinsinfermentorculturesoftheyeastPichiapastoris.Curr.Opin.Biotechnol.13329-332.Cereghino，G.P.，Cereghino，J.L.，Sunga，A.J.，Johnson，M.A.，Lim，M.，Gleeson，M.A.G.andCregg，J.M.(2001)Newselectablemarker/auxotrophichoststraincombinationsformoleculargeneticmanipulationofPichiapastoris.Gene263，159-169.Che，F(xiàn).Y.，J.F.Song，X.X.Shao，K.Y.WangandQ.C.Xia.1999.Comparativestudyonthedistributionofovalbuminglycoformsbycapillaryelectrophoresis.J.Chromatogr.A849599-608.Chen，J.Y.C.，Bodley，J.W.andLivingston，D.W.(1985)Diphtheriatoxin-resistantmutantsofSaccharomycescerevisiae.Mol.Cell.Biol.5，3357-3360.Chen，S.R.，D.D.Dunigan，andM.B.Dickman.2003.Bcl-2familymembersinhibitoxidativestress-inducedprogrammedcelldeathinSaccharomycescerevisiae.FreeRadic.Biol.Med.341315-1325.Collier，J.(1975)Diphtheriatoxinmodeofactionandstructure.Bact.Rev.39，54-85.Conover，W.J.1999.Sometestsbasedonthebinomialdistribution，p.123-178.InB.Wiley(ed.)，Practicalnonparametricstatistics，3rded.JohnWileyandSons，Inc.，NewYork，NY.Couderc，R.，andJ.Baratti.1980.Oxidationofmethanolbytheyeast，PichiapastorisPurificationandpropertiesofthealcoholoxidase.Agric.Biol.Chem.442279-2289.Davis，C.A.，Grate，L.，Spingola，M.andAresJr.，M.(2000)Testofintronpredictionrevealsnovelsplicesites，alternativelysplicedmRNAsandnewintronsinmeioticall.regulatedgenesofyeast.NucleicAeidsResearch28，1700-1706.Desai，U.R.，H.Wang，S.A.AmpofoandR.J.Linhardt.1993.Oligosaccharidecompositionofheparinandlow-molecular-weightheparinsbycapillaryelectrophoresis.Anal.Bioehem.213120-127.Dring，F(xiàn).，Klapper，M.，Theis，S.andDaniel，H.(1998)Useoftheglyceraldehyde-3phosphatedehydrogenasepromoterforproductionoffunctionalmammalianmembranetransportproteinsintheyeastPichiapastoris.Biochem.Biophys.Res.Commun.250，531-535.Foley，B.T.，Moehring，J.M.，andMoehring，T.J.(1992)Amutationincodon717oftheCho-K1elongationfactor2genepreventsthefirststepinthebiosynthesisofdiphthamide.Somat.CellMol.Genet.18，227-231Frankel，A.E.，D.M.Neville，T.A.Bugge，R.J.Kreitman，andS.H.Leppla.2003.Immunotoxintherapyofhematologicmalignancies.Semin.Oncol.30545-557.Gellissen，G.(2000)Heterologousproteinproductioninmethylotrophicyeasts.Hardy，E.，E.Martinez，D.Diago，R.Diaz，D.Gonzalez，andL.Herrera.2000.Large-scaleproductionofrecombinanthepatitisBsurfaceantigenfromPichiapastoris.J.Biotechnol.77157-67.Houchins，J.P.(2000)Immunotoxin-inducedapoptosis.StemCell18，384-385.Hu，V.W.，andR.K.Holmes.1987.SinglemutationintheAdomainofdiphtheriatoxinresultsinaproteinwithalteredmembraneinsertionbehavior.BiochimBiophysActa90224-30.Jahic，M.，F(xiàn).Wallberg，M.Bollok，p.Garcia，andS.O.Enfors.2003.Temperaturelimitedfed-batchtechniqueforcontrolofproteolysisinPichiapastorisbioreactorcultures.Microb.CellFact.26.Jahic，M.，J.C.Rotticci-Mulder，M.Martinelle，K.Hult，andS.O.Enfors.2002.ModelingofgrowthandenergymetabolismofPichiapastorisproducingafusionprotein.BioprocessBiosyst.Eng.24385-393.Kimata，Y.andKohno，K.(1994)Elongationfactor2mutantsdeficientindiphthamideformationshowtemperature-sensitivecellgrowth.J.Biol.Chem.269，13497-13501.Kimata，Y.，Harashima，S.andKohno，K.(1993)Expressionofnon-ADP-ribosylatable，Diphtheriatoxin-resistantelongationfactor2inSaccharomycescerevisiae.Biochem.Biophys.Res.Commun.191，1145-1131.Kohno，KandUchida，T.(1987)Highlyfrequentsingleaminoacidsubstitutioninmammalianelongationfactor2(EF-2)resultsinexpressionofresistancetoEF-2-ADPribosylatingToxins.J.Biol.Chem.262，12298-12305.Kohno，K.，Uchida，T.，Ohkubo，H.，Nakanishi，S.，Nakanishi，T.，F(xiàn)ukui，T.，Ohtsuka，E.，Ikehara，M.andOkada，Y.(1986)AminoAcidSequenceofMammalianElongationFactor2DeducedfromthecDNASequenceHomologywithGTP-BindingProteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，4978-4982.Li，Z.，F(xiàn).Xiong，Q.Lin，M.d′Anjou，A.J.Daugulis，D.S.Yang，andC.L.Hew.2001.Low-temperatureincreasestheyieldofbiologicallyactiveherringantifreezeproteininPichiapastoris.ProteinExpr.Purif21438-45.Liebman，J.M.，D.LaSala，W.Wang，andP.M.Steed.1999.Whenlessismoreenhancedbaculovirusproductionofrecombinantproteinsatverylowmultiplicitiesofinfection.Biotechniques2636-8，40，42.Liu，Y.Y.，Gordienko，I.，Mathias，A.，Ma，S.，Thompson，J.，Woo，J.H.，andNeville，D.M.，Jr.(2000)Expressionofananti-CD3single-chainimmunotoxinwithatruncateddiphtheriatoxininamutantCHOcellline.ProteinExpr.Purif.19，304-11.Liu，Y.Y.，J.H.Woo，andD.M.Neville.2003.TargetedintroductionofadiphtheriatoxinresistantmutationintothechromosomalEF-2locusofPichiapastorisandexpressionofimmunotoxinintheEF-2mutants.ProteinExpr.Purif.，inpress.Liu，Y.Y.，J.H.Woo，andD.M.Neville.2003.TargetedintroductionofadiphtheriatoxinresistantmutationintothechromosomalEF-2locusofPichiapastorisandexpressionofimmunotoxinintheEF-2mutants.ProteinExpr.Purif.30262-274.Mattheakis，L.C.，Shen，W.H.andCollier，R.J.(1992)DPG5，aMethyltransferasegenerequiredforDiphthamidebiosynthesisinSaccharomycescerevisiae.Mol.Cell.Biol.124026-4037.MitaK，MorimyoM，ItoK，SugayaK，EbiharaK，HongoE，HigashiT，HirayamaY，NakamuraY.(1997)ComprehensivecloningofSchizosaccharomycespombegenesencodingtranslationelongationfactors.Gene187，259-266.Myohanen，T.A.，V.BouriotisandP.D.Dean.1981.Affinitychromatographyofyeastalpha-glucosidaseusingligand-mediatedchromatographyonimmobilizedphenylboronicacids.Biochem.J.197683-688.Narasimhan，S.，N.Harpaz，G.Longmore，J.P.Carver，A.A.GreyandH.Schachter.1980.Controlofglycoproteinsynthesis.Thepurificationbypreparativehighvoltagepaperelectrophoresisinborateofglycopeptidescontaininghighmannoseandcomplexoligosaccharidechainslinkedtoasparagine.J.Biol.Chem.2554876-4884.Neville，D.M.，J.Scharff，andK.Srinivasachar.1992.InvivoT-cellablationbyaholo-immunotoxindirectedathumanCD3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA892585-2589.Nokelainen，M.，H.Tu，A.Vuorela，H.Notbohm，K.I.Kivirikko，andJ.Myllyharju.2001.High-levelproductionofhumantypeIcollagenintheyeastPichiapastoris.Yeast18797-806.Nomoto，H.andY.Inoue.1983.Anovelglycoasparagineisolatedfromanovalbuminglycopeptidefraction(GP-IV).Anion-exchangeboratechromatographyandstructuralanalysisofGP-IVglycoasparagines.Eur.J.Biochem.135243-250.Nomoto，H.，T.EndoandY.Inoue.1982.Preparationandcharacterisationoffragmentglycoasparaginesfromovalbuminglycopeptidesreferencecompoundsforstructuralandbiochemicalstudiesoftheoligo-mannoseandhybridtypesofcarbohydratechainsofglycoproteins.Carbohydr.Res.10791-101.Ormerod，M.G.2000.Furtherapplicationstocellbiology，p.249-258.InM.G.Ormerod(ed.)，F(xiàn)lowcytometry，Apracticalapproach，3rded.OxfordUniversityPress，NewYork.Otsuka，H.，E.Uchimura，H.Koshino，T.OkanoandK.Kataoka.2003.AnomalousBindingProfileofPhenylboronicAcidwithN-AcetylneuraminicAcid(Neu5Ac)inAqueousSolutionwithVaryingpH.J.Am.Chem.Soc.1253493-3502.Paiva，P.M.，A.F.Souza，M.L.Oliva，J.F.Kennedy，M.S.Cavalcanti，L.C.CoelhoandC.A.Sampaio.2003.IsolationofatrypsininhibitorfromEchinodoruspaniculatusseedsbyaffinitychromatographyonimmobilizedCratyliamollisisolectins.Bioresour.Technol.8875-79.Pendse，G.J.，S.Karkare，andJ.E.Bailey.1992.EffectofclonedgenedosageoncellgrowthandhepatitisBsurfaceantigensynthesisandsecretioninrecombinantCHOcells.Biotechnol.Bioeng.40119-129.Perentesis，J.P.，Phan，L.D.，Gleason，W.B.，LaPorte，D.C.，Livingston，D.M.andBodley，J.W.(1992)SaccharomycescerevisiaeElongationFactor2geneticcloning，characterizationofexpression，andG-domainmodeling.J.Biol.Chem.267，1190-1197.Phan，L.D.，Perentesis，J.P.andBodley，J.W.(1993)SaccharomycescerevisiaeElongationFactor2mutagenesisofthehistidineprecursorofdiphthamideyieldsafunctionalproteinthatisresistanttodiphtheriatoxin.J.Biol.Chem.268，8865-8868.Potter，K.J.，W.Zhang，L.A.Smith，andM.M.Meagher.2000.ProductionandpurificationoftheheavychainfragmentCofbotulinumneurotoxin，serotypeA，expressedinthemethylotrophicyeastPichiapastoris.ProteinExpr.Purif19393-402.Ratts，R.，H.Zeng，E.A.Berg，C.Blue，M.E.McComb，C.E.Costello，J.C.VanderSpek，andJ.R.Murphy.2003.Thecytosolicentryofdiphtheriatoxincatalyticdomainrequiresahostcellcytosolictranslocationfactorcomplex.JCellBiol1601139-1150.Rothman，R.J.andL.Warren.1988.AnalysisofIgGglycopeptidesbyalkalineborategelfiltrationchromatography.Biochim.Biophys.Acta955143-153.Rymond，B.C.，andRosbash，M.(1992).Yeastpre-mRNAsplicing.InTheMolecularandCellularBiologyoftheYeastSaccharomycesGeneExpression.E.W.Jones，J.R.Pringle，andJ.R.Broach，eds.(ColdSpringHarbor，NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress)，pp.143-192.Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch.E.F.andManiatis，T.(1989)MolecularCloning，ALaboratoryManual2ndedition.(ColdSpringHarbor，NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress)pp8.21-8.35.Schroder，M.，J.S.Chang，andR.J.Kaufman.2000.Theunfoldedproteinresponserepressesnitrogen-starvationinduceddevelopmentaldifferentiationinyeast.GenesDev.142962-2975.Scocca，J.R.1986.IdentificationofN-acetylhexosaminesproducedbyenzymesoftheN-acetylneuraminicacidmetabolicpathwaybyboratecomplexanion-exchangechromatographyofthecorrespondingN-acetylhexosaminitols.Anal.Biochem.15661-66.Thompson，J.，H.Hu，J.Scharff，andD.M.Neville.1995.Ananti-CD3single-chainimmunotoxinwithatruncateddiphtheriatoxinavoidsinhibitionbypre-existingantibodiesinhumanblood.J.Biol.Chem.27028037-28041.Thompson，J.，Stavrou，S.，Weetall，M.，Hexham，J.M.，Digan，M.E.，Wang，Z.，Woo，J.H.，Yu，Y.，Mathias，A.，Liu，Y.Y.，Ma，S.，Gordienko，I.，Lake，P.andD.M.Neville，Jr.2001.Improvedbindingofabivalentsingle-chainimmunotoxinresultsinincreasedefficacyforinvivoT-celldepletion.ProteinEng.141035-1041.Thorburn，J.，A.E.Frankel，andA.Thorburn.2003.Apoptosisbyleukemiacell-targeteddiphtberiatoxinoccursviareceptor-independentactivationofFas-associateddeathdomainprotein.Clin.CancerRes.9861-865.Tschopp，J.F.，P.F.Brust，J.M.Cregg，C.A.Stillman，andT.R.Gingeras.1987.ExpressionofthelacZgenefromtwomethanol-regulatedpromotersinPichiapastoris.NucleicAcidsRes.153859-76.Valkonen，M.，M.Penttila，andM.Saloheimo.2003.Effectsofinactivationandconstitutiveexpressionoftheunfolded-proteinresponsepathwayonproteinproductionintheyeastSaccharomycescerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.692065-2072.Veenhuis，M.，J.P.VanDijken，andW.Harder.1983.Thesignificanceofperoxisomesinthemetabolismofone-carboncompoundsinyeasts.Adv.Microb.Physiol.241-82.Wang，Y.，Z.H.Liang，Y.S.Zhang，S.Y.Yao，Y.G.Xu，Y.H.Tang，S.Q.Zhu，D.F.Cui，andY.M.Feng.2001.HumaninsulinfromaprecursoroverexpressedinthemethylotrophicyeastPichiapastorisandasimpleprocedureforpurifyingtheexpressionproduct.Biotechnol.Bioeng.7374-9.Weigel，H.1963.Paperelectrophoresisofcarbohydrates.Adv.Carbohyd.Chem.1861-97.Weith，H.L.，J.L.WiebersandP.T.Gilham.1970.Synthesisofcellulosederivativescontainingthedihydroxyborylgroupandastudyoftheircapacitytoformspecificcomplexeswithsugarsandnucleicacidcomponents.Biochemistrv94396-4401.Werten，M.W.，T.J.vandenBosch，R.D.Wind，H.Mooibroek，andF.A.deWolf.1999.High-yieldsecretionofrecombinantgelatinsbyPichiapastoris.Yeast151087-96.Willer，M.，A.J.Jermy，G.J.Steel，H.J.Garside，S.Carter，andC.J.Stirling.2003.AninvitroassayusingoverexpressedyeastSRPdemonstratesthatcotranslationaltranslocationisdependentupontheJ-domainofSec63p.Biochemistry427171-7177.Williams，G.T.，A.P.Johnstone，V.BouriotisandP.D.Dean.1981.Affinitychromatographyofmembraneproteinsondihydroxyboryl-matrixgel.Biochem.Soc.Trans.9137-139.Woo，J.H.，andD.M.Neville.2003.Separationofbivalentanti-TcellimmunotoxinfromP.pastorisglycoproteinsbyborateanionexchange.BioTechniques35392-398.Woo，J.H.，Y.Y.Liu，A.Mathias，S.Stavrou，Z.Wang，J.Thompson，andD.M.Neville.2002.Geneoptimizationisnecessarytoexpressabivalentanti-humananti-TcellimmunotoxininPichiapastoris.ProteinExpr.Purif.25270-82.Woo，J.H.，Y.Y.Liu，andD.M.Neville.2004.Increasingsecretionofabivalentanti-TcellimmunotoxinbyPichiapastoris.Appl.Environ.Microbiol.70(6)3370-3376.Zanette，D.，A.Soffientini，C.SottaniandE.Sarubbi.2003.Evaluationofphenylboronateagaroseforindustrial-scalepuriificationoferythropoietinfrommammaliancellculturesJ.Biotechnol.101275-287.Zhang，W.，K.J.HywoodPotter，B.A.Plantz，V.L.Schlegel，L.A.Smith，andM.M.Meagher.2003.Pichiapastorisfermentationwithmixed-feedsofglycerolandmethanolgrowthkineticsandproductionimprovement.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30210-215.序列表&lt;110&gt;美國(guó)政府(由衛(wèi)生和人類服務(wù)部、國(guó)立衛(wèi)生研究院的部長(zhǎng)所代表)D.M.內(nèi)維爾J-H.禹Y-Y.劉&lt;120&gt;免疫毒素的表達(dá)和純化方法&lt;130&gt;14028.0295P1&lt;140&gt;未分配&lt;141&gt;2004-08-02&lt;150&gt;60/491,923&lt;151&gt;2003-08-01&lt;160&gt;35&lt;170&gt;FastSEQforWindowsVersion4.0&lt;210&gt;1&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人(H.sapiens)&lt;400&gt;1AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrAlaArgArg20&lt;210&gt;2&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;小鼠(M.musculus)&lt;400&gt;2AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrAlaArgArg20&lt;210&gt;3&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;褐家鼠(R.norvegicus)&lt;400&gt;3AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrAlaArgArg20&lt;210&gt;4&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;中國(guó)倉(cāng)鼠(C.griseus)&lt;400&gt;4AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrAlaArgArg20&lt;210&gt;5&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;黑腹果蠅(D.melanogaster)&lt;400&gt;5AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrThrArgArg20&lt;210&gt;6&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)&lt;400&gt;6AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrAlaArgArg20&lt;210&gt;7&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;裂變酵母(S.pombe)&lt;400&gt;7AspValValLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrAlaArgArg20&lt;210&gt;8&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)&lt;400&gt;8AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnVal151015IleProThrMetLysArg20&lt;210&gt;9&lt;211&gt;22&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;釀酒酵母(S.cerevisiae)&lt;400&gt;9AspValThrLeuHisAlaAspAlaIleHisArgGlyGlyGlyGlnIle151015IleProThrMetArgArg20&lt;210&gt;10&lt;211&gt;66&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;10gatgttaccctgcacgccgatgctatccaccgccgcggaggacaagtcattccaaccatg60aagaga66&lt;210&gt;11&lt;211&gt;223&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;11actttgaagttcttaattttgttcctcgtagaaagaacgcatagataattcaaaatggca60aaatgggtatgtgtttttttatagttcatgtgccgaacaactaccgttttaacttcactg120tcgatcagatgcgatcccttatggacaaggtgtccaacgtccgtaacatgtcggttattg180cccacgttgatcacggtaagtccactttaactgactccctggt223&lt;210&gt;12&lt;211&gt;250&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;12actttgaagttcttaattttgttcctcgtagaaagaacgcatagataattcaaaatgggt60atgtgtttttttatagttcatgtgccgaacaactaccgtttcaagatgggagccagccac120taacatctcctctagttaacttcactgtcgatcagatgcgatcccttatggacaaggtga180ccaacgtccgtaacatgtcggttattgcccacgttgatcacggtaagtccactttaactg240actccctggt250&lt;210&gt;13&lt;211&gt;2601&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;13atggttaacttcactgtcgatcagatgcgatcccttatggacaaggtgaccaacgtccgt60aacatgtcggttattgcccacgttgatcacggtaagtccactttaactgactccctggtg120caacgtgccggtattatttctgctgccaaggctggtgaggcccgtttcactgatactaga180aaggacgagcaagagagaggtatcaccatcaagtctaccgccatttctttgtactctgag240atgggtgacgacgatgtcaaggagatcaagcagaagactgaaggtaacagtttccttatc300aacttaattgactccccaggtcacgttgacttctcttctgaggtcactgctgctctgcgt360gttactgacggtgctttggtcgtcgttgactgtgttgaaggtgtctgtgttcaaactgag420accgttttgcgtcaagctttgggtgaaagaatcaagccagttgttgtcattaacaaggtc480gaccgtgctcttttggagttgcaagttaccaaggaggacctgtaccagtctttcgctaga540accgtcgagtccgtaaacgtcgttatcgctacttacactgacaagaccattggtgacaac600caagtctacccagaacagggtaccgtcgctttcggttcaggtctgcacggatgggctttc660accgttagacagttcgccactagatactccaagaagttcggtgttgacagaatcaagatg720atggagcgtctgtggggagactcttacttcaacccaaagaccaagaaatggaccaacaag780gacaaggacgccgctggaaagcctttggagcgtgccttcaacatgttcgttttggaccct840atcttccgtctgtttgctgccatcatgaacttcaagaaggatgaaattccagttctgttg900gagaaattggagatcaacctgaagcgtgaggagaaggagttggagggtaaggctcttttg960aaggttgtcatgagaaagttcttgccagctgccgacgctttgttggagatgattgttctt1020cacctgccatctccagtcaccgctcaagcttacagagccgagactttgtacgaaggtcca1080tctgatgaccaattctgcattggtatcagagagtgtgaccctaaggctgagctgatggtt1140tacatttccaagatggtgccaacctccgacaaaggtagattctacgccttcggtcgtgtt1200ttctccggtactgttaagtccggtcaaaaggtcagaatccaaggtcctaactacgttcca1260ggtaagaaggaggacttgttcatcaaggctgttcaaagaactgttttgatgatgggaaga1320accgtcgagcctattgacgatgtcccagctggtaacattctgggtattgtgggtatcgac1380cagttcttgctgaagtctggtactcttactaccaacgaagccgctcacaacatgaaggtg1440atgaaattctctgtctctccagttgtgcaagttgccgttgaggtcaagaacgctaatgat1500ctgcccaagttggttgagggtctgaagcgtttgtccaagtctgacccatgtgttttaacc1560tacatctccgagtctggtgagcacattgttgctggtactggtgagctgcacttggaaatc1620tgtttgcaagatctgcaagacgaccacgctggtgtccctctgaagatttctcctccagtt1680gttacctaccgtgagactgtcactaacgaatcttccatgactgccctgtccaagtctcag1740aacaagcataacagaatttacctgaaggctcaaccaattgacgaggaattgtctttggct1800atcgaagaaggtaaggttcacccaagagacgactttaaagccagagccagaatcatggct1860gatgaatacggttgggacgtcactgatgccagaaagatctggtgtttcggtccagacggt1920actggtgccaacttagttgttgaccagtctaaggctgtccaatacttgcacgagatcaag1980gactctgttgttgccggtttccaattggctaccaaggaaggtccaattttgggagaaaac2040atgagatccgtcagagtcaacatcttggatgttaccctgcacgccgatgctatccacaga2100ggtggaggacaagtcattccaaccatgaagagagttacctacgccgccttcctgttggct2160gagccagctatccaggagcctatcttcttggtggagatccaatgtccagagaatgccatt2220ggtggtatctactctgttttgaacaagaagagaggtcaagttatctctgaggaacaaaga2280ccaggtaccccattgttcactgtcaaagcttacttgccagttaacgagtcattcggtttc2340accggtgaactgagacaagctaccgctggtcaagctttcccacagatggtgttcgaccac2400tgggccaacatgaatggtaacccattggacccagcctccaaggtcggtgagattgttctt2460gctgccagaaagagacagggtatgaaggagaacgttcctggttatgaagagtactacgac2520aagttgtaagcttaatgtttcattaacttatttgtgtcgttcgtatgtctatttacgtac2580ttaattcagtgtattgttgtt2601&lt;210&gt;14&lt;211&gt;9&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;14AlaHisValAspHisGlyLysSerThr15&lt;210&gt;15&lt;211&gt;13&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;15AspGluGlnGluArgGlyIleThrIleLysSerThrAla1510&lt;210&gt;16&lt;211&gt;896&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;16AlaGlyAlaAspAspValValAspSerSerLysSerPheValMetGlu151015AsnPheAlaSerTyrHisGlyThrLysProGlyTyrValAspSerIle202530GlnLysGlyIleGlnLysProLysSerGlyThrGlnGlyAsnTyrAsp354045AspAspTrpLysGlyPheTyrSerThrAspAsnLysTyrAspAlaAla505560GlyTyrSerValAspAsnGluAsnProLeuSerGlyLysAlaGlyGly65707580ValValLysValThrTyrProGlyLeuThrLysValLeuAlaLeuLys859095ValAspAsnAlaGluThrIleLysLysGluLeuGlyLeuSerLeuThr100105110GluProLeuMetGluGlnValGlyThrGluGluPheIleLysArgPhe115120125GlyAspGlyAlaSerArgValValLeuSerLeuProPheAlaGluGly130135140SerSerSerValGluTyrIleAsnAsnTrpGluGlnAlaLysAlaLeu145150155160SerValGluLeuGluIleAsnPheGluThrArgGlyLysArgGlyGln165170175AspAlaMetTyrGluTyrMetAlaGlnAlaCysAlaGlyAsnArgVal180185190ArgArgSerValGlySerSerLeuSerCysIleAsnLeuAspTrpAsp195200205ValIleArgAspLysThrLysThrLysIleGluSerLeuLysGluHis210215220GlyProIleLysAsnLysMetSerGluSerProAlaLysThrValSer225230235240GluGluLysAlaLysGlnTyrLeuGluGluPheHisGlnThrAlaLeu245250255GluHisProGluLeuSerGluLeuLysThrValThrGlyThrAsnPro260265270ValPheAlaGlyAlaAsnTyrAlaAlaTrpAlaValAsnValAlaGln275280285ValIleAspSerGluThrAlaAspAsnLeuGluLysThrThrAlaAla290295300LeuSerIleLeuProGlyIleGlySerValMetGlyIleAlaAspGly305310315320AlaValHisHisAsnThrGluGluIleValAlaGlnSerIleAlaLeu325330335SerSerLeuMetValAlaGlnAlaIleProLeuValGlyGluLeuVal340345350AspIleGlyPheAlaAlaTyrAsnPheValGluSerIleIleAsnLeu355360365PheGlnValValHisAsnSerTyrAsnArgProAlaTyrSerProGly370375380HisLysThrGlnProPheLeuProTrpAspIleGlnMetThrGlnThr385390395400ThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGlyAspArgValThrIleSerCys405410415ArgAlaSerGlnAspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLys420425430ProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeuHis435440445SerGlyValProSerLysPheSerGlySerGlySerGlyThrAspTyr450455460SerLeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGluAspIleAlaThrTyrPhe465470475480CysGlnGlnGlyAsnThrLeuProTrpThrPheAlaGlyGlyThrLys485490495LeuGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly500505510GlyGlySerGluValGlnLeuGlnGlnSerGIyProGluLeuValLys515520525ProGlyAlaSerMetLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPhe530535540ThrGlyTyrThrMetAsnTrpValLysGlnSerHisGlyLysAsnLeu545550555560GluTrpMetGlyLeuIleAsnProTyrLysGlyValSerThrTyrAsn565570575GlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSer580585590ThrAlaTyrMetGluLeuLeuSerLeuThrSerGluAspSerAlaVal595600605TyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyrGlyAspSerAspTrpTyrPhe610615620AspValTrpGlyAlaGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGly625630635640GlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGlnMet645650655ThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGlyAspArgValThr660665670IleSerCysArgAlaSerGlnAspIleArgAsnTyrLeuAsnTrpTyr675680685GlnGlnLysProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyrTyrThrSer690695700ArgLeuHisSerGlyValProSerLysPheSerGlySerGlySerGly705710715720ThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGluAspIleAla725730735ThrTyrPheCysGlnGlnGlyAsnThrLeuProTrpThrPheAlaGly740745750GlyThrLysLeuGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly755760765SerGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGlu770775780LeuValLysProGlyAlaSerMetLysIleSerCysLysAlaSerGly785790795800TyrSerPheThrGlyTyrThrMetAsnTrpValLysGlnSerHisGly805810815LysAsnLeuGluTrpMetGlyLeuIleAsnProTyrLysGlyValSer820825830ThrTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrValAspLys835840845SerSerSerThrAlaTyrMetGluLeuLeuSerLeuThrSerGluAsp850855860SerAlaValTyrTyrCysAlaArgSerGlyTyrTyrGlyAspSerAsp865870875880TrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValPheSer885890895&lt;210&gt;17&lt;211&gt;15&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;220&gt;&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;15&lt;223&gt;S＝G或C&lt;400&gt;17ggggsggggsggggs15&lt;210&gt;18&lt;211&gt;16&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;220&gt;&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;4，8，12，16&lt;223&gt;s＝g或c&lt;400&gt;18gggsgggsgggsgggs16&lt;210&gt;19&lt;211&gt;3&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;2&lt;223&gt;Xaa＝任何氨基酸&lt;220&gt;&lt;221&gt;變體&lt;222&gt;3&lt;223&gt;Xaa＝s或t&lt;400&gt;19AsnXaaXaa1&lt;210&gt;20&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;20ttggttattgaccaaactaaggctgtccaa30&lt;210&gt;21&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;21acctctcttcttgtttaagacggagtagat30&lt;210&gt;22&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;22cttgcttttgcggccgctttttttttttttttttttttt39&lt;210&gt;23&lt;211&gt;41&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;23gataagaatgcggccgccatttcttggtctttgggttgaag41&lt;210&gt;24&lt;211&gt;42&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;24gataagaatgcggccgccaacttagttgttgaccagtctaag42&lt;210&gt;25&lt;211&gt;36&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;25atagctagcactttgaagttcttaattttgttcctc36&lt;210&gt;26&lt;211&gt;43&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;26ataagaatgcggccgcaagttaatgaaacattaagcttacaac43&lt;210&gt;27&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;27gaatgacttgtcctccacc19&lt;210&gt;28&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;28gaatgacttgtcctccgcgg20&lt;210&gt;29&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;29caactagctagcgctcacaacatgaaggtcatgaaattc39&lt;210&gt;30&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;30agaaccgtcgagcctattgacgat24&lt;210&gt;31&lt;211&gt;56&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;31ccctgcacgccgatgctatccacagaagaggaggacaagtcattccaaccatgaag56&lt;210&gt;32&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;32gccgatgctatccacagaaga21&lt;210&gt;33&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;33gccgatgctatccaccgccgc21&lt;210&gt;34&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;400&gt;34tctcttcttgttcaaaacagagtagatacc30&lt;210&gt;35&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述；note＝合成構(gòu)建體&lt;220&gt;&lt;221&gt;miscfeature&lt;222&gt;7.15&lt;223&gt;n＝g，a，c或t(u)&lt;400&gt;35gtatgtncactaacntag18權(quán)利要求1.一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)可表達(dá)免疫毒素的巴斯德畢赤酵母；b)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中甲醇誘導(dǎo)的溫度在約17.5℃以下。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述甲醇誘導(dǎo)是添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培養(yǎng)基)的限量甲醇。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述甲醇誘導(dǎo)是含甲醇和甘油的補(bǔ)料。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中在所述含甲醇和甘油的補(bǔ)料中，甲醇和甘油比例約為4∶1。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫毒素為融合蛋白。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述白喉毒素部分為截短型。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，進(jìn)一步包括CD3抗體部分。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述巴斯德畢赤酵母包括在編碼EF-2的氨基酸序列中具有突變。11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白的酶消化產(chǎn)物是大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物。12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接觸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接觸至少2小時(shí)。14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中苯甲烷磺酰氟溶于4∶1甲醇甘油誘導(dǎo)補(bǔ)料中，濃度不超過(guò)10mM。15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述氨基酸源為酵母提取物。16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溫度選自17.5、17.0、16.5、16.0、15.5、15.0、14.5、14.0、13.5、13.0、12.5和12.0℃。17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溫度約為15℃。18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)一步包括消泡劑。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述消泡劑的濃度為約0.01％或更高。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成為約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，約0.43％PTM1溶液以及約0.02％消泡劑。22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溶解氧的濃度保持在40％的數(shù)值或更高。23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生長(zhǎng)步驟的pH值約為3.5，甲醇誘導(dǎo)步驟的pH值約為7.0。24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中甲醇誘導(dǎo)步驟進(jìn)行約22至288小時(shí)之間。25.一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母；b)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中所述甲醇誘導(dǎo)包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導(dǎo)進(jìn)行的溫度低于17.5℃，補(bǔ)充消泡劑至0.07％，攪拌速度保持在400RPM，且其中誘導(dǎo)步驟進(jìn)行約22至288小時(shí)之間。26.一種在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)可表達(dá)免疫毒素的巴斯德畢赤酵母，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括約4％甘油，約2％酵母提取物，約2％大豆蛋白的酶消化產(chǎn)物，約1.34％含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，以及約0.43％PTM1溶液，其中生長(zhǎng)期間pH值約為3.5，且生長(zhǎng)培養(yǎng)基中溶解氧濃度保持在40％或更高的數(shù)值；b)對(duì)巴斯德畢赤酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，其中所述甲醇誘導(dǎo)包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導(dǎo)進(jìn)行的溫度為15℃，pH值約7.0，補(bǔ)充消泡劑0.02％，攪拌速度保持在約400RPM，且誘導(dǎo)步驟進(jìn)行約163小時(shí)。27.一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液加入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素加于陰離子交換柱上；d)通過(guò)使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達(dá)到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述非糖基化免疫毒素在酵母中表達(dá)。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母。30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫毒素為融合蛋白。31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述白喉毒素部分為截短型。33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括CD3抗體部分。34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述非糖基化免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G4S)。35.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，進(jìn)一步包括在使用硼酸鈉溶液洗脫之前，使用約25mM的硼酸鈉溶液洗滌陰離子交換柱。36.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中步驟(d)中硼酸鈉溶液濃度在約50mM和約200mM之間。37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中步驟(d)中硼酸鈉溶液濃度在約75mM和約100mM之間。38.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中步驟(e)中硼酸鈉濃度約20mM。全文摘要本發(fā)明一方面涉及一種在毒素抗性的突變型巴斯德畢赤酵母菌株中表達(dá)免疫毒素的方法，包括a)在包含蛋白的酶消化產(chǎn)物和酵母提取物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母，并保持溶解氧濃度在40％或以上；b)進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過(guò)程中添加0.5－0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，持續(xù)注入酵母提取物，溫度低于17.5℃，補(bǔ)充消泡劑至0.07％，攪拌減慢至400RPM，且誘導(dǎo)階段延長(zhǎng)至163小時(shí)。本發(fā)明另一方面涉及一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括a)將含有非糖基化免疫毒素的溶液加入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟(b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素加于陰離子交換柱上；d)通過(guò)使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟(d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達(dá)到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟(e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。文檔編號(hào)C12N1/16GK1863921SQ200480028919公開(kāi)日2006年11月15日申請(qǐng)日期2004年8月2日優(yōu)先權(quán)日2003年8月1日發(fā)明者D·M·內(nèi)維爾,J·H·禹,Y-Y·劉申請(qǐng)人:美國(guó)政府(由衛(wèi)生和人類服務(wù)部、國(guó)立衛(wèi)生研究院的部長(zhǎng)所代表)