專利名稱:改進(jìn)的dna亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的制作方法
背景技術(shù):
本發(fā)明涉及DNA中胞嘧啶甲基化的檢測(cè)方法。5-甲基胞嘧啶是真核細(xì)胞DNA中最常見的共價(jià)修飾堿基。例如,它在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、遺傳印記和腫瘤發(fā)生中起作用(綜述參見Millar等人Five not fourHistory andsignificance of the fifth base.在S.Beck和A.Olek,eds.TheEpigenome.Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003,S.3-20)。因此5-甲基胞嘧啶作為遺傳信息組分的鑒定是非常有意義的。但是不能通過(guò)測(cè)序鑒定5-甲基胞嘧啶的位置,原因是5-甲基胞嘧啶與胞嘧啶有相同的堿基配對(duì)行為。此外,在PCR擴(kuò)增時(shí),5-甲基胞嘧啶攜帶的后生信息(epigenetic information)完全丟失。
對(duì)甲基化分析的通常方法基本上依據(jù)兩個(gè)不同的原理操作?;蛘呤褂眉谆禺惖南拗泼福蛘邔?duì)未甲基化的胞嘧啶進(jìn)行選擇性的化學(xué)轉(zhuǎn)化(亞硫酸氫鹽處理)成尿嘧啶。然后對(duì)經(jīng)過(guò)酶學(xué)或者化學(xué)預(yù)處理的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,可以用不同的方法進(jìn)行分析(綜述參見Fraga和EstellerDNA MethylationA Profile of Methods and Applications.Biotechniques 33632-649,Sept.2002).WO 02/072880 pp.1ff)。
因?yàn)榧谆禺惖拿傅氖褂弥幌抻诤斜凰雒缸R(shí)別的限制位點(diǎn)的某些序列,所以對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用進(jìn)行的是亞硫酸氫鹽處理(綜述參見US 10/311,661)。
根據(jù)本發(fā)明“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”、“亞硫酸氫鹽處理”或者“亞硫酸氫鹽方法”指的是在亞硫酸氫根離子存在的條件下將核酸中的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的反應(yīng),而5-甲基胞嘧啶基本上沒(méi)有轉(zhuǎn)化。亞硫酸氫鹽反應(yīng)含有脫氨基步驟以及脫磺酸基步驟,這兩步可以分別或者同時(shí)進(jìn)行(在EP1394172A1中描述了進(jìn)一步的細(xì)節(jié)并且顯示了反應(yīng)方案,該文獻(xiàn)的全部在此引用作為參考)。有各種不同的文獻(xiàn)討論了亞硫酸氫鹽反應(yīng)的特殊方面,包括Hayatsu等人,Biochemistry 9(1970)2858-28659;Slae和Shapiro,J.Org.Chem.43(1978)4197-4200;Paulin等人,Nucl.Acids Res.26(1998)5009-5010;Raizis等人,Anal Biochem.226(1995),161-1666;Wang等人Nucleic Acids Res.8(1980)4777-4790。這些文獻(xiàn)在EP 1394172A1中給予總結(jié)(在此引用其全部作為參考)。
亞硫酸氫鹽處理通常按照以下的方式進(jìn)行分離基因組DNA,用機(jī)械或者酶學(xué)方法使其片段化,氫氧化鈉變性,使用濃亞硫酸氫鹽溶液轉(zhuǎn)化幾個(gè)小時(shí),最后脫磺酸基和脫鹽(例如Frommer等人A genomicsequencing protocol that yields a positive display of5-methylcytosine residues in individual DNA strands.Proc NatlAcad Sci USA.1992 Mar 1;89(5)1827-31;在此引用其全部作為參考)。
最近開發(fā)出了亞硫酸氫鹽方法的幾種技術(shù)改進(jìn)。瓊脂糖小珠法將研究的DNA加入到瓊脂糖基質(zhì)中,這樣防止了DNA的擴(kuò)散和復(fù)性(亞硫酸氫鹽只與單鏈的DNA反應(yīng)),并且所有的沉淀和純化步驟被快速透析所替代(Olek A.等人A modified and improved method for bisulphitebased cytosine methylation analysis,Nucl.Acids Res.1996,24,5064-5066)。在專利申請(qǐng)WO01/98528(=DE 100 29 915;=US申請(qǐng)10/311,661)中,描述了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,其中在變性劑和/或溶劑以及至少一種清除劑(scavenger)存在下,DNA樣品與濃度范圍在0.1mol/L到6mol/L的亞硫酸氫鹽溶液共同溫育。在所述的專利申請(qǐng)中描述了幾種適宜的變性劑和清除劑(文獻(xiàn)的全部在這里引用作為參考)。在專利申請(qǐng)WO 03/038121(=DE 101 54 317;=10/416,624)中,公開了在亞硫酸氫鹽處理過(guò)程中將要被分析的DNA結(jié)合到固相表面的方法。因此有助于純化和洗滌步驟的進(jìn)行。在專利申請(qǐng)EP1394173A1和EP1394172A1(其整體在這里引用作為參考)中描述了進(jìn)一步的改進(jìn)。
但是亞硫酸氫鹽處理中的主要問(wèn)題是需要長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間,以確保完全轉(zhuǎn)化并且排除假陽(yáng)性結(jié)果。但是由于長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間,這同時(shí)導(dǎo)致DNA的降解。更高的反應(yīng)溫度的確產(chǎn)生更高轉(zhuǎn)化率,但是也產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的DNA降解。最近對(duì)溫度、反應(yīng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化率以及降解之間的相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。這樣能夠表明最高的轉(zhuǎn)化率在溫度為55℃(反應(yīng)時(shí)間在4到18小時(shí)之間)和95℃(反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí))時(shí)獲得。但是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題時(shí)在這一過(guò)程中DNA的降解。在反應(yīng)溫度為55℃時(shí),84-96%的DNA被分解。95℃時(shí)降解實(shí)際上更高(Grunau等人Bisulfitegenomic sequencingsystematic investigation of criticalexperimental parameters.Nucleic Acids Res.2001 Jul 1;29(13)E65-5;其全部在這里引用作為參考)。因此,大多數(shù)作者使用的反應(yīng)溫度是大約50℃(參見Frommer等人,在上述引文中1992,p.1827;Olek等人,在上述引文中1996,p.5065;RaizisetalA bisulfitemethodof 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.Anal Biochem.1995 Mar 20;226(1)161-6,162)。
除了高的DNA降解率,在傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽方法中還有另外一個(gè)問(wèn)題,即至今還沒(méi)有描述對(duì)轉(zhuǎn)化后DNA的強(qiáng)有力的純化方法。許多作者使用沉淀(參見Grunau等人,在上述引文中)。也已經(jīng)有通過(guò)DNA結(jié)合表面進(jìn)行的純化(參見Kawakami等人Hypermethylated APC DNA inplasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma.Journal of the National Cancer Institute,Vol.92,No.22,2000,pp.1805-11)。但是這些純化的產(chǎn)率有限。
由于傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽處理中DNA的大量損失,如果研究中需要進(jìn)行分析的DNA只有有限量,使用這些方法進(jìn)行研究是有問(wèn)題的。但是甲基化分析的一個(gè)特別有趣的領(lǐng)域是,通過(guò)對(duì)來(lái)自體液例如血液或者尿的DNA進(jìn)行分析,診斷與甲基化狀態(tài)改變相關(guān)的癌癥疾病或者其他病癥。但是DNA只是以很小的濃度存在于體液中,使得甲基化分析的應(yīng)用受到傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽處理的低產(chǎn)量的限制。
因此,基于甲基化分析的特殊重要性以及所描述的傳統(tǒng)方法學(xué)的缺點(diǎn),對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的改進(jìn)方法有急切的技術(shù)上的需要。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)加入某些變性溶劑,以出人意料的、令人驚奇的方式提高亞硫酸氫鹽反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。同時(shí),降低了所需的反應(yīng)時(shí)間因此降解率也降低。盡管在本領(lǐng)域中已經(jīng)知道使用變性溶劑,但是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員還是不能預(yù)料在本發(fā)明中選擇的溶劑能夠產(chǎn)生如此強(qiáng)烈的效果。除了明顯提高的轉(zhuǎn)化率和降低的降解率以外,使用所述的溶劑產(chǎn)生另一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)通常亞硫酸氫鹽處理是在高濃度亞硫酸氫鹽的條件下進(jìn)行的(Fraga和Esteller推薦的最終濃度是5mol/l;參見以上,p.642,左欄,第二段)。但是如此高的鹽濃度導(dǎo)致高的降解,并且使接下來(lái)的純化和擴(kuò)增中產(chǎn)生問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明,與已知的變性溶劑相比,使用正烷撐二醇(n-alkylenglycol)作為變性劑的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些溶劑具有更高的水溶性。所以反應(yīng)化合物包括清除劑可以在更廣的濃度范圍下進(jìn)行應(yīng)用。將這些新型溶劑與優(yōu)化的反應(yīng)條件和新型純化方法相組合,轉(zhuǎn)化效率可以進(jìn)一步提高。對(duì)組織或者體液進(jìn)行敏感的DNA甲基化分析就變得可能了。
發(fā)明描述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法,其中DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng),其特征在于所述的反應(yīng)在選自二烷、其衍生物之一以及類似的脂肪族環(huán)醚的化合物的存在下進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法,其中DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng),其特征在于所述的反應(yīng)在具有下式的化合物存在下進(jìn)行 n=1-35000m=1-3R1=H,Me,Et,Pr,BuR2=H,Me,Et,Pr,Bu因此優(yōu)選的是正烷撐二醇化合物,特別是其二烷基醚,特別是二甘醇二甲醚(DME)。
對(duì)于兩個(gè)實(shí)施方案,研究的DNA可以來(lái)自不同的來(lái)源,這取決于是診斷還是科學(xué)研究的目的。對(duì)于診斷研究,優(yōu)選使用組織樣品作為原料,但是體液,特別是血清或者血漿也可以使用。也可以使用來(lái)自痰、糞便、尿或者腦脊液的DNA。優(yōu)選地,DNA從生物樣本中分離。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法,例如使用Qiagen UltraSens DNA提取試劑盒從血液中提取DNA。其他純化DNA的方法對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是已知的。
接下來(lái)可以對(duì)分離的DNA進(jìn)行片段化,例如通過(guò)與限制酶進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件和使用的酶對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是已知的,且來(lái)自例如生產(chǎn)商提供的實(shí)驗(yàn)方案。
可以根據(jù)以上所示的已知的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。反應(yīng)可在溶液中進(jìn)行,也可以在結(jié)合在固相上的DNA上進(jìn)行。優(yōu)選地,使用sodium disulfite(=亞硫酸氫鈉/焦亞硫酸鈉),原因是它在水中比亞硫酸鈉更易溶。在水溶液中,disulfite鹽與胞嘧啶轉(zhuǎn)化所需的亞硫酸氫根(hydrogen sulfite)陰離子不成比例。在以下討論亞硫酸氫鹽的濃度時(shí),這指的是在反應(yīng)溶液中亞硫酸氫根和亞硫酸根陰離子的濃度。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法,可能的濃度范圍是0.1-6mol/L(參見上面)。特別優(yōu)選的是濃度范圍是1-6mol/L,最特別優(yōu)選的是2-4mol/L。但是,在使用二烷時(shí),能夠使用的亞硫酸氫鹽最大濃度更低(參見以下)。在選擇亞硫酸氫鹽濃度時(shí),必須要考慮高濃度的亞硫酸氫鹽產(chǎn)生高的轉(zhuǎn)化,但是由于更低的pH,也導(dǎo)致高的分解率。
可以使用不同濃度的二烷。優(yōu)選地,二烷的濃度從10%到35%(體積/體積),特別優(yōu)選的是20-30%,最特別優(yōu)選的是22-28%,特別是25%。高于35%的二烷濃度是有問(wèn)題的,因?yàn)檫@會(huì)使反應(yīng)溶液中產(chǎn)生兩相。在使用濃度22-28%的二烷的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,最終的優(yōu)選亞硫酸氫鹽濃度是3.3-3.6mol/L,在使用濃度25%的二烷的最特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,最終的優(yōu)選亞硫酸氫鹽濃度是3.5mol/L(參見實(shí)施例)。
可以在不同濃度范圍內(nèi)使用根據(jù)本發(fā)明的正烷撐二醇混合物。優(yōu)選使用的DME濃度是1-35%(體積/體積)。優(yōu)選為5-25%,最優(yōu)選是10%DME。
根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選清除劑是色烷(chromane)衍生物,例如6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷2-羧酸(也被稱為Trolox-CTM)。在專利申請(qǐng)WO01/98528(=DE 100 29 915;=US 申請(qǐng) 10/311,661;其整體在這里引用作為參考)中列出了其他的清除劑。
可以在0-95℃攝氏度的廣闊溫度范圍內(nèi)進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化(參見以上)。但是由于在更高溫度下DNA的轉(zhuǎn)化和分解率都提高,在優(yōu)選的實(shí)施方案中反應(yīng)溫度在30-70℃。特別優(yōu)選的范圍是45-60℃。最特別優(yōu)選的是50-55℃。亞硫酸氫鹽處理最佳的反應(yīng)時(shí)間取決于反應(yīng)的溫度。反應(yīng)時(shí)間一般是1到18小時(shí)(參見Grunau等人2001,在上述引文中)。對(duì)于50℃的反應(yīng)溫度,反應(yīng)時(shí)間一般是4-6小時(shí)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化在溫和的反應(yīng)溫度下進(jìn)行,其中在反應(yīng)進(jìn)行的過(guò)程中,反應(yīng)溫度至少一次明顯地短暫升高。這樣,亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化效率可以被令人驚奇地明顯升高。短暫持續(xù)的溫度升高在以下被稱為“熱尖峰(thermospikes)”。在熱類峰以外的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度定義為基礎(chǔ)反應(yīng)溫度。如以上所描述的,基礎(chǔ)反應(yīng)溫度為0-80℃,優(yōu)選在30-70℃,最優(yōu)選在45-55℃。在熱尖峰中,通過(guò)至少一次熱尖峰使反應(yīng)溫度升高到85℃以上。最佳的熱尖峰數(shù)目是基礎(chǔ)溫度的函數(shù)。最佳熱尖峰數(shù)目越多,基礎(chǔ)溫度越低。在每個(gè)情況下至少需要一個(gè)熱尖峰。另一方面,原則上任何數(shù)目的熱尖峰都是可能的。當(dāng)然必須考慮到溫度多次提高,DNA的分解速率也提高,就不能再保證最佳的轉(zhuǎn)化。因此優(yōu)選的熱尖峰數(shù)目是每次1到10個(gè)熱尖峰,這取決于基礎(chǔ)反應(yīng)溫度。因此特別優(yōu)選的熱尖峰數(shù)目是2到5個(gè)。熱尖峰使反應(yīng)溫度優(yōu)選升高到85-100℃,特別優(yōu)選升高到90-98℃,最優(yōu)選升高到94-96℃。
熱尖峰的持續(xù)時(shí)間也取決于反應(yīng)批次的體積。必須確保溫度在整個(gè)反應(yīng)溶液中均勻升高。在使用熱循環(huán)儀時(shí),對(duì)于20μl的反應(yīng)批次,持續(xù)時(shí)間在15秒到1.5分鐘,特別地優(yōu)選持續(xù)時(shí)間為20到50秒。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中持續(xù)時(shí)間是30秒。對(duì)100μl的體積進(jìn)行操作時(shí)優(yōu)選的范圍在30秒到5分鐘之間,特別是在1到3分鐘之間。特別優(yōu)選是1.5分鐘。對(duì)于600μl的體積,優(yōu)選的持續(xù)時(shí)間是1到6分鐘,特別是2到4分鐘。特別優(yōu)選的持續(xù)時(shí)間是3分鐘。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠很容易地根據(jù)各種不同的反應(yīng)體積確定適宜的熱尖峰持續(xù)時(shí)間。
在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)中,即使沒(méi)有使用以上描述的變性溶劑,以上描述的使用熱尖峰產(chǎn)生了顯著更好的轉(zhuǎn)化率。根據(jù)本發(fā)明,DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法特征在于基礎(chǔ)反應(yīng)溫度在0-80℃,在轉(zhuǎn)化過(guò)程中,反應(yīng)溫度至少一次短暫升高到85℃以上。可以根據(jù)以上的描述處理原料。
優(yōu)選的溫度范圍、熱尖峰的數(shù)目以及它們的持續(xù)時(shí)間與以上描述的范圍一致。因此基礎(chǔ)反應(yīng)溫度在0-80℃,優(yōu)選在30-70℃,最優(yōu)選在45-55℃。通過(guò)至少一次熱尖峰使反應(yīng)溫度升高到85℃以上。優(yōu)選的熱尖峰數(shù)目是1到10個(gè)熱尖峰,這取決于基礎(chǔ)反應(yīng)溫度。特別優(yōu)選的熱尖峰數(shù)目是2到5個(gè)。在熱尖峰中,反應(yīng)溫度優(yōu)選升高到85-100℃,特別優(yōu)選升高到90-98℃,最優(yōu)選升高到94-96℃。
溫度升高的持續(xù)時(shí)間也取決于反應(yīng)批次的體積(參見以上)。
完成亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后,將DNA去磺酸基并純化。已知對(duì)于這個(gè)目的有不同的方法(例如參見DE 101 54 317 A1=US 10/416,624;Grunau等人2001,在上述引文中)。一般地,首先使用氫氧化鈉處理反應(yīng)溶液。接下來(lái)進(jìn)行DNA的中和以及乙醇沉淀。在根據(jù)本發(fā)明的上述實(shí)施方案的優(yōu)選實(shí)施方案中,通過(guò)凝膠過(guò)濾例如使用Sephadex-G25柱進(jìn)行純化。這樣可以非常有效地除去亞硫酸氫鹽,不需要進(jìn)一步的洗滌步驟。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,通過(guò)DNA結(jié)合表面例如通過(guò)Promega的Wizard DNA純化樹脂(參見Kawakami等人,在上述引文中)進(jìn)行純化。第三個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案使用磁性顆粒用于純化,例如使用Magna-Pure方法。這些純化方法與根據(jù)本發(fā)明的正烷撐二醇化合物組合,特別是與DME組合,產(chǎn)生特別好的結(jié)果。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行純化。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員還知道通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn),改變生產(chǎn)商的說(shuō)明產(chǎn)量可能得到進(jìn)一步提高。因此,經(jīng)過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案也是本發(fā)明的一部分。通過(guò)凝膠過(guò)濾、DNA結(jié)合表面以及磁性顆粒純化核酸的進(jìn)一步技術(shù)說(shuō)明是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的,并且在例如生產(chǎn)商的說(shuō)明中提供。在最特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用超濾方式進(jìn)行純化。這一方法具有幾個(gè)技術(shù)優(yōu)勢(shì),并且使轉(zhuǎn)化后的DNA被令人驚奇地成功純化。轉(zhuǎn)化后的DNA回收率非常高(大于85%,參見實(shí)施例6)。這對(duì)于高分子量的DNA以及片段化的DNA如體液中發(fā)現(xiàn)的DNA都是如此。相反,分離亞硫酸氫鹽處理的DNA的通常方法,其回收率只有大約25%。超濾還有其他優(yōu)點(diǎn)。例如,就使用的樣品體積而言,純化是非常靈活的。此外,亞硫酸氫鹽可以幾乎完全除去。而且,去磺酸基可以在濾膜上進(jìn)行,這進(jìn)一步節(jié)約了時(shí)間。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道不同的商品化的超濾系統(tǒng),可以在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用它們。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用了Millipore的MicroconTM柱。這樣純化可以根據(jù)修改后的生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行。為此將亞硫酸氫鹽反應(yīng)溶液與水混和,加到超濾膜上。接下來(lái)離心超濾溶液大約15分鐘,然后使用1×TE緩沖液洗滌。在這一處理中,DNA留在了膜上。接下來(lái)進(jìn)行去磺酸基。為此加入0.2mol/L氫氧化鈉,并將DNA溫育10分鐘。然后進(jìn)行另一次離心(10分鐘),接下來(lái)使用1×TE緩沖液洗滌。接下來(lái)洗脫DNA。為此,用50μl溫的1×TE緩沖液(50℃)與膜混和10分鐘。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明將膜反過(guò)來(lái),重復(fù)離心,這樣將DNA從膜上移下來(lái)?,F(xiàn)在可以直接使用洗脫物用于計(jì)劃中的檢測(cè)反應(yīng)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知使用其他超濾系統(tǒng)時(shí)可能涉及其他的步驟,也可以通過(guò)改變以上提到的條件得到良好的產(chǎn)量。相應(yīng)的實(shí)施方案也是本發(fā)明的部分。
在不使用以上描述的變性溶劑或者在不使用熱尖峰進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí),使用以上描述的超濾也促進(jìn)了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA純化的顯著改善。因此,根據(jù)本發(fā)明,DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法特征在于轉(zhuǎn)化后的DNA的純化通過(guò)超濾方式進(jìn)行。這樣可以根據(jù)以上的描述處理原料。也可以使用熱尖峰。優(yōu)選的溫度范圍、熱尖峰的數(shù)目以及它們的持續(xù)時(shí)間與以上描述的范圍一致(參見以上)。而且,超濾優(yōu)選地根據(jù)以上描述進(jìn)行。因此,可以使用不同的超濾系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用Millipore的MicroconTM柱。純化優(yōu)選根據(jù)修改的生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案按照以上的描述進(jìn)行。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知使用其他超濾系統(tǒng)時(shí)可能涉及其他的步驟,也可以通過(guò)改變以上提到的條件得到進(jìn)一步提高的產(chǎn)量。相應(yīng)的實(shí)施方案也是本發(fā)明的部分。
通過(guò)以上描述的不同實(shí)施方案經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化和純化的DNA,現(xiàn)在可以用不同方式進(jìn)行分析了。非常優(yōu)選地首先通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA。這樣,可以通過(guò)不同的方法,例如通過(guò)所謂的“重甲基(HeavyMethyl)”方法(綜述參見Cottrell等人;A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.Nucleic AcidsRes.2004 Jan 13;32(1)e10.WO02/072880)或者所謂的“甲基化敏感PCR”(″MSP″;參見Herman等人Methylation-specific PCRanovel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc NatlAcad Sci USA.1996 Sep 3;93(18)9821-6)確保對(duì)原來(lái)甲基化或者非甲基化的DNA進(jìn)行選擇性的擴(kuò)增。可以通過(guò)常規(guī)方法例如引物延伸反應(yīng)(″MsSNuPE″;參見例如DE 100 10 280=US 10/220,090)或者與寡聚體陣列雜交(參見例如Adorjan等人,Tumour class predictionand discovery by microarray-based DNA methylation analysis.Nucleic Acids Res.2002 Mar 1;30(5)e21)對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用實(shí)時(shí)PCR的變異方法(參見US 6,331,393″Methyl Light″)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。因此優(yōu)選的變異方法是“Taqman”以及“Lightcycler”方法。
這里公開的方法優(yōu)選地用于患者或者個(gè)體的有害事件的診斷和/或預(yù)后,其中這些有害事件屬于以下的種類的至少一種不希望的藥物相互作用;癌癥疾?。籆NS機(jī)能障礙、損傷和疾??;攻擊癥狀或者行為障礙;腦損傷的臨床、心理以及社會(huì)的后果;精神障礙和性格疾患;癡呆和/或相關(guān)的綜合征;心血管疾病、功能障礙和損傷;胃腸道功能障礙、損傷或者疾??;呼吸系統(tǒng)功能障礙、損傷或者疾?。粨p傷、發(fā)炎、感染、免疫性和/或恢復(fù)期;由于發(fā)育過(guò)程異常產(chǎn)生的身體的功能障礙、損傷或者疾??;皮膚、肌肉結(jié)締組織或者骨骼的功能障礙、損傷或者疾病;內(nèi)分泌和代謝功能障礙、損傷或者疾?。活^痛或者性功能障礙。
新方法還以特別優(yōu)選的方式區(qū)分細(xì)胞類型、組織或者研究細(xì)胞分化。
新方法還以特別優(yōu)選的方式用于分析患者對(duì)藥物治療的反應(yīng)。
本發(fā)明的對(duì)象還是試劑盒,試劑盒含有含亞硫酸氫鹽的試劑、變性劑或者溶劑以及清除劑,用于產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的引物以及選擇地,超濾管或者進(jìn)行檢測(cè)的說(shuō)明。
實(shí)施例以下的實(shí)施例解釋了本發(fā)明。
實(shí)施例1自動(dòng)進(jìn)行的亞硫酸氫鹽反應(yīng)本實(shí)施例描述了檢測(cè)基因組DNA樣品中因子VIII基因的胞嘧啶甲基化狀態(tài)的方法的應(yīng)用,根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明DNA樣品使用限制性核酸內(nèi)切酶處理。該方法基于具有四個(gè)分開的、垂直可移動(dòng)的適配器的用于可交換的吸頭的自動(dòng)化移液系統(tǒng)(MWG RoboSeq 4204)的應(yīng)用,這樣避免交叉污染。移液系統(tǒng)可使100μl(等分試樣)移液誤差小于±2μl。自動(dòng)化移液系統(tǒng)的操作臺(tái)配有六個(gè)用于移液吸頭的架子以及八個(gè)移液位置(其中兩個(gè)可以被冷卻),可以冷卻的試劑架,可以堆放10個(gè)微量滴定平板的堆垛系統(tǒng)(stacking system),移液吸頭清洗站以及將移液吸頭從適配器上分開的裝置。
自動(dòng)移液系統(tǒng)通過(guò)連續(xù)的界面與計(jì)算機(jī)相連,通過(guò)軟件程序被控制,軟件程序可以對(duì)本發(fā)明方法的應(yīng)用所需的所有移液步驟進(jìn)行自由編程。
在本方法的第一步中,手動(dòng)將DNA樣品的等分試樣置于微量滴定板96個(gè)可自由選擇的位置中的一個(gè)。然后使用Eppendorf MasterCycler將微量滴定板加熱到96℃,使預(yù)處理的DNA樣品變性。然后將微量滴定板轉(zhuǎn)移到自動(dòng)移液系統(tǒng)中。將變性劑(二烷)、3.3M亞硫酸氫鈉溶液以及溶于所使用變性劑中的清除劑溶液的等分試樣以程控的方式一個(gè)接一個(gè)從試劑架上移液到所有含有DNA的位置中。然后微量滴定板在Eppendorf Mastercycler中溫育,使DNA樣品中所有未甲基化的胞嘧啶殘基在亞硫酸氫鈉的作用下轉(zhuǎn)化為亞硫酸氫鹽的加合物。
在亞硫酸氫鹽處理以后,將微量滴定板從熱循環(huán)儀中轉(zhuǎn)移到自動(dòng)移液系統(tǒng)中。然后裝上相同類型的第二微量滴定板。首先將堿性的Tris-HCl緩沖液(pH9.5)然后將亞硫酸氫鹽處理的DNA等分試樣轉(zhuǎn)移到在所有室(chamber)內(nèi)的第二塊微量滴定板上的相應(yīng)位置中(它們?cè)诘谝粔K平板上的相應(yīng)的位置處含有亞硫酸氫鹽處理的DNA樣品)。在堿性溶液中未甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽加合物被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基。
通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理的DNA的一條鏈(在本實(shí)施例中是有義鏈)的靶向擴(kuò)增。使用了一對(duì)類型1引物(AGG GAGTTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG A(SEQ.ID1)和TAA TCC CAA AAC CTCTCC ACT ACA ACA A(SEQ ID2),這使被亞硫酸氫鹽成功處理的DNA鏈被特異地?cái)U(kuò)增,而未甲基化的胞嘧啶殘基沒(méi)有被轉(zhuǎn)化或者被完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基的DNA鏈則不能被擴(kuò)增。將第三個(gè)相同類型的微量滴定板置于自動(dòng)移液系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。在所有的室中(其在第一塊平板上的相應(yīng)的位置含有亞硫酸氫鹽處理的DNA樣品)首先自動(dòng)移入含有PCR緩沖液、DNA聚合酶以及類型1引物的儲(chǔ)液的等分試樣。然后將稀釋后的亞硫酸氫鹽處理的DNA的等分試樣從第二塊微量滴定板的每一個(gè)位置自動(dòng)轉(zhuǎn)移到第三塊微量滴定板的相應(yīng)位置上,之后將第三塊平板轉(zhuǎn)移到循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用瓊脂糖凝膠電泳以及接下來(lái)溴乙啶染色鑒定PCR產(chǎn)物(
圖1)。圖1顯示了PCR擴(kuò)增的亞硫酸氫鹽處理的DNA鏈的凝膠圖像(左側(cè)分子量標(biāo)志,右側(cè)PCR產(chǎn)物)。
實(shí)施例2通過(guò)加入二烷對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化進(jìn)行優(yōu)化,用于檢測(cè)血漿樣品中的DNA
將會(huì)顯示優(yōu)化的亞硫酸氫鹽方法可對(duì)來(lái)自體液的DNA進(jìn)行敏感甲基化分析。為了這個(gè)目的,將1毫升人血漿與特異量的人DNA混和。使用Magna Pure方法(Roche)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明從血漿樣品中分離DNA。純化得到的100μl洗脫物完全用于以下的亞硫酸氫鹽反應(yīng)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Frommer等人,在上述引文中)進(jìn)行轉(zhuǎn)化作為對(duì)照。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟如下洗脫物與354μl亞硫酸氫鹽溶液(5.89mol/L)以及146μl含有自由基清除劑(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷2-羧酸,98.6毫克溶于2.5毫升二烷)的二烷混和。反應(yīng)混合物在99℃變性3分鐘,接下來(lái)在以下的溫度程序中溫育,共5小時(shí)50℃30分鐘;一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘;50℃ 1.5小時(shí);一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘;50℃3小時(shí)。接下來(lái)通過(guò)超濾使用Millipore的MicroconTM柱純化對(duì)照和根據(jù)本發(fā)明的方法的反應(yīng)混合物。純化基本上根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行。為此將反應(yīng)混合物與300μl水混和,加到超濾膜上,離心15分鐘,然后使用1×TE緩沖液洗滌。在這一處理中,DNA留在了膜上。接下來(lái)進(jìn)行脫磺酸基。為此加入0.2mol/L氫氧化鈉,并溫育10分鐘。然后進(jìn)行離心(10分鐘),接下來(lái)使用1×TE緩沖液洗滌。這以后洗脫DNA。為此,用50μl溫的1×TE緩沖液(50℃)與膜混和10分鐘。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明將膜反過(guò)來(lái)。接下來(lái)重復(fù)離心,這樣將DNA從膜上移下來(lái)。使用10μl洗脫物用于以下的Lightcycler實(shí)時(shí)PCR。對(duì)人β-肌動(dòng)蛋白的一部分進(jìn)行分析(參見MiyamotoNucleotide sequence of thehuman beta-actin promoter 5′flanking region;Nucleic Acids Res.15(21),9095(1987))。使用以下的引物和探針正向引物TGG TGA TGGAGG AGG TTT AGT AAG T(SEQ ID 3);反向引物AAC CAA TAA AAC CTACTC CTC CCT TAA(SEQ ID 4);供體探針TTG TGA ATT TGT GTT TGTTAT TGT GTG TTG-flou(SEQ ID 5);受體探針LC Red640-TGG TGGTTA TTT TTT TTA TTA GGT TGT GGT-Phos(SEQ ID 6)。通過(guò)亞硫酸氫鹽特異的試驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)增。使用Lightcycle軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。可以與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較對(duì)轉(zhuǎn)化的并且分離的DNA定量。優(yōu)化的方法產(chǎn)生的DNA濃度是133.21ng/100μl,而傳統(tǒng)的方法產(chǎn)生的DNA濃度是41.03ng/100μl。因此根據(jù)本發(fā)明的方法能使DNA產(chǎn)量比傳統(tǒng)方法高3倍。
實(shí)施例3通過(guò)加入DME優(yōu)化亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,用于檢測(cè)血漿樣品中的DNA將會(huì)顯示優(yōu)化的亞硫酸氫鹽方法可對(duì)來(lái)自體液的DNA進(jìn)行敏感甲基化分析。為了這個(gè)目的,將1毫升人血漿與特異量的人DNA混和。使用Magna Pure方法(Roche)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明從血漿樣品中分離DNA。純化得到的100μl洗脫物完全用于以下亞硫酸氫鹽反應(yīng)中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Frommer等人,在上述引文中)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化作為對(duì)照。根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟如下洗脫物與354μl亞硫酸氫鹽溶液(5.89mol/L)以及46μl含有自由基清除劑(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷2-羧酸,98.6毫克溶于787μl的DME)的DME混和。反應(yīng)混合物在99℃變性3分鐘,接下來(lái)在以下的溫度程序中溫育,共5小時(shí)50℃30分鐘;一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘;50℃ 1.5小時(shí);一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘;50℃ 3小時(shí)。接下來(lái)通過(guò)超濾使用Millipore的MicroconTM柱純化對(duì)照和根據(jù)本發(fā)明的方法的反應(yīng)混合物。純化基本上根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行。為此將反應(yīng)混合物與300μl水混和,加到超濾膜上,離心15分鐘,然后使用1×TE緩沖液洗滌。在這一處理中,DNA留在了膜上。接下來(lái)進(jìn)行脫磺酸基。為此在DNA中加入0.2mol/L氫氧化鈉,溫育10分鐘。然后進(jìn)行離心(10分鐘),接下來(lái)使用1×TE緩沖液洗滌。這以后洗脫DNA。為此,用50μl溫的1×TE緩沖液(50℃)與膜混和10分鐘。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明將膜反過(guò)來(lái)。接下來(lái)重復(fù)離心,這樣將DNA從膜上移下來(lái)。使用10μl洗脫物用于以下的Lightcycler實(shí)時(shí)PCR。通過(guò)使用實(shí)施例2中所述的引物和探針對(duì)人β-肌動(dòng)蛋白區(qū)域進(jìn)行分析。通過(guò)亞硫酸氫鹽特異的試驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)增。使用Lightcycler軟件計(jì)算的結(jié)果在圖2中示出。左側(cè)的曲線對(duì)應(yīng)于優(yōu)化的方法,而右側(cè)的曲線對(duì)應(yīng)于傳統(tǒng)方法。顯示即使使用小的循環(huán)數(shù)目,優(yōu)化后的方法也產(chǎn)生了顯著的熒光信號(hào)。因此DNA產(chǎn)量比傳統(tǒng)方法高??梢耘c標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較對(duì)轉(zhuǎn)化的DNA定量。優(yōu)化的方法產(chǎn)生的DNA濃度是133.27ng/100μl,而傳統(tǒng)的方法產(chǎn)生的DNA濃度是41.03ng/100μl。因此根據(jù)本發(fā)明的方法能使DNA產(chǎn)量比傳統(tǒng)方法高3倍。
實(shí)施例4在熱尖峰的幫助下進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化向1μl MssI酶切的高純度人DNA(Promega;160ng)中加入2μlddH2O。樣品在96℃下變性10分鐘。然后加入大約10μl亞硫酸氫鹽溶液(5.85mol/L)和7μl自由基消除劑/二烷混合物(5μl二烷和2μl清除劑)。這以后取出第一個(gè)樣品(0小時(shí))置于冰上。反應(yīng)混合物在96℃溫育30秒然后在50℃溫育59.5分鐘。取出第二個(gè)樣品(1小時(shí))置于冰上。第三個(gè)樣品(2小時(shí))再次在96℃孵育30秒然后在50℃育59.5分鐘。然后該樣品也置于冰上。第四個(gè)樣品(3小時(shí))再次在96℃溫育30秒然后在50℃溫育59.5分鐘,接下來(lái)冷卻。向樣品中加入30μl ddH2O。通過(guò)G25 Sephadex柱純化反應(yīng)混合物。洗脫物與50μl100mmol/L Tris-HCl(pH9.5)混和在96℃下脫磺酸基20分鐘。每個(gè)PCR反應(yīng)使用2μl該溶液。在PCR中每次擴(kuò)增兩個(gè)亞硫酸氫鹽特異的片段、兩個(gè)非特異的片段以及一個(gè)基因組片段。隨著亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化進(jìn)行,亞硫酸氫鹽特異的片段被更為強(qiáng)烈地?cái)U(kuò)增出來(lái)。非特異片段的擴(kuò)增與亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化無(wú)關(guān),它提供了DNA降解的指示。只有沒(méi)有被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的基因組DNA仍然存在才有基因組片段被擴(kuò)增。因此基團(tuán)組DNA擴(kuò)增是不完全亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的測(cè)量。在瓊脂糖凝酸中分離的擴(kuò)增產(chǎn)物可參見圖3。這里顯示在根據(jù)本發(fā)明的方法中即使在1小時(shí)以后大部分的DNA都已經(jīng)被轉(zhuǎn)化。最晚3小時(shí)以后已經(jīng)不能再檢測(cè)出基因組DNA了,即亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化是完全的。在傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理中,相應(yīng)的數(shù)值最早也要在5小時(shí)以后(參見下面)才產(chǎn)生。
實(shí)施例5使用熱尖峰的亞硫酸氫鹽處理與沒(méi)有熱尖峰的亞硫酸氫鹽處理的比較如實(shí)施例4中進(jìn)行處理的樣品溫育3或者5小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間,具有兩次熱尖峰。對(duì)照反應(yīng)沒(méi)有熱尖峰。根據(jù)以上的描述進(jìn)行純化和PCR。擴(kuò)增了兩個(gè)亞硫酸氫鹽特異的片段。其中一個(gè)片段富含胞嘧啶。這樣需要相對(duì)較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間以獲得完全的轉(zhuǎn)化。相反,另一個(gè)片段具有少量的胞嘧啶因此在相對(duì)較短的時(shí)間之后即被完全轉(zhuǎn)化。擴(kuò)增的結(jié)果示于圖4中。在左圖中可以看到傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,而在右圖中可以看到使用熱尖峰的優(yōu)化的轉(zhuǎn)化。每一幅圖內(nèi)富含胞嘧啶的片段都示于左側(cè),而含少量胞嘧啶的片段示于右側(cè)。圖中顯示根據(jù)本發(fā)明的方法能進(jìn)行明顯更靈敏的檢測(cè)。因此,使用熱尖峰處理,即使在3小時(shí)以后,富含胞嘧啶的片段也可以被明確地檢測(cè)出來(lái),而使用傳統(tǒng)的方法即使在5小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后,富含胞嘧啶的片段也不能被檢測(cè)出來(lái)。
實(shí)施例6在根據(jù)本發(fā)明的方法中DNA的回收率將會(huì)顯示根據(jù)本發(fā)明的方法能非常有效地進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和純化。為了這個(gè)目的,將不同量的M13-DNA和人DNA溶于100μl水中。DNA溶液與354μl亞硫酸氫鹽溶液(5.89mol/L)以及146μl含有自由基清除劑(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷2-羧酸,98.6毫克溶于2.5毫升二烷)的二烷混和。反應(yīng)混合物在99℃變性3分鐘,接下來(lái)在以下的溫度程序中溫育,共5小時(shí)50℃30分鐘;一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘;50℃1.5小時(shí);一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘;50℃3小時(shí)。接下來(lái)使用Millipore的MicroconTM柱通過(guò)超濾純化反應(yīng)混合物。純化基本上根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行。為此,將反應(yīng)混合物與300μl水混和,加到超濾膜上,離心15分鐘,然后使用1×TE緩沖液洗滌。在這一處理中,DNA留在了膜上。接下來(lái)進(jìn)行脫磺酸基。為此加入0.2mol/L氫氧化鈉,溫育10分鐘。然后進(jìn)行離心(10分鐘),接下來(lái)使用1×TE緩沖液洗滌。這以后洗脫DNA。為此,用50μl溫的1×TE緩沖液(50℃)與膜混和10分鐘。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明將膜反過(guò)來(lái)。接下來(lái)重復(fù)離心,這樣將DNA從膜上移下來(lái)。然后熒光測(cè)定法測(cè)定DNA的濃度(橄欖綠)。數(shù)據(jù)示于表1中。DNA的回收率至少為75%。相反,在已知的DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和純化的方法中,DNA的回收率低于25%。
表1
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1顯示了實(shí)施例1的結(jié)果。顯示了PCR擴(kuò)增的亞硫酸氫鹽處理的DNA鏈的凝膠圖形(左側(cè)分子量標(biāo)志,右側(cè)PCR產(chǎn)物)。
圖2顯示了實(shí)施例3的結(jié)果(使用DME)。從血漿樣品中分離DNA,使用亞硫酸氫鹽處理并且通過(guò)Lightcycler PCR的方式擴(kuò)增。Y軸顯示了每次循環(huán)中測(cè)量的熒光信號(hào)。X軸表示了循環(huán)數(shù)目。左側(cè)顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法的曲線,右側(cè)顯示的是根據(jù)傳統(tǒng)方法的曲線。圖中顯示,即使使用小的循環(huán)數(shù)目,優(yōu)化的方法產(chǎn)生了明顯的熒光信號(hào)。DNA產(chǎn)量比傳統(tǒng)方法高。
圖3顯示了實(shí)施例4的結(jié)果。顯示了PCR擴(kuò)增后的電泳凝膠。每一次擴(kuò)增兩個(gè)不同的亞硫酸氫鹽特異的片段、兩個(gè)非特異片段以及一個(gè)基因組片段。最上面的圖片顯示了零值(反應(yīng)時(shí)間=0小時(shí))。從上面數(shù)的第二幅圖片顯示具有一次熱尖峰、總反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)的反應(yīng)。從上面數(shù)的第三幅圖片對(duì)應(yīng)的是具有兩次熱尖峰、總反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)的反應(yīng)。最下面的圖片顯示了具有三次熱尖峰、反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)的反應(yīng)。使用根據(jù)本發(fā)明的方法,即使在1小時(shí)之后大部分的DNA被轉(zhuǎn)化了(從上面數(shù)的第二幅圖片)。最晚在3小時(shí)以后,已經(jīng)不能再檢測(cè)出基因組DNA了(最下面的圖片)。
圖4顯示了實(shí)施例5的結(jié)果。顯示了PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳。擴(kuò)增了兩種不同的亞硫酸氫鹽特異擴(kuò)增產(chǎn)物。左側(cè)的圖片顯示了傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽處理,而右側(cè)的圖片顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法。上面顯示的是3小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間,下面顯示的是5小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間。使用根據(jù)本發(fā)明的方法(熱尖峰)顯然可以得到更為敏感的檢測(cè)。因此,左側(cè)泳道顯示的片段在3小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間之后可以被檢測(cè)出來(lái),而來(lái)自傳統(tǒng)方法的片段即使在5小時(shí)的溫育之后也不能被檢測(cè)出來(lái)。
序列表<110>Epigenomics AG<120>改進(jìn)的DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化<160>6<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1agggagtttt ttttagggaa tagaggga28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2taatcccaaa acctctccac tacaacaa28<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3tggtgatgga ggaggtttag taagt 25<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4aaccaataaa acctactcct cccttaa 27<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測(cè)探針
<400>5ttgtgaattt gtgtttgtta ttgtgtgttg 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測(cè)探針<400>6tggtggttattttttttatt aggttgtggt 30
權(quán)利要求
1.DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法,其中基因組DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng),該方法的特征在于所述的反應(yīng)在選自二烷、其衍生物之一以及類似的脂肪族環(huán)醚存在下進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物的濃度是10-35%體積。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物的濃度是20-30%體積。
4.DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法,其中基因組DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng),其特征在于所述的反應(yīng)在具有下式的化合物存在下進(jìn)行 n=1-35000m=1-3R1=H,Me,Et,Pr,BuR2=H,Me,Et,Pr,Bu。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物包括正烷撐二醇化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物包括二烷基醚。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物包括二甘醇二甲醚(DME)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物以1-35%體積濃度存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其進(jìn)一步特征在于所述化合物以5-25%體積濃度存在。
10.DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法,其中分離的基因組DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng),該方法特征在于反應(yīng)在0-80℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行,在轉(zhuǎn)化過(guò)程中,反應(yīng)的溫度短暫升高到85-100℃的范圍(熱尖峰)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其進(jìn)一步特征在于短暫的溫度升高(熱尖峰)的次數(shù)是2到5次。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其進(jìn)一步特征在于在短暫的溫度升高(熱尖峰)中反應(yīng)溫度升高到85-100℃。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法,其進(jìn)一步特征在于短暫的溫度升高(熱尖峰)使反應(yīng)溫度升高到90-98℃。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法,其進(jìn)一步特征在于通過(guò)磁性顆粒純化被轉(zhuǎn)化的DNA。
15.DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法,其特征在于通過(guò)超濾純化被轉(zhuǎn)化的DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、4、10或者15的方法,其進(jìn)一步特征在于通過(guò)以下方法之一對(duì)被轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行分析MSP,Heavy Methyl,MsSNuPE,Methyl Light。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、4、10或者15的方法,其進(jìn)一步特征在于研究組織樣品或者體液的DNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求1、4、10或者15的方法用于患者或者個(gè)體的有害事件的診斷和/或預(yù)后的用途,其中這些有害事件屬于以下的種類的至少一種不希望的藥物相互作用;癌癥疾??;CNS機(jī)能障礙、損傷或疾??;攻擊癥狀或者行為障礙;腦損傷的臨床、心理以及社會(huì)后果;精神障礙和性格疾患;癡呆和/或相關(guān)的綜合征;心血管疾病、功能障礙和損傷;胃腸道功能障礙、損傷或者疾?。缓粑到y(tǒng)功能障礙、損傷或者疾??;損傷、炎癥、感染、免疫性和/或恢復(fù)期;由于發(fā)育過(guò)程異常產(chǎn)生的身體的功能障礙、損傷或者疾?。黄つw、肌肉、結(jié)締組織或者骨骼的功能障礙、損傷或者疾??;內(nèi)分泌和代謝功能障礙、損傷或者疾??;頭痛或者性功能障礙。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、4、10或者15的方法用于區(qū)分細(xì)胞類型、組織或者研究細(xì)胞分化的用途。
20.試劑盒,其由含有亞硫酸氫鹽的試劑、變性劑或者溶劑以及清除劑,用于產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的引物組成以及選擇地,含有超濾管或者用于進(jìn)行根據(jù)前面權(quán)利要求中的一項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)的使用說(shuō)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的改進(jìn)方法。將變性溶劑、新的反應(yīng)條件以及新的純化方法組合在一起,亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的效果得到了明顯提高。接下來(lái)可以通過(guò)不同的方法分析被轉(zhuǎn)化的DNA。本發(fā)明有助于對(duì)胞嘧啶甲基化的分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1863929SQ200480029442
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者K·博林, M·保豪瑟, K·卡頓 申請(qǐng)人:Epi基因組股份公司